特許 6235460 可逆的に架橋されたミセルＳＹＳＴＥＭＳ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6235460

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】可逆的に架橋されたミセルＳＹＳＴＥＭＳ

(51)【国際特許分類】

   C08G 65/334 20060101AFI20171113BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 49/12 20060101ALI20171113BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171113BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20171113BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 31/573 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20171113BHJP

【ＦＩ】

   C08G65/334

   A61K47/10

   A61K9/48

   A61K49/12

   A61P35/00

   A61P11/06

   A61P37/08

   A61K31/573

   A61K31/337

   A61K31/704

   A61K47/20

【請求項の数】10

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2014-510540(P2014-510540)

(86)(22)【出願日】2012年5月14日

(65)【公表番号】特表2014-514431(P2014-514431A)

(43)【公表日】2014年6月19日

(86)【国際出願番号】US2012037794

(87)【国際公開番号】WO2012158622

(87)【国際公開日】20121122

【審査請求日】2015年4月27日

(31)【優先権主張番号】61/485,774

(32)【優先日】2011年5月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/487,953

(32)【優先日】2011年5月19日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(72)【発明者】

【氏名】キット エス．ラム

(72)【発明者】

【氏名】リ ユアンペイ

(72)【発明者】

【氏名】ルオ チュンタオ

(72)【発明者】

【氏名】シャオ カイ

【審査官】 小出 直也

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０３９４９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００１−１４６５５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０６２９０９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０８Ｇ６５／００−６７／０４

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ４７／００−４７／４８

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記式の化合物：

【化1】

（式中、
Ａは、ＰＥＧ基に連結されたリシンであり；
分岐モノマー単位Ｘは各々、リシンであり；
ＰＥＧは、分子量１〜１００ｋＤａのポリエチレングリコール（polyethyleneglycol：ＰＥＧ）ポリマーからなる基を表し；
Ｒは各々、コール酸であり；
Ｙ^２はシステインからなる群より選択される架橋性基であり；
リンカーＬ’は各々、下記式：

【化2】

を有するＥｂｅｓリンカーである。）。

【請求項2】

ＰＥＧは、分子量５ｋＤのＰＥＧである、請求項１の化合物。

【請求項3】

内部及び外部を有し、少なくとも２のコンジュゲートを含む、可逆的に架橋されたナノ担体（nanocarrier）であって、各コンジュゲートが、請求項１の化合物から選択され、
ここで、各コンジュゲートが水性溶媒中で自己組織化してナノ担体を形成し、各コール酸の疎水面が相互に対して配向することによって、ナノ担体の内部に疎水ポケットが形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧがナノ担体の外部に自己組織化し、少なくとも２のコンジュゲートが架橋性基を介して可逆的に架橋された、ナノ担体。

【請求項4】

ナノ担体が更に、疎水性薬物又は造影剤を含み、ここで疎水性薬物又は造影剤が、ナノ担体の疎水ポケット内に隔離されている（sequestered）、請求項３のナノ担体。

【請求項5】

疎水性薬物が、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダウノルビシン、ＶＰ１６、プレドニゾン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス、カルムスチン、ラパチニブ、ソラフェニブ、フェンレチニド、及びアクチノマイシンＤからなる群より選択される、請求項４のナノ担体。

【請求項6】

造影剤が、有機蛍光染料、量子ドット（quantum dots：ＱＤｓ）、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（super paramagnetic iron oxide nanoparticles：ＳＰＩＯ−ＮＰｓ）、及び金ナノ粒子からなる群より選択される、請求項４のナノ担体。

【請求項7】

造影剤が、放射性核種である、請求項４のナノ担体。

【請求項8】

請求項４の可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消する方法であって、可逆的に架橋されたナノ担体を、架橋結合を開裂するのに適した結合開裂成分とインビトロ（in vitro）で接触させることにより、可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消することを含む、方法。

【請求項9】

請求項４の可逆的に架橋されたナノ担体を含む医薬組成物であって、可逆的に架橋されたナノ担体を、架橋結合を開裂するのに適した結合開裂成分とインビボ（in vivo）で接触させることにより、可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消するために用いられる医薬組成物。

【請求項10】

結合開裂成分が、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン、及び２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）からなる群より選択される、請求項８の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第６１／４８５，７７４号（２０１１年５月１３日出願）及び第６１／４８７，９５３号（２０１１年５月１９日出願）に基づく優先権の利益を享受する。これらの出願の内容はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究開発の下で為された発明に対する権利に関する宣言
本発明は、国立衛生研究所の許可番号ＣＡ１１５４８３及びＣＡ１４０４４９の下、政府支援により為されたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

種々の癌の治療に有効な化学療法剤の中には、水溶性が極めて悪いために、不所望の副作用を引き起こす製剤を必要とするものがある。近年、Abraxane^{（登録商標）}（パクリタキセル担持アルブミンナノ粒子）、Doxil^{（登録商標）}（ドキソルビシン担持リポゾーム）等のナノ治療製剤が、薬物の臨床毒性プロファイルを改善することが示されたが、その抗腫瘍効果は元の薬物製剤と比べて僅かに改善するに過ぎない。その理由の一つは、ナノ治療製剤のサイズが比較的大きい（一般に＞１００ｎｍ）ために、薬物の腫瘍塊への浸透が制限されてしまう点にあるとされてきた。更には、斯かるサイズの大きさゆえに、ナノ治療剤が肝臓や細網内皮系（reticuloendothelial system：ＲＥＳ）にトラップされてしまう場合もあった。従って、抗癌薬をインビボ（in vivo）で効率的に送達するために、より小さな（２０〜８０ｎｍ）ステルス且つ生体適合ナノ担体を開発することが求められている。

【0004】

本発明者等は近年、パクリタキセル（ＰＴＸ）等の疎水性薬物のために、幾つかの新たなナノ担体を開発した。斯かる新規のナノ担体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びオリゴコール酸を含み、水性条件下で自己組織化してコアシェル（コラン−ＰＥＧ）構造を形成し、疎水性内相にＰＴＸを担持し得る。これらの両親媒性薬物担持ナノ粒子はそれ自身が治療効果を有すると共に、臨床毒性プロファイルも改善される。より重要なことに、このナノ担体に癌細胞表面標的化リガンド及び／又は腫瘍血管リガンドを付与すれば、毒性治療剤を腫瘍部位に送達することが可能となる。種々の異なるコラン−ＰＥＧ調製物、或いはその組み合わせを用いることにより、ナノ担体の最終サイズ（１０〜１００ｎｍ）を調整することもできる。斯かるナノ担体の成分たるＰＥＧ及びコール酸は、何れも生体適合性を有し、その多くは毒性を有さない。実際に、ＰＴＸナノ治療薬は、マウスモデル及びペットのイヌの抗癌治療において、インビボ（in vivo）投与により安全なプロファイルを示した。しかし、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）の双方で幾分の溶血性活性を示すと共に、一部の薬物の安定性及び担持容量が低下したナノ担体もあった。従って、安定性、生体適合性及び多用途性が改善されたナノ担体を開発する必要がある。

【0005】

本発明は、特定の架橋性官能基をテロデンドリマー（telodendrimers）に導入してナノ粒子を可逆的に架橋することにより、薬物の早期脱落を最少化し、ナノ治療薬のインビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）での安定性を改善することができる、という驚くべき知見に基づくものである。架橋されたナノ治療薬によれば、ナノ担体の組織化、薬物担持容量及び安定性を損なうことなく、治療特性を改善することができるので、上記要請に対処することが可能となる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

ある実施例によれば、本発明は、式Ｉの化合物を提供する。
（ＰＥＧ）_ｍ−Ａ（Ｙ^１）_ｐ−Ｌ−Ｄ（Ｙ^２）_ｑ−（Ｒ）_ｎ （Ｉ）
式中、式ＩのラジカルＡは、少なくとも１のＰＥＧ基に連結される。式ＩのラジカルＤは、単一の焦点基、複数の分岐モノマー単位Ｘ、及び複数の末端基を有する樹枝状ポリマーである。式ＩのラジカルLは、樹枝状ポリマーの焦点基に連結される結合又はリンカーである。式Ｉの各ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。ここで各ＰＥＧポリマーの分子量は１〜１００kDaである。式Ｉの各Rは、例えば樹枝状ポリマーの末端基、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、又は薬物である。但し、Ｒが末端基でない場合、各Ｒは末端基の一つに結合する。式ＩのY^１及びY^２は各々、ボロン酸、ジヒドロキシベンゼン又はチオールの何れかからなる架橋性基である。式Ｉの下付きのmは、整数０〜２０の整数である。式Ｉの下付きのnは、２〜２０の整数である。ここで、下付きのｎは、樹枝状ポリマーの末端基の数に等しい。また、ｎ個のＲ基のうち少なくとも半分は各々独立に、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、又は薬物である。下付きのｐ及びｑは各々０又は２〜８であり、ここで下付きのｐ及びｑの一方は２〜８である。

【0007】

ある実施例によれば、本発明は、内部及び外部を有し、少なくとも２のコンジュゲートを含む、可逆的に架橋されたナノ担体（nanocarrier）であって、各コンジュゲートがポリエチレングリコール（polyethyleneglycol：ＰＥＧ）ポリマーと；親水面及び疎水面の双方を有する少なくとも２の両親媒性化合物と；少なくとも２の架橋性基と；ＰＥＧ、両親媒性化合物、及び架橋性基に共有結合された樹枝状ポリマーとを含み、ここで、各コンジュゲートが水性溶媒中で自己組織化してナノ担体を形成し、各両親媒性化合物の疎水面が相互に対して配向することによって、ナノ担体の内部に疎水ポケットが形成され、ここで各コンジュゲートのＰＥＧがナノ担体の外部に自己組織化し、少なくとも２のコンジュゲートが架橋性基を介して可逆的に架橋された、ナノ担体を提供する。

【0008】

ある実施例によれば、本発明は、本発明の可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消する方法であって、可逆的に架橋されたナノ担体を、架橋結合を開裂するのに適した結合開裂成分と接触させることにより、可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消することを含む方法を提供する。

【0009】

ある実施例によれば、本発明は、疾患を治療する方法であって、斯かる治療を必要とする対象に対して、治療有効量の本発明のナノ担体を投与することを含み、ここでナノ担体が更に薬物を含む方法に関する。薬物は、ナノ担体のコンジュゲートに共有結合していてもよい。

【0010】

ある実施例によれば、本発明は薬物を、それを必要とする対象に送達する方法であって、本発明のナノ担体を対象に投与することを含み、ここでナノ担体は薬物と、複数の架橋結合とを含む方法を提供する。この方法は更に、結合開裂成分を用いて架橋結合を開裂し、ナノ担体から薬物を放出させることにより、薬物を対象に送達することを含む。

【0011】

ある実施例によれば、本発明は、イメージングの方法であって、イメージングの対象に対して有効量の本発明のナノ担体を投与することを含み、ここでナノ担体が造影剤を含む方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、自己組織化の後、チオール化されたテロデンドリマーＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の酸化により形成されたジスルフィド架橋ミセルの概略図を示す。

【0013】

【図2】図２は、酸化時間の関数としての、エルマン試験（Ａ）及びチオール変換（Ｂ）におけるＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセル溶液の吸光度を示す。初期搭載で加えた薬物のレベルに対する、架橋前後のＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルのＰＴＸ搭載（Ｃ）及びサイズ変化（Ｄ）。最終ミセル溶液の容積は、１ｍＬに保たれ、ポリマーの最終濃度は２０ｍｇ／ｍＬに保たれた。ＰＴＸ搭載架橋ミセルのＤＬＳサイズ分布（Ｅ）及びＴＥＭ画像（Ｆ）（ＰＴＸ搭載は４．６ｍｇ／ｍＬであった。ＴＥＭスケールバー：５０ｎｍ）。

【0014】

【図3】図３は、３７℃における、ヒト血漿５０％（ｖ／ｖ）中、１分間（Ａ）、２４時間（Ｂ）での、ＰＴＸ搭載非架橋ミセル（ＮＣＭ）（ＰＴＸ搭載：５．０ｍｇ／ｍＬ）、並びに血漿５０％（ｖ／ｖ）中で、１分間（Ｃ）及び２４時間（Ｄ）での、ＰＴＸ搭載ジスルフィド架橋ミセル（ＤＣＭ）（ＰＴＸ搭載：４．６ｍｇ／ｍＬ）の粒径をそれぞれ示す。２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの非存在（Ｅ）及び存在（Ｆ）下での凍結乾燥ＰＴＸ−ＤＣＭ粉末から再水和されたＰＴＸ−ＤＣＭの粒径。

【0015】

【図4】図４は、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの存在下でＤＬＳによって測定されたＮＣＭ及びＤＣＭの粒径の安定性（Ａ）を示す。ＮＣＭ（Ｂ）、ＤＣＭ（Ｃ）、及び１０ｍのＭＧＳＨで２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの存在下で３０分間処理されたＤＣＭ（Ｄ）（スケールバー：５０ｎｍ）のＴＥＭ画像。

【0016】

【図5】図５は、（Ａ）異なるＧＳＨ濃度でのＤＣＭのＰＴＸ放出プロフィールを示す。ＰＴＸ−ＮＣＭと比較した、新しく調製されたＰＴＸ−ＤＣＭ（Ｂ）及び再水和された凍結乾燥ＰＴＸ−ＤＣＭ（Ｃ）の、特定の放出時間（５時間）にＧＳＨ（１０ｍＭ）を加えることによるＧＳＨ反応性ＰＴＸ放出プロフィール。特定の放出時間（５時間）にＮＡＣ（１０ｍＭ）を加えることによるＰＴＸ−ＤＣＭ（Ｄ）のＮＡＣ反応性ＰＴＸ放出プロフィール。報告されている値は、３連の試料の平均直径±ＳＤである。

【0017】

【図6】図６を、２０ｍのＭＧＳＨ−ＯＥｔで前処理をして、及び前処理をせずに、（Ａ）異なる濃度の空のＮＣＭ及びＤＣＭ；並びに（Ｂ）タキソール（登録商標）、ＴＸ−ＮＣＭ及びＰＴＸ−ＤＣＭと、２時間インキュベーションした後のＳＫＯＶ−３細胞の生存率を示すＭＴＴアッセイ示す。（Ｃ）空のＮＣＭ及びＤＣＭのインビトロ赤血球（ＲＢＣ）溶解。報告されている値は、３連の試料の平均値±ＳＤである。

【0018】

【図7】図７は、ヌードマウスに静注した後の異なる時点で採取された血液における、ボディピー標識（Ａ）及びＤｉＤ搭載（Ｂ）ＤＣＭ及びＮＣＭの蛍光シグナルを示す。

【0019】

【図8】図８は、インビボ及び生体外近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）光学的画像を示す。上：ＳＫＯＶ−３異種移植片をもつマウスのインビボＮＩＲＦ光学的画像は、ＰＴＸ及びＤｉＤを共搭載したＤＣＭの静注後に異なる時点で、コダックイメージングシステムを用いて得た；下：解剖した臓器及び腫瘍の生体外ＮＩＲ造影画像を注射の７２時間後に得た。

【0020】

【図9】図９を、（Ａ）ＳＫＯＶ−３卵巣癌の皮下マウスモデルにおける異なるＰＴＸ製剤の静脈内治療後のインビボ抗腫瘍有効性示す。腫瘍容積が約１００〜２００ｍｍ³（ｎ＝８〜１０）に達したとき、腫瘍をもつマウスに、リン酸緩衝食塩水（対照）及び異なるＰＴＸ製剤を、０、３、６、９、１２、及び１５日目に静注で投与した。（Ｂ）異なる治療群におけるマウスの生存曲線。（Ｃ）３０ｍｇ／ｋｇの投与量で計６回のＰＴＸミセル製剤の投与で治療されたマウスの３群の完全腫瘍反応率。

【0021】

【図10】図１０は、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の化学構造（Ａ）及び概略図（Ｂ）を示す。

【0022】

【図11】図１１は、出発ＰＥＧ５０００及びＰＥＧ^5k−ＣＡ₈テロデンドリマーと比較した、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマーのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを示す。

【0023】

【図12】図１２は、ＣＤＣｌ₃及びＤ₂Ｏ中で記録されたＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマーの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0024】

【図13】図１３は、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの非存在（Ａ）及び１０秒間の存在（Ｂ）下でのＮＣＭの粒径を示す。２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳ（Ｄ）、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳ＋２μＭＧＳＨ（Ｅ）、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳ＋１０ｍのＭＧＳＨ（Ｆ）の４０分間の存在及び非存在（Ｃ）下におけるＤＣＭの粒径。粒径は、動的光散乱（Microtrac）により測定した。

【0025】

【図14】図１４は、タキソール（登録商標）、ＰＴＸ搭載ＮＣＭ、及びＤＣＭからの累積ＰＴＸ放出プロフィールを示す。

【0026】

【図15】図１５は、ＮＣＭ−ＶＣＲ（Ａ）、ＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｂ）、及び架橋後のＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｃ）の粒径を示す。架橋後のＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｄ）のＴＥＭ画像（スケールバー：５０ｎｍ）。ビンクリスチン（ＶＣＲ）搭載は、テロデンドリマー対ＶＣＲ（ｗ／ｗ）、２０：１であった。

【0027】

【図16】図１６は、ミセル破壊条件下におけるＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲの粒径を示す。ＮＣＭ−ＶＣＲ（Ａ）及びＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｃ）は、５０％ヒト血漿（ｖ／ｖ）中で２４時間、３７℃にてインキュベーションした。更に、ＮＣＭ−ＶＣＲ（Ｂ）及びＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｄ）を２ｍｇ／ｍＬに希釈し、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳとともに３０分間インキュベーションした。ＤＣＭ−ＶＣＲ（Ｅ）を、ＳＤＳ及び２０ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の双方とインキュベーションした。

【0028】

【図17】図１７は、従来のＶＣＲ、ＮＣＭ−ＶＣＲ、及びＤＣＭ−ＶＣＲ（Ａ）の薬物放出プロフィールを示す。沈んだ状態を維持するのに１０ｇ／Ｌのチャコールの存在下で、ＶＣＲ製剤を１ＬのＰＢＳに対して３７℃にて透析した。従来のＶＣＲ、ＮＣＭ−ＶＣＲ、及びＤＣＭ−ＶＣＲのインビトロ細胞毒性を、７２時間連続（Ｂ）、又は２時間処理して洗浄し、次に７０時間インキュベーションした（Ｃ）ラージ細胞中で評価した。細胞の生存率は、ＭＴＳアッセイを用いて測定した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５。

【0029】

【図18】図１８は、生体外近赤外蛍光光学的画像を示す。ラージ腫瘍をもつマウスに、遊離ＤｉＤ又はＶＣＲ及びＤｉＤで共搭載したＤＣＭ（ＤＣＭ−ＶＣＲ／ＤｉＤ）を静注した。注射の７２時間後に、腫瘍及び主な臓器を摘出し、６２５／７００ｎｍの励起／発光フィルターを用いて撮像した。

【0030】

【図19】図１９は、ＰＢＳ、従来のＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇ）、１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣの存在又は非存在下でのＤＣＭ−ＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇ）、又はＤＣＭ−ＶＣＲ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で治療したラージ腫瘍をもつヌードマウスのインビボ抗腫瘍有効性（Ａ）及び体重減少（Ｂ）を示す。矢印は、マウスが治療された日を示す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００５。

【0031】

【図20】図２０は、ＰＢＳ（Ａ）、従来のＶＣＲ１ｍｇ／ｋｇ（Ｂ）、及びＤＣＭ−ＶＣＲ２．５ｍｇ／ｋｇ（Ｃ）群からのマウス（ｎ＝３）を、最終治療の８日後に殺処分し、坐骨神経を解剖したことを示す。神経をエポキシブロックの中にて処理し、５００ｎｍ切片を切り取り、スライド上に取って、メチレンブルー及びアズールＢ染色で染色した。

【0032】

【図21】図２１は、テロデンドリマーペア［ＰＥＧ^5k−（ボロン酸／カテコール）₄−ＣＡ₈］の概略図、及びマンニトール及び／又は酸性のｐＨに応えて結果として生じるボロン酸架橋ミセル（ＢＣＭ）を示す。

【0033】

【図22】図２２は、（Ａ）ｐＨ７．４のＰＢＳ中でＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈（０〜０．５ｍＭ）の異なる割合で、ＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈（０．１ｍＭ）により形成されるミセルと混合して際の、ＡＲＳ（０．１ｍＭ）の蛍光強度を示す。励起：４６８ｎｍ。（Ｂ）マンニトールを加えるか、又は溶液のｐＨを５．０に調整した時間である（矢印を参照）１２０分間ＳＤＳ中のＮＣＭ及びＳＤＳ中のＢＣＭ４の連続動的光散乱測定。ＰＢＳ中のＢＣＭ４（Ｃ１）、１２０分間ＳＤＳ中のＢＣＭ４（Ｃ２）、１２０分間ＳＤＳ中で、次に溶液のｐＨを５．０に２０分間調製したＢＣＭ４（Ｃ３）、及び１２０分間ＳＤＳ中で、次にマンニトール（１００ｍＭ）で２０分間処理したＢＣＭ４（Ｃ４）のＴＥＭ画像（スケールバー：１００ｎｍ）。

【0034】

【図23】図２３は、ＮＣＭの放出プロフィールと比較した、ジオール（マンニトール及びグルコース）並びに／又はｐＨ５．０で５時間処理することによる（Ａ）ＢＣＭ４のｐＨ−及びジオール−反応性パクリタキセル（ＰＴＸ）放出プロフィールを示す。（Ｂ）ｐＨ５．０での１００ｍＭのマンニトールで処理して、又は処理しないで、タキソール（登録商標）、ＰＴＸ−ＮＣＭ及びＰＴＸ−ＢＣＭ４と１時間インキュベーションし、続いてＰＢＳでの３時間洗浄、及び更なる２３時間インキュベーションした後のＳＫＯＶ−３細胞の生存率を示すＭＴＴアッセイ。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。

【0035】

【図24】図２４は、ｐＨ７．４におけるＰＢＳ（Ａ）及びＤＭＳＯ（Ｂ）中のＦＲＥＴ−ＮＣＭの略図；（Ｃ）４８０ｎｍ励起でのＰＢＳ（赤線）及びＤＭＳＯ（黒線）中のＦＲＥＴ−ＮＣＭ蛍光発光スペクトルを示す。（Ｄ）４８０ｎｍ励起でのＰＢＳ（赤線）及びＤＭＳＯ（黒線）中のＦＲＥＴ−ＢＣＭ４の発光スペクトル。（Ｅ）１００μＬのＦＲＥＴ−ＮＣＭ及びＦＲＥＴ−ＢＣＭ４（２．０ｍｇ／ｍＬ）静注後の経時的な、ヌードマウス（ｎ＝３）の血液中のＦＲＥＴ比（Ｉ_{ローダミンB}／（Ｉ_{ローダミンB}＋Ｉ_DiO））。励起：４８０ｎｍ。（Ｆ）ヌードマウス（ｎ＝３）に静注した後の異なる時点で採取した血液中の、ローダミンＢ結合ＮＣＭ及びＢＣＭ４の蛍光シグナル変化。励起：５４０ｎｍ。（Ｇ）ＳＫＯＶ−３異種移植片をもつマウスの生体外近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）画像を、ＰＴＸ及びＤｉＤを共搭載したＢＣＭ４の静注後に得た。

【0036】

【図25A】図２５Ａ〜Ｃは、カテコール含有テロデンドリマー及びボロン酸含有テロデンドリマーの合成スキーム（Ａ、Ｂ、及びＣ）を示す。ボロン酸含有テロデンドリマーのピナコールエステルは、最終工程でＤＣＭ／ＴＦＡ（１／１、ｖ／ｖ）によって除去した。ＰＥＧ^5k−ＢＡ₂−ＣＡ₈の合成スキームを一例として示した。

【図25B】同上。

【図25C】同上。

【0037】

【図26】図２６は、カテコール（Ａ）含有テロデンドリマー並びにボロン酸（Ｂ及びＣ）含有テロデンドリマーの化学構造を示す。

【0038】

【図27】図２７は、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈テロデンドリマーと比較して、出発ＰＥＧ、及び代表的なテロデンドリマーペア（ＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈／ＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを示す。ピナコールエステルの形式のＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈を示した。

【0039】

【図28】図２８は、対応する低分子３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸及び３，４−ジヒドロキシ安息香酸並びにＰＥＧ^5k−ＣＡ₈テロデンドリマーと比較した、ＤＭＳＯ−ｄ６中で記録された、代表的なテロデンドリマーペア（ＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈／ＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈）の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0040】

【図29】図２９は、動的光散乱（Microtrac（登録商標））によって測定された、ＮＣＭ、ＢＣＭ１、ＢＣＭ２、ＢＣＭ３、及びＢＣＭ４の粒径を示す。

【0041】

【図30】図３０は、血漿５０％（ｖ／ｖ）の非存在（Ａ）及び２４時間存在（Ｂ）下でのＮＣＭの粒径；２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの１０秒間存在下でのＮＣＭの粒径（Ｃ）；血漿５０％（ｖ／ｖ）の非存在（Ｄ）、及び２４時間存在（Ｅ）下でのＢＣＭ４の粒径；２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの１２０分間存在下でのＢＣＭ４の粒径（Ｆ）；１２０分間ＳＤＳ中で、次に溶液のｐＨを５．０に２０分間調製したＢＣＭ４の粒径（Ｇ）、１２０分間ＳＤＳ中で、次にマンニトール（１００ｍＭ）で２０分間処理したＢＣＭ４の粒径（Ｈ）、１２０分間ＳＤＳ中で、次にグルコース（１００ｍＭ）で２０分間処理したＢＣＭ４の粒径（Ｉ）を示す。粒径は動的光散乱（Microtrac）により測定した。ミセルの濃度はＰＢＳ中で１．０ｍｇ／ｍＬに保った。

【0042】

【図31】図３１は、２．５ｍｇ／ｍＬのＳＤＳの存在下、ｐＨ７．４でのＤＬＳによる連続粒径測定を示す。ミセルの濃度は１．０ｍｇ／ｍＬに保った。

【0043】

【図32】図３２は、（Ａ）異なるｐＨレベル及び（Ｂ）異なる濃度のマンニトール（Ｍａｎ）又はグルコース（Ｇｌｕ）の存在下での、９時間時の、ＮＣＭ、ＢＣＭ３及びＢＣＭ４からのＰＴＸ放出を示す。（Ｃ）ｐＨ７．４でのＮＣＭの放出プロフィールと比較した、異なるｐＨレベル（５．０及び７．４）並びにマンニトール（１００ｍＭ）の存在下でのＢＣＭ４の累積ＰＴＸ放出プロフィール。

【0044】

【図33】図３３は、パクリタキセル、無架橋及びボロン酸−カテコール架橋ナノ粒子さまざまな製剤の、ナノ粒子薬物の各投与の２４時間後にマンニトールを添加した、及び添加しない治療効果（腫瘍サイズ）を示す。

【0045】

【図34】図３４は、ナノ担体に搭載した静脈投与デキサメタゾン（Ｄｅｘ）が、等しい投与量のＤｅｘ単独静注と比べて、より大幅に肺洗浄好酸球計数を減少することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

Ｉ．概要
本発明は、架橋性基を有するテロデンドリマーを提供し、ここでテロデンドリマーから形成されるナノ担体ミセルが架橋され、ナノ担体ミセルの安定性を向上する。架橋性基は、樹枝状ポリマーそのものに存在することができ、又は樹枝状ポリマーとＰＥＧ基との間の連結部分に存在することができる。自己反応する能力があるもの、又は互いと反応する官能基の相補的なペアなど、任意の好適な架橋性基を使用することができる。

【0047】

ＩＩ．定義
本明細書で使用される場合、「デンドリマー」及び「樹枝状ポリマー」という用語は、焦点、複数の分岐モノマー単位、及び複数の末端基を含有する分岐ポリマーを指す。モノマーは、共に連結して、焦点から延びて末端基にて終結するアーム（arms）（又は「デンドロン」）形成する。デンドリマーの焦点は、本発明の化合物の他の部分に結合することができ、末端基は、付加的な化学的構成部分で更に官能化してもよい。

【0048】

本明細書で使用される場合、「テロデンドリマー」という用語は、親水性のＰＥＧ部分、及びデンドリマーの１以上の末端基に共有結合する１以上の化学的構成部分を含有するデンドリマーを指す。これらの構成部分としては、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、及び薬物が挙げられるが、これらに限定されない。異なる構成部分は、直交保護基戦略（orthogonal protecting group strategies）を用いて、所望の末端基に選択的に設けられうる。

【0049】

本明細書で使用される場合、「ちょうネクタイ型（bow-tie）デンドリマー」又は「ちょうネクタイ型テロデンドリマー」という用語は、デンドリマー及び分岐したＰＥＧ部分などの、リンカー部分を用いてその焦点に共に連結する２の分岐したセグメントを含有するデンドリマーを指す。

【0050】

本明細書で使用される場合、「ナノ担体」という用語は、本発明のデンドリマーコンジュゲートの凝集に由来するミセルを指す。ナノ担体は、疎水性のコア及び親水性の外部を有する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「モノマー」及び「モノマー単位」という用語は、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸、及びヒドロキシルアミノカルボン酸を指す。本発明のジアミノカルボン酸基としては、例えば、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン）、２，６−ジアミノヘキサン酸（リシン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ‐２−（２−アミノエチル）酪酸、及び５−アミノ‐２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のジヒドロキシカルボン酸基としては、例えば、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、及び２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸が挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロキシルアミノカルボン酸としては、例えば、セリン及びホモセリンが挙げられるが、これらに限定されない。他のモノマー単位が、本発明において有用であることを当業者なら理解するであろう。

【0052】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、カルボン酸をもつアミン官能基を指す。アミノ酸は、上記のジアミノカルボン酸を含む。アミノ酸は天然に存在するα−アミノ酸を含み、ここで、アミンはカルボン酸のカルボニル炭素に隣接する炭素に結合する。天然に存在するα−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、及びＬ−アルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸はまた、天然に存在するα−アミノ酸のＤ−鏡像異性体、並びにβ−アミノ酸及び他の天然に存在しないアミノ酸を含み得る。

【0053】

本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、１のデンドリマーコンジュゲートのセグメントを別のセグメントに連結する化学構成部分を指す。リンカーをデンドリマーのセグメントに連結するのに用いられる結合のタイプとしては、アミド、アミン、エステル、カルバミン酸塩、尿素、チオエーテル、チオカルバミン酸塩、チオ炭酸塩、及びチオ尿素が挙げられるが、これらに限定されない。結合の他のタイプが本発明において有用であることを、当業者なら理解するであろう。

【0054】

本明細書で使用される場合、「オリゴマー」という用語は、上記のように共有結合的に連結された５以下のモノマーを指す。モノマーは、線形形式又は分岐形式で結合し得る。オリゴマーは、テロデンドリマーの分岐したセグメントの焦点として機能し得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、「疎水性基」という用語は、水に不溶、又は水にはじかれる化学構成部分を指す。疎水性基としては、例えば、長鎖アルカン及び脂肪酸、フルオロ炭素、シリコーン、コレステロールなどのある種のステロイド、並びに例えば、ポリスチレン及びポリイソプレンを含む多くのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

本明細書で使用される場合、「親水性基」という用語は、水に溶ける又は水を引き付ける化学構成部分を指す。親水性基としては、例えば、アルコール、短鎖カルボン酸、第４級アミン、スルホン酸塩、リン酸塩、糖、及びＰＥＧなどのある種のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0057】

本明細書で使用される場合、「両親媒性化合物」という用語は、疎水性の部分及び親水性の部分の双方を有する化合物を指す。例えば、本発明の両親媒性化合物は、化合物の１の親水面及び化合物の１の疎水面を有することができる。本発明において有用な両親媒性化合物としては、限定されないが、コール酸並びにコール酸アナログ及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0058】

本明細書で使用される場合、「コール酸」という用語は、（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，７，１２−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸を指す。コール酸は、３α，７α，１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン酸；３−α，７−α，１２−α−トリヒドロキシ−５−β−コラン−２４−オイック酸；１７−β−（１−メチル−３−カルボキシプロピル）エチオコラン−３α，７α，１２α−トリオール；コラール酸（cholalic acid）；及びコラリンとしても知られる。アロコール酸、ピトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などのコール酸誘導体及びアナログもまた本発明において有用である。コール酸誘導体は、ミセル安定性及び膜活性などのテロデンドリマー組織化に由来するナノ担体の性質を調節するように設計されることができる。例えば、コール酸誘導体は、１以上のグリセロール基、アミノプロパンジオール基、又は他の基で修飾される親水面を有することができる。

【0059】

本明細書で使用される場合、「薬物」又は「治療薬」という用語は、病態又は疾患を治療及び／又は改善する能力がある薬剤を指す。薬物は、水をはじく任意の薬物である疎水性薬物であり得る。本発明において有用な疎水性薬物としては、パクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ−３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アムホテリシン、イキサベピロン、パツピロン（エポチロン類）、ラパマイシン、及び白金剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬物はまた、プロドラッグの形も含む。他の薬物が本発明において有用であることを、当業者なら理解するであろう。

【0060】

本明細書で使用される場合、「架橋性基（crosslinkable group）」又は「架橋性基（crosslinking group）」という用語は、例えば、第２の樹枝状ポリマー上の第２架橋性基に結合する第１樹枝状ポリマー上の第１架橋性基など、別の分子上の類似する基又は相補的な基に結合する能力がある官能基を指す。本発明における架橋性（crosslinkable）及び架橋性（crosslinking）基として好適な基は、システインなどのチオール、ボロン酸、及びカテコールなどの１，２−ジヒドロキシベンゼンを含む１，２−ジオールを含む。架橋性（crosslinkable）及び架橋性（crosslinking）基を混ぜ合わせたとき、それらは、ジスルフィド及びボロン酸エステルなどの架橋結合を形成する。他の架橋性（crosslinkable）及び架橋性（crosslinking）基が、本発明に好適である。

【0061】

本明細書で使用される場合、「結合開裂成分」という用語は、本発明の架橋性（crosslinkable）及び架橋性（crosslinking）基を用いて形成された架橋結合を開裂する能力がある薬剤を指す。結合開裂成分は、架橋結合がジスルフィドである場合、グルタチオンなどの還元剤であり、又は架橋結合がボロン酸及び１，２−ジオールから形成される場合、マンニトールであることができる。

【0062】

本明細書で使用される場合、「造影剤」という用語は、体の器官、組織、又は系を撮像することを可能にする化学薬品を指す。好ましい造影剤は、常磁性剤、光学プローブ、及び放射性核種を含む。

【0063】

本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、軽減；寛解；症状の減退、又は症状、損傷、病変若しくは病態を患者にとってより耐容可能にすること；症状若しくは病態の頻度若しくは期間を減じること；又は、時として、症状若しくは病態の発現を予防することなどの任意の客観的又は主観的パラメーターを含む、損傷、病変、病態、又は症状（例えば、痛み）の治療又は改善における成功の任意の兆候を指す。症状の治療又は改善は、例えば、身体検査の結果を含む、任意の客観的又は主観的パラメーターを基にすることができる。

【0064】

本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、限定されないが、霊長類（例えばヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む哺乳類などの動物を指す。ある実施形態では、対象はヒトである。

【0065】

本明細書で使用される場合、「治療有効量若しくは投与量」又は「治療上充分な量若しくは投与量」又は「効果的若しくは充分な量若しくは投与量」という用語は、投与に対して治療効果をもたらす投与量を指す。正確な投与量は、治療の目的によって決まることになり、公知の技術を用いて当業者により確かめられるであろう（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999);及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkinsを参照されたい）。感作細胞では、治療上効果的な投与量は、多くの場合、非感作細胞に対する従来の治療上効果的な投与量と比べて、低量であることができる。

【0066】

ＩＩＩ．テロデンドリマー
本発明は、親水性のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分及び疎水性の部分を有する架橋性テロデンドリマーコンジュゲートを提供する。ＰＥＧ部分は、１以上のＰＥＧ鎖を含む分岐構造又は線形構造を有することができる。テロデンドリマーの疎水性の部分は、コール酸によってもたらされることができ、疎水面及び親水面を有する。コール酸及びＰＥＧは、多様な酸の繰り返し単位を含有することができるオリゴマー及び／又はポリマーによってつなげられる。典型的には、オリゴマー及びポリマーは、ジアミノカルボン酸、リシンを含んでなる。また、テロデンドリマーは、架橋性基で官能化される。テロデンドリマーは、溶液中で凝集して疎水性の内部及び親水性の外部をもつミセルを形成することができ、ナノ担体として使用され、水溶性の低い薬物又は他の薬剤を送達することができる。ミセル形成に続いて、テロデンドリマーは架橋性基を用いて架橋され、より安定なミセルを形成することができる。

【0067】

本発明は、デンドリマー末端にコール酸基及び他の構成部分、並びに架橋性基を含有するペグ化されたデンドリマーを提供し、テロデンドリマーと呼ばれる。幾つかの実施形態では、本発明は式Ｉの化合物：
（ＰＥＧ）_m−Ａ（Ｙ¹）_p−Ｌ−Ｄ（Ｙ²）_q−（Ｒ）_n （Ｉ）
を提供し、式中、式ＩのＡ基は、少なくとも１のＰＥＧ基に連結する。式ＩのＤ基は、単一の焦点基と、複数の分岐モノマー単位Ｘと、複数の末端基とを有する樹枝状ポリマーである。式ＩのＬ基は、樹枝状ポリマーの焦点基に連結される結合又はリンカーである。式Ｉの各ＰＥＧは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーであって、ここで各ＰＥＧポリマーは、１〜１００ｋＤａの分子量を有する。式Ｉの各Ｒは、樹枝状ポリマーの末端基、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、又は薬物であることでき、ここで、末端基でないＲは各々、末端基の一つに結合する。式Ｉの各Ｙ¹及びＹ²は、ボロン酸、ジヒドロキシベンゼン、又はチオールのいずれかであることができる架橋性基である。式Ｉの下付きのｍは、０〜２０の整数である。式Ｉの下付きのｎは、２〜２０の整数であり、ここで、下付きのｎは、樹枝状ポリマーの末端基の数に等しく、ここで、ｎ個のＲ基のうち少なくとも半分は、各々、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、及び薬物であることができる。また、下付きのｐ及びｑは各々、０又は２〜８、ここで下付きのｐ及びｑの一方は２〜８である。

【0068】

Ａ基は、ＰＥＧをリンカー又は樹枝状ポリマーＤに連結する能力がある任意の好適な基であることができる。好適なＡ基は、樹枝状ポリマーに関する下記のモノマー単位Ｘを含む。幾つかの実施形態では、Ａ基はリシンのモノマー又はオリゴマーである。幾つかの実施形態では、Ａ基はリシンである。Ａ基は、直接的に又はリンカーを介して、架橋性基又は造影剤に連結されることができる。また、幾つかの実施形態では、Ａ基は少なくとも１の造影剤を含む。本発明のテロデンドリマーに結合するのに有用な造影剤としては、蛍光色素、キレート、及び放射性金属が挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

樹枝状ポリマーは、任意の好適な樹枝状ポリマーであることができる。樹枝状ポリマーは、アミノ酸又は他の二官能性ＡＢ２−型モノマーを含む、分岐モノマー単位から作られることができ、ここで、Ａ及びＢは、結果として得られるポリマー鎖が、Ａ−Ｂ結合が形成される分岐点を有するように、共に反応する能力がある２の異なる官能基である。幾つかの実施形態では、各分岐モノマー単位Ｘは、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸、及びヒドロキシルアミノカルボン酸であることができる。幾つかの実施形態では、各ジアミノカルボン酸は、２，３−ジアミノプロパン酸、２，４−ジアミノブタン酸、２，５−ジアミノペンタン酸（オルニチン），２，６−ジアミノヘキサン酸（リシン）、（２−アミノエチル）−システイン、３−アミノ−２−アミノメチルプロパン酸、３−アミノ−２−アミノメチル−２−メチルプロパン酸、４−アミノ‐２−（２−アミノエチル）酪酸、又は５−アミノ‐２−（３−アミノプロピル）ペンタン酸であることができる。幾つかの実施形態では、各ジヒドロキシカルボン酸は、グリセリン酸、２，４−ジヒドロキシ酪酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）酪酸、セリン、又はトレオニンであることができる。幾つかの実施形態では、各ヒドロキシルアミノカルボン酸は、セリン又はホモセリンであることができる。幾つかの実施形態では、ジアミノカルボン酸はアミノ酸である。幾つかの実施形態では、分岐モノマー単位Ｘは各々、リシンである。

【0070】

テロデンドリマーの樹枝状ポリマーは、世代１、２、３、４、又は５以上を含む、デンドリマーの任意の好適な世代であることができ、ここで、デンドリマーの各「世代」は、デンドリマーの１の分岐の後の焦点と末端基との間に見られる分岐点の数を指す。テロデンドリマーの樹枝状ポリマーはまた、１．５、２．５、３．５、４．５、５．５、などの部分的な世代であることができ、ここでデンドリマーの分岐点は、単一の分岐のみである。樹枝状ポリマーの多様な構造は、任意の好適な数の末端基をもたらすことができ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は３２末端基が挙げられるが、これらに限定されない。

【0071】

テロデンドリマー又はテロデンドリマー部分の焦点は、任意の好適な官能基でありうる。幾つかの実施形態では、焦点は、テロデンドリマー又はテロデンドリマー部分の別の部分への結合を可能にさせる官能基を含む。焦点官能基は、求核性基であることができ、例えば、アルコール、アミン、チオール、又はヒドラジンが挙げられるが、これらに限定されない。焦点官能基はまた、アルデヒド、カルボン酸、又は酸塩化物若しくはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを含むカルボン酸誘導体などの求電子剤でありうる。

【0072】

テロデンドリマー末端に据えられたＲ基は、親水性基、疎水性基、又は両親媒性化合物を含む、任意の好適な化学構成部分であることができる。疎水性基としては、例えば、長鎖アルカン及び脂肪酸、フルオロ炭素、シリコーン、コレステロールなどのある種のステロイド、並びに、例えば、ポリスチレン及びポリイソプレンを含む多くのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。親水性基としては、例えば、アルコール、短鎖カルボン酸、アミン、スルホン酸塩、リン酸塩、糖、及びＰＥＧなどの多くのポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。両親媒性化合物としては、例えば、１の親水面及び１の疎水面を有する分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0073】

本発明において有用な両親媒性化合物としては、コール酸並びにコール酸アナログ及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。「コール酸」とは、下記構造：

【化1】

を有する（Ｒ）−４−（（３Ｒ，５Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）−３，７，１２−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ペンタン酸を指す。

【0074】

コール酸誘導体及びアナログとしては、アロコール酸、ピトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、及びケノデオキシコール酸が挙げられるが、これらに限定されない。コール酸誘導体は、ミセル安定性及び膜活性などのテロデンドリマーアセンブリに由来するナノ担体の性質を調節するように設計することができる。例えば、コール酸誘導体は、１以上のグリセロール基、アミノプロパンジオール基、又は他の基で修飾される親水面を有することができる。

【0075】

また、テロデンドリマー末端基は、パクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、ＳＮ−３８、シクロスポリンＡ、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アムホテリシン、イキサベピロン、パツピロン（エポチロン類）、ラパマイシン、及び白金剤などの薬物を含みうる。本発明において有用であることを、当業者なら理解するであろう。

【0076】

幾つかの実施形態では、各Ｒは、コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７−ヒドロキシ−３，１２−ジ（２，３−ジヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、（３α，５β，７α，１２α）−７，１２−ジヒドロキシ−３−（３−アミノ‐２−ヒドロキシ−１−プロポキシ）−コール酸、ギ酸コレステロール、ドキソルビシン、又はレインであることができる。幾つかの実施形態では、各Ｒはコール酸であることができる。

【0077】

テロデンドリマー骨格は、分岐の数、並びに末端基及びＲ基の数及び化学的性質により変化することができ、溶液構造、レオロジー特性、及び他の特徴を調節することになる。テロデンドリマーは、末端基任意の好適な数及びＲ基任意の好適な数を有することができる。幾つかの実施形態では、ｎは、２〜７０、２〜５０、２〜３０、又は２〜１０であることができる。下付きのｎは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０であることができる。幾つかの実施形態では、下付きのｎは、２〜１０、２〜８、又は４〜８であることができる。幾つかの実施形態では、ｎは２〜２０である。

【0078】

テロデンドリマーは、末端に単一のタイプのＲ基、又は任意の好適な割合で任意に組み合わせたＲ基を有することができる。例えば、ｎ個のＲ基のうち少なくとも半分は、疎水性基、親水性基、両親媒性化合物、薬物、又はその任意の組み合わせであることができる。幾つかの実施形態では、ｎ個のＲ基のうち半分は、両親媒性化合物である。

【0079】

幾つかの実施形態では、各Ｒ基は同一である。幾つかの実施形態では、２の異なる両親媒性基、両親媒性基及び薬物、両親媒性基及び樹枝状ポリマー末端基、２の異なる薬物、又は薬物及び樹枝状末端基などの、少なくとも２の異なるＲ基が存在する。

【0080】

リンカーＬは、任意の好適なリンカーを含むことができる。概して、リンカーは二官能性リンカーであり、２のテロデンドリマー部分の各々と反応する２の官能基を有する。幾つかの実施形態では、リンカーはヘテロ二官能性リンカーであることができる。幾つかの実施形態では、リンカーはホモ二官能性リンカーであることができる。幾つかの実施形態では、リンカーＬは、ポリエチレングリコール、ポリセリン、ポリグリシン、ポリ（セリン−グリシン）、脂肪族アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、５−アミノペンタン酸、４−アミノブタン酸、又はβ−アラニンであることができる。リンカーのサイズ及び化学的性質が、連結されるテロデンドリマーセグメントの構造に基づいて変化できることを当業者なら理解するであろう。

【0081】

幾つかの実施形態では、リンカーＬは下記の式：

【化2】

を有するＥｂｅｓリンカーである。

【0082】

任意のサイズ及び構造のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは、本発明のナノ担体に有用である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは１〜１００ｋＤａである。その他の実施形態では、ＰＥＧは１〜１０ｋＤａである。幾つかの他の実施形態では、ＰＥＧは約３ｋＤａである。更に他の実施形態では、付加的なＰＥＧポリマーが両親媒性化合物に連結する。例えば、両親媒性化合物がコール酸場合、最大で３のＰＥＧポリマーが、各コール酸に連結する。両親媒性化合物に連結されたＰＥＧポリマーは、２００〜１０，０００Ｄａの大きさである。更なる他の実施形態では、両親媒性化合物に連結されたＰＥＧポリマーは、１〜５ｋＤａの大きさである。他のＰＥＧポリマー及び他の親水性のポリマーが本発明において有用であることを当業者なら理解するであろう。ＰＥＧは任意の好適な長さであることができる。

【0083】

任意の好適な数のＰＥＧ基が存在することができる。例えば、下付きのｍは、０、１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０であることができる。また、下付きのｍは、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、１〜５、１〜４、又は１〜３であることができる。幾つかの実施形態では、下付きのｍは１である。

【0084】

本発明の化合物に好適な架橋性基は、別のテロデンドリマーに同一の官能基と共有結合、又は別のテロデンドリマーに相補的官能基と共有結合を形成する能力がある任意の官能基を含むことができる。同一の官能基と共有結合を形成する能力がある官能基は、チオールを含む。本発明の化合物に有用なチオールは、システインなどの任意のチオールを含む。

【0085】

共有結合を形成する能力がある相補的官能基は、ボロン酸及び１，２−ジオールを含む。本発明の化合物に有用なボロン酸としては、フェニルボロン酸、２−チエニルボロン酸、メチルボロン酸、及びプロペニルボロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好適な１，２−ジオールは、アルキル−１，２−ジオール及びカテコールなどのフェニル−１，２−ジオールを含む。

【0086】

幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹及びＹ²は各々、ボロン酸、ジヒドロキシベンゼン、又はチオールのいずれかであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹及びＹ²は各々、ボロン酸又はジヒドロキシベンゼンのいずれかであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹及びＹ²は各々、フェニルボロン酸又はジヒドロキシベンゼンであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹は各々、フェニルボロン酸又はジヒドロキシベンゼンであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹は各々、カルボキシフェニルボロン酸、カルボキシニトロフェニルボロン酸又は３，４−ジヒドロキシ安息香酸であることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹及びＹ²は各々、チオールであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ¹及びＹ²は各々、システインであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基Ｙ²は各々、システインであることができる。

【0087】

幾つかの実施形態では、式Ｉの化合物は、下記構造：
ＰＥＧ−Ａ（Ｙ¹）_p−Ｄ−（Ｒ）_n （Ｉａ）
を有し、式中、下付きのｐは２〜８の整数であり、下付きのｑは０である。

【0088】

幾つかの実施形態では、式の化合物は、下記構造：

【化3】

を有し、式中、各Ｌ’はリンカーＥｂｅｓであり、ＰＥＧはＰＥＧ５ｋであり、Ｒは各々コール酸であり、分岐モノマー単位Ｘは各々、リシンであり、並びにＹ¹は、カルボキシフェニルボロン酸、カルボキシニトロフェニルボロン酸、及び３，４−ジヒドロキシ安息香酸であることができる。

【0089】

その他の実施形態では、式Ｉの化合物は、下記構造：
ＰＥＧ−Ａ−Ｄ（Ｙ²）_q−（Ｒ）_n （Ｉｂ）
を有し、式中、下付きのｐは０であり、下付きのｑは２〜８の整数である。

【0090】

幾つかの実施形態では、式の化合物は、下記構造：

【化4】

を有し、式中、Ａはリシンであり、各Ｌ’はリンカーＥｂｅｓであり、ＰＥＧはＰＥＧ５ｋであり、各Ｒはコール酸であり、各分岐モノマー単位Ｘはリシンであり、各Ｙ²はシステインである。

【0091】

本発明の化合物及びコンジュゲートは、当業者に公知の方法により調製されることができる。例えば、確立された段階的Ｆｍｏｃペプチド化学法が、本発明のコンジュゲート化合物及び調製に採用され、明確に定義されたポリマー構造を有するチオール化されたテロデンドリマーを結果としてもたらす。１の例では、化合物及びコンジュゲートが、構造中のＰＥＧの長さ、並びにシステイン、親水性のスペーサー、及びコール酸の数に対応するＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈として設計される。図に示されるように、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈は、ポリ（リシン−システイン−Ｅｂｅｓ）主鎖を通して線形ＰＥＧの１の末端に結合されたコール酸の樹枝状オリゴマーを含む。前述のように、チオールを含まないテロデンドリマー、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈もまた、比較のために合成された。ボディピーなどの蛍光色素が、Ｄｄｅ保護基を除去した後に、ＰＥＧとオリゴコール酸鎖との間の分岐合流点のリシンのε−アミノ基の結合されることができる。

【0092】

ＩＶ．ナノ担体
本発明のテロデンドリマーは凝集して、疎水性のコア及び親水性の外部をもつナノ担体を形成し、そこでは、架橋性基がそれに続いて架橋され、結果として生じるナノ担体に、更なる安定性をもたらす。

【0093】

幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２のコンジュゲートを含む、内部及び外部を有するナノ担体を提供し、ここで、各コンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、親水面及び疎水面の双方を有する少なくとも２の両親媒性化合物、少なくとも２の架橋性基、並びにＰＥＧ、両親媒性化合物、及び架橋性基に共有結合された樹枝状ポリマーを含み、ここで各コンジュゲートは、ナノ担体の内部に疎水ポケットが形成されるように水性溶媒中で自己組織化してナノ担体を形成し、ここで、各化合物のＰＥＧは、ナノ担体の外部に自己組織化し、並びにここで、少なくとも２のコンジュゲートは、架橋性基を介して可逆的に架橋される。

【0094】

幾つかの実施形態では、各コンジュゲートは、本発明のコンジュゲートであることができる。

【0095】

上記のように、架橋性基は、任意の好適な架橋された基であることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基は、チオール、ボロン酸、又はジヒドロキシベンゼンであることができる。幾つかの実施形態では、架橋性基は、チオールであることができる。幾つかの実施形態では、第１のコンジュゲートの群は、ボロン酸架橋性基を含み、第２のコンジュゲートの群は、ジヒドロキシベンゼン架橋性基を含む。

【0096】

幾つかの実施形態では、ナノ担体はまた、疎水性薬物又は造影剤を含み、ここで、疎水性薬物又は造影剤は、ナノ担体の疎水ポケット内に隔離されている。本発明のナノ担体に有用な疎水性薬物は、低水溶性の任意の薬物を含む。幾つかの実施形態では、ナノ担体中の疎水性薬物は、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド及びドキソルビシン、ドセタキセル、ダウノルビシン、ＶＰ１６、プレドニゾン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス、並びにカルムスチンであることができる。

【0097】

幾つかの実施形態では、ナノ担体は、光学プローブ、放射性核種、常磁性剤、金属キレート、又は薬物に随意に連結された、少なくとも１のモノマー単位を含む。薬物は、多様な親水性又は疎水性薬物であることができ、本発明のナノ担体の内部に隔離されている疎水性薬物に限定されない。

【0098】

ナノ担体中に隔離されることができる、又は本発明のコンジュゲートに連結されることができる薬物としては、細胞増殖抑制剤、細胞毒性剤（限定されないが、例えば、ＤＮＡ相互作用剤（DNA interactive agent）（シスプラチン又はドキソルビシンなど）；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼＩＩ抑制剤（エトポシドなど）；トポイソメラーゼＩ抑制剤（イリノテカン（若しくはＣＰＴ−１１）、カンプトスター（camptostar）、又はトポテカンなど）；チューブリン相互作用剤（パクリタキセル、ドセタキセル、又はエポチロンなど）；ホルモン剤（タモキシフェンなど）；チミジル酸合成酵素阻害剤（５−フルオロウラシルなど）；代謝拮抗剤（メトトレキサートなど）；アルキル化剤（テモゾロマイド（ニュージャージー州ケニルワース、シェリング・プラウ社のテモダール（TEMODAR）（商標）、シクロホスファミドなど）；アロマターゼ配合剤；ａｒａ−Ｃ、アドリアマイシン、シトキサン、及びゲムシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。本発明のナノ担体中で有用な他の薬物としては、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスフォルアミン（Triethylenethiophosphoramine）、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンホスフェート（Fludarabine phosphate）、オキサリプラチン、ロイコボリン、オキサリプラチン(フランスのＳａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のELOXATIN（商標））、ペントスタチン（Pentostatine）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、L-アスパラギナーゼ、テニポシド、１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール（Megestrolacetate）、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン（Hydroxyprogesterone）、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトザントロン、レバミゾール、ナベルベン、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、ドロロキサフィン、又はヘキサメチルメラミンが挙げられるが、これらに限定されない。プロドラッグの形態もまた、本発明において有用である。

【0099】

また、本発明において有用な他の薬物は、⁶⁷Ｃｕ、⁹⁰Ｙ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁸⁶Ｒｅ、及び²¹¹Ａｔなどの放射性核種を含む。幾つかの実施形態では、放射性核種治療上は、薬物として、及び造影剤として作用することができる。

【0100】

造影剤は、常磁性剤、光学プローブ、及び放射性核種を含む。常磁性剤は、ナノ担体の疎水ポケット内に隔離された、鉄ナノ粒子などの鉄粒子を含む。幾つかの実施形態では、造影剤は、有機蛍光色素、量子ドット（ＱＤ）、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ−ＮＰ）、又は金ナノ粒子を含むことができる。幾つかの実施形態では、造影剤は放射性核種である。

【0101】

本発明の幾つかの実施形態は、ナノ担体を提供し、そこにおいて、各両親媒性化合物は、コール酸、アロコール酸、ピトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、又はケノデオキシコール酸のいずれかであることができる。幾つかの実施形態では、各両親媒性化合物はコール酸であることができる。

【0102】

ナノ担体テロデンドリマーの架橋性基は、当業者に公知の任意の好適な手段によって架橋されることができる。例えば、架橋性基がチオールである場合、ジスルフィド結合が、チオールの酸化により、２の本発明のコンジュゲートの間に形成されることができる。酸素などの任意の好適な酸化剤が使用されることができる。他の架橋性基に関しては、例えば、ボロン酸、及びジヒドロキシベンゼンのような１，２−ジオールなどの相補的な基などは、付加的な反応物質の必要なしに、架橋が自然に生じる。

【0103】

本発明のナノ担体における架橋は可逆的であって、薬物の、例えば標的部位への送達を容易にする。架橋されたナノ担体の架橋を解消することは、架橋されたナノ担体と好適な結合開裂成分との接触を必要とする。幾つかの実施形態では、本発明は、可逆的に架橋されたナノ担体を、架橋結合を開裂するのに適した結合開裂成分と接触させることによる、本発明の可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消する方法を提供し、それによって可逆的に架橋されたナノ担体の架橋を解消する。幾つかの実施形態では、接触はインビボで行われる。

【0104】

任意の好適な結合開裂成分が、本発明において使用される。幾つかの実施形態では、結合開裂成分は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタチオン、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）、マンニトール、又は酸であることができる。架橋された結合がジスルフィドである場合、任意のジスルフィド還元剤が好適である。幾つかの実施形態では、本発明の化合物及びコンジュゲートがチオールを含む場合、結合開裂成分は、Ｎ−アセチルシステイン又は２−メルカプトエタンスルホネートであることができる。幾つかの実施形態では、本発明の化合物及びコンジュゲート架橋性基が、ボロン酸及びジヒドロキシベンゼンを含む場合、結合開裂成分は、マンニトールであることができる。

【0105】

Ｖ．治療方法
本発明のナノ担体は、疎水性薬物をナノ担体の内部に隔離すること、又は薬物をナノ担体のコンジュゲートに共有結合することなどによって、薬物の投与を必要とする任意の疾患を治療するのに使用することができる。また、ナノ担体は、造影剤をナノ担体の内部に隔離すること、又は造影剤をナノ担体のコンジュゲートに結合することなどによって、撮像にも使用することができる。

【0106】

幾つかの実施形態では、本発明は、斯かる治療を必要とする対象に対して、本発明のナノ担体治療有効量を投与すること含む疾患を治療する方法を提供し、ここでナノ担体は薬物を含む。薬物は、ナノ担体のコンジュゲートに共有結合されることができる。幾つかの実施形態では、薬物は、ナノ担体の内部に隔離されている疎水性薬物である。

【0107】

任意の好適な薬物は、本発明のナノ担体とともに使用することができる。幾つかの実施形態では、疎水性薬物は、ボルテゾミブ、パクリタキセル、ＳＮ３８、カンプトテシン、エトポシド及びドキソルビシン、ドセタキセル、ダウノルビシン、ＶＰ１６、プレドニゾン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テムシロリムス、カルムスチン、ラパチニブ、ソラフェニブ、フェンレチニド、又はアクチノマイシンＤであることができる。

【0108】

幾つかの実施形態では、ナノ担体はまた、造影剤を含む。造影剤はナノ担体のコンジュゲートに共有結合されることができ、又は造影剤は、ナノ担体の内部に隔離されることができる。幾つかの他の実施形態では、疎水性薬物及び造影剤の双方は、ナノ担体の内部に隔離される。更に他の実施形態では、薬物及び造影剤の双方は、コンジュゲート又はナノ担体のコンジュゲートに共有結合的に連結される。更なる他の実施形態では、ナノ担体はまた、放射性核種を含むことができる。

【0109】

本発明のナノ担体は、例えば、限定されないが、上皮性悪性腫瘍、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、バーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道の癌、胃癌、膵癌、肝胆道癌、胆嚢の癌、小腸の癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫（更なる癌についてはCANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE（DeVita, V. T. et al. eds 2008）を参照されたい）などの癌を含む過剰増殖性障害を治療するのに、対象に投与することができる。幾つかの実施形態では、疾患は癌である。

【0110】

本発明のナノ担体により治療することのできる他の疾患は、（Ｉ）全身性アナフィラキシー又は過敏症反応、薬物アレルギー、虫刺されアルルギー；クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎及び腸炎などの炎症性腸疾患；腟炎；乾癬並びに皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹などの炎症性皮膚病；血管炎；脊椎関節症；硬皮症；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏症肺疾患などの呼吸アレルギー疾患などの炎症性又はアレルギー疾患など、（２）関節炎（リウマチ様及び乾癬性）、変形性関節症、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、糖尿病、糸球体腎炎のどの自己免疫疾患など、（３）移植片拒絶反応（例えば、同種移植拒絶反応及び移植対ホスト疾患）、並びに（４）望ましくない炎症反応が阻害されるべき他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎、脳卒中及び非開放性頭部損傷などの神経学的疾患、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗しょう症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎、及びベーチェット症候群）、を含む。幾つかの実施形態では、疾患は喘息である。

【0111】

くわえて、本発明のナノ担体は、ウイルス、細菌、菌類、及び寄生虫などの病原体による感染症の治療に有用である。他の疾患が本発明のナノ担体を用いて治療されることができる。

【0112】

Ａ．製剤
本発明のナノ担体は、さまざまな、当業者に公知の異なる方法で製剤することができる。医薬的に許容し得る担体は、一部には投与される特定の組成物によっても、組成物を投与するのに使用される特定の方法によっても決定される。
それ故に、本発明の医薬組成物の好適な製剤が、幅広い種類で存在する（例えば、レミントンの薬学、第２０版、２００３年、上記（supra）、を参照）。効果のある製剤は、経口及び経鼻製剤、非経口投与用製剤、並びに徐放用に製剤された組成物を含む。

【0113】

経口投与に適している製剤は、（ａ）水、食塩水又はＰＥＧ４００などの希釈剤に懸濁された本発明の化合物の有効量などの液体溶液；（ｂ）各々、所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒、又はゼラチンとして含有する、カプセル、サッシェ剤、デボー製剤、又はタブレット剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；（ｄ）好適なエマルション；及び（ｅ）パッチから構成されることができる。上記の液体溶液は、滅菌溶液であることができる。医薬的形態は、１以上の乳糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香料、色素、崩壊剤、及び医薬的に適合する担体含むことができる。トローチ剤の形態は、香味料、例えば蔗糖中の活性成分、並びに活性成分に加えて、当該技術分野において公知である担体を含有するゼラチン及びグリセリン、又は蔗糖、及びアカシアエマルジョン、ゲルなどの不活性ベース中の活性成分を含んでなる香錠を含んでなることができる。

【0114】

医薬製剤は、好ましくは単位投薬形態である。そのような形態では、製剤は、適量の活性成分を含有する単位投与量に分割される。単位投与形態は、パッケージ入り製剤、バイアル又はアンプルに小分けされたタブレット剤、カプセル、及び粉末などの、個別の量の製剤を含有するパッケージであることができる。また、単位投与形態は、カプセル、タブレット剤、カシェー、又はトローチ剤そのものであることができ、又は単位投与形態は、パッケージ入りの形態における適切な数のこれらのいずれかであることができる。所望の場合ならば、組成物はまた、他の混合可能な治療薬を含有する。好ましい医薬製剤は、本発明の化合物を徐放性製剤で送達することができる。

【0115】

本発明において有用な医薬製剤はまた、徐放性製剤を含む。幾つかの実施形態では、本発明において有用な徐放性製剤は、米国特許第６，６９９，５０８号に記載され、米国特許第７，１２５，５６７号に従って調製されることができ、両特許は参照により本願明細書に組み込まれる。

【0116】

典型的には、医薬製剤は哺乳類、例えばヒト及びヒト以外の哺乳類に送達される。本方法を用いて治療されるヒト以外の哺乳類は、家畜（すなわち、イヌ科の動物、ネコ科の動物、ネズミ科の動物、齧歯目、及びウサギ目）、並びに農業用動物（ウシ属の動物、ウマ科の動物、ヒツジ、ブタ）を含む。

【0117】

本発明の方法を実行するにあたって、医薬組成物は単独、又は他の治療薬若しくは診断薬と併用して使用されることができる。

【0118】

Ｂ．投与
本発明のナノ担体は、必要に応じた頻度で、例えば毎時間、毎日、毎週、又は毎月、投与することができる。本発明の医薬的方法に利用される化合物は、１日あたり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの初期投与量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの一日の投与量範囲が用いられることができる。しかし、投与量は、患者の要件、治療される病態の重症度、及び採用される化合物により変更され得る。例えば、投与量は、特定の患者における診断された疾患の種類及び段階を考慮して経験的に決定することができる。本発明の内容において患者に投与された投与量は、時間とともに、患者に有益な治療反応をもたらすのに十分であるべきである。また、投与の量も、特定の患者における特定の化合物の投与に伴っておこる任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度により決定されることになる。特定の状況に関して適正な投与量の決定は、医師の技術の範囲内にある。概して、治療は、化合物の至適投与量未満である、少ない投与量で開始する。その後、投与量を、状況下で至適効果が達成されるまで、少量ずつ増加する。便宜上、一日の全投与量を分割してもよく、所望ならば一日の間に分けて投与してもよい。治療を行う医師により決定された通り、毎日又は隔日で投与し得る。また、より長い期間（週、月又は年）にわたって、定期的又は継続的に、皮下カプセル剤、サッシェ剤、若しくはデボー製剤の使用を通して、又はパッチ若しくはポンプを介してなどで、投与することができる。

【0119】

医薬組成物は、さまざまな方法で、例えば局所的、非経口的、静脈内、皮内、皮下、筋肉注射、経結腸的、経直腸的、又は腹膜内に、患者に投与することができる。好ましくは、医薬組成物は、非経口的、局所的、静脈内、筋肉注射、皮下、経口的又は吸入を介してなど経鼻的に投与する。

【0120】

本発明の方法を実行するにあたって、医薬組成物は単独で使用するか、又は他の治療薬若しくは診断用薬と併用することができる。本発明の併用プロトコールに使用される追加薬物は、別々に投与するか、又は併用プロトコールに使用される１以上の薬物を、一緒に、例えば、混合などして投与することができる。１以上の薬物が別々に投与される場合、各薬物の投与のタイミング及びスケジュールは変更できる。他の治療薬又は診断用薬は、本発明の化合物と同時に、別々に、又は異なる時点で投与することができる。

【0121】

本発明のナノ担体は、治療の必要な対象に任意の好適な薬物を投与するのに使用することができる。幾つかの実施形態では、本発明は、本発明のナノ担体を対象に投与することにより、薬物を、それを必要とする対象に送達する方法を提供し、そこにおいて、ナノ担体は薬物及び複数の架橋結合を含む。該方法はまた、結合開裂成分を用いて架橋結合を開裂することを含み、薬物をナノ担体から放出させることにより、薬物を対象に送達する。上記のように、任意の好適な結合開裂成分が使用することができる。

【0122】

ＶＩ．造影方法
幾つかの実施形態では、本発明は、撮像される対象に、本発明のナノ担体の有効量を投与することを含む、撮像の方法を提供し、そこにおいて、ナノ担体は造影剤を含む。その他の実施形態では、治療方法及び撮像方法は、薬物及び造影剤双方を有するナノ担体を用いて、同時に遂行される。

【0123】

好ましい造影剤は、常磁性剤、光学プローブ、及び放射性核種を含む。常磁性剤は、外部から印加された場の下で磁性がある造影剤である。常磁性剤としては、例えば、ナノ粒子を含む鉄粒子が挙げられるが、これらに限定されない。光学プローブは、１の放射波長での励起、及び第二の異なる放射波長での検出によって検出することができる蛍光組成物である。本発明において有用な光学プローブとしては、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｃｙ５、ＤｉＤ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−過塩素酸テトラメチルインドジカルボシアニン）、及びＤｉＲ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−ヨウ化テトラメチルインドトリカルボシアニン）が挙げられるが、これらに限定されない。他の光学プローブは、量子ドットを含む。放射性核種は、放射性崩壊を経る元素である。本発明において有用な放射性核種としては、³Ｈ、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁸Ｆ、¹⁹Ｆ、⁶⁰Ｃｏ、⁶⁴Ｃｕ、⁶⁷Ｃｕ、⁶⁸Ｇａ、⁸²Ｒｂ、⁹⁰Ｓｒ、⁹⁰Ｙ、⁹⁹Ｔｃ、^99mＴｃ、¹¹¹Ｉｎ、¹²³Ｉ、¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹²⁹Ｉ、¹³¹Ｉ、¹³⁷Ｃｓ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、²¹¹Ａｔ、Ｒｎ、Ｒａ、Ｔｈ、Ｕ、Ｐｕ、及び²⁴¹Ａｍが挙げられるが、これらに限定されない。

【実施例】

【0124】

材料
モノメチル末端（Monomethylterminated）ポリ（エチレングリコール）モノアミン（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂、Ｍ_w：５０００Ｄａ）は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ（ドイツ）から購入した。ＰＴＸは、ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州マウンテンビュー）から購入した。タキソール（登録商標）（Ｍａｙｎｅ Ｐｈａｒｍａ、ニュージャージー州パラマス）は、カリフォルニア大学デービス校のがんセンターから入手した。硫酸ビンクリスチンは、ＡｖａＣｈｅｍ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（テキサス州サンアントニオ）から購入した。硫酸ビンクリスチンの従来の（臨床）製剤は、カリフォルニア大学デービス校のがんセンターから入手した。（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、及び（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＯＨは、ＡｎａＳｐｅｃ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンノゼ）から入手した。１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−過塩素酸テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉＤ）、ボディピー６５０／６６５、及び４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青）は、インビトロジェンから購入した。テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３ カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、ＭＴＳ］、及びフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）は、プロメガ（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。コール酸、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５ ジフェニルテトラゾリウムブロミド］、エルマン試薬［ＤＴＮＢ、５，５９−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）］、及び他の薬品の全ては、シグマ‐アルドリッチ（セントルイス）から購入した。無架橋ミセル（ＮＣＭ）、ジスルフィド架橋ミセル（ＤＣＭ）、及びボロン酸架橋ミセル（ＢＣＭ）。

【0125】

動物モデル
雌胸腺欠損ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ株）、６〜８週齢は、Ｈａｒｌａｎ（カリフォルニア州リバモア）から購入した。全ての動物は、ＡＡＡＬＡＣガイドラインに従って無菌状態の下で保持され、いずれの実験の前に、少なくとも４日間順化させた。全ての動物実験は、組織のガイドラインに準じて、動物実験委員会（Animal Use and Care）に承認されたプロトコール番号０７−１３１１９及び番号０９−１５５８４に従って行った。

【0126】

統計分析
統計分析は、２の基についてはスチューデントのｔ検定により、数の多いの基については一元配置分散分析により行った。結果は全て、特に断りのない限り、平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表わした。Ｐ＜０．０５の値を、統計的に有意と見なした。

【0127】

実施例１ チオール化されたコンジュゲートの調製（ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈）
チオール化されたテロデンドリマー（ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈と命名された）を、段階的なペプチド化学を利用してＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂から液相縮合反応を解して合成した。ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の合成の典型的な手順は次の通りである：（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ（３当量）を、ＤＩＣ及びＨＯＢｔをカップリング試薬として用いて、それによってカップリング反応の完了が示される陰性のカイザーテスト結果が得られるまで、ＰＥＧのＮ末端にカップリングした。冷エーテルを加えることによって、ペグ化された分子を沈殿させ、次に冷エーテルで２回洗浄した。Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）４−メチルピペリジンでの処理によって除去し、ペグ化された分子を沈殿させ、冷エーテルで３回洗浄した。白色粉末沈殿物を真空下で乾燥し、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨのカップリングを２回、及び（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングを１回、それぞれ実施し、ＰＥＧの１の末端が４のＢｏｃ及びＦｍｏｃ基で終わる、第三世代の樹枝状ポリリシンを生成した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でＢｏｃ基を除去した後、（Ｆｍｏｃ）Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＯＨ、及びコール酸ＮＨＳエステルを、樹枝状ポリリシンの端末側終端に段階的にカップリングした。システイン上のＴｒｔ基を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／エタンジチオール（ＥＤＴ）／トリエチルシラン（ＴＩＳ）（９４：２．５：２．５：１、ｖ／ｖ）により除去し、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈のチオール化されたテロデンドリマーを得た（図１０）。チオール化されたテロデンドリマーを、ＤＭＦ及びエーテルでのそれぞれ溶解／再沈殿の３回のサイクルにより、混合物から回収した。そして、チオール化されたテロデンドリマーをアセトニトリル／水に溶かし、凍結乾燥した。我々が以前に報告した方法に従って、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈のオールを含まないテロデンドリマーを合成し、無架橋ミセルを調製した。ＤＭＦ中の２％（ｖ／ｖ）ヒドラジンによって１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イルジン）エチル（Ｄｄｅ）保護基を除去した後、ボディピー６５０／６６５（ＮＩＲＦ色素）で標識したテロデンドリマーを、ＰＥＧとコール酸との間に、ボディピーＮＨＳエステルを隣接するリシンのアミノ基にカップリングすることによって合成した。

【0128】

エルマン試験を使用して、遊離チオール基によりテロデンドリマーに結合したシステインの数を決定した。エルマン試薬を標準チオール（システイン）に１５分間加えた後、システイン濃度の関数として４１２ｎｍでの吸光度をプロットすることによって、校正曲線を作成した。校正曲線に基づいて、エルマン試験における試料の吸光度から、テロデンドリマー上のシステインの数を計算した。テロデンドリマーの質量スペクトルを、Ｒ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして用いて、ＡＢＩ４７００ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（線形モード）に集めた。ポリマーの¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを、ＣＤＣｌ₃及びＤ₂Ｏを溶媒として用いて、Ａｖａｎｃｅ５００核磁気共鳴分光計（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer）に記録した。ＮＭＲ測定のために、ポリマーの濃度を５×１０−⁴Ｍに保持した。

【0129】

遊離システインを用いて標準曲線を作ることによって定量的エルマン試験により決定すると、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈中の共有結合されたシステインの数は３．９７であり、標的テロデンドリマーの分子式と一致した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いて、出発ＰＥＧ及びＰＥＧ^5k−ＣＡ₈と比較して、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の分子量を決定した。単分散した微量な質量を、出発ＰＥＧ及びテロデンドリマーについて検出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳからテロデンドリマーの分子量は理論値とほぼ一致した。ＰＥＧ鎖（３．５〜３．７ｐｐｍ）及びコール酸（０．６〜２．４ｐｐｍ）の化学シフトを、ＣＤＣｌ₃中のＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の¹Ｈ ＮＭＲスペクトルの中に観察することができた。これらピークを積分して、テロデンドリマーの化学組成を計算することができる。テロデンドリマーに関して¹Ｈ−ＮＭＲにより決定したコール酸の数は、標的テロデンドリマーの分子式と一致した。これらの結果は、テロデンドリマーの明確に定義された構造を明示する。ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈のＮＭＲスペクトルをＤ₂Ｏ中にて記録したとき、コール酸プロトンピークは大幅に抑制され、これは水性の環境におけるコア−シェルミセル構造の形成によるコランのもつれを示している。架橋前のＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセル及びＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルのＣＭＣを、疎水性蛍光プローブとしてピレンを用いて測定し、それぞれ、５．５３μＭ及び５．９６μＭであることがわかった。ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルは、架橋前、２６ｎｍのサイズを示し、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセルと同様のサイズでもある。これらの結果は、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセル及びＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルは同様の物理的性質を有することを示す。

【0130】

実施例２ ジスルフィド架橋ミセルの調製
２０ｍｇのＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマーを、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶かしてミセルを形成し、次に１０分間、超音波処理した。テロデンドリマー上のチオール基を酸化してジスルフィド結合を形成し、酸素をミセル溶液にパージした。遊離チオール基のレベルを、エルマン試験により、経時的にモニターした。遊離チオール基のレベルが一定の低い値にとどまった後、ミセル溶液を、透析無しに特徴付けを行うのに使用した。

【0131】

実施例３ ＰＴＸ搭載ジスルフィド架橋ミセル調製
パクリタキセルの搭載
我々の以前の研究で記載したように、溶媒蒸発法によりミセルにＰＴＸを搭載した。簡潔に、最初に１０ｍＬの丸底フラスコ中で、ＰＴＸ（１、２、３、５、７．５、９ｍｇ）及びＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマー（２０ｍｇ）を、クロロホルムに溶かした。クロロホルムを真空下で蒸発させ、薄膜を形成した。ＰＢＳバッファー（１ｍＬ）を加えて薄膜を再水和し、その後、ソニケーションを３０分間した。次に、ＰＴＸ搭載ミセルを、上記のようにＯ₂を介した酸化により架橋した。９倍量のアセトニトリルの添加及び１０分間のソニケーションによりミセルから薬物を放出した後に、ミセルに搭載された薬物の量を、ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社）で分析した。薬物搭載は、基準薬物のＨＰＬＣ面積値と濃度との間の校正曲線に従って計算した。搭載能力は、水溶液中でミセルにより得ることができる最高薬物濃度として定義され、一方、搭載効率は、初期薬物含量に対するミセルに搭載された薬物の比として定義される。ＰＴＸ搭載ミセル溶液の一部を、特徴付けのために４℃で保存し、残りを凍結乾燥した。ＰＴＸ搭載無架橋ミセルを、以前に報告されているようにＰＥＧ^5k−ＣＡ₈チオールを含まないテロデンドリマーを使用することにより調製した。

【0132】

架橋前、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセル中のＰＴＸ搭載能力は、８．６ｍｇ／ｍＬのレベルに達することができた（１ｍＬのＰＢＳ中、２０ｍｇのミセルに８．６ｍｇの搭載されたＰＴＸ）（図２Ｃ）。搭載効率は、ほぼ１００％であり、最終粒径は全て、架橋前搭載に対して、２５〜５０ｎｍの範囲にとどまった（図２Ｄ）。酸素を介して架橋した後、ミセルのＰＴＸ搭載能力は、８．６ｍｇ／ｍＬから７．１ｍｇ／ｍＬへわずかに減少した。それは、３５．５％（ｗ／ｗ）の薬物／ミセル比に相当する（表１）。架橋後、５．０ｍｇ／ｍＬ以下のＰＴＸ搭載で、ミセルが同様の粒径及び１００％のＰＴＸ搭載効率が保有されたことが言及されるべきである。しかし、５．０ｍｇ／ｍＬを超えると、架橋ミセルの粒径は増加した（図２Ｄ）一方で、搭載効率は８１％に減少した。

【0133】

１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−過塩素酸テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉＤ）の搭載
ＤｉＤ（疎水性ＮＩＲＦ色素）を上記と同じ方法を用いて、ミセルに搭載した。ミセル溶液を０．２２μｍフィルターでろ過して、サンプルを滅菌した。

【0134】

実施例４ ＰＴＸ搭載ジスルフィド架橋ミセルの特徴付け
一般的性質
ミセルのサイズ及びサイズ分布を、動的光散乱（ＤＬＳ）計測器（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ）により測定した。ＤＬＳ測定のために、ミセル濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに保った。これらのミセルのゼータ電位を、Ｚｅｔａｔｒａｃ（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ）の機能を用いてＤＬＳにより測定した。測定の全てを２５℃で行い、データをＭｉｃｒｏｔｒａｃ ＦＬＥＸソフトウェア １０．５．３により分析した。ミセルの形態を、フィリップスＣＭ−１２０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。ミセル水溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を銅グリッドに置き、リンタングステン酸で染色し、室温にて測定した。架橋前後のＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセル及びＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、前述のように、ピレンを疎水性蛍光プローブとして使用することによって、蛍光スペクトルを介して測定した。簡潔に、ミセルをＰＢＳで連続段階希釈して、５×１０−⁷〜５×１０−⁴Ｍの範囲の濃度とした。メタノール中のピレンのストックをミセル溶液に加え、２×１０−⁶Ｍのピレンの最終濃度とした。溶液を、一晩穏やかに振とうした。発光を３９０ｎｍで固定し、励起スペクトルを３００〜３６０ｎｍの範囲で記録した。ピレンの励起スペクトルからの、強度３３２ｎｍに対する３３７ｎｍの比を、ミセルの濃度に対してプロットした。強度比Ｉ３３７／Ｉ３３２が著しく増加し始める閾値濃度からＣＭＣを決定した。

【0135】

ジスルフィド架橋に続いて、薬物が搭載されていないＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセル（空ミセル）を、粒径、見かけのＣＭＣ、及びゼータ電位について、更に特徴付けした。水溶液に分散して即時にミセルを形成した後、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈の遊離チオール基を酸素により酸化して、ジスルフィド結合を形成した。エルマン試験により、Ｏ₂を介した酸化をモニターした。遊離チオール基は時間とともに酸化され、酸化の４８時間後には、８５％を超えるチオール基が反応してジスルフィドを形成した。興味深いことに、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルは、ジスルフィド架橋の後、狭い分布で２７ｎｍ前後の類似した粒径を保持した。この結果は、ジスルフィド結合形成がミセル内で起こる事象であることを示唆する。ＰＥＧ外部コロナは、ミセル内に架橋反応を制限し、ミセル間凝集体の形成を防ぐ。架橋後、ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルの見かけのＣＭＣは、０．６７μＭに減少し、無架橋ミセルの見かけのＣＭＣより９倍低い。この架橋ミセルについての観察所見は、報告されている架橋プルロニックＬ１２１ミセルと一致する。これらミセルは非荷電ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈から構成されるので、ミセルのゼータ電位を測定したところ、ほぼ中性であった。酸化前ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルは、保存にあたり、空気中の酸素によって間違いなく部分的に架橋されることになるので、以下のインビトロ及びインビボ評価における絶対的無架橋ミセル（ＮＣＭ）として、酸化前ＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈ミセルの代わりに、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセルを選択した。更に我々は、本架橋ナノ製剤を、我々が以前に公表した無架橋ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈ミセルと直接比較したいと思う。

【0136】

【表1】

【0137】

ＳＤＳ及びヒト血漿におけるミセルの安定性
安定性試験を行って、高分子ミセルを効率的に破壊することが報告されているドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、ＤＣＭ及びＮＣＭの粒径の変化をモニターした。ＳＤＳ溶液（７．５ｍｇ／ｍＬ）をミセルの水溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）に加えた。最終ＳＤＳ濃度は、２．５ｍｇ／ｍＬであり、ミセル濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに保った。ミセル溶液のサイズ及びサイズ分布を、所定の時間間隔でモニターした。ミセルの安定性もまた、ＳＤＳとともにＧＳＨ及びＮＡＣ（２０ｍＭ）の存在下で評価した。凍結乾燥ＰＴＸ搭載ミセル粉末を、ＰＢＳで再水和し、同一条件下でテストした。安定性試験の最後に、試料をＴＥＭ下で更に観察した。更に、ＰＴＸ搭載ＮＣＭ及びＤＣＭの安定性を、健常人のボランティアからの５０％（ｖ／ｖ）血漿中で調べた。混合物を生理的体温（３７℃）でインキュベーションし、続いて所定の時間間隔で９６時間までサイズ測定をした。

【0138】

ＰＴＸ搭載無架橋ミセル（ＰＴＸ−ＮＣＭ）及びジスルフィド架橋ミセル（ＰＴＸ−ＤＣＭ）は、４℃で安定であることがわかった。ＰＴＸ−ＮＣＭ及びＰＴＸ−ＤＣＭを５０％ヒト血漿とインキュベーションし、ミセルの粒径をＤＬＳにより経時的にモニターした。同様のＰＴＸ搭載を有するＤＣＭ及びＮＣＭミセルの双方は、ヒト血漿において約３０ｎｍの平均粒径を２４時間保有した（図３）。しかし、ＰＴＸ−ＤＣＭは、サイズの均一性及び狭い分布を保ったままであった。一方で、ＰＴＸ−ＮＣＭはより幅広いサイズ分布、及び１００ｎｍを超えるサイズの集団を示し、凝集体の形成を示した（図３）。

【0139】

強力なイオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、高分子ミセルを効率的に破壊できることが報告されている。高分子ミセルとユニマーとの間の交換率は、ＳＤＳの低濃度によって速められる一方で、より高い濃度では、ＳＤＳミセルの存在により、両親媒性ブロック共重合体が溶解し、高分子ミセルの不安定化をもたらす。また、ＮＣＭ及びＤＣＭの安定性を、報告されている２．５ｍｇ／ｍＬのミセル破壊ＳＤＳ濃度の存在下でテストした。ＳＤＳバックグラウンドの程度は、ＤＬＳ分析の検出限界を下回り、スペクトルにおいて０．９ｎｍ集団を示す。各ミセル溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を、ＳＤＳ（２．５ｍｇ／ｍＬ）の水溶液と混ぜた後、粒径をさまざまな時点でモニターした。ＮＣＭの粒径シグナルの即時消失は、無架橋ミセルの特徴のある動的な会合解離特性を反映する（図４、図１３Ａ及びＢ）。ＤＣＭの長い時間にわたる、一定した粒径は、懸かる架橋ミセルが完全なまま残ったことを示した。また、再水和した凍結乾燥ＰＴＸ−ＤＣＭは、ＳＤＳの存在下で、約２６ｎｍの粒径を保持した（図３Ｅ及びＦ）。

【0140】

細胞内のＧＳＨ濃度（〜１０ｍＭ）は、細胞外のレベル（〜２μＭ）より実質的に高いことが知られている。図１３Ｅに示すように、細胞の外部レベル（〜２μＭ）のＧＳＨを有するＳＤＳ溶液中で、ＤＣＭは安定であった。しかし、ＳＤＳ及び細胞内の還元ＧＳＨレベル（１０ｍＭ）の存在下で、ジスルフィド架橋ミセルの粒径シグナルは、３０分間変化しないままで、その後突然（１０秒以内）減少した。これは、ジスルフィド結合の臨界数が減少したときのミセルの急速な解離を示した（図４Ａ、図１３Ｆ）。ＰＴＸ−ＮＣＭ及びＰＴＸ−ＤＣＭの、ＳＤＳ及び異なるレベルのＧＳＨに対するは、それぞれ空のＮＣＭ及びＤＣＭの反応と同様であった。また、我々は、ＳＤＳ及びＮＡＣ（１０ｍＭ）の存在下での４０分後のＤＣＭの粒径の完全な消失（データ示さず）からも明らかなように、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）が効率的にＤＣＭのジスルフィド結合を開裂することができることを見出した。更に、安定性試験の終点において、ＤＣＭ及びＮＣＭの試料をＴＥＭにより検討した。ＮＣＭのミセル構造がＳＤＳ溶液中で破壊されていることを更に確認した（図４Ｂ）。また、ＴＥＭ画像は、ＤＣＭのミセル構造はＳＤＳの存在下で良く保持されていた（図４Ｃ）が、ＳＤＳ及び１０ｍＭのＧＳＨの存在下で効率的に破壊された（図４Ｄ）ことを示した。

【0141】

細胞取り込み及びＭＴＴアッセイ
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、８ウェル組織培養チャンバースライド（ＢＤバイオサイエンス、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ベッドフォード）に、１ウェルあたり５００００細胞の密度で播種し、続いて１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５ａ培地中で、２４時間インキュベーションした。培地を交換し、ＤｉＤで標識したミセル（１００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。３０分後、１時間後、２時間後、及び３時間後に、細胞をＰＢＳで３回洗い、４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。スライドをカバーガラスでマウントし、共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス、ＦＶ１０００）下で観察した。

【0142】

ＳＫＯＶ−３細胞を、処理の２４時間前に、９６ウェルプレートに１００００細胞／ウェルの密度で播種した。最初に、細胞をＧＳＨ−ＯＥｔ（２０ｍＭ）の存在又は非存在下で２時間処理し、次にＰＢＳで３時間洗った。空ミセル及び異なる希釈剤を有するＰＴＸのさまざまな製剤をプレートに加え、次に２時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで洗浄し、加湿した、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター中で更に２２時間インキュベーションした。ＭＴＴを各ウェルに加え、更に４時間インキュベーションした。５７０ｎｍ及び６６０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダー（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）を用いて検出した。未処理の細胞が対照の役割を果たした。結果は、３連のウェルの平均細胞の生存率［（ＯＤ_処理−ＯＤ_ブランク）／（ＯＤ_対照−ＯＤ_ブランク）×１００％］として表わした。

【0143】

ＰＴＸ−ＮＣＭは、タキソール（登録商標）に匹敵する、ＳＫＯＶ−３細胞に対するインビトロ抗癌効果（図６Ｂ）を示した。しかし、ＰＴＸ−ＤＣＭは、タキソール及びＰＴＸ−ＮＣＭより細胞毒性が低いことがわかった。このことは、細胞培養培地内でもＰＴＸ−ＤＣＭが細胞に取り込まれた後でも、ＰＴＸがよりゆっくりと放出されるため予期されたことであった（図６Ｂ）。ＰＴＸの濃度が１０ｎｇ／ｍＬより高かったとき、細胞のＧＳＨ−ＯＥｔでの前インキュベーションは、ＰＴＸ−ＤＣＭの阻害効果を増強する（図６Ｂ）。対照的に、ＰＴＸ−ＮＣＭの毒性プロフィールは、ＧＳＨ−ＯＥｔでの前処理の影響を受けなかった。上記のように、ＤＣＭのミセル内ジスルフィド架橋の開裂のために、ＧＳＨ−ＯＥｔの添加は、細胞内のＧＳＨ濃度を増加し、細胞内の薬物放出を促進し、細胞毒性の増加をもたらす。

【0144】

溶血反応アッセイ
健常人のボランティアからの新鮮なクエン酸血を用いて、ＮＣＭ及びＤＣＭの溶血反応を調べた。赤血球（ＲＢＣ）を１０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により回収し、ＰＢＳで３回洗い、次にＰＢＳで最終濃度２％にした。２００μＬの赤血球懸濁液を、異なる濃度（０．２及び１．０ｍｇ／ｍＬ）のＮＣＭ及びＤＣＭとそれぞれ混ぜ、３７℃で４時間、インキュベーター振とう器でインキュベーションした。混合物を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、全試料の１００μＬの上澄みを９６ウェルプレートに移した。上澄み中の遊離ヘモグロビンを、マイクロプレートリーダー（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）を用いて、５４０ｎｍでの吸光度により測定した。トリトン１００（２％）及びＰＢＳとのＲＢＣのインキュベーションを、それぞれ、陽性及び陰性対照として使用した。ＲＢＣの溶血反応割合を、次式を用いて計算した：ＲＢＣ溶血反応＝（ＯＤ_試料−ＯＤ_陰性対照）／（ＯＤ_陽性対照−ＯＤ_陰性対照）×１００％

【0145】

図６Ｃに示されるように、空ＮＣＭは投与量依存ＲＢＣ溶解を呈することがわかった。ＮＣＭ濃度の０．２ｍｇ／ｍＬから１．０ｍｇ／ｍＬへ増加するにつれて、溶血反応の割合は、９．０％から１６．３％へ増加した。対照的に、空ＤＣＭは同じ実験濃度で、観察可能なＲＢＣでの溶血作用（＜５％）を示さなかった。ミセル内ジスルフィド架橋は、ＤＣＭが解離して両親媒性テロデンドリマーを形成するのを妨げる。よって、溶血作用を最小限にする。
インビボ血中消失動態及び生体内分布

【0146】

ＤｉＤ又はボディピーで標識したＮＣＭ及びＤＣＭを、血中消失試験のために調製した。ボディピー結合ミセルの濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。０．５ｍｇ／ｍＬのＤｉＤ搭載で、ＤｉＤ搭載ミセルの濃度は２０ｍｇ／ｍＬであった。ＰＢＳにより２０倍に希釈した、これらの蛍光標識ミセルの蛍光スペクトルを、蛍光分光計（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）により特徴付けした。１００μＬのボディピー結合又はＤｉＤ搭載ＮＣＭ及びＤＣＭを、無腫瘍ヌードマウスに尾静脈から注射した。注射後の異なる時点で５０μＬの血液を採取して、ＤｉＤ又はボディピーの蛍光シグナルを測定した。

【0147】

直径約８〜１０ｍｍの皮下ＳＫＯＶ−３腫瘍をもつヌードマウスを、インビボＮＩＲＦ光学的イメージングに供した。ＤｉＤ及びＰＴＸ（ＤｉＤ及びＰＴＸの濃度はともに０．５ｍｇ／ｍＬであった）を共搭載した架橋ミセルの注射後の異なる時点で、励起６２５ｎｍ及び発光７００ｎｍの帯域フィルターを備えたコダックマルチモーダルイメージングシステムＩＳ２０００ＭＭを用いてマウスをスキャンした。各イメージングの前に、マウスにペントバルビタール（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。インビボイメージング後、動物をＣＯ₂過剰投与により注射の２４時間後、安楽死させた。腫瘍及び主な臓器を摘出し、コダックイメージングステーションでイメージングした。

【0148】

血液のバックグラウンドのＮＩＲＦシグナルは、非常に低いことがわかった。ＤｉＤ又はボディピー６５０／６６５で標識したＮＣＭ及びＤＣＭは、推定インビボ濃度で、同等のインビトロ近赤外線蛍光シグナルを有した。マウスに静注した後、ＮＣＭのボディピーシグナルは、血液循環から急速に消失し、注射後８時間以内にバックグラウンドレベルに下がった。血液中のＤＣＭのボディピーシグナルは、注射の８時間後で、ＮＣＭのシグナルより８倍高く、最長２４時間まで持続したことが言及されるべきである（図７Ａ）。ＤｉＤ搭載ＮＣＭ又はＤＣＭについて、注射した総ミセル濃度は２０ｍｇ／ｍＬであり、ボディピーで標識したＮＣＭ又はＤＣＭ（５ｍｇ／ｍＬ）に対する濃度と比べて４倍高かった。それでもなお、ＤｉＤ搭載ＮＣＭ及びＤＣＭについて、同様の傾向の血液循環動態が観察された。ＮＣＭのＤｉＤシグナルは、初期に増加したにもかかわらず、より速く減少した一方で、ＤＣＭのＤｉＤシグナルは、最長３０時間、血液中で持続した（図７Ｂ）。媒体及び搭載物の双方に関する消失動態の上記プロフィールは、架橋ミセルが無架橋ミセルより長い血液循環時間を有することを示した。

【0149】

更に、注射後７２時間の生体外イメージングは、正常な臓器に比較して、腫瘍におけるＤＣＭの優先的な取り込みを裏付けた（図８）。これは、ミセルのインビボ血液循環時間が長く、サイズにより媒介されるＥＰＲ効果のためである。

【0150】

インビボ毒性
テロデンドリマーに関連する毒性を調べるために、空の無架橋及び架橋ミセルの双方を、尾静脈を通して２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇの単回投与で、無腫瘍ヌードマウスに注射した。毒性の可能性のある兆候について、マウスをチェックし、生存状況を、２週間、毎日モニターした。

【0151】

２００ｍｇ／ｋｇ，の単回投与では、ＮＣＭ群のマウス全ては著しい体重減少を示し、４匹のマウスのうち１匹が注射後２日のうちに死亡した。より多いＮＣＭ投与量である４００ｍｇ／ｋｇで治療された群のマウスの全ては、注射後２時間のうちに死亡した。何匹かのマウスでは血尿が見られ、高投与量でのＮＣＭに起因する溶血の可能性を示した。反対に、ＤＣＭで治療された群では、４００ｍｇ／ｋｇの単回投与で死亡したマウスはおらず、毒性の明らかな兆候は、注射後２週内に観察されなかった。

【0152】

実施例５ ジスルフィド架橋ミセルからの薬物放出
ＰＴＸ搭載架橋ミセル溶液を、インビトロ薬物放出プロフィールを決定するのに調製した。初期ＰＴＸ濃度は、４．６ｍｇ／ｍＬであった。ＰＴＸ搭載架橋ミセル溶液のアリコートを、３．５ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析カートリッジ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）に注入した。カートリッジを、さまざまなＧＳＨ濃度（０、２μＭ、１ｍＭ、及び１０ｍＭ）を含む１ＬのＰＢＳに対して３７℃で透析した。理想的に沈んだ状態を作るために、１０ｇのチャコールを放出培地に加えた。さまざまな時点で透析カートリッジに残るＰＴＸの濃度を、ＨＰＬＣにより測定した。タキソール（登録商標）及びＰＴＸ搭載無架橋ミセル（ＰＴＸ濃度：５．０ｍｇ／ｍＬ）の薬物放出プロフィールを、比較のために同一条件下で決定した。幾つかの実験では、特定の放出時間（５時間）に、ＧＳＨ又はＮＡＣ（１０ｍＭ）を放出培地に加えた。凍結乾燥し、再水和したミセル溶液のＰＴＸ放出プロフィールを、同じ条件下で評価した。値は、各３連の試料の平均として記録した。

【0153】

タキソール（登録商標）、ＮＣＭ及びＤＣＭからのＰＴＸ放出プロフィールを、透析法を使用することによって比較した。タキソール（登録商標）からのＰＴＸ放出は急速であり、約６０％のＰＴＸが、はじめの５時間のうちに放出された。対照的に、ＮＣＭ及びＤＣＭからのＰＴＸ放出は著しく遅かった（図１４）。ＧＳＨの細胞外のレベル（２μＭ）での存在では、ＤＣＭからのＰＴＸ放出プロフィールは、ＧＳＨを含まない放出培地でのプロフィールと同様であった。なお、細胞内レベル（１０ｍＭ）までＧＳＨ濃度が増加するにつれて、ＰＴＸ放出は徐々に進んだことに留意すべきである（図５Ａ）。また、この薬物放出試験は、ＤＣＭからのＰＴＸ放出が、ＮＣＭからのＰＴＸ放出より著しく遅いことを示した（図１４、図５Ｂ）。５時間の時点で１０ｍのＭＧＳＨを加えたとき、ＤＣＭから一気に薬物が放出したが、ＮＣＭからはなかった（図５Ｂ）。両製剤のそれに続く放出曲線（６時間後）は、同一であった（図５Ｂ）。再水和した凍結乾燥したＰＴＸ−ＤＣＭのＰＴＸ放出プロフィールは、新鮮なサンプルと非常に類似し、ＧＳＨにより大きく促進できることがわかった（図５Ｃ）。ＦＤＡ承認還元剤であるＮＡＣは、ジスルフィド架橋ミセルからのＰＴＸ放出を誘発することに関して、ＧＳＨと同じ効果を有することが示された（図５Ｄ）。従って、ＮＡＣは、全身静注による、必要に応じた開裂試薬としてインビボで適用でき、ナノ治療薬が腫瘍部位に蓄積した後に薬物放出を誘発する。

【0154】

実施例６ ＰＴＸ搭載ジスルフィド架橋ミセルを用いた卵巣癌の治療
腫瘍異種移植片モデル
１００μＬのＰＢＳとマトリゲル（１：１ ｖ／ｖ）との混合物中の７×１０⁶のＳＫＯＶ−３卵巣細胞を、雌ヌードマウスの右脇腹に皮下注入することによって、卵巣癌の皮下異種移植片モデルを確立した。

【0155】

インビボ治療試験
ＳＫＯＶ−３卵巣癌異種移植片をもつヌードマウスを使用して、ＰＴＸの異なる製剤の治療有効性を評価した。腫瘍異種移植片が１００〜２００ｍｍ³の腫瘍容積に達したときに治療を開始し、この日を０日目とした。０日目、これらのマウスをランダムに７群に分け、尾静脈を通して製剤を静注し、３日毎に計６回の投与を繰り返した。注入容積は、マウス体重１０ｇにつき０．１ｍＬであった。７群（ｎ＝８〜１０）を表１に示す。タキソール（登録商標）は、その最大耐量（ＭＴＤ）に近い１０ｍｇ／ｋｇの投与量で与えた。ＰＴＸ搭載ＮＣＭ及びＤＣＭは、比較のため、同じＰＴＸ投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。我々が以前に報告したように、ＰＴＸのミセル製剤は、よりずっと多量に許容されるので（ＭＴＤ ７５ｍｇ／ｋｇ）、抗癌効果が増強されることができるかどうかを決定するのに、ＰＴＸ搭載ミセルはまた、より高投与量（３０ｍｇ／ｋｇ）で投与された。Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）は還元剤であり、粘液溶解薬治療（ブランド名：Mucomyst（登録商標））及びアセトアミノフェン過剰摂取の治療に対してＦＤＡにより承認されている。７番目の群では、ＰＴＸ搭載ＤＣＭの各投与量の投与の２４時間後に、ＮＡＣを１００ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに尾静脈を通して注射した。腫瘍サイズを、デジタルノギスを用いて、週に二回測定した。腫瘍容積を式（Ｌ×Ｗ²）／２により計算した。式中、Ｌは腫瘍直径における最長の長さ、及びＷは最短の長さである（ｍｍ）。群間を比較するには、相対腫瘍容積（ＲＴＶ）を、各測定時点で計算した（ＲＴＶは、最初の治療前の腫瘍容積により除されたある時点での腫瘍容積に相当する）。潜在的な毒性をモニターするには、各マウスの体重を３日毎に測定した。人道的な理由のため、注入した腫瘍容積が、生存データの終点と見なされる１５００ｍｍ³に達したとき、動物を安楽死させた。

【0156】

ＰＴＸ−ＤＣＭ及びＰＴＸ−ＮＣＭの抗癌効果を、皮下ＳＫＯＶ−３腫瘍をもつマウスにおいて、ＰＴＸ（タキソール（登録商標））の臨床製剤と比較して評価した。７群（ｎ＝８〜１０）を表１に示す。ＰＢＳ、タキソール（登録商標）、ＰＴＸ−ＮＣＭ、及びＰＴＸ−ＤＣＭで治療した、ＳＫＯＶ−３腫瘍をもつマウスの腫瘍増殖阻害及び生存率を比較した。結果を図９に示す。対照群と比較して、全治療群のマウスは、腫瘍増殖の著しい阻害を示した（Ｐ＜０．０５）。しかし、１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇ（タキソール（登録商標）のＭＴＤ）の投与量では、タキソール（登録商標）と比較して、ＰＴＸ−ＮＣＭ及びＰＴＸ−ＤＣＭは、より優れた腫瘍増殖阻害及びより長い生存期間を示した。生存期間の中央値は、それぞれ、ＰＢＳについては２１日、１０ｍｇ／ｋｇのタキソール（登録商標）については２７日、１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ−ＮＣＭについては２８．５日、及び１０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭについては３２．５日であった。重要なことには、１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭで治療したマウスの腫瘍増殖率は、１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＮＣＭで治療したマウスと比較して低かった（Ｐ＜０．０５）。ＳＫＯＶ−３癌細胞に対するインビトロ細胞毒性がより低いにもかかわらず、ＰＴＸ−ＤＣＭはインビボ治療有効性の増加を示し、これは長い血液循環時間を経て腫瘍部位に到達するＰＴＸの量がより多いためであるかもしれない。

【0157】

【表2】

【0158】

腫瘍部位及び特に腫瘍細胞内部において、高いグルタチオンレベルが、ミセルからの薬物放出を促進し、細胞毒性を増加することが予期される。３群のマウスに、より高い投与量レベル：３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＮＣＭ、３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣ、Ｍ及び３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭを投与し、２４時間後に１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣをそれぞれ投与した。ＰＴＸ（タキソール（登録商標））を標準的なクレモフォールＥＬ／エタノール製剤で与えた場合、３０ｍｇ／ｋｇはマウスに対する最大耐量（ＭＴＤ）の２倍以上であることを理解することは重要である。３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇにて、３のミセルＰＴＸ製剤で治療したマウス全てにおいて、腫瘍増殖が阻害された（図９Ａ）。高投与量３群の相対腫瘍容積（ＲＴＶ）の中央値は全て、３６日目以前は、１．０未満であった。しかし、その後、高投与量の３群全てで、腫瘍の進行が見られた。３６日目以降、ＰＴＸ−ＤＣＭは、ＰＴＸ−ＮＣＭより有効な腫瘍阻害を示した。なお、３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭ、それに続く１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣでの治療は、腫瘍増殖を阻害するのに有効であることに留意すべきである。８匹のマウスのうち６匹では、９３日目までに、触診可能な腫瘍は検出されなかった。７５％の最高完全腫瘍反応率が、ＰＴＸ−ＤＣＭ及びＮＡＣの併用治療で達成された（図９Ｃ）。ＮＡＣは、病院で還元剤として一般的に使用され、粘液溶解薬治療、及びアセトアミノフェン過剰摂取の治療に対して、ＦＤＡにより承認されている。また、ＮＡＣは全身毒性を減じる手段として、多くの化学療法薬剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）とともに使用されている。しかし、場合によっては、ＮＡＣの投与はまた、これら化学療法薬剤の治療有効性を減じることもあった。この試験では、３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭ、それに続く１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣでの治療は、ＮＡＣを用いない治療より優れた抗癌効果を示した。この結果は、ＮＡＣは、ナノ治療薬治療の２４時間後に投与されたとき、主に還元剤の役割を果たして、ミセル内ジスルフィド架橋を開裂し、必要に応じて薬物を放出することを示した。この重要なインビボでの観察所見は、大きな橋渡し的な（translational）可能性があり、将来、治験において容易にテストすることができる。

【0159】

動物の行動及び体重変化への影響を分析することにより、毒性を評価した。１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのタキソール（登録商標）で治療したマウスの群は、注射後１０分を超えて全体的な行動の減少を、しばしば示した。これは、恐らく、パクリタキセル用の媒体としてクレモフォールＥＬ及びエタノールを使用したこと、及び血中のＰＴＸのピークレベルが急速に高まったことによるものである。１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＮＣＭ及び１０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭの投与後に、行動に目立った変化は観察されなかった。３０ｍｇＰＴＸ／ｋｇのＰＴＸ−ＤＣＭ、それに続く１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣを受けたマウスの群は、他のミセルＰＴＸ群に比較して、若干多い体重減少（１２．２％）を治療サイクル中に示した。特定の理論に束縛されるものではないが、考えられる理由の１つは、高投与量のＮＡＣの注射である。他方では、注射の２４時間後に血液循環中に、ほんの一部のＰＴＸ−ＤＣＭが依然として存在した可能性があるかもしれない。ＮＡＣの投与は、循環するＰＴＸ−ＤＣＭから血流への薬物放出を誘発し、従ってマウスに毒性をもたらし得る。ＮＡＣの投与量及び注射時間を至適化することにより、恐らく全身毒性を最小限に抑えることができる。

【0160】

実施例７ ビンクリスチン搭載ジスルフィド架橋ミセルの調製
１０ｍＬ丸底フラスコ中で、１ｍｇの硫酸ビンクリスチン粉末を、クロロホルム中の３モル当量のトリエチルアミン（ＴＥＡ）で溶かし、２０ｍｇのＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマーと混ぜた。クロロホルムを真空下で蒸発させて、薄膜を形成し、続いて１ｍＬのＰＢＳバッファーで膜を水和し、３０分間ソニケーションした。次に、上記のように、ＶＣＲ搭載ミセルを、Ｏ₂を介した酸化によって架橋した。１０ｍＬ丸底フラスコ中で、１ｍｇの硫酸ビンクリスチン粉末を、クロロホルム中の３モル当量のトリエチルアミン（ＴＥＡ）で溶かし、２０ｍｇのＰＥＧ^5k−Ｃｙｓ₄−Ｌ₈−ＣＡ₈テロデンドリマーと混ぜた。クロロホルムを真空下で蒸発させて、薄膜を形成し、続いて１ｍＬのＰＢＳバッファーで膜を水和し、３０分間ソニケーションした。次に、上記のように、ＶＣＲ搭載ミセルを、Ｏ₂を介した酸化によって架橋した。遊離チオール基のレベルを、エルマン試験により、経時的にモニターした。

【0161】

実施例８ ビンクリスチン搭載ジスルフィド架橋ミセルの特徴付け
ビンクリスチン搭載ジスルフィド架橋ミセルの特徴付けを、特に示した場合を除いて、上記の方法を用いて実施した。

【0162】

安定性
生理的条件及び苛酷なミセル破壊条件におけるＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲの安定性を比較した。両タイプのミセルを、５０％ヒト血漿と３７℃でインキュベーションし、ＤＬＳを用いて経時的にそのサイズをモニターした。２４時間後、ＮＣＭ−ＶＣＲのサイズは、１６から３１ｎｍへわずかに増加し、粒径分布は広く、幾つかの粒子は１００ｎｍｍの大きさであった（図１６Ａ）。それに引き換え、ＤＣＭ−ＶＣＲのサイズは、２４時間の間変わらなかった（図１６Ｃ）。ミセル安定性を更に検討するのに、我々は、ＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲを、高分子ミセルを効率的に破壊することが知られているＳＤＳ、２．５ｍｇ／ｍＬとインキュベーションした後、粒径をモニターした。ＳＤＳをＮＣＭ−ＶＣＲに加えて直ちに、ミセルサイズが１５から１ｎｍへ減少し、完全なミセル破壊を示した（図１６Ｂ）。ＤＣＭ−ＶＣＲはミセル破壊に抵抗を示し、粒径を維持した（図１６Ｄ）。ＤＣＭ−ＶＣＲを安定させるミセル内ジスルフィド結合は可逆的であり、標的細胞の内部が高度に還元環境である場合か、又はＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）などの還元剤が外部添加された際に、薬物放出が可能になる。ＳＤＳ及びＮＡＣ（２０ｍＭ）の存在下で、ＤＣＭ−ＶＣＲの完全な状態に支障を来たし、１時間後には粒子の完全な破壊が観察された（図１６Ｅ）。

【0163】

薬物放出
ＶＣＲの異なる製剤のインビトロ薬物放出プロフィールを、透析法を用いて測定した。ＮＣＭ及びＤＣＭを２０ｍｇ／ｍＬのテロデンドリマーで調製し、１ｍｇ／ｍＬのＶＣＲを搭載した。ＶＣＲの従来の製剤（１ｍｇ／ｍＬ）、ＮＣＭ−ＶＣＲ、及びＤＣＭ−ＶＣＲのアリコートを、３．５ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）をもつ透析カートリッジ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）に注入した。カートリッジを、１ＬのＰＢＳに対して１００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１０ｇ／Ｌの活性炭の存在下で透析し、沈んだ状態にした。さまざまな時点で透析カートリッジに残るＶＣＲの濃度を、９倍量のＤＭＳＯを加え、及び１０分間ソニケーションすることにより、薬物をミセルから放出した後、分光測定により測定した。値は、各３連の試料の平均として記録した。

【0164】

８時間後、ＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲについては、それぞれ４４％及び２４％の放出であったのに対して、従来のＶＣＲ試料は、ＶＣＲを７３％放出した。２４時間までに、ほぼ１００％の従来のＶＣＲが放出されていた一方で、ＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲは、その元のＶＣＲ含量の２０％及び４３％を保持した。我々は、ＮＡＣ又はグルタチオン（ＧＳＨ）などの還元剤を透析液に加えたとき、薬物放出を急速に進めることができることを、以前に明らかにしている。

【0165】

インビトロ毒性
ラージ細胞を、９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。細胞をＶＣＲの従来の製剤、ＮＣＭ−ＶＣＲ、及びＤＣＭ−ＶＣＲで、７２時間連続して治療した。別の実験で、ラージ細胞をＶＣＲ製剤とともに２時間インキュベーションし、ＰＢＳで３回洗い、培地再懸濁し、更に７０時間インキュベーションした。７２時間後、細胞の生存を、製造業者の取扱説明書に従ってCellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assayを用いて評価した。ＭＴＳ溶液（２０μＬ）を各ウェルに加え、１時間インキュベーションした後に細胞の生存を評価した。３連ウェルについて、処理されていない対照の割合としての細胞の生存を次のようにして計算した：［（ＯＤ₄₉₀処理−ＯＤ₄₉₀バックグラウンド）／（ＯＤ₄₉₀対照−ＯＤ₄₉₀バックグラウンド）×１００］

【0166】

２のＶＣＲミセル製剤の間では、ＮＣＭ−ＶＣＲのほうが、ＤＣＭ−ＶＣＲより細胞毒性が強かった。２５ｎＭの濃度で従来のＶＣＲは、６８％の細胞を死滅させた一方で、同じ濃度のＮＣＭ−ＶＣＲ及びＤＣＭ−ＶＣＲは、それぞれ５８％及び３６％の細胞を死滅させた。

【0167】

実施例９ ビンクリスチン搭載ジスルフィド架橋ミセルを用いたＢ細胞リンパ腫の治療
異種移植片モデル
バーキットＢ細胞リンパ腫細胞株であるラージ細胞を、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ；バージニア州マナサス、アメリカ合衆国）から購入した。加湿した、５％ＣＯ₂インキュベーターを用いて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充した、ＡＴＣＣにより配合されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃にて、細胞を培養した。腫瘍細胞移植の３日前に、マウスは４００ラドの全身照射を受けた。腫瘍の樹立には、ＰＢＳに再懸濁した５ｘ１０⁶のラージ細胞を、各マウスの横腹に皮下注入した。

【0168】

インビボ治療試験
ＮＨＬラージ腫瘍を、１００〜２００ｍｍ³の範囲に達するまで増殖させ、これを０日目とした。次に、マウスをランダムに５治療群に分けた（１群あたり、ｎ＝６〜８）。第１治療群は、対照としてＰＢＳから構成した。第２及び第３群は、ともに１ｍｇ／ｋｇの投与量の、ＶＣＲの従来の製剤及びＤＣＭ−ＶＣＲから構成した。第４群は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を１００ｍｇ／ｋｇで加えたＤＣＭ−ＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇ）から構成した。ＮＡＣは還元剤であり、粘液溶解薬治療（ブランド名：Mucomyst（登録商標））及びアセトアミノフェン過剰摂取の治療に対してＦＤＡにより承認されている。ＮＡＣは、ＤＣＭ−ＶＣＲの投与の２４時間後に静脈内投与した。第５群は、２．５ｍｇ／ｋｇの投与量のＤＣＭ−ＶＣＲのみから構成した。治療は０日目及び９日目に施され、尾静脈から注射した。体重および腫瘍容積を、週に２回測定し、腫瘍容積はデジタルノギスを用いて評価し、式：（ＬｘＷ²）／２を用いて計算した。マウスは、腫瘍容積が１５００ｍｍ³又は２０ｍｍのどちらかの寸法を超えた場合、殺処分した。

【0169】

ＰＢＳ対照に比較して、ＶＣＲ治療の全てが、腫瘍増殖における減少を引き起こした（ｐ＜０．０５）。１ｍｇ／ｋｇのＤＣＭ−ＶＣＲを受けたマウスは、従来のＶＣＲと同じ投与量で比較して、優れた抗癌効果を示さなかった。しかし、１ｍｇ／ｋｇのＤＣＭ−ＶＣＲとその２４時間後に１００ｍｇ／ｋｇのＮＡＣを受けたマウスは、従来のＶＣＲと同じ投与量で比較して、より大幅な腫瘍容積の減少を確かに示した（ｐ＜０．０５）。我々は、より高い有効性は、ＤＣＭ−ＶＣＲが腫瘍部位に蓄積すると、ＤＣＭ−ＶＣＲから必要に応じて薬物が放出されることに起因すると考える。１ｍｇ／ｋｇの従来のＶＣＲ及びＮＡＣを用いないＤＣＭ−ＶＣＲは、同等な有効性を示した、（ＮＡＣを用いて及び用いずに）ＤＣＭ−ＶＣＲを受けたマウスの群は、従来のＶＣＲを受けたマウスの群と比べて、重量の減少が著しく少なかった（図１９Ｂ）。臨床的利点の点から、ＤＣＭ−ＶＣＲは、有効性を犠牲にしない、毒性のより少ない治療の選択肢を提供し得る。腫瘍容積おける最大の減少は、２．５ｍｇ／ｋｇのＤＣＭ−ＶＣＲを受けた群で観察され、全治療群と比べて著しく大きな腫瘍減少を示した（ｐ＜０．００５）。なお、２．５ｍｇ／ｋｇのＤＣＭ−ＶＣＲ治療群は、１ｍｇ／ｋｇの従来ＶＣＲ群と同量の体重を失ったこと（図１９Ｂ）に留意すべきである。

【0170】

【表3】

【0171】

【表4】

【0172】

最終治療の８日後に、我々は、ＰＢＳ群、従来のＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇ）群、及びＤＣＭ−ＶＣＲ（２．５ｍｇ／ｋｇ）群のマウスの坐骨神経を解剖して、組織学的分析によりＶＣＲの急性神経毒性作用を評価した。ＶＣＲは、光学顕微鏡又は電子顕微鏡のいずれかで観察することができる神経線維の軸索変性及び脱髄の原因となることが知られている。組織学的分析により、従来のＶＣＲ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＤＣＭ−ＶＣＲ（２．５ｍｇ／ｋｇ）で治療した群の神経線維には明らかな損傷がなく、ＰＢＳ対照群と比較して違いがないことが明らかになった（図２０）。

【0173】

最大耐量
ＶＣＲの従来の製剤及びＤＣＭ−ＶＣＲの最大耐量を、健常な雌ｂａｌｂ／ｃマウスで調べた。マウス（ｎ＝４）を、１．５、２．５、３．５、及び４．５ｍｇのＶＣＲ／ｋｇの投与量にて、ＶＣＲの従来の製剤又はＤＣＭ−ＶＣＲで治療した。ＶＣＲは、１０日毎に計２回の治療で、尾静脈から投与した。体重及び他の毒性の症状（粗毛、運動失調、立毛、後肢まひ）を、２０日間、毎日観察した。ＭＴＤは、２０％の体重中央値減少の許容値として定義され、毒性作用による死亡も、全身兆候における著しい変化も引き起こさない。

【0174】

従来のＶＣＲの１．５ｍｇ／ｋｇで治療したマウスでは、著しい体重減少があった（１８％）。４日目以降、これらのマウスは体重を取り戻し始め、１０日目に初期体重に達した。１．５ｍｇ／ｋｇを超える従来のＶＣＲの投与量で治療したマウスは、体重の＞２０％を失い、殺処分された。この試験において決定された従来のＶＣＲのＭＴＤは、以前に他のグループにより観察されたＭＴＤと同様であった。ＤＣＭ−ＶＣＲの形態のＶＣＲの同じ投与量で治療したマウスは、全ての投与量で、重量減少が著しく少なかった。ＤＣＭ−ＶＣＲの最高投与量である４．５ｍｇ／ｋｇを受けたマウスの群のみが、初期体重の＞２０％のを失い、殺処分された。よって、ＤＣＭ−ＶＣＲは、ＶＣＲのＭＴＤを１．５から３．５ｍｇ／ｋｇに増加（＞２倍）することができた。薬が使用される状況においてＶＣＲの投与量を強化することは、患者が毒性に制限されることなく全投与量の化学療法を受けることを可能にし得るので重大な意義がある。

【0175】

毒性
上記の治療試験からのマウスを同様に使用して、ＶＣＲの血液及び神経毒性も調べた。最終治療の８日後に、各群からのマウス（ｎ＝３）の血液を、全血球を決定し、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、総ビリルビン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、及びクレアチニンを含む血液生化学的な分析をするために採取した。ビンクリスチン製剤の神経毒性作用を比較するには、最終治療の８日後にマウス（ｎ＝３）を殺処分し、坐骨神経を大腿部の近位側から総腓骨、脛骨、及び腓腹神経に分かれるところの近位にある膝関節まで慎重に解剖した。神経をエポキシブロックの中にて処理し、５００ｎｍの切片を切り、スライド上に取り、メチレンブルー及びアズールＢ染色で染色した。切片をオリンパスＢＨ−２顕微鏡で撮像し、像をSpot Insightデジタルカメラ（Diagnostic Instruments, Inc.）を用いて取得した。

【0176】

実施例１０ カテコールで修飾されたコンジュゲート（ＰＥＧ^5k−カテコール₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈）の調製
２及び４の３，４−ジヒドロキシ安息香酸を含有するテロデンドリマー（それぞれ、ＰＥＧ^5k−カテコール₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈と命名した）を、段階的なペプチド化学によってＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂から液相縮合反応を介して合成した。ＰＥＧ^5k−カテコール₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈の合成の典型的な手順は次の通りである：（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（３当量）を、ＤＩＣ及びＨＯＢｔをカップリング試薬として用いて、それによってカップリング反応の完了が示される陰性のカイザーテスト結果が得られるまで、ＰＥＧのＮ末端にカップリングした。冷エーテルを加えることによって、ペグ化された分子を沈殿させ、次に冷エーテルで２回洗浄した。Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）の４−メチルピペリジンでの処理によって除去し、ペグ化された分子を沈殿させ、冷エーテルで３回洗浄した。白色粉末沈殿物を真空下で乾燥し、（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングを１回、及び（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨのカップリングを３回、それぞれ実施し、ＰＥＧの１の末端が４のＦｍｏｃ基で終わる、第三世代の樹枝状ポリリシンを生成した。次に、コール酸ＮＨＳエステルを、樹枝状ポリリシンの端末側終端にカップリングした。ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の５０％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でＢｏｃ基を除去して、（Ｆｍｏｃ）Ｅｂｅｓ−ＣＯＯＨを、ＰＥＧとコール酸との間の隣接するリシンのアミノ基にカップリングした。Ｆｍｏｃ基を除去した後、ポリマーの一部を、３，４−ジヒドロキシ安息香酸とカップリングし、生じＰＥＧ^5k−Ｌ₂−カテコール₂−ＣＡ₈テロデンドリマーを得た（スキームＳ−１）。ポリマーの他の一部を、（Ｆｍｏｃ）ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ及び３，４−ジヒドロキシ安息香酸と続けてカップリングし、ＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈テロデンドリマーを生成した（スキームＳ−１）。

【0177】

ローダミンＢで標識したテロデンドリマーを調製するために、初めに（Ｆｍｏｃ）Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ₂にカップリングし、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イルジン）エチル（Ｄｄｅ）保護アミノ基を導入した。ＤＭＦ中の２％（ｖ／ｖ）ヒドラジンによりＤｄｅ保護基を除去した後に、ローダミンＢイソチオシアネートを、最終テロデンドリマー中のＰＥＧとコール酸との間の隣接するリシンのアミノ基に結合した。

【0178】

実施例１１ ４−カルボキシフェニルボロン酸で修飾されたコンジュゲート（ＰＥＧ^5k−ＢＡ₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−ＢＡ₄−ＣＡ₈）並びに３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸で修飾されたコンジュゲート（ＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈）の調製
２又は４の４−カルボキシフェニルボロン酸及び３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸を含有するテロデンドリマー（それぞれ、ＰＥＧ^5k−ＢＡ₂−ＣＡ₈、ＰＥＧ^5k−ＢＡ₄−ＣＡ₈、ＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₂−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈と命名した）を、上記と同様の方法によって合成した。最終工程で、４−カルボキシフェニルボロン酸ピナコールエステル及び３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸ピナコールエステルを、Ｅｂｅｓリンカー又はＰＥＧとコール酸との間のリシンにカップリングした。ＤＣＭ中の５０％（ｖ／ｖ）ＴＦＡでピナコールエステルを除去して、４種類のテロデンドリマーを含有するボロン酸を生成した。テロデンドリマーを、ＤＭＦ及びエーテルでのそれぞれ溶解／再沈殿の３回のサイクルにより、混合物から回収した。そして、テロデンドリマーをアセトニトリル／水に溶かし、凍結乾燥した。我々が以前に報告した方法に従って、ＰＥＧ^5k−ＣＡ₈親テロデンドリマーを合成し、無架橋ミセルを調製した。

【0179】

実施例１２ ボロン酸架橋ミセルの調製
最初に、１０ｍＬ丸底フラスコ中で、２の異なるボロン酸含有テロデンドリマー及びカテコール含有テロデンドリマー（計２０ｍｇ）を無水クロロホルムに溶かした。クロロホルムを真空下で蒸発させて、薄膜を形成した。ＰＢＳバッファー（１ｍＬ）を加えて、薄膜を再水和し、続いて３０分間ソニケーションした。ＰＢＳ中で自己組織化して、ボロン酸と隣接したテロデンドリマーのカテコールとの間にボロン酸エステル結合を形成して、ボロン酸架橋ミセル（ＢＣＭ）の形成をもたらした。ミセル溶液を０．２２μｍフィルターでろ過して、サンプルを滅菌した。

【0180】

実施例１３ 薬物搭載ボロン酸架橋ミセルの調製
パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、及びビンクリスチン（ＶＣＲ）などの疎水性の抗癌剤を、我々の以前の研究で記載したように溶媒蒸発法によりミセルに搭載した。簡潔に、最初に１０ｍＬの丸底フラスコ中で、薬物（２．０ｍｇ）及びテロデンドリマー（計２０ｍｇ）を無水クロロホルムに溶かした。クロロホルムを真空下で蒸発させ、薄膜を形成した。ＰＢＳバッファー（１ｍＬ）を加えて薄膜を再水和し、その後、３０分間ソニケーションした。搭載されなかったＰＴＸを、ミセル溶液を遠心式フィルターろ過装置（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ、Microcon（登録商標））に通すことによって取り除いた。フィルター上のＰＴＸ搭載ミセルをＰＢＳで回収した。９倍量のアセトニトリルの添加及び１０分間のソニケーションによりミセルから薬物を放出した後に、ミセルに搭載された薬物の量を、ＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社）で分析した。薬物搭載は、基準薬物のＨＰＬＣ面積値と濃度との間の校正曲線に従って計算した。搭載効率は、初期薬物含量に対するミセルに搭載された薬物の比として定義される。同じ方法を用いて、疎水性の色素（ＤｉＯ又はＤｉＤ）をミセルに搭載した。９倍量のアセトニトリルの添加及び１０分間のソニケーションによりミセルから薬物を放出した後に、ミセルに搭載された色素の量を、蛍光分光計（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）で分析した。色素の搭載は、アセトニトリル中の基準色素の蛍光強度と濃度との間の校正曲線に従って計算した。

【0181】

実施例１４ 薬物搭載ボロン酸架橋ミセルの特徴付け
一般的性質
ミセルのサイズ及びサイズ分布を、動的光散乱（ＤＬＳ）計測器（Microtrac）により測定した。ＤＬＳ測定のために、ミセル濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに保った。測定の全てを２５℃で行い、データをMicrotrac FLEXソフトウェア １０．５．３により分析した。ミセルの形態を、フィリップスＣＭ−１２０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。ミセル水溶液（１．０ｍｇ／ｍＬ）を銅グリッドに置き、リンタングステン酸で染色し、室温にて測定した。ＮＣＭ及びＢＣＭのみかけの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、前述のように、ピレンを疎水性蛍光プローブとして使用することによって、蛍光スペクトルを介して測定した。簡潔に、ミセルをＰＢＳで連続段階希釈して、５×１０−⁷〜５×１０−⁴Ｍの範囲の濃度とした。メタノール中のピレンのストックをミセル溶液に加え、２×１０−⁶Ｍのピレンの最終濃度とした。溶液を、一晩穏やかに振とうした。発光を３９０ｎｍで固定し、励起スペクトルを３００〜３６０ｎｍの範囲で記録した。ピレンの励起スペクトルからの、強度３３２ｎｍに対する３３７ｎｍの比を、ミセルの濃度に対してプロットした。強度比Ｉ３３７／Ｉ３３２が著しく増加し始める閾値濃度からＣＭＣを決定した。

【0182】

【表5】

【0183】

【表6】

【0184】

ＡＲＳを基にした比色及び蛍光アッセイ
ＡＲＳは、ボロン酸に結合するとすぐに劇的な色及び蛍光強度の変化を見せるカテコール色素である。この試験では、我々は、ＡＲＳ指示薬を基にした比色アッセイを利用して、テロデンドリマー上のボロン酸の濃度を推定した。簡潔に、ボロン酸の濃度が増加するにつれて、赤紫色から黄色への目に見える色の変化が観察された。ＡＲＳの色及び吸光度の変化は、３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸を加えるとともに観察された。ボロン酸を加えるにつれて、５２０ｎｍでの遊離ＡＲＳの吸光度は減少し、新たに５２０ｎｍでの吸光度が出現する。４６０ｎｍでの吸光度変化（ΔＡ）を、４−カルボキシフェニルボロン酸の濃度（［ＢＡ］）及び３−カルボキシ−５−ニトロフェニルボロン酸の濃度（［ＮＢＡ］）の関数としてプロットすることにより、校正曲線を作成した。校正曲線に基づいて、比色アッセイにおける試料の吸光度から、テロデンドリマー上のボロン酸の数を計算した（表６）。

【0185】

またＡＲＳは、ボロン酸の結合に応えて劇的な蛍光強度の変化を見せる。ボロン酸含有テロデンドリマー溶液（ボロン酸濃度：０〜５ｍＭ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のＡＲＳ溶液と混ぜ、混合物の蛍光シグナルを蛍光分光計（Nanodrop3000、Microtrac）により測定した。ＡＲＳの最終濃度を０．１ｍＭに固定した。ＡＲＳ蛍光アッセイを更に使用して、ボロン酸含有テロデンドリマーとカテコール含有テロデンドリマーとの間の結合の特徴付けを行った。この実験では、ＡＲＳ及びボロン酸含有テロデンドリマーのボロン酸の最終濃度を０．１ｍＭに固定した。異なるモル比のカテコール含有テロデンドリマーを、無水クロロホルム中で、ボロン酸含有テロデンドリマー（０．１ｍＭ）と前もって混ぜた。クロロホルムを蒸発させ、フラスコの内面上の薄膜をＰＢＳバッファーで再水和して、ボロン酸架橋ミセルを生成した。次に、ＡＲＳ溶液を上記ミセル溶液と混ぜ、混合物の蛍光シグナルを蛍光分光計（Nanodrop3000、Microtrac）により測定した。

【0186】

ＡＲＳ及びボロン酸含有テロデンドリマーの濃度を０．１ｍＭに固定したとき、ＡＲＳの蛍光は、ＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈（０〜０．５ｍＭ）の量の増加とともに、劇的に抑制された（図２２）。ＡＲＳはボロン酸含有テロデンドリマーとの錯体形成を阻まれたので、これらの結果はカテコール−ボロン酸架橋エステルの形成の定性的な指標である。

【0187】

安定性
安定性試験を行って、高分子ミセルを効率的に分解することが報告されていたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で、ＤＣＭ及びＮＣＭの粒径の変化をモニターした。ＳＤＳ溶液（７．５ｍｇ／ｍＬ）をミセルの水溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）に加えた。最終ＳＤＳ濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであり、ミセル濃度を１．０ｍｇ／ｍＬに保った。ミセル溶液のサイズ及びサイズ分布を、動的光散乱（ＤＬＳ）計測器（Microtrac）によって、２日間連続してモニターした。ミセルの安定性もまた、異なるｐＨレベルのＰＢＳ中、又はＳＤＳとともにマンニトール及びグルコース（０、１０ｍＭ、５０ｍＭ、及び１００ｍＭ）の存在下で評価した。塩化水素及び水酸化ナトリウム溶液を使用して、異なるｐＨレベルのＰＢＳを調製した。バッファーのｐＨ値は、ｐＨ値を０．０１ユニット以内で与えるデジタルｐＨメーター（Φ３５０ ｐＨ／Ｔｅｍｐ／ｍＶメーター、ベックマン・コールター、アメリカ合衆国）により決定した。安定性試験中に、ほんの一部の試料を取り出し、ＴＥＭの下で更に観察した。更に、ＮＣＭ及びＤＣＭの安定性を、健常人のボランティアからの５０％（ｖ／ｖ）血漿中で調べた。混合物を生理的体温（３７℃）でインキュベーションし、続いて所定の時間間隔で９６時間までサイズを測定した。

【0188】

ＮＣＭの粒径シグナルの急速な消失（＜１０秒）は、完全な状態が失われとことを反映する（図３０Ａ及びＣ）。ＢＣＭ１、ＢＣＭ２、及びＢＣＭ３は、ＳＤＳ中で、それぞれ２分間、５分間、及び３０分間、サイズを保持した（表５）。同じ条件下で処理したＢＣＭ４については、初期の減少にもかかわらず、一定の粒径が２日にわたって観察され、これは、架橋ミセルが完全な状態のままのＰＥＧ^5k−ＮＢＡ₄−ＣＡ₈及びＰＥＧ^5k−カテコール₄−ＣＡ₈のテロデンドリマーペアから自己組織化したことを示した（図２２Ｂ、図３０）。ＢＣＭ３及びＢＣＭ４は、２倍の数のボロン酸エステルを含有しており、ＢＣＭ１及びＢＣＭ２とそれぞれ比較して、ＳＤＳの存在下で著しく長い間、その構造的完全性を保持した。ニトロフェニルボロン酸エステルによって架橋されたＢＣＭ２及びＢＣＭ４は、対応するフェニルボロン酸エステル架橋ミセルであるＢＣＭ１及びＢＣＭ３と比べて、より安定であった。

【0189】

更に、我々は、ＳＤＳの存在下で、ｐＨ及びジオールへの反応をＢＣＭ４について調べた。ｐＨ５．０でのインキュベーションの１２０分後に、ＢＣＭ４の粒径シグナルは、ＳＤＳ中で急に（２分以内）減少し、臨界割合のボロン酸結合が加水分解されてミセルが急速に解離したことを示した（図２２Ｂ、図３０Ｇ）。ＳＤＳ及び過剰なマンニトール（１００ｍＭ）の存在下でのＢＣＭ４の粒径の急速な減少からも明らかなように、我々は、マンニトール（３のシス−ジオールペアを含有する）もまた、効率的にＢＣＭ４の架橋ボロン酸結合を開裂できることを見出した（図２２Ａ、図３０Ｈ）。反対に、ＳＤＳ及び１００ｍＭグルコース（１のシス−ジオールを含有する）の双方の存在下では、ＢＣＭ４のサイズは変わらなかった（図３０Ｉ）。ＴＥＭにより、ＮＣＭのミセル構造がＳＤＳ溶液中で破壊されていることを確認できた。ＴＥＭグラフはまた、ＢＣＭ４のミセル構造は、ｐＨ７．４のＳＤＳ中では良く保持されたが（図２２Ｃ２）、ｐＨ５．０のＳＤＳ中、又は１００ｍＭのマンニトールの存在下では急速に破壊された（図２２Ｃ３、Ｃ４）ことを示した。

【0190】

細胞取り込み及びＭＴＴアッセイ
ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、８ウェル組織培養チャンバースライド（ＢＤバイオサイエンス、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ベッドフォード）に、１ウェルあたり５００００細胞の密度で播種し、続いて１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５ａ培地中で、２４時間インキュベーションした。培地を交換し、ＤｉＤで標識したミセル（１００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに加えた。３０分後、１時間後、２時間後、及び３時間後に、細胞をＰＢＳで３回洗い、４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞核をＤＡＰＩで染色した。スライドをカバーガラスでマウントし、共焦点レーザー走査顕微鏡（オリンパス、ＦＶ１０００）下で観察した。ＤｉＤチャネルについては、励起を６２５ｎｍに設定した一方で、発光を７００ｎｍに設定した。

【0191】

ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、処理の２４時間前に、９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルの密度で播種した。培養培地を、１００ｍの マンニトールの非存在又は存在下でｐＨ７．４又は５．０の異なる希釈剤と、ＰＴＸのさまざまな製剤を含有する新鮮な培地と交換した。細胞をＰＢＳで洗浄し、加湿した、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーター中で更に２３時間インキュベーションした。ＭＴＴを各ウェルに加え、更に４時間インキュベーションした。５７０ｎｍ及び６６０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダー（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）を用いて検出した。未処理の細胞が対照の役割を果たした。結果は、３連のウェルの平均細胞の生存率［（ＯＤ_処理−ＯＤ_ブランク）／（ＯＤ_対照−ＯＤ_ブランク）×１００％］として表わした。また、テロデンドリマーに関連する毒性を評価するために、異なる希釈剤とともにテロデンドリマー及び空架橋ミセルでも細胞を処理し、計７２時間インキュベーションした。

【0192】

ＰＴＸ−ＮＣＭは、タキソール（登録商標）（パクリタキセルの遊離薬物）に匹敵するＳＫＯＶ−３細胞に対するインビトロ抗癌効果を示した。ＰＴＸ−ＢＣＭ４は、等しい投与量レベルで、タキソール（登録商標）及びＰＴＸ−ＮＣＭより細胞毒性が著しく低いことがわかった。ＰＴＸ−ＮＣＭ及び酸性のｐＨ及びマンニトールで誘発された遊離薬物の毒性プロフィールには微少な変化があった。ＰＴＸ−ＢＣＭ４は、マンニトール（１００ｍＭ）の存在下で、ｐＨ５．０にて、著しく増強した癌細胞阻害を示した。

【0193】

インビボ血中消失動態及び生体内分布
ローダミンＢで標識したＮＣＭ及びＤＣＭを、血中消失試験のために調製した。ローダミンＢ結合ミセルの濃度は２．０ｍｇ／ｍＬであった。ＰＢＳにより２０倍に希釈した、これらのミセルの吸光度及び蛍光スペクトルを、蛍光分光計（SpectraMax M2、モレキュラーデバイス社、アメリカ合衆国）により特徴付けを行った。１００μＬのローダミンＢ結合ＮＣＭ及びＤＣＭを、無腫瘍ヌードマウスに尾静脈をから注射した。注射後の異なる時点で５０μＬの血液を採取して、ローダミンＢの蛍光シグナルを測定した。

【0194】

マウスに静注した後、ＮＣＭのローダミンＢシグナルは、血液循環から急速に消失し、注射後１０時間以内にバックグラウンドレベルに下がった（図２４Ｆ）。血中のＢＣＭ４のローダミンＢシグナルは、注射の１０時間後で、ＮＣＭのシグナルより６倍高く、２４時間を超えて持続した。

【0195】

インビボ毒性
ＰＴＸ搭載ＮＣＭは、安全にインビボ癌治療に適用されてきた。マウスにおける単回治療ＭＴＤは、７５ｍｇＰＴＸ／ｋｇと観察され、対応するテロデンドリマー投与量は２００ｍｇ／ｋｇであった。しかし、疎水性のＰＴＸをＮＣＭ内部に封入してテロデンドリマーを一緒に保つことなしに、ミセルはより動的であり、希釈するとより容易に解離する傾向にあって、溶血性の副作用の原因となり得る。テロデンドリマーに関連するインビボでの毒性について調べるために、空の無架橋及び架橋ミセルの双方を、２００ｍｇ／ｋｇの単回投与で、無腫瘍ヌードマウスに尾静脈から注射した。対照として、ＰＢＳをマウスに注射した。毒性の可能性のある兆候についてマウスをチェックし、生存状況を、２週間、毎日モニターした。注射の７日後に、血球数、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）を含む血液生化学の測定のために、全てのマウスから血液試料を得た。

【0196】

実施例１５ ボロン酸架橋ミセルからの薬物の放出
ＰＴＸ搭載ＮＣＭ及びＢＣＭを、インビトロ放出プロフィールを決定するのに調製した。ＮＣＭ、ＢＣＭ１、ＢＣＭ２、ＢＣＭ３、及びＢＣＭ４に対するＰＴＸ搭載は、計２０ｍｇの測定テロデンドリマーの存在下で、９．９％、９．８％、９．８％、９．９％、１０．０％（ｗ／ｗ、ＰＴＸ／ミセル）であった。ＰＴＸ搭載ミセル溶液のアリコートを、３．５ｋＤａのＭＷＣＯを有する透析カートリッジ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．）に注入した。理想的に沈んだ状態を作るために、１０ｇのチャコールを放出培地に加えた。カートリッジを、異なるｐＨレベル（ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、及びｐＨ５．０）、又はさまざまな濃度のグルコース若しくはマンニトール（０、１０ｍＭ、５０ｍＭ、及び１００ｍＭ）の存在下でＰＢＳ対して３７℃にて透析した。放出培地を、１００ｒｐｍの速度で撹拌した。さまざまな時点で透析カートリッジに残るＰＴＸの濃度を、ＨＰＬＣにより測定した。幾つかの実験では、特定の放出時間（５時間）で放出培地（ｐＨ７．４）を、異なるｐＨレベル（ｐＨ６．５、ｐＨ６．０、ｐＨ５．５、及びｐＨ５．０）及び／又はマンニトール若しくはグルコース（１０及び１００ｍＭ）の存在する新鮮な培地と置き換えた。値は、各２連の試料の平均として記録した。

【0197】

ＮＣＭからのＰＴＸ放出は、急速であり、放出培地のｐＨ又はジオールの存在とは無関係に、約３０％のＰＴＸが、初めの９時間のうちに放出された。フェニルボロン酸を介して架橋されたＢＣＭ３からのＰＴＸ放出は、ｐＨ７．４で、ＮＣＭと比べて著しく遅かったが、ニトロフェニルボロン酸架橋をもつＢＣＭ４と比べて速かった。ＢＣＭ３からのＰＴＸ放出は、培地のｐＨが７．４から６．５へ減少したとき促進された一方で、ＢＣＭ４のＰＴＸ放出はｐＨ５．５で加速された。グルコースのその生理的レベル（２〜１０ｍＭ）での存在下、又はより高い濃度（５０ｍＭ）での存在下でさえでも、ＢＣＭ３及びＢＣＭ４からのＰＴＸ放出は、グルコースを含まない放出培地中でのＰＴＸ放出と同様であった。ＰＴＸ放出は１０ｍＭのマンニトールに影響を受けなかったが、マンニトールの濃度が５０〜１００ｍＭの範囲のまで増加するにつれて徐々に促進されたことに留意すべきである。

【0198】

インビボ（生体内の状況を模倣するために、初めに生理的ｐＨの下である期間（例えば５時間）インキュベーションし、次に酸性のｐＨ及び／又はマンニトールで、ＢＣＭ４からのＰＴＸ放出を誘発した。最初の５時間は、ＢＣＭ４からのＰＴＸ放出は、ＮＣＭからのＰＴＸ放出と比べて著しく遅かった。５時間の時点で、１００ｍＭのマンニトールを加えたとき、又は培地のｐＨを５．０に調整したとき、ＢＣＭ４から一気に薬物が放出した。ＰＴＸ放出は、１００ｍＭのマンニトール及びｐＨ５．０の組み合わせによって更に加速されることができることに留意すべきである。この２段階放出方法を活用することができ、インビボで血液循環中の尚早な薬物放出を最小限にし、続いて酸性の腫瘍微環境、癌細胞の酸性のコンパートメントへのミセルの露出、又はマンニトールの付加的な投与によって誘発される急速な薬物放出が起こることができる。

【0199】

実施例１６ 喘息の治療
ミセルに封入されたデキサメタゾンの治療有効性を評価するために、我々は、アラム中のオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｏｖａ／ａｌｕｍ）感作及びＯＶＡエアロゾル曝露レジメンを採用する喘息マウスモデルを使用する。このモデルは、Ｔ細胞及び好酸球が主動する炎症反応及び粘液過分泌反応という点で喘息の病理学的特徴を模倣し、慢性喘息の構造的な気道の変化を示す（参照文献１及び２）。この実験は、ＵＣデービス校のNick Kenyon博士と共同で行った。デキサメタゾンを、ＰＥＧ^5k−ＣＡ⁸及びＰＥＧ^2k−ＣＡ₄でナノ製剤した。ＯＶＡ曝露マウスを、デキサメタゾン搭載ナノ粒子、又はＰＢＳで治療した。デキサメタゾンナノ製剤は双方とも、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）単独と比べて、肺洗浄細胞計数及び好酸球計数が、より多く減少した（図３４）。

【0200】

以上、明確な理解の助けとなるよう、本発明を実例に基づき詳細に説明したが、当業者であれば理解し得るように、添付の特許請求の範囲内で一定の変更及び修正を加えてもよい。また、本明細書に示す文献は、各文献を個別に援用することにより本明細書に組み込まれるのと同様に、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。本願明細書の記載と引用される文献の記載との間に矛盾がある場合には、本明細書の記載が優先する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】