特許 6235618 感光性イオンを通過させる分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6235618

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】感光性イオンを通過させる分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171113BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171113BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20171113BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20171113BHJP

   C07K 14/405 20060101ALI20171113BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N5/10

   A01K67/027

   A61K31/7088

   A61K49/00

   A61P25/00

   C07K14/405

【請求項の数】20

【全頁数】95

(21)【出願番号】特願2016-72(P2016-72)

(22)【出願日】2016年1月4日

(62)【分割の表示】特願2013-500217(P2013-500217)の分割

【原出願日】2011年3月17日

(65)【公開番号】特開2016-144443(P2016-144443A)

(43)【公開日】2016年8月12日

【審査請求日】2016年2月2日

(31)【優先権主張番号】61/314,969

(32)【優先日】2010年3月17日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100149294

【弁理士】

【氏名又は名称】内田 直人

(72)【発明者】

【氏名】ダイセロート，カール

(72)【発明者】

【氏名】チャン，フェン

(72)【発明者】

【氏名】グラティナール，ヴィヴィアナ

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０８−５０８１６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Zhao et al，Brain Cell Biology，２００８年，Vol.36，p.141-154

【文献】 The Journal of Biological Chemistry，１９９０年，Vol.265, No.3，p.1253-1260

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む送達装置であって、光活性化タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、
ｉ）配列番号：３、配列番号：１、配列番号：２、または配列番号：４に示される配列と少なくとも９５％同一であるコアアミノ酸配列、
ｉｉ）小胞体（ＥＲ）移行シグナル、及び、
ｉｉｉ）膜輸送シグナル、
を含む、送達装置と、
ｂ）光源と、
ｃ）光源による光の発生を制御する制御装置と
を含むシステム。

【請求項2】

制御装置が外部信号に応答するように構成された制御回路を含む、請求項１記載のシステム。

【請求項3】

制御装置が整流回路、バッテリー、パルスタイマー、コンパレータ回路の１以上を含む制御回路を含む、請求項１記載のシステム。

【請求項4】

制御装置が集積回路を含む制御回路を含む、請求項１記載のシステム。

【請求項5】

システムの全て又は一部が埋め込み可能である、請求項１記載のシステム。

【請求項6】

ポリヌクレオチドがマトリックスに存在する、請求項１記載のシステム。

【請求項7】

ポリヌクレオチドがゲルに存在する、請求項１記載のシステム。

【請求項8】

光源が発光ダイオードを含む、請求項１記載のシステム。

【請求項9】

光源が光ファイバーを含む、請求項１記載のシステム。

【請求項10】

ＥＲ移行シグナルがアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む、請求項１記載のシステム。

【請求項11】

膜輸送シグナルがアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む、請求項１記載のシステム。

【請求項12】

コアアミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸２５−３６５と少なくとも９５％同一である、請求項１記載のシステム。

【請求項13】

コアアミノ酸配列が配列番号：３と少なくとも９５％同一である、請求項１記載のシステム。

【請求項14】

コアアミノ酸配列が配列番号：４と少なくとも９５％同一である、請求項１記載のシステム。

【請求項15】

光活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列がプロモータに操作可能に連結されている、請求項１記載のシステム。

【請求項16】

プロモータがＣａＭＫＩＩａプロモータである、請求項１５記載のシステム。

【請求項17】

プロモータがシナプシンＩプロモータである、請求項１５記載のシステム。

【請求項18】

ポリヌクレオチドが発現ベクター中にある、請求項１記載のシステム。

【請求項19】

発現ベクターがウイルスベクターである、請求項１８記載のシステム。

【請求項20】

ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１９に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本特許文献は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１０年３月１７日に出願された、表題「Ｌｉｇｈｔ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｏｎ−Ｐａｓｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」の米国特許仮出願第６１／３１４，９６９号の利益を主張し、本特許文献およびこの基礎となる仮出願で提出された付録は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。

【発明の概要】

【0002】

本開示の態様は、概して、標的細胞を刺激するためのシステムおよびアプローチ、より具体的には、光学を用いて、標的細胞を刺激することに関する。数々の有益な効果を生み出すために、身体の様々な細胞への刺激が利用されている。刺激方法の１つとしては、外部で発生させたシグナルを細胞中へと導く電極の使用が挙げられる。電極による脳刺激技術が抱える１つの問題は、ある所定の精神的プロセスに関与するニューロンの分布の性質である。反対に、異なる種類のニューロンが互いに近く存在して、特定のタスクを実行する間、脳のある領域中で特定の細胞のみが活性化されることである。言い換えれば、異種の神経路が並行して密接な空間的境界を通って移動しているだけでなく、それらの細胞体が、それ自身、混在してまばらに埋め込まれた配置で存在していることもある。このプロセシングの分布した様式のために、中枢神経系内の規範的秩序（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｏｒｄｅｒ）を理解しようとする最良の試みは拒まれてしまうようであり、また、神経調節を困難な治療上の努力としている。脳のこの構造により、電極が、電極が刺激するニューロンの基礎的な生理機能に関して比較的無差別であるため、電極に基づいた刺激に対して問題が生じる。代わりに、電極の極の、ニューロンへの物理的近接が、しばしば、いずれのニューロンが刺激されることとなるかを決める最も大きな唯一の要因となる。したがって、電極を使用して刺激をたった１種類のニューロンへと絶対的に限定するということは、一般的に実現不可能である。

【0003】

刺激するための電極の使用に伴うもう１つの問題は、電極の配置によりいずれのニューロンが刺激されることとなるかが決まるため、機械的安定性が、しばしば不十分となり、電極の、標的領域からの移動を引き起こす、ということである。さらに、体内においてある一定期間が経過すると、電極はしばしばグリア細胞によりカプセル化された状態となり、電極の実効電気抵抗が上昇し、ひいては標的細胞に達するのに必要な電力供給量が増加する。しかしながら、電圧、振動数、またはパルス幅の代償的な上昇により、電流が広がり、さらなる細胞への意図しない刺激が増加する場合がある。

【0004】

もう１つの刺激方法は、光感受性生体分子構造を利用し、光に応答して標的細胞を刺激するものである。例えば、光活性化タンパク質を用いて、細胞膜を通るイオンの流れを制御することができる。細胞膜を通る陽イオンまたは陰イオンの流れを促進または抑制することにより、細胞を一時的に脱分極させることができ、または、脱分極させかつその状態で維持することもでき、または過分極させることもできる。ニューロンは、脱分極によって生じる電流を利用して通信信号（すなわち、神経インパルス）を発生させる種類の細胞の例である。電気的に興奮性の他の細胞としては、骨格筋細胞、心筋細胞、および内分泌細胞が挙げられる。ニューロンは、急速な脱分極を利用して、シグナルを全身に、例えば、運動制御（例えば、筋肉の収縮）、感覚応答（例えば、触覚、聴覚、および他の感覚）、ならびに計算的な機能（例えば、脳機能）等の種々の目的のために伝達する。したがって、細胞の脱分極の制御は、例えば、心理療法、筋肉制御、および感覚機能等が挙げられる（が、これらに限定されない）、数多くの異なる目的のために有益であり得る。

【0005】

本発明の様々な態様は、神経活動を抑制することができる青色光を感知するオプシンに関する。オプシンは、クリプト植物のギャラルディアシータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）（Ｇ．ｔｈｅｔａ）由来である。対象となるオプシンは、Ｇ．ｔｈｅｔａから単離された３番目のオプシンであり、ＧｔＲ３と略される。ＧｔＲ３は、光により照射されたとき、過分極電流を媒介することができる。ＧｔＲ３についての作用スペクトルの特徴は、吸収極大が約４９０ｎｍであり、ＧｔＲ３が黄色光により活性化されないことを示唆している。

【0006】

本発明の様々な態様は、神経活動を興奮させることができる青色光を感知するチャネルロドプシンを対象とするものである。チャネルロドプシンは、デュナリエラサリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）由来である。対象となるチャネルロドプシンは、ＤＣｈＲと略される。ＤＣｈＲは、哺乳動物のニューロンにおいて異種発現される得、青色光により照射されるとき、ロバストな脱分極電流を媒介する。ＤＣｈＲの作用極大は、約５００ｎｍである。

【0007】

本開示の実施形態と一致して、抑制性電流の流れは、ニューロンの脱分極を制止する抑制性電流を生じることにより光に応答するギャラルディアシータ由来のタンパク質を改変することにより生成される。このタンパク質は、対象となるニューロンに送達され、このニューロンが、光に曝露される。

【0008】

本開示の別の実施形態と一致して、ＧｔＲ３プロトンポンプを発現する細胞の光学的な刺激の方法は、細胞へ一連の刺激を提供することを含み、それぞれの刺激は、細胞中に生じる脱分極事象の可能性を増大させる。光は、細胞に、ＧｔＲ３プロトンポンプの発現を活性化するように提供され、それにより、細胞中に生じる脱分極事象の可能性を低下させる。ある特定の実施形態において、提供される光は、青色光スペクトルにある。

【0009】

本開示の別の実施形態と一致して、インビボでのニューロンまたは他の細胞の活動電位を制御するための系が開示される。この系は、青色光に応答するタンパク質をニューロンまたは細胞に導入する送達装置を含む。青色光に応答するタンパク質は、青色光に応答して抑制性電流を生じる。この系は、青色光応答性タンパク質の刺激に対して光を発生する青色光源、および光源による光の発生を制御する制御装置を含む。

【0010】

本開示の別の実施形態と一致して、哺乳動物発現のための光応答性タンパク質を提供するための方法が開示される。光応答性タンパク質は、ギャラルディアシータから単離される。単離されたタンパク質は、Ｃ末端およびＮ末端を有する。小胞体（ＥＲ）移行シグナルを、単離タンパク質のＣ末端に加えて、強化した光応答性タンパク質を作製する。この強化したタンパク質は、対象となる細胞への送達のために空のウイルスベクター中に置かれる。次いで、強化したタンパク質を有するウイルスベクターは、対象となる細胞に送達される。

【0011】

本開示の実施形態と一致して、動物細胞が提供される。動物細胞は、青色光に応答するプロトンポンプを発現する集積された外因性分子を含む。この外因性分子は、ギャラルディアシータ由来である。ある実施形態において、動物細胞は、神経細胞である。動物細胞はまた、例えば、筋細胞であっても、細胞株であってもよい。

【0012】

本開示の上記の考察は、本発明のそれぞれの例示された実施形態または全ての実現形態を記述するように意図されたものではない。以下に続く図および発明を実施するための形態は、これらの実施形態をより具体的に例示するものである。

【図面の簡単な説明】

【0013】

本発明は、以下に続く本発明の種々の実施形態の詳細な説明を考慮し、次の添付の図面と併せて、より完全に理解することができる。

【図1A】細胞小器官膜におけるイオンポンプを示す。

【図1B】細胞膜におけるイオンポンプを示す。

【図2A】光応答性タンパク質の組み合わせを発現する細胞集団を示す。

【図2B】２つ以上の光応答性タンパク質が、同じ細胞集団に導入されるある種の実施形態とともに使用するための刺激プロファイルを示す。

【図3】本発明の例示的実施形態に従う、標的細胞を刺激するためのシステムのブロック図を示す。

【図4】本発明の例示的実施形態に従う、標的細胞を刺激するための埋め込み型装置のブロック図を示す。

【図5】本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み型装置のブロック図を示す。

【図6】Ａ：本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み型装置のブロック図を示す。Ｂ：本発明の例示的実施形態に従う、図６Ａのブロック図に対応する回路図を示す。

【図7】本発明の例示的実施形態に従う、光感受性生体分子を含有するためのメッシュの略図を示す。

【図8】本発明の例示的実施形態に従う、ウイルスマトリックスの略図を示す。

【図9】本発明の例示的実施形態に従う、磁場に応答して光を生成する回路の回路図を示す。

【図10】本発明の例示的実施形態に従う、ＲＦシグナルに応答して、光の生成のためのブロック図および回路を示す。

【図11】本発明の例示的実施形態に従う、それぞれが、光ファイバー装置の略図を示す。

【図12】本発明の例示的実施形態に従う、光感受性生物学的部分の生成における種々の段階を示す。

【図13】本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み型装置を示す。

【図14】本発明の例示的実施形態に従う、別の埋め込み型装置についての略図を示す。

【図15】本発明の例示的実施形態に従う、複数の光源を用いた配置を示す。

【図16】本発明の例示的実施形態に従う、インビボでの１つ以上の細胞の電気的性質を制御するためのシステムを示す。

【図17】本発明の例示的実施形態に従う、インビボでの１つ以上の細胞の電気的性質を制御するためのシステムを示す。

【図18A】本発明の例示的実施形態に従う、光学薬物スクリーニングのためのシステムのブロック図を示す。

【図18B】本発明の例示的実施形態に従う、本方法に基づく、薬物スクリーニングの大型の擬自動化システムの特定の系統図を示す。

【図19】本発明の例示的実施形態に従う、本方法に基づいて動作する、小型の完全に自動化された薬物スクリーニングの系統図を示す。

【図20】Ａ：本発明の例示的実施形態に従う、エミッター／検出器ユニットの一例の仕組みを示す。Ｂ：本発明の例示的実施形態に従う、エミッター／検出器ユニットの別の実施形態の仕組みを示す。

【図21】本発明の例示的実施形態に従う、エミッター／検出器ユニット内で使用されるＬＥＤエミッターを作動させるための電子回路機構を示す。

【図22】本発明の例示的実施形態に従う、一例のスクリーニングプロセスとの関連で一連の事象についての時系列を示す。

【図23】本発明の例示的実施形態に従う、ウェルプレートのウェル内の細胞および薬物サンプルのレイアウトの一例を示す。

【図24】本発明の例示的実施形態に従う、本開示の発明は、ハイスループットの薬物スクリーニングを促進するより大型のシステム内で利用され得る状況を示す。

【図25】Ｄ：ｅＮｐＨＲ３．０で形質導入された細胞およびｅＮｐＨＲ２．０で形質導入された細胞内で示される典型的な光電流トレース、ならびにその要約プロットを示す。Ｅ：ｅＮｐＨＲ３．０で形質導入された細胞およびｅＮｐＨＲ２．０で形質導入された細胞内で示される典型的な過分極トレース、ならびにその要約プロットを示す。

【図26】Ｂ：ＷＧＡ−Ｃｒｅ融合によるシナプス経由の遺伝子活性化のモデルを示す。この概略図は、２つの注入部位（ＷＧＡ−Ｃｒｅ融合遺伝子によるものおよびＣｒｅ依存性オプシンウイルスによる別のもの）ならびに長期間の突出を示し、Ｃｒｅは、形質導入細胞からシナプス経由で送達されて、Ｃｒｅ依存性ウイルスを受けているシナプスによって連結されたニューロンにおいてのみ遠隔の遺伝子発現を活性化することができる。Ｃ：哺乳動物コドンで最適化されたＷＧＡ−ＣｒｅおよびＣｒｅ依存性ＡＡＶベクターに対する構築設計を示す。

【図27】Ａ：６３０ナノメートルの光は、ｅＮｐＨＲ３．０で形質導入されたニューロンにおいてロバストな光電流を誘発することを示す（典型的な電圧クランプトレースを左側に示す）。ｅＮｐＨＲ２．０およびｅＮｐＨＲ３．０を発現するニューロンを比較する要約プロット（右側）；ｅＮｐＨＲ２．０、４２．７±４．５ｐＡ、ｅＮｐＨＲ３．０、２３９．４±２８．７ｐＡ、不対ｔ検定ｐ＝０．００００４；ｎ＝１０。 Ｂ：６３０ナノメートルの照射は、ロバストな過分極を誘発したことを示す（典型的な電圧クランプトレースを左側に示す）。ｅＮｐＨＲ２．０およびｅＮｐＨＲ３．０を発現するニューロンを比較する要約プロット（右側）；ｅＮｐＨＲ２．０については、１５．６±３．２ｍＶおよびｅＮｐＨＲ３．０については、４３．３±６．１ｍＶ；不対ｔ検定ｐ＝０．００１１６；ｎ＝１０。 Ｃ：赤色および遠赤色／赤外線の境界線の照射の異なる５つの波長により誘発される外向き光電流の要約を示す：６３０ｎｍ、２３９．４±２８．７ｐＡ（左、ｎ＝１０）；６６０ｎｍ、１２０．５±１６．７ｐＡ（中央、ｎ＝４）；および６８０ｎｍ：７６．３±９．１ｐＡ（右、ｎ＝４）。出力密度：３．５ｍＷ／ｍｍ^２（６３０ｎｍ）および７ｍＷ／ｍｍ^２（６６０ｎｍ、６８０ｎｍ）。 Ｄ：赤色および遠赤色／赤外線の境界線の光による照射は、ｅＮｐＨＲ３．０を発現するニューロンにおける電流注入により誘導されたスパイクを抑制したことを示す。典型的な電流クランプトレースは、６３０ｎｍ（左上）、６６０ｎｍ（右上）、および６８０ｎｍ（下）で光学的抑制を示す。出力密度：３．５ｍＷ／ｍｍ^２（６３０ｎｍ）および７ｍＷ／ｍｍ^２（６６０ｎｍ、６８０ｎｍ）。 Ｇ：青色光（４４５ｎｍ、５ｍパルス）は、２０Ｈｚ（左）および１０Ｈｚ（右）でスパイクをもたらしたが、黄色光（５９０ｎｍ）の同時適用は、スパイクを抑制したことを示す。 Ｆ：ｅＮＰＡＣ、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、およびｅＮｐＨＲ３．０のみに対する活性化スペクトラルを示す。

【図28】Ｂ：５６０ナノメートルの光は、ｅＢＲ細胞中で外向き光電流を誘導したこと、および電圧クランプ法にける対応するサンプルトレースを示す。Ｃ：５６０ナノメートルの光は、ｅＢＲ細胞中で過分極を誘導したこと、および電流クランプ法における対応するサンプルトレースを示す。

【図29】Ａ：後生動物の無傷システム生物学に、微生物オプシン遺伝子を適応させるための一般的な細胞内を標的とする戦略を示す。Ｂ：組織および細胞内レベルにおける標的化の改良を示す。

【図30】Ａ：２．５秒、５秒、１０秒、および２０秒の時間により隔てられた１０秒の長さの黄色光パルス対に曝露されたときの、ｅＮｐＨＲ３．０を発現する細胞中の強力な光電流の安定性および回復を示す。Ｂ：長期間の連続的な光曝露に対するｅＮｐＨＲ３．０の規格化された光電流の時間経過を示す。Ｃ：１０分間を超えるｅＮｐＨＲ３．０の外向き電流の安定性を示す。

【図31】Ｃ：４７２ｎｍ 光の下で、ＧｔＲ３機能のサンプル電流クランプおよび電圧クランプトレースおよび要約データを示す。

【0014】

本発明は、種々の変形および代替形態を受け入れることが可能であるが、それらの例が、図面において例として示されており、詳細に説明される。しかしながら、その意図は、本発明を、示されるおよび／または記載される特定の実施形態に限定するものではないと理解されるべきである。反対に、その意図は、本発明の精神および範囲の範囲内に入る全ての変形、代替物、および代替形態を網羅しようというものである。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、種々の光感受性生体分子構造の実用的なの適用を促進するために有用であると考えられ、また、本発明は、特に、細胞膜の電圧制御および刺激を扱う設定および方法における使用に適しているということが分かった。本発明は、必ずしもこのような応用に限定されるわけではないが、本発明の様々な態様が、この背景を用いた種々の例に関する考察を通して理解され得るものである。

【0016】

本明細書で使用される場合、標的細胞の刺激は、概して、細胞の特性の改変を説明するために使用される。例えば、標的細胞の刺激は、標的細胞の脱分極または偏光を引き起こす可能性がある細胞膜の特性の変化をもたらし得る。特定の一例では、標的細胞は、ニューロンであり、この刺激は、ニューロンによるインパルスの発生を促進または抑制することにより、インパルスの伝達に影響を及ぼす。

【0017】

本発明の一つの例示的実施形態と一致して、光応答性タンパク質が、細胞中で作り出される。このタンパク質は、光に応答して、細胞膜を横断するイオン（陰イオン、陽イオン、またはプロトン）の流れに影響を及ぼす。このイオンの流れの変化は、例えば、細胞膜を横断する電圧および電流の流れを含む、細胞の電気的性質の対応する変化を引き起こす。一例では、このタンパク質は、内因性の共同因子を用いて、インビボで機能して、細胞膜を横断するイオンの流れを修正する。別の例では、このタンパク質は、細胞中の活動電位発火（ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｉｒｉｎｇ）を制止するまたは促すように、細胞膜を横断する電圧を変化させる。さらに別の例では、このタンパク質は、光が導入される数ミリ秒以内に、その細胞の電気的性質を変化させることが可能である。

【0018】

抑制性タンパク質は、細胞の電位を、その細胞の活動電位の引き金となるレベル（ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒｉｇｇｅｒ ｌｅｖｅｌ）から遠ざけることにより、活動電位の発火を制止する。多くのニューロンにおいて、これは、当該タンパク質により、その細胞膜にわたって見られる負電圧が増加するということを意味する。特定の一例では、このタンパク質は、その細胞から外へプロトンを能動的に移動させるプロトンポンプとして作用する。このようにして、このタンパク質は、細胞膜を横断する抑制性電流を発生させる。より具体的には、このタンパク質は、その細胞にかかる電圧を低下させ、それにより、活動電位または脱分極が生じる可能性を減少させることにより、光に応答する。

【0019】

本発明のある態様は、プロトンポンプとしての機能を果たす分子／タンパク質の特定および開発に基づいている。このプロトンポンプは、クリプト植物のギャラルディアシータ（Ｇ．ｔｈｅｔａ）由来であり、標的細胞中での発現のために開発されている。ある種のより特定の実施形態において、この細胞は、ニューロンである。改変タンパク質、ＧｔＲ３は、抑制性電流を生じて、細胞の脱分極を制止することにより、青色光に応答する。神経細胞中に発現したとき、プロトンポンプ（ＧｔＲ３）を用いて、青色光刺激に応答して、神経活動を抑制することができる。ＧｔＲ３ポンプは、神経細胞膜を横断する抑制性電流を生じることにより、光学的な刺激に応答する。修飾細胞が（青色）光に曝露される間、この電流は、活動電位を抑制する。

【0020】

本開示はまた、哺乳動物細胞の原形質膜への移動を促進する１つ以上のアミノ酸配列モチーフの付加により、細胞中で発現した光活性化タンパク質の修飾も提供する。進化的に、より単純な生物に由来する光活性化タンパク質は、哺乳動物細胞により発現もしくは許容され得ないか、または哺乳動物細胞において高いレベルで発現されるとき、細胞内局在性の低下を示し得る。したがって、いくつかの実施形態において、細胞上に発現される光活性化タンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）移行シグナル、膜輸送シグナル、およびＮ末端ゴルジ移行シグナルからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合される。哺乳動物細胞の原形質膜への光活性化タンパク質の移動を促進する１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光活性化タンパク質の、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の終端の両方に融合され得る。任意に、光活性化タンパク質および１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーにより分離されてもよい。細胞の原形質膜への光活性化タンパク質の移動を促進することができるさらなるタンパク質モチーフは、米国特許出願第１２／０４１，６２８号に記載されており、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0021】

本開示は、さらに、天然光活性化タンパク質（例えば、限定されないが、天然ＧｔＲ３、ＮｐＨＲ、ＤＣｈＲ、およびＢＲ等）のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換、欠失、および挿入を含む光活性化タンパク質を提供する。光活性化タンパク質は、１つ以上のアミノ酸残基が、アミノ酸置換を行う一方、光に対して応答する能力および原形質膜の偏光状態を制御する能力を保有するものを含む。例えば、光活性化タンパク質は、このタンパク質の天然または野生型アミノ酸配列に、１つ以上のアミノ酸を置換することにより作製することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、天然アミノ酸配列と比較して、改変アミノ酸配列を含むタンパク質を含み、この改変光活性化タン パク質は、特有の光活性化の性質および／または前駆タンパク質の原形質膜を横断するイオンの流れを調節する能力を保有するが、いくつかの具体的な態様において、改変した性質（例えば、天然タンパク質と比較して、光に対する感受性の増加もしくは減少、光の特定の波長に対する感受性の増加もしくは減少、および／または哺乳動物細胞の原形質膜の偏光状態を調節する能力の増加もしくは減少）を有してもよい。天然タンパク質配列におけるアミノ酸置換は、保存的であっても、保存的でなくてもよく、このような置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされるものであっても、コードされないものであってもよい。標準的な２０種類のアミノ酸「アルファベット」は、それらの側鎖の化学的性質に基づいて化学的ファミリーに分類される。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである（すなわち、塩基性側鎖を保有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置換する）。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換するものである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸で置換する）。

【0022】

本発明のある態様は、ＧｔＲ３分子を発現する動物細胞を対象とするものである。このように、動物細胞は、青色光に応答するプロトンポンプを発現する統合された外因性分子を含む。ある非限定の実施形態において、動物細胞は、神経細胞、筋細胞、桿体細胞もしくは錐体細胞、または細胞株であり得る。いくつかの実施形態において、動物細胞は、哺乳動物細胞である。

【0023】

本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、青色光に応答し、ギャラルディアシータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａ）由来であり、該タンパク質は、細胞が光により照射されるとき、該細胞中の過分極電流を媒介することが可能である。いくつかの実施形態において、光は、約４５０〜４９５ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は、約４９０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞の原形質膜の偏光状態を調節するために、光に対する感受性を増加もしくは減少させる、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させる、および／または光活性化タンパク質の能力を増加もしくは減少させるような、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／もしくは挿入を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入される置換、欠失、および／もしくは挿入を含む光活性化タンパク質は、適切に、光に応答して神経細胞の原形質膜を過分極化する能力を保持する。

【0024】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルと、を含む。ＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５，１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。

【0025】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩＥＳＲＧＴＮＧを含む。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を用いてもよい。

【0026】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、膜輸送シグナル（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。

【0027】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチドと、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルと、からなる群から選択される哺乳動物細胞の原形質膜への移動を促進する２つ以上のアミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＥＲ移行シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ移行シグナル、およびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルは、リンカーにより連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５，１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、膜輸送シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。

【0028】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードする、単離ポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光活性化タンパク質等である。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書に記載のウイルスベクター等）であり、例えば、配列番号１に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光活性化タンパク質等である。このポリヌクレオチドは、動物細胞中で光活性化タンパク質の発現のために使用してもよい。

【0029】

本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、青色光青色光に応答し、デュナリエラサリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）由来であり、該タンパク質は、細胞が光により照射されるとき、該細胞中の脱分極電流を媒介することできる。いくつかの実施形態において、光は、約４５０〜４９５ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は、約４９０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５，１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞の原形質膜の偏光状態を調節するために、光に対する感受性を増加もしくは減少させる、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させる、および／または光活性化タンパク質の能力を増加もしくは減少させるような、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／もしくは挿入を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入される置換、欠失、および／もしくは挿入を含む光活性化タンパク質は、適切に、光に応答して神経細胞の原形質膜を脱分極する能力を保持する。

【0030】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルと、を含む。ＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。

【0031】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩＥＳＲＧＴＮＧを含む。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を用いてもよい。

【0032】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、膜輸送シグナル（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５，１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。

【0033】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチドと、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルと、からなる群から選択される哺乳動物細胞の原形質膜への移動を促進する２つ以上のアミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＥＲ移行シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ移行シグナル、およびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルは、リンカーにより連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、膜輸送シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。

【0034】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードする、単離ポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光活性化タンパク質等である。また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター（本明細書に記載のウイルスベクター等）であり、例えば、配列番号２の残基２５〜３６５、２４〜３６５、２３〜３６５、２２〜３６５、２１〜３６５、２０〜３６５、１９〜３６５、１８〜３６５、１７〜３６５、１６〜３６５、１５〜３６５、１４〜３６５、１３〜３６５、１３〜３６５、１２〜３６５、１１〜３６５、１０〜３６５、９〜３６５、８〜３６５、７〜３６５、６〜３６５、５〜３６５、４〜３６５、３〜３６５、２〜３６５、または１〜３６５に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光活性化タンパク質等である。このポリヌクレオチドは、動物細胞中で光活性化タンパク質の発現のために使用してもよい。

【0035】

本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であって、該タンパク質は、琥珀色および赤色光に応答し、ナトロノモナスパラオニス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ）由来であり、該タンパク質は、細胞が光により照射されるとき、該細胞中の過分極電流を媒介することが可能である。
いくつかの実施形態において、光は、約５８０〜６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は、約５８９ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は、約６３０ｎｍを超える波長（例えば、７４０ｎｍ未満）を有する。いくつかの実施形態において、光は、約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞の原形質膜の偏光状態を調節するために、光に対する感受性を増加もしくは減少させる、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させる、および／または光活性化タンパク質の能力を増加もしくは減少させるような、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／もしくは挿入を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入される置換、欠失、および／もしくは挿入を含む光活性化タンパク質は、適切に、光に応答して神経細胞の原形質膜を過分極化する能力を保する。

【0036】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルと、を含む。ＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。

【0037】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、膜輸送シグナル（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。

【0038】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルおよび膜輸送シグナルからなる群から選択される哺乳動物細胞の原形質膜への移動を促進する２つ以上のアミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルは、リンカーにより連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、膜輸送シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。

【0039】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む、動物細胞であり、該タンパク質は、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含み、配列番号３のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換される。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号３の残基４０〜２９１、３９〜２９１、３８〜２９１、３７〜２９１、３６〜２９１、３５〜２９１、３４〜２９１、３３〜２９１、３２〜２９１、３１〜２９１、３０〜２９１、２９〜２９１、２８〜２９１、２７〜２９１、２６〜２９１、２５〜２９１、２４〜２９１、２３〜２９１、２２〜２９１、２１〜２９１、２０〜２９１、１９〜２９１、１８〜２９１、１７〜２９１、１６〜２９１、１５〜２９１、１４〜２９１，１３〜２９１、１３〜２９１、１２〜２９１、１１〜２９１、１０〜２９１、９〜２９１、８〜２９１、７〜２９１、６〜２９１、５〜２９１、４〜２９１、３〜２９１、２〜２９１、または１〜２９１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を用いてもよい。光活性化タンパク質は、本明細書に記載のＥＲ移動シグナルおよび膜輸送シグナルをさらに含んでもよい。

【0040】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号３に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルと、を含む、光活性化タンパク質等である。このポリヌクレオチドは、発現ベクター（本明細書に記載のウイルスベクター等）中にあり得る。このポリヌクレオチドは、動物細胞中で光活性化タンパク質の発現のために使用してもよい。

【0041】

本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、緑色光に応答し、ハロバクテリウム・サリナルム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）由来であり、このタンパク質は、細胞が光により照射されるとき、過分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は、約５２０〜５７０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光は、約５６０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、細胞の原形質膜の偏光状態を調節するために、光に対する感受性を増加もしくは減少させる、光の特定の波長に対する感受性を増加もしくは減少させる、および／または光活性化タンパク質の能力を増加もしくは減少させるような、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／もしくは挿入を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含む。天然アミノ酸配列に導入される置換、欠失、および／もしくは挿入を含む光活性化タンパク質は、適切に、光に応答して神経細胞の原形質膜を過分極化する能力を保持する。

【0042】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルと、を含む。ＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。

【0043】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、膜輸送シグナル（例えば、原形質膜への移動を促進する）と、を含む。シグナルペプチドは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されても、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。

【0044】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルおよび膜輸送シグナルからなる群から選択される哺乳動物細胞の原形質膜への移動を促進する２つ以上のアミノ酸配列モチーフと、を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルは、リンカーにより連結される。このリンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸長のうちのいずれかを含むことができる。このリンカーは、例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青緑色蛍光タンパク質であるが、これらに限定されない、蛍光タンパク質をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、膜輸送シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもさらにＣ末端に位置する。

【0045】

また、本明細書に提供されるのは、細胞膜上に発現される光活性化タンパク質を含む動物細胞であり、このタンパク質は、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含み、配列番号４のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換される。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号４の残基４０〜２６２、３９〜２６２、３８〜２６２、３７〜２６２、３６〜２６２、３５〜２６２、３４〜２６２、３３〜２６２、３２〜２６２、３１〜２６２、３０〜２６２、２９〜２６２、２８〜２６２、２７〜２６２、２６〜２６２、２５〜２６２、２４〜２６２、２３〜２６２、２２〜２６２、２１〜２６２、２０〜２６２、１９〜２６２、１８〜２６２、１７〜２６２、１６〜２６２、１５〜２６２、１４〜２６２、１３〜２６２、１３〜２６２、１２〜２６２、１１〜２６２、１０〜２６２、９〜２６２、８〜２６２、７〜２６２、６〜２６２、５〜２６２、４〜２６２、３〜２６２、２〜２６２、または１〜２６２に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（他のオプシンからのシグナルペプチド等）を用いてもよい。光活性化タンパク質は、本明細書に記載のＥＲ輸送シグナルおよび／または膜輸送シグナルをさらに含んでもよい。

【0046】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のタンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、配列番号４に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルと、を含む、光活性化タンパク質等である。このポリヌクレオチドは、発現ベクター（本明細書に記載のウイルスベクター等）中にあり得る。このポリヌクレオチドは、動物細胞中で光活性化タンパク質の発現のために使用してもよい。

【0047】

ある種のより特定の実施形態において、哺乳動物発現のための光応答性タンパク質を提供するための方法が提供される。光応答性タンパク質は、ギャラルディアシータ（ＧｔＲ３）から単離される。ＧｔＲ３は、Ｃ末端およびＮ末端を有する。プロモータを、ＧｔＲ３のＣ末端に付加する。ある種の実施形態において、このプロモータは、小胞体（ＥＲ）移行シグナルである。哺乳動物細胞中での発現のためにＧｔＲ３を最適化する際のさらなる詳述については、この基礎となる仮出願で提出された、表題「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」の付録Ａを参照のこと。

【0048】

興奮性タンパク質は、その細胞の活動電位の引き金となるレベル（ａｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｒｉｇｇｅｒ ｌｅｖｅｌ）の方へ細胞の電位を移動することにより、活動電位の発火を促す。多くのニューロンにおいて、これは、このタンパク質により、その細胞膜にわたって見られる負電圧が減少するということを意味する。特定の一例では、このタンパク質は、陽イオンをその細胞に移動するさらなるイオンチャネルとして作用する。このようにして、このタンパク質は、細胞膜を横断する興奮性電流を発生させる。より具体的には、このタンパク質は、その細胞膜にかかる電圧を上昇させ、それにより、活動電位または脱分極が生じる可能性を増大することにより、光に応答する。ある例では、その細胞膜にかかる電圧は、活動電位の引き金となるレベルまたはそれより高いレベルまで引き上げて、細胞の脱分極を生じることができる。

【0049】

本発明のある態様は、デュナリエラサリナ由来である、チャネル（ＤＣｈＲ）の特定および開発に基づいている。チャネルロドプシンＤＣｈＲは、青色光により照射されたとき、ロバストな脱分極電流を媒介する。脱分極電流は、細胞を、青色光への曝露に応答して興奮させ得る。ある実施形態において、ＤＣｈＲは、対象となる細胞中で外因性タンパク質として発現される。神経細胞については、ＤＣｈＲは、対象となる細胞に送達されるとき、内因性の共同因子を用いる興奮性タンパク質としての機能を果たすことができる。

【0050】

光遺伝学の分野へのＧｔＲ３およびＤＣｈＲの導入は、種々の応用を可能にする。例えば、ＧｔＲ３およびＤＣｈＲは、ＣｈＲ２（クラミドモナスラインハーディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）から開発される）等の他の光遺伝学イオンを通過させる分子と組み合わせて用いることができる。ＧｔＲ３およびＤＣｈＲは、他の光応答性分子と比較して、異なる動作パラメータを有する。これにより、異なる波長の光に対して精密に調節された応答を有する細胞または細胞集団の開発を促進する。同調され得るパラメータとしては、電流密度、過分極レベル、膜コンダクタンス、刺激周波数、静止電位、光学的波長、および／光強度が挙げられるが、これらに限定されない。

【0051】

別の例示的実施形態において、ニューロンの活動電位を制御するための方法は、ニューロンにおいて第１の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、ニューロン中で、かつ第１の光応答性タンパク質から、抑制性電流を生じるステップと、ニューロンにおいて第２の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、ニューロン中で、かつ第２の光応答性タンパク質から、励磁電流を生じるステップと、を含む。第１の光応答性タンパク質および第２の光応答性タンパク質は、異なる波長の光に応答し得る。ある例では、ＤＣｈＲまたはＧｔＲ３の使用は、そのような電流が発生するこの励起もしくは抑制性電流および／または光学的波長に対する特定の電流密度を促進することができる。

【0052】

別の例示的実施形態において、ニューロンの活動電位を制御するための方法は、ニューロンにおいて第１の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、ニューロン中で、かつ第１の光応答性タンパク質から、抑制性電流を生じるステップと、ニューロンにおいて第２の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、第２の光応答性タンパク質から第２の抑制性電流を生じるステップと、を含み、２つの電流の組み合わせは、単一の光応答性タンパク質よりもニューロンをより強力に抑制する。例えば、第１の光応答性タンパク質が、ＮｐＨＲであり、第２の光応答性タンパク質が、ＧｔＲ３であり得る。

【0053】

細胞の細胞膜を横断する電圧レベルを制御するための別の方法は、細胞膜の電圧レベルを測定することを含む。光応答性タンパク質が作り出され、光応答性タンパク質を細胞に導入し、そこで光応答性タンパク質が発現される。光の特定の波長が提供され、これは、光応答性タンパク質によって細胞中で反応を生じる。光応答性タンパク質による応答は、細胞膜を横断する電流を生じる。この電流は、測定された電圧レベルに応答する。

【0054】

本発明の別の態様は、インビボでのニューロンの活動電位を制御するためのシステムを対象とする。このシステムには、送達装置、光源、および制御装置が含まれる。この送達装置は、光応答性タンパク質をニューロンに導入し、この光応答性タンパク質は、抑制性電流を生じる。この光源は、光応答性タンパク質を刺激するための光を発生させ、制御装置は、光源による光の発生を制御する。他の実施形態において、ニューロンに導入された光応答性タンパク質は、興奮性電流を生じる。

【0055】

より詳細な実施形態において、そのようなシステムをさらに適合させて、送達装置により、この光応答性タンパク質が、トランスフェクション、形質導入、およびマイクロインジェクションのうちの１つにより導入されるようにするか、および／または、光源により、光が、埋め込み型光発生装置および光ファイバーのうちの１つを介してニューロンに導入されるようにする。遺伝子の送達および発現のさらに詳細な関連方法については、表題「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｇｅｎｅ 発現」のＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／０１９６１９ Ａ１号（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３４７４）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0056】

本開示の別の態様は、疾患の治療のための方法を対象とするものである。本方法は、疾患に関連する一群のニューロンを標的とするものであり、この群において、本方法は、ニューロンの脱分極を制止する抑制性電流を生じることにより、光に応答する抑制性タンパク質を作り出すことと、ニューロンを光に曝露し、それにより、ニューロンの脱分極を制止することと、を含む。

【0057】

本開示のなお別の態様は、疾患の治療のためのさらなる方法を対象とするものである。本方法は、疾患に関連する一群のニューロンを標的とするものであり、この群において、本方法は、ニューロンの脱分極を促す興奮性電流を生じることにより、光に応答する興奮性タンパク質を作り出すことと、ニューロンを光に曝露し、それにより、ニューロンの脱分極を促すことと、を含む。本発明の他の態様では、異なる波長の光に応答する、抑制性および興奮性タンパク質が両方とも、標的とされた一群のニューロンに導入される。ニューロンは、代替として、異なる波長の光に曝露させて、励起し、かつニューロンの脱分極を抑制する。

【0058】

より詳細な実施形態は、そのような技術において拡張する。例えば、本発明の別の態様は、例えば、種（例えば、マウスおよびシノラブディスエレガンス）の中で、ＮｐＨＲおよびＶＣｈＲ１等の他の周知のオプシンと、ＧｔＲ３およびＤＣｈＲとを共発現する。また、異極性の電流を生じ、異なる感色性を有するオプシンが、神経活動の双方向の光変調および読み出し（ｒｅａｄｏｕｔ）のための哺乳動物の脳の急性切片におけるカルシウムイメージングに統合される。同様に、結合したオプシンは、シノラブディスエレガンスの筋肉およびコリン作動性運動ニューロンを標的として、移動運動を双方向に制御することができる。同時に、結合したオプシンは、生きている神経回路についての、マルチモーダルであり、高速であり、遺伝学的に標的とされた、全光学的な調査のための、完全かつ補完的な光遺伝学的システムとして用いることができる。さらに、１組を超える細胞が、異なるオプシンの統合を用いて標的とされてもよく、互いに独立して複数の組の細胞の精密制御を可能にする。

【0059】

ＧｔＲ３およびＤＣｈＲに加えて、細胞内のイオン流束または二次メッセンジャーを光学的に調節するようにつくりだすことができる、いくつかのチャネルロドプシン、ハロロドプシン、および微生物のオプシンが存在する。本発明の種々の実施形態には、そのようなイオンの光学的調節因子の、コドン最適化された、変異させた、切断された、融合タンパク質、標的とされたバージョン、またはそれ以外の修正されたバージョンが含まれる。例えば、ＧｔＲ３およびＤＣｈＲ（例えば、この基礎となる仮出願で提出されるような、付録ＢおよびＣ）。前述のオプシンは、数多くの異なる実施形態を代表するものとして使用される。ＧｔＲ３およびＤＣｈＲを具体的に特定する考察は、別途指定がない限り、本発明を、光学的調節因子のそのような具体的な例に限定することを意味するものではない。前述の配列に関するさらなる詳細については、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇらによる「Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｆａｓｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ」、Ｎａｔｕｒｅ（Ａｐｒｉｌ ５，２００７）Ｖｏｌ．４４６：６３３−６３９に参照がなされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0060】

表１は、可視スペクトルを通じて細胞活動の抑制のために特定されたオプシンを示す。

【表1】

【0061】

表２は、可視スペクトルを通じて励起および調節のために特定されたオプシンを示す。

【表2】

【0062】

米国特許出願第１２／９８８，５６７号および第１２／９９６，７５３号、米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号、第２０１０／０２３４２７３号、第２００７／０２６１１２７号、第２００７／００５３９９６号、第２０１０／０１４５４１８号、第２００９／００９３４０３号、第２００８／００８５２６５号、第２０１０／０１９０２２９号、第２００９／００９９０３８号、ならびにＰＣＴ公開第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６４３５５号に記載されるオプシンが、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0063】

本発明のある実施形態において、列挙されるオプシンの種々の組み合わせが、例えば、細胞集団に送達される。第２の組み合わせを、異なる細胞集団に送達することができる。それぞれのオプシンについて画定された作用および波長感度を用いて、オプシンの組み合わせを、例えば、その他を抑制しながら、ある細胞集団を励起させるように選択することができる。

【0064】

本発明の一例示的実施形態と一致して、標的細胞は、埋め込み型配置を用いて刺激される。この埋め込み型配置は、光の受容に応答して標的細胞の刺激を促進する生物学的部分を含む。この埋め込み型配置はまた、標的細胞の刺激の引き金となる光を生じるための光発生装置も含む。ある実施形態において、この埋め込み型配置は、マイクロコントローラおよびフィードバックループを含む。光発生装置により生じた光の色は、細胞の電圧に依存する。標的細胞は、異なる波長の光に応答して、標的細胞の脱分極を抑制または促す複数の感光性タンパク質を含むことができる。

【0065】

本発明の別の例示的実施形態と一致して、一つの方法が、光感受性イオンチャネルの成長（例えば、ＤＣｈＲイオンチャネル）または光感受性イオンポンプ（例えば、ＧｔＲ３プロトンポンプ）を誘導することができるイオン導入ベクター（例えば、ウイルス）を用いて、インビボでの標的細胞を刺激するために実行される。これらのベクターは、器具の電気構成要素と共に、身体内に埋め込まれる。発光装置は、標的細胞付近に埋め込まれる。標的細胞は、発光装置により発生した光に応答して刺激される。ある種のより具体的な実施形態において、遺伝子導入ベクターは、１つを超えるイオンチャネルまたはイオンポンプの成長を誘導することができる。

【0066】

本発明の特定の実施形態と一致して、タンパク質が１つ以上の標的細胞に導入される。細胞に導入されたとき、このタンパク質は、ある周波数を有する光に応答して、細胞の電位を変化させる。これにより、活動電位発火の制御する（静止する）のに使用することができる静止電位の変化がもたらされ得る。ある具体的な例では、このタンパク質は、光に応答して、細胞膜を横断する電荷を移動させるための膜ポンプとして作用するＧｔＲ３である。膜ポンプは、この膜を横断するイオンの転座のために、電磁または化学結合エネルギーを用いるエネルギー変換器である。他の具体的な例において、このタンパク質は、膜ポンプとして作用するハロロドプシンである。ハロロドプシン膜ポンプは、この膜を渡って特定のイオンを移動する。ハロロドプシン膜ポンプに関するさらなる情報については、Ｂｒｉｇｉｔｔｅ Ｓｃｈｏｂｅｒｔらによる「Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ Ｉｓ ａ Ｌｉｇｈｔ−ｄｒｉｖｅｎ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ Ｐｕｍｐ」、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２５７，Ｎｏ．１７．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １０，１９８２，ｐｐ．１０３０６−１０３１３に参照がなされ得、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0067】

具体的な実施形態において、ＧｔＲ３およびＮｐＨＲが、それぞれ、異なる標的細胞に導入されてもよい。この２つの抑制剤は、異なる波長の光に応答して、異なる標的細胞を独立して抑制するために２つのタンパク質を用いることを可能にする。ＧｔＲ３およびＮｐＨＲはまた、細胞集団の抑制を上回る勾配制御のために、同じ細胞集団に導入されてもよい。例えば、同じ細胞内のＧｔＲ３およびＮｐＨＲ分子は、比較的に互いに独立して、活性化され得る。したがって、第１のレベルの抑制は、細胞状態に対する最小の電流レベルを提供する分子型（ＧｔＲ３またはＮｐＨＲ）を活性化することにより実行することができる。次のレベルは、この第１の分子型を非活性化し、他の分子型を活性化することにより実行することができる。第３のレベルが、両方の分子を同時に活性化することにより実行することができる。さらなる勾配制御を、例えば、光の波長を変化させることにより、あるいはそれぞれのタンパク質の最大値、またはほぼ最大値で光強度を変化させることにより達成することができる。

【0068】

複数の抑制剤の組み合わせはまた、短絡抑制を引き起こすこともでき、これは、過分極抑制と組み合わされて、組み合わせアプローチにおいて、単一の抑制タンパク質を使用するものより強力な過分極を引き起こすことができる。細胞膜において、イオンの逆転電位（ネルンスト電位としても知られている）は、膜の片側からもう一方の片側にイオンの正味（全体）流れがない膜電位である。それぞれの型のイオンチャネルは、特定の逆転電位を有する。ネルンスト電位で、イオン移動の外向きおよび内向き速度は、同じである（イオン流出は、イオン型に対して平衡状態にある）。ネルンスト電位のいずれかの側における膜電位の変化は、イオン流出の全体の方向を逆にする。イオンチャネルの逆転電位が、細胞膜の静止電位（または光応答性タンパク質イオンチャネルが刺激され、「静止」電位に変化する場合の瞬間電位）を下回る場合、イオンチャネルは、細胞の過分極により抑制する一因となる。対照的に、イオンチャネルの逆転電位が、静止電位と活動電位の発生の閾値の間にある場合、イオンチャネルは、短絡効果を有する。任意の所与のイオン（例えば、Ｃｌ−）の濃度勾配は、他のイオン（例えば、Ｎａ＋およびＫ＋）の活性間の平衡によりある程度決定される。短絡抑制は、このチャネルコンダクタンスが、隣接した興奮性チャネルで発生する電流をショートするため、「短絡」と称される。したがって、抑制性の特徴を有する光応答性タンパク質チャネルの付加は、既存のイオンチャネルが方向を逆にし、電流を「短絡する」点まで膜電位を低下させ、膜電位が活動電位に達することを防ぐ、さらなる経路を作製することができる。

【0069】

本明細書に提供されるのは、細胞膜上に本明細書に記載の１つ以上の光活性化タンパク質を発現させる細胞を含む、細胞集団、組織、および非ヒト動物である。細胞、細胞集団、組織、および非ヒト動物の使用方法も提供される。

【0070】

図１Ａは、細胞膜１６０における、光応答性イオンを通過させる分子（ポンプまたはチャネル）１５０を示す。一般に、イオンチャネルは、チャネルの逆転電位（またはチャネルの平衡電位）の方への流れを可能にし、この方向は、膜電位がチャネルの逆転電位を上回るか、あるいは下回るかどうかに基づいている。イオンチャネルは、イオンを移動するためのさらなるエネルギーを必要としない。イオンポンプは、平衡流れに逆らってイオンを移動し、膜を横断するイオンを移動するために、ＡＴＰ等のいくつかのエネルギー形態の導入を必要とする。イオン１６２は、陰イオンであっても、陽イオンであってもよい。水素イオンは、プロトン（および陽イオン）である。イオン極性に伴うイオン流れの方向は、イオンを通過させる分子が、細胞上に過分極効果または脱分極効果を有するかどうかを決定する。ある実施形態において、イオンを通過させる分子１５０は、細胞から外へプロトンを移動し、細胞を過分極し、細胞の発火を抑制する。光応答性イオンチャネル／ポンプ１５０は、適切な周波数の光が存在しない限り、開口／活性しない。

【0071】

図１Ｂは、光応答性イオンを通過させる分子１５０が、細胞の内部にある膜内に発現される場合の、本発明の代替的な実施形態を示す。細胞の多くの内部成分は、細胞を取り囲む細胞膜と同様の膜を有する。細胞小器官１５２の膜は、光応答性タンパク質の導入前に、天然に存在するイオンポンプ／チャネルを含む。外因性光応答性タンパク質と共に導入されるプロモータに依存して、光応答性タンパク質は、種々の異なる細胞小器官の膜中、細胞膜中、または異なる細胞小器官および／もしくは細胞膜の組み合わせにおけるイオンポンプ／チャネルとして発現することができる。ある実施形態において、光応答性イオンを通過させる分子１５０は、プロトンポンプである。他の実施形態において、ポンプは、特定の陽イオンまたは特定の陰イオンのポンプ／チャネルであり得る。イオンポンプ／チャネル１５０は、細胞小器官の膜１５６に位置する。

【0072】

イオンを通過させる分子が発現される膜を横断するプロトンの移動は、膜１５６および膜１６０のいずれか、あるいは両方の膜電位を変化させるのに使用することができる。細胞質から外へのプロトンの移動は、細胞に過分極を生じ、これは、細胞の抑制をもたらす。

【0073】

ある例において、ポンプ／チャネル１５０を用いて、細胞小器官１５２およびその周囲の細胞質１５４のｐＨを変化させることができる。加えて、タンパク質が発現される細胞小器官のｐＨを、変化させる、および／または制御することができる。細胞内のほとんどの酵素は、ｐＨ感受性があり、それぞれの細胞小器官のｐＨは、エンドサイトーシスおよび分泌経路に沿って生じる協調的生化学的反応を厳密に決定する。正常な細胞小器官のｐＨホメオスタシスの異常は、著しい機能変化をもたらす場合がある。光応答性タンパク質の発現のレベルおよび場所（すなわち、細胞小器官）に依存して、細胞の様々の機能が、強化または遅延され得る。発現の十分高いレベルで、細胞は、殺滅され得る。これは、望ましくない細胞（すなわち、癌）において、望ましいものであり得る。例えば、細胞は、癌性の腫瘍部位で局所的にトランスフェクトされ得、次いで、慎重に指向された光パルスを用いて、腫瘍を縮小するまたは除去することができる。

【0074】

図２Ａは、光応答性タンパク質の使用の２つの例を示し、それぞれの例は、３つの細胞集団、Ａ、Ｂ、およびＣを含む。上で簡潔に考察されたように、２つ以上の光応答性タンパク質を、同じ細胞集団に導入することができる。導入された光応答性タンパク質は、活性化されるとき、同じ応答または異なる応答を生じる場合がある。異なるタンパク質はまた、異なる反応時間、または反応の強度を有する場合もある。同じ極性の２つのタンパク質は、同時に、活性化することができ、これにより、相加効果をもたらす。例えば、２つの脱分極タンパク質は、選択的に刺激してもよい。これにより、発火の周波数を増加させることができる。例１では、細胞集団ＡおよびＢは、同じ抑制タンパク質を発現するが、異なる興奮性タンパク質を発現する。細胞集団Ｃは、細胞集団ＡおよびＢの抑制タンパク質とほぼ同じ波長で光に反応する興奮性タンパク質を有する。細胞集団Ｃの抑制剤は、細胞集団Ａの興奮性タンパク質と同様の波長に反応する。この構成は、細胞集団を刺激するように提供された光への、種々の組み合わせの細胞集団の反応を可能にする。例１に設定されるように、細胞集団Ｂは、他の２つの集団のいずれを励起させるあるいは抑制することもなく、励起させることができる。しかしながら、細胞集団ＡおよびＣは、提供される光に、ほぼ逆方向に反応する。

【0075】

例２は、３つの光応答性タンパク質を有する細胞集団Ａ、ならびに２つの光応答性タンパク質を有する細胞集団ＢおよびＣを含む。細胞集団Ａは、異なる光の波長に反応する２つの興奮性タンパク質および１つの抑制性タンパク質を含む。細胞集団ＢおよびＣはそれぞれ、細胞集団Ａの興奮性タンパク質のうちの１つと、他の細胞集団（ＢまたはＣ）に存在する興奮性タンパク質と同じスペクトル中の波長に応答する抑制性タンパク質と、を有する。この構成により、細胞集団ＡおよびＢの組み合わせを励起させる、または第３の細胞集団を抑制しながら、細胞集団ＢおよびＣの組み合わせを励起させることができる。細胞集団ＢあるいはＣのいずれにも影響を及ぼすことなく、細胞集団Ａを抑制し、細胞集団ＢおよびＣの両方を抑制しながら、細胞集団Ａを励起させることができる。図２Ａの例示的組み合わせは、限定することを意味するものではなく、単一の細胞集団、および細胞集団に渡る組み合わせの両方において、光応答性タンパク質の多くの組み合わせのいくつかを説明するものである。

【0076】

本発明の別の例示的実施形態と一致して、標的細胞は、哺乳動物の脳中に位置するニューロンである。標的細胞は、遺伝的に修飾されて、例えば、ＤＣｈＲイオンチャネル等の光感受性の生体分子配置を発現する。次いで、光を用いて、ニューロンを刺激することができる。脳内の位置ならびに刺激の周波数および長さ等の多くの因子に依存して、異なる目標を達成することができる。例えば、脳深部刺激（ＤＢＳ）の現在の技術は、脳の標的とされるエリアに直接電流を流すために電極を用いる。電気刺激の周波数は、時折、低周波ＤＢＳあるいは高周波ＤＢＳと称される。研究は、高周波ＤＢＳが、刺激細胞からのインパルスの発生を抑制し、一方、低周波ＤＢＳが、刺激細胞からのインパルスの発生を促進することを示唆している。低周波ＤＢＳの高周波の効果を生じる周波数はまた、刺激される脳の特定のエリアに依存して異なることも示している。高周波ＤＢＳの一例によれば、ニューロンは、約１００Ｈｚまたはそれ以上の周波数で電流パルスを供給する電極を用いて刺激される。そのような周波数は、本明細書でさらに考察されるように、ある応用において効果的であることが示されている。

【0077】

種々の細胞集団において、図２Ａに示されるものと同様に、２つ以上の光応答性タンパク質が存在してもよい。２つ以上の光応答性タンパク質のいくつか（または全て）は、細胞集団内の同じ作用（すなわち、励起または抑制）を導くことができる。例えば、例２の細胞集団Ａは、２つの興奮性光応答性タンパク質ＤＣｈＲおよびＶＣｈＲ１を含む。図２Ｂは、２つ以上の型の光応答性タンパク質、例えば、ＤＣｈＲおよびＶＣｈＲ１が、同じ細胞集団に導入され得るある種の実施形態で用いる刺激プロファイルを示す。それぞれのイオンを通過させる分子は、ｐＨ等の環境因子に部分的に応答することができる、それぞれの刺激周波数限界を有する。この限界は、活性状態から不活性状態の推移に対して分子に必要とされる回復時間を反映する。それぞれが、異なる光学的波長に応答する２つの型の光応答性タンパク質の使用は、それぞれの型のタンパク質を、別々に制御することが可能にすることができる。それぞれのイオンチャネルは、選択的に活性化することができ、これにより、脳の刺激の周波数の増加を可能にする。

【0078】

例えば、例３は、第１の波長の光パルス（実線の縦線）が、周波数Ｆで提供されることを示す。この波長は、第１の型の分子（三角）を活性化するために選択される。第２の波長の第２の組の光パルス（破線の縦線）はまた、周波数Ｆで提供することもできる。この第２の組の光パルスを用いて、第２の型の分子（正方形）を活性化することができる。したがって、両方の細胞に対して得られた活性周波数は、それぞれの個々のイオンを通過させる分子に対して活性化周波数の２倍である。当然ながら、この周波数は、２つの型の分子間で同一である必要はなく、時間と共に変化させることができる。

【0079】

別の実施では、例４に示されるように、第１の型のイオンを通過させる分子は、一期間中活性化し、続いて、第２の型のイオンを通過させる分子を活性化することができる。これは、イオンを通過させる分子のそれぞれを、その期間中不活性であることを可能にし、この間、他のイオンを通過させる分子を活性化することを可能にするのに特に有用であり得る。ある例では、これは、イオンを通過させる分子の回復および持続的使用を促進することができる。さらに、異なる電流型、密度、およびイオンを通過させる能力を、所望の応答を生じるような特定の刺激プロファイルを決定するとき、考慮することができる。

【0080】

ＤＢＳの特定の例は、パーキンソン病の治療のために使用される。本応用では、ＤＢＳは、しばしば、患者の脳内の淡蒼球内部または視床下核に適用される。光に応答するように細胞を修飾する生物学的配置を埋め込むことにより、光を点滅する光を、電極の代わりに使用することができる。このようにして、標的ニューロン細胞および外部電気信号を標的細胞に直接適用する必要はない。さらに、光は、しばしば、その原点から電気よりもさらに遠くに移動することができ、それにより、刺激源に対して有効な領域を増加させ、光増感されているそれらのニューロンのみが刺激される。

【0081】

電極ベースのＤＢＳ方法と同様に、本発明の一実施形態は、ニューロンにより発生したインパルスを抑制するために、高周波ＤＢＳを用いて実行することができる。高周波ＤＢＳは、約１００Ｈｚの周波数で達成されているが、本発明の種々の実施形態を用いる高周波ＤＢＳは、同じ周波数を必ずしも必要としない場合がある。例えば、光活性化技術を用いるとき、低周波数（例えば、５０Ｈｚ）で高周波ＤＢＳの抑制効果を再現することは可能であり得る。例えば、ＧｔＲ３ポンプの活性化は、本来的に、過分極、および活動電位発生への耐性を促す。種々の周波数を、特定の応用（例えば、脳の標的部位および所望の効果）、および適用される刺激モダリティに応じて使用することができる。

【0082】

本発明の別の例示的実施形態と一致して、光感受性生体分子の発現を誘発する遺伝子導入ベクターが、特定の細胞型を標的とするために使用される。例えば、ウイルスベースのタンパク質（例えば、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス）を、それらが独特に発現するタンパク質に基づいて、特定の細胞型を標的とするように作製することができる。次いで、標的細胞は、ウイルスベースの遺伝子導入タンパク質により感染され、新型のイオンチャネル（例えば、ＤＣｈＲ）を生成し始め、それにより、光感受性になる。これは、標的細胞に近接している他の細胞を刺激することなく、標的細胞を刺激するのに特に有用であり得る。例えば、ニューロンの異種の長さ、直径、クロナキシー、他の膜性質、電気絶縁、神経伝達物質の出力、および総括的機能は、互いにごく接近しており、そのため、ニューロンの刺激を提供するために電極を用いるとき、不注意で刺激される場合がある。ウイルスベクターの発生、ならびに神経細胞のインビボでの修飾および刺激におけるさらなる詳細については、２００６年７月２４日に出願された米国特許出願第１１／４５９，６３６号のＡｌｅｘａｎｄｅｒ Ｍ．Ａｒａｖａｎｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４（２００７）Ｓ１４３−Ｓ１５６による「Ａｎ ｏｐｔｉｃａｌ ｎｅｕｒａｌ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ：ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｏｄｅｎｔ ｍｏｔｏｒ ｃｏｒｔｅｘ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｆｉｂｅｒ ｏｐｔｉｃ ａｎｄ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ａｎｔｏｉｎｅ Ｒ．Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５，２００７）Ｖｏｌ．４５０：４２０−４２４による「Ｎｅｕｒａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｏｆ ａｗａｋｅｎｉｎｇ ｐｒｏｂｅｄ ｗｉｔｈ ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｈｙｐｏｃｒｅｔｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｖｉｖｉａｎａ Ｇｒａｄｉｎａｒｕ，ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２６，２００７）２７（５２）：１４２３１−１４２３８による「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（Ａｐｒｉｌ ５，２００７）Ｖｏｌ．４４６：６３３−６３９による「Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ｆａｓｔ ｏｐｔｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ」、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ａｕｇｕｓｔ ２００７） Ｖｏｌ．８：５７７−５８１による「Ｃｉｒｃｕｉｔ−ｂｒｅａｋｅｒｓ：ｏｐｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｎｇ ｎｅｕｒａｌ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ」に参照がなされ得、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0083】

本発明の特定の実施形態は、インビボでの使用のために埋め込み型構成を利用する。発光ダイオード、レーザー、または同様の光源が、光を発生するために含まれる（例えば、図３中の光発生装置１０４に示されるように）。光源により発生させた光に応答して標的細胞の刺激を促進する光応答性分子を含むように標的細胞を修飾する生物学的部分。

【0084】

本発明の別の実施形態は、標的細胞を光に応答して刺激することを可能にする光感受性タンパク質を用いて標的細胞を刺激するための構成を利用する。図４の生物学的部分２０４と関連して考察されるもの等の生物学的送達装置は、光感受性タンパク質を含むように標的細胞を修飾するベクターを埋め込むために使用される。生物学的部分２０４と関連して考察されるもの、図７のメッシュ、または図８のウイルスマトリックス等の埋め込み型構成要素が、標的細胞付近の光発生装置を埋め込むために使用される。制御回路２０８と関連して考察されるもの等の制御装置は、標的細胞により受光された光を発生させるように光発生デバイスを活性化して、それにより、発生した光に応答して標的細胞を刺激するために使用される。

【0085】

ここで、図に戻ると、図３は、本発明の例示的実施形態に従う、標的細胞を刺激するためのシステムのブロック図を示す。ブロック１０２は、インビボの表示により示されるように、生物（例えば、哺乳動物）の内部の位置を示す。光発生装置１０４は、インビボで光を発生する埋め込み型装置である。光感受性の生物学的部分１０６は、発生した光の攻撃が、標的の刺激を生じるように標的細胞に影響を及ぼす。一例では、光発生装置１０４は、約数ミリメートルの大きさの小型電子デバイスである。この小さなサイズは、デバイスおよび関連した埋め込み型手順の貫入を最小限にするのに特に有用である。別例では、光発生装置１０４は、外部光源からの光を標的細胞に伝送するために使用することができる光ファイバーデバイスを含んでもよい。

【0086】

本発明の一実施形態において、標的細胞は、光活性化プロトンポンプ／チャネルタンパク質を含むように修飾される。そのようなタンパク質の具体的な例は、ＧｔＲ３であり、これは、クリプト植物のギャラルディアシータに基づいた生成物である。ＧｔＲ３の作用スペクトルの特徴分析により、吸収極大が約４９０ｎｍであることを示唆される。別の具体的な例は、デュナリエラサリナ由来のＤＣｈＲである。ＤＣｈＲの作用極大は、約５００ｎｍである。

【0087】

これらの感光性タンパク質は、多くの異なる方法を用いて埋め込むことができる。例示的方法としては、ゼラチンカプセル、液体注入等の種々の送達装置の使用が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法はまた、身体の領域に埋め込む、またはそうでなければアクセスするためのフレームまたはコンピュータ制御の手術ナビゲーションシステム等の定位手術技術の使用も含む。そのようなタンパク質の送達におけるさらなる詳細については、２００６年７月２４日に出願された米国特許出願第１１／４５９，６３６号の表題「Ｌｉｇｈｔ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃａｔｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」に参照がなされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0088】

図４は、本発明の例示的実施形態に従う、標的細胞を刺激するための埋め込み型装置のブロック図を示す。図には、制御回路２０８、光源２０６、生物学的部分２０４、および標的細胞２０２が含まれる。生物学的部分２０４が、標的細胞２０２に影響を及ぼし、この標的細胞は、光に応答して刺激される。
本発明の一実施形態において、生物学的部分２０４は、光感受性であるように修飾されている標的細胞２０２からなり得る。本発明の別の実施形態において、生物学的部分２０４は、標的細胞２０２を光に対して感受性にさせる、遺伝子導入ベクター等の生物学的素子を含有してもよい。この一例は、ＤＣｈＲ発現のための遺伝子を担持するレンチウイルスである。このようにして、標的細胞２０２の刺激を、埋め込み型装置により制御することができる。例えば、制御回路２０８を、光源２０６の作動もしくは非作動、または光源２０６に電力を供給するバッテリーの充電により、外部信号に応答するように構成することができる。一例では、この外部信号は、制御回路２０８により受け取られる電磁放射線である。例えば、無線周波数（ＲＦ）信号は、外部ＲＦ送信機により伝達されて、制御回路２０８により受け取られ得る。別例では、磁場を用いて、制御回路を作動させる、および／または電力を供給することができる。

【0089】

制御回路２０８は、様々な程度の複雑度を用いて実現することができる。一例では、この回路は、磁場に曝露された場合に電流を発生する単純なコイルである。次いで、この電流を用いて、光源２０６に電力を供給する。そのような実装は、大きさおよび複雑度を限定すること、ならびに装置の寿命のを伸ばすために特に有用であり得る。別例では、制御回路２０８は、ＲＦアンテナを含むことができる。任意に、バッテリーまたは容量性素子等の同様の電源を、制御回路２０８で使用することができる。充電されている間、この回路は、電源により、体外からの同時的なエネルギー送達を必要とせずに動作し続けることが可能となる。これは、光源２０６により発せられた光の正確な制御のために特に有用であり得、またその発せられた光の強度の増加のためにも特に有用であり得る。本発明の一実施形態において、光源２０６は、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いて実現される。ＬＥＤは、低出力応用に有用であることが立証されており、また、電気信号に対して比較的迅速に応答することも立証されている。

【0090】

本発明の別の実施形態において、生物学的部分２０４は、標的細胞を光感受性に遺伝的にコードする遺伝子導入ベクターを含有するゼラチンまたは同様の物質を含む。一例では、このベクターは、体内に一旦埋め込まれると放出される。これは、例えば、これらのベクターが、（例えば、脱水された材料またはゼラチン等の水溶性材料を用いて）水溶液中へと放出されることを可能にする封じ込め材料を用いることにより、達成することができる。ベクターの放出により、標的細胞が修飾され、その結果、それらは、光源２０６からの光に応答して刺激される。

【0091】

本発明の別の実施形態において、生物学的部分２０４は、光感受性細胞を含有する合成メッシュを含む。一例では、これらの細胞は、光感受性であるように修飾されているニューロンである。この合成メッシュは、ニューロン全体（例えば、細胞体）が通るのを許容することなく、樹状突起および軸索がこのメッシュを通過できるように構成することができる。そのようなメッシュの一例は、直径が約３〜７ミクロンである細孔を有し、ポリエチレンテレフタレートでできている。別の例示的実施形態において、生物学的部分２０４は、本明細書でさらに詳細に考察されるような、注入機構が含まれる。

【0092】

図５は、本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み型装置のブロック図を示す。図３の埋め込み型装置は、磁場に応答する。より具体的には、巻線３０２およびコア３０４から構成されるインダクターは、磁場に応答して電流／電圧を発生する。電流は、導電性経路３０６を通って制御回路３１０まで通過する。制御回路３１０は、応答して、導電性経路３０８を用いて光源３１２を作動させる。光源３１２は、標的細胞を刺激するために、生物学的部分３１４を照射する。一例では、生物学的部分３１４には、ゼラチン、合成メッシュ、または本明細書でさらに詳細に考察されるような、注入機構が含まれる。

【0093】

本発明の一実施形態において、この制御部分は、単純なの電気的接続、抵抗素子であり得るか、または完全に除去することができる。そのような一実施形態において、発生した光の強度、持続時間、および周波数は、磁場から発生した電流により直接制御される。これは、安価な、長持ちし、かつ小型のデバイスを作製するのに特に有用であり得る。そのような実施形態の一例は、図６Ａおよび図６Ｂと関連してさらに考察される。

【0094】

本発明の別の実施形態において、この制御部分は、より複雑な回路として、実装することができる。例えば、この制御回路は、異なる整流回路、バッテリー、パルスタイミング、コンパレータ回路等を含むことができ、そうでなければ、実装することができる。特定の例では、この制御回路には、ＣＭＯＳまたは他のプロセスを用いて作製した集積回路（ＩＣ）が含まれる。集積回路技術は、非常に小さな面積に多数の回路素子を使用することを可能にし、ひいては、いくつかの応用のために比較的複雑な制御回路を実装することができる。

【0095】

本発明の特定の実施形態において、インダクター（図５の３０２および３０４）は、Ｇｏｗａｎｄａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社により供給される１００μＨのインダクター部品番号ＣＦ１００８−１０３Ｋ等の表面実装インダクターである。光発生部分は、０６０３または０８０５のパッケージサイズのＬＥＤ等の青色ＬＥＤである。特定の例は、ＬＥＤｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から市販の部品番号ＳＭＬ０８０５を有する青色表面実装ＬＥＤである。接続経路３０６および３０８は、導電性エポキシ、テープ、はんだ、または他の接着剤等の種々の導電体を用いて、実装することができる。琥珀色スペクトルおよび他のスペクトル中の光を発光する（ＮｐＨＲチャネルに適用できるような）ＬＥＤは、この同じ製造業者を含む、商業的供給源を通じて入手可能である。

【0096】

図６Ａは、本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み型装置のブロック図を示す。図６Ａは、４０６により示される導電性パスを用いてＬＥＤ４０８に接続されるコイル４０２およびコア４０４を含むインダクターを示す。図６Ｂは、図６Ａのブロック図に対応する回路図を示す。インダクター４１２は、ＬＥＤ４１０に並列して接続される。したがって、インダクター４１２で見られる磁場を変化させることにより発生される電流および電圧は、ＬＥＤ４１０に発光をもたらす。変化する磁場の周波数および強度は、ＬＥＤ４１０からの光の所望の量および周期性を生じるように変化させることができる。

【0097】

図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の例示的実施形態に従う、光感受性の生体分子を含有するメッシュの略図を示す。メッシュ５０２は、照射を通過することが可能であるが、細胞５０６が通過するのを防ぐほど十分小さい大きさの穴５０４を有するように構成される。これにより、細胞５０６が、埋め込まれるが、光発生装置からの光をなお受け取ることが可能となる。

【0098】

本発明の一実施形態において、細胞５０６は、光感受性であるように修飾される幹細胞である。幹細胞は、図７Ｂにより示されるように成熟させる。特定の例では、幹細胞は、細胞体５１２、軸索／樹状突起５０８および５１０を有するニューロンに成熟する。ニューロンは、光感受性であるように遺伝的に修飾される。穴５０４は、直径で約３〜７ミクロンである。この大きさは、いくつかの軸索／樹状突起が、穴５０４を通過することを可能にし、一方、細胞体５１２が通過するのを防ぐ。

【0099】

図８Ａおよび図８Ｂは、本発明の例示的実施形態に従う、ウイルスマトリックスの略図を示す。ウイルスマトリックスは、ウイルスベクター６０４を含有する構造体６０２を含む。一例では、構造体６０２は、ウイルスベクター６０４が、哺乳動物６０６に埋め込まれるまで、ウイルスベクター６０４を含有するゲルまたは液体の物質を含む。一旦ウイルスベクター６０４が放出されると、それらは、図８Ｂに示されるように、埋め込み型ウイルスマトリックスの近くの標的細胞６０８を感染させる。感染した標的細胞６１０は、光感受性になり、ひいては、光を用いて、標的細胞６１０の刺激を制御することができる。

【0100】

本発明の一実施形態によれば、構造体６０２は、含有するウイルスベクター６０４で含浸されているか、またはそうでなければ密閉されるゼラチンである。構造体６０２が埋め込まれるとき、このゼラチンは、水和させるか、およびまたは溶解され、それにより、ウイルスベクター６０４を放出する。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）によるマトリゲル等の化合物に加えて、標準的な市販のゼラチンミックスを使用することができる。

【0101】

図９は、本発明の例示的実施形態に従う、磁場に応答して光を生じる回路の回路図を示す。図９は、入力回路７２０および出力回路７３０を含む。インダクター７０４は、磁場７０２に応答して電流を発生させる。磁場の性質のため、インダクター７０４により生じた電流は、交流（ＡＣ）信号である。全波ブリッジ整流器７０６は、ＡＣ信号を整流し、ＲＣ回路とともに、ＡＣ信号からの比較的安定した電圧を発生する。この発生した電圧は、磁場７０２、および発生した電圧が十分なレベルであるとき光を発生する出力回路７３０に応答する。より具体的には、バッテリー７０８からの電源を用いて、磁場７０２に応答してＬＥＤ７１０を駆動する。これは、インダクター７０４により見られる磁場７０２が、あまり強力でない（例えば、インダクター７０４のインビボでの位置のため）場合の応用に特に有用である。

【0102】

図１０Ａは、本発明の例示的実施形態に従う、ＲＦ信号８０１に応答して光を生じる回路の回路図を示す。アンテナ８０２を用いて、ＲＦ送信信号８０１を受信し、その信号を電気に変換する。受信した送信信号は、ダイオード８０３により整流され、コンデンサ８０５によりさらに濾波される。一例では、ダイオード８０３は、ショットキーダイオード等の、低い順方向バイアスおよび高速スイッチング能力を有するダイオードを用いて実装することができる。

【0103】

本発明の特定の実施形態において、ＲＦ送信信号８０１は、バッテリー８１５を充電するための電力成分と、ＬＥＤ８２５を制御するための信号成分と、を含む。コンデンサ８０５を選択して、回路により使用するためにこれらの成分を分離することができる。例えば、電力成分は、比較的に、低周波、大振幅信号であり得、一方、信号成分は、比較的に、高周波、小振幅信号である。コンデンサ８０５を選択して、信号の電力成分を濾波して、対応する電圧を生成することができる。ＲＦ送信信号の残りの高周波成分を、この電圧に付加する。次いで、送信信号の電力成分を用いて、バッテリー８１５を充電することができ、送信信号の信号成分を用いて、ＬＥＤ８２５を作動させる。ＬＥＤ８２５により生じた光は、標的細胞８２７の刺激の引き金となる。

【0104】

図１０Ｂは、バッテリーを充電し、次に、バッテリーがＬＥＤに電力を供給するデジタルパルス発電機の電力を供給する、代替の実施形態のラジオ周波数エネルギー蓄電池を示す。電磁信号８５０は、ループアンテナ８５２により受信され、対応する電気信号を生じる。ループアンテナ８５２から生じた電圧は、ダイオード８５５および８５６の逆方向バイアス電圧により制限され、コンデンサ８５４に蓄えられる。特定の例では、これらのダイオードは、ツェナーダイオード等の比較的精密である低い逆方向バイアス電圧を有するものである。電磁信号８５０は、ダイオード整流器ブリッジ８５８を介して整流され、電圧レギュレータ８５９によりフィルタリングして、ＤＣ電圧を生じる。ＤＣを用いて、電源８６０を充電することができる。

【0105】

バッテリー８６０は、コンデンサ８６２を通じて、シュミットトリガー８６５の入力に結合される。シュミットトリガーの出力からのフィードバックは、コンデンサ８６３の充電に比例して、抵抗器８６４を通じて提供される。したがって、シュミットトリガー８６５の方形波出力の周波数は、コンデンサ８６３および抵抗器８６４を含む抵抗器−コンデンサのネットワークにより決定される。抵抗器８６４およびコンデンサ８６３は、不変であっても、可変であってもよい。シュミットトリガー８６５の出力は、ＬＥＤ８６６に電力を供給するデジタルインバーター８６７を通じて与えられる。ＬＥＤ８６６からの光は、シュミットトリガー８６５の方形波出力の周波数に応じて感光性ニューロン８６８に送信される。

【0106】

図１０Ｃは、電磁場（ＥＭＦ）エネルギー蓄電池およびパルスアプローチについてのブロック図を示し、そこでは受信したＥＭＦ８９７（例えば、無線周波数エネルギー）は、蓄積エネルギーのみならず、マイクロコントローラ８９５への命令に関するコードされた信号を含む。ステップ８８５（エネルギー＋パラメータ制御信号：コード化および送信）では、例えば、周波数変調によるような、当技術分野で知られている方法により、制御命令信号をコード化して、エネルギー成分上に乗せる。エネルギー受信器ブロック８９０は、ＥＭＦ信号の一部を用いて、ブロック８９３への電力を提供する。制御信号受信器ブロック８９１は、ＥＭＦ信号の一部を用いて、制御命令をマイクロコントローラブロック８９５に提供する。

【0107】

制御命令を用いて、周波数、強度、持続時間、色等の発生させる光の種々のパラメータに関する情報を送信することができる。これらの命令は、ブロック８９５により示されるような、マイクロコントローラまたは論理回路を用いて、デコードおよび処理することができる。ブロック８９５は、デコードされた命令に応答して、制御信号を発生することができる。したがって、ＬＥＤ８９６により発生される光の周波数（および他のパラメータ）は、所与の埋め込み型装置に対して不変である必要はない。アンテナ８８９は、エネルギー受信器８９０（電圧レギュレータおよびバッテリー回路８９３への電力を提供する）への入力を送達する。同時に、アンテナ８８９は、コード化したデータを制御信号受信器８９１に送達し、これは、ＬＥＤ８９６を駆動するマイクロコントローラ８９５に制御入力を提供する。次いで、選択した波長の光８９７が、電気的に励起され得る細胞８９８に送達される。電圧レギュレータおよびバッテリー回路８９３のバッテリーは、マイクロコントローラ８９５および制御信号受信器８９１へ電力を提供する。

【0108】

図９、ならびに図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃの回路図は、単に本発明のいくつかの特定の実施形態の例示であり、種々の他の実装形態が企図される。例えば、特定の実施形態は、青色ＬＥＤを用いる光源を実装するが、他の色および光源を、特定の応用に依存して実装することができる。他の特定の実施形態において、光源は、１つを超える色の光源を含む。回路は、命令が、細胞の抑制または励起を必要であるかどうかに依存して、いつ光が提供されるかだけでなく、どの色かも制御する。例えば、特定の例では、標的細胞は、抑制剤（例えば、ＧｔＲ３）および励起剤（例えば、ＶＣｈＲ１）の両方を発現し、これらは、異なる波長の光に応答する。このシステムはまた、細胞が励起または抑制されるレベルを制御することもできる。これは、励起する（または抑制する）標的細胞中に複数の光応答性タンパク質を含め、単回で１を超える光の波長を提供するように命令をプログラミングすることにより行うことができる。

【0109】

図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ、本発明の例示的実施形態に従う、光ファイバー装置の略図を示す。この光ファイバー装置は、制御部分９０８と、光発生装置９０６と、光ファイバーケーブル９０２と、を含む。

【0110】

光ファイバーケーブル９０２は、本明細書に考察されるように、ウイルスマトリックスまたは合成メッシュ等の光感受性生物学的部分付近に位置付けることができる。これにより、制御部分９０８および光発生装置９０６を、標的細胞９１０からの距離を置いた位置（例えば、光ファイバーケーブル９０２の長さ対応する距離）に位置付けることができる。これは、標的細胞付近にある、例えば、標的細胞が、脳内の敏感な位置で、またはその付近である場合、埋め込み型装置の部分の大きさを最小限に抑えるのに特に有用であり得る。場合によっては、部分９０８および９０６の遠隔位置はまた、種々の構成要素（例えば、バッテリー）の交換、刺激の周波数および長さの変更が挙げられるが、これらに限定されない、装置の修正も容易にする。

【0111】

制御部分９０８は、磁場またはＲＦ信号等の外部信号に応答するように設定することができる。あるいは、制御部分９０８は、プログラムされたスケジュール、または外部信号とプログラムされた応答の組み合わせに従って、光発生装置９０６を作動させるように設定することができる。

【0112】

図１２Ａ〜１２Ｄは、本発明の例示的実施形態に従う、光感受性の生物学的部分の生成における様々な段階を示す。より具体的には、図１２Ａは、いくつかの型１００２を有する成形構造体１００４を示す。型１００２は、特定の応用に依存して、種々の大きさに構成される。１つのそのような応用では、これらの型は、直径数ミリメートル以下である。

【0113】

図１２Ｂは、１００６および１００８により示されるような、一層のゼラチンまたは同様の物質を適用した後の、図１２Ａからの型１００２を示す。さらに、ウイルスベクター（「ｖ」で示される）は、上の２つの型中にある。これらのウイルスは、液体培地、またはゼラチン様培地であり得る培地１０１２内に懸濁されてもよい。そのような液体には、生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、ならびに他の周知のウイルス物質および移動媒体が含まれる。好適なゼラチン様培地には、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）が挙げられる。これらのウイルスベクターは、移植後の標的細胞の細胞膜へ光感作のために遺伝子を導入するように設計される。

【0114】

図１２Ｃは、型１００６の側面図を示す。１０１６は、ゼラチン層１０１４の形状を形成する成形構造体を示す。ゼラチン層１０１４は、培地１０１２内に含有されるウイルスベクターを捕捉する。上部のゼラチン層１０１０を、ウイルスベクターを十分に含有するように適用する。

【0115】

図１２Ｄは、得られたウイルスベクターカプセルを示す。ウイルスベクター１０１８は、ケーシング１０２０により領域１０２２内に含められる。ケーシング１０２０は、一旦移植されると、溶解されるか、他の方法でウイルスベクター１０１８を標的細胞に播種することができるように設計することができる。一例では、このカプセルは、移植時、ウイルスベクターを身体に流出させるように、例えば、ゼラチン等の水溶性材料から構成される。水溶性材料は、製薬産業において良く知られている。

【0116】

図１３は、本発明の例示的実施形態に従う、埋め込み装置を示す。生物学的部分１１０２および光発生装置１１０８は、この埋め込み装置を用いて埋め込まれる。例えば、装置１１１４の軸は、標的細胞付近に位置付けられる。次に、装置のユーザーは、部分１１１２が、標的細胞付近に生物学的部分１１０２および光発生装置１１０８を設置させる部分１１１６を押圧する。次いで、この埋め込み装置を除去することができる。

【0117】

図１４Ａおよび図１４Ｂは、本発明の例示的実施形態に従う、別の埋め込み装置の略図を示す。埋め込み型光発生装置１２０４は、流体チャネル１２０２により取り囲まれ、透過される。流体チャネル１２０２は、生体分子材料（例えば、光感受性のあるウイルスベクター）を含有する溶液１２１０を、光発生装置１２０４および標的細胞のごく近くに注入することを可能にする。流体チャネルは、１２１２および１２１４によりそれぞれ示されるように、装置１２０４の外および／または装置１２０４内に位置することができる。このようにして、ウイルスベクターを、多量に、またはある期間にわたって注入することができる。例えば、ウイルスベクターにより感染した細胞は、ある期間後、それらの注射前の状態に戻り得る。図１２Ａの装置を用いて、ウイルスベクターを、標的細胞に周期的に再導入することができる。あるいは、異なるウイルスベクターを流体チャネルを通じて導入することができ、埋め込み部位で異なる細胞を標的とすることができる。これは、異なる型の細胞の刺激を介した段階的治療に特に有用であり得る。

【0118】

本発明の特定の実施形態は、ニューロンを遺伝的に修飾して、感光性イオンチャネルＤＣｈＲを発現させる方法に関する。本方法では、青色光のパルスが、ＤＣｈＲニューロンに、それぞれのパルスに対応して活動電位を発火させる。脱分極および再分極が、本方法を通常のネットワーク神経生理学と一致させるミリ秒時間スケールで生じる。

【0119】

特定の標的ニューロンが、遺伝子導入のためのウイルスベクターを用いて修飾される。ウイルスベクターの生成におけるさらなる詳細については、Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６の表題「Ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１０に参照がなされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このトランスフェクションは、単一タンパク質、「ＤＣｈＲ」として知られている細胞膜イオンチャネルの遺伝子の導入をもたらす。自然では、ＤＣｈＲは、デュナリエラサリナの細胞膜上に存在する。青色／緑色光（５００ｎｍ）の吸収時、このイオンチャネルは、短時間開口し、陽イオンを流入させる。哺乳動物神経細胞にトランスフェクトされるとき、罹患した神経は、光感受性になり、これは、光が引き金となる活動電位を生じる。

【0120】

ロバストプロモータでもあるニューロン型に特異的な機能が、ウイルス内のＤＣｈＲコードに隣接して挿入され、その株は、２９３ＦＴ細胞のカルシウム−リン酸塩の共トランスフェクションにより増殖される。次いで、上清をウイルスペレットに遠心分離し、これをリン酸緩衝生理食塩水内に入れる。

【0121】

特定の例では、ＤＣｈＲの応用は、光刺激のために使用される。デュナリエラサリナ由来のＤＣｈＲチャネルロドプシンを含むアミノ酸残基を、ウイルスベクターを用いて、ＤＣｈＲの遺伝子を標的神経細胞に挿入することにより、哺乳動物神経細胞に高速光感受性を与えるために使用することができ、これにより、その後、標的細胞はこの遺伝子を発現し得る。約５００ｎｍの青色／緑色光により照射されると、ＡＴＲは、異性化し、立体配座変化の引き起こし、チャネル孔を開口する。ＤＣｈＲは感光性イオンチャネルであるので、内向き電流を可能にする。

【0122】

別例では、応用ＧｔＲ３（デュナリエラサリナ由来）は、光刺激のために使用される。このプロトンポンプは、ウイルスベクターを用いて、標的神経細胞にＧｔＲ３の遺伝子を挿入することにより、哺乳動物神経細胞上に付与され得、これにより、その後、神経細胞はこの遺伝子を発現し得る。約４７２ｎｍの青色光で照射すると、ニューロンの細胞質からのプロトンの活性ポンプは、細胞の過分極をもたらす。
ＤＣｈＲまたはＧｔＲ３を介した青色光に対する感受性は、ウイルスベクターが、前述の正常細胞に応答する遺伝子を挿入するとき、誘発されるため、挿入は、特定の細胞のサブタイプにより発現される生成物に遺伝的に標的され得る。例えば、ドーパミン作動性ニューロンにのみ生じ、青色光に反応するコリン作動性ニューロンには生じないことは有利であり得る。

【0123】

上記で考察されたように、本発明のある実施形態は、細胞中に発現される光学的に応答するイオンポンプまたはイオンチャネルの使用を含む。特定例では、細胞は、神経細胞または幹細胞のいずれかである。特定の実施形態は、イオンポンプを発現するインビボ動物細胞を含む。本発明のある態様は、例えば、神経活動の時間的に正確な光学的抑制のための、ギャラルディアシータ由来のプロトンポンプの特定および開発に基づいている。このポンプにより、速いスパイクトレーン内の単一の活動電位のノックアウト、および何分間にもわたるスパイク発生の持続的な遮断の両方が可能となる。

【0124】

本発明の例示的実施形態によれば、光学的に応答するイオンポンプおよび／またはチャネルは、１つ以上の幹細胞、前駆細胞、または幹細胞もしくは前駆細胞の子孫において発現される。光学的な刺激を用いて、発現したポンプ／チャネルを活性化する。この活性化を用いて、細胞中のプロトン濃度を制御することができる。また、それを用いて、特定の細胞内の細胞小器官のｐＨを制御することもできる。これは、その細胞中の生存、増殖、分化、脱分化、または分化の欠如に影響を及ぼすのに特に有用であり得る。したがって、光学的な刺激を行って、幹細胞または前駆細胞の（成熟）に対する制御を提供する。

【0125】

本発明の他の例示的実施形態によれば、抑制性のニューロン電流の流れを発生させるための方法は、ニューロンにおいて、ニューロンの脱分極を制止する抑制性電流を生じることにより、光に応答するタンパク質を作り出すことを含む。そのような一方法では、このタンパク質は、ニューロンにおける外因性分子であるＧｔＲ３であり、別の方法では、このタンパク質は、内因性の共同因子を用いる抑制性タンパク質である。

【0126】

別例の実施形態において、ニューロンの活動電位を制御するための方法は、ニューロンにおける第１の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、ニューロン中で、かつ第１の光応答性タンパク質から抑制性電流を生じるステップと、ニューロンにおける第２の光応答性タンパク質を作り出すステップと、光に応答して、ニューロン中で、第２の光応答性タンパク質から励磁電流を生じるステップと、を含む。光応答性タンパク質の組み合わせは、例えば、このタンパク質の光感受性、このタンパク質の応答時間、およびこのタンパク質の画定された作用に依存し得る。同じ型（抑制性対興奮性）の複数の光応答性タンパク質は、同じ細胞集団において使用され得、例えば、活動電位の長期間の妨害または使用される光の波長に依存する単一の活動電位の抑制を可能にする。

【0127】

細胞の細胞膜をに渡る電圧レベルを制御するための別の方法では、本方法は、細胞における第１の光応答性タンパク質を作り出すことと、細胞膜に渡る電圧レベルを測定することと、第１の波長の光に応答して、かつ、第１の光応答性タンパク質を用いて、その測定された電圧レベルに応答性であるその細胞膜に渡る電流を生じることと、を含む。

【0128】

本発明の別の態様は、インビボでのニューロンの活動電位を制御するためのシステムを対象とするものである。このシステムには、送達装置、光源、および制御装置が含まれる。この送達装置は、光応答性タンパク質をニューロンに導入し、この光応答性タンパク質は、抑制性電流を生じる。この光源は、光応答性タンパク質を刺激するための光を発生させるものであり、制御装置は、光源による光の発生を制御するものである。特定の実施形態において、この光源は、青色光源であり、この光応答性タンパク質は、青色光に応答性である。

【0129】

より詳細な実施形態において、そのようなシステムをさらに適合させて、送達装置により、この光応答性タンパク質が、トランスフェクション、形質導入、およびマイクロインジェクションのうちの１つにより導入されるようにするか、および／または、光源により、光が、埋め込み型光発生装置および光ファイバーのうちの１つを介してニューロンに導入されるようにする。

【0130】

本発明の別の態様は、疾患の治療のための方法を対象とするものである。本方法は、疾患に関連する一群のニューロンを標的とするものであり、この群において、本方法は、ニューロンの脱分極を制止する抑制性電流を生じることにより、光に応答する内因性の共同因子を用いる抑制性タンパク質を作り出すことと、ニューロンを光に曝露し、それにより、ニューロンの脱分極を制止することと、を含む。

【0131】

本発明の別の態様において、ＧｔＲ３は、哺乳動物発現のために最適化される。光応答性タンパク質は、ギャラルディアシータから単離される。単離されたタンパク質は、Ｃ末端およびＮ末端を有する。小胞体（ＥＲ）移行シグナルプロモータを、単離されたタンパク質のＣ末端に加えて、増強した光応答性タンパク質を作製する。種々の実施形態において、単離されたＧｔＲ３に付加したプロモータは、所望の発現の位置に依存して異なる。

【0132】

図１５は、本発明の例示的実施形態に従う、複数の光源を用いた配置を示す。図１５は、タンパク質１６１０および１６１４を照射する光源１６０２および１６０４を示す。タンパク質１６１０および１６１４は、それぞれ、光源１６０２および１６０４からの光に応答して、細胞膜に渡る電流を制御するように、細胞１６１２内に作り出される。一例では、第１のタンパク質１６１０は、活動電位の発火を制止するように機能し、一方、第２のタンパク質１６１４は、活動電位の発火を促すように機能する。タンパク質１６１０および１６１４のそれぞれは、光に応答する。特定の例では、第１のタンパク質は、波長Ａを有する光源１６０２からの光に応答し、第２のタンパク質は、波長Ｂを有する光源１６０４からの光に応答する。したがって、これらの光源を用いて、それぞれのタンパク質を独立して制御することができる。これは、細胞中の活動電位を促すことおよび制止することの両方に有用であり得る。別例では、両方のタイプのタンパク質を有することにより、細胞膜電圧の正および負の制御の両方を可能にする。したがって、異なる光源およびタンパク質を用いて、細胞膜の電圧または電流レベル（例えば、クランピング）を制御することができた。

【0133】

反応性を判定する１つの方法は、所定の応答を生じるのに必要とされる光の強度から反応性を定量化することを含む。いくつかの例では、タンパク質の反応性が、一次波長の反応性よりも少ない可能性があるが、第１または第２のタンパク質は、それでも、光の交互の波長に応答することができる。したがって、第１の型のタンパク質は、他の型のタンパク質に対応する波長に対していくつかの反応性があり得るが、それでも、動作の十分な独立性を維持する。１つのそのような例では、細胞の制御は、光の波長あるいは光の強度をシフトすることにより、実行することができる。例えば、波長は、ＡからＢの間でシフトされ、細胞膜電圧電位の対応する増加または低下を促すことができる。あるいいは、同様の作用を有するが、異なる活性化波長を有さない複数のタンパク質を、同じ細胞に導入してもよい。この応答は、波長がシフトされる場合、変化する場合あり、所によっては、２つの応答の組み合わせは、個々のタンパク質からのものよりも大きい応答を生じる。

【0134】

本発明の一実施形態によれば、ポンプ１６１４は、細胞１６１２の電圧レベルを制御することのような、活動電位の発火を制止すること以外の目的のために、任意に、実装することができる。より具体的には、センサーを、光源１６０２のフィードバックを提供するために使用することができる。例えば、このフィードバックは、細胞膜に渡る電圧または電流の測定であり得る。したがって、光源は、細胞に渡って定電流または電圧（例えば、クランプ）を維持するように設定され得る。さらに、反応性の量は、光の強度および波長のうちの１つ以上を変更することにより制御することができる。

【0135】

図１６は、本発明の例示的実施形態に従う、インビボでの１つ以上の細胞の電気的性質を制御するためのシステムを示す。制御／インターフェースユニット１７０２は、光源１７０４が、標的細胞１７０８を照射することを可能にする／不可能にする。光ファイバーケーブル１７０６等の送達機構は、光を標的細胞１７０８に送る、またはそうでなければ、誘導する。光ファイバーケーブル１７０６は、光ケーブルの束を含むことができ、それぞれが、独立して、光を伝送し、誘導する。したがって、光ファイバーケーブル１７０６は、複数の位置に１つ以上の波長を有する光を送達するように設計することができる。センサー１７１０を、例えば、光学顕微鏡等の光学顕微鏡として、または電圧計として、実装して、コントロールユニット１７０２へのフィードバックを提供することができる。特定の例では、フィードバックは、標的細胞または他の関連細胞の光学画像を含む。別例では、フィードバックは、活動電位の発火の量を含む、標的細胞の電圧レスポンスをモニターすることができた。

【0136】

図１７は、本発明の例示的実施形態に従う、インビボでの１つ以上の細胞の電気的性質を制御するためのシステムを示す。制御／インターフェースユニット１８０２は、埋め込み型光源１８０４を作動／非作動にし、次いで光源は、標的細胞１８０６を照射する。２つの光源の、抑制性電流光源１８０８および励起電流光源１８１０を有する光源１８０４が、示される。光源１８０８は、抑制性タンパク質に応答する波長および強度で光を生成し、一方、光源１８１０は、励起タンパク質に応答する波長および強度で光を生成する。当業者は、単一の抑制性光源または１つ以上の波長を有する一連の光源を含む、光源１８１０の種々の設定が可能であることを認識するであろう。制御／インターフェースユニット１８０２は、ラジオ周波数信号、磁気信号等を用いて、有線通信および無線通信等の任意の適切な通信機構を通じて、光源１８０４と通信する。図１６に関連して上で考察されるように、センサー１８１２は、任意に、コントロールユニット１８０２へのフィードバックを提供するために、実装することができる。

【0137】

本発明のある実施形態は、薬物スクリーニングにおいて有用であり得る。イオンスイッチを用いて膜電圧を調節するのに役立つ、種々の感光性タンパク質は、光に応答して活性化される（または脱活性化される）とき、チャネルまたはポンプとして作用し、以降、光応答性イオンスイッチ、または光活性化膜電位スイッチ（ＬＡＭＰＳ）と称する。

【0138】

本発明の１つの例示的実施形態と一致して、システムは、イオンチャネルおよびイオンポンプに影響を及ぼす化合物をスクリーニングする。システムは、薬物候補をスクリーニングするために、上述のタンパク質（とりわけ、ＣｈＲ２、ＤＣｈＲ、ＮｐＨＲ）の組み合わせの付加により光学的に応答させる細胞へのイオンチャネルまたはイオンポンプの活性を遮断するあるいは増強することができる１つ以上の薬物候補を導入する。光は、細胞中の光学的に応答するイオンチャネルの引き金となり、細胞膜にわたって見られる電圧の変化を生じる。電圧変化は、細胞中の電位依存性イオンチャネルを刺激し、これは、次いで、光出力として読み出すことができるイオン濃度の変化を生じる。これらの光信号を、検出して、もしあれば、薬物候補が、電位依存性イオンチャネルにおいてどのような効果を有するかを判定するために使用する。より具体的な実施形態において、プロトンポンプを発現するタンパク質は、細胞に導入される。

【0139】

一例では、システムは、異なる薬物候補を、スクリーニング間の広範な設定を必要とせずスクリーニングすることができる。例えば、光学的に応答する細胞を刺激するためのみならず薬物の有効性を検出するために、光学系を用いて、アッセイを行うことができる。手作業の接触の代わりに光学系の使用、例えば、全細胞パッチクランプの使用は、特に、アッセイのスクリーニングプロセスのスループットを増加させるのに有用であり得る。例えば、スクリーニング間の時間は、そうでなければ、標的細胞中のイオン流れを刺激するまたは検出するのに必要であったであろう物理的処置を最小化または除外することにより、削減することができる。細胞はまた、試験装置が、調製された細胞に光学的に結合されるのにのみ必要であるため、スクリーニングプロセス前に調製することもできる。別例では、スループットは、例えば、一連の光検知器および対応する一連の異なる薬物に曝露される修飾細胞を用いて、同時に、多くの異なる薬物をスクリーニングすることによって増加させることができる。

【0140】

細胞株に基づくアプローチは、特定のイオンチャネルに限定されない。例えば、細胞株は、電位依存性ナトリウム（例えば、Ｎａ_ｖ１．１〜Ｎａ_ｖ１．９）、カリウム（例えば、ｈＥＲＧ、ＴＡＳＫ１、Ｓｈａｋｅｒ、またはＫｖＬＱＴ１等のＫ_ｖ）、またはクロライドを伝導するチャネル／ポンプ（例えば、クロライドチャネルのＣＬＣファミリーのメンバー）のために作製することができる。細胞株へのそのような遺伝子を導入する方法は、当技術分野で知られており、例えば、リポソーム性トランスフェクション、またはウイルス遺伝子導入が含まれる。これに関するさらなる情報に関しては、以下の参照文献のうちの１つ以上を参照され得る。
Ｗａｒｒｅｎ Ｐｅａｒ．Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｔｉｔｅｒ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ６８．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．１１．１−９．１１．１８．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）．
Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ．Ｃ．Ａ．Ｃｈｅｎ．Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ，ａｎｄ Ｊ．Ｋ．Ｒｏｓｅ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｅｕｋａｒｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ６３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．１．１−９．１．１１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）
Ｒ．Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ．Ｊ．Ｄ．Ｃｈｅｓｎｕｔ．Ｊ．Ｐ．Ｈｏｅｆｆｌｅｒ．ａｎｄ Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ６２．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．５．１−０９．５．１９．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）．
Ｈ．Ｐｏｔｔｅｒ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ６２．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．３．１−９．３．６．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）．
Ｔ．Ｇｕｌｉｃｋ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４０．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９．２．１−９．２．１０．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）．
Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ．Ｃ．Ａ．Ｃｈｅｎ．Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ．Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ ＤＮＡ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３１．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （ＣＰＩ），１０．１３．１−１０．１３．９．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．
上の参照文献のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。

【0141】

これらおよび他の遺伝子導入ベクターは、種々の遺伝子工学技術を用いて生成することができる。例えば、遺伝子導入ベクターは、免疫欠損ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２、またはＳＩＶ）等のレトロウイルスのプロウイルスクローンに由来してもよい。２９３Ｔ細胞およびそのトランスフェクションの使用におけるさらなる詳細に関しては、米国特許第６，７９０，６５７号（Ａｒｙａらの表題Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）に参照がなされ得、これは、参照により本明細書がその全体に組み込まれる。

【0142】

本発明の一実施形態において、修飾細胞の光学的な刺激を改変して、導入された薬物候補の特定の性質を決定することができる。例えば、光学的な刺激の強度は、脱分極の対応するレベルを変化させるように変更することができる。所望の脱分極レベルは、試験用の薬物の有効性をさらに特徴付けるように調節することができる。別例では、光学的な刺激は、光の高速パルシングを含むことができる。光学的な刺激と結果として起こる検出された蛍光との間の時間的関係を相関させることにより、この薬物は、動的応答に関してさらに特徴付けることができる。したがって、薬物は、イオン濃度における定常状態の効果、電位依存性イオンチャネルの引き金となることが必要である脱分極レベルの変化、および反復脱分極における効果が挙げられるが、これらに限定されない、種々の異なる態様について特徴付けることができる。

【0143】

一実施形態において、システムは、光学的な刺激および／または検出の単純較正を可能にする。修飾細胞は、薬物候補の導入前に光学的に刺激することができる。イオンチャネルの反応性が検出され、記録される。記録された値は、試験用薬物の導入後、同じ修飾細胞のイオンチャネルの反応性に対する比較のために、ベースラインとして使用することができる。また、記録された値を用いて、光学検出器の光学的な刺激または感受性を修正することもできる。そのような修飾は、個々の試験サンプルまたは一連の試験サンプルに適用することができる。そのような一連の試験サンプルのために、それぞれの試験サンプルは、対応する光学的な刺激を調節することによって、個々に較正され得る。同様に、それぞれの対応する光検知器は、個々に調節され得る。

【0144】

図１８Ａは、本発明の一実施形態に従う、イオンチャネルに影響を及ぼす薬物のスクリーニングのためのシステムの基本ブロック図を示す。光学制御１９０４は、データベース１９０２、光源１９０６、および光学検出器１９０９と通信する。光源１９０６は、試験サンプル１９０８への光学的な刺激を提供する。試験サンプル１９０８には、試験用薬物、光学的に応答するイオンチャネルを有する細胞、および電圧／イオン指示薬が含まれる。一例では、この指示薬は、光源１９０６からの光に応答して蛍光を発する。光学制御１９０４はまた、再構成可能な読み出し情報を含みこともできるので、異なるＬＡＭＰＳおよび異なるＬＥＩＡを使用するとき、同じ制御システムを、それぞれのパラダイムに容易に適合させることができる。光学検出器１９０９は、そのような蛍光に応答する信号を生じ、光学制御１９０４は、生じた信号を受信する。光学制御１９０４は、データベース１９０２中に信号から得られたデータを格納する。格納された情報は、検出された光の強度、持続時間、および波長等の因子を含むことができる。特定の例では、保存されたデータは、ベースラインデータと比較され得、このベースラインデータは、試験サンプル１９０８への薬物の導入前に記録されたデータに対応する。別例では、光源１９０６は、光源１９０６の制御と関連して強度、持続時間、または他のパラメータを変化させることができる。これらおよび他のパラメータは、データベース１９０２中に格納することができる。

【0145】

光源１９０６が、発光ダイオード（ＬＥＤ）等の単一光源を用いて、またはいくつかの光源を用いて、実現され得ることは、明らかであるべきである。同様に、光学検出器１９０９は、１つ以上の検出器を使用することができ、データベース１９０２は、いくつでも適切な記憶装置を用いて、実現することができる。

【0146】

図１８Ｂは、本発明の特定の実施形態に従って、薬物スクリーニングの大型の擬自動化システムの系統図を示す。制御装置１９０１（例えば、コンピュータまたは制御論理）は、種々のプロセスを制御し、システムの入力／出力機能の中心点として働く。この環境は、１つ以上のセンサー１９１４（例えば、サーモスタット、二酸化炭素センサー、および湿度センサー）、二酸化炭素および加湿装置１９１２、ならびにヒーター１９１０を用いて、温度と湿度が調節されたチャンバ１９０５の壁内の適切な温度、湿度、二酸化炭素レベル、および周辺光レベルで維持することができる。複数のウェルトレイ１９４１は、培養細胞、薬物、およびそれぞれの試験に必要とされる他の材料を保有する試験ウェル１９４０を含有する。トレイ１９４１は、ＸＹＺ台１９２５上に置かれる。これらの移動は、コンピュータ１９０１の制御下で、台アクチュエータ１９２０により実行される。キセノンランプ１９５５は、高強度の白色光１９５６を発光し、光は、色フィルター１９６０を通過する。ＤＣｈＲが、ウェル１９４０内の細胞を刺激するために使用される場合、色フィルター１９６０は、青色であり、フィルターから抜け出す青色光１９６１を生じ、２色性ミラー１９７０を打つ。次いで、青色光１９６１は、顕微鏡の対物レンズ器具１９３０を通じて、および透明なトレイ１９４１の底部を通じて、上のほうへ通過する。このような様式で、透明な底面のあるウェル１９４０の内容物が、照射される。別々の波長の光が、細胞活性の蛍光発光指示薬を刺激する必要があるときには、適切な仕様のフィルターが、上述のフィルター１６０の代わりに置き換えられてもよく、これにより、後者のタスクのために、適切な波長の光がウェル１９４０へ送られる。ウェル１９４０内の細胞が、光感受性とされた場合、およびこれらのウェルのそれぞれで試験される薬物が、このプロセスを抑えない場合、それぞれのウェルに付加されるか、または遺伝子修飾を介して、細胞により発現される、細胞活性の発光する指示薬（ＬＥＩＡ）は、光の効果により生じる電圧変化に従って光を発する。刺激光よりもさらに小さい規模であり得るこの第２の波長の光は、顕微鏡タレット１９３５により回収され、また、（ＣＣＤ）カメラのレンズ１９８０上に、２色性ミラー１９７５を通過させる。

【0147】

２色性ミラー１９７０は、細胞膜の光学的ゲーティングを刺激するために必要とされる波長（例えば、ＤＣｈＲに対して青色−緑色）と、使用されるいかなるＬＥＩＡにも必要とされる波長（例えば、ＦＵＲＡ−２に対して紫外線）の両方の上方への反射光を可能にする。この２色性ミラーは、最小の反射または吸収のあるＬＥＩＡの出力スペクトル（例えば、ＦＵＲＡ−２に対して青色−緑色）の通路を可能にするように配置され得る。

【0148】

図１９は、本発明の例示的実施形態に従う、自動化薬物スクリーニングシステムの系統図である。エミッター／検出器ユニット２０５０は、エミッター／検出器アレイ２０５１を構成する。エミッター／検出器アレイ２０５１は、トレイ２０４０上のウェルの数、大きさ、およびレイアウトと一致する。トレイを保持する装置２０２５は、所定のトレイの試験が完了したらすぐに、トレイを交換する機構２０２０が、新しいトレイを位置に迅速に移動させることを可能にする。全プロセスは、装置２００１の制御下で、自動化されてもよい。装置２００１は、コンピュータ、制御論理、プログラマブル・ロジック・アレイ、ディスクリート論理等を用いて、実現することができる。試験下で薬物候補の導入はまた、薬物を保存するための容器およびトレイに薬物を注入するための分注ノズルを提供する機械を用いて自動化することもできる。図１８により示されるものと同様の様式で、温度と湿度が調節されたチャンバ２００５の壁内の環境は、サーモスタット、二酸化炭素センサー、および湿度センサー２０１４、二酸化炭素および加湿装置２０１２、ならびにヒーター２０１０を用いて、適切な温度、湿度、二酸化炭素レベル、および周辺光レベルで維持することができる。同時に、および並行した、複数の刺激装置／検出器素子の使用は、全プロセスの速度を増大させるのに特に有用であり得る。低価格の素子を用いて、複数の並列検出器（例えば、図２０Ａおよび２０Ｂの説明において以下に詳細されるコンポーネント）を作製することができ、この複数のエミッター／検出器ユニットはまた、とても経済的に実行可能であり得る。

【0149】

図２０Ａは、本発明の例示的実施形態に従う、図１９に示されるもの等のエミッター／検出器ユニットの仕組みを示す。ＬＥＤは、ウェル内に位置する細胞の感光性イオンチャネルを刺激し、フォトダイオードは、ＬＥＩＡの応答を検出する。本実施形態において、装置２１０１は、ＬＥＤ２１１０を含み、これは、ウェル２１０６内の培地中の感光性トランスジェニック細胞２１０５を刺激するために、適切な波長、パルス周波数、および強度で、光パルス２１１１を生成する。ＬＥＩＡ（例えば、電位感受性色素またはカルシウム色素）の存在のため、光２１１６は、細胞２１０５から戻り、フォトダイオード２１１５により検出される。ＲＨ１６９１が使用される場合、赤色光が、蛍光を発し、フォトダイオード２１１５により検出される。細胞脱分極の不在下では、フォトダイオード２１１５により蛍光は検出されない。また、他の光検出技術は、フォトトランジスタおよびＣＣＤ素子を含む、フォトダイオードの代わりに使用することもできる。

【0150】

ＬＥＩＡの光学画像技術との光刺激の組み合わせは、多くの異なる理由のために有用であり得る。例えば、光刺激は、刺激のための機械電極を使用する必要性を削減することにより、興奮細胞の研究を単純化することができる。いくつかの市販のＬＥＩＡは、電気的に興奮した細胞の活性化を写真測量的に示すのに適している。そのようなＬＥＩＡの１つは、カルシウム色素Ｆｕｒａ−２であり、これは、約３４０ｎｍの紫色／紫外線光で刺激することができ、この蛍光出力は、約５３５ｎｍの青色−緑色光として検出可能である。別例は、電位感受性色素ＲＨ１６９１であり、これは、約５５０ｎｍで、緑色光により刺激することができ、この蛍光出力は、約７０ｎｍで、赤色光として検出可能である。別例は、電位感受性色素ジ−４−ＡＮＥＰＰＳであり、これは、約５６０ｎｍで、青色光により刺激され、この蛍光出力は、約６４０ｎｍで、赤色光として検出可能である。

【0151】

図２０Ｂは、図１９に示されるエミッター／検出器ユニットの別の実施形態の仕組みを示し、そこでは複数の効果が、単一ウェルの文脈内で試験される。例えば、ウェル２１５６中の細胞２１５５は、ＧｔＲ３およびＶＣｈＲ１の両方を発現することができ、それ故に、青色光の過分極効果と琥珀色光の脱分極効果の両方に対して感受性がある。装置２１５１は、ＬＥＤ２１６０を含み、これは、感光性トランスジェニック細胞２１５５の標的プロトンポンプ（例えば、ＧｔＲ３）の刺激のために使用される。さらなるＬＥＤ２１７５を用いて、第２のイオンチャネルまたはポンプ（例えば、ＶＣｈＲ１）を刺激することができる。さらに別のＬＥＤ２１８０を用いて、電位感受性色素（例えば、ＲＨ１６９１またはＦｕｒａ−２等のカルシウム色素）を刺激することができる。それぞれのＬＥＤは、それぞれの標的化合物の特定の波長および強度を出力するように配置することができる。一例では、ＬＥＤは、使用されたそれぞれの化合物の特定の感受性に依存して、１つを超える標的に影響を及ぼすことができる。フォトダイオード２１６５は、選択された電位色素の蛍光を検出し、一方、フォトダイオード２１７０は、選択されたカルシウム色素により蛍光を発したスペクトルに対して感受性がある。同じ細胞における複数のＬＥＤの使用は、異なる波長で、ＬＥＩＡの刺激を可能にする。また、複数のＬＥＤを用いて、ＬＥＩＡにより発せられる異なる光の波長を検出することもできる。

【0152】

図２１Ａは、本発明の例示的実施形態に従う、エミッター／検出器ユニット内で使用されるＬＥＤエミッターを活性化するための電子回路機構を示す。制御装置２２０１は、トランジスタベース２２０５に、「点灯信号」２２０２を発生する。この点灯信号２２０２は、所望の光フラッシュの持続期間、維持されるか、または代替として、特定の周波数で律動的光フラッシュを生じるために点滅することができる。点灯信号２２０２は、（従来の）電流が、電源２２１０から、抵抗器２２１１を通じて、ならびにトランジスタコレクタ２２０７およびトランジスタエミッター２２１２を通じて、接地２２１３に流れることを可能にする。電流はまた、それによって、抵抗器２２１５を通じて、ＬＥＤ２２２０に通過することができる。ＬＥＤ２２２０は、光２２２１を発し、これは、ウェル２２２５上に当たる。特定例では、トランジスタは、信号２２０２の相互コンダクタンス増幅器として機能する。このようにして、適切な波長、強度、および周波数の光は、ウェル２２２５内の細胞に送達され、特定のチャネル（例えば、ＤＣｈＲ）もしくはポンプ（例えば、ＧｔＲ３）、または電気的に興奮した細胞の活性を調節するために使用される他の光活性膜構造体への刺激をもたらす。また、種々の他の回路も可能である。例えば、他の回路を、回路２２０６の代わりに用いて、ＬＥＤ２２２０を制御することができ、これには、トランジスタを、演算増幅器、電界効果トランジスタ、抵抗分圧器ネットワーク、トランジスタ−トランジスタ論理、プッシュプルドライバー回路、およびスイッチと置き換えることが挙げられるが、これらに限定されない。

【0153】

図２１Ｂは、本発明の一実施形態に従う、エミッター／検出器ユニットによる光検出のための例示的電子回路機構を示す。制御装置２２５０は、（任意に、特定の実施に依存して）電力をフォトダイオード２２５５に供給することができる。フォトダイオード２２５５は、ウェル２２５７内の細胞上にＬＥＩＡからの蛍光を発した（放射された）光２２５６を受信する。受信した光は、出力信号をもたらす。この出力は、抵抗器２２６０を通過し、信号を調整するシュミットトリガーするヘックスインバータ２２７０に入力され、コンピュータ２２５０に入力する問題のない「高」または「低値」を提供する。

【0154】

光検出器の動作は、光起電モードで示されるが、この素子はまた、光伝導モードの動作においても使用することができる。当然ながら、多くの他の光検出装置および方法も使用することができ、これには、フォトトランジスタ、フォトサイリスタ、および電荷結合装置（ＣＣＤ）素子、または素子のアレイが含まれる。

【0155】

代替として、図２１Ｂの回路は、シュミットトリガーするヘックスインバータ２２７０を用いずに使用することができ、これは、信号強度の連続スペクトルを、コンピュータ２２５０へのアナログ入力、またはアナログ・デジタル・コンバータに直接送信することができる。また、種々の他の信号調整回路も可能である。

【0156】

図２２は、予測されたハイスループットプロセスの時間的経過２３００との関連で、および本発明の一実施形態に従って、図 １９、２０、および２１に示される実施形態を用いた一連のステップを示す。ステップ２３０５では、標的イオンチャネルの適切な波長および強度の光が、この場合、約３秒間点滅する。同時に、ＬＥＩＡ刺激フラッシュ２３１０が、任意に、使用された特定の電位またはカルシウム色素に依存して、トリガーされ得る。このＬＥＩＡ化合物は、ウェルにあらかじめ付加され得るか、または化学物質が細胞により生成される／発現されるように、細胞上に（人工的に）遺伝的に付与され得る。ステップ２３１５では、ＬＥＩＡにより生じた光信号は、光検出器素子（例えば、フォトダイオード）により検出される。例えば、ＲＨ１６９１は、約７０ｎｍで赤色光の蛍光を発する。

【0157】

ステップ２３２０では、光検出器素子への光の衝突から得られる信号は、コンピュータに返信される。これは、二元（例えば、「高」対「低」信号強度）であり得るか、または活性レベルの連続スペクトルに反映するように段階的であり得る。複数の光検出器を用いて、異なる波長でエネルギーを決定する場合には、これらの光検出器の個々の読み出しは、自動化プロセスの後期で適切な解釈に対して、並行して、または配列において、記録され得る。ステップ２３３０では、このシステムは、自動化システムにより配置されるように次のトレイを要求する。次のトレイは、ステップ２３３５で位置に移動し、このプロセスは、バッチ処理において全てのトレイが処理されるまで繰り返すことができる。

【0158】

光送達のために割り当てられた時間は異なり得、光開口型プロトンまたはイオンチャネル／ポンプ発現のレベル、ならびにその細胞集団の他のプロトンの密度および特性／イオンチャネル特性を含む因子に依存する。光受容のために割り当てられた時間は異なり得、スクリーニング期間に必要とされる精度の程度を含む因子に依存する。ウェルプレート（トレイ）を変えるために割り当てられた時間は異なり得、自動化装置の機械的速度を含む因子に依存する。高速ニューロンが、試験される細胞として使用される場合、細胞刺激およびＬＥＩＡの検出プロセスは、ミリ秒台で達成することができる。

【0159】

上述のプロセスは、変動条件下で繰り返すことができる。例えば、所与の一組の細胞を、薬物が存在しない場合、続いて、１つ以上の薬物が存在する場合で、試験することができる。これらの条件下で、電気的に興奮した細胞の応答は、それにより、記録され、比較され、研究され得る。本発明は、トレイ上のそれぞれのウェルに対して少なくとも１つのエミッター／検出器および少なくとも２つの共に操作する装置とともに実装される場合、連続操作は、長時間維持することができる。

【0160】

図２３は、本発明の一実施形態内で使用するのに適しているウェルプレートのウェル内の細胞および薬物サンプルの配置の一例を示す。
この図では、ウェルプレート２４０１（ウェル２４０５を含有する「トレイ」としても本明細書に称される（例）は、番号１〜１２で表示される列２４２５と、文字Ａ〜Ｈで表示される行２４２０で構成される。より具体的には、一例示的な列および行は、それぞれ、２４１０および２４１５で定義される。

【0161】

これらのウェルに導入される内容物の機能的なレイアウトの一例として、単一プレートの行Ａ〜Ｈは、２つの異なる薬物の試験のために使用してもよい。ベースライン条件を示すために、列１は、薬物は含有しないが、光学的に開口された細胞、内因性または外因性ＬＥＩＡを含有してもよい。列２〜６は、列ごとに１つの濃度レベルである、薬物Ｘの５つの異なる濃度のために使用してもよい。同様に、列７〜１１は、列ごとに１つの濃度レベルである、薬物Ｙの５つの異なる濃度のために使用してもよい。列１２は、完全に使用可能であるが、この特定の例では、未使用のままである。

【0162】

種々のウェル中の可変要素は、試験される細胞の種類、この細胞のために試験されるイオンチャネルの種類、細胞中に置かれる薬物の種類、ウェル中に置かれる薬物の濃度、使用される特定のＬＥＩＡ、およびそのウェル中の細胞に適用される光学的に開口する刺激パラメータ（例えば、波長、強度、周波数、持続時間）を含んでもよい。

【0163】

図２４は、本開示の発明が、ハイスループットの薬物スクリーニングを促進するより大型のシステム内で利用され得る状況を示す。ウェルプレート２５０６は、ウェル２５０５を含有する。これらは、ベルトコンベア、ロボット運搬装置、または他の送達機構等の装置であり得るコンベヤ２５２０により前方に運ばれる。ピペット２５１０は、ロボット部材２５１５中に保持され、適切な数の培養細胞および培地をウェル２５０５に注入する働きをする。続いて、ウェルプレート２５０６は、コンベヤ２５２０の下方へ移動され、ロボット部材２５１５に類似し、ピペットも含有するロボット部材２５２５は、適切な量のＬＥＩＡをウェル２５０５に注入する。次いで、コンベヤ２５２０は、ウェルプレート２５０５をスクリーニングチャンバ２５３０に持ち込む。図１７、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１９Ａ、および図１９Ｂに関連して記載されるもの等のエミッター／検出器装置は、チャンバ２５３０内に位置する。さらに、図２０Ａおよび図２０Ｂに記載されるプロセスの部分は、このチャンバ内で起こり得る。続いて、ウェルプレート２５３５は、コンベヤ２５４０によりスクリーニングチャンバ２５３０から取り出され、２５４５で廃棄される。代替的な一実施形態において、１つ以上のロボット装置は、ウェルプレート２５０６の位置にピペット２５１０、スクリーニングチャンバ２５３０等を移動し、その逆とはならないようにしてもよい。

【0164】

上記の考察と一致して、例示的スクリーニング方法は、サンプルを交換する必要なしに、複数のデータ点の収集を含むこともあり得る。サンプルの制御は、高速シャッターで活性化する光を単に点滅させることにより同じサンプルの調製に反転できるため、同じサンプルを再使用することができる。さらに、一連のパターンの刺激を同じ細胞サンプルに提供することができるため、異なるサンプル調製物にわたる差異に関して懸念することなしに、薬物の効果についての試験を行うことができる。励起のレベルを調節することにより（例えば、光のないレベルから高いまたは最大強度のレベルに増加することにより）、一連の膜電位にわたる薬物の効果を試験することができる。これにより、過分極、自然、または脱分極膜電位中、効果的である薬物の特定を可能にする。

【0165】

本明細書に記載の細胞株は、ハイスループットの様式で、薬物候補を詳細に特性付けるのに特に有用であり得る。光学制御は、比較的高速であり、それにより、活性化のより生理学的な形態下で、薬物の活性を試験することができる。例えば、脱分極および／または過分極の異なる周波数を用いて、神経活動の生理学的な形態下で、いかに薬物がチャネルと相互作用するかを決定することができる。場合によっては、このプロセスは、細胞株への高価な化学染料の適用なしで達成することができる。

【0166】

本明細書に考察される種々の性質と関連して、本発明の種々の実施形態の使用は、扱いにくい機械的操作および液体の処理の必要性を排除することにより、スクリーニングスループットを改善するために特に有用であり得る。種々の実施形態はまた、同じサンプルを用いてスクリーニングアッセイを繰り返し可能にすることと、化学的に基づいた蛍光方向の必要性を排除することによりスクリーニング費用を軽減することと、高い時間精度および低い信号アーチファクトを生じることと（電圧操作の光学的性質による）、刺激のために使用される光強度を減衰させることにより脱分極のレベルを調節することと、パルス光パターンの使用を通じてイオンチャネルにおける薬物の調節の動力学を解明すること、にも有用であり得る。

【0167】

複数の単独で制御可能な励起タンパク質および抑制性タンパク質の存在は、種々の疾患の治療のための応用、および複数のそれぞれの光学的波長に応答するように選択することができる複数の光応答性タンパク質の使用が挙げられるが、これらに限定されない、種々の応用への道を開く。必ずしも明確に提示されないが、抑制は、応用において、励起と組み合わせて、励起に加えて、または励起の代わりに使用することができる。単一成分のタンパク質のファミリーは、複数の光の波長および強度に応答することが示されている。本発明の態様は、さらなる光学的波長および／もしくは個々に制御可能なタンパク質チャネルを可能にするさらなる変異体ならびに／または配列検索を可能にする。光学的な刺激におけるバリエーション（例えば、波長、強度、または持続時間プロファイル）も使用することができる。例えば、刺激プロファイルは、２つの異なるイオンチャネルタンパク質の励起波長における重なりを利用して、両方のタンパク質を同時に励起させることができる。１つのそのような例では、タンパク質は、異なるレベルの責任を有してもよい。したがって、神経への応用では、１組のイオンチャネルは、第２の組のイオンチャネルと比較して異なる成功率でスパイクを生成し得る。同様に、２つの異なるイオンチャネル（またはポンプ）の抑制性波長における重なりは、両方のタンパク質を同時に抑制させる。
あるいは、複数の光源は、所望の組み合わせにおいて光応答性タンパク質の刺激を可能にするが、他のタンパク質を刺激しないまま残すように使用することができる。

【0168】

本発明の多くのヒトへの応用は、それらの使用前に政府の承認が必要である。例えば、遺伝子治療のヒトへの使用は、そのような承認が必要になり得る。しかしながら、ニューロンの同様な遺伝子治療（新生物に対して感受性のない非増殖細胞）は急速に進んでおり、ヒトの脳へのウイルス遺伝子送達を含む、現行の、ＦＤＡに承認された臨床試験が既に進行中である。これは、幅広い応用への本発明の種々の実施形態の使用を促すであろう。以下に、そのような応用および実施形態の例の一部を非網羅的に挙げる。

【0169】

中毒は、報酬および期待を含む種々の脳機能に関連している。さらに、中毒を引き起こす原因は、個体間で異なり得る。一実施形態によれば、中毒、例えば、ニコチン中毒を、島の小さな領域を光遺伝学的に安定化することで治療してもよい。任意に、脳機能イメージング、例えば、ｃｕｅｄ−ｓｔａｔｅ ＰＥＴまたはｆＭＲＩを用いて、島表面上の介入のための正確な標的スポットを決定するために、代謝亢進焦点の位置を決めてもよい。

【0170】

側坐核および中隔の光遺伝学的興奮は、物質の使用に頼る必要なく、患者に報酬および快楽を与えることができるため、中毒治療の鍵を握っている可能性がある。逆に、側坐核および中隔の光遺伝学的安定化を用いて、中毒と関連する薬物渇望を低下させることができる。代替的な一実施形態において、前帯状回（ＢＡ３２）の膝（ｇｅｎｕ）で観察される代謝亢進活性の光遺伝学的安定化を用いて、薬物渇望を低下させることができる。プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド生成物を含有する視床下部内側部の弓状核内の細胞の光遺伝学的安定化を用いて、薬物中毒行動を減少させることもできる。この点に関するさらなる情報については、Ｎａｑｖｉ ＮＨ，Ｒｕｄｒａｕｆ Ｄ，Ｄａｍａｓｉｏ Ｈ，Ｂｅｃｈａｒａ Ａ．“Ｄａｍａｇｅ ｔｏ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌａ ｄｉｓｒｕｐｔｓ ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏ ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｉｎｇ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｊａｎ ２６；３１５（５８１１）：５３１−５３４を参照してもよく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0171】

ソマトスタチンを分泌する視床下部室周核（ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）の神経内分泌ニューロンの光遺伝学的刺激を用いて、例えば、末端肥大症において、下垂体前葉からの成長ホルモンの分泌を抑制することができる。ソマトスタチンまたは成長ホルモンを分泌する神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化を用いて、成長および身体的発達を増進することができる。「正常な」加齢に伴う変化の中に、４０または５０代以後の、血清成長ホルモンレベルの急激な低下が挙げられる。したがって、脳室周囲核の光遺伝学的安定化により、加齢に伴う身体的な衰えを低減し得る。

【0172】

視床下部の腹内側核の光遺伝学的安定化、特に、弓状核のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）の光遺伝学的安定化を用いて、食欲を増加させることができ、それにより、神経性食欲不振を治療することができる。あるいは、視床下部の外側核の光遺伝学的刺激を用いて、食欲および摂食行動を増加させることができる。

【0173】

側頭葉、ＮＢＭ（マイネルト基底核）および後帯状回（ＢＡ３１）を含む、患部のコリン作動性細胞における光遺伝学的興奮は、刺激をもたらし、ひいては、悪化している領域に対し、神経栄養性の動因（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｄｒｉｖｅ）を与える。この患部は、脳内で広範囲に広がっているため、埋め込み型電極を用いての類似の治療は、光遺伝学的アプローチよりも実現可能性が低いことがある。

【0174】

不安障害は、通常、左側頭皮質および前頭皮質ならびに扁桃体における活性増加に関連し、これは、不安が解消されるにつれ正常に向かう。したがって、患部の左側頭部および前頭部ならびに扁桃体は、光遺伝学的安定化によって治療して、これらの領域の活性を抑えることができる。

【0175】

正常な生理機能では、受けた光に応答して脱分極する、網膜の光感受性神経系細胞は、その受けた光のパターンの視覚地図を作り出す。光遺伝学的イオンチャネルを用いて、身体の多くの部分でこのプロセスを模倣することができ、眼も例外ではない。網膜損傷に起因する視覚障害または失明の場合、埋め込み型装置からの閃光パターンよりもむしろ天然の周辺光を利用する、機能的に新しい網膜を成長させることができる。成長させた人工網膜を、本来の網膜の位置（視覚皮質に戻る導管としての機能を果たす視神経を活用することができる）に配置してもよい。あるいは、この人工網膜は、例えば、前頭等の別の位置に配置してもよいが、但し、脱分極信号のための導管が、光遺伝学的センサーマトリックスからのコード化情報を解読できる皮質組織へと伝達されることを条件とする。視覚皮質の視覚経路の下流を刺激することにより、皮質盲を治療することもできる。刺激は、視覚皮質の上流で、または人工の光センサーにより生成された視覚的データに基づくであろう。

【0176】

頻脈の治療は、ＣＮ Ｘまたは迷走神経を含む、副交感神経系繊維への光遺伝学的刺激により達成することができる。これは、洞房結節（ＳＡ ｎｏｄｅ）の速度を低下させ、それにより、心拍数および収縮力を低下させる。同様に、脊髄神経Ｔ１〜Ｔ４内の交感神経系繊維の光遺伝学的安定化は、心臓を遅くする働きをする。病的徐脈の治療のためには、迷走神経の光遺伝学的安定化またはＴ１〜Ｔ４中の交感神経系繊維の光遺伝学的刺激が、心拍数を増加させる働きをする。洞房結節より速い異常な電気的病巣（ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｆｏｃｉ）に起因する不整脈は、適度な光遺伝学的安定化で異常な電気的病巣を治療することにより抑制することができる。これにより、治療される組織内の固有の発火速度を低下させ、かつ、洞房結節に心臓の電気系のペーシングする役割を取り戻すことを可能にする。同様な方法で、あらゆる種類の心不整脈が治療され得る。心筋症またはうっ血性心不全で起きる心臓組織の変性も、本発明を用いて治療することができ、残った組織を本発明の種々の実施形態を用いて興奮させることができる。

【0177】

前頭葉、頭頂葉、および海馬を含む脳領域の光遺伝学的興奮刺激は、処理速度を上昇させ、記憶力を向上させ、また、神経前駆細胞の発達刺激を含むニューロンの成長および相互接続を刺激することができる。一例として、本発明のそういった応用の１つは、ほぼ植物（ほとんど意識が無い）状態から患者を抜け出させることを目的とした、視床における標的ニューロンの光遺伝学的興奮刺激を対象とする。標的視床ニューロンの膜における光開口型イオンチャネルまたはポンプの増殖がもたらされる。次いで、光のフラッシュを向けることにより、（例えば、同じ経路によってもアクセスできる光学部品を介して）これらの修飾されたニューロンを刺激し、その結果、標的ニューロンおよび／または周囲の細胞の機能を調節する。（電極による治療を用いた）適切な調節技術に関するさらなる情報について、または、そのような患者の関連脳領域に関するさらなる情報については、Ｓｃｈｉｆｆ ＮＤ，Ｇｉａｃｉｎｏ ＪＴ，Ｋａｌｍａｒ Ｋ，Ｖｉｃｔｏｒ ＪＤ，Ｂａｋｅｒ Ｋ，Ｇｅｒｂｅｒ Ｍ，Ｆｒｉｔｚ Ｂ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ Ｂ，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ ＪＯ，Ｋｏｂｙｌａｒｚ ＥＪ，Ｆａｒｒｉｓ Ｓ，Ｍａｃｈａｄｏ Ａ，ＭｃＣａｇｇ Ｃ，Ｐｌｕｍ Ｆ，Ｆｉｎｓ ＪＪ，Ｒｅｚａｉ ＡＲ “Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｌａｍｉｃ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｅｖｅｒｅ ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ，”Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４４８，Ａｕｇ ２，２００７，ｐｐ．６００−６０４を参照され得る。

【0178】

代替的な一実施形態において、光遺伝学的興奮を用いて、例えば、うっ血性心不全等の状況における弱った心筋を治療することができる。心臓壁が薄く伸張した脆弱な状態にあり、また、電極と筋肉との間に均等に分布された電気的連結の提供が困難であるため、ＣＨＦの不全心筋の電気的に補助するのは、一般的には実用的でない。このため、心筋収縮性を増大させるための、従来の好ましい方法には、ベータ作動薬等の薬理学的方法、および心室補助装置等の機械的アプローチ、のいずれもが含まれた。本発明のこの実施形態において、心臓の周囲の包被（ｊａｃｋｅｔ）の内表面上の、または、そうでなければ患部心臓壁に対置された発光要素により、弱った心筋へと、光遺伝学的興奮が、送達される。光は、当該技術分野において周知の手段により拡散させて、筋肉の広い領域を平滑に覆ってもよく、それにより、各光パルスにより収縮が促される。

【0179】

帯状回膝下野（Ｃｇ２５）の光遺伝学的安定化に、埋め込み型装置を用いて黄色光を適用してもよい。その目的は、Ｍａｙｂｅｒｇ ＨＳ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｅｐ Ｂｒａｉｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．４５，６５１−６６０，Ｍａｒｃｈ ３，２００５，ｐｐ．６５１−６６０に教示されているのと同様な様式で標的活性を抑制することにより、うつ病を治療することであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。代替的な一実施形態において、光遺伝学的興奮刺激法は、Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｅｐ Ｂｒａｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｒｅｗａｒｄ Ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ Ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ Ａｎｈｅｄｏｎｉａ ｉｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍａｊｏｒ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００７，ｐｐ．１−１０に教示されているのと同様な様式で、その領域における活性を増加させることであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0180】

さらなる別の実施形態において、左背側前頭前皮質（ＬＤＰＦＣ）を、光遺伝学的興奮刺激法による標的とする。５〜２０ＨｚでのＬＤＬＰＦＣのペーシングは、連結している回路を介してＣｇ２５の活性を低下させる働きをしているこの構造の基礎代謝レベルを上昇させる働きをし、そのプロセスでうつ病が改善される。右背外側前頭前皮質（ＲＤＬＰＦＣ）の抑制も、効果的なうつ病治療戦略である。これは、ＲＤＬＰＦＣにおける光遺伝学的安定化により達成することができ、あるいは、抑制は、光遺伝学的興奮刺激を用い、かつ、ゆっくりとした速度（例えば、１Ｈｚ以下）でパルスを発することによっても達成することができる。迷走神経刺激（ＶＮＳ）は、光遺伝学的アプローチを用いて改善することができる。光遺伝学的興奮の使用を、例えば、節状神経節および頚静脈神経節等の、脳への求心性迷走神経のみを刺激するために用いてもよい。脳からの遠心路は、このアプローチによる刺激を受けないため、喉の不快感、咳、嚥下困難、および嗄声を含む、ＶＮＳの副作用の一部が除去される。代替的な一実施形態において、海馬を光遺伝学的に興奮させてもよく、これは、樹状突起および軸索発芽の増加ならびに海馬の全体的な成長を導く。本発明を用いて治療され得るうつ病に関連する他の脳領域としては、扁桃体、側坐核、眼窩前頭皮質、および眼窩内側（ｏｒｂｉｔｏｍｅｄｉａｌ）皮質、海馬、嗅皮質、ならびに、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、およびノルアドレナリン作動性の突出が挙げられる。光遺伝学的アプローチを用いて、海馬等の構造体を介して活性の広がりを制御して、抑うつ症状を制御することができ得る。

【0181】

生存可能なアルファおよびベータ細胞集団が膵ランゲルハンス島中に存在する限り、膵島は、糖尿病の治療の標的となり得る。例えば、（手作業で、または閉ループグルコース検出システムにより決定して）血清グルコースが高い場合、光遺伝学的興奮を用いて膵臓中のランゲルハンス島のベータ細胞からのインスリン放出を引き起こすことができ、その一方で、光遺伝学的安定化を用いて膵臓中のランゲルハンス島のアルファ細胞からのグルカゴン放出を妨げる。逆に、（手作業で、または閉ループグルコース検出システムにより決定して）血糖が低すぎる場合、光遺伝学的安定化を用いてインスリンのベータ細胞分泌を停止させることができ、かつ、光遺伝学的興奮を用いてグルカゴンのアルファ細胞分泌を増加させることができる。

【0182】

てんかんの治療のために、てんかん発作性活性を停止させるかまたはブロックすることは、光遺伝学的アプローチによく適している。ほとんどのてんかん患者は、てんかん病巣により、定型的な活性の広がりのパターンを有する。光遺伝学的安定化を用いて、広がる前に異常活性を抑制するか、またはその経過の早期にそれを打ち切ることができ得る。あるいは、光遺伝学的興奮刺激による興奮性組織の活性化を、一連の意図的な非同時的パターンで送達して、出現する発作活性を中断させることができ得る。別の代替案は、同様の結果を得るためのＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける光遺伝学的興奮刺激の活性化に関連する。視床中継を、異常なＥＥＧパターンが検出される場合に引き起こされる光遺伝学的安定化による標的としてもよい。

【0183】

別の実施形態は、胃腸障害の治療に関連する。消化器系は、それ自体の、感覚ニューロン、運動ニューロン、および介在ニューロンを含有する半自律神経系を有する。これらのニューロンは、ＧＩ管の動きも制御し、ならびに腸内の特定の細胞が酸、消化酵素、ならびに、ガストリン、コレシストキニン、およびセクレチンを含むホルモンを放出することを引き起こす。これらの細胞産物のいずれかの分泌不全を含む症候群は、産生細胞型、またはそれらの活性を促進するニューロンの光遺伝学的刺激により治療することができる。
逆に、過剰な内分泌物および外分泌物を作り出される症候群は、光遺伝学的安定化を用いて治療することができる。便秘（特に、脊髄損傷のある患者の便秘）から巨大結腸症にまで及ぶ、腸運動低下障害は、腸内の運動ニューロンの光遺伝学的興奮により治療することができる。いくつかの形態の過敏性腸症候群を含む腸運動過剰障害は、運動を制御するニューロンの光遺伝学的安定化により治療してもよい。神経原性の胃流出路閉塞は、胃の幽門部におけるニューロンおよび筋組織の光遺伝学的安定化により治療することができる。運動性低下症候群（ｈｙｐｏｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）に対する１つの代替的アプローチは、腸壁中の伸張感受性ニューロン（ｓｔｒｅｔｃｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｎｅｕｒｏｎ）に対して光遺伝学的興奮を与え、それにより、その腸がいっぱいになっており、排出（ｅｍｐｔｙｉｎｇ）を必要としているという信号を増加させることである。

【0184】

この同じパラダイムで、腸の運動過剰症候群（ｈｙｐｅｒｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｔ）に対する１つのアプローチは、下部ＧＩ中の伸張受容体ニューロン（ｓｔｒｅｔｃｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）に対して光遺伝学的安定化を提供し、それにより、その腸が空であり、排出を必要としていなかったという「偽の合図（ｆａｌｓｅ ｃｕｅ）」を与える。明白な（ｆｒａｎｋ）便失禁の場合には、内括約筋および外括約筋の制御を改善することが、この管全体の運動性を低下させるのに好ましいことがある。患者が便を体内にとどめておく必要がある間は、内肛門括約筋の光遺伝学的興奮は、保持力を提供する。光遺伝学的刺激を外括約筋に与えることにより、さらなる自制を与えることができる。患者が排便する必要があるときには、その光遺伝学的刺激を休止させるか、または光遺伝学的安定化を追加するかのいずれかによって、内肛門括約筋、次いで外肛門括約筋を弛緩させなければならない。

【0185】

伝音難聴は、光学的蝸牛インプラントの使用により治療することができる。一旦、この蝸牛が光遺伝学的刺激に対して準備されると、閃光を発する蝸牛インプラントを用いてもよい。感音難聴は、聴覚路における下流の標的の光学的な刺激を介して治療することができる。

【0186】

本発明の別の実施形態は、高血圧等の血圧障害の治療を対象とする。例えば、大動脈（大動脈体および大動脈傍体）および頸動脈（「頚動脈小体」）等の領域にある圧受容器および化学受容器は、迷走神経（ＣＮ Ｘ）を介した求心性神経、および他の経路を、髄質および橋、特に孤束および孤束核、へと送ることにより、血圧および呼吸の調整に関与する。頚動脈小体、大動脈体、大動脈傍体の光遺伝学的興奮を用いて、「高血圧」という偽のメッセージを、孤束核および孤束へ送り、血圧を低下させるべきであるという報告をさせることができる。また、脳幹の適切な部分への直接的な光遺伝学的興奮または安定化を用いて血圧を下げることもできる。これと反対のモダリティは、光遺伝学的アプローチを、昇圧薬（ｐｒｅｓｓｏｒ）として働かせ、それにより血圧が上昇する。また、迷走神経の光遺伝学的興奮を介して、または脊髄神経Ｔ１〜Ｔ４内の交感神経繊維の光遺伝学的安定化によっても、同様の効果を達成することができる。代替的な一実施形態において、高血圧は、心臓の光遺伝学的安定化により治療することができ、それにより、心拍出量の減少および血圧の低下がもたらされる。別の実施形態によれば、副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的安定化を用いて、血圧を低下させることができる。さらなる別の代替的な実施形態において、高血圧は、血管平滑筋の光遺伝学的安定化により治療することができる。活性化している光は、末梢血管床へと経皮的に通過させることができる。

【0187】

別の例示的実施形態は、視床下部‐下垂体‐副腎系障害の治療を対象とする。甲状腺機能低下症の治療では、視床下部室傍核および視床下部前核中の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的興奮を用いて、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）の分泌を増加させることができる。ＴＲＨは、次いで下垂体前葉を刺激し、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を分泌させる。逆に、甲状腺機能亢進症は、小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化により治療することができる。副腎不全またはアディソン病の治療には、視索上核および室傍核中の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的興奮を用いて、バソプレシンの分泌を増加させることができ、バソプレシンは、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）に補助されて、下垂体前葉を刺激して、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を分泌させる。クッシング症候群は、過剰なＡＣＴＨ分泌によって度々引き起こされるが、上述の同じ生理学的連鎖の効果を介して、視索上核の小細胞性神経内分泌ニューロンの光遺伝学的安定化により治療することができる。弓状核の神経内分泌ニューロンは、ドーパミンを産生し、これが、下垂体前葉からのプロラクチンの分泌を抑制する。したがって、高プロラクチン血症は、光遺伝学的興奮を介して治療することができ、一方、低プロラクチン血症は、弓状核の神経内分泌細胞の光遺伝学的安定化により治療することができる。

【0188】

例えば、不安障害等の自律神経過剰（ｈｙｐｅｒａｕｔｏｎｏｍｉｃ）状態の治療では、副腎髄質の光遺伝学的安定化を用いて、ノルエピネフリンの分泌量（ｏｕｔｐｕｔ）を減少させることができる。同様に、副腎髄質の光遺伝学的刺激を、例えば、重症喘息を患っている人または慢性的な眠気として現れる障害を有する人等のアドレナリンの急増が必要な人に用いてもよい。

【0189】

副腎皮質の光遺伝学的刺激は、コルチゾール、テストステロン、およびアルドステロンを含む化学物質の放出を引き起こす。副腎髄質とは違い、副腎皮質は、下垂体および視床下部、肺、ならびに腎臓から分泌される神経内分泌性ホルモンからの指令を受ける。それにはかかわらず、副腎皮質は、光遺伝学的刺激に対し従順である。副腎皮質のコルチゾール産生細胞の光遺伝学的刺激を用いて、アディソン病を治療することができる。副腎皮質のコルチゾール産生細胞の光遺伝学的安定化を用いて、クッシング病を治療することができる。テストステロン産生細胞の光遺伝学的刺激を用いて、女性における性的関心の障害を治療することができ、同細胞の光遺伝学的安定化を用いて、女性における顔ひげを減少させることができる。副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的安定化を用いて、血圧を低下させることができる。副腎皮質内のアルドステロン産生細胞の光遺伝学的興奮を用いて、血圧を上昇させることができる。

【0190】

特定の患部脳領域の光遺伝学的興奮刺激を用いて、処理速度を増加させ、また、例えば、神経前駆細胞の成熟刺激を含むニューロンの増殖および相互接続を刺激することができる。そのような使用は、精神遅滞の治療に特に有用であり得る。

【0191】

本発明の別の実施形態によれば、種々の筋肉疾患および損傷を治療することができる。筋損傷、末梢神経損傷、およびジストロフィー疾患に関連した麻痺は、収縮を引き起こすための光遺伝学的興奮、および弛緩を引き起こすための光遺伝学的安定化により治療することができる。この後者の、光遺伝学的安定化アプローチを介した弛緩を用いて、筋肉の消耗を防止し、緊張を維持し、また、対立筋群が収縮するので、協調運動が可能となり得る。同様に、明白な痙縮は、光遺伝学的安定化を介して治療することができる。

【0192】

末梢神経切断、脳卒中、外傷性脳損傷、および脊髄損傷等のような広範な領域で、新たなニューロンの増殖を促進し、かつ、他のニューロンとの、およびそれらの標的組織との機能的ネットワークの中へそれらが統合されることを助ける必要性がある。新たなニューロン経路（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｒａｃｔ）の再成長を、光遺伝学的興奮を介して促すことができ、これは、幹細胞に信号を送って、軸索および樹状突起を発芽させ、かつ、それら自身をネットワークと統合させるのに役立つ。（電極ではなく）光遺伝学的技術の使用は、損傷を受けていない組織による信号の受け取りを防止し、かつ、電極から発生する電流のような人工的な信号によってではなく、発生中のニューロンによって築かれた連絡網（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）による新たな標的組織の成長を確実にするのに役立つ。

【0193】

肥満は、視床下部の腹内側核への光遺伝学的興奮、特に、弓状核のプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）への光遺伝学的興奮により治療することができる。代替的な一実施形態において、肥満は、視床下部の外側核の光遺伝学的安定化を介して治療することができる。別の実施形態において、レプチン産生細胞への、または視床下部内のレプチン受容体を有する細胞への光遺伝学的刺激を用いて、食欲を低下させることにより肥満を治療することができる。

【0194】

前嚢（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃａｐｓｕｌｅ）への破壊病変、およびその領域に対する類似のＤＢＳは、重度の難治性の強迫性障害４８（ＯＣＤ４８）を治療する、確立された手段である。内包前脚への、またはＯＣＤが軽減するにつれて代謝の低下を示す部位（例えばＢＡ３２およびＣｇ２４等）への、光遺伝学的安定化を用いて、このようなアプローチを模倣してもよい。

【0195】

慢性疼痛を、本発明の別の実施形態を用いて治療することができる。電気刺激法としては、局所的な末梢神経刺激、局所的な脳神経（ｃｒａｎｉａｌ ｎｅｒｖｅ）刺激、および「閾値下の」運動皮質刺激が挙げられる。適切な光遺伝学的アプローチには、局所的な有痛性部位における光遺伝学的安定化が含まれる。プロモータ選択に注意することにより、他の感覚および運動繊維への影響を確実に回避し得よう。一次運動皮質における介在ニューロンの選択的な光遺伝学的興奮によっても、効果的に疼痛を軽減し得る。また、感覚系視床（特に内側視床核）、脳室周囲灰白質、および腹側縫線核における光遺伝学的安定化を用いて、疼痛の軽減をもたらすことができる。代替的な一実施形態において、標的化戦略としてパルブアルブミンを発現する細胞を標的とする光遺伝学的安定化を用いて、疼痛を、サブスタンスＰ産生を減少させることにより治療することができる。内因性オピオイドの放出は、光遺伝学的興奮を用いて側坐核の活性を上昇させることにより達成され得る。代替的な一実施形態において、視床下部内側部の弓状核のＰＯＭＣニューロンを光遺伝学的に興奮させたとき、ベータエンドルフィンが増加し、うつ病および慢性疼痛に対する実行可能な治療アプローチが提供される。

【0196】

境界型および反社会型を含むある種の人格障害は、「前頭葉機能低下（ｈｙｐｏｆｒｏｎｔａｌｉｔｙ）」を含む脳障害における局所的欠陥を示す。これらの領域の直接的または間接的な光遺伝学的興奮は、症状の改善をもたらすことが予想される。扁桃体における活動の異常なバーストが、境界性人格障害の１つの症状である突然の自発的な激怒、ならびに他の状態を引き起こすことも知られているが、これには、扁桃体の光遺伝学的安定化が有益であり得る。光遺伝学的アプローチは、例えば、扁桃体、線条体、および前頭皮質を含む、脳の異なる部分同士の連絡および同期化を改善するであろうが、このことは衝動性の軽減および洞察力の改善に役立つであろう。

【0197】

外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）の扁桃中心（ａｍｙｇｄａｌｏ‐ｃｅｎｔｒｉｃ）モデルは、扁桃体の過覚醒ならびに内側前頭前皮質（ｍｅｄｉａｌ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ）および海馬によるトップダウン制御が不十分であることが関連していると提唱している。したがって、ＰＴＳＤは、扁桃体または海馬の光遺伝学的安定化により治療することができる。

【0198】

統合失調症は、幻聴を含む異常を特徴とする。これらは、光遺伝学的安定化を用いた聴覚皮質の抑制により治療できる可能性がある。統合失調症に付随する前頭葉機能低下は、前頭部患部における光遺伝学的興奮により治療できる可能性がある。光遺伝学的アプローチは、脳の異なる部分同士の連絡および同期化を改善し得、このことは、自己生成した（ｓｅｌｆ‐ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）刺激を外来性のものと解してしまう誤帰属（ｍｉｓａｔｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の軽減に役立ち得る。

【0199】

プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド生成物を含有する視床下部内側部の弓状核内の細胞の光遺伝学的安定化を用いて、強迫的性行動の低減させることができる。プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）およびコカイン・アンフェタミン調節転写産物（ＣＡＲＴ）のペプチド生成物を含有する視床下部内側部弓状核内の細胞の光遺伝学的興奮を用いて、性的欲求の障害の症例の治療において、性的関心を増加させることができる。性的欲求低下障害の治療では、精巣および副腎によるテストステロン産生は、下垂体の光遺伝学的興奮により増加させることができる。側坐核の光遺伝学的興奮は、無オルガスム症の治療に用いることができる。

【0200】

視交叉上核は、睡眠／覚醒サイクルを調整する働きをするメラトニンを分泌する。視交叉上核への光遺伝学的興奮を用いて、睡眠を誘導し、メラトニン産生を増加させることができ、それにより不眠症を治療することができる。オレキシン（ヒポクレチン）ニューロンは、覚醒状態を促進するために、多数の脳核を激しく興奮させる。オレキシン産生細胞集団の光遺伝学的興奮を用いて、ナルコレプシーおよび慢性的な日中の眠気を治療することができる。

【0201】

視索上核の光遺伝学的刺激を用いてオキシトシンの分泌を誘発することができ、視索上核の光遺伝学的刺激を用いて出産の最中に分娩（ｐａｒｔｕｒｉｔｉｏｎ）を促進することができ、また、視索上核の光遺伝学的刺激を用いて社会的愛着における障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｏｆ ｓｏｃｉａｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を治療することができる。

【0202】

筋肉の麻痺と同様に、脊髄損傷により求心路が遮断された運動機能は、収縮を引き起こすための光遺伝学的興奮、および弛緩を引き起こすための光遺伝学的安定化により治療することができる。この後者の、光遺伝学的安定化アプローチを介した弛緩を用いて、筋肉の消耗を防止し、緊張を維持し、また、対立筋群が収縮するので、協調運動も可能となり得る。同様に、明白な痙縮は、光遺伝学的安定化を介して治療することができる。新たな脊髄ニューロン路の再成長を、光遺伝学的興奮を介して促すことができ、これは、幹細胞に信号を送って、軸索および樹状突起を発芽させ、かつ、それら自身をネットワークと統合させるのに役立つ。

【0203】

脳卒中障害（ｓｔｒｏｋｅ ｄｅｆｉｃｉｔ）には、人格変化、運動障害、感覚障害、認知欠損、および情緒不安定が含まれる。脳卒中障害を治療するための１つの戦略は、興奮性結合から求心路が遮断された脳および身体構造に、光遺伝学的刺激を与えることである。同様に、抑制性結合から求心路が遮断された脳および身体構造に、光遺伝学的安定化能を与えることができる。

【0204】

トゥレット症候群の根底にある生物病理は、皮質領域および皮質下領域、視床、大脳基底核、ならびに前頭皮質におけるドーパミン伝達の相動性の（ｐｈａｓｉｃ）機能障害である、ということが研究により示されている。治療を提供するために、患部領域を、まず、脳機能イメージングおよび脳磁図（ＭＥＧ）を含む技術を用いて特定することが好ましい。具体的に特定されてもされなくても、候補経路の光遺伝学的安定化を用いて、運動性チックを抑制することができる。装置パラメータの、移植後実験的（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ）試験により、いずれの部位で光遺伝学的安定化がなされ、またいずれが継続の必要性がないかが明らかとなる。

【0205】

尿失禁または便失禁の障害を治療するために、光遺伝学的安定化を、括約筋に対して、例えば、膀胱排尿平滑筋の光遺伝学的安定化またはその筋肉の神経支配を介して、用いることができる。排尿が必要なときは、これらの光遺伝学的プロセスをオフにするか、またはあるいは、（外）尿道括約筋への光遺伝学的安定化、および膀胱排尿筋の光遺伝学的興奮またはその神経支配とともに、逆進させてもよい。膀胱が求心路遮断されている場合、例えば、ヒトにおける脊髄癆等の背根の疾患により仙骨背根（ｓａｃｒａｌ ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ）が、切断または破壊されている場合には、膀胱の全ての反射収縮が消失し、膀胱は膨張する。直接的に筋肉の光遺伝学的興奮を用いて、排尿に対する緊張を回復させ、腎臓損傷を防止し、また、排尿プロセスを補助することができる。膀胱が、「神経中枢から隔離されて」、動きに対して過敏（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）になっている場合、したがって、失禁しやすくなっている場合、器官のこの反応性を最小限に抑えるために膀胱筋への光遺伝学的安定化を用いることができる。

【0206】

ニューロンの、ある所定の集団、例えば、ある病気の病状に関連するもの等を選択的に興奮させる／抑制するために、いくつかの戦略を用いて、特定の集団に対する光遺伝学的タンパク質／分子を標的とすることができる。

【0207】

本発明の種々の実施形態については、遺伝子の標的化を用いて、種々の光遺伝学的タンパク質または分子を発現させることができる。そのような標的化には、例えば、プロモータ（例えば、パルブアルブミン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ＧＦＡＰ）、エンハンサー／サイレンサー（例えば、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー）、および他の転写または翻訳調節因子（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子）等の遺伝学的な制御因子を介して光遺伝学的タンパク質／分子の標的発現が含まれる。プロモータ＋エンハンサー＋調節因子の組み合わせの順列を用いて、光遺伝学的プローブの発現を、遺伝学的に定義された集団に限定することができる。

【0208】

本発明の種々の実施形態は、空間的／解剖学的な標的化を用いて実施してもよい。そのような標的化は、ニューロンの突出パターン、ウイルス、または、遺伝情報（ＤＮＡプラスミド、フラグメント等）を保持する他の試薬が、ニューロンのある所定の集団が突出する領域へと、局所的に送達されることがある、という事実を巧みに利用したものである。この遺伝物質は、その後、輸送されて該ニューロンの細胞体へと戻され、光遺伝学的プローブの発現を仲介する。あるいは、局所領域中の細胞を標識することが望ましい場合には、目的の領域にウイルスまたは遺伝物質を局所的に送達して、局在化された発現を仲介させてもよい。

【0209】

本発明の１つ以上の実施形態を実施する際には、種々の遺伝子送達システムが有用である。そのような送達システムの１つは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶを用いて、プロモータ＋光遺伝学的プローブカセットを、目的の特異的領域へと送達することができる。プロモータの選択により、ニューロンの、ある特定の集団における発現が促されることとなる。例えば、ＣａＭＫＩＩａプロモータを使用することにより、光遺伝学的プローブの、興奮性ニューロン特異的発現が促される。ＡＡＶは、少なくとも１年以上にわたる、光遺伝学的プローブの長期的な発現を仲介する。さらなる特異性を達成するために、ＡＡＶは、それぞれが異なる細胞型に対して異なる栄養性（ｔｒｏｐｈｉｓｍ）を有する特異的な血清型１、２、３、４、５、６、７、および８を有する偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）であってもよい。例えば、血清型２および５は、良好なニューロン特異的栄養性を有することが知られている。

【0210】

別の遺伝子送達機構は、レトロウイルスの使用である。ＨＩＶまたは他のレンチウイルス由来レトロウイルスベクターを用いて、プロモータ＋光遺伝学的プローブカセットを、目的の特異的領域へと送達することができる。また、レトロウイルスも、細胞を標識するための、それらの軸索の突出パターンに基づく逆行性輸送を達成するために、狂犬病ウイルスエンベロープ糖タンパク質を有する偽型であってもよい。レトロウイルスは、宿主細胞のゲノムと一体化するので、光遺伝学的プローブの永続的発現を仲介することができる。非レンチウイルス由来レトロウイルスベクターを用いて、分裂細胞を選択的に標識することができる。

【0211】

Ｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、２本鎖ＤＮＡに基づくウイルスであり、これらを用いて、プロモータ＋光遺伝学的プローブカセットを、脳の特異的領域へと送達することができる。ＨＳＶおよびアデノウイルスは、よりずっと大きなパッケージング容量を有しており、よりずっと大きなプロモータ因子を収容可能であり、それらを用いることで、光遺伝学的プローブとともに、複数の光遺伝学的プローブまたは他の治療用遺伝子を送達することもできる。

【0212】

また、局所的エレクトロポレーションを用いて、ニューロンを一時的にトランスフェクションすることもできる。ＤＮＡプラスミドまたはフラグメントを、脳の特定の領域に局所的に送達することができる。穏やかな電流を印加することにより、周囲の局所細胞は、ＤＮＡ物質と光遺伝学的プローブの発現とを受けることとなる。

【0213】

別例では、リポフェクションが、遺伝物質を脂質試薬と混合することにより用いられ、次いで、引き続き脳へと注入されて、局所細胞のトランスフェクトを仲介することができる。

【0214】

種々の実施形態には、種々の制御因子の使用が含まれる。遺伝学的な制御因子に加えて、他の制御因子（特に、化学的な磁気刺激または赤外線照射に対して感受性である活性を有する、プロモータおよびエンハンサー）を用いて、光遺伝学的プローブの、時間的に制御された発現を仲介することができる。例えば、転写活性が赤外線照射の影響を受けやすいプロモータにより、集束照射を用いて、所望の時間のみ、局所領域において光遺伝学的プローブの発現を微調整することを可能にする。

【0215】

パーキンソン病は、ＣａＭＫＩＩα等の興奮特異的プロモータを用いて、視床下核（ＳＴＮ）または淡蒼球内節（ＧＰｉ）のいずれかにおけるグルタミン酸作動性ニューロンにて光遺伝学的安定化を発現させることにより治療することができ、光遺伝学的安定化を適用することができる。全ての細胞型が影響を受ける電気的な調節とは異なり、グルタミン酸作動性のＳＴＮニューロンのみが抑制されるであろう。

【0216】

本発明の態様は、神経回路または神経疾患のモデルを試験することを対象とする。このモデルは、入力信号の関数として回路の出力応答を決定することができる。出力応答は、複数の異なる測定可能な特性を用いて評価することができる。例えば、特性は、下流ニューロンの電気的反応および／または患者の行動応答を含むことができる。モデルを試験するために、モデルの入力位置で光遺伝子的プローブを発現させる。光遺伝子的プローブを刺激し、出力特性をモニターし、モデルから予測される出力と比較する。

【0217】

ある実現形態において、光遺伝子的プローブの使用により、電気的プローブを用いて決定されたモデルを微調整することができる。電気的プローブは、刺激を向ける限られた能力しか与えないため、近くのエリアを直接刺激することなく、特定のエリアを刺激するのにはあまり適していない。本明細書に開示される光遺伝子的プローブは、刺激位置のより正確に選択する機構を提供する。例えば、光遺伝子的プローブからの刺激は、求心性線維等の非常に特定された種類の回路／細胞を対象とすることができる。以下の説明は、そのような実施形態と一致する実施例を提供するものであり、本発明の態様の実行可能性および広い適用性を示すことを意図する。

【0218】

本発明の一実施形態によれば、本発明は、治療効果に関与する標的細胞型（激しく議論される領域であり、臨床的に極めて重要である）を特定するために、例えば、パーキンソン病ラット等の脳深部刺激の動物モデルにおいて用いてもよい。この知見だけでも、ヒトの疾患を治療するための改善された薬理学的および外科的戦略の進展につながり得る。

【0219】

そのような応用の１つは、２つのニューロン群の間における長期増強（ＬＴＰ）および／または長期抑圧（ＬＴＤ）を含む。ＶＣｈＲ１およびＣｈＲ２の発現を異なるニューロン集団に標的化し、それぞれを異なる周波数の光で刺激することにより、２群間でＬＴＰまたはＬＴＤを達成することができる。それぞれの波長の光を用いて、それぞれの群を個別に制御することができる。これは、同じ波長の光を用いて個別に制御する際に、２群の空間的配置が問題となる応用で特に有用であり得る。したがって、光送達装置は、間違ったニューロン群を興奮させにくく、光学的な刺激の正確な空間的位置への依存が少なくなり得る。

【0220】

インビボでの細胞へのタンパク質の送達は、複数の異なる送達装置、方法、およびシステムを用いて達成することができる。そのような送達装置の１つは、例えば、ウイルスベクター等のインビボで細胞を修飾するためのヌクレオチド配列を送達する埋め込み型装置である。埋め込み型装置はまた、光送達機構を含むこともできる。光送達は、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、光ファイバー、および／またはレーザーを用いて達成することができる。

【0221】

本発明の別の実施形態は、生存／死滅、分化、および複製を含む幹細胞の運命に影響を与えるためにＶＣｈＲ１の使用を含む。電気的性質の調節は、幹細胞の運命を制御することが示されている。種々の技術を用いて、幹細胞の運命を修飾する刺激パターンを与えることができる。具体例は、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ，Ｋ．ｅｌ ａｌ．“Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ，”Ｎｅｕｒｏｎ ４２，ｐｐ．５３５−５５２（２００４）に説明される技術に従うものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0222】

本発明の別の実施形態は、治療の有効性を評価ためのＤＣｈＲおよび／またはＧｔＲ３の使用を対象とする。これには、薬物スクリーニング、治療レジメン、または治療／疾患のモデリングが含まれるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、ＤＣｈＲは、そのような評価における主要な光学的に応答するタンパク質として用いられる。代替的な実施形態において、ＤＣｈＲは、異なる波長に応答する他の種類の光学的に応答するタンパク質（例えば、ＶＣＨＲ１、ＧｔＲ３、ＣｈＲ２、および／またはＮｐＨＲ）と一緒に用いられる。

【0223】

また、本明細書に提供されるのは、動物または組織中の神経細胞間の経シナプス結合を特定する方法であって、本方法は、ａ）該動物または組織の領域Ａ内の神経細胞に、細胞間トレーサータンパク質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする第１のウイルスベクターを投与することと、ｂ）該動物または組織の領域Ｂ内の神経細胞に、光活性化タンパク質をコードする第２のウイルスベクターを投与することであって、該光活性化タンパク質の発現は、該Ｃｒｅリコンビナーゼの存在に依存する、第２のウイルスベクターを投与することと、ｃ）領域Ｂ内で該光活性化タンパク質を発現する神経細胞を特定することであって、該神経細胞中での光活性化タンパク質の発現は、これらの細胞が領域Ａ内の細胞と経シナプス結合していることを示す、神経細胞を特定することと、を含む。

【0224】

また、本明細書に提供されるのは、動物または組織中の標的とされた神経細胞の光学制御の生成方法であって、本方法は、ａ）該動物または組織の領域Ａに、細胞間トレーサータンパク質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼを発現する第１のウイルスベクターを投与することと、ｂ）該動物または組織の領域Ｂに、光活性化タンパク質をコードする第２のウイルスベクターを投与することであって、該光活性化タンパク質の発現は、該Ｃｒｅリコンビナーゼの存在に依存し、領域Ａおよび領域Ｂ内の神経細胞が、経シナプス結合している、第２のウイルスベクターを投与することと、ｃ）該タンパク質を活性化する光により領域Ｂ内の神経細胞の活動電位を制御することと、を含む。

【0225】

また、本明細書に提供されるのは、動物におけるニューロンの活動電位の制御方法であって、光により該ニューロン内の光活性化タンパク質を活性化して、活動電位の変化を生じさせることを含み、該ニューロン内の該光活性化タンパク質の発現は、ａ）該動物の領域Ａに、細胞間トレーサータンパク質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼを発現する第１のウイルスベクターを投与することと、ｂ）該ニューロンを含む前記動物の領域Ｂに、光活性化タンパク質をコードする第２のウイルスベクターを投与することであって、該光活性化タンパク質の発現は、該Ｃｒｅリコンビナーゼの存在に依存し、領域Ａおよび領域Ｂ内の該ニューロンは、経シナプス結合している、第２のウイルスベクターを投与することと、により生成される。

【0226】

いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、ＨＳＶ、およびレンチウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、細胞間トレーサータンパク質は、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）または破傷風毒素断片Ｃ（ＴＴＣ）である。

【0227】

本明細書に記載の種々の実施形態のうちの１つ、いくつかの、または全ての性質を組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成してもよいことを理解されるべきである。本発明のこれらおよび他の態様は、当業者には明らかであろう。

【0228】

本明細書に記載の本発明の態様および変形例は、態様および変形例「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことを理解されよう。

【0229】

本明細書中で、および添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに異なるように述べていない限り、複数の参照も含む。例えば、「動物細胞」への言及は、１つから多くの細胞への言及である。

【0230】

「単離」ポリヌクレオチドは、その自然環境の成分から特定される、分離される、および／または回収されるものである。

【0231】

本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形例を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。「約」という用語は、およその通常の意味を有する。いくつかの実施形態において、「約」は、±１０％または±５％を意味する。

【0232】

【表3a】

【0233】

【表3b】

【0234】

【表3c】

【0235】

【表3d】

【0236】

【表3e】

【0237】

【表4a】

【0238】

【表4b】

【0239】

【表4c】

【0240】

【表4d】

【0241】

【表4e】

【0242】

本明細書に提供されるのは、神経細胞、細胞株、および筋細胞が挙げられるが、これらに限定されない動物細胞であり、この動物細胞は、青色光に応答してプロトンポンプを発現する集積された外因性分子を含み、該外因性分子は、ギャラルディアシータ由来である。

【0243】

また、本明細書に提供されるのは、ギャラルディアシータ由来の光応答性タンパク質を修飾して、光応答性タンパク質のＣ末端で小胞体（ＥＲ）移行シグナルを加えることを含む、方法である。

【0244】

また、本明細書に提供されるのは、インビボでのニューロンの活動電位を制御するためのシステムであり、このシステムには、送達装置であって、タンパク質をニューロンに導入し、タンパク質が青色光に応答し、青色光に応答するタンパク質の刺激に対して光を発生する青色光源に抑制性電流を生じる、送達装置と、光源による光の発生を制御する制御装置と、を含む。

【0245】

また、本明細書に提供されるのは、ＧｔＲ３プロトンポンプを発現する細胞の光学的な刺激のために行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0246】

また、本明細書に提供されるのは、ＧｔＲ３および／またはＤＣｈＲを用いて、細胞内プロセスの制御のために行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0247】

また、本明細書に提供されるのは、一般的な細胞内ネットワークの異なる細胞集団における、ＧｔＲ３およびＤＣｈＲの使用のために行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0248】

また、本明細書に提供されるのは、ＤＣｈＲのために行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0249】

また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の配列（例えば、表１に示される配列）のいずれかと一致するタンパク質である。

【0250】

また、本明細書に提供されるのは、その反応プロファイルに基づき得る他の光応答性オプシン型と、ＤＣｈＲまたはＧｔＲ３の組み合わせに対して行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0251】

また、本明細書に提供されるのは、３つ以上の光応答性オプシン型の組み合わせに対して行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0252】

また、本明細書に提供されるのは、同じ細胞内であるが、異なる光に応答する複数のオプシン型を用いて、活性の段階的レベルを提供するための方法である。

【0253】

また、本明細書に提供されるのは、同じ細胞内で複数のオプシン型を用いて、それぞれのオプシン型の刺激を交互に行うことを通じてチャネル機能の周波数の増加を提供するために、活性の段階的レベルを提供するための方法である。

【0254】

また、本明細書に提供されるのは、筋肉制御に対して行われるシステム、方法、配置、またはキットである。

【0255】

また、本明細書に提供されるのは、いくつかの異なる細胞群の制御の組み合わせに対して行われるシステム、方法、配置、またはキットであり、それぞれの群が、少なくとも１つの他の群から独立して制御することができるように、それぞれの群は、異なるオプシンの組み合わせを有する。

【0256】

また、本明細書に提供されるのは、細胞（または細胞集団）の制御のためのフィードバックループからなるシステムであり、細胞（単数または複数）は、その中に発現される光応答性タンパク質型を有する。

【0257】

また、本明細書に提供されるのは、パーキンソン病の治療が含まれるが、これに限定されない、治療への応用である。

【0258】

また、本明細書に提供されるのは、複数の波長の強度に応答するための、網膜細胞中の移植／脳の再教育のために行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0259】

また、本明細書に提供されるのは、薬物試験に対して行われるシステム、方法、構成、またはキットである。

【0260】

また、本明細書に提供されるのは、トランスジェニック動物を用いたＧｔＲ３および／またはＤＣｈＲの使用のために行われるシステム、方法、配置、またはキットである。

【0261】

また、本明細書に提供されるのは、細胞小器官内のｐＨレベルの制御が挙げられるが、これに限定されない、細胞中のｐＨレベルの制御のために行われるシステム、方法、構成、またはキットであり、限定されることなく、その機能を促すもしくは抑制する、またはその細胞を死滅させるもしくは損なうために、実施することができる。

【実施例】

【0262】

ある実施形態によれば、細胞内および細胞間輸送戦略は、これより、（１）遠赤外線／赤外線の境界での光学的調節および全可視スペクトルを横切る光遺伝学的な制御の拡張；（２）光源条件を増加させることなく光学的抑制の有効性の増加（早期ツールの光感受性および可逆性、段階状動力学的安定性を維持するナノアンペアスケールのクロリドを媒介した光電流）；ならびに（３）プロモータが、知られていない、もしくは遺伝的に扱いにくい生物にある場合、多用途の標的化を可能にするような、遺伝的同一性だけでなく、形態学および組織トポロジーにも基づいた細胞を標的とするための一般的戦略を可能にする。これらの結果は、無傷システムの生物学および行動に適している多用途の高速光遺伝学的な技術の拡張を可能にする細胞生物学的な原理の使用を示す。

【0263】

本開示の特定の態様は、光遺伝学の力を定量的および定性的に増強し、研究の異なる手段を開くツールの一団を駆動するための、分子を輸送する戦略の応用を対象とする。特に、組織内のそれらの位相的関係のみによって細胞の標的化を可能にし、赤外線の境界まで光学的な制御の範囲を拡大する、他の周知のツールを超えて強化され、全可視スペクトルを網羅するエフェクター機能を有するツールが開発されている。

【0264】

本開示によれば、ｅＮｐＨＲ２．０を発現する海馬ニューロンの試験は、持続的な細胞内の標識化および膜への局在化の不良による球形ＥＲ蓄積の不在を示し、これにより、ＥＲ移行ステップの後のさらなる修正が重要であることを示唆している。異なる膜への局在による内向き整流のカリウムチャネルの２つの形態（Ｋｉｒ２．１およびＫｉｒ２．４）間の一次配列の差異の試験は、Ｃ末端ＥＲ移行モチーフだけでなく、Ｎ末端ゴルジ移行シグナルおよびＣ末端膜輸送シグナルにおいて差異を示した（Ｈｏｆｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）。驚くことに、ゴルジ移行シグナルの提供は、表面発現には重大な影響を及ぼさなかったが、ｅＮｐＨＲとＥＹＦＰとの融合の間で、あるいは融合タンパク質のＣ末端でのいずれかで、Ｋｉｒ２．１からの膜輸送シグナルの付加は、細胞内の標識化を劇的に減少させ、見かけの表面膜の発現を増加させ、細胞プロセスの標識化も改善した。実際に、高解像度の共焦点画像は、プロセスにおいて著しい局在化を示し、特定できる標識化された膜貫通細胞内領域が、ＮｐＨＲまたはその誘導体で今までに観察されたことないパターンで、オプシン−ＥＹＦＰの融合タンパク質が明らかに欠けていた。

【0265】

ホールセルパッチクランプ記録法を用いて、ハロロドプシンポンプ分子の正真正銘の機能的な原形質膜への局在を定量化する、光電流を試験した。光電流は、実際に、大いに増加した（初期に記載されたＮｐＨＲの電流よりも約２０倍大きいレベルまで；ヒトシナプシンＩプロモータ下で、レンチウイルス形質導入された海馬錐体ニューロンにおける平均値±標準誤差［ＳＥＭ］、光電流７４７．２±９３．９ｐＡ；ｎ＝１０）。図２５Ｄは、図の左部分で代表的なトレースおよび図の右部分で要約プロットを示す。図２５Ｄの代表的なトレースおよび要約プロットは、黒色で示されるｅＮＰＨＲ３．０（７４７．２±９３．９ｐＡ）および灰色で示されるｅＮｐＨＲ２．０（２１４．１±２４．７ｐＡ；不対ｔ検定ｐ＝０．０００５；ｎ＝１０）を発現する細胞における平均光電流レベルを示す。膜の入力抵抗は、パッチした全てのニューロンに対して同様であった（ｅＮｐＨＲ：１９３．１±３６．６ ＭΩ；ｅＮｐＨＲ３．０：１５１．６±２８．５ ＭΩ；不対ｔ検定ｐ＝０．３７）。下述の作用スペクトルピークで、ナノアンペアスケールの平均の外向き電流が、このレベルの光電流を得るためにプロトンポンプにより必要とされるものよりも一桁低い強度である３．５ｍＷ／ｍｍ２の黄色光で、容易に観察された（低い光強度の維持は、、相当な組織容量の安全制御が、最優先事項であるインビボ実験においてのみ、重要な問題になる）（Ａｒａｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。図２５Ｅは、図の左部分でｅＮｐＨＲ３．０（黒色）およびｅＮｐＨＲ２．０（灰色）の代表的な電圧トレース、および右部分で要約プロットを示す。ウイルス形質導入ニューロンでは、１００ｍＶ超で光誘起された過分極は、通常、図２５Ｅで示されるように、同じ少量の光パワーレベルで、達成可能であった（ｅＮｐＨＲ３．０：１０１．０±２４．７ｍＶ、ｎ＝１０；およびｅＮｐＨｒ２．０：５７．２±６．８ｍＶ、不対ｔ検定ｐ＝０．０００５、ｎ＝１０を発現する細胞における平均過分極）。この新しい大きさの膜電位の変化は、光遺伝子の抑制において機能的に異なる進歩を示し、それ故に、我々は、ｅＮｐＨＲ３．０としてこの第３世代ＮｐＨＲを指定する（ナトロノモナスハロロドプシンは、２００５年にＮｐＨＲと命名され［Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００５］、Ｇｒａｄｉｎａｒｕら［２００８］により開発された第１の輸送を強化したバージョンは、現在、ｅＮｐＨＲ２．０と称される）。ＮｐＨＲ光電流が、段階状であり、１０分間を超える連続照射でほとんど不活性化を呈さなかったことを示したことを示す先行研究（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）から予期されたように（実際に、Ｚｈａｎｇら［２００７ａ］に記載されるこの理由によりＮｐＨＲが選択された）、ｅＮｐＨＲ３．０の光電流もまた、段階状であり、不活性化に対して耐性があり、複数の光パルスおよび長い（挙動的に関連した）タイムスケールにわたって高度に安定であった（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。

【0266】

図３０Ａは、短いタイムスケールにわたってｅＮｐＨＲ３．０に対する安定性および回復を示す。図３０Ａの左部分の代表的なトレースは、図３０Ａの上から下：２．５秒、５秒、１０秒、および２０秒による時間で分かれた１０秒の長さの黄色光パルスの対で曝露したときの、ｅＮｐＨＲ３．０を発現する細胞における光電流を示す。図３０Ａの右上部分は、ｅＮｐＨＲ３．０を発現する細胞における正規化した平均光電流レベルを示す、パルス２０秒間隔の要約プロットを示す（Ｐ１＝第１のパルスピーク、１．００、Ｓ１＝第１のパルス定常状態、０．７４±０．０１、Ｐ２＝第２のパルスピーク、０．８６±０．０２；ｎ＝１１）。
図３０Ａの右下部分は、約５０％のピーク回復（Ｐ２−Ｓ１）／（Ｐ１−Ｓ１）を示す、パルス２０秒間隔の要約プロットを示す。２０秒後、ピークは、（４５．２±６．６）％まで回復する。図３０Ｂは、長期間の連続光曝露に対するＮｐＨＲ３．０の正規化した光電流の時間経過を示す（ｎ＝１１；種々のプロット化は、平均値±ＳＥＭである）。図３０Ｃは、１０分間にわたるｅＮｐＨＲ３．０の安定性の外向き電流を示す（５９３ｎｍの光送達は、実線の棒で示される、出力密度：２．５ｍＷ／ｍｍ^２）。

【0267】

ロバスト改善された発現が、インビボでの哺乳動物脳中に保存されるかどうかの問に答えるために、ＣａＭＫＩＩαプロモータの制御下で、成体マウスにおける海馬形成のＣＡ１領域に、新規のオプシン遺伝子を送達するレンチウイルスベクターを注入し、発現したＥＹＦＰ融合の分布を試験した。培養された細胞におけるのと同様に、強力な発現が、ｅＮｐＨＲ３．０およびｅＮｐＨＲ３．１（同等の機能性を有するｅＮｐＨＲ３．０のより短いバージョンであるが、Ｎ末端シグナルペプチドが除去されたいる）の両方で、インビボにおいて、樹状突起だけでなく、軸索でも観察された。システム神経生物学に対する主要なインビボでの機会は、領域Ａから領域Ｂまでの突出のみでなく、（その接続の中でも）ＡからＢの突出を有する細胞型自体を制御することである。この根本的に異なる結果は、他の標的化方法との光学制御の多重化を必要とする。そのような制御は、システム神経生物学において大きな価値があるものであり、例えば、皮皮質興奮性錐体ニューロンは、細胞の遺伝的かつ解剖学的に定義される細胞のクラスを形成するが、このクラス内では、それぞれが、脳の複数の異なる領域（例えば、視床、脊髄、線条体、および他の皮質領域）に突出する細胞であり、したがって、根本的に異なる役割を有する（Ｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。遺伝子ツールは、これらの異なる細胞クラスの全てを分離するのに十分に進歩する可能性が低く、接続状態により定義される細胞を抑制または興奮させるための必要性を示す（図２６Ｂ）。この目標を達成するための１つの方法は、細胞間輸送を十分に利用すること、つまり、局在の細胞体位置に、最適な微生物のオプシン遺伝子を条件付きで発現するＣｒｅ依存性ウイルスを導入し（例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）、Ｃｒｅ駆動マウス株をさらに利用するのではなく、代わりに、例えば、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）（図２６Ｂ）、または破傷風毒素フラグメントＣ（ＴＴＣ）等の細胞間トレーサータンパク質に融合されたＣｒｅリコンビナーゼを発現するウイルスを遠隔ターゲット構造体（解剖学的結合性により対象となる細胞を定義するように選択される）に導入することである（Ｋｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｍａｓｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｓｕｇｉｔａ ａｎｄ Ｓｈｉｂａ，２００５）。融合タンパク質におけるＣｒｅリコンビナーゼは、この結合性により画定された局所細胞のサブセットにおいて、オプシン発現を活性化する場合、局在の細胞体位置にトレーサーとともに推定されるエンドソーム輸送機構により解剖学的に結合される（図２６Ｂ）（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，２００９、Ｐｅｔｒｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，２００９）。このアプローチは、いかなる特定のプロモータフラグメントまたは標的細胞の発生的定義も必要としないが（ラットおよび霊長類等の遺伝的に細工されることが少ない種で用いる明らかな利点）、必要である場合、そのようなさらなる遺伝的な改良は、容易に加えることができ（例えば、ＷＧＡ−Ｃｒｅ−およびＣｒｅ依存性オプシンの両方は、利用可能な場合は細胞型に特異的なプロモータの制御下で送達することもあり得る）、これは、結合性、位置、および遺伝学の共通部分で定義される細胞に対応するための多用途手段を形成することに留意されたい。

【0268】

この概念は、第１に、ｅＮｐＨＲ３．０を、一次感覚野（Ｓ１）による皮質−皮質結合に関与するこれらの一次運動野（Ｍ１）超小型回路に選択的に導入するための戦略を考案することにより、ラットにおいて検証された（Ｃｏｌｅｃｈｉｏ ａｎｄ Ａｌｌｏｗａｙ，２００９）。これを行うために、上述のＣｒｅ依存性ＡＡＶであり、現在、条件付きで発現するｅＮｐＨＲ３．０を運動野に注入し、新規のＷＧＡ−Ｃｒｅを発現するＡＶ（ＡＡＶ２−ＥＦ１α−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−ＷＧＡ−Ｃｒｅ）を遠隔で一次体性感覚野に注入した。ロバストなｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰ発現が、実際に、ＣｒｅリコンビナーゼＡＡＶの注入の遠隔性にもかかわらず、注入から５週間後に、運動野ニューロンの分散型サブセットに観察されたが、Ｃｒｅリコンビナーゼを有さない対照動物においては、これらのＣｒｅ依存性ＡＡＶから発現は観察されなかった（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）。図２６Ｃは、ＷＧＡおよびＣｒｅ遺伝子はともに、哺乳動物コドンで最適化されるＷＧＡ−ＣｒｅおよびＣｒｅ依存性ＡＡＶベクターに対する構築設計を示す。Ｃｒｅのシナプス経由または経細胞輸送の予想されたモードと一致して、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞体は、運動野において観察されず、ＥＹＦＰ陽性細胞体もＳ１感覚野において観察されなかった。Ｃｒｅは、Ｃｒｅ依存性ウイルスを受容するシナプスによって結合されたニューロンにおいてのみ遠隔の遺伝子発現を活性化するが、他のものにおいて活性化しないように、形質導入細胞からシナプス経由で送達することができる。Ｍ１から生じる予期されたＥＹＦＰ−ｅＮｐＨＲ３．０軸索末端は、Ｓ１に存在した。同時に起こるオプトロード刺激／記録（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）を、ＷＧＡシステム下でｅＮｐＨＲ３．０の機能性を検証するために行ない、実際に、ロバストな抑制が、ＸＦＰオプシン融合タンパク質の強い蛍光発光から予期されるように、Ｍ１において容易に観察された。これらのデータは、皮質−皮質結合に関与するニューロンが、実際に、単に突出としてではなく、結合性によって定義された細胞型として対処され、標的化することができることを示す。

【0269】

異なる回路において、異なるオプシンを用いて、この標的化技術を単独で検証するために、次に、大脳半球間の突出に関与する海馬体の歯状回ニューロンを標的化した。歯状門内で、唯一知られている単シナプス対側突出は、門苔状細胞から生じ、分子層の樹状突起において、対側歯状の顆粒細胞上で終了する（Ｆｒｅｕｎｄ ａｎｄ Ｂｕｚｓaｋｉ，１９９６、Ｒａｔｚｌｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＷＧＡ−Ｃｒｅ ＡＡＶは、一方的に、１つの歯状回に注入されたが、一方、Ｃｒｅ依存性ＡＡＶは、同じ動物の対側歯状回に注入された。著しくは、オプシン発現は、対側部位の門細胞にのみ観察された。実際に、この場合およびこの時点で、Ｃｒｅの蓄積は、対側門細胞を退化させ、対側門細胞への単シナプスであたが、これはＥＹＦＰの標識化は、対側顆粒細胞層では観察されず、さらに、このＡＡＶ血清型による軸索末端の直接変換の欠如を示し、ｍＣｈｅｒｒｙは、対側歯状において観察されなかったからである。光学制御に対して正確な機会が得られる、同側歯状において唯一ＥＹＦＰを発現する回路素子は、対側歯状門から生じる繊維にまさに予期されるように、顆粒細胞層の分子層において終了することが観察された軸索繊維であった。実際に、インビボオプトロード記録は、オプシンを発現する細胞体とニューロン下流の両方で、対側半球において、ＣｈＲ２を発現する細胞の軸索突出への、光が引き金となるスパイクを駆動する際、ＷＧＡ／Ｃｒｅを活性化したＣｈＲ２の機能性を確認し、以前の光遺伝学の研究（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ，２００７ｂ）と一致して、光ファイバーを通じて送達された３０Ｈｚ（５ｍｓパルス幅）での４７０ｎｍの光パルスは、インビボでニューロン発火を確実に駆動した。

【0270】

無傷組織内で改変されたオプシンに対するこれらの標的化戦略の有用性は、さらなる利点が、インビボで調節可能な組織の容量に関して生じ得るかどうかの問題が生じた。膜輸送修飾のみは、作用スペクトルをシフトさせない、遠赤色光においてニューロンを制御する能力は、光遺伝学の念願の目標であり、これは、散乱する生物組織にさらにより深く貫通する光の使用を可能にするように（蛍光タンパク質に対して最近示された遠赤色光の実用性と同様に）（Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）、したがって、より多量の容量の動員が可能であるからである（Ａｒａｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ｅＮｐＨＲ３．０に対して観察された大量の光電流（ＮｐＨＲに対して当初報告されたものの約２０倍、それ自体は、５８９ｎｍの琥珀色光に応答してスパイクを遮断することができる）は、遠赤色光による光遺伝制御が達成され得ることを示唆した。したがって、輸送を強化したｅＮｐＨＲ３．０を用いた遠赤色光における光学制御を詳しく研究した。

【0271】

わずか３．５ｍＷ／ｍｍ^２の真の赤色（６３０ｎｍ）光にさえも応答して、ウイルスで形質転換された細胞において、強力な約２５０ｐＡの外向き光電流が観察され、それは、これでも黄色光による初めに観察されたＮｐＨＲ電流よりも６倍超上回り（図２７Ａ）、ＮｐＨＲに特有であるステップのような安定した動力学の特徴を維持した（ｅＮｐＨＲ３．０を発現するニューロンおよびｅＮｐＨＲ２．０を発現するニューロン：ｅＮｐＨＲ３．０：２３９．４±２８．７ｐＡ、ｅＮｐＨＲ２．０：４２．７±４．５ｐＡ、不対ｔ検定ｐ＝０．００００４、ｎ＝１０）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。さらに、赤色光に誘発されるこれらの光電流を用いて、海馬錐体ニューロンにおいて大きな（＞４０ｍＶ）過分極の引き金となり得ることを見出した（図２７Ｂ）（ｅＮｐＨＲ３．０を発現するニューロンおよびｅＮｐＨＲ２．０を発現するニューロン：ｅＮｐＨＲ３．０：４３．３±６．１ｍＶ、ｅＮｐＨＲ２．０：１５．６±３．２ｍＶ、不対ｔ検定ｐ＝０．００１１６、ｎ＝１０）。したがって、さらに赤色シフトした光を詳しく研究した。６６０ｎｍの光を有する深赤色において、および６８０ｎｍの光を有する赤／赤外線の境界で、ロバストな光電流を継続して観察した（図２７Ｃ）。６８０ｎｍで、光電流（約７５ｐＡ）は、７ｍＷ／ｍｍ^２で以前報告されたピーク（黄色光）のｅＮｐＨＲ２．０電流よりもさらに大きかった。重要なことには、試験した赤色および遠赤色波長の全てで、ｅＮｐＨＲ３．０の光電流は、７ｍＷ／ｍｍ^２以下で電流注入により誘発された活動電位を容易に遮断し （図２７Ｄ）、これは、遠赤色光への光遺伝制御チャネルの拡張を検証した。赤色および遠赤色／赤外線の境界照射の異なる波長により誘発された外向き光電流は、６３０ｎｍで２３９．４±２８．７ｐＡ（ｎ＝１０）、６６０ｎｍで１２０．５±１６．７ｐＡ（ｎ＝４）、および６８０ｎｍで７６．３±８．１ｐＡ（ｎ＝４）である。

【0272】

ＮｐＨＲの１つの重要な特徴は、ＣｈＲ２によるスペクトル適合性であり、２つのオプシンは、ほぼ分離可能なスペクトルを有し、類似の光出力密度の必要条件で動作し、小さな領域のスペクトル重なりにもかかわらず、インビトロまたはインビボで光学活性の双方向の制御を可能にする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。ｅＮｐＨＲ３．０が、強力すぎるかどうかを試験するために、同じ細胞中のＣｈＲ２と組み合わせて使用するためのスペクトル重なりを考えて、ｅＮｐＨＲ３．０を含有するバイシストロニックベクターを作製し、類似の２Ａベースの組み合わせベクター（Ｒｙａｎ ａｎｄ Ｄｒｅｗ，１９９４）が、前のツールとともに利用され、この方法を用いたチャネルロドプシン電流は、１５０〜２４０ｐＡであり、ハロロドプシン電流は、１１〜４０ｐＡである（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｈａｎ ｅｔ ａｉ．，２００９ｂ）。ｅＮｐＨＲ３．０−２Ａ−ＣｈＲ２構築体（ｅＮＰＡＣと略される）を海馬錐体ニューロンにトランスフェクトした。これらの実験により、細胞プロセスへの両方のオプシン遺伝子生成物の輸送が観察された。独立した励起および抑制が、ｅＮｐＨＲ３．０からの電流の増加にもかかわらず、なお可能であることを確認するために、ｅＮＰＡＣに対しておよびＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）およびｅＮｐＨＲ３．０のみに対して詳細に定常状態の光電流作用スペクトルをまとめた。図２７Ｆは、図２７Ｆの左部分にｅＮＰＡＣ、および図２７Ｆの右部分にＣｈＲ２（Ｈ１２４Ｒ）およびｅＮｐＨＲ３．０の活性化スペクトルを示す。図２７Ｆの右部分には、ＣｈＲ２の活性化スペクトルは、濃灰色で示され、ｅＮｐＨＲ３．０の活性化スペクトルは、薄灰色で示される。最大のｅＮＰＡＣ定常状態の興奮性および抑制性電流はともに、それぞれのオプシンが、個々に発現されるときに観察されたものの約６０％であり、それぞれの方向において５５０ｐＡを上回る最大光電流を得て（図 ２７Ｆ〜Ｇ）、やや重なる作用スペクトルは、過分極抑制と組み合わせた強力な短絡抑制が、この組み合わせアプローチとともに可能性が高いという点で、特性を与え得る。より具体的には、最大のｅＮＰＡＣの定常状態の励起は、４２７ｎｍ（ｎ＝９）で、５６７±４９ｐＡであり、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）のみに対する値の６２％（９１６±１８５ｐＡ、ｎ＝５）であった。同様に、最大のｅＮＰＡＣ抑制は、５９０ｎｍ（ｎ＝９）で６７９±１０９ｐＡであり、ｅＮｐＨＲ３．０のみに対する値の６１％（１１１０±３３３ｐＡ、ｎ＝４）であった。ピーク電流値の出力密度は、３．５〜５ｍＷ／ｍｍ２（５９０ｎｍで３．５ｍＷ／ｍｍ^２）であった。インビボでの検証は、特定のＰ２Ａ方法（または他のリンカーアプローチ）が、特定の回路または細胞型において機能的であることを示す必要がある（いまだ決定されていない）が、培養された海馬ニューロンにおけるこれらのデータは、それぞれ、５００ｐＡを上回る強力な双方向の光電流が、輸送を強化したオプシンの干渉の能力を奪うことなく、単一細胞内で達成することができることを示す。

【0273】

微生物のオプシンの周知の広範な作用スペクトルは、複数の独立したチャネルの制御を達成することに関して課題をもたらし、興味深いことに、ｅＮｐＨＲ３．０は、強力な遠赤色の光学制御ツールであるだけでなく、最も強力であることが知られている青色光を駆動するオプシンベースの抑制剤でもある（４７２ｎｍで４００ｐＡ超）。実際に、ここで示される膜輸送戦略は、光遺伝学的制御の目的の独特な性質を有する様々な微生物オプシンに適応するための一般的に可能な戦略を形成し得る。一連の最終的な実験では、これらおよび他の強化した膜輸送原理が、光遺伝学的ツールボックスに、遺伝的かつ機能的に異なる成分の追加が可能であり得るかどうかを詳しく研究した。

【0274】

非常に多数の微生物オプシン遺伝子が、自然に存在するが、我々および他者は、光電流の大きさ、要光量、または動力学に関して、（本明細書に記載の）ｅＮｐＨＲ３．０より機能が優れているものは、これまで見出していない（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ、Ｈａｎ ａｎｄ Ｂｏｙｄｅｎ，２００７、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。光遺伝学的ツールボックスを拡張し続けることは重要であるが、ほとんどの微生物オプシンは、哺乳動物細胞において、不完全に運送されていることを見出した。しかしながら、本明細書に概説される微生物オプシンの操作についての輸送原理の適用は、光遺伝学が、過去数年かけてゲノミクスの進歩を継続させることができ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、微生物オプシンの膨大な自然多様性に利用し得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。膜貫通イオン伝導性の緑色光を活性化した調節因子であるハロバクテリウム・サリナルム（Ｈ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）（Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１）からの、最良に特徴付けられた微生物オプシンであるバクテリオロドプシン（ＢＲ）（Ｓｔｏｅｃｋｅｎｉｕｓ ａｎｄ Ｂｏｇｏｍｏｌｎｉ，１９８２）を用いて、膜輸送原理の適合性を試験しようと試みた。

【0275】

修正されていない形態で発現され、卓越した細胞内蓄積が観察されたことが見出し、これらと同様に、ナトロノモナス（Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ）ハロロドプシンが、高レベルで発現されるときに見られるが、光電流は観察されなかった。しかしながら、ＢＲとＥＹＦＰとの間の膜輸送シグナル（ＴＳ、ｅＮｐＨＲ３．０に対して利用されるような）の付加は、大幅に、膜およびプロセスの局在を改善し、より小さい持続性のあるＥＲ様の蓄積を伴ったが、ＥＲ移行シグナルＦＣＹＥＮＥＶのさらなるＣ末端の付加で排除された。得られた構築体（ｅＢＲ、最適な膜輸送に対して二重に改変される）は、著しい膜への局在および標的化するプロセスを伴って、培養されたニューロンにおいて、良好な耐性を示した。機能的な原形質膜の標的化の検証は、ｅＢＲが、一般的に、５６０ｎｍの光の最適波長に曝露されるとき、海馬錐体ニューロンにおいてスパイクを遮断するのに十分である約５０ｐＡの外向き光電流および約１０ｍＶの過分極を送達し得ることを示し、それにより、光遺伝学的制御に対して別のチャネルを提供し、微生物オプシン膜輸送アプローチの強力な一般化可能性を示した。より具体的には、図２８Ｂに見られるように、５６０ナノメートルの光が、ｅＢＲ細胞中で４６．４±７．２ｐＡの外向き光電流を誘発した（平均値±ＳＥＭは、プロットされる、ｎ＝１２）。この膜の入力抵抗は、パッチした全てのニューロンに対して同様であった（１３１．６±１９．５ｍΩ）。サンプルで光出力密度は、７ｍＷ／ｍｍ^２であった。図２８Ｃに見られるように、光誘起過分極は、１０．８±１．０ｍＶであった（平均値±ＳＥＭは、プロットされた、ｎ＝１２）。

【0276】

また、ボルボックスカルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）からの赤色シフトした興奮性オプシンＶＣｈＲ１の特定を可能にしたものと同様のゲノム戦略を継続し（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、実際に、多くの微生物が、紫色からほぼ赤外線の光感受性を示すことが報告されている。したがって、チャネルまたはポンプの性質を有する新しいロドプシンならびに新規の光感受性について検索するための、環境の配列データベース、植物／微生物を発現した配列タグ（ＥＳＴ）ライブラリー、および全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）の配列リポジトリにおける広範なゲノムを採掘するアプローチを継続した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）。テンプレート配列としてＣｈＲ、ＨＲ、およびＢＲの一次アミノ酸配列を用いて、進化的に離れた種の間での検索を継続した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。様々な宿主（クリプトモナス、ギャラルディア、メソスティグマ、デュナリエラ、グロイオバクタ等）からの他の候補配列の中で、ギャラルディアシータからのこれらの１つは、以前に報告されたＧｔＲ１およびＧｔＲ２とは異なり（Ｓｉｎｅｓｈｃｈｅｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）、ＣｈＲ２に対して高いアミノ酸相同性を示した。ギャラルディアシータのロドプシン−３（ＧｔＲ３）としてこの新しいタンパク質を指定し、哺乳動物発現に対してＧｔＲ３のコドンバイアスを最適化し、ＧｔＲ３−ＥＹＦＰ融合遺伝子を海馬錐体ニューロンに送達した。新生の論題では、ＧｔＲ３は、細胞内蓄積を示したが、光電流は示さなかった。ＧｔＲ３とＥＹＦＰとの間のＴＳシグナルの供給は、少しだけ蓄積を減少させたが、Ｃ末端へのＥＲ移行シグナルＦＣＹＥＮＥＶの付加とともに、蓄積は、なくなり、表面を増加し、プロセスへの局在化が観察された。

【0277】

得られた修飾されたＧｔＲ３は、ｅＢＲよりも小さい電流を用いたにもかかわらず、４７２ｎｍの青色光に応答して海馬ニューロンを過分極し、スパイクも抑制することができた。また、改善された輸送に対して改変されたアセタブラリアアセタブラム（Ａｃｅｔａｂｕｌａｒｉａ ａｃｅｔａｂｕｌｕｍ）（Ｔｓｕｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０）由来のオプシン（ＡＲ）を用いて、スパイクの青色抑制を達成し、ＡＲは、機能的な膜への局在およびスパイク抑制のために、単独で電流をほとんど発生しないが、初めに凝集がなく、ＡＲとＥＹＦＰとの間のＴＳシグナルの付加のみ必要であった。サンプルの電流クランプおよび電圧クランプトレースおよび要約データは、４７２ｎｍの光（１８．５ｍＷ／ｍｍ^２）下で、ＧｔＲ３機能を示し、それは、それぞれ、図３１Ｃの左部分および右部分に示される。光誘起された外向き光電流の要約は、図３１Ｃの左の棒グラフに示され、青色光ピークについての対応する過分極の要約は、右の棒グラフに示される。対応する光電流および過分極は、黄色光（５８９ｎｍ、７．５ｍＷ／ｍｍ^２）では、０．５±０．４ｐＡおよび０．１２±０．０９ｍＶであり、青色光（４７２ｎｍ、１８．５ｍＷ／ｍｍ^２）では、２０．０±６．７ｐＡおよび５．６±１．２ｍＶであり、紫色光（４０６ｎｍ、３ｍＷ／ｍｍ^２）では、１．７±０．９ｐＡおよび０．６±０．３ｍＶであった（平均値±ＳＥＭ プロットされた、ｎ＝１０、入力抵抗は、全てのニューロンについて同様であった：１１３．５±２４．２ｍΩ）。

【0278】

これらおよび他の公開された微生物オプシン由来の抑制剤は、ｅＮｐＨＲ３．０ほど強力なものではないが（そしてこの理由により、光遺伝学応用のためにｅＮｐＨＲ３．０を用いて継続される）、膜輸送修飾により本明細書で達成された改善された機能性は、生態的多様性の潜在性の低下を解き明かす際に、このアプローチの潜在的な多用途性および異なる微生物オプシン遺伝子に対して示される個別の戦略を示す。図２９Ａは、後生動物の無傷システム生物学に微生物オプシン遺伝子を適応させるための一般的な細胞内を標的とする戦略を示す。図２９Ｂは、組織および細胞内レベルでの標的化の改善点を示す（細胞内オプシン標的化方法は、上述されており、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．［２００７］およびＬｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，［２００９］を参照されたく、組織／細胞間オプシン標的化方法は本明細書に記載の通りである）。

【0279】

光遺伝学的アプローチは、既に、自由に行動している哺乳動物（Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｐｅｔｒｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，２００９、Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）、および他の動物（Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｌｅｒｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）において、無傷システム生物学において重要である高い時間精度を有する、生物学的プロセスおよび挙動の制御における実質的な実用性を見出している。微生物タンパク質のための膜輸送の特異的能力の操作が、無傷システム生物学の様々な光遺伝学的技術を生じる際に、重要であることを見出している。全ての輸送戦略が、全ての微生物オプシンに適しているわけではなく、異なるモチーフが、異なる段階で輸送する問題に直面するオプシンに必要とされ、したがって、適切な修飾の理論的選択を有する慎重な細胞内分析が、非哺乳動物起源の全てのオプシンに適用可能であり得る有向かつ理にかなった戦略をともに構成し、それにより、ゲノム源からの新規の光遺伝子学的ツールの系統的な生成を可能にする。

【0280】

前に、多くの応用において有用であるが（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔoｎｎｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ａｒｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）、ＮｐＨＲおよびＮｐＨＲ２．０を用いた抑制が、場合によっては、非常に強力な励起により圧倒され得ることを前に観察した（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ｅＮｐＨＲ３．０を用いた１００ｍＶを上回る過分極は、光学的抑制の有効性を進める実質的なステップを提供する。初期のＮｐＨＲよりも２０倍を上回る、ｅＮｐＨＲ３．０を用いた現在提供される抑制は、光遺伝学的ツールのいずれとも同様に、光強度または負荷サイクルを用いて調節可能な状態である。作用スペクトルピークで、ナノアンペア台の平均外向き電流が、わずか３．５ｍＷ／ｍｍ２の黄色光（上述のプロトンポンプを用いて同様の電流に達するために必要とされるよりも１０倍弱い光出力）を用いて容易に生じた。同時に、ｅＮｐＨＲ３．０は、ステップ様の動力学、高速回復、およびＮｐＨＲの長いタイムスケールにわたる不活性化への耐性を維持していた（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ａ）。

【0281】

ｅＮｐＨＲ３．０は、今日まで最も赤色シフトし、強力な光遺伝学的抑制剤として、インビボ応用に特によく適しているが、このツールおよび他のツールの有効性を強化するためのさらなる戦略が、恐らく出現し、本明細書に記載の膜輸送の研究が、将来、さらに強力な抑制剤を可能にし得る。ｅＮｐＨＲ３．０を利用するとき、抑制は、必要に応じて、より弱いプロモータ、より短い発現時間、または軽減した光レベルを用いることにより、より深く貫通し、より安全な光子を用いた赤外線の境界で動作することができるように、前述の報告（６８０ｎｍ対５８９ｎｍ）から赤色シフトした新しい波長約１００ｎｍへのアクセスを維持しながら、容易に低下させることができる。もちろん、選択されるオプシン遺伝子および光源だけでなく、回路素子を標的化するための戦略もまた、有効性を決定し得る、例えば、パーキンソン病モデルにおける光遺伝学的研究（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）は、視床下核（ＳＴＮ）における治療効果のある脳深部電気刺激（ＤＢＳ）が、求心性神経軸索（次いで、同様に、下流および上流ネットワークの両方を調節する）における作用により開始される可能性が高いことを示した。ＳＴＮ中の局在的な細胞体の直接の光ファイバーに基づいた抑制剤が、求心性神経軸索の直接調節で観察されたものに匹敵する行動的影響を示さなかったが、これらの結果は、ＳＴＮの抑制が、重要でないという意味ではない（実際に、ＳＴＮ中の光遺伝学的軸索調節が、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．［２００９］により言及されるように、ＳＴＮスパイクの抑制をもたらす）。むしろ、これらの結果は、軸索調節が、罹患した神経回路において、構造体またはネットワークを制御するために、有望な治療機構、およびＤＢＳ電極（または光ファイバー）等の点光源のための高効率手段を構成することを示すことにより、ＤＢＳの機構および標的を取り囲む長年の臨床的に有意な問題に知識を与えた（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）。これらの回路素子標的化の考慮に加えて、光強度および波長、プロモータの選択、ウイルスタイター、ウイルス向性、オプシン発現の時間、標的細胞生物物理学、ならびに内因性活性および調節の局在パターンが全て、光遺伝学的抑制効果に影響を及ぼし、それぞれの実験システムが、慎重に考慮されるべきである（Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0282】

結合性の性質に基づいて細胞型の制御を可能にするために、Ｃｒｅリコンビナーゼの細胞間送達を利用した。第１に、ラットにおいて、Ｓ１との皮質−皮質結合に関与するＭ１ニューロンを選択的に標的化し、第２に、大脳半球間の突出に関与する海馬体の歯状回ニューロンを標的化し、いずれの場合にも、細胞型に特異的なプロモータフラグメントまたはトランスジェニック動物を用いずに、結合性によってのみ定義された細胞が、標的化された。それぞれのシステムにおいて、このアプローチは、Ｃｒｅ輸送の方向性（順行性または逆行性）および範囲に対して検証されなければならず、これは、細胞特異的なエンドソーム動力学および実験的時点に依存し得、この戦略はまた、トランスジェニックマウスではなくウイルスを用いてのみ作用し得、ＣｒｅをエピソームＤＮＡにアクセスすることができる。このアプローチは、軸索末端を直接変換しないベクターにより供給されるのが最良であり、これは、（我々および他者は、くつかの回路において観察されたが［Ｐａｔｅｍａ ｅｔ ａｌ．，２００４］）、全てのＡＡＶ血清型に対して当てはまるわけではない。軸索末端のいかなる直接変換も、適切なＸＦＰマーカーで検出されるか、または排除され得、場合によっては、軸索末端の直接変換が、望ましい場合があり、ＨＳＶ、いくつかのＡＡＶ血清型、および偽型レンチウイルスを用いて達成され得るが、そのようなアプローチ（本アプローチとは異なって）は、変換された末端に、シナプス後の細胞型を選択することができず、また、高いタイター、組織透過性、安全性、および耐性のため、多くの応用のために最適なベクターであるある種のＡＡＶを用いるほど有効ではない。

【0283】

膜輸送修飾により可能である細胞プロセスの標的化は、位相的に定義される細胞の制御を可能にする、つまり、組織内のそれらの結合性の本質的特性により可能にする。現在のところ、輸送は、シナプスまたは単シナプスであることは保証されず（海馬回路実験において、そのような性質は、それぞれのシステムにおいて有効である必要があるため）、したがって、シナプス標的化というよりも「位相的な標的化」という用語が、ＡからＢへのいかなる経路もとることができる結合−軸索結合の基本的特徴の独立した変形を強調するために本明細書で使用され、この結合性が存在する限り、位相的な標的化戦略が、いまだに有効である。この性質は、遺伝的に細工されることが少ない生物において重要であるだけでなく、遺伝子を標的とするツールが、多くの場合、不適切であるマウス等の動物においてでさえ相当な価値がある。当然ながら、遺伝子を標的とする戦略は、位相的な標的化とともに多重化され得、例えば、Ｃｒｅ依存性ベクターおよびＣｒｅ融合ベクターからの発現は、それぞれ、可能な場合は、特異的な遺伝子を標的とする配列により統治され得る。さらに、複数のチャネルの光学制御の可能性は、組み合わせによる位相的な標的化戦略への道を開く。

【0284】

ＣｈＲ２、ＮｐＨＲ、およびＶＣｈＲ１と同様に、ほとんどの微生物オプシンが、新しい種類の機能性を達成するための実質的なタンパク質操作から恩恵を受けることができることに留意する。実際に、我々および他者は、既に、微生物オプシンから、光感受性の増加（Ｂｅｍｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）、光電流量の増加（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，２００８、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）、より高速な動力学（Ｇｕｎａｙｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）、および双安定の切り替え動作（Ｂｅｍｄｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）を誘発するための分子戦略を示している。シフトした作用スペクトル（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｇｕｎａｙｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、二光子応答の増加、および（例えば、Ｃａ２＋に対する）改変されたイオン透過性等の他の可能性はまた、将来、達成され得る。

【0285】

イオン伝導性を調節するオプシンは、即時の翻訳に対して最も応用が広く（一般の電気言語を利用する）が、定義された細胞型において、光を用いた生化学的制御もまた、可能である（しかし、微生物のシグナル変換が、後生動物のシグナル伝達とは異なる原理を利用する場合、異なる一組のアプローチを用いる）。実際に、良好に定義された生化学的シグナル伝達経路の光遺伝学的制御が、最近、特異的なＧタンパク質を結合した受容体シグナル伝達の光学制御の光学上のＸＲ方法を用いて、培養された細胞および自由に行動している哺乳動物の両方において達成された（Ａｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）。インビボ応用を制限する高い暗活性化を有するが（Ｓｃｈｒoｄｅｒ−Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７）、光活性化することができるアデニリル・シクラーゼは、ユーグレナにより研究されており、感光性ＰＡＳまたはＬＯＶドメインにおけるその後の研究（Ｌｅｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００９）は、これらのアプローチが、生きている動物において作用し得る場合、タンパク質・タンパク質連合を制御するための新しい方法を開拓することができる。

【0286】

神経系において、光遺伝学的ツールを適用して、情報伝送、振動、移動、覚醒、および報酬の神経回路の基盤をプローブすること、ならびにパーキンソン病およびてんかんを含む尾億の脳疾患において重要である神経回路の動作をプローブすることができることを見出した（Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｃａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔoｎｎｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。さらに、結果は、動物種にわたる光遺伝学的アプローチの十分な多用途をさらに示す（Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｉｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ａｒａｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｒｅｎｋｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｂｉ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｂｏｙｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００８，２００９、Ｈａｇｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９ａ、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｉｓｈｉｚｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００３，２００５、Ｐｅｔｒｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，２００９、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，２００７ａ、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｏｅｒｔｎｅｒ，２００７、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。光ファイバー（Ａｄａｍａｎｔｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ａｒａｖａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）、ならびに光ファイバーと電極とを一体化した「オプトロード」アセンブリ（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）とともに、大きな密度の高い臓器内に深く位置した細胞でさえ、自由に行動している哺乳動物において、容易にアクセスし、調べることができる。本明細書で定義されるさらなる供給源は、光学制御の能力を拡張することができる、分子、細胞、およびゲノム戦略から生じ、このツールボックスが迅速に増殖する場合、光遺伝学は、機能する組織内の定義された細胞の高速制御のために、無傷システム生物学において、増加する影響力の強い、多用途の役割を果たすようになり得る。
実験手順
構築体

【0287】

全てのＮｐＨＲ変異体は、既刊のＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ構築体のＰＣＲ増幅により生成された（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）。本明細書に記載の全てのオプシンは、ヒトコドン使用分布に従うようにそれぞれの遺伝子のコドンを変化させることにより、哺乳動物発現に対して最適化されている。最新のマップおよびベクターは、Ｄｅｉｓｓｅｒｏｔｈ研究室（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａに属する）から入手可能であり、自由に配布され、２０１０ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，“Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｒ，”Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ／）に記載され、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0288】

シグナルペプチド配列を有さないＧｔＲ３のアミノ酸配列

【数1】

【0289】

ＣｈＲ２からのシグナルペプチド配列を有するＧｔＲ３のアミノ酸配列

【数2】

【0290】

ＤＣｈＲのアミノ酸配列

【数3】

【0291】

ＮｐＨＲのアミノ酸配列

【数4】

【0292】

ＢＲのアミノ酸配列

【数5】

【0293】

海馬培養
一次培養海馬ニューロンを、Ｐ０ Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ仔ラットから調製した。ＣＡ１およびＣＡ３領域を単離し、０．４ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）で消化され、６５，０００／ｃｍ^２の密度で、１：３０のマトリゲル（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でプレコートされたガラス製のカバースリップ上に播種した。カバースリップ上に成長させた海馬培養物に、トランスフェクトされたか、または全ての構築体に対してタイターが一致したウイルスを、４日間インビトロで（ＤＩＶ）形質導入した（ニューロン成長培地中の最終希釈１０^４感染単位（ｉ．ｕ．）／ｍＬ）。前に記述されたように、ホールセルパッチクランプ記録法を行った（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）。一次海馬培養は、タイターで一致させたウイルスを用いて、４日間インビトロで感染させた（ニューロン成長培地中の最終希釈１０^４感染単位／ｍＬ）。１４日間インビトロで、培養は、氷冷した４％ パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、次いで、２％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中の０．４％ サポニンで３０分間透過させた。一次抗体インキュベーションは、４℃で一晩行い、Ｃｙ３共役型二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、室温で１時間２％ ＮＤＳ中に適用した。画像は、６３倍／１．４ ＮＡ油浸対照を用いてＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡上で得た。

【0294】

齧歯動物脳への定位注射およびオプトロード記録
成体マウスおよびＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットを、Ｓｔａｎｆｏｒｄでの承認されたプロトコルに従って収容した。全ての手術は、無菌状態下で行われた。動物を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）のカクテル（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射で麻酔した。ウイルスを１０μＬの注射器および細い３４ゲージの金属針を介して送達し、注射容量および流量（０．１μＬ／分で１μＬ）を、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）からの注入ポンプで制御した。オプシンの機能性の検証のために、生きた齧歯動物における同時の光学的な刺激および電気的記録を、記録されたニューロンの照射を確実にするために、光ファイバーの先端よりも深い（約０．４ｍｍ）電極の先端を用いて、光ファイバー（約２００μｍ）に結合された細胞外タングステン電極（１ＭΩ、約１２５μｍ）からなるオプトロードを用いて、以前に記述されたように行った（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。光ファイバーは、ＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒからの４７３ｎｍ（ＣｈＲ２用）または５６０ｎｍ（ｅＮｐＨＲ３．０用）レーザーダイオード（１０ｍＷのファイバー出力）に連結した。オプトロード記録は、１．５％ イソフルランで麻酔した齧歯動物において行い、オプトロードは、標的領域上に形成された小開頭して設置した。データの収集およびファイバーを介した光パルスの生成の両方にｐＣｌａｍｐ １０およびＤｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａボードを用いた。記録された信号を、３００Ｈｚ低／５ｋＨｚ高でバンドパスフィルターに通した（１８００微小電極 ＡＣ増幅器）。

【0295】

組織切片の調製
脳切片の調製のために、マウスまたはラットを、ウイルスを注射してから４〜５週間後に殺処分した。齧歯動物は、２０ｍＬの氷冷したＰＢＳ、続いて、２０ｍＬの４％ パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、脳を４％ パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、３０％ スクロース溶液に２日間移した。脳を冷凍し、冠状切片（４０μｍ）を、Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０００Ｒクリオスタットで調製し、抗凍結剤（ＰＢＳ中の２５％ グリセロールおよび３０％ エチレングリコール）中で、４℃で保存した。切片（ＤＡＰＩ染色 １：５０，０００）を、顕微鏡用スライド上にＰＶＡ−ＤＡＢＣＯで装着し、単一の共焦点光学的断面（例えば、背部のＣＡ１領域を通して、ブレグマよりも約１〜２．５ｍｍ後方、または背側鉤状回、ブレグマよりも２．７〜３ｍｍ後方）を、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡上に、１０倍の空気および４０倍／１．４ ＮＡ油浸対照を用いて得た。

【0296】

拡張した実験手順
オプシン源
本明細書に記載の全てのオプシンは、ヒトコドン使用分布に従うようにそれぞれの遺伝子のコドンを変化させることにより、哺乳動物発現に対して最適化されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝９６０６）。本来のＡＲ、ＢＲ、およびＧｔＲ３配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受入コードは、ＤＱ０７４１２４、Ｍ１１７２０、およびＥＧ７２２５５３である。

【0297】

ＤＮＡ構築体
全てのＮｐＨＲ変異体は、既刊のＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ構築体のＰＣＲ増幅により生成し（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）、標準的な分子生物学プロトコルに従って、ＣａＭＫＩＩαまたはシナプシン−１プロモータを運搬するレンチウイルスのＡｇｅｌおよびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位に、インフレームにクローン化した。同様の戦略をＢＲおよびＡＲのために使用した。ＧｔＲ３を、ゲノムサーチを通じて特定した。本明細書に記載の全てのオプシンは、ヒトコドン使用分布に従うようにそれぞれの遺伝子のコドンを変化させることにより、哺乳動物発現に対して最適化されており（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ− ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝９６０６）、最適化された配列は、カスタム合成した（ＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）。本来のＡＲ、ＢＲ、およびＧｔＲ３配列についてのＧｅｎＢａｎｋ受入コードは、ＤＱ０７４１２４、Ｍ１１７２０、およびＥＧ７２２５５３である。ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−ＷＧＡ−Ｃｒｅ ベクターを、標準的な分子生物学プロトコルを用いて構築した。ＷＧＡおよびＣｒｅ遺伝子のコドンを、哺乳動物細胞中の発現のために最適化した。遺伝子は、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）により合成した。Ｃｒｅを、ＷＧＡのＣ末端にインフレーム融合させ、これを、同様に、ＩＲＥＳに融合させた。ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−ＷＧＡ−Ｃｒｅバイシストロニック発現カセットを、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列を用いて設計した。ｐＡＡＶ−ＥＦ１ａ プラスミドバックボーンは、前に記述されたものと同一である（Ｓｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，２００９）。ｐＡＡＶ−ｈＳｙｎ−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＦＹＰ−Ｐ２Ａ−ＣｈＲ２Ｈ１３４Ｒ−ｍＣｈｅｒｒｙを、５’末端でＥＲ移行配列を有するｐ２Ａ領域および３’末端でｈＣｈＲ２から始まる２０塩基を含有した１２０−ｍｅｒプライマーで構築した（５’ｃａａｇｔｔｃｔｇｃｔａｃｇａｇａａｃｇａｇｇｔｇｇｇｃｔｃｃｇｇａｇｃｃａｃｇａａｃｔｔｃｔｃｔｃｔｇｔｔａａａｇｃａａｇｃａｇｇａｇａｃｇｔｇｇａａｇａａａａｃｃｃｃｇｇｔｃｃｃａｔｇｇａｃｔａｔｇｇｃｇｇｃｇｃｔｔｔｇｔｃｔｇｃｃｇ３’）。まず、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｍＣｈｅｒｒｙフラグメントを、順方向プライマーとして、１２０−ｍｅｒおよび逆プライマーとして、５’−ａｔａｔｃｇａａｔｔｃｔｃａｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔ−３’を用いて増幅した。次に、この増幅された生成物を、干渉されたｐ２Ａ領域を用いてｅＮｐＨＲ ３．０−ＥＹＦＰをＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ｍＣｈｅｒｒｙに融合するために、順方向プライマー５’−ｃｃｇｇａｔｃｃｃｃｇｇｇｔａｃｃｇｇｔａｇｇｃｃａｃｃａｔｇａｃａｇａｇａｃｃｃｔｇｃｃｔ−３’とともに、逆プライマーとして使用した。次いで、３．４Ｋｂフラグメントを精製し、ｐＡＡＶ−ｈＳｙｎベクターのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位にクローン化された。全ての構築体は、クローニングの精度のために完全に配列化され、最新マップは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｏｒｇ．のオンラインで入手可能であり、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0298】

レンチウイルスの調製および滴定度決定
培養されたニューロン感染およびインビボ注入のためのレンチウイルスを、前に記述されたように生成した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００７ｂ）。ウイルス滴定は、２４ウェルプレート中で増殖され、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下で５倍の連続希釈でインキュベートされたＨＥＫ２９３細胞において行われた。４日間後、培養物をＰＢＳ中に再懸濁し、（サンプルあたり２０，０００の症例を回収する）ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター上でＥＹＦＰ蛍光について分別し、続いて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて分析した。ウイルスの滴定度は、以下のように決定した：［（感染した細胞の割合％）×（ウェル中の細胞の総数）×（希釈係数）］／（細胞に付加した接種材料の容量）＝感染単位／ｍＬ。培養感染のウイルスに対する滴定度は、１０^５感染単位／ｍＬであった。インビボ注入のための濃縮したウイルスの滴定度は、１０^１０感染単位／ｍＬであった。

【0299】

海馬培養
一次培養海馬ニューロンをＰ０ Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ仔ラットから調製した。ＣＡ１およびＣＡ３領域を単離し、０．４ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）で消化し、６５，０００／ｃｍ^２の密度で、１：３０のマトリゲル（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でプレコートされたガラス製のカバースリップ上に播種した。培養物は、１．２５％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、４％ Ｂ−２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、およびＦＵＤＲ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて５％ＣＯ_２湿潤インキュベータ内で維持した。

【0300】

リン酸カルシウムのトランスフェクション
６〜１０に分けた海馬ニューロンを、２４ウェルプレート中で６５，０００細胞／ウェルで増殖させた。それぞれのウェルに対してＤＮＡ／ＣａＣ ＣＩ_２混合：１５μＬの総Ｈ_２Ｏ中の１．５〜３μｇのＤＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ 内毒素のない調製物）＋１．８７５μＬの２Ｍ ＣａＣ ＣＩ_２（最終Ｃａ^２＋濃度 ２５０ｍＭ）。ＤＮＡ／ＣａＣｌ_２に、１５μＬの２Ｘ ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ｐＨ７．０５）を添加し、最終容量をピペット操作により十分に混合した。室温で２０分間後、３０μＬのＤＮＡ／ＣａＣＩ２_２／ＨＢＳの混合物を、それぞれのウェルに滴加し（ここから成長培地が一時的に除去され、４００μＬの温かいＭＥＭと置き換えた）、３７℃で４５〜６０分間、トランスフェクションを開始した。次いで、それぞれのウェルを３×１ｍＬの温かいＭＥＭで洗浄し、成長培地を置き換えた。オプシン発現は、通常、２０〜２４時間以内に観察された。

【0301】

電気生理学
カバースリップ上に成長させた海馬培養物に、全ての構築体に対して滴定度が一致したウイルスを、４日間インビトロで形質導入し（神経細胞成長培地中の最終希釈１０^４感染単位／ｍＬ）、１週間発現させた。ホールセルパッチクランプ記録を、前に記述されたように行った（細胞内溶液：１２９ｍＭ Ｋ−グルコン酸塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣＩ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰ、ｐＨ７．２まで滴定；細胞外タイロード：１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣＩ、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３０ｍＭ グルコース、および２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３まで滴定）。電圧クランプ記録のために、細胞は、−７０ｍＶで保たれた。可視範囲内の光を、３００Ｗ ＤＧ−４ランプ（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）から異なる波長の選択性のあるフィルター（Ｓｅｍｒｏｃｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）およびＬｅｉｃａ ４０Ｘ／０．８ＮＡ水浸対物を通じて送達した。パワースペクトルを除くフィルター（波長ｎｍ／帯域幅ｎｍ／出力ｍＷ／ｍｍ^２として本明細書に示される）は、４０６／１５／３、４７２／３０／１８．５、５６０／１４／７、５８９／１５／７．５、５９３／４０／１５．５、６３０／２０／３．５であった。遠赤色光および近赤外線の送達：６６０ｎｍの抑制剤に対する光（７ｍＷ／ｍｍ^２）を、発光ダイオードおよび４０×／０．８ＮＡ水浸対物を用いて送達した。６８０ｎｍの抑制剤に対する光（７ｍＷ／ｍｍ^２）を、６８０±１３ｎｍのフィルターを通じて、Ｘ−Ｃｉｔｅ １２０Ｗハロゲン光源および４０×／０．８ＮＡ水浸対物を用いて送達した。ｅＮＰＡＣ、ＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）、およびｅＮｐＨＲ３．０のパワースペクトルの光送達は、異なる波長の２５ｍｍフィルターのために、１０ポジションホイールを有するラムダ１０−３フィルターホイール（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を装備する３００Ｗ ＤＧ−４ランプおよび４０×／０．８ＮＡ水浸対物から送達した。フィルター（波長ｎｍ／帯域幅ｎｍ／出力ｍＷ／ｍｍ^２として本明細書に示される）は、３８７／１０／３．５、４０６／１５／３．５、４２７／１０／４．０、４４５／２０／４．０、４７０／２２／４．０、４９４／２０／４．５、５２０／１５／４．５、５４２／２７／５．０、５６０／２０／５．０、５９０／２０／３．５、６３０／２０／３．５であった。図１、３Ａ〜３Ｄ、および４および図Ｓ２（下表５を参照のこと）については、共焦点像およびホールセルパッチクランプデータは、レンチウイルスＮｐＨＲ、ＢＲ、ＧｔＲ３、およびＡＲベースの構築体を用いて、トランスフェクトされるか（共焦点データ）、あるいは変換される（パッチデータ）のいずれかで、１週間発現される、培養された海馬ニューロン由来のものである。発現は、ヒトシナプシンＩプロモータにより駆動され、ＥＹＦＰへの融合により可視化された。

【0302】

表５は、青色抑制剤および新しいオプシン配列：ギャラルディアシータロドプシン−３またはＧｔＲ３のためのさらなる輸送強化されたツールを示す。

【表5】

【0303】

新しいオプシン配列：ギャラルディアシータロドプシン−３またはＧｔＲ３。ＥＳＴ配列は、全て７つの膜貫通らせんを含み、５’アミノ酸配列は、ＣｈＲ２から提供された（膜貫通モチーフ：棒；保存残基：ハイライト表示；ペプチドの切断部位：^＊；ＣｈＲ２から提供されたシグナルペプチド：灰色。

【0304】

免疫組織化学
一次海馬培養は、タイターで一致させたウイルスを用いて、４日間インビトロで感染させた（神経細胞成長培地中の最終希釈１０^４感染単位／ｍＬ）。１４日間インビトロで、培養物を、氷冷した４％ パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、次いで、２％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中の０．４％ サポニンで３０分間透過した。一次抗体のインキュベーションを、ＫＤＥＬ保留シグナル（ＫＤＥＬ １：２００、Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有する内因性小胞体タンパク質を認識する小胞体のモノクローナルマーカーを用いて、４℃で一晩行った。Ｃｙ３共役させた二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を、室温で１時間２％ ＮＤＳ中に適用した。画像は、６３倍／１．４ＮＡ油浸対照を用いてＬｅｉｃａ共焦点顕微鏡上で得た。

【0305】

齧歯動物脳への定位注射
成体マウスおよびＬｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットを、Ｓｔａｎｆｏｒｄでの承認されたプロトコルに従って収容した。全ての手術は、無菌状態下で行われた。動物を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１５〜２０ｍｇ／ｋｇ）のカクテル（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射で麻酔した。頭部を定位固定装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ；Ｏｌｙｍｐｕｓ立体顕微鏡）中に設置した。眼科用の軟膏を眼の乾燥を防ぐために適用した。正中頭皮切開が行われ、小規模の開頭術を定位固定装置（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上に実装されたドリルを用いて行った。ウイルスを１０μＬの注射器および細い３４ゲージの金属針を用いて送達し、注射容量および流量（０．１μＬ／分で１μＬ）を、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）からの注入ポンプで制御した。注入後、この針をさらに５分間放置し、次いで、徐々に引き抜いた。皮膚をＶｅｔｂｏｎｄ組織接着剤を用いて元の位置に接着した。この動物は、麻酔から回復するまで、加温パッド上に保持した。ブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｋｇ）を、不快感を最小限に抑えるために、外科手術後、皮下に投与した。図２Ａの実験では、背部ＣＡ１の大きな面積を覆うために、ＣａＭＫＩＩαプロモータ下で、ｅＮｐＨＲ３．１（Ｎ末端シグナルペプチドを有するｅＮｐＨＲ３．０の短い形態、元のＮｐＨＲの初めから１７個のアミノ酸を除去した）を担持する１μＬの濃縮されたレンチウイルス（１０^１０感染単位／ｍＬ）を、それぞれの海馬において、２つの部位にマイクロ注入した（部位１：ブレグマから前後−１．５ｍｍ；側部、±１ｍｍ；腹部、１．５ｍｍ；部位２：ＡＰ、ブレグマから−２．５ｍｍ；側部、±２ｍｍ；腹部、１．５ｍｍ）。図２Ｄおよび２Ｅでは、２つの異なるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（ウイルス滴定度２×１０^１２ｇ．ｃ．／ｍＬ）を、同じ手術中、０．１５ｕＬ／分の注入速度を用いて、定位的に注入した。高い滴定度（２×１０^１２ｇ．ｃ．／ｍＬ）ＡＡＶを、ＵＮＣ ＶｅｃｔｏｒＣｏｒｅにより生成した。図２Ｄでは、ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰ（ＡＡＶ５−Ｅｆｌａ−ＤＩＯ−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰ）を担持する二重に惹起されたｃｒｅ依存性ＡＡＶ５を、Ｍ１に注入し、ＡＡＶ２−Ｅｆｌα−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳＷＧＡ−Ｃｒｅを成体Ｌｏｎｇ−ＥｖａｎｓラットのＳ１に注入した。１μＬのウイルスを、以下の調整物により定義された５つの異なる部位で送達した：Ｍ１の注入Ｉ：ＡＰ、ブレグマから＋１ｍｍ；側部、１．５ｍｍ；腹部、２ｍｍ；Ｍ１の注入ＩＩ：ＡＰ、＋２ｍｍ；側部、１．５ｍｍ；腹部、２ｍｍ；Ｓ１の注入Ｉ：ＡＰ、−０．３ｍｍ；側部、３．４ｍｍ；腹部、２ｍｍ；Ｓ１の注入ＩＩ：ＡＰ、−１．３ｍｍ；側部、３ｍｍ；腹部、２ｍｍ；Ｓ１の注入ＩＩＩ：ＡＰ、−２．１２ｍｍ；側部、３ｍｍ；腹部、２ｍｍ。図２Ｅでは、１μＬのウイルスを、成体ＢＬ６マウスの歯状回（ＤＧ）に左右対称に注入した。ＡＡＶ８−ＥＦ１ａ−ＤＩＯ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを、以下の調整物を用いて、右側ＤＧに注入し、ＡＡＶ２−ＥＦ１ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−ＷＧＡ−Ｃｒｅを、左側ＤＧに注入した：ＡＰ、ブレグマから−２．１；側部、±１．０５ｍｍ；腹部、２．１ｍｍ。

【0306】

インビボオプトロード記録
ＷＧＡ−Ｃｒｅシステムにおいてオプシン機能性を検証するために、生きている齧歯動物における同時の光学的な刺激および電気的記録を、記録されたニューロンの照射を確実にするために、光ファイバーの先端よりも深い（約０．４ｍｍ）電極の先端を有する光ファイバー（約２００μｍ）に結合された細胞外タングステン電極（１ＭΩ、約１２５μｍ）からなるオプトロードを用いて、前に記述されたように行った（Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。光ファイバーは、ＣｒｙｓｔａＬａｓｅｒからの４７３ｎｍ（ＣｈＲ２用）または５６０ｎｍ（ｅＮｐＨＲ３．０用）レーザーダイオード（１０ｍＷのファイバー出力）に連結した。オプトロード記録は、１．５％ イソフルランで麻酔した齧歯動物において行い、オプトロードは、標的領域上に形成された開頭術を通して設置した。ｐＣｌａｍｐ１０およびＤｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａボードは、データを回収することと、光ファイバーを通じて光パルスを発生させることの両方のために用いた。記録された信号を、３００Ｈｚ低／５ｋＨｚ高でバンドパスフィルターに通した（１８００微小電極 ＡＣ増幅器）。光ファイバー／電極対の精密な設置のために、定位固定用の器具類を用いた。

【0307】

組織切片の調製
脳切片の調製のために、マウスまたはラットを、ウイルスを注射してから４〜５週間後に殺処分した。齧歯動物は、２０ｍＬの氷冷したＰＢＳ、続いて、２０ｍＬの４％ パラホルムアルデヒドで灌流した。次いで、脳を４％ パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、３０％ スクロース溶液に２日間移した。脳を冷凍し、冠状切片（４０μｍ）を、Ｌｅｉｃａ ＳＭ２０００Ｒクリオスタットで調製し、抗凍結剤（ＰＢＳ中の２５％ グリセロール、３０％ エチレングリコール）中で、４℃で保存した。切片（ＤＡＰＩ染色 １：５０，０００）を、顕微鏡用スライド上にＰＶＡ−ＤＡＢＣＯで装着し、単一の共焦点光学的断面（例えば、背部のＣＡ１領域を通して、ブレグマよりも約１〜２．５ｍｍ後方、または背側鉤状回、ブレグマよりも２．７〜３ｍｍ後方）が、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡上で、１０倍の空気および４０倍／１ＮＡ油浸対照を用いて得た。

【0308】

上述の実施形態のさらなる詳細および考察については、Ｖｉｖｉａｎａ Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４１，１５４−１６５，Ａｐｒｉｌ ２，２０１０による「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ」に参照がなされ得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
参照文献

【0309】

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【0310】

本明細書に開示される全ての参考文献、刊行物、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0311】

上記の種々の実施形態は、説明のために提供されるに過ぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。上記の考察および説明に基づいて、本明細書に説明および記載される例示的な実施形態および応用例に厳密に従わずに、本発明に種々の修正および変更がなされ得ることが、当業者には、容易に理解されよう。例えば、そのような変更には、放射光を制御するためのデジタル論理またはマイクロプロセッサの使用が含まれ得る。そのような修正および変更は、以下の請求項に記載される、本発明の真の精神および範囲から逸脱しない。上で考察されたように、本発明に関連して詳述される特定の応用および背景が、上記、以下の説明、および本明細書で引用される参照文献を通じて考察される。付録における実施形態は、上述の実施形態および実行形態のうちの１つ以上、ならびに図に示され、以下に説明されるものに関連して実行することができる。付録（Ａ、Ｂ、およびＣ）に参照がなされ得、これらは、この基礎となる仮出願で出願され、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]