特許 6235795 細胞のリプログラミングのための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6235795

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】細胞のリプログラミングのための組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/074 20100101AFI20171113BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20171113BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/074

   C12N5/071

【請求項の数】17

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2013-113297(P2013-113297)

(22)【出願日】2013年5月29日

(65)【公開番号】特開2014-230521(P2014-230521A)

(43)【公開日】2014年12月11日

【審査請求日】2016年3月23日

(73)【特許権者】

【識別番号】504179255

【氏名又は名称】国立大学法人 東京医科歯科大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000002897

【氏名又は名称】大日本印刷株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100125508

【弁理士】

【氏名又は名称】藤井 愛

(72)【発明者】

【氏名】森田 育男

(72)【発明者】

【氏名】小牧 基浩

(72)【発明者】

【氏名】岩崎 剣吾

(72)【発明者】

【氏名】横山 尚毅

(72)【発明者】

【氏名】菖蒲 弘人

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５００７９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−１５１９０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０１１５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Am. J. Reprod. Immunol.，２０１０年，vol.63, no.6，pp.520-533

【文献】 Differentiation，２００７年，vol.75, no.4，pp.279-291

【文献】 Stem Cells，２００４年，vol.22, no.5，pp.649-658

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物であって、
培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを含む、前記組成物。

【請求項2】

胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、請求項１記載の組成物。

【請求項3】

リプログラミングに関わる転写因子として、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、請求項１または２記載の組成物。

【請求項4】

エキソソームが、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子を実質的に含まない、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。

【請求項5】

標的細胞をリプログラミングするための組成物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。

【請求項6】

標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物の製造方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
を含む、前記方法。

【請求項7】

工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、請求項６記載の方法。

【請求項8】

工程ｂ）が、無血清培地中でさらに培養する工程である、請求項６または７記載の方法。

【請求項9】

組成物が、リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。

【請求項10】

胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。

【請求項11】

標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
ｄ）エキソソームと標的細胞とを接触させる工程と、
を含む、前記方法。

【請求項12】

工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、請求項１１記載の方法。

【請求項13】

工程ｂ）が、無血清培地中でさらに培養する工程である、請求項１１または１２記載の方法。

【請求項14】

リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させる、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。

【請求項15】

胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。

【請求項16】

標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、標的細胞をリプログラミングする方法である、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。

【請求項17】

標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、多分化能を持つ細胞を製造する方法である、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞再生医療分野における複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現亢進による治療用細胞／組織の分化誘導および製造に関する。より具体的には、本発明は、複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現亢進を可能とするエキソソーム、ならびに該エキソソームを用いた体細胞リプログラミングおよび多分化能を持つ細胞（ｉＰＳ細胞など）の誘導に関する。

【背景技術】

【0002】

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を維持したまま培養することができる。この性質を利用して、多能性をもつ幹細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療の手段として期待されている。しかし、ＥＳ細胞は、臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。

【0003】

ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として利用できるものと期待されている。ｉＰＳ細胞の樹立方法として、下記特許文献１が知られている。特許文献１には、複数の特定因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子の４因子）を体細胞に導入してリプログラミングを行う工程が記載されている。遺伝子の導入のために、レトロウイルス等を体細胞に導入することから、ｉＰＳ細胞、またはｉＰＳ細胞を分化誘導することによって得られる細胞において腫瘍発生の危険性が危惧されている。

【0004】

近年、エキソソームやマイクロベシクル（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）と呼ばれる小型脂質小胞を細胞に投与し、細胞の脱分化を試みる研究がなされている。例えば、非特許文献１には、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＮａｎｏｇ遺伝子を多量に含むＥＳ細胞由来のマイクロベシクルをマウス骨髄由来単核球の培養系に加えると、Ｏｃｔ４遺伝子が細胞内で発現することが報告されている。また、非特許文献２には、ＥＳ細胞のマイクロベシクルを媒介として、網膜のミュラー細胞にＯｃｔ４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子およびｍｉＲＮＡを導入すると、Ｏｃｔ４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現が亢進することが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開WO2007/069666号のパンフレット

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Leukemia（2006）, 20, 847-856, Embryonic Stem Cell-Derived Microvesicles Preprogram Hematopoietic Progenitors: Evidence for Horizontal Transfer of mRNA and Protein Delivery

【非特許文献2】PLOS ONE（2012）, 7, e50417, Embryonic Stem Cell-Derived Microvesicles Induce Gene Expression Changes in Muller Cells of the Retina

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

非特許文献１および２では、ＥＳ細胞を利用するため、その取得方法に倫理上の問題が伴う。さらに、非特許文献１および２では、Ｏｃｔ４遺伝子やＳｏｘ−２遺伝子の発現量を上昇させるものであるが、幹細胞性に関与するＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を上昇させるものではない。

【0008】

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、ＥＳ細胞を利用することなく、体細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる手段であって、腫瘍発生の危険性の低い手段を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、エキソソームの作製に胎盤由来細胞を利用することで、少なくともＥＳ細胞を利用する場合に生じる倫理上の問題を解決できる点に着目した。また、胎盤由来細胞は、腫瘍性や腫瘍増殖性が極めて低いか、またはこれを有しないため、従来のｉＰＳ細胞のように腫瘍発生の危険性を低下させることできる点にも着目した。これらの知見をもとに、本発明者らは、更に研究を進め、胎盤由来細胞を利用することで、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子のみならず、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現を亢進させる能力をもつエキソソームを抽出できることを見出した。

【0010】

すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物であって、
培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを含む、前記組成物。
（２）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（１）記載の組成物。
（３）リプログラミングに関わる転写因子として、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、（１）または（２）記載の組成物。
（４）エキソソームが、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子を実質的に含まない、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）標的細胞をリプログラミングするための組成物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させるための組成物の製造方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
を含む、前記方法。
（７）工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、（６）記載の方法。
（８）組成物が、リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるための組成物である、（６）または（７）記載の方法。
（９）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる方法であって、
ａ）胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる工程と、
ｂ）コロニー形成した胎盤由来細胞を取得してさらに培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた培養上清からエキソソームを抽出する工程と、
ｄ）エキソソームと標的細胞とを接触させる工程と、
を含む、前記方法。
（１１）工程ａ）が、胎盤由来細胞を１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で播種して培養し、コロニー形成させる工程である、（１０）記載の方法。
（１２）リプログラミングに関わる転写因子として、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させる、（１０）または（１１）記載の方法。
（１３）胎盤由来細胞が胎盤由来幹細胞を含む、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、標的細胞をリプログラミングする方法である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることにより、多分化能を持つ細胞を製造する方法である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞であって、体細胞のＯｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させるエキソソームを産出することを特徴とする、前記細胞。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、ＥＳ細胞を利用することなく、体細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる手段であって、腫瘍発生の危険性の低い手段を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】コロニー形成したヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームについて、リアルタイムＰＣＲを用い、歯根膜由来幹細胞をポジティブコントロールとして融解曲線分析法を行い、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子の定量化を行った結果を示す。

【図2】コロニー形成したヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームのリアルタイムＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、リアルタイムＰＣＲ産物のサイズを定性的に調べた結果を示す。

【図3】図３ａは、コロニー形成したヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ３／４遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図３ｂは、コロニー形成していないヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ３／４遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図３ｃは、コロニー形成していないヒト頭蓋冠骨芽細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ３／４遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。対照は、エキソソームを接触させていないヒト皮膚線維芽細胞におけるＯｃｔ３／４遺伝子の発現量を示す。

【図4】図４ａは、コロニー形成したヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＳｏｘ−２遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図４ｂは、コロニー形成していないヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＳｏｘ−２遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図４ｃは、コロニー形成していないヒト頭蓋冠骨芽細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＳｏｘ−２遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。対照は、エキソソームを接触させていないヒト皮膚線維芽細胞におけるＳｏｘ−２遺伝子の発現量を示す。

【図5】図５ａは、コロニー形成したヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図５ｂは、コロニー形成していないヒト胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。図５ｃは、コロニー形成していないヒト頭蓋冠骨芽細胞から抽出されたエキソソームを接触させたヒト皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を対照と比較した結果を示す。対照は、エキソソームを接触させていないヒト皮膚線維芽細胞におけるＮａｎｏｇ遺伝子の発現量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明者らは、培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソーム（以下本発明のエキソソームと称する場合がある）を用いて、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進できることを見出した。

【0014】

エキソソームは、後期エンドソーム区画由来の直径３０〜１００ｎｍの小型脂質小胞であって、脂質だけではなくタンパク質および核酸等を含むものをいう（Nature Reviews Immunology 9, 581-593, 2009）。エキソソームは、細胞が分泌する脂質二重膜に囲まれた膜小胞であり、それを別の細胞が取り込むことで細胞間のコミュニケーション、生体現象の調節が行われていることが明らかになってきている。エキソソームは、細胞の産生する生体物質であり、血中などでも分解されにくく安定な膜粒子であり、エキソソーム内部の核酸はエキソソームが取り込まれた他の細胞のなかで機能する、といった性質を有する。

【0015】

本発明で用いるエキソソームは胎盤由来細胞から抽出されたものである。胎盤を有する動物由来のものであれば特に制限されず、例えば、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）由来のものを使用できるが、好ましくは、標的細胞と同種の動物由来のものを使用する。

【0016】

本発明においては、培養によりコロニー形成した胎盤由来細胞からエキソソームを抽出する。胎盤由来細胞には、羊膜由来細胞および臍帯由来細胞も包含される。好ましくは胎盤由来幹細胞を含むものからエキソソームを抽出する。胎盤由来幹細胞は、胎児に由来し、低免疫原性であり、三胚葉分化能を有するものである。胎盤由来幹細胞には、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胎盤多能性細胞および胚性様幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0017】

胎盤由来細胞の調製方法は、当技術分野で公知の方法を使用でき、特に制限されない。例えば、破砕した組織を用いたｏｕｔｇｒｏｗｔｈ法や、消化酵素を用いる方法などを使用できる。用いる消化酵素としては、マトリクスメタロプロテインナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ）、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、プロテインナーゼＫ、ディスパーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カルパインおよびスブチリシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0018】

組織を破砕する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ミンチにする、ミキサーにかける等が含まれる。胎盤組織を破砕することにより、結果として、浮遊する胎盤細胞と胎盤組織の組織混合物が生じる。組織混合物を１つまたは複数の篩、例えば、５０μｍ〜５００μｍまでの範囲の様々な孔径のストレイナーにかけることで、浮遊している胎盤細胞から組織を分離することが可能である。例えば、胎盤組織混合物を繰り返し徐々に小さな孔径のメッシュに通すことで、最後には、ほぼ全ての組織を除去し、胎盤細胞懸濁液（例えば、単細胞懸濁液）を取得することができる。

【0019】

胎盤細胞懸濁液は、胎盤由来幹細胞以外に、一つまたは複数のその他の胎盤由来細胞種、例えば、上皮細胞（例えば、胎生繊毛膜細胞）を含んでいてもよい。胎盤由来幹細胞以外の胎盤由来細胞は、１回または複数回の洗浄、遠心分離、密度勾配遠心分離、溶出、ポジティブセレクションおよびネガティブセレクションなど、すでに確立している方法を用いて分離することができる。

【0020】

胎盤由来細胞を培養してコロニー形成させる方法は、当技術分野で公知の方法を使用でき特に制限されない。例えば、上記のようにして得た胎盤由来細胞を、培養容器の培養面に低密度で播種して培養することにより、コロニー形成させることができる。胎盤由来細胞を、好ましくは５，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度、より好ましくは５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度、さらに好ましくは５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で、さらにより好ましくは２５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で、好ましくは０．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度、より好ましくは１．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度、さらに好ましくは５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度で、播種して培養することにより、コロニー形成させることができる。

【0021】

細胞をコンフルエントにならない条件で、低密度で播種して培養することによりコロニーを形成させ、コロニー形成能を有する細胞のみを選択することができる。培養条件は、当技術分野で公知の方法を使用でき特に制限されない。培地としては、胎盤由来細胞の培養に使用される公知の培地を使用でき、例えば、ＭＳＣＧＭ培地、１９９培地、ＢＭＥ培地（ＢＭＥ−Ｅａｒｌｅ、ＢＭＥ−Ｈａｎｋｓ）、Ａｍｅｓ'培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地、ＨＡＴ培地、Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ５ａ培地、ＲＰＭＩ１６２９倍地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地（ＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ、ＭＥＭ−Ｈａｎｋｓ）、Ｄ−ＭＥＭ培地（低グルコース（１．０ｇ／Ｌグルコース）、高グルコース（４．５ｇ／Ｌグルコース））やＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｄ）等を使用できる。培養は、３６〜３８℃の温度で、培地交換しながら、１２〜１６日間培養する。

【0022】

多種の細胞を含む初代培養細胞から、標的細胞に対するリプログラミング効果を有する細胞を濃縮培養するためにはコロニー形成が有効である。リプログラミング効果を有する細胞は高い増殖能を有するため、コロニー形成を行うことで、多種類の細胞のなかで、その割合を高めることができる。コロニーを形成させる具体的方法としては、当技術分野で公知の方法を使用できる（STEM CELLS (2001), 19 , 219-225, Rat Marrow Stromal Cells are More Sensitive to Plating Density and Expand More Rapidly from Single-Cell-Derived Colonies than Human Marrow Stromal Cells）。

【0023】

このようにしてコロニー形成した胎盤由来細胞は、優れた増殖能を有する細胞であり、この胎盤由来細胞から抽出したエキソソームは、コンフルエントになった胎盤由来細胞から抽出したエキソソームと比較して、効果的にリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させる能力において優れ、細胞をリプログラミングする能力および多分化能を持つ細胞を誘導する能力において優れている。

【0024】

コロニー形成した胎盤由来細胞（以下、コロニー形成細胞と称する場合がある）のみを取得し、さらに培養することにより増殖させ、増殖した胎盤由来細胞からエキソソームを抽出することが好ましい。例えば、コロニー形成細胞を別の培養容器に播種して培養し、６０〜８０％コンフルエントになったら、ＰＢＳで洗浄し、培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ_２、飽和水蒸気条件下でインキュベートし、培養上清を回収して遠心分離後、フィルトレーションを行う。培地として無血清培地を用いることにより、他の細胞種に由来するエキソソームの混入を防ぐことができる。無血清培地としては、例えば、１９９培地、ＢＭＥ培地（ＢＭＥ−Ｅａｒｌｅ、ＢＭＥ−Ｈａｎｋｓ）、Ａｍｅｓ'培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１０培地、Ｈａｍ'ｓ Ｆ１２培地、ＨＡＴ培地、Ｌ−１５培地、ＭｃＣｏｙ５ａ培地、ＲＰＭＩ１６２９倍地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地（ＭＥＭ−Ｅａｒｌｅ、ＭＥＭ−Ｈａｎｋｓ）、Ｄ−ＭＥＭ培地（低グルコース（１．０ｇ／Ｌグルコース）、高グルコース（４．５ｇ／Ｌグルコース））やＣＤ培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−Ｄｅｆｉｎｄ）が挙げられる。他の細胞に由来するエキソソームが混入していても問題ない場合は、培地は特に無血清培地に制限されない。

【0025】

このとき細胞を播種する密度は、特に制限されないが、好ましくは５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度、より好ましくは５０ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下の密度で、好ましくは１．５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度、より好ましくは５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以上の密度とする。

【0026】

エキソソームは、任意の適切な技術を用いて、コロニー形成細胞の細胞培養上清から調製することができる（例えば、Current Protocols in Cell Biology (2006) 3.22.1-3.22.29に記載の方法が挙げられる）。具体的には、まず、得られた培養上清を、５０００〜２００００ｇ、好ましくは８０００〜１２０００ｇの速度で、１５〜６０分間、好ましくは２０〜４０分間遠心分離を行う。次に、得られた上清をさらに、５００００〜１５００００ｇ、好ましくは９００００〜１１００００ｇの速度で、５０〜１００分間、好ましくは６０〜８０分間遠心分離を行う。続いて、得られたペレットをＰＢＳに懸濁し、５００００〜１５００００ｇ、好ましくは９００００〜１１００００ｇの速度で、５０〜１００分間、好ましくは６０〜８０分間遠心分離を行う。こうして得られたペレットをエキソソームとして取得することができる。

【0027】

別の好ましいエキソソーム画分の調製法としては、遠心分離とゲルろ過カラムを用いる方法を挙げることができる。具体的には、まず、得られた培養上清をエキソソーム画分が沈殿しない条件で１回目の遠心分離を行う。例えば、１〜３０℃、５００〜４０００ｇの速度で５〜３０分間遠心分離を行う。最適な例として室温、２０００ｇ、１５分間の遠心分離が挙げられる。更に、２回目の遠心分離として１回目の遠心分離よりも速い速度でなおかつエキソソーム画分が沈殿しない条件で遠心分離を行う。２回目の遠心分離の例としては１〜３０℃、５０００〜２５０００ｇの速度で５〜１２０分間の遠心分離を挙げることができ、最も好ましい例として室温、１２０００ｇ、３５分間の遠心分離を挙げることができる。得られた上清画分を一般的な生化学実験に用いられるゲルろ過カラムに供し、溶出液の２６０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の高いフラクションをエキソソーム画分とする。ゲルろ過カラムは担体を購入し自ら作製しても、市販品を使用してもよく、ここではＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ ＨＲ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を適した例として挙げることができる。また、吸光度の高いフラクションとしては吸光度値の上位１０フラクション程度を用いればよいが、もちろん最高値を示すフラクションを以てエキソソーム画分とすることも可能である。

【0028】

別の好ましいエキソソーム画分の調製法としては、例えば分画遠心分離法を挙げることができる。好ましい一具体例として、Ｒａｐｏｓｏ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２（１９９６）記載の方法を以下に示す。細胞培養物を３００ｇ、１０分間遠心分離する。得られた上清を３００ｇ、１０分間の遠心分離を２回、１００００ｇ、３０分間の遠心分離を１回、７００００ｇ、６０分間の遠心分離を１回行う。得られた沈殿を２．５Ｍ スクロース、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．２を含む溶液に溶解し、２〜０．２５Ｍの密度勾配を持つスクロース溶液に重層する。１０００００×ｇ、１５時間の遠心分離を行った後、得られた残渣をＰＢＳに溶解し、更に２０００００×ｇ、１時間の超遠心分離を行う。

【0029】

本発明のエキソソームは、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることができるが、好ましくは、亢進可能なリプログラミングに関わる転写因子をコードするすべての遺伝子、例えば亢進可能なリプログラミングに関わる転写因子をコードするｍＲＮＡやＤＮＡのすべてを含まない。本発明のエキソソームは、好ましくはＯｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子、すなわち、これらをコードするｍＲＮＡやＤＮＡを実質的に含まない。ここで、遺伝子を実質的に含まないとは、検出可能な範囲で含まないことを意味し、例えば、エキソソームからのｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出および逆転写を経て得られたｃＤＮＡの定量ＰＣＲにおいて、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子が検出されないことをさす。本発明のエキソソームが、Ｏｃｔ３／４遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子を含まないにもかかわらず、標的細胞においてこれらをコードする遺伝子の発現を亢進可能なことは、驚くべきことである。

【0030】

本発明のエキソソームを標的細胞に接触させることにより、標的細胞において、複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることができる。本発明のエキソソームは、標的細胞において、特にＯｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現を亢進させることから、標的細胞をリプログラミングすることができ、体細胞から多分化能を持つ細胞を誘導することができる。

【0031】

Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現亢進により細胞のリプログラミングが可能であることは、例えば、Differentiation (2010), 80 , 123-129（Rapid and efficient reprogramming of human amnion-derived cells into pluripotency by three factors OCT4/SOX2/NANOG）において報告されている。

【0032】

「リプログラミング」または「リプログラム」とは、細胞分化とは逆のプロセス、すなわち、分化した細胞がかつて保持していた未分化状態を再度獲得することをいう。特に、細胞のリプログラミングによって、その細胞が三胚葉形成能および個体発生能を有する分化多能性を獲得した場合には、このプロセスを「核初期化」または「初期化」といい、得られた細胞を「ｉＰＳ細胞」という。この「核初期化」または「初期化」は、典型的には、体細胞の核が受精卵の状態に戻ることをいう。

【0033】

リプログラミングに関わる転写因子は、標的細胞に独立してまたは組み合わせて発現した場合に、細胞をリプログラミングするために使用することができる核タンパク質をさす。リプログラミングに関わる転写因子としては、Ｏｃｔファミリー遺伝子（例えばＯｃｔ３／４遺伝子）、Ｓｏｘファミリー遺伝子（例えばＳｏｘ−２遺伝子）、Ｎａｎｏｇファミリー遺伝子（例えばＮａｎｏｇ遺伝子）、Ｋｌｆファミリー遺伝子（例えばＫｌｆ４遺伝子）、およびＭｙｃファミリー遺伝子（例えばｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の各遺伝子が知られている（ＷＯ２００７／０６９６６６）。本発明のエキソソームは、標的細胞において複数のリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進させることを特徴とするが、少なくともＮａｎｏｇ遺伝子の発現を亢進させるものであり、好ましくはさらにＳｏｘ−２遺伝子およびＯｃｔ３／４遺伝子の発現を亢進させるものである。

【0034】

Ｏｃｔ３／４は、多能性の維持に重大な役割を果たすことが知られている。割球および胚性幹細胞などのＯｃｔ３／４＋細胞にＯｃｔ３／４が不在になると、栄養芽層の自然分化に繋がることから、Ｏｃｔ３／４の存在は、胚性幹細胞の多能性および分化能の元となると考えられている。Ｏｃｔ３／４タンパク質の例として、マウスＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１３６３３）およびヒトＯｃｔ３／４遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００２７０１）によってコードされるタンパク質が挙げられる。

【0035】

Ｓｏｘファミリー遺伝子は、Ｏｃｔ３／４に類似して多能性の維持に関連するが、多能性幹細胞にのみ発現されるＯｃｔ３／４とは対照的に、多能性および単能性幹細胞に関連する。Ｓｏｘ−２は、誘導のために使用される最初の遺伝子であったが（Takahashi et al, Cell, 2006, 126: 663-76; Takahashi et al. Cell, 2007, 131-861-72; Yu et al, Science 2007, 318: 1917）、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に誘導過程において作用することが見出されている。Ｓｏｘ−２タンパク質の例として、マウスＳｏｘ−２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０１１４４３）およびヒトＳｏｘ−２遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿００３１０６）によってコードされるタンパク質が挙げられる。

【0036】

Ｎａｎｏｇはホメオボックス転写因子であり、遺伝子をノックアウトするとＥＳ細胞は分化多能性を失い原始内胚葉系の細胞へと分化する。また、Ｎａｎｏｇ遺伝子を正常の数倍発現させると、マウスＥＳ細胞はＬＩＦ／ＳＴＡＴ３シグナル非存在下で分化多能性を維持できることが報告されている。したがって、ＮａｎｏｇはＥＳ細胞の分化多能性にとって必要かつ十分な因子であると考えられている（Yamanaka et al, Cell, 2003, 113: 631-642）。Ｎａｎｏｇタンパク質の例として、マウスＮａｎｏｇ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２８０１６）およびヒトＮａｎｏｇ遺伝子（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションナンバーＮＭ＿０２４８６５）によってコードされるタンパク質が挙げられる。

【0037】

標的細胞においてリプログラミングに関わる転写因子の発現を亢進（増大）させることには、リプログラミングに関わる転写因子を過剰発現させることが包含され、標的細胞におけるリプログラミングに関わる転写因子タンパク質の量を増加させること、標的細胞におけるリプログラミングに関わる転写因子をコードするｍＲＮＡの量を増加させることが包含される。また、上記で例示したリプログラミングに関わる転写因子の遺伝子には、各遺伝子のオルソログやホモログも包含される。本発明において、遺伝子には、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が包含され、ＲＮＡにはｍＲＮＡが包含され、ＤＮＡにはゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡが包含される。

【0038】

本発明のエキソソームを接触させた標的細胞は、リプログラミングに関わる転写因子の発現が亢進する一方、テロメア逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする遺伝子の発現量は変化しない。ＴＥＲＴは、腫瘍増殖性およびテラトーマ形成との関連性が報告されており、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量は、腫瘍性または腫瘍増殖性の指標として使用される。したがって、本発明のエキソソームは、接触させた標的細胞の腫瘍化や癌化を促進せず、腫瘍性または腫瘍増殖性が低いかまたはこれを有しないと考えられる。

【0039】

本発明においてリプログラミングの標的となる標的細胞は、好ましくは、幹細胞を除く、分化した体細胞である。例えば、線維芽細胞（例えば、皮膚線維芽細胞）、上皮細胞（例えば、胃上皮細胞、肝上皮細胞）、内皮細胞（例えば血管、リンパ管）、神経細胞（例えば、ニューロン、グリア細胞）、すい臓細胞、血球細胞、骨髄細胞、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、肝実質細胞、非肝実質細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、歯周組織を構成する細胞（例えば、歯根膜細胞、セメント芽細胞、歯肉線維芽細胞、骨芽細胞）、腎臓・眼・耳を構成する細胞などが挙げられる。

【0040】

本発明の好ましい実施態様によれば、リプログラミングの標的とする細胞は線維芽細胞、特に皮膚線維芽細胞である。本発明においてリプログラミングの標的となる細胞は、いかなる動物に由来するものであってもよいが、好ましくは哺乳動物（例、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等）由来の細胞、より好ましくはマウスまたはヒトに由来する細胞である。

【0041】

以上のようにしてリプログラミングした細胞の用途としては、まず、治療用細胞としての利用が可能である。このような治療用細胞としては、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングした細胞が挙げられる。すなわち、リプログラミングされた細胞は疾患の治療に用いることができ、具体的には、組織幹細胞やその前駆細胞の分化状態にリプログラミングされた細胞を用いて各種疾患の治療を行うことができる。例えば、高橋ら、実験医学、ｖｏｌ．２６、Ｎｏ．５（増刊）、２００８年（羊土社）；再生医療、第７巻、第３号、２００８年（メディカルレビュー社）；および医学のあゆみ、ｖｏｌ．２２９、Ｎｏ．９、２００９年（医歯薬出版株式会社）を参照されたい。

【0042】

例えば、血球系細胞をリプログラミングして造血幹細胞を得た場合には、造血幹細胞移植への利用が可能となる。具体的には、得られた造血幹細胞を点滴またはカテーテルなどを用いて移植することにより、白血病やリンパ腫、あるいは自己免疫疾患、あるいはリソソーム病やペルオキシソーム病を含む先天性代謝異常症（例えばムコ多糖症、Ｇａｕｃｈｅｒ病、Ｆａｂｒｙ病、Ｐｏｍｐｅ病、副腎白質ジストロフィー、Ｉ−ｃｅｌｌ病、異染性ロイコジストロフィー、ＧＭ１ガングリオドーシスなど）などへ適用できる。また、骨髄球系またはリンパ球系前駆細胞を得た場合には、それらの細胞そのもの、または更に赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、血小板、樹状細胞または制御性Ｔ細胞へ分化誘導した後に、直接注射するか点滴で移植することにより、造血幹細胞移植後や抗ガン化学療法後の免疫回復、抗ガン細胞治療、自己免疫疾患細胞治療、リューマチ治療、多発性硬化症治療、再生不良性貧血などの貧血治療、血小板減少症治療、外傷治療などへ利用できる。また、間葉系幹細胞を得た場合には、点滴かカテーテルなどを用いて移植することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療、あるいは関節障害の治療などへ利用できる。

【0043】

同様に、神経系では、例えば体細胞からのリプログラミングによりドーパミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することによりパーキンソン病治療へ利用できる。また、例えばオリゴデンドロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脊髄損傷治療などへ利用できる。また、例えばニューロン前駆細胞やアストロサイト前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより運動神経障害の治療などへ利用できる。また、例えばＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉなどの分化マーカー発現で識別できる神経幹細胞や神経前駆細胞を得た場合には、これを患部へ直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより脳梗塞や脳出血治療などへ利用できる。

【0044】

同様に、動静脈などの血管／リンパ管系、心筋／平滑筋／骨格筋／オーバル細胞などの筋組織系、膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮／真皮／毛髪などの皮膚系、角膜などの視覚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用細胞を得ることもできる。例えば、腸系では、クリプト細胞などの腸前駆細胞を得た場合には、これをカテーテルなどで移植することにより、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症などの治療へ利用できる。視覚系では、例えば体細胞からリプログラミングにより網膜前駆細胞や網膜色素上皮細胞や視細胞を得た場合には、これを直接注入あるいは細胞シート化して移植することにより加齢黄斑変性症や網膜色素変性症の治療へ利用できる。膵臓系では、例えばβ細胞やインスリン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、糖尿病の治療へ利用できる。肝臓系では、例えばアルブミン産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療などへ利用できる。また、例えば血液凝固因子産生細胞を得た場合には、これをカテーテルなどであるいは免疫遮断デバイスに封入して移植することにより、大量出血を伴う外傷治療や血友病などの先天性遺伝病などへ利用できる。

【0045】

本発明に従ってリプログラミングした細胞はまた、治療用再生組織、器官、臓器の材料としての利用が可能である。例えば、心筋細胞、あるいはｉｓｌｅｔ−１遺伝子などを発現する心筋前駆細胞やｎｋｘ−２．５遺伝子、ｇａｔａ−４遺伝子などの心筋分化関連マーカー因子を発現する細胞を誘導し、これをカテーテルなどで直接移植する他、誘導した心筋細胞などをシート化／積層化して移植することにより、心筋梗塞などの心不全や拡張型心筋症などの心臓疾患に適用することができる。細胞のシート化／積層化は、例えば温度感受性培養皿などを利用して行うことができる。また、誘導した心筋細胞に加えて血管内皮細胞を混合して細胞シート化／積層化することにより、血管網が再構築された細胞積層シートを作ることができる。

【0046】

同様に、例えば脂肪細胞や骨髄細胞や血球細胞などの体細胞から間葉系幹細胞を得た場合、軟骨細胞を誘導し、これをカテーテルなどで直接移植する他、誘導した軟骨細胞などを高分子支持担体とともに移植することにより、軟骨や骨組織を再構築や関節障害の治療へ適用できる。同様に、例えば膵臓、肝臓、胃、腸などの消化器系、表皮／真皮／毛髪などの皮膚系、内耳などの聴覚系などにおける治療用組織を高分子支持担体などを利用して培養することにより得ることもできる。例えば、肝臓組織を誘導して得た場合は、肝癌、肝硬変、急性肝不全や、ヘモクロマトーシスなどの肝代謝障害の治療へ利用できる。平滑筋／骨格筋などの筋組織系を誘導して得た場合には、これを直接注入あるいはカテーテルなどを用いて移植することにより、筋ジストロフィー治療などへ利用できる。肺細胞組織を得た場合、これを患部へ移植することにより嚢胞性線維症や喘息などの肺呼吸器疾患治療へ利用できる。腎臓系では、メサンギウム細胞や尿細管上皮細胞、糸球体細胞など含む組織を得た場合、これを直接移植することにより、腎不全や腎炎の治療や透析治療などへ利用できる。動静脈などの血管／リンパ管系では、細胞シート化または高分子支持担体などを用いて血管を構築し、これを直接移植することにより、冠動脈大動脈バイパス移植などの心臓疾患治療、下肢虚血性疾患治療、虚血性心疾患治療などへ利用できる。

【0047】

さらに、本発明に従ってリプログラミングした細胞は、創薬研究ツールとしての利用が可能である。例えば、ヒト体細胞をリプログラミングしてヒト組織幹細胞やその前駆細胞、あるいはｉＰＳ細胞を得た場合には、これらの細胞を用いて目的の分化状態の細胞、または組織もしくは器官を誘導し、これを被検物質の薬効／毒性評価や作用メカニズムの解明、あるいは生物現象メカニズムの解析に用いることが可能である。

【0048】

また、本発明は、遺伝子組換え体製剤を製造する細胞への応用も可能である。すなわち、本発明のリプログラミング法により、ホルモン、代謝酵素などを産生する細胞を得た場合、これを治療用タンパク質の製造細胞とすることができる。例えば、肝臓系の、物質代謝が可能な細胞を得ることにより、アルブミン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、α１アンチトリプシンなどの代謝酵素産生細胞を作製し、産生した代謝酵素を直接注射するか点滴投与することにより、これらのタンパク質の欠乏症の治療に用いることができる。例えばβ細胞などの、物質代謝が可能な膵臓系の細胞を得ることにより、インスリン産生細胞を作製し、産生したインスリンを直接注射することにより、Ｉ型糖尿病の治療に用いることもできる。さらに、得られた細胞へ所望の外来遺伝子を導入することにより、遺伝子組換え体を付加する治療用タンパク質製剤の製造細胞とすることができる。同様に、産生タンパク質に機能付加したり分泌能力を高める機能遺伝子を細胞に導入することにより、該細胞の物質生産能力を高めることができる。

【0049】

本発明のエキソソームを含む組成物は、そのまま液剤として、または薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とともに適当な剤型の医薬組成物として製剤化することができる。ここで、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、賦形剤、溶剤（分散剤）、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、保存剤、抗酸化剤などの製剤添加物を用いることもできる。

【0050】

前記医薬組成物の剤形としては、例えば注射剤（例：皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、動脈内注射剤など）、点滴剤等の注入型製剤が挙げられる。

【0051】

医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。医薬組成物中のエキソソームの含量は、剤形、投与量などにより異なるが、例えば約０．０１〜約５０重量％である。投与は、経口投与、例えば母乳、経鼻投与、非経口投与、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮投与などである。

【0052】

以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されるものではない。

【実施例】

【0053】

（１）胎盤由来細胞採取
帝王切開の分娩により、ヒトの胎盤組織を得た。この胎盤組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。胎盤組織から外膜を除去し、メスや剃刀等を用いて組織を個片化した。胎盤組織１０ｇあたり４０ｍｌの３ｍｇ／ｍｌのコラーゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）を含有する溶液で、３７℃で６０分間の酵素処理を行った。その後、孔径１００μｍのストレイナーでフィルトレーションし、遠心分離装置で６００ｇ、５分間遠心分離し、その上清をアスピレートした。次に、胎盤組織１０ｇあたり３５ｍｌのＡＣＫバッファーで５分間、溶血処理し、胎盤組織１０ｇあたり３５ｍｌの３％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と５Ｕ／ｍｌヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）で溶血反応を止めた。さらに、遠心分離装置で６００ｇ、１５分間遠心分離し、その上清をアスピレートした。ＭＳＣＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ社）でペレットを再懸濁し、細胞数計測した。

【0054】

（２）コロニー形成
上記のようにして得られた胎盤由来細胞を、ＭＳＣＧＭ培地を含むφ１０ｃｍディッシュに８００個播種した（１４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）。３日おきに培地交換しながら２週間培養した。増殖してきた細胞をＣＦＣ（コロニー形成細胞）とした。

【0055】

（３）培養上清作製
上記のＣＦＣを定法に従い、φ１５ｃｍディッシュに２ｘ１０^６個播種した（１３，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）。７０％コンフルエントになったら、ＰＢＳで３回洗浄後、無血清ＤＭＥＭに培地交換した。その後、４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２、飽和水蒸気条件下でインキュベートした。４８時間経過後、培養上清を回収し、遠心分離装置で２０００ｇ、２０分間遠心分離し、その上清を回収し、孔径０．２μｍのフィルターでフィルトレーションすることにより、細胞成分を除去した。

【0056】

（４）エキソソーム調製
上記培養上清を遠心分離装置で１０，０００ｇ、３０分間遠心分離した後、さらにその上清を１００，０００ｇ、７０分間遠心分離した。このペレットをＰＢＳに懸濁し、さらに１００，０００ｇ、７０分間遠心分離した。このペレットを培養上清２０ｍｌあたり１００μｌのＰＢＳにサスペンドした。以上のようにしてエキソソーム１を製造した。

【0057】

また同様の手法において、（２）の工程でコロニー形成していないヒト胎盤由来細胞からエキソソームを抽出したものをエキソソーム２とし、コロニー形成していないヒト頭蓋冠骨芽細胞からエキソソームを抽出したものをエキソソーム３として調製した。

【0058】

上記のエキソソーム１について、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、歯根膜由来幹細胞をポジティブコントロールとして融解曲線分析法を行い、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子の定量化を試みた。エキソソーム１には、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子が実質的に含まれていないことが示唆され、Ｎａｎｏｇ遺伝子は含まれている可能性があることが示唆された（図１）。また、リアルタイムＰＣＲ産物を、アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色し、リアルタイムＰＣＲ産物のサイズを定性的に調べた（図２）。リアルタイムＰＣＲ産物のサイズから、エキソソーム１にはＯｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子が実質的に含まれず、Ｎａｎｏｇ遺伝子は含まれている可能性があることが示唆された。

【0059】

（５）ヒト皮膚線維芽細胞への添加実験
組織培養用６ウェルプレート（ＡＧＣ旭硝子）を準備し、このディッシュにヒト皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａより入手）を１×１０^５個ずつ播種した。２４時間後、ディッシュにエキソソーム１〜３をそれぞれ１００μｌずつ加えた（この時点を０日とする）。１日目および３日目のタイミングで、ｔｏｔａｌＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ）を用いて回収した。

【0060】

（６）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるヒト皮膚線維芽細胞中のｍＲＮＡの定量
上記ＲＮＡからＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ−２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡを定量した。

【0061】

（７）結果を図３〜５に示す。縦軸は、各遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量を示す。

【0062】

コロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを皮膚線維芽細胞に接触させることにより、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現が亢進することが確認された。一方、コロニー形成していなかったヒト胎盤由来細胞およびヒト頭蓋冠骨芽細胞から抽出したエキソソームを皮膚線維芽細胞に接触させても、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子およびＳｏｘ−２遺伝子の発現亢進は観察されなかった。また、コロニー形成した胎盤由来細胞から抽出されたエキソソームを接触させた皮膚線維芽細胞においては、ＴＥＲＴ遺伝子の発現量に変化は見られなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】