特許 6236086 １種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅおよび／またはＰｉｌＡを含むタンパク質成分とを含む免疫原性組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6236086

(24)【登録日】2017年11月2日

(45)【発行日】2017年11月22日

(54)【発明の名称】１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅおよび／またはＰｉｌＡを含むタンパク質成分とを含む免疫原性組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/09 20060101AFI20171113BHJP

   A61K 39/07 20060101ALI20171113BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20171113BHJP

   A61K 39/08 20060101ALI20171113BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20171113BHJP

   C07K 14/285 20060101ALN20171113BHJP

   C07K 14/315 20060101ALN20171113BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/09

   A61K39/07

   A61P31/04

   A61K39/08

   !C07K19/00ZNA

   !C07K14/285

   !C07K14/315

【請求項の数】21

【全頁数】106

(21)【出願番号】特願2015-537216(P2015-537216)

(86)(22)【出願日】2013年10月15日

(65)【公表番号】特表2015-536312(P2015-536312A)

(43)【公表日】2015年12月21日

(86)【国際出願番号】EP2013071472

(87)【国際公開番号】WO2014060383

(87)【国際公開日】20140424

【審査請求日】2016年9月16日

(31)【優先権主張番号】1218660.7

(32)【優先日】2012年10月17日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】61/714,942

(32)【優先日】2012年10月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/714,956

(32)【優先日】2012年10月17日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/826,696

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/826,932

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/827,203

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】305060279

【氏名又は名称】グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム

(74)【代理人】

【識別番号】100091096

【弁理士】

【氏名又は名称】平木 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100118773

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 節

(74)【代理人】

【識別番号】100122389

【弁理士】

【氏名又は名称】新井 栄一

(74)【代理人】

【識別番号】100111741

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 夏夫

(74)【代理人】

【識別番号】100169971

【弁理士】

【氏名又は名称】菊田 尚子

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】セディア，フランチェスカ

(72)【発明者】

【氏名】ハウスドルフ，ウィリアム ポール

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルラント，ヴィンセント

(72)【発明者】

【氏名】イスバアート，カリーヌ

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３１３３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５０００３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５２３７９０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／０９

Ａ６１Ｋ ３９／０７

Ａ６１Ｋ ３９／０８

Ａ６１Ｐ ３１／０４

Ｃ０７Ｋ １４／２８５

Ｃ０７Ｋ １４／３１５

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとタンパク質成分とを含み、そのタンパク質成分がインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅもしくはタンパク質Ｅの免疫原性断片およびＰｉｌＡもしくはＰｉｌＡの免疫原性断片を含む、免疫原性組成物。

【請求項2】

１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとタンパク質成分とを含み、そのタンパク質成分がインフルエンザ菌由来のタンパク質ＥおよびＰｉｌＡを含む、免疫原性組成物。

【請求項3】

タンパク質Ｅまたはタンパク質Ｅの免疫原性断片が、配列番号４とその全長にわたって少なくとも７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むポリペプチドである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

タンパク質Ｅの免疫原性断片が、配列番号４の少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５または１００個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

ＰｉｌＡまたはＰｉｌＡの免疫原性断片が、配列番号５８とその全長にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の同一性を有する配列を含むポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

ＰｉｌＡまたはＰｉｌＡの免疫原性断片が、配列番号５８の少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含むポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

ＰｉｌＡまたはＰｉｌＡの免疫原性断片と共有結合により連結されて融合タンパク質を形成するタンパク質Ｅまたはタンパク質Ｅの免疫原性断片を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記融合タンパク質が
式Ｉ：
（Ｘ）ｍ−（Ｒ１）ｎ−Ａ−（Ｙ）ｏ−Ｂ−（Ｚ）ｐ （式Ｉ）
を有し、式中、
Ｘは、シグナルペプチドまたはＭＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）であり；
ｍは、０であり；
Ｒ１は、アミノ酸であり；
ｎは、０であり；
Ａは、タンパク質Ｅの免疫原性断片であり、ここでタンパク質Ｅが配列番号４〜配列番号５７のいずれか１つから選択される；
Ｙは、ＧＧであり；
ｏは、０または１であり；
Ｂは、ＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ここでＰｉｌＡが配列番号５８〜配列番号１２１のいずれか１つから選択される；
Ｚは、ＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）であり；かつ
ｐは、０または１である、
請求項７に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記融合タンパク質が、配列番号１９４である、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記融合タンパク質が、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２または配列番号２０４のいずれかと少なくとも９５％、９８％または９９％同一である、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

シグナルペプチドが除去されている、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートがコンジュゲートされた血清型１糖類、コンジュゲートされた血清型４糖類、コンジュゲートされた血清型５糖類、コンジュゲートされた血清型６Ｂ糖類、コンジュゲートされた血清型７Ｆ糖類、コンジュゲートされた血清型９Ｖ糖類、コンジュゲートされた血清型１４糖類、コンジュゲートされた血清型１８Ｃ糖類、コンジュゲートされた血清型１９Ｆ糖類およびコンジュゲートされた血清型２３Ｆ糖類を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートがコンジュゲートされた血清型６Ａ糖類およびコンジュゲートされた血清型１９Ａ糖類をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートがコンジュゲートされた血清型３３Ｆ糖類およびコンジュゲートされた血清型２２Ｆ糖類をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートが、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのＣ断片、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７（交差反応物質１９７）、ニューモリシン、タンパク質Ｄ（インフルエンザ菌由来）、ＰｈｔＤ（ポリヒスチジントライアドＤ）、ＰｈｔＤＥ（肺炎球菌ヒスチジントライアドＤとＥの間の融合物）およびＮ１９からなる群から独立に選択される担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記１種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートが、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型１糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型４糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型５糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型６Ｂ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型７Ｆ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型９Ｖ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型１４糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型２３Ｆ糖類、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型１８Ｃ糖類およびジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた血清型１９Ｆ糖類を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

免疫原性組成物がさらに、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断型、ＬｙｔＸ（自己分解酵素）ファミリー、ＬｙｔＸ末端切断型、ＣｂｐＸ末端切断型−ＬｙｔＸ末端切断型キメラタンパク質、ＰｃｐＡ（肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ）、ＰｓｐＡ（肺炎球菌表面タンパク質Ａ）、ＰｓａＡ（肺炎球菌表面アドヘシンＡ）、Ｓｐ１２８（肺炎球菌１２８）、Ｓｐ１０１（肺炎球菌１０１）、Ｓｐ１３０（肺炎球菌１３０）、ＳＰ１２５（肺炎球菌１２５）およびＳＰ１３３（肺炎球菌１３３）からなる群から選択される少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と薬学上許容される賦形剤とを含むワクチン。

【請求項19】

肺炎球菌感染またはインフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物または請求項１８に記載のワクチンであって、該疾患が、肺炎、浸潤性肺炎球菌性疾患（ＩＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、中耳炎、髄膜炎、菌血症、および結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患を含む、上記免疫原性組成物またはワクチン。

【請求項20】

融合タンパク質が、シグナルペプチドが除去されている配列番号１４８、すなわち、配列番号１７７ (QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ)である、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

融合タンパク質が、シグナルペプチドが除去されている配列番号１９４、すなわち、配列番号２１９ (IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQ IVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ) である、請求項７または８に記載の免疫原性組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、１種以上の肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜糖類コンジュゲートとタンパク質成分とを含み、そのタンパク質成分がインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)由来のタンパク質Ｅおよび／またはＰｉｌＡを含む、免疫原性組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

無莢膜型インフルエンザ菌(non-typeable Haemophilus influenzae)（ＮＴＨｉ）は、乳幼児および小児に中耳炎を引き起こす重要かつ一般的な呼吸器系の病原体である。ＮＴＨｉは、肺炎球菌に次いで、小児における急性中耳炎の最も多い原因である(J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004))。ＮＴＨｉは、小児および成人における副鼻腔炎の重要な原因である(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。ＮＴＨｉは、成人における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪のリスク上昇と関連付けられている(Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006))。さらに、無莢膜型インフルエンザ菌は、成人に市中肺炎を引き起こし、発展途上国では小児に肺炎を引き起こし得る(Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009))。

【0003】

肺炎球菌(S. pneumoniae)は、肺炎球菌(pneumococcus)としても知られるグラム陽性細菌である。肺炎球菌は世界の至る所で大きな公衆衛生問題であり、特に、乳幼児、高齢者および免疫不全者の間では相当な罹患および死亡の原因となっている。肺炎球菌は、市中肺炎、急性副鼻腔炎、中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、骨髄炎、敗血性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、蜂巣炎、および脳膿瘍を含む、広範囲の重要なヒト病態を引き起こす。肺炎球菌は、米国だけで、年間、３，０００症例の髄膜炎、５０、０００症例の菌血症、５００，０００症例の肺炎、および７，０００，０００症例の中耳炎の病原となっていると推計される(Reichler, M. R. et al., 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346; Stool, S. E. and Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11)。肺炎球菌性疾患による死亡率は、先進国および発展途上国の両方で、５歳未満の小児において特に高い。高齢者、免疫不全者および他の基礎病態（糖尿病、喘息）を有する患者も特に罹患しやすい。

【0004】

肺炎球菌により引き起こされる主要な臨床症候群は広く認識されており、標準的な医学の教科書に記述されている(Fedson D S, Muscher D M. In: Plotkin S A, Orenstein W A, editors. Vaccines. 第4版. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588)。例えば、浸潤性肺炎球菌性疾患(Invasive pneumococcal diseas)（ＩＰＤ）は、肺炎球菌が血液または通常無菌である別の部位から単離された場合の感染と定義される(Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (編). Principles and Practice of Infectious diseases (第5版). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147)。

【0005】

慢性閉塞性肺疾患は、肺の慢性炎症性疾患であり、世界の罹患および死亡の主因である。米国では２００５年におよそ死者２０人に１人が基礎原因としてＣＯＰＤを有していた(Drugs and Aging 26:985-999 (2009))。２０２０年にはＣＯＰＤは、障害調整生命年、慢性無効化疾患の主因の第５位、そして最も重大な死因の第３位に浮上すると予想される(Lancet 349:1498-1504 (1997))。

【0006】

よって、肺炎球菌およびインフルエンザ菌に対する組合せワクチンの必要がある。

【0007】

タンパク質Ｅ（ＰＥ）は、接着特性を有する外膜リポタンパク質である。ＰＥは、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）の上皮細胞への接着／浸潤に役割を果たす(J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008))。ＰＥは、有莢膜型インフルエンザ菌と無莢膜型インフルエンザ菌の両方で保存性が高く、保存された上皮結合ドメインを有する(The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010))。参照株としてのインフルエンザ菌Ｒｄと比較して、異なるヘモフィルス種には１３の異なる点突然変異が記載されている。その発現は対数増殖期の細菌と静止期の細菌の両方で見られる（国際公開第２００７／０８４０５３号）。

【0008】

タンパク質Ｅはまた、結合ビトロネクチンを介したヒト補体抵抗性にも関与している(Immunology 183: 2593-2601 (2009))。ＰＥは、結合ドメインＰＫＲＹＡＲＳＶＲＱ ＹＫＩＬＮＣＡＮＹＨ ＬＴＱＶＲ（配列番号１、配列番号４のアミノ酸８４〜１０８に相当）により、終末補体経路の重要な阻害剤であるビトロネクチンと結合する(J. Immunology 183:2593-2601 (2009))。

【0009】

ピリン(Pilin)Ａ（ＰｉｌＡ）は、おそらくツイッティング運動(twitching motility)に関与するインフルエンザ菌ＩＶ型Ｐｉｌｕｓ（Ｔｆｐ）繊毛の主要ピリンサブユニットであると思われる(Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005))。ＮＴＨｉ ＰｉｌＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで発現される保存されたアドヘシンである。ＮＴＨｉの接着、定着およびバイオフィルム形成に関与することが示されている(Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007))。

【0010】

本発明者らは、ＰｉｌＡおよびＰＥはインフルエンザ菌を回避するための免疫原性組成物中に有利に存在し得ること、およびさらに、インフルエンザ菌および肺炎球菌感染を予防し得る免疫原性組成物を提供するために、肺炎球菌莢膜糖類を含む組成物にＰｉｌＡおよびタンパク質Ｅを添加することができることを見出した。当業者ならば、担体により誘導されるエピトープ的抑制の効果に気づくであろうし、一般に複数のコンジュゲート抗原に同時に曝されると免疫応答の増強か低減のいずれかが起こり得ることを知っているであろう(Plotkin et al, Vaccines fourth addition 2003)。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】国際公開第２００７／０８４０５３号

【非特許文献】

【0012】

【非特許文献1】J. Immunology 183: 2593-2601 (2009)

【非特許文献2】Pediatrics 113:1451-1465 (2004)

【非特許文献3】Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)

【非特許文献4】Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)

【非特許文献5】Reichler, M. R. et al., 1992, J. Infect. Dis. 166: 1346

【非特許文献6】Stool, S. E. and Field, M. J., 1989 Pediatr. Infect. Dis J. 8: S11

【非特許文献7】Fedson D S, Muscher D M. In: Plotkin S A, Orenstein W A, editors. Vaccines. 第4版. Philadelphia WB Saunders Co, 2004a: 529-588

【非特許文献8】Musher D M. Streptococcus pneumoniae. In Mandell G L, Bennett J E, Dolin R (編). Principles and Practice of Infectious diseases (第5版). New York, Churchill Livingstone, 2001, p 2128-2147

【非特許文献9】Drugs and Aging 26:985-999 (2009)

【非特許文献10】Lancet 349:1498-1504 (1997)

【非特許文献11】The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009)

【非特許文献12】Microbes and Infection 10:87-96 (2008)

【非特許文献13】The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010)

【非特許文献14】Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)

【非特許文献15】Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)

【非特許文献16】Plotkin et al, Vaccines fourth addition 2003

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

簡単な概要
本発明者らは、肺炎球菌由来のＰｉｌＡ、ＰＥ（またはその断片）および糖類が、インフルエンザ菌および肺炎球菌に対する効果的な防御を提供するために免疫原性組成物中で有利に配合可能なことを見出した。

【0014】

よって、第１の態様において、１種以上（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種）の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとタンパク質成分とを含み、そのタンパク質成分がインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅもしくはタンパク質Ｅの免疫原性断片および／またはＰｉｌＡ（もしくはＰｉｌＡの免疫原性断片）を含む免疫原性組成物が提供される。

【0015】

第２の態様において、本発明の免疫原性組成物と薬学上許容される賦形剤とを含むワクチンが提供される。

【0016】

第３の態様において、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法であって、前記対象に治療上有効な用量の本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチン投与することを含む方法が提供される。

【0017】

第４の態様において、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法であって、前記対象に治療上有効な用量の本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチンを投与することを含む方法が提供される。

【0018】

第５の態様において、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチンが提供される。

【0019】

第６の態様において、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチンが提供される。

【0020】

第７の態様において、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチンの使用が提供される。

【0021】

第８の態様において、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物または本発明のワクチンの使用が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９に関する誘導細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。誘導（ｉｎｄ）前後のＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９に関して不溶性画分（Ｉ）、可溶性画分（Ｓ）および培養培地画分（Ｍ）をロードした。

【図2】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９の精製抽出物に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９の精製に関して、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分（Ｗ）および溶出画分（Ｅ）をロードした。抗ｈｉｓタグを抽出物のプローブに用いた。

【図3】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１およびＬＶＬ３１５に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＬＶＬ２９１およびＬＶＬ３１５に関して培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓｏｌ）、不溶性画分（Ｉｎｓ）、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分＃１（Ｗ１）、洗浄画分＃２（Ｗ２）および溶出画分（Ｅ）をロードした。

【図4】融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１２に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。ＬＶＬ３１２に関する培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓｏｌ）、不溶性画分（Ｉｎｓ）、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分＃１（Ｗ１）、洗浄画分＃２（Ｗ２）および溶出画分（Ｅ）をロードした。

【図5】融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１７に関する誘導（１ｍＭおよび１０μＭ ＩＰＴＧ）細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。誘導前（ＮＩ）および誘導後（Ｉｎ）、可溶性画分（Ｓ）、不溶性画分（Ｉ）由来の抽出物。

【図6】融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１８に関する誘導（１ｍＭおよび１０μＭ ＩＰＴＧ）細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。誘導（Ｉｎ）前後、培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓ）、不溶性画分（Ｉ）由来の抽出物。

【図7】ＰＥ、ＰｉｌＡおよびＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質のＣＤスペクトル。

【図8】ＰＥおよびＰｉｌＡ ＣＤスペクトルの組合せ。

【図9】ＰｉｌＡの熱変性曲線。

【図10】ＰＥの熱変性曲線。

【図11】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の熱変性曲線。

【図12】典型的なＳＰセファロース（商標）ファーストフロークロマトグラム。

【図13】典型的なＱセファロース（商標）ファーストフロークロマトグラム。

【図14】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の精製プロセスからのインプロセスサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。

【図15】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質からの精製プロセスのインプロセスサンプルのウエスタンブロット。ウサギポリクローナル抗ＰＥを用いたブロット。

【図16】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質からの精製プロセスのインプロセスサンプルのウエスタンブロット。ウサギポリクローナル抗大腸菌(E.coli)（ＢＬＲ）を用いたブロット。

【図17】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質およびＰＥおよびＰｉｌＡタンパク質の温度遷移。曲線：ＰｉｌＡ（１）、タンパク質Ｅ（Ｐｒｏｔ Ｅ、ＰＥ）（２）、ＰＥ−ＰｉｌＡ精製バルク無希釈液７３７μｇ／ｍｌ（３）、および最終容器濃度６０μｇ／ｍｌのＰＥ−ＰｉｌＡ精製バルク希釈液（４）。

【図18】Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質ならびに一価ＰＥおよびＰｉｌＡに対する抗体応答。

【図19】マウス鼻咽頭における８６−０２８ＮＰ細菌株のクリアランスに対するＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質接種の効果。

【図20】マウス鼻咽頭におけるＮＴＨｉ ３２２４Ａ細菌株のクリアランスに対するＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質接種の効果。

【図21】マウス鼻咽頭における細菌クリアランスに対するＰｉｌＡ接種の効果。

【図22】マウス鼻咽頭における細菌クリアランスに対するＰＥ接種の効果。

【図23】（ａ）ビトロネクチンに対するＬＶＬ３１７ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の結合および（ｂ）ＬＶＬ３１７およびビトロネクチンに対するＬＶＬ７３５ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の結合。

【図24】ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質に対するポリクローナル抗体によるビトロネクチン結合の阻害。

【図25a】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ７０２、ＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９、ＬＶＬ７４０およびｐＥＴ２６ｂベクター（陰性対照）に関する誘導細菌抽出物の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ａ）実験１。ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質は矢印で示す。

【図25b】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ７０２、ＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９、ＬＶＬ７４０およびｐＥＴ２６ｂベクター（陰性対照）に関する誘導細菌抽出物の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｂ）実験２。ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質は矢印で示す。

【図25c】融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ７０２、ＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９、ＬＶＬ７４０およびｐＥＴ２６ｂベクター（陰性対照）に関する誘導細菌抽出物の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（ｃ）実験３。ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質は矢印で示す。

【図26】実験１、２および３からの可溶性画分における融合タンパク質の平均バンドパーセンテージ。

【図27】ＬＶＬ３１７およびＬＶＬ７３５に対するＰＥおよびＰｉｌＡ抗体応答。

【図28】無莢膜型インフルエンザ菌鼻咽頭定着のマウスモデルにおける細菌クリアランスに対するＬＶＬ７３５およびＬＶＬ３１７接種の効果。

【図29】マウス注射後に抗糖類ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した１２の糖類コンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、１２の糖類コンジュゲートを含む組成物（１２Ｖ）および１０の糖類コンジュゲートを含む組成物（１０Ｖ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。ＩＣ＝信頼区間。

【図30】マウス注射後にオプソニン化貪食作用アッセイを用いて測定した１２の糖類コンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、１２の糖類コンジュゲートを含む組成物（１２Ｖ）および１０の糖類コンジュゲートを含む組成物（１０Ｖ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＴ＝幾何平均力価。

【図31】マウス注射後に抗タンパク質ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した１２のコンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡのみを含む組成物（ｐｒｏｔ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。ＩＣ＝信頼区間。

【図32】モルモット注射後にオプソニン化貪食作用アッセイを用いて測定した１２の糖類コンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、１２の糖類コンジュゲートを含む組成物（１２Ｖ）および１０の糖類コンジュゲートを含む組成物（１０Ｖ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＴ＝幾何平均力価。

【図33】モルモット注射後に抗糖類ＥＬＩＳＡを用いて測定した１２の糖類コンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、１２の糖類コンジュゲートを含む組成物（１２Ｖ）および１０の糖類にコンジュゲートを含む組成物（１０Ｖ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。ＩＣ＝信頼区間。

【図34】モルモット注射に抗タンパク質ＥＬＩＳＡを用いて測定した１２の糖類コンジュゲート、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを含む組成物（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）と、ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡのみを含む組成物（ｐｒｏｔ）の免疫原性を比較したグラフ。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。ｉｃ＝信頼区間。

【発明を実施するための形態】

【0023】

詳細な説明
第１の態様において、本発明は、１種以上（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種）の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとタンパク質成分とを含み、そのタンパク質成分がインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅ（もしくはその免疫原性断片）および／またはＰｉｌＡ（もしくはその免疫原性断片）を含む免疫原性組成物に関する。

【0024】

用語「タンパク質成分」は、タンパク質Ｅ（もしくはその免疫原性断片）および／またはＰｉｌＡ（もしくはその免疫原性断片）を含むアミノ酸の配列に関し、前記タンパク質成分は、タンパク質Ｅ単独、ＰｉｌＡ単独、タンパク質Ｅの免疫原性断片単独、ＰｉｌＡの免疫原性断片単独、タンパク質ＥとＰｉｌＡ、タンパク質Ｅの免疫原性断片とＰｉｌＡ、タンパク質Ｅの免疫原性断片とＰｉｌＡの免疫原性断片またはタンパク質ＥとＰｉｌＡの免疫原性断片を（例えば、融合タンパク質として）含み得る。前記タンパク質成分は、付加的配列をさらに含んでよい。
タンパク質Ｅ
本明細書で使用する場合、「タンパク質Ｅ(Protein E)」、「タンパク質Ｅ(protein E)」、「Ｐｒｏｔ Ｅ」、および「ＰＥ」は、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅを意味する。タンパク質Ｅは、配列番号４(MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK）のアミノ酸配列ならびに配列番号４とその全長にわたって少なくともまたは正確に７５％、７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％もしくは１００％の同一性を有する配列からなり得るか、または前記配列を含み得る。インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの５３配列（表１の配列番号５〜配列番号５７）を比較したところ、配列番号４で示されるタンパク質Ｅとおよそ７７％〜およそ１００％の同一性が示された。例えば、タンパク質Ｅのアミノ酸配列では、アミノ酸＃２０はイソロイシン（Ｉ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃２３はアラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）であり得；アミノ酸＃２４はリシン（Ｋ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり得；アミノ酸＃３１はアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃３２はプロリン（Ｐ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃３４はトレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃３７はアルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり得；アミノ酸＃４７はバリン（Ｖ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃５７はトリプトファン（Ｗ）であり得るか、または不在（−）であり得；アミノ酸＃７０はアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃９３はグルタミン（Ｑ）または不在（−）であり得；アミノ酸＃１０９はトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）であり得；アミノ酸＃１１９はグリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）であり得；アミノ酸＃１５３はグルタミン酸（Ｅ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃１５６はセリン（Ｓ）またはロイシン（Ｌ）であり得；アミノ酸＃１６０はリシン（Ｋ）またはアスパラギン（Ｎ）であり得；アミノ酸＃１６１はリシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）または不在（−）であり得；アミノ酸＃１６２〜＃１９５は不在であり得るか、または配列番号１５（（−）はアミノ酸＃１６６が不在であることを示す）で示される通り、もしくは配列番号１６で示される通りであり得；またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0025】

タンパク質Ｅは、アミノ酸＃２０、アミノ酸＃２３、アミノ酸＃２４、アミノ酸＃３１、アミノ酸＃３２、アミノ酸＃３４、アミノ酸＃３７、アミノ酸＃４７、アミノ酸＃５７、アミノ酸＃７０、アミノ酸＃９３、アミノ酸＃１０９、アミノ酸＃１１９、アミノ酸＃１５３、アミノ酸＃１５６、アミノ酸＃１６０、アミノ酸＃１６１およびアミノ酸＃１６２〜＃１９５からなる群から選択されるいずれか１以上のアミノ酸が配列番号４と異なるアミノ酸配列からなり得るか、または前記配列を含み得、ここで、アミノ酸＃２０はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃２３はバリン（Ｖ）であり；アミノ酸＃２４はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃３１はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃３２はアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃３４はアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃３７はグルタミン（Ｑ）であり；アミノ酸＃４７はアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃５７は不在（−）であり；アミノ酸＃７０はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃９３は不在（−）であり；アミノ酸＃１０９はイソロイシン（Ｉ）であり；アミノ酸＃１１９はセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃１５３はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃１５６はロイシン（Ｌ）であり；アミノ酸＃１６０はアスパラギン（Ｎ）であり；アミノ酸＃１６１はリシン（Ｋ）またはイソロイシン（Ｉ）であり；またはアミノ酸＃１６２〜＃１９５は配列番号１５（（−）はアミノ酸＃１６６が不在であることを示す）で示されるか、または配列番号１６で示される。

【0026】

【表1】

タンパク質Ｅは、インフルエンザ菌株３２２４Ａ、ＲｄＫＷ２０、８６−０２８ＮＰ、Ｒ２８４６、Ｒ２８６６、３６５５、ＰｉｔｔＡＡ、ＰｉｔｔＥＥ、ＰｉｔｔＨＨ、ＰｉｔｔＩＩ、Ｒ３０２１、２２．４−２１、３２１９Ｃ、３１８５、３２４１Ａ、０３８１４４Ｓ１、８１０９５６、８２１２４６、８４０６４５、９０２５５０Ｚ１９、Ａ８４０１７７、Ａ８６０５１４、Ａ９５００１４、３０６５４３Ｘ４、Ａ９３０１０５、９０１９０５Ｕ、Ａ９２００３０、３２２１Ｂ、２７Ｗ１１６７９１Ｎ、Ｎ２１８、Ｎ１６３、Ｎ１６２、Ｎ１０７、Ｎ９１、Ｄ２１１ＰＧ、Ｄ２１１ＰＤ、Ｄ２０１ＰＧ、Ｄ２０１ＰＤ、Ｄ１９８ＰＧ、Ｄ１９８ＰＤ、Ｄ１９５ＰＤ、Ｄ１８９ＰＧ、Ｄ１８９ＰＤ、Ｄ１２９ＣＧ、Ｄ１２４ＰＧ、Ｄ１２４ＰＤ、Ｄ５８ＰＧ、Ｄ３３ＯＤ、ＢＳ４３３、ＢＳ４３２、１７１４、１１２８またはＢＳ４３０由来のタンパク質Ｅであり得る。タンパク質Ｅは、配列番号５〜配列番号５７のいずれかで示されるタンパク質Ｅであり得る。

【0027】

タンパク質Ｅは、配列番号４〜配列番号５７のいずれかとその全長にわたって少なくとも９５％または９８％、９９％の同一性を有する配列であり得る。タンパク質Ｅは、表１の配列番号５〜配列番号５７で示される配列のいずれかとその全長にわたって少なくとも９５％の同一性を有する配列であり得る。

【0028】

タンパク質Ｅの免疫原性断片は、配列番号４の少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。一実施形態では、前記断片は、タンパク質Ｅの１５０、１２５、１００、７５、または個未満のアミノ酸であり、例えば、一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、タンパク質Ｅの１５０、１２５、１００、７５または６０個未満のアミノ酸を含む。前記免疫原性断片は、配列番号４と結合することができる抗体を惹起し得る。前記免疫原性断片は、配列番号４のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含み得る。

【0029】

タンパク質Ｅの免疫原性断片は、配列番号４〜配列番号５７のいずれかの少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含み得る。前記免疫原性断片は、その断片が由来する全長配列と結合することができる抗体を惹起し得る。前記免疫原性断片は、配列番号４〜配列番号５７のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含み得る。一実施形態では、タンパク質Ｅの免疫原性断片は、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）および配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）からなる群から選択される。別の実施形態では、タンパク質Ｅの免疫原性断片は、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択される。さらなる実施形態では、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片は、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択される。より具体的には、一実施形態では、前記免疫原性断片は、配列番号１２４、すなわち、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０である。さらなる実施形態では、前記免疫原性断片は、配列番号１２５、すなわち、配列番号５のアミノ酸２０〜１６０である。別の実施形態では、前記免疫原性断片は、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択される、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。

【0030】

タンパク質Ｅは、１００を超える臨床ＮＴＨｉ単離株、莢膜型インフルエンザ菌、および分析されたカルチャーコレクション株の間で保存されていることが報告されている(Singh et al, J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010))、上皮細胞結合領域（PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR、配列番号１２８）を含有する。Ｓｉｎｇｈらは、タンパク質ＥがＮＴＨｉおよび莢膜型インフルエンザ菌の両方で保存性が高かったことを報告している（シグナルペプチドを除いて９６．９％〜１００％の同一性）。一実施形態では、タンパク質Ｅの断片は、配列番号１２８(PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR）の結合領域を含む。
タンパク質Ｅ−配列番号４
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１７〜１６０−配列番号１２２
SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１８〜１６０−配列番号１２３
AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１９〜１６０−配列番号１２４
QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２０〜１６０−配列番号１２５
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２２〜１６０−配列番号１２６
KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２３〜１６０−配列番号１７９
AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２４〜１６０−配列番号１８０
EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
一実施形態では、タンパク質Ｅまたはその免疫原性断片は、配列番号４を認識する免疫応答を惹起し得る。第１のタンパク質が第２のタンパク質を認識する免疫応答を惹起し得るかどうかはＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、実施例２２の記載のＥＬＩＳＡ）を用いて判定することができる。
ＰｉｌＡ
本明細書で使用する場合、「ＰｉｌＡ」は、インフルエンザ菌由来のピリンＡを意味する。ＰｉｌＡは、配列番号５８(MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ)のタンパク質配列ならびに配列番号５８と８０％〜１００％の同一性を有する配列からなり得るか、または前記配列を含み得る。例えば、ＰｉｌＡは、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または１００％同一であり得る。インフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの６４の配列（表２の配列番号５８〜配列番号１２１）の全長比較によれば、配列番号５８で示されるＰｉｌＡとおよそ８０％〜１００％の同一性が示された。例えば、ＰｉｌＡのアミノ酸配列では、アミノ酸＃６はグルタミン（Ｑ）またはロイシン（Ｌ）であり得；アミノ酸＃７はグルタミン（Ｑ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃３７はグルタミン（Ｑ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃はアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）であり得；アミノ酸＃５７はアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）であり得；アミノ酸＃６７はアスパラギン（Ｎ）またはグリシン（Ｇ）であり得；アミノ酸＃６８はグルタミン酸（Ｅ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃６９はトレオニン(threonine)（Ｔ）またはプロリン（Ｐ）であり得；アミノ酸＃７１はリシン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃７３はトレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）またはメチオニン（Ｍ）であり得；アミノ酸＃７６はリシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）であり得；アミノ酸＃８４はトレオニン（Ｔ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃８６はアラニン（Ａ）またはバリン（Ｖ）であり得；アミノ酸＃９１はリシン（Ｋ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃９４はトレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃９６はセリン（Ｓ）またはグルタミン（Ｑ）であり得；アミノ酸＃９７はアスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり得アミノ酸＃９９はアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）であり得；アミノ酸＃１０３はアラニン（Ａ）またはリシン（Ｋ）であり得；アミノ酸＃１０９はアスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃１１０はグリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得；アミノ酸＃１１２はセリン（Ｓ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり得；アミノ酸＃１１４はトレオニン（Ｔ）またはイソロイシン（Ｉ）であり得；アミノ酸＃１１６はトレオニン（Ｔ）またはグルタミン（Ｑ）であり得；アミノ酸＃１１８はグルタミン酸（Ｅ）、トレオニン（Ｔ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）またはセリン（Ｓ）であり得；アミノ酸＃１２１はセリン（Ｓ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃１２２はアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃１２３はリシン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）またはアラニン（Ａ）であり得；アミノ酸＃１２８はリシン（Ｋ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃１３５はアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）であり得；アミノ酸＃１３６はアラニン（Ａ）またはトレオニン（Ｔ）であり得；アミノ酸＃１４５はグリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）であり得；アミノ酸＃１４９はグルタミン（Ｑ）またはリシン（Ｋ）であり得；またはそれらの任意の組合せであり得る。

【0031】

ＰｉｌＡは、アミノ酸＃６、アミノ酸＃７、アミノ酸＃３７、アミノ酸＃４４、アミノ酸＃５７、アミノ酸＃６７、アミノ酸＃６８、アミノ酸＃６９、アミノ酸＃７１、アミノ酸＃７３、アミノ酸＃７６、アミノ酸＃８４、アミノ酸＃８６、アミノ酸＃９１、アミノ酸＃９４、アミノ酸＃９６、アミノ酸＃９７、アミノ酸＃９９、アミノ酸＃１０３、アミノ酸＃１０９、アミノ酸＃１１０、アミノ酸＃１１２、アミノ酸＃１１４、アミノ酸＃１１６、アミノ酸＃１１８、アミノ酸＃１２１、アミノ酸＃１２２、アミノ酸＃１２３、アミノ酸＃１２８、アミノ酸＃１３５、アミノ酸＃１３６、アミノ酸＃１４５およびアミノ酸＃１４９からなる群から選択されるいずれか１以上のアミノ酸が配列番号５８と異なるアミノ酸配列からなり得るか、または前記配列を含み得、ここで、アミノ酸＃６はロイシン（Ｌ）であり；アミノ酸＃７はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃３７はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃４４はセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃５７はセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃６７はグリシン（Ｇ）であり；アミノ酸＃６８はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃６９はプロリン（Ｐ）であり；アミノ酸＃７１はリシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃７３はセリン（Ｓ）またはメチオニン（Ｍ）であり；アミノ酸＃７６はセリン（Ｓ）またはアスパラギン（Ｎ）であり；アミノ酸＃８４はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃８６はバリン（Ｖ）であり；アミノ酸＃９１はアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃９４はイソロイシン（Ｉ）またはリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃９６はグルタミン（Ｑ）であり；アミノ酸＃９７はセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃９９はグリシン（Ｇ）であり；アミノ酸＃１０３はアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃１０９はアスパラギン酸（Ｄ）またはトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃１１０はグリシン（Ｇ）またはアルギニン（Ｒ）であり；アミノ酸＃１１２はセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃１１４はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃１１６はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃１１８はグルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）、リシン（Ｋ）またはセリン（Ｓ）であり；アミノ酸＃１２１はセリン（Ｓ）；アミノ酸＃１２２はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃１２３はリシン（Ｋ）またはアラニン（Ａ）であり；アミノ酸＃１２８はリシン（Ｋ）であり；アミノ酸＃１３５はグルタミン酸（Ｅ）であり；アミノ酸＃１３６はトレオニン（Ｔ）であり；アミノ酸＃１４５はアルギニン（Ｒ）であり；アミノ酸＃１４９はリシン（Ｋ）である。

【0032】

【表2】

ＰｉｌＡは、インフルエンザ菌株ＮＴＨｉ３２１９Ｃ、ＮＴＨｉ３２２４Ａ、ＮＴＨｉ１２、ＮＴＨｉ４４、ＮＴＨｉ６７、１０５４ＭＥＥ、１７２９ＭＥＥ、１７２８ＭＥＥ、１８８５ＭＥＥ、１０６０ＭＥＥ、ＲｄＫＷ２０、２１４ＮＰ、１２３６ＭＥＥ、１７１４ＭＥＥ、１１２８ＭＥＥ、８６−０２８ＮＰ、Ｒ２８４６、Ｒ２８６６、３６５５、ＰｉｔｔＡＡ、ＰｉｔｔＧＧ、ＰｉｔｔＩＩ、Ｒ３０２１、２２．４−２１、３１８５Ａ、３２２１Ｂ、３２４１Ａ、０３８１４４Ｓ１、８２１２４６、８４０６４５、９０２５５０Ｚ１９、Ａ８４０１７７、Ａ９２００３０、Ａ９５００１４、９０１９０５Ｕ、Ａ９２００２９、Ａ９３０１０５、３０６５４３Ｘ４、Ｎ２１８、Ｎ１６３、Ｎ１６２、Ｎ１２０、Ｎ１０７、Ｎ９２、Ｎ９１、Ｄ２１９ＰＧ、Ｄ２１１ＰＧ、Ｄ２１１ＰＤ、Ｄ２０４ＣＤ、Ｄ１９８ＰＧ、Ｄ１９８ＰＤ、Ｄ１９５ＰＤ、Ｄ１９５ＣＤ、Ｄ１８９ＰＧ、Ｄ１８９ＰＤ、Ｄ１２４ＰＧ、Ｄ１２４ＰＤ、Ｄ１２４ＣＧ、Ｄ５８ＰＧ、ＢＳ４３３、ＢＳ４３２、ＢＳ４３０、１７１４または１１２８由来のＰｉｌＡであり得る。インフルエンザ菌株Ｄ２０４ＣＤ由来のＰｉｌＡのアミノ酸配列は配列番号１０６で示され、ここで、Ｘの＃１１６の位置はグルタミン（Ｑ）またはロイシン（Ｌ）のいずれかであり；＃１１６の位置におけるアミノ酸についての曖昧さは、アミノ酸＃１１６をコードする第２のヌクレオチドの、Ｄ２０４ＣＤ株のＰｉｌＡ配列を明らかにする技術的解決によって明瞭にすることができる。ＰｉｌＡは、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかで示されるＰｉｌＡであり得る。

【0033】

ＰｉｌＡは、配列番号５８〜配列番号１２１（表２に示される通り）のいずれかとその全長にわたって少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有する配列であり得る。

【0034】

ＰｉｌＡの免疫原性断片は、配列番号〜配列番号１２１の少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。免疫原性断片は、その断片が由来する全長配列と結合することができる抗体を惹起し得る。前記免疫原性断片は、配列番号５８〜配列番号１２１のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含み得る。

【0035】

例えば、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、配列番号５８の少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の連続するアミノ酸の免疫原性断片を含む。一実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、ＰｉｌＡの１５０、１２５、１００、７５、または６０個未満のアミノ酸を含み、さらなる実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性組成物は、１５０、１２５、１００、７５または６０個未満のアミノ酸を含む。免疫原性断片は、配列番号５８と結合することができる抗体を惹起し得る。免疫原性断片は、配列番号５８のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含み得る。

【0036】

一実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、ＰｉｌＡが配列番号５８である、インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来の断片である。

【0037】

インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡ−配列番号５８
MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQL
別の実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、配列番号１２７とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。より具体的には、一実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、配列番号１２７、すなわち、配列番号５８のアミノ酸４０〜１４９からなる断片である。

【0038】

インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡのアミノ酸４０〜１４９−配列番号１２７
T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ
別の実施形態では、ＰｉｌＡの免疫原性断片は、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかに由来のアミノ酸４０〜１４９からなる。さらなる実施形態では、免疫原性断片は、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかに由来のアミノ酸４０〜１４９と少なくとも９５％同一である。

【0039】

ポリペプチド間の同一性は、様々なアルゴリズムによって計算され得る。例えば、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（フリーソフトウエア；EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277）のＮｅｅｄｌｅプログラムおよびＧＣＧ（登録商標）パッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）のＧａｐプログラムが使用可能である。このＧａｐプログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453に記載のＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムの実装形態である。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが使用されており、ギャップオープンペナルティーおよびエクステンションペナルティーはそれぞれ８および２であった。

【0040】

コンピューター処理されたアラインメントを調べれば、２つの比較配列間で同一の残基を見出すことができる。同一性パーセンテージは、（１）同一の数をアラインメントの長さで割った商に１００を掛けること（例えば、Ｎｅｅｄｌｅプログラム分析の場合）、（２）同一の数を最長配列の長で割った商に１００を掛けること、（３）同一の数を最短配列の長さで割った商に１００を掛けること、または（４）同一の数をアラインされた残基の数で割った商に１００を掛けること（ある残基が別の残基の正面にくる場合にその残基はアラインされたという）（例えば、Ｇａｐプログラム分析の場合）によりコンピューター処理され得る。

【0041】

一実施形態では、ＰｉｌＡは、配列番号５８を認識する免疫応答を惹起し得る。
タンパク質Ｅ／ＰｉｌＡ融合タンパク質
一実施形態では、タンパク質ＥおよびＰｉｌＡは、融合タンパク質中に存在する。さらなる実施形態では、融合タンパク質は式（Ｉ）：
Ｌ（Ｘ）_ｍ−（Ｒ_１）_ｎ−Ａ−（Ｙ）_ｏ−Ｂ−（Ｚ）_ｐ （式Ｉ）
を有し、式中、
Ｘは、シグナルペプチドまたはＭＨＨＨＨＨＨ（配列番号２）であり；
ｍは、０または１であり；
Ｒ_１は、アミノ酸であり；
ｎは、０、１、２、３、４、５または６であり；
Ａは、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡもしくはその免疫原性断片であり；
Ｙは、ＧＧ、ＳＧ、ＳＳ、ＧＧＧおよび（Ｇ）_ｈ（ここで、ｈは４、５、６、７、８、９、または１０である）からなる群から選択され；
ｏは、０または１であり；
Ｂは、インフルエンザ菌由来のＰｉｌＡもしくはその免疫原性断片、またはインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅもしくはその免疫原性断片であり；
Ｚは、ＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）であり；かつ
ｐは、０または１である。

【0042】

一実施形態では、ＸがＣｃｍＨ（シトクロムｃ膜タンパク質Ｈ）、ＤｓｂＡ（周辺質タンパク質ジスルフィド異性化Ｉ）、ＤｓｂＢ（ジスルフィド結合膜タンパク質Ｂ）、ＦｌｇＩ（鞭毛ペプチドグリカン環タンパク質）、ＦｏｃＣ（Ｆ１ｃシャペロンタンパク質）、ＭａｌＥ（マルトース輸送体サブユニットＥ）、ＮａｄＡ（キノリン酸シンターゼサブユニットＡ）、ＮｉｋＡ（ニッケルＡＢＣ輸送体成分Ａ）、ＮｓｐＡ（ナイセリア表面タンパク質Ａ）、Ｏｍｐ２６（外膜タンパク質２６）、ＯｍｐＡ（外膜タンパク質Ａ）、ＯｓｐＡ（外表タンパク質Ａ）、ｐｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼＢ）、ＰｈｏＡ（細菌アルカリ性ホスファターゼ）、ＰｈｔＤ（ポリヒスチジントライアドタンパク質Ｄ）、ＰｈｔＥ（ポリヒスチジトライアドタンパク質Ｅ）、ＳｆｍＣ（周辺質ピリンシャペロン）、Ｓｉｐ１（表面免疫原性タンパク質）、ＴｏｌＢ（Ｔｏｌ−Ｐａｌ細胞エンベロープ複合体成分Ｂ）、ＴｏｒＡ（トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼシステムサブユニットＡ）、ＴｏｒＴ（トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼシステム周辺質タンパク質Ｔ）およびＹｒａｌ（推定周辺質ピリンシャペロン）；またはそれらのいずれかのサブループからなる群から選択されるシグナル配列である、式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。一実施形態では、Ｘは、共翻訳シグナルペプチドまたは翻訳後シグナルペプチドである。一実施形態では、Ｘは、ＦｌｇＩ由来のシグナル配列（ｆｌｇＩ ｓｐ）である。別の特定の実施形態では、Ｘは、ｐｅｌＢ由来のシグナル配列（ｐｅｌＢ ｓｐ）である。別の実施形態では、Ｘは、翻訳後シグナルペプチドである。別の実施形態では、Ｘは、ＦｌｇＩ、ＮａｄＡおよびｐｅｌＢ由来のシグナル配列からなる群から選択される。

【0043】

一実施形態では、ｍが１である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ｍは０である。

【0044】

ある特定の実施形態では、（Ｒ_１）_ｎが、小型の、通常は親水性のアミノ酸が富化された１〜６個のアミノ酸であるＲ_１およびｎが定義される。親水性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）およびアスパラギン（Ｎ）が含まれる。

【0045】

一実施形態では、ｎが０、１、２および６からなる群から選択される式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。ある特定の実施形態では、（Ｒ_１）_ｎがＤ、Ｅ、ＡＴＮＤＤＤ（配列番号１７８）およびＭＤまたはそれらのいずれかのサブセットからなる群から選択されるＲ_１およびｎが定義される。

【0046】

ある特定の実施形態では、ｎは、１、２および６からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ｎは０である。

【0047】

一実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅである式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７；または配列番号５〜配列番号５７のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列によりコードされるようなタンパク質Ｅである式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは、配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ９０％〜１００％同一である。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは、配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。さらなる実施形態では、Ａはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは、配列番号４〜配列番号５７のいずれかで示されるタンパク質Ｅと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ａは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅである。

【0048】

別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７；または配列番号４〜配列番号５７のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは、配列番号４で示されるアミノ酸配列とおよそ７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一である。別の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは、配列番号４とおよそ９０％〜１００％同一である。さらなる実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは、配列番号４〜配列番号５７のいずれかと少なくとも９５％同一である。より具体的には、一実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは、配列番号１２４と少なくとも９３％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である。特定の実施形態では、Ａはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは配列番号４である。

【0049】

別の実施形態では、Ａは、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）および配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）からなる群から選択されるインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。別の実施形態では、Ａは、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択されるインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。さらなる実施形態では、Ａは、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択されるインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態では、Ａは配列番号１２４、すなわち、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０である。さらなる実施形態では、Ａは配列番号１２５、すなわち、配列番号５のアミノ酸２０〜１６０である。別の実施形態では、Ａは、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択されるインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。

【0050】

タンパク質Ｅ−配列番号４
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１７〜１６０−配列番号１２２
SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１８〜１６０−配列番号１２３
AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１９〜１６０−配列番号１２４
QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２０〜１６０−配列番号１２５
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２２〜１６０−配列番号１２６
KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２３〜１６０−配列番号１７９
AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸２４〜１６０−配列番号１８０
EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡである式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ａが配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１；または配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡである式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ＡはＰｉｌＡであり、ＰｉｌＡは配列番号５８とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一である。別の実施形態では、ＡはＰｉｌＡであり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ａは配列番号５８のＰｉｌＡである。

【0051】

別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの免疫原性断片である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ＡはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一である。例えば、ＡはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１；または配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。さらなる実施形態では、ＡはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ａはインフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８である。

【0052】

インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡ−配列番号５８
MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQL
別の実施形態では、Ａは、配列番号１２７とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一のＰｉｌＡの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態では、Ａは、配列番号５８のアミノ酸４０〜１４９からなる断片である配列番号１２７である。

【0053】

インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡのアミノ酸４０〜１４９−配列番号１２７
T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ
別の実施形態では、Ａは、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれか由来のアミノ酸４０〜１４９からなるＰｉｌＡの免疫原性断片である。さらなる実施形態では、Ａは、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかに由来のアミノ酸４０〜１４９と少なくとも９５％同一の免疫原性断片である。

【0054】

一実施形態では、ＹがＧＧ、ＳＧおよびＳＳからなる群から選択される式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ＹがＧＧまたはＳＧである式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。ある特定の実施形態では、ＹはＧＧである。

【0055】

一実施形態では、ｏが１である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ｏは０である。

【0056】

一実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅまたはインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である場合に、Ｂがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡまたはインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの免疫原性断片である、式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。例えば、Ｂはインフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡである。別の実施形態では、Ｂは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１；または配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡである。別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡであり、ＰｉｌＡは配列番号５８とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一である。別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡであり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％、９８％または９９％同一である。特定の実施形態では、Ｂは配列番号５８のＰｉｌＡである。

【0057】

別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡであり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％、９８％または９９％同一であり、かつ、ＡはＰＥであり、ＰＥは配列番号４〜配列番号５７のいずれかと少なくとも９５％、９８％または９９％同一である。

【0058】

別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である場合に、Ｂがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの免疫原性断片である、式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。例えば、Ｂは、インフルエンザ菌８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡの免疫原性断片である。別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８とおよそ少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０および配列番号１２１；または配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸を有する。別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％、９８％または９９％同一である。特定の実施形態では、Ｂはインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８で示されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、Ｂは、配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかに由来のアミノ酸４０〜１４９からなるＰｉｌＡの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態では、Ｂは配列番号１２７で示されるＰｉｌＡの断片である。さらなる実施形態では、Ｂは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかのアミノ酸４０〜１４９と少なくとも９５％、９８％または９９％同一の免疫原性断片である。

【0059】

ある特定の実施形態では、Ｂは配列番号１２７で示されるＰｉｌＡの断片であり、かつ、Ａは配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２５および配列番号１２６からなる群から選択されるタンパク質Ｅの免疫原性断片である。より詳しくは、Ｂは配列番号１２７で示されるＰｉｌＡの断片であり、かつ、Ａは配列番号１２４、すなわち、配列番号４由来のタンパク質Ｅのアミノ酸１９〜１６０で示されるタンパク質Ｅの断片である。別の実施形態では、Ｂは配列番号１２７で示されるＰｉｌＡの断片であり、かつ、Ａは配列番号１２５で示されるタンパク質Ｅの断片である。

【0060】

別の実施形態では、ＢはＰｉｌＡの免疫原性断片であり、ＰｉｌＡは配列番号５８〜配列番号１２１のいずれかと少なくとも９５％同一であり、かつ、ＡはＰＥの免疫原性断片であり、ＰＥは配列番号４〜配列番号５７のいずれかと少なくとも９５％同一である。

【0061】

別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡである場合に、Ｂがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅである、式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。例えば、Ｂは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７；または配列番号４〜配列番号５７のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅである。別の実施形態では、Ｂがタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅが配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である式（Ｉ）の融合タンパク質である。別の実施形態では、Ｂはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。例えば、Ｂはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは配列番号４で示されるタンパク質Ｅと少なくとも９５％同一である。別の実施形態では、Ｂはタンパク質Ｅであり、タンパク質Ｅは配列番号４〜配列番号５７のいずれかと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態では、Ｂは配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅである。

【0062】

別の実施形態では、Ａがインフルエンザ菌由来のＰｉｌＡの免疫原性断片である場合に、Ｂがインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である、式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。例えば、Ｂは、タンパク質Ｅが配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６および配列番号５７；または配列番号４〜配列番号５７のいずれかのサブセットからなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅの免疫原性断片である。別の実施形態では、Ｂがタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅが配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、Ｂはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは配列番号４で示されるタンパク質Ｅのアミノ酸配列とおよそ９０％〜１００％同一である。特定の実施形態では、Ｂは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質Ｅの免疫原性断片である。さらなる実施形態では、Ｂはタンパク質Ｅの免疫原性断片であり、タンパク質Ｅは配列番号４〜配列番号５７のいずれかと少なくとも９５％同一である。

【0063】

別の実施形態では、Ｂは、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）および配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）からなる群から選択される、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの断片である。別の実施形態では、Ｂは、配列番号４のアミノ酸１７〜１６０（配列番号１２２）、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０（配列番号１２３）、配列番号４のアミノ酸１９〜１６０（配列番号１２４）、配列番号４のアミノ酸２０〜１６０（配列番号１２５）、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０（配列番号１２６）、配列番号４のアミノ酸２３〜１６０（配列番号１７９）および配列番号４のアミノ酸２４〜１６０（配列番号１８０）からなる群から選択される、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅの免疫原性断片である。より具体的には、一実施形態では、Ｂは、配列番号１２３、すなわち、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０で示されるタンパク質Ｅの断片である。

【0064】

ある特定の実施形態では、Ａが配列番号１２７で示されるＰｉｌＡの免疫原性断片である場合に、Ｂは、配列番号１２３、すなわち、配列番号４のアミノ酸１８〜１６０で示されるタンパク質Ｅの免疫原性断片である。

【0065】

一実施形態では、ｐが０である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。別の実施形態では、ｐが１である式（Ｉ）の融合タンパク質が定義される。

【0066】

一実施形態では、式（Ｉ）の融合タンパク質は、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２および配列番号２０４；またはそれらのいずれかのサブセットからなる群から選択される。別の実施形態では、式（Ｉ）の融合タンパク質は、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１８８、配列番号１９０、配列番号１９２、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８、配列番号２００、配列番号２０２または配列番号２０４のいずれかとおよそ８５％、８８％、９０％、９２％、９５％または９８％同一である。

【0067】

一実施形態では、式（Ｉ）の融合タンパク質は、シグナルペプチドが除去されている配列番号１４８の融合タンパク質、すなわち、配列番号１７７(QIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ)である。

【0068】

一実施形態では、式（Ｉ）の融合タンパク質は、シグナルペプチドが除去されている配列番号１９４の融合タンパク質、すなわち、配列番号２１９(IQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ)である。
肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲート
莢膜糖類という用語には、莢膜多糖および莢膜多糖に由来するオリゴ糖が含まれる。オリゴ糖は、少なくとも４つの糖残基を含有する。コンジュゲートおよびコンジュゲートされたという用語は、担体タンパク質に共有結合されている莢膜糖類に関する。

【0069】

免疫原性組成物において、糖類血清型の総数は任意選択により２３未満である。一実施形態では、免疫原性組成物は、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、または１３未満の肺炎球菌糖類を含み、任意選択により、免疫原性組成物は、１０〜２３の血清型、１０〜１６の血清型、１０〜１５の血清型、１０〜１４の血清型、１０〜１３の血清型または１０〜１２の血清型を含む。

【0070】

一実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、下記の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するが、ワクチンを受容するレシピエントの年齢および免疫原性組成物が投与される地理的位置に応じて１つまたは２つの他の血清型が置き換えられると認識される。例えば、７価の免疫原性組成物は、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の糖類を含み得る。１０価免疫原性組成物は、血清型１、５および７Ｆ由来の糖類をさらに含み得る。１２価免疫原性組成物は、血清型６Ａ、１９Ａ由来の糖類をさらに含み得る。１５価免疫原性組成物は、血清型２２Ｆおよび３３Ｆ由来の糖類をさらに含み得る。

【0071】

さらなる糖類抗原、例えば、２３価（血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆなど）も本発明により企図される。

【0072】

用語「担体タンパク質」は、小ペプチドおよび大ポリペプチド（＞１０ｋＤａ）の両方を包含することを意図する。担体タンパク質はいずれのペプチドまたはタンパク質であってもよい。担体タンパク質は、１以上のＴ−ヘルパーエピトープを含み得る。担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、破傷風トキソイドＣ断片、破傷風菌毒素の非毒性変異体［注：ＴＴのこのような変異体は全て、本発明の目的で同タイプの担体タンパク質であると見なされる］、Ｎ１９（国際公開第２００６／０６７６３２号）などの破傷風菌毒素Ｔ細胞エピトープを含むポリペプチド、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ＣＲＭ１９７（交差反応物質１９７）、ジフテリア毒素の他の非毒性変異体［例えば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ１９７、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５(Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973)；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３およびＣＲＭ１０７（ここで、ＣＲＭは、交差反応物質(cross reacting material)を表す）およびNicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992により記載されている他の突然変異；Ｇｌｕ−１４８の欠失またはＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒへの突然変異および／またはＡｌａ １５８のＧｌｙへの突然変異および米国特許第４７０９０１７号または米国特許第４９５０７４０号に開示されている突然変異；少なくとも１つもしくは複数の残基Ｌｙｓ ５１６、Ｌｙｓ ５２６、Ｐｈｅ ５３０および／もしくはＬｙｓ ５３４の突然変異、および米国特許第５９１７０１７号もしくは米国特許第６４５５６７３号に開示されている他の突然変異；または米国特許第５８４３７１１号に開示されている断片］（注：ＤＴのこのような変異体は全て、本発明の目的で同タイプの担体タンパク質であると見なされる）、肺炎球菌ニューモリシン(Kuo et al(1995) Infect Immun 63; 2706-13)、ＯＭＰＣ（通常、髄膜炎得菌(N. meningitides)血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌由来の外膜タンパク質Ｃ−欧州特許第０３７２５０１号）、合成ペプチド（欧州特許第０３７８８８１号、欧州特許第０４２７３４７号）、熱ショックタンパク質（国際公開第９３／１７７１２号、国際公開第９４／０３２０８号）、百日咳菌タンパク質（国際公開第９８／５８６６８号、欧州特許第０４７１１７７号）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（国際公開第９１／０１１４６号）、種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugi et al(2001) Eur J Immunol 31; 3816-3824)、例えば、Ｎ１９タンパク質(Baraldoi et al(2004) Infect Immun 72; 4884-7)、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（国際公開第０２／０９１９９８号）、鉄取り込みタンパク質（国際公開第０１／７２３３７号）、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)の毒素Ａまたは毒素Ｂ（国際公開第００／６１７６１号）、インフルエンザ菌タンパク質Ｄ（欧州特許第５９４６１０号および国際公開第００／５６３６０号）、肺炎球菌ＰｈｔＡ（国際公開第Ｏ９８／１８９３０号、Ｓｐ３６とも呼ばれる）、肺炎球菌ＰｈｔＤ（国際公開第００／３７１０５号に開示されているポリヒスチジントライアドＤ、Ｓｐ０３６Ｄとも呼ばれる）、肺炎球菌ＰｈｔＢ（国際公開第００／３７１０５号に開示されているポリヒスチジントライアドＢ、Ｓｐ０３６Ｂとも呼ばれる）、またはＰｈｔＥ（国際公開第００／３０２９９号に開示されているポリヒスチジントライアドＥ、ＢＶＨ−３とも呼ばれる）であり得る。

【0073】

一実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ＴＴのＣ断片、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７（交差反応物質１９７）、無毒化ニューモリシン、タンパク質Ｄ（インフルエンザ菌由来）、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ（ポリヒスチジントライアドタンパク質Ｄおよびポリヒスチジントライアドタンパク質Ｅを含有するタンパク質）およびＮ１９からなる群から独立に選択される担体タンパク質にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、全て独立にＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。

【0074】

この文脈において用語「にコンジュゲートされる」は、そのタンパク質が糖類と共有結合されることを意味し、この場合、タンパク質は担体タンパク質として機能する。

【0075】

一実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた少なくとも１種の肺炎球菌莢膜糖類を含む。一実施形態では、コンジュゲートされた肺炎球菌糖類の少数がタンパク質Ｄにコンジュゲートされ、ここで、用語「少数」は、その組成物中の糖類の総数の半分未満がタンパク質Ｄにコンジュゲートされていることを意味する。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた１〜２０の間、１〜１８の間、１〜１６の間、１〜１４の間、１〜１２の間、１〜１０の間、１〜９の間、１〜８の間、１〜７の間、１〜６の間、１〜５の間、１〜４の間、１〜４の間または１〜２の間の肺炎球菌莢膜糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた少なくとも１種の肺炎球菌莢膜糖類を含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、ジフテリアトキソイドにコンジュゲートされている１９Ｆを含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされている少なくとも１種の肺炎球菌莢膜糖類を含む。さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、破傷風トキソイドにコンジュゲートされている１８Ｃを含む。

【0076】

一実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたコンジュゲート血清型１糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたコンジュゲート血清型４糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型５糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型５糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型６Ｂ糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型６Ｂ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型７Ｆ糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型７Ｆ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、９Ｖ糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型９Ｖ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型１４糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型１４糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型１８Ｃ糖類が破傷風トキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート血清型１８Ｃ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型１９Ｆ糖類がジフテリアトキソイドまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート１９Ｆ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、血清型２３Ｆ糖類がタンパク質ＤまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされているコンジュゲート２３Ｆ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたコンジュゲート６Ａ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされたコンジュゲート１９Ａ糖類を含む。

【0077】

一実施形態では、免疫原性組成物は、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型１糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型４糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型５糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型６Ｂ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型７Ｆ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型９Ｖ糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型１４糖類、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型２３Ｆ糖類、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた肺炎球菌血清型１８Ｃ糖類およびジフテリアトキソイドにコンジュゲートされた肺炎球菌１９Ｆ糖類を含む。一実施形態では、免疫原性組成物は、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌血清型６ＡおよびＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた肺炎球菌血清型１９Ａをさらに含む。

【0078】

任意選択により、担体タンパク質と肺炎球菌糖類の比は１：５〜５：１の間；１：２〜２．５：１の間；１：１〜２：１（ｗ／ｗ）の間である。一実施形態では、コンジュゲートの大多数、例えば、６、７、８、９またはそれを超えるコンジュゲートの担体タンパク質と糖類の比が１：１、例えば、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１または１．６：１である。

【0079】

一般に、本発明の免疫原性組成物は、糖類０．１〜２０μｇの間、１〜５μｇの間、１〜１０μｇの間または１〜３μｇの間の各糖類コンジュゲート用量を含み得る。

【0080】

一実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、糖類０．１〜２０μｇの間；０．５〜１０μｇの間；０．５〜５μｇの間または１〜３μｇの間の用量で各肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含有する。一実施形態では、莢膜糖類は異なる用量で存在してよく、例えば、ある莢膜糖類は正確に１μｇの用量で存在してよく、またはある莢膜糖類は正確に３μｇの用量で存在してよい。一実施形態では、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）由来の糖類は、他の糖類よりも高い用量で存在する。この実施形態の一態様において、血清型３、１８Ｃおよび１９Ｆ（または４、１８Ｃおよび１９Ｆ）はおよそまたは正確に３μｇの用量で存在するが、免疫原性組成物中の他の糖類はおよそまたは正確に１μｇの用量で存在する。一実施形態では、血清型１、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および２３Ｆはおよそまたは正確に１μｇの用量で存在する。

【0081】

本発明を通じて用語「糖類」は多糖またはオリゴ糖を示す場合があり、両方を含む。多糖は細菌から単離し、公知の方法（例えば、欧州特許第４９７５２４号および欧州特許第４９７５２５号参照）により、また、任意選択の微少溶液操作によって一定の程度にサイズ調整してもよい。多糖は、多糖サンプル中での粘度を小さくするためおよび／またはコンジュゲート生成物の濾過性を向上させるためにサイズ調整することができる。オリゴ糖は低数の反復単位（一般に、５〜３０の反復単位）を持ち、一般に加水分解された多糖である。

【0082】

肺炎球菌の莢膜多糖は、最大８個の糖残基を含有し得る反復オリゴ糖単位を含む。重要な肺炎球菌血清型のオリゴ糖単位に関する総説としては、JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Cienc., June 2005, vol.77, no.2, p.293-324. ISSN 0001-3765を参照。一実施形態では、莢膜糖類抗原は全長多糖であり得るが、他の実施形態では、１オリゴ糖単位、または反復オリゴ糖単位の天然長糖鎖よりも短くてもよい。一実施形態では、ワクチン中に存在する糖類の全てが多糖である。全長多糖は「サイズ調整」が可能であり、すなわち、それらのサイズは、酸加水分解処理、過酸化水素処理、ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ（登録商標）によるサイズ調整とその後の過酸化水素処置によるオリゴ糖断片の生成、または微少溶液操作などの種々の方法によって小さくすることができる。

【0083】

一実施形態では、免疫原性組成物は、コンジュゲートされたものとは異なる血清型の非コンジュゲート肺炎球菌糖類を、コンジュゲート糖類血清型と非コンジュゲート糖類血清型の数が２３以下となるようにさらに含む。
コンジュゲーション
本発明の免疫原性組成物中に存在する糖類コンジュゲートは、任意のコンジュゲーション技術を用いて、担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。

【0084】

一実施形態では、肺炎球菌糖類は、リンカー、例えば、二官能性リンカーを介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。リンカーは、任意選択により、例えば、１個の反応性アミノ基および反応性カルボン酸基、２個の反応性アミノ基または２個の反応性カルボン酸基を有する、ヘテロ二官能性またはホモ二官能性である。リンカーは、例えば、４〜２０個の間、４〜１２個の間、５〜１０個の間の炭素原子を有する。可能性のあるリンカーはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）である。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（国際公開第００／１０５９９号）、ニトロフェニル−エチルアミン(Gever et al(1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288)、ハロアルキルハリド（米国特許第４０５７６８５号）、グリコシド結合（米国特許第４６７３５７４号、米国特許第ＵＳ４８０８７００号）、ヘキサンジアミンおよび６−アミノカプロン酸（米国特許第Ｓ４４５９２８６号）が含まれる。一実施形態では、ＡＤＨが、血清型１８Ｃ由来の糖類にコンジュゲートさせるためのリンカーとして使用される。

【0085】

本発明の免疫原性組成物中に存在する糖類コンジュゲートは、いずれの既知のカップリング技術によって作製してもよい。コンジュゲーション法は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＣＤＡＰ）を用いた糖類の活性化によるシアン酸エステルの形成に頼るものであり得る。このように、活性化された糖類を、担体タンパク質上のアミノ基に直接またはスペーサー（リンカー）基を介して結合させることができる。例えば、スペーサーは、チオール化多糖を得るためのシスタミンまたはシステアミンであってよく、チオール化多糖は、マレイミドにより活性化された担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを使用）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド［例えば、エチルヨードアセトイミドＨＣｌ］またはＮ−スクシンイミジルブロモアセテートもしくはＳＩＡＢ、もしくはＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰ）との反応の後に得られるチオエーテル結合を介して担体に結合させることができる。任意選択により、シアン酸エステル（任意選択により、ＣＤＡＰ化学により作製）をヘキサンジアミンまたはＡＤＨと結合させ、このアミノで誘導体化された糖類を、カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学を用い、タンパク質担体上のカルボキシル基を介して担体タンパク質にコンジュゲートさせる。このようなコンジュゲートは、ＰＣＴ公開出願国際公開第９３／１５７６０号Ｕｎｉｆｏｒｍｅｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙならびに国際公開第９５／０８３４８号および国際公開第９６／２９０９４号に記載されている。

【0086】

他の好適な技術では、カルボジイミド、カルビイニド(carbiinides)、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。多くが国際公開第９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩの反応 (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18)とその後のタンパク質との反応によるカルバミン酸結合の形成により形成され得るカルボニルリンカーを含んでよい。これは、アノマー末端の第一ヒドロキシル基への還元、任意選択の、ＣＤＩを用いた第一ヒドロキシル基の第一ヒドロキシル基反応の保護／脱保護によるＣＤＩカルバミン酸中間体の形成、およびこのＣＤＩカルバミン酸中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含み得る。

【0087】

前記コンジュゲートはまた、米国特許第４３６５１７０号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）および米国特許第４６７３５７４号（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）に記載の直接的還元的アミノ化法によって製造することもできる。他の方法はＥＰ−０−１６１−１８８、ＥＰ−２０８３７５およびＥＰ−０−４７７５０８に記載されている。

【0088】

さらなる方法は、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）誘導体化糖類を臭化シアノゲン（またはＣＤＡＰ）で活性化したものを、例えば、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を用いた、カルボジイミド縮合(Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256)によってタンパク質担体に結合させることを含む。

【0089】

一実施形態では、糖類上のヒドロキシル基（任意選択により、活性化ヒドロキシル基、例えば、活性化してシアン酸エステルを形成させたヒドロキシル基［例えば、ＣＤＡＰを使用］）をタンパク質上のアミノ基またはカルボキシル基に、直接的または間接的（リンカーを介する）に連結する。リンカーが存在する場合、糖類上のヒドロキシル基は、任意選択により、例えば、ＣＤＡＰコンジュゲーションを用い、リンカー上のアミノ基に連結してもよい。リンカー、例えばＡＤＨ中のさらなるアミノ基は、例えばカルボジイミド化学を使用することにより、例えばＥＤＡＣを使用することにより、タンパク質上のカルボン酸基にコンジュゲートしてもよい。一実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類をまずリンカーにコンジュゲートした後、そのリンカーを担体タンパク質にコンジュゲートする。あるいは、リンカーを担体にコンジュゲートした後に糖類にコンジュゲートしてもよい。

【0090】

一部の糖類−タンパク質コンジュゲートをＣＤＡＰにより作製し、一部を還元的アミノ化により作製するといった技術の組合せも使用可能である。

【0091】

一般に、タンパク質担体上の下記のタイプの化学基をカップリング／コンジュゲーションに使用することができる：
Ａ）カルボキシル（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸を介する）。一実施形態では、この基は、糖類上のアミノ基に直接、またはカルボジイミド化学を用いて、例えば、ＥＤＡＣを用いて、リンカー上のアミノ基に連結させる。

【0092】

Ｂ）アミノ基（例えば、リシンを介する）。一実施形態では、この基は、糖類上のカルボキシル基に直接、またはカルボジイミド化学を用いて、例えば、ＥＤＡＣを用いて、リンカー上のカルボキシル基に連結させる。別の実施形態では、この基は、糖類上のＣＤＡＰもしくはＣＮＢｒで活性化したヒドロキシル基に直接、またはリンカー上のこのような基に；アルデヒド基を有する糖類またはリンカーに；スクシンイミドエステル基を有する糖類またはリンカーに連結させる。

【0093】

Ｃ）スルフヒドリル（例えば、システインを介する）。一実施形態では、この基は、マレイミド化学を用いて、ブロモまたはクロロアセチル化糖類またはリンカーに連結させる。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化／修飾する。

【0094】

Ｄ）ヒドロキシル基（例えば、チロシンを介する）。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化／修飾する。

【0095】

Ｅ）イミダゾリル基（例えば、ヒスチジンを介する）。一実施形態では、この基は、ビスジアゾベンジジンで活性化／修飾する。

【0096】

Ｆ）グアニジル基（例えば、アルギニンを介する）。

【0097】

Ｇ）インドリル基（例えば、トリプトファンを介する）。

【0098】

糖類上では、一般に、下記の基がカップリングに使用可能である：ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２。アルデヒド基は、過ヨウ素酸塩、酸加水分解、過酸化水素などの当技術分野で公知の種々の処理の後に生成し得る。

【0099】

直接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ −−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ−−−−＞シッフ塩基＋ＮａＣＮＢＨ３−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＮＨ２−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−＞コンジュゲート
スペーサー（リンカー）を介した間接的カップリング手法：
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＮＨ２ −−−−＞糖類−−−−ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ＋ＥＤＡＣ−−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質またはタンパク質のアミノ基の例えばＳＰＤＰによる修飾後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−ＳＨ −−−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の修飾）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＯＨ＋ＣＮＢｒまたはＣＤＡＰ−−−＞シアン酸エステル＋ＮＨ２−−−−−ＳＨ −−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−＞糖類−−−−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋ＳＨ−Ｐｒｏｔ（システインが露出した天然タンパク質またはタンパク質のアミノ基の例えばＳＰＤＰによる修飾後に得られる天然タンパク質）−−−−−＞糖類−Ｓ−Ｓ−Ｐｒｏｔ
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−−−＞糖類−−−−ＳＨ＋マレイミド−Ｐｒｏｔ（アミノ基の修飾）−−−−＞コンジュゲート
糖類−ＣＯＯＨ＋ＥＤＡＣ＋ＮＨ２−−−−ＳＨ−−−＞糖類−ＳＨ＋ハロアセチル化−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
糖類−アルデヒド＋ＮＨ２−−−−−ＮＨ２−−−−＞糖類−−−ＮＨ２＋ＥＤＡＣ＋ＣＯＯＨ−Ｐｒｏｔ−−−−＞コンジュゲート
注：上記のＥＤＡＣの代わりに、任意の好適なカルボジイミドを使用してもよい。

【0100】

まとめると、糖類とのカップリングに一般に使用可能なタンパク質担体化学基のタイプはアミノ基（例えば、リシン残基上）、ＣＯＯＨ基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基上）およびＳＨ基（利用可能な場合）（例えば、システイン残基上）。

【0101】

一実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の肺炎球菌糖類が、還元的アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。一実施形態では、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満の肺炎球菌糖類が、還元的アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。一実施形態では、１〜２３、２〜２２、３〜２１、４〜２０、５〜１９、６〜１８、７〜１７、８〜１６、９〜１５、１０〜１４、１１〜１３、１〜２３、および２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３の間、または１もしくは２種の肺炎球菌糖類が、還元的アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類の全てが、還元的アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。

【0102】

一実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の肺炎球菌糖類が、ＣＤＡＰ化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。一実施形態では、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満の肺炎球菌糖類が、ＣＤＡＰ化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。一実施形態では、１〜２３、２〜２２、３〜２１、４〜２０、５〜１９、６〜１８、７〜１７、８〜１６、９〜１５、１０〜１４、１１〜１３、１〜２３、および２２、１〜２１、１０〜２３、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１０〜１２、１０〜１１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３の間、または１もしくは２種の肺炎球菌糖類が、ＣＤＡＰ化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。さらなる実施形態では、肺炎球菌莢膜糖類の全てが、ＣＤＡＰ化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。

【0103】

一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、還元的アミノ化を介して担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２の糖類を含み、かつ、還元的アミノ化以外の化学、例えば、ＣＤＡＰ化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされた少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２の糖類を含む。

【0104】

一実施形態では、血清型１、３、１９Ａおよび１９Ｆからなる群から選択される血清型のうちの少なくとも１つに由来の莢膜糖類が、還元的アミノ化以外の化学を介してコンジュゲートされ、かつ、血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃおよび２３Ｆからなる群から選択される血清型のうちの少なくとも１つが還元的アミノ化を介してコンジュゲートされている。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、還元的アミノ化以外の化学を介してコンジュゲートされた血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ；１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆ；または１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎球菌莢膜糖類を含む。一実施形態では、１９Ｆは、還元的アミノ化以外の化学を介して担体タンパク質にコンジュゲートされている。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、ＣＤＡＰ化学などのシアニル化化学を介してタンパク質担体にコンジュゲートされた血清型１または３または１９Ａまたは１９Ｆ；１および３；１および１９Ａ；１および１９Ｆ；３および１９Ａ；３および１９Ｆ；１９Ａおよび１９Ｆ；１、３および１９Ａ；１、３および１９Ｆ；１、１９Ａおよび１９Ｆ；３、１９Ａおよび１９Ｆ；または１、３、１９Ａおよび１９Ｆ由来の肺炎球菌莢膜糖類を含む。一実施形態では、１９Ｆは、ＣＤＡＰ化学により担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の一実施形態では、下記の１または複数の肺炎球菌莢膜糖類が還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている；血清型４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃまたは２３Ｆ、４および５、４および６Ａ、４および６Ｂ、４および７Ｆ、４および９Ｖ、４および１４、４および１８Ｃ、４および２３Ｆ、５および６Ａ、５および６Ｂ、５および７Ｆ、５および９Ｖ、５および１４、５および１８Ｃ、５および２３Ｆ、６Ａおよび６Ｂ、６Ａおよび７Ｆ、６Ａおよび９Ｖ、６Ａおよび１４、６Ａおよび１８Ｃ、６Ａおよび２３Ｆ、６Ｂおよび７Ｆ、６Ｂおよび９Ｖ、６Ｂおよび１４、６Ｂおよび１８Ｃ、６Ｂおよび２３Ｆ、７Ｆおよび９Ｖ、７Ｆおよび１４、７Ｆおよび１８Ｃ、７Ｆおよび２３Ｆ、９Ｖおよび１４、９Ｖおよび１８Ｃ、９Ｖおよび２３Ｆ、１４および１８Ｃ、１４および２３Ｆまたは１８Ｃおよび２３Ｆ。一実施形態では、血清型２３Ｆは、還元的アミノ化化学により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質
本発明の免疫原性組成物は、少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質を含み得る。一実施形態では、少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質は、ポリヒスチジントライアドファミリー（ＰｈｔＸ）、無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断型、ＬｙｔＸ（自己分解酵素）ファミリー、ＬｙｔＸ末端切断型、ＣｂｐＸ末端切断型−ＬｙｔＸ末端切断型キメラタンパク質、ＰｃｐＡ（肺炎球菌コリン結合タンパク質Ａ）、ＰｓｐＡ（肺炎球菌表面タンパク質Ａ）、ＰｓａＡ（肺炎球菌表面アドヘシン タンパク質Ａ）、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１（肺炎球菌１０１）、Ｓｐ１３０（肺炎球菌１３０）、ＳＰ１２５（肺炎球菌１２５）およびＳＰ１３３（肺炎球菌１３３）からなる群から選択される。

【0105】

Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアド）ファミリーは、タンパク質ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、およびＰｈｔＥを含む。Ｐｈｔファミリーはポリヒスチジントライアドファミリーまたは肺炎球菌ヒスチジントライアドファミリーと呼ぶことができ、従って、用語「ポリヒスチジントライアド」および「肺炎球菌ヒスチジントライアド」は互換的であると見なされ得ることに留意されたい。このファミリーは、脂質化配列、プロリンリッチ領域により分離された２つのドメインおよびおそらく金属またはヌクレオシド結合または酵素活性に関与するいくつかのヒスチジントライアド、（３−５）コイルドコイル領域、保存されたＮ末端および異種Ｃ末端を特徴とする。それは試験した全ての肺炎球菌株に存在する。他の連鎖球菌およびナイセリア菌でも、相同タンパク質が見つかった。本発明の一実施形態では、本発明のＰｈｔタンパク質はＰｈｔＤである。しかしながら、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤおよびＰｈｔＥという用語は、下記の引例に開示される配列を有するタンパク質ならびに参照タンパク質と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然の（および人工の）変異体を意味すると理解される。任意選択により、それは少なくとも９５％同一または少なくとも９７％同一である。

【0106】

ＰｈｔＸタンパク質に関して、ＰｈｔＡは国際公開第９８／１８９３０号に開示され、Ｓｐ３６とも呼ばれる。上述のように、それはＰｈｔファミリー由来のタンパク質であり、ＬＸＸＣのＩＩ型シグナルモチーフを有する。ＰｈｔＤは国際公開第００／３７１０５号に開示され、Ｓｐ０３６Ｄとも呼ばれる。上述のように、それもＰｈｔファミリー由来のタンパク質であり、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。一実施形態では、用語「ＰｈｔＤ」は、配列番号２２０を指す。ＰｈｔＢは国際公開第００／３７１０５号に開示され、Ｓｐ０３６Ｂとも呼ばれる。ＰｈｔＢファミリーの別のメンバーは、国際公開第００／１７３７０号に開示されているように、Ｃ３分解ポリペプチドである。このタンパク質もＰｈｔファミリーに由来し、ＩＩ型ＬＸＸＣシグナルモチーフを有する。例えば、免疫学的に機能的な等価物は国際公開第９８／１８９３０号に開示されているタンパク質Ｓｐ４２である。ＰｈｔＢ末端切断型（およそ７９ｋＤ）は国際公開第９９／１５６７５号に開示され、これもＰｈｔファミリーのメンバーと見なされる。ＰｈｔＥは国際公開第００／３９２９９号に開示され、ＢＶＨ−３と呼ばれる。本明細書で任意のＰｈｔタンパク質に言及する場合、Ｐｈｔタンパク質の免疫原性断片またはその融合物が使用可能であることを意味する。例えば、ＰｈｔＸという場合、任意のＰｈｔタンパク質由来の免疫原性断片またはその融合物を含む。ＰｈｔＤまたはＰｈｔＢｔいう場合、例えば、国際公開第０１／９８３３４号に見出されるように、それぞれＰｈｔＤＥ（ＰｈｔＤおよびＰｈｔＥを含む融合タンパク質）またはＰｈｔＢＥ（ＰｈｔＢおよびＰｈｔＥを含む融合タンパク質）を排除しない。

【0107】

一実施形態では、少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質(unconjugated to conjugated Streptococccus pneumoniae protein)は、ポリヒスチジントライアドファミリー由来の少なくとも１つのタンパク質（例えば、前記タンパク質はＰｈｔＤ、ＰｈｔＢＤおよびＰｈｔＤＥ融合タンパク質からなる群から選択され得る）を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質は、ＰｈｔＤタンパク質である。さらなる実施形態では、ＰｈｔＤタンパク質は、国際公開第００／３７１０５号の配列番号４のアミノ酸２１〜８３８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む。

【0108】

一実施形態では、少なくとも１つの非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質は、無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）である。一実施形態では、ニューモリシンは化学的に無毒化されている。さらなる実施形態では、ニューモリシンは化学的に無毒化されている。なおさらなる実施形態では、ニューモリシンは化学的および遺伝学的の両面で無毒化されている。

【0109】

さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）およびＰｈｔＤを含む。さらなる実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、非コンジュゲート無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）および非コンジュゲートＰｈｔＤを含む。

【0110】

コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）に関して、このファミリーのメンバーは元々、コリン−アフィニティークロマトグラフィーによって精製できた肺炎球菌タンパク質として同定された。コリン結合タンパク質は、細胞壁テイコ酸および膜結合性リポテイコ酸のホスホリルコリン部分に非共有結合的に結合されている。構造上、それらはファミリー全体に共通のいくつかの領域を有するが、そのタンパク質の厳密な性質（アミノ酸配列、長さなど）は様々であり得る。一般に、コリン結合タンパク質は、Ｎ末端領域（Ｎ）、保存されている反復領域（Ｒ１および／またはＲ２）、プロリンリッチ領域（Ｐ）、ならびにタンパク質のおよそ半分を含む複数の反復で構成された保存されているコリン結合領域（Ｃ）を含む。本出願で使用する場合、用語「コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）」は、国際公開第９７／４１１５１号で同定されたコリン結合タンパク質ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧからなる群に由来するタンパク質を含む。ＣｂｐＡは、国際公開第９７／４１１５１号に開示されている。ＣｂｐＤおよびＣｂｐＧは、国際公開第００／２９４３４号に開示されている。ＰｓｐＣは、国際公開第９７／０９９９４号に開示されている。ＰｂｃＡは、国際公開第９８／２１３３７号に開示されている。ＳｐｓＡは、国際公開第９８／３９４５０号に開示されているコリン結合タンパク質である。任意選択により、コリン結合タンパク質は、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群から選択される。

【0111】

本発明の一実施形態は、ＣｂｐＸ末端切断型を含み、ここで、「ＣｂｐＸ」は上記で定義され、「末端切断型」は、コリン結合領域（Ｃ）の５０％以上を欠くＣｂｐＸタンパク質を意味する。任意選択により、このようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。任意選択により、前記タンパク質末端切断型は、（ｉ）コリン結合領域を欠き、かつ（ｉｉ）タンパク質のＮ末端半分の部分も欠くが、少なくとも１つの反復領域（Ｒ１またはＲ２）を保持する。任意選択により、末端切断型は、２つの反復領域（Ｒ１およびＲ２）を保持する。このような実施形態の例は、国際公開第９９／５１２６６号または国際公開第９９／５１１８８号に例示されているＮＲ１ｘＲ２およびＲ１ｘＲ２であるが、同様のコリン結合領域を欠く他のコリン結合タンパク質も本発明の範囲内で企図される。

【0112】

ＬｙｔＸファミリーは、細胞溶解に関連する膜結合タンパク質である。そのＮ末端ドメインは、コリン結合ドメインを含む。しかしながら、ＬｙｔＸファミリーは、上記のＣｂｐＸファミリーに見られる特徴の全てを持つわけではない。本発明に関しては、ＬｙｔＸファミリーはＣｂｐＸファミリーとは異なると考えられる。ＣｂｐＸファミリーとは対照的に、ＬｙｔＸファミリーのＣ末端ドメインは、ＬｙｔＸタンパク質の触媒ドメインを含む。このファミリーは、ＬｙｔＡ、ＬｙｔＢおよびＬｙｔＣを含む。ＬｙｔＸファミリーに関して、ＬｙｔＡはRonda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)に開示されている。ＬｙｔＢは国際公開第９８／１８９３０号に開示され、Ｓｐ４６とも呼ばれる。ＬｙｔＣもまた国際公開第９８／１８９３０号に開示され、Ｓｐ９１とも呼ばれる。本発明の実施形態はＬｙｔＣを含む。

【0113】

別の実施形態は、ＬｙｔＸ末端切断型を含み、ここで、「ＬｙｔＸ」は上記で定義され、「末端切断型」は、コリン結合領域の５０％以上を欠くＬｙｔＸタンパク質を意味する。任意選択により、このようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。本発明のさらに別の実施形態は、ＣｂｐＸ末端切断型−ＬｙｔＸ末端切断型キメラタンパク質または融合タンパク質を含む。任意選択により、融合タンパク質は、ＣｂｐＸのＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）およびＬｙｔＸのＣ末端部分（Ｃｔｅｒｍ、すなわち、コリン結合ドメインを欠くタンパク質）（例えば、ＬｙｔＣＣｔｅｒｍまたはＳｐ９１Ｃｔｅｒｍ）を含む。任意選択により、ＣｂｐＸは、ＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡおよびＰｓｐＣからなる群から選択される。任意選択により、それはＣｂｐＡである。任意選択により、ＬｙｔＸはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも呼ばれる）である。本発明の別の実施形態は、コリン結合ドメイン（Ｃ）を欠き、ＬｙｔＸとの融合タンパク質として発現されるＰｓｐＡまたはＰｓａＡ末端切断型である。任意選択により、ＬｙｔＸはＬｙｔＣである。

【0114】

ＰｓａＡおよびＰｓｐＡに関しては、両方とも当技術分野で記述されている。例えば、ＰｓａＡおよびその膜貫通欠失変異体は、Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62により記載されている。ＰｓｐＡおよびその膜貫通欠失変異体は、例えば、米国特許第５８０４１９３号、国際公開第９２／１４４８８号、および国際公開第９９／５３９４０号に記載されている。

【0115】

ＰｃｐＡに関して、このタンパク質は当技術分野で記載されており、例えば、ＰｃｐＡは国際公開第２０１１／０７５８２３号に記載されている。用語「ＰｃｐＡ」は、国際公開第２０１１／０７５８２３号の配列番号２もしくは７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一を含むタンパク質、または国際公開第２０１１／０７５８２３号の配列番号２もしくは７の少なくとも１００、１５０、２００、２５もしくはそれを超える連続するアミノ酸の断片を意味する。

【0116】

Ｓｐ１２８およびＳｐ１３０は、国際公開第００／７６５４０号に開示されている。Ｓｐ１２５は、ＬＰＸＴＧ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）の細胞壁係留モチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質の例である。このモチーフを有するこの種の肺炎球菌表面タンパク質内のタンパク質は、本発明の文脈内で有用であるころが分かっており、従って、本発明のさらなるタンパク質と見なされる。Ｓｐ１２５自体は国際公開第９８／１８９３０号に開示されており、亜鉛メタロプロテイナーゼであるＺｍｐＢとしても知られる。Ｓｐ１０１は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（そこで、それは参照＃ｙ８５９９３を有する）。それはＩ型シグナル配列を特徴とする。Ｓｐ１３３は国際公開第９８／０６７３４号に開示されている（そこで、それは参照＃ｙ８５９９２を有する）。これもまたＩ型シグナル配列を特徴とする。

【0117】

存在し得るこれらのさらなる肺炎球菌タンパク質はいずれも、非コンジュゲート型またはコンジュゲート型である。１以上の肺炎球菌タンパク質は、任意選択により、肺炎球菌糖類にコンジュゲートされる（上記の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートと題された節に記載）。任意選択により、１以上の肺炎球菌タンパク質は、異なる細菌に由来する糖類にコンジュゲートされる。

【0118】

この文脈において用語「コンジュゲートされる」は、タンパク質が糖類に共有結合されることを意味し、この場合、タンパク質は担体タンパク質として機能する。

【0119】

一実施形態では、少なくとも１つのさらなる非コンジュゲートまたはコンジュゲート肺炎球菌タンパク質は、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢＤおよびＰｈｔＤＥからなる群から選択されるポリヒスチジンファミリー（ＰｈｔＸ）タンパク質を含む。
アジュバント
一実施形態では、免疫原性組成物はアジュバントを含む。

【0120】

好適なアジュバントとしては、限定されるものではないが、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、モノホスホリル脂質Ａ（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、水中油エマルション、グラム陰性菌株由来のブレブまたは外膜小胞調製物（国際公開第０２／０９７４６号により教示されるものなど）、脂質Ａまたはその誘導体、リン酸アルキルグルコサミドまたはこれらのアジュバントの２種以上の組合せが含まれる。一実施形態では、リン酸アルミニウムである。さらなる実施形態では、アジュバントは、ヒト一用量当たり１００〜７５０、１５０〜６００、２００〜５００、２５０〜４５０、３００〜４００、または３５０μｇ前後のアルミニウムをリン酸アルミニウムとして含む。
ワクチン
本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。本発明の「免疫原性組成物」に関する本明細書内の実施形態は、本発明の「ワクチン」に関する実施形態にも適用可能であり、逆も同じである。一実施形態では、ワクチンは、本発明の免疫原性組成物と薬学上許容される賦形剤とを含む。

【0121】

本発明のワクチンは、皮内、粘膜、例えば、鼻腔内、経口の筋肉内または皮下などのいずれの好適な送達経路によって投与してもよい。他の送達経路も当技術分野で周知である。ワクチン製剤は一般に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach” (Powell M.F. & Newman M.J.編) (1995) Plenum Press New York)に記載されている。

【0122】

一態様において、本発明の免疫原性組成物は、筋肉内送達経路によって投与される。筋肉内投与は、大腿または上腕に対するものであり得る。注射は一般に、針（例えば、皮下針）によるが、無針注射も選択使用することができる。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。

【0123】

本発明のさらなる態様は、非コンジュゲート肺炎球菌タンパク質をアジュバント組成物と混合する工程を含む、本発明のワクチンの製造方法である。

【0124】

本発明の一態様において、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法であって、前記対象に治療上有効な用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む方法が提供される。本発明のさらなる態様において、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法であって、前記対象に治療上有効な用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、肺炎球菌およびインフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患に対して対象を免疫する方法であって、前記対象に治療上有効な用量の本発明の免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、前記疾患は、肺炎、浸潤性肺炎球菌性疾患（ＩＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、中耳炎、髄膜炎、菌血症、および結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患を含む。一実施形態では、対象は哺乳類対象である。さらなる実施形態では、哺乳類対象は、マウス、モルモットおよびヒトからなる群から選択される。一実施形態では、対象は成人、任意選択により、高齢者である。さらなる実施形態では、対象は乳幼児である。

【0125】

本発明のさらなる態様では、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための本発明の免疫原性組成物またはワクチンが提供される。本発明のさらなる態様では、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための本発明の免疫原性組成物またはワクチンが提供される。さらなる実施形態では、肺炎球菌およびインフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防において使用するための本発明の免疫原性組成物またはワクチンが提供される。一実施形態では、前記使用は、成人宿主、任意選択により、高齢者宿主への免疫原性組成物の投与を含む。さらなる実施形態では、前記使用は、乳幼児宿主への免疫原性組成物の投与を含む。さらなる実施形態では、前記疾患は、肺炎、浸潤性肺炎球菌性疾患（ＩＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、中耳炎、髄膜炎、菌血症、および結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患を含む。

【0126】

本発明のさらなる態様では、肺炎球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用が提供される。本発明のさらなる態様では、インフルエンザ菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用が提供される。さらなる実施形態では、インフルエンザ菌および肺炎球菌感染により引き起こされる疾患の治療または予防のための薬剤の製造における本発明の免疫原性組成物またはワクチンの使用が提供される。一実施形態では、前記疾患は、肺炎、浸潤性肺炎球菌性疾患（ＩＰＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪、中耳炎、髄膜炎、菌血症、および結膜炎からなる群から選択される少なくとも１つの疾患を含む。

【0127】

一実施形態では、前記使用は、成人宿主、高齢者宿主および乳幼児宿主からなる群から選択される宿主への本発明の免疫原性組成物またはワクチンの投与を含む。

【0128】

式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、哺乳類、特にヒトなどの対象において免疫原として有用である。特に、式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、対象、特にヒトにおいてインフルエンザ菌に対する免疫応答を誘導する上で有用である。さらに、式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートは、対象、特にヒトにおいて肺炎球菌に対する免疫応答を誘導する上で有用である。より具体的には、式（Ｉ）の融合タンパク質は、中耳炎および／またはＡＥＣＯＰＤおよび／または肺炎の治療または予防において有用である。

【0129】

一実施形態では、本発明はさらに、必要とする対象において中耳炎を治療または予防するための方法であって、前記対象に本明細書に記載の式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む治療上有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、必要とする対象において慢性閉塞性肺疾患（ＡＥＣＯＰＤ）の急性増悪を治療または予防するための方法であって、前記対象に本明細書に記載の式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む治療上有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0130】

別の実施形態では、本発明は、必要とする対象において肺炎を治療または予防する方法であって、前記対象に本明細書に記載の式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む治療上有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0131】

別の実施形態では、本発明は、必要とする対象においてインフルエンザ菌感染また疾患を治療または予防するための方法であって、前記対象に本明細書に記載の式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む治療上有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0132】

別の実施形態では、本発明は、必要とする対象において肺炎球菌感染また疾患を治療または予防するための方法であって、前記対象に本明細書に記載の式（Ｉ）の融合タンパク質および肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含む治療上有効な量の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
さらなる定義
本明細書においてそうではないことが説明または定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の熟練者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、分子生物学における一般用語の定義はBenjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (編), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers出版, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出せる。

【0133】

単数形の用語「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示語を含む。同様に、「または」という語は、文脈がそうではないことを明示しない限り、「および」を含むことが意図される。さらに、核酸またはポリペプチドに関して示される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および分子量または分子質量値は概数であり、記述のために示されるものと理解される。さらに、抗原などの物質の濃度またはレベルに関して示される数値限界も概数であり得る。従って、濃度が（例えば、）およそ２００ｐｇであると示される場合、その濃度が２００ｐｇよりもやや多いまたはやや少ない（「約」または「〜」）値を含むことが意図される。

【0134】

本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料本開示の実施または教示に使用可能であるが、好適な方法および材料を以下に記載する。

【0135】

用語「含む(comprises)」は、「包含する(includes)」を意味する。従って、文脈がそうではないことを要さない限り、「含む(comprises)」および「含む(cocmprise)」および「含む(comprising)」などの変形形態は、記載の化合物または組成物（例えば、核酸、ポリペプチド、抗原）もしくは工程、または化合物群もしくは工程群の包含を意味するが、他の任意の化合物、組成物、工程、またはそれらの群の排除を意味しないものと理解される。省略形「e.g.」は、ラテン語の例えば(exempli gratia)に由来し、本明細書では限定されない例を示すために使用される。従って、省略形「e.g.」は、用語「例えば」と同義である。

【0136】

本明細書で使用する場合、「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、および非霊長類哺乳類、例えば、齧歯属（限定されるものではないが、マウスおよびラットを含む）のメンバーおよびウサギ目（限定されるものではないが、ウサギを含む）のメンバーを含む、哺乳類である。

【0137】

本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、ワクチン、免疫療法薬、または他の抗原もしくは免疫原含有組成物とのコンジュゲーションで対象に投与した際に、投与された抗原または免疫原に対する対象の免疫応答を（アジュバントの不在下で得られるであろう免疫応答に比べて）増大または増強する化合物または物質を意味する。これは癌治療に関して米国国立衛生研究所の国立癌研究所により定義される、一次治療の後に施される、癌が再発するリスクを低減するための追加治療としての「補助療法」とは区別される。

【0138】

保存的置換は周知であり、一般に、配列アラインメントコンピュータープログラムにおいてデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、ＰＡＭ２５０(Dayhoft M.O. et al., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, In “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (編), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、およびＢｌｏｓｕｍ ６２ (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919が含まれる。本発明はさらに、保存的アミノ酸置換を含有する式（Ｉ）の融合タンパク質を提供する。例えば、式（Ｉ）の融合タンパク質は、本明細書に示される配列のいずれかに記載されるインフルエンザ菌のＰＥまたはＰｉｌＡ（例えば、配列番号４〜配列番号５７で示されるいずれかのＰＥ配列、配列番号５８〜配列番号１２１で示されるいずれかの任意のＰｉｌＡ配列）に由来する任意のアミノ酸の保存的置換を含み得る。

【0139】

本明細書で使用する場合、「シグナルペプチド」は、前駆体タンパク（一般にＮ末端）上に存在し、一般に成熟タンパク質には不在の短い（６０個未満のアミノ酸、例えば、３〜６０個のアミノ酸）ポリペプチドを意味する。シグナルペプチド（ｓｐ）は一般に疎水性アミノ酸に富む。シグナルペプチドは、翻訳されたタンパク質の膜を経た輸送および／または分泌を指示する。シグナルペプチドはまた、標的シグナル、輸送ペプチド、局在シグナル、またはシグナル配列とも呼ばれる。例えば、シグナル配列は、共翻訳または翻訳後シグナルペプチドであり得る。

【0140】

異種シグナルペプチドは、タンパク質輸送または分泌の際またはその後にシグナルペプチドペプチダーゼにより融合タンパク質構築物から切断され得る。例えば、シグナルペプチドペプチダーゼは、シグナルペプチドペプチダーゼＩである。「異種」シグナルペプチドは、それが天然に存在する場合にそのタンパク質とは会合していないものである。

【0141】

本明細書で使用する場合、「処置」は、対象におけるその病態また疾患の症状の発生の予防、対象におけるその病態また疾患の症状の再発の予防、対象におけるその病態また疾患の症状の再発の遅延、対象におけるその病態また疾患の症状の重篤度または頻度の低減、病態の進行の緩徐化または排除、および対象における疾患または病態の症状の部分的または完全排除を意味する。

【0142】

本明細書で使用する場合、「任意選択により」は、続いて記載される事象が存在しても存在しなくてもよいことを意味し、存在する事象および存在しない事象を含むことを意味する。

【0143】

本特許明細書内に引用される参照文献または特許出願は全て、引用することにより本明細書の一部とされる。

【0144】

本明細書で使用する場合、「乳幼児」は、０〜２歳のヒトを意味する。

【0145】

本明細書で使用する場合、「成人」は、１８歳を超えるヒトを意味する。

【0146】

本明細書で使用する場合、「高齢者」は、６０歳を超える、任意選択により、６５歳を超えるヒトを意味する。

【実施例】

【0147】

実施例では、以下の用語は、示された意味を有する。
６ｘｈｉｓ＝６ヒスチジン；
ｘｇ＝遠心力（重力数）；
ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸；
ＢＣＡ＝ビシンコニン酸；
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン；
℃＝摂氏度；
ＣａＣｌ_２＝塩化カルシウム；
ＣＶ＝カラム容量；
ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸；
ＤＳＣ＝示差走査熱量測定；
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール；
ｄＮＴＰ＝デオキシヌクレオシド三リン酸；
ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸；
ＦＴ＝フロースルー；
ＨＣｌ＝塩化水素；
Ｈｉｓ＝ｈｉｓ＝ヒスチジン；
ＨＥＰＥＳ＝４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；
ＩＭＡＣ＝固定化メタルアフィニティークロマトグラフィー；
ＩＰＴＧ＝イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド；
ＫＣｌ＝塩化カリウム；
Ｋ_２ＨＰＯ_４＝第二リン酸カリウム；
ＫＨ_２ＰＯ_４＝第一リン酸カリウム；
ＬＤＳ＝ドデシル硫酸リチウム；
Ｌ＝リットル；
ＭＥＳ＝２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸；
ＭｇＣｌ_２＝塩化マグネシウム；
ｍｌ＝ミリリットル；
ＲＰＭ＝回転毎分
ｍｉｎ＝分；
ｍＭ＝モリモル；
μＬ＝マイクロリットル；
ＮａＣｌ＝塩化ナトリウム；
Ｎａ_２ＨＰＯ_４＝第二リン酸水素ナトリウム；
ＮａＨ_２ＰＯ_４＝第一リン酸ナトリウム；
ｎｇ＝ナノグラム；
ｎｍ＝ナノメートル；
Ｏ／Ｎ＝一晩；
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；
ＳＢ＝サンプルバッファー；
ｓｅｃ＝秒；
ｗ／ｖ＝重量／容量
ＰＳ＝多糖、「糖類」と互換的に使用することができる。
１．実施例
実施例１：融合タンパク質
種々のシグナルペプチドおよびアミノ酸リンカー配列との融合タンパク質を作製した。これらの融合タンパク質は、タンパク質ＥおよびＰｉｌＡ（またはそれらの断片）の両方の分泌を、単一の細菌株に限定されることなく可能とした。融合タンパク質は、シグナルペプチドペプチダーゼにより異種シグナルペプチドが取り除かれた後に周辺質に放出される。細菌から精製された融合タンパク質は、異種シグナルペプチドを含有しない。「精製された」タンパク質は、細菌から取り出され、シグナルペプチドを欠く。

【0148】

下表に作製した融合タンパク質構築物を記載する。

【0149】

【表3】

表３に挙げたシグナルペプチドおよびプラスミドそれぞれのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
シグナル配列：

融合タンパク質構築物配列：
アミノ酸配列の一本の下線を引いた箇所はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡに由来する。アミノ酸配列の太い下線を引いた箇所はＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ７７２株に由来するタンパク質Ｅに由来した。

上記配列が得られたＰＥ及びＰｉｌＡの全長配列を、配列番号４（ＰＥ）及び配列番号５８（ＰｉｌＡ）にそれぞれ示す。
実施例２：ベクター構築物及び形質転換
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ７７２株由来のＰＥを増幅するためのプライマーをＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｈｉ Ｒｄ株の配列に基づいて設計した。５’プライマー配列はＮＴＨｉ ７７２配列と比べて一つ異なるヌクレオチドを含み、これは現在報告されているＮＴＨｉ ７７２ゲノム配列と比べて、２４位に異なるアミノ酸が導入されている。融合タンパク質構築物におけるアミノ酸＃２４は、ＮＴＨｉ ７７２にて見出されるＫ（リシン）に代えて、グルタミン酸である。

ベクター構築：
ＬＶＬ３１２、ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８、ＬＶＬ２６９、ＬＶＬ２７０、ＬＶＬ７０２、ＬＶＬ７３５、ＬＶＬ７７８、ＬＶＬ７７９、ＬＶＬ７８０、ＬＶＬ７８１およびＬＶＬ７８２を作製するために、下記の成分のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）調製物を調製した（具体的成分を次に例示する）：３６．６μｌの脱イオン水、５μｌのバッファー＃１ １０×、５μｌのｄＮＴＰ ２ｍＭ、２μｌのＭｇＣｌ_２ ２５ｍＭ、０．４μｌのプライマー＃１（５０μＭ）、０．４μｌのプライマー＃２（５０μＭ）、０．５μｌの鋳型（１００ｎｇ／μｌ）および０．４μｌのＫＯＤ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位／μｌ（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））を配合した。ポリメラーゼ連鎖反応は、９８℃で１５秒の変性、５５℃で２秒のアニーリングおよび７２℃で２０秒のプライマー伸長を２５サイクル含んだ。ＰＣＲ産物をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて精製した。この産物を、１容量のＰＣＲ調製物に対して、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ精製キットに提供されている５容量のバッファーＰＢの添加という供給者により推奨されている条件下で使用した。次に、バッファーＰＢを含むＰＣＲ調製物をボルテックスにより混合した。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを２ｍｌのコレクションチューブに入れた。ＰＣＲ調製物中のＤＮＡをカラムに結合させるため、混合したサンプルをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムに適用し、１４０００ＲＰＭで３０〜６０秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを同じチューブに戻した。結合したＤＮＡを洗浄するために、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ精製キットに提供されている０．７５ｍｌのバッファーＰＥをＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムに加え、このカラムを１４０００ＲＰＭで３０〜６０秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを同じチューブに戻した。残留する洗浄バッファーを除去するために、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを２ｍｌコレクションチューブ中でもう１回、１分間、遠心分離した。各ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）カラムを１．５ ｍｌの透明なマイクロ遠沈管に入れた。ＤＮＡを溶出させるため、３３μｌの水をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）膜の中央に加え、カラムを１４０００ＲＰＭで１分間遠心分離した。制限酵素および関連のバッファーはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓから入手した。例えば、およそ５μｌのｐＥＴ２６ｂベクター（１００ｎｇ／μｌ）、２μｌのＮＥバッファー２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、１×ＮＥバッファー２：５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭジチオトレイトール、ｐＨ７．９、２５℃）、１μｌのＮｄｅＩ（２００００単位／ｍｌ）、１μｌのＨｉｎｄＩＩＩ（２００００単位／ｍｌ）および１１μｌの脱イオン水を混合し、ＤＮＡ消化のために３７℃で２時間インキュベートした。その後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を上記の手順に従って用い、第２段階の精製を行った。

【0150】

ライゲーションは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓからのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＱｕｉｃｋライゲーション反応バッファーを用いて行った。例えば、１０μｌの脱イオン水中、１０ｎｇ前後のベクターおよび３０ｎｇのインサートを、１０μｌの２×Ｑｕｉｃｋライゲーション反応バッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、１３２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ ＡＴＰ、１５％ポリエチレングリコール、ｐＨ７．６、２５℃）および１μｌのＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。この酵素反応物を室温で５分間インキュベートした後、形質転換を行った。

【0151】

ＬＶＬ３１５、ＬＶＬ３１７、ＬＶＬ３１８、ＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９およびＬＶＬ７４０を作製するために、下記の成分のＰＣＲ調製物を調製した：４０μｌの脱イオン水、５μｌの反応バッファー１０×、１μｌのｄＮＴＰｓミックス、１μｌのプライマー＃１（１０μＭ）、１μｌのプライマー＃２（１０μＭ）、１μｌの鋳型（２５ｎｇ／μｌ）および１μｌのＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位／μｌ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を配合した。ポリメラーゼ連鎖反応は、９５℃で３０秒の変性１サイクル、９５℃で３０秒の変性、５５℃で１分のアニーリング、および６８℃で５分３０秒のプライマー伸長１８サイクルを含んだ。ＰＣＲ産物を１μｌのＤｐｎＩ制限酵素を用い、３７℃で１時間消化した後、形質転換を行った。

【0152】

増幅に用いたＰＣＲプライマー配列の詳細な一覧を表４に示す。

【0153】

ｐＲＩＴ１６７１１を作製するため、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０をコードするＰＥ遺伝子断片（その対応する分泌シグナルをコードする配列を除く）を、ＮＴＨｉ ７７２株のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。増幅プライマーは、利用可能なＨｉ Ｒｄ株配列に基づいて設計した（その時点で、７７２配列は未知であった）。５’プライマー配列は、ＮＴＨｉ ７７２配列（現在利用可能なものとしての配列）に比べて１つの突然変異を含み、２４番のＰＥコード配列に１つのアミノ酸の違い、すなわち、リシン（Ｋ）の代わりにグルタミン酸（Ｅ）が導入されている。ＰＣＲ増幅後、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用い、インサートをｐＥＴ−２６（＋）発現ベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））にクローニングした。

【0154】

ｐＲＩＴ１６６７１を生成するために、ＰｉｌＡ遺伝子断片（配列番号５８のアミノ酸４０〜１４９、配列番号１２７）をコードするＤＮＡ断片（そのリーダーペプチドならびに推定疎水性αヘリックスの部分を除く）を、ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株のゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＥＴ１５発現ベクターにクローニングした。ベクターｐＲＩＴ１６７９０（ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株に由来するアミノ酸４０〜１４９を含有する）を鋳型として用い、ベクターｐＲＩＴ１６６７１を作製した。ＰｉｌＡ遺伝子断片は、ベクターｐＲＩＴ１６７９０ならびにプライマーＭＤＥＳ ＰＩＬＡ−３およびＭＤＥＳ ＰＩＬＡ−４を用い、ＰＣＲにより増幅した。このＰｉｌＡ断片を、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてｐＥＴ−２６発現ベクターにクローニングした。６ヒスチジン（ｈｉｓ）アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＰｉｌＡ配列のＮ末端に６ヒスチジン（６ｘｈｉｓ）を付加した（ＭＤＥＳ ＰＩＬＡ−３）。

【0155】

ＬＶＬ３１２（ＦｌｇＩシグナルペプチド−Ｅ−ＰｉｌＡ断片−ＧＧ−ＰＥ断片−ＧＧＨＨＨＨＨＨ）を作製するために、鋳型としてのｐＲＩＴ１６６７１ベクターとプライマーＣＡＮ５３４およびＣＡＮ５３７を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰｉｌＡ遺伝子（アミノ酸４０〜１４９／８６−０２８ＮＰ株）を増幅した。ＦｌｇＩシグナルペプチド（ｓｐ）およびグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５３４）に組み込んだ。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、２個のグリシン（ＧＧ）に相当するＤＮＡ配列をアミノ酸リンカーおよびＮ末端ＰＥアミノ酸を３’プライマー（ＣＡＮ５３７）に組み込んだ。鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１１ベクターとプライマーＣＡＮ５３６およびＣＡＮ５３８を用い第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰＥ遺伝子（アミノ酸１８〜１６０）を増幅した。ｐｉｌＡをＰＥ配列に連結するために、Ｃ末端ＰｉｌＡアミノ酸およびＧＧアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５３６）に組み込んだ。ＧＧアミノ酸リンカーおよび６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５３８）に組み込んだ。最後に、ＬＶＬ３１２を作製するために、第３のポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎ末端にＦｌｇＩシグナルペプチド、ＦｌｇＩとｐｉｌＡの間にグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸、ＰｉｌＡ配列とＰＥ配列の間にＧＧリンカーおよびＰＥとＣ末端の６ｘｈｉｓアミノ酸の間にＧＧリンカーとなるように融合したＰｉｌＡおよびＰＥ遺伝子を増幅した。この増幅を達成するために、鋳型としての上記の２つのポリメラーゼ連鎖反応の産物をプライマーＣＡＮ５３４およびＣＡＮ５３８とともに用いた。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0156】

ＬＶＬ２９１（ｐｅｌＢシグナルペプチド−ＰＥ断片−ＧＧ−ＰｉｌＡ断片−ＧＧ−６ｘｈｉｓ）を作製するために、鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１１ベクターとプライマーＣＡＮ５４４およびＣＡＮ５４６を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰＥ遺伝子（アミノ酸１９〜１６０）を増幅した。ｐｅｌＢシグナルペプチド（ｓｐ）アミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４４）に組み込んだ。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、ＧＧアミノ酸リンカーおよびＮ末端ＰｉｌＡアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５４６）に組み込んだ。鋳型としてのｐＲＩＴ１６６７１ベクターをプライマーＣＡＮ５４５およびＣＡＮ５３５とともに用いて第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰｉｌＡ遺伝子（配列番号５８のアミノ酸４０〜１４９、配列番号１２７）を増幅した。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、Ｃ末端ＰＥアミノ酸およびＧＧアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４５）に組み込んだ。リンカーＧＧアミノ酸および６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５３５）に組み込んだ。最後に、ＬＶＬ２９１を作製するために、第３のポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎ末端にｐｅｌＢシグナルペプチド、ＰＥ配列とＰｉｌＡ配列の間にＧＧリンカーおよびＰｉｌＡとＣ末端の６ｘｈｉｓアミノ酸の間にＧＧリンカーとなるように融合したＰＥおよびＰｉｌＡ遺伝子を増幅した。この増幅を達成するために、鋳型としての上記の２つのポリメラーゼ連鎖反応の産物をプライマーＣＡＮ５４４およびＣＡＮ５３５とともに用いた。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0157】

ＬＶＬ２６８（ｐｅｌＢシグナルペプチド−Ｄ−ＰＥ断片−ＧＧ−ＰｉｌＡ断片−ＧＧ−６ｘｈｉｓ）を作製するために、鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１１ベクターをプライマーＣＡＮ５４７およびＣＡＮ５４６とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰＥ遺伝子（アミノ酸２０〜１６０）を増幅した。ｐｅｌＢシグナルペプチド（ｓｐ）アミノ酸およびアスパラギン酸（Ｄ）アミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４７）に組み込んだ。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、ＧＧアミノ酸リンカーおよびＮ末端ＰｉｌＡアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５４６）に組み込んだ。鋳型としてのｐＲＩＴ１６６７１ベクターをＣＡＮ５４５およびＣＡＮ５３５を用いて第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰｉｌＡ遺伝子（アミノ酸４０〜１４９／ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株）を増幅した。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、Ｃ末端ＰＥアミノ酸およびＧＧアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４５）に組み込んだ。リンカーＧＧアミノ酸および６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５３５）に組み込んだ。最後に、ＬＶＬ２６８を作製するために、第３のポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎ末端にｐｅｌＢシグナルペプチド、ｐｅｌＢシグナルペプチドとＰＥの間にＤアミノ酸、ＰＥ配列とｐｉｌＡ配列の間にＧＧリンカーおよびＰｉｌＡとＣ末端の６ｘｈｉｓアミノ酸の間にＧＧリンカーとなるように融合したＰＥおよびＰｉｌＡ遺伝子を増幅した。この増幅を達成するために、鋳型としての上記の２つのポリメラーゼ連鎖反応の産物をプライマーＣＡＮ５４７およびＣＡＮ５３５とともに用いた。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0158】

ＬＶＬ２６９（ＮａｄＡシグナルペプチド−ＡＴＮＤＤＤ−ＰＥ断片−ＧＧ−ＰｉｌＡ断片−ＧＧ−６ｘｈｉｓ）を作製するために、鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１１ベクターをプライマーＣＡＮ５４８およびＣＡＮ５４６とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰＥ遺伝子（配列番号４のアミノ酸２２〜１６０）を増幅した。ｐｅｌＢシグナルペプチド（ｓｐ）アミノ酸およびＡＴＮＤＤＤアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４８）に組み込んだ。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、ＧＧアミノ酸リンカーおよびＮ末端ＰｉｌＡアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５４６）に組み込んだ。鋳型としてのｐＲＩＴ１６６７１ベクターをプライマーＣＡＮ５４５およびＣＡＮ５３５とともに用いて第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰｉｌＡ遺伝子（配列番号５８のアミノ酸４０〜１４９、配列番号１２７）を増幅した。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列に連結させるために、Ｃ末端ＰＥアミノ酸およびＧＧアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４５）に組み込んだ。リンカーＧＧアミノ酸および６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５３５）に組み込んだ。最後に、ＬＶＬ２６９を作製するために、第３のポリメラーゼ連鎖反応を行い、Ｎ末端にＮａｄＡシグナルペプチド、ｐｅｌＢシグナルペプチドとＰＥの間にＡＴＮＤＤＤアミノ酸、ＰＥ配列とｐｉｌＡ配列の間にＧＧリンカーおよびＰｉｌＡとＣ末端の６ｘｈｉｓアミノ酸の間にＧＧリンカーとなるように融合したＰＥおよびＰｉｌＡ遺伝子を増幅した。この増幅を達成するために、鋳型としての上記の２つのポリメラーゼ連鎖反応の産物をプライマーＣＡＮ５４８およびＣＡＮ５３５とともに用いた。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0159】

ＬＶＬ２７０（Ｍ−６ｘＨｉｓ−ＰＥ断片−ＧＧ−ＰｉｌＡ断片）を作製するために、鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１１ベクターをプライマーＣＡＮ５４０およびＣＡＮ５４２とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰＥ遺伝子（アミノ酸１７〜１６０）を増幅した。６ｘｈｉｓアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４０）に組み込んだ。ＰｉｌＡ配列をＰＥ配列と連結させるために、ＧＧアミノ酸リンカーおよびＮ末端ＰｉｌＡアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を３’プライマー（ＣＡＮ５４２）に組み込んだ。鋳型としてのｐＲＩＴ１６６７１ベクターをプライマーＣＡＮ５４１およびＣＡＮ５４３とともに用いて第２のポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＰｉｌＡ遺伝子（アミノ酸４０〜１４９／ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株）を増幅した。ＰｉｌＡをＰＥ配列と連結させるために、Ｃ末端ＰＥアミノ酸およびＧＧアミノ酸に相当するＤＮＡ配列を５’プライマー（ＣＡＮ５４１）に組み込んだ。最後に、ＬＶＬ２７０を作製するために、第３のポリメラーゼ連鎖反応を行い、６−ｈｉｓ−ＰＥ−ＧＧ−ＰｉｌＡ遺伝子を融合物として増幅した。この増幅を達成するために、鋳型としての上記の２つのポリメラーゼ連鎖反応の産物をプライマーＣＡＮ５４０およびＣＡＮ５４３とともに用いた。ＮｄｅＩ制限部位に相当するＤＮＡ配列を５’プライマーに組み込み、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0160】

ＬＶＬ３１５（ｐｅｌＢシグナルペプチド−ＭＤ−ＰＥ断片−ＧＧ−ＰｉｌＡ断片−ＧＧ−６ｘｈｉｓ）を作製するために、鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ６７０およびＣＡＮ６７１とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて部位特異的突然変異誘発を行い、Ｎ末端ＰＥアミノ酸配列のＱＩＱ〜ＭＤを変化させた。

【0161】

ＬＶＬ３１７（ｐｅｌＢシグナルペプチド−ＰＥ断片−ＧＧ−ｐｉｌＡ断片）を作製するために、鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ６７８およびＣＡＮ６７９とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて部位特異的突然変異誘発を行い、ＰｉｌＡ遺伝子とＧＧＨＨＨＨＨＨアミノ酸残基に相当するＤＮＡ配列（配列番号３）の間に終止コドンを組み込んだ。

【0162】

ＬＶＬ３１８（ｐｅｌＢシグナルペプチド−ＭＤ−ＰＥ−ＧＧ−ＰｉｌＡ）を作製するために、鋳型としてのＬＶＬ３１５をプライマーＣＡＮ６７８およびＣＡＮ６７９とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を用いて部位特異的突然変異誘発を行い、ＰｉｌＡ遺伝子とＧＧＨＨＨＨＨＨアミノ酸残基（配列番号３）に相当するＤＮＡ配列との間に終止コドンを組み込んだ。

【0163】

ＬＶＬ７０２（ＬＶＬ２９１ ΔＱ）を作製するために、鋳型としてのＬＶＬ２９１ベクターとプライマーＣＡＮ１５１７およびＣＡＮ１５１８を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＬＶＬ２９１配列上の２３番におけるアミノ酸Ｑに相当する３つのヌクレオチドの欠失を５’プライマーに組み込んだ。ＬＶＬ７０２とＬＶＬ２９１の間の唯一の違いは、ＬＶＬ２９１配列上の２３番におけるアミノ酸Ｑの欠失である。ＮｄｅＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ５’プライマーおよび３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0164】

ＬＶＬ７３５（ＬＶＬ３１７ ΔＱ）を作製するために、鋳型としてのＬＶＬ３１７ベクターとプライマーＣＡＮ１５１７およびＣＡＮ１５１９を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＬＶＬ３１７配列上の２３番におけるアミノ酸Ｑに相当する３つのヌクレオチドの欠失を５’プライマーに組み込んだ。ＬＶＬ７３５とＬＶＬ３１７の間の唯一の違いは、ＬＶＬ３１７配列上の２３番におけるアミノ酸Ｑの欠失である。ＮｄｅＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ５’プライマーおよび３’プライマーに組み込んだ。作製されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0165】

ＬＶＬ７３６（ＬＶＬ２９１＋ＳＡ）を作製するために部位特異的突然変異誘発を行い、ＬＶＬ２９１配列上のアミノ酸２２と２３の間にアミノ酸ＳおよびＡを付加した。鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ１５３１およびＣＡＮ１５３２とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いた。

【0166】

ＬＶＬ７３７（ＬＶＬ２９１＋Ａ）を作製するために部位特異的突然変異誘発を行い、ＬＶＬ２９１配列上のアミノ酸２２と２３の間にアミノ酸Ａを付加した。鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ１５２９およびＣＡＮ１５３０とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いた。

【0167】

ＬＶＬ７３８（ＬＶＬ２９１ ΔＱＩＱ）を作製するために部位特異的突然変異誘発を行い、ＬＶＬ２９１配列上の２３〜２５番のアミノ酸Ｑ、ＩおよびＱを欠失させた。鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ１５２３およびＣＡＮ１５２４とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いた。

【0168】

ＬＶＬ７３９（ＬＶＬ２９１ ΔＱＩＱＫ）を作製するために部位特異的突然変異誘発を行い、ＬＶＬ２９１配列上の２３〜２６番のアミノ酸Ｑ、Ｉ、ＱおよびＫを欠失させた。鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ１５２５およびＣＡＮ１５２６とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いた。

【0169】

ＬＶＬ７４０（ＬＶＬ２９１ ΔＱＩＱＫＡ）を作製するために部位特異的突然変異誘発を行い、ＬＶＬ２９１配列上の２３〜２７番のアミノ酸Ｑ、Ｉ、Ｑ、ＫおよびＡを欠失させた。鋳型としてのＬＶＬ２９１をプライマーＣＡＮ１５２７およびＣＡＮ１５２８とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いた。

【0170】

ＬＶＬ７７８（ＬＶＬ７３６ Δ６ｘＨｉｓタグ）、ＬＶＬ７７９（ＬＶＬ７３７ Δ６ｘＨｉｓタグ）、ＬＶＬ７８０（ＬＶＬ７３８ Δ６ｘＨｉｓタグ）、ＬＶＬ７８１（ＬＶＬ７３９ Δ６ｘＨｉｓタグ）およびＬＶＬ７８２（ＬＶＬ７４０ Δ６ｘＨｉｓタグ）を作製するために、それぞれ鋳型としてのＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９およびＬＶＬ７４０ベクターをプライマーＣＡＮ１６６９およびＣＡＮ５４３とともに用いてポリメラーゼ連鎖反応を行った。６ｘＨｉｓタグの欠失は、Ｃ末端配列のアミノ酸配列ＧＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）に相当する。この欠失を３’プライマーに組み込んだ。ＮｄｅＩ制限部位およびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位をそれぞれ５’プライマーおよび３’プライマーに組み込んだ。生成されたＰＣＲ産物を次に、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）クローニングベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））に挿入した。

【0171】

【表4】

形質転換
大腸菌(Escherichia coli)ＢＬＲ（ＤＥ３）または大腸菌ＨＭＳ（ＤＥ３）細胞を、ＣａＣｌ_２処理細胞を用いた標準的方法に従ってプラスミドＤＮＡで形質転換した(Hanahan D. ≪ Plasmid transformation by Simanis. ≫ In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)。簡単に述べれば、ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）コンピテント細胞を氷上で温和に解凍した。およそ４μｌのプラスミド（１０〜１００ｎｇ）を、５０〜１００μｌコンピテント細胞を用いて混合した。その後、この配合物を氷上で３０分間インキュベートした。形質転換反応を行うために、配合物に４２℃で４５秒、熱パルスをかけた後、氷上で２分間インキュベートした。およそ０．５ｍｌのＳＯＣ培地(Super Optimal broth with Catabolite repression)を形質転換細胞に加え、細胞培養物を３７℃で１時間インキュベートした後、５０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天に播種した。１００μｌ前後の形質転換細胞培養物を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。

【0172】

ＢＬＲ（ＤＥ３）： ＢＬＲは、ＢＬ２１のｒｅｃＡ⁻誘導体（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）である。組換えタンパク質の発現に使用されるこの大腸菌株はプラスミド単量体収率を改善し、反復配列を含有するまたはその産物がＤＥ３プロファージの損失を生じ得る標的プラスミドを安定化させる助けとなり得る(Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44)。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）の詳細な遺伝子型は、ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）により公開されている（Ｆ−ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−） ｇａｌ ｄｃｍ Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）（ＤＥ３）。

【0173】

ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）： ＨＭＳ１７４株は、Ｋ−１２バックグラウンドでｒｅｃＡ突然変異を提供する。ＢＬＲと同様に、これらの株は、その産物がＤＥ３プロファージの損失を生じ得るある特定の標的遺伝子を安定化させ得る。大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の詳細な遺伝子型は、ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）により公開されている（Ｆ− ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ（ｒＫ１２− ｍＫ１２＋）（ＤＥ３）（Ｒｉｆ Ｒ）。
ＢＬＲ（ＤＥ３）を用いた生産およびＨｉｓタグを有する構築物の特徴を実施例３〜実施例６に記載する。
実施例３：振盪フラスコを用いたタンパク質発現
一般に、組換えプラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を播種した１枚のコンフルエント寒天プレートを掻き取り、培養培地に再懸濁させ、これを用いて、８００ｍｌのＬＢブロス（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）±１％（重量／容量、ｗ／ｖ）グルコース（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ＭＡＴ、カタログ番号：ＧＲ−０１０１）および５０μｇ／ｍｌカナマイシン（Ｓｉｇｍａ）を、Ｏ．Ｄ．_{６００ｎｍ}が０．１〜０．２となるまで播種した。培養物を、Ｏ．Ｄ．_{６００ｎｍ}が約０．８に達するまで、３７℃にて２５０ＲＰＭの回転でインキュベートした。

【0174】

次に、１ｍｌの各培養物を回収し、１４０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清およびペレットを−２０℃で別々に冷凍した。

【0175】

Ｏ．Ｄ．_{６００ｎｍ}が約０．８の時、ＢＬＲ（ＤＥ３）培養物を冷却（−２０℃、２０分または４℃、１時間、好ましくは、４℃、１時間）した後、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号：５８１５）を添加して１６、２２および３０℃で一晩、または２５０ＲＰＭで振盪しながら３７℃で３時間、好ましくは、２２℃で一晩インキュベートすることにより組換えタンパク質の発現を誘導した。この誘導期間の後、培養物を１４０００ＲＰＭで５分間または６０００ＲＰＭで１５分間遠心分離し、上清（培地画分サンプル）およびペレット（可溶性および不溶性画分を含有する）を−２０℃で別々に冷凍した。

【0176】

これらの条件を周辺質タンパク質発現に用いた。
実施例４：振盪フラスコ、細胞ペースト、Ｈｉｓタグを有する構築物を用いたタンパク質精製
誘導後に得られた各細菌ペレットを、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールおよびＲｏｃｈｅ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（１錠／５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー、Ｒｏｃｈｅ ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ錠、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する２０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファー（ｐＨ８．０）を再懸濁した。

【0177】

あるいは、ＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳバッファーの代わりに２０〜５０ｍＭのビシンバッファー用いてよい。例えば、２０ｍＭのビシンバッファーを用いてよい。細菌を、Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ １．１ ＫＷ ２ Ｘ ３００００ ＰＳＩ(pounds per square inch)用いて溶解させた。２００００ｇで４℃にて２０分間遠心分離することによって可溶性（上清）と不溶性（ペレット）成分を分離した。

【0178】

６−Ｈｉｓタグを有するタンパク質を、ＰＲＯＦＩＮＩＡ（商標）タンパク質精製プロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にて、非変性条件下で精製した。可溶性成分を細菌の再懸濁に用いたものと同じバッファーで予め平衡化した５ｍｌ容のＨｉｓ Ｔｒａｐカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）にロードした。なお、可溶性成分は最大５ｍｌ／分で添加した（「フロースルー画分」を形成）。カラムにロードした後に、カラムを１０カラム容量の同バッファーを用い、１０ｍｌ／分の測度で洗浄した（「洗浄画分＃１」を形成）。５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭビシンバッファーまたは２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）を用いて第２の洗浄を行った（「洗浄画分＃２」を形成）。５００ｍＭ ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含有する２カラム容量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーまたは５０ｍＭビシンバッファー（ｐＨ８．０）を用い、１０ｍｌ／分の測度で溶出を行った（「溶出画分」を形成する）。

【0179】

タンパク質の純度を改善するために、ＩＭＡＣからの陽性溶出画分をプールし、カルシウムまたはマグネシウム（ＮａＣｌ １３７ｍＭ、ＫＣｌ ２．７ｍＭ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ ８．１ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４ １．４７ｍＭ、ｐＨ７．４）を除いたリン酸緩衝生理食塩水で予め平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅからのＨＩＬＯＡＤ（商標）ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００ ２６／６０）にロードした。溶出画分からのサンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ １００００ＭＷ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてサンプルを濃縮した。

【0180】

タンパク質濃度は分光計を用いて測定した。
実施例５：Ｈｉｓタグを有する構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析ならびにｈｉｓタグを有さないＬＶＬ３１７およびＬＶＬ３１８構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
可溶性画分および不溶性画分の調製
例えば、誘導後の１ｍｌの培養物（例えば、上記の実施例３参照）を１４０００ＲＰＭで２分間遠心分離した。ペレットを、４０μｌのＢＵＧＢＵＳＴＥ（登録商標）タンパク質抽出試薬（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）、ＥＭＤ４ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｒｃｋ）を用いて再可溶化して細胞懸濁液を作製した。この細胞懸濁液を回転プラットフォーム上、室温で１０分間インキュベートした。次に、この細胞懸濁液を１４０００ＲＰＭで２分間遠心分離して可溶性画分を分離した。得られたペレット（不溶性画分）を、７０μｌの脱イオン水、５μｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）１Ｍおよび２５μｌのＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）サンプルバッファー４×（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を用いて再可溶化した。可溶性画分（再可溶化ペレットの細胞懸濁液からの上清）を３０μｌの脱イオン水、５μｌのＤＴＴ １Ｍおよび２５μｌのＬＤＳサンプルバッファー４×に加えた。
培地画分の調製
例えば、培地画分を調製するために、遠心分離後の誘導済みの全細胞培養物からの１００μｌの上清（例えば、上記の実施例３参照）を、５００μｌのＲＣ試薬Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を加えることによって濃縮し、このサンプルを室温で１分間混合し、インキュベートした。次に、５００μｌの試薬ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）をこのサンプルに加え、混合した。この配合物を１４０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。ペレットを、２８μｌの脱イオン水、２μｌのＤＴＴ １Ｍおよび１０μｌのＬＤＳ ＳＢ ４×を用いて再可溶化した。
精製画分の調製
例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために、７０μｌのサンプル、５μｌのＤＴＴ １Ｍおよび２５μｌのＬＤＳサンプルバッファー４×を加えることにより、精製タンパク質（例えば、実施例４に記載の通りに得た）調製した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびニトロセルロース膜への転写
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびニトロセルロース膜への転写は、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４−１２％ゲルを用い、製造者の推奨（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って行った。サンプル、バッファーの調製および泳動条件は、供給者が推奨している条件下で行った。

【0181】

一例では、ゲルに、７０μｌの精製タンパク質画分、５μｌのＤＴＴ １Ｍおよび２５μｌのＬＤＳ ＳＢ ４×を含むマスターミックスからの２０μｌサンプルをロードした。

【0182】

サンプルをＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４〜１２％ゲルに流した後、それらのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。

【0183】

ニトロセルロース膜を、３％ミルク／ＰＢＳ １×新鮮溶液を用い、３７℃、６０ＲＰＭで３０分間ブロッキングした。このブロッキングインキュベーションの後、一次抗体を（６Ｘ Ｈｉｓタグ（登録商標）抗体、Ａｂｃａｍ ＰＬＣ、カタログ番号：ａｂ９１０８）３％ミルク／ＰＢＳ １×新鮮溶液中１：１０００倍希釈で、３７℃、６０ＲＰＭにて１時間加えた。その後、膜を、各回、室温で０．０２％ポリソルベート(polsorbate)２０（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）／ＰＢＳ １×を用いて５分間、３回洗浄した。二次抗体（アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）ウサギ抗ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ウサギ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を、３％ミルク／ＰＢＳ １×新鮮溶液を用いて１：１４０００希釈で加えた。膜を３７℃、６０ＲＰＭで１時間インキュベートした。その後、膜を、０．０２％ポリソルベート２０（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）／ＰＢＳ １×を用いて室温で５分間３回洗浄した後、膜を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（例えば、ＢＣＩＰ（登録商標）／ＮＢＴ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）製、１錠剤／１０ｍｌ水）に曝した。

【0184】

融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９に関する誘導細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては図１を参照。誘導（ｉｎｄ）前後のＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９に関して、不溶性画分（Ｉ）、可溶性画分（Ｓ）および培養培地画分（Ｍ）をロードした。

【0185】

融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９の精製抽出物に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットに関しては図２を参照。ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ２６８およびＬＶＬ２６９の精製に関して、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分（Ｗ）および溶出画分（Ｅ）をロードした。抗ｈｉｓタグを用いて抽出物をプロービングした。

【0186】

融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１およびＬＶＬ３１５に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては図３を参照。ＬＶＬ２９１およびＬＶＬ３１５に関して、培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓｏｌ）、不溶性画分（Ｉｎｓ）、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分＃１（Ｗ１）、洗浄画分＃２（Ｗ２）および溶出画分（Ｅ）をロードした。

【0187】

融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１２に関する誘導細菌抽出物および精製抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては図４を参照。ＬＶＬ３１２に関して、培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓｏｌ）、不溶性画分（Ｉｎｓ）、フロースルー画分（Ｆｔ）、洗浄画分＃１（Ｗ１）、洗浄画分＃２（Ｗ２）および溶出画分（Ｅ）をロードした。

【0188】

融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１、ＬＶＬ７０２、ＬＶＬ７３６、ＬＶＬ７３７、ＬＶＬ７３８、ＬＶＬ７３９、ＬＶＬ７４０およびｐＥＴ２６ｂベクター（陰性対照）に関する誘導細菌抽出物由来の可溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては図２５を参照。（ａ）実験１（ｂ）実験２（ｃ）実験３。ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質を矢印で示す。

【0189】

実験１、２および３からの可溶性画分中の融合タンパク質の平均バンドパーセンテージに関しては図２６を参照。

【0190】

図５および図６のそれぞれにおいてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用したＬＶＬ３１７およびＬＶＬ３１８細菌抽出物は一般に上記のように調製した。

【0191】

図５．融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１７に関する誘導（１ｍＭおよび１０μＭ ＩＰＴＧ）細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。誘導前（ＮＩ）および誘導後（Ｉｎ）、可溶性画分（Ｓ）、不溶性画分（Ｉ）からの抽出物。

【0192】

図６．融合タンパク質構築物ＬＶＬ３１８に関する誘導（１ｍＭおよび１０μＭ ＩＰＴＧ）細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。誘導前（ＮＩ）および誘導後（Ｉｎ）、培養培地画分（Ｍ）、可溶性画分（Ｓ）、不溶性画分（Ｉ）からの抽出物。

【0193】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質分離物をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に転写した。クーマシーブルー染色タンパク質バンドを切り取り、シークネーターリアクター(sequenator reactor)に入れた。配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＯＣＩＳＥ（登録商標）タンパク質シーケンサー、モデル４９４−ｃＬＣを用いて、製造者のプロトコールに従って行った。

【0194】

【表5】

実施例６：ＬＶＬ２９１融合タンパク質の特徴
ＬＶＬ２９１の物理的特性：ＬＶＬ２９１におけるＰＥおよびＰｉｌＡの折り畳みおよび融点
円偏光二色性：
二次構造の解析
円偏光二色性（ＣＤ）を用いて、構造的非対称による左円偏光と右円偏光の吸収の違いを測定することによってタンパク質の二次構造組成を決定する。遠ＵＶ領域（１９０〜２５０ｎｍ）内のＣＤスペクトルの形状および大きさは、タンパク質がβ−シートを呈するかα−ヘリックスを呈するかまたはランダムコイル構造を呈するかによって異なる。あるタンパク質サンプルにおける各二次構造タイプの相対的存在量は、参照スペクトルとの比較によって計算することができる。

【0195】

遠ＵＶスペクトルは、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７２０分光偏光計にて、０，０１ｃｍの光路長を用いて１７８〜２５０ｎｍまで、１ｎｍの分解能帯域幅で測定する。セルの温度は、ＰｅｌｔｉｅｒサーモスタットＲＴＥ−１１１セルブロックによって２３℃に維持する。測定の間、１０Ｌ／分の窒素流を維持した。
結果：
ＰＥ（構築物ｐＲＩＴ１６７６２由来）、ＰｉｌＡ（構築物ｐＲＩＴ１６７９０由来）およびＰＥ−ＰｉｌＡタンパク質に関して得られた遠ＵＶ ＣＤスペクトルは、α構造とβ構造の混合物を含有する折り畳まれたタンパク質に特徴的なものであるが、ＰＥはＰｉｌＡおよびＰＥ−ＰｉｌＡよりもαヘリックスが有意に豊富である（図７、ＰＥ、ＰｉｌＡおよびＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質のＣＤスペクトル）。

【0196】

ひと度、キメラタンパク質として相互に結合したＰＥおよびＰｉｌＡ個々のタンパク質の折り畳みの完全性を評価し、次に、両方の間の可能性のある相互作用を確認するために、様々なスペクトルを計算した。

【0197】

ＰＥおよびＰｉｌＡ遠ＵＶスペクトルが組み合わさると、得られるスペクトルはＰＥ−ＰｉｌＡキメラ(chimer)のスペクトルに重なる（図８、ＰＥおよびＰｉｌＡ ＣＤスペクトルの組合せ）。この結果は、ＰＥ−ＰｉｌＡキメラ(chimer)が個々の成分中に検出される全ての二次構造を含むことを示唆する。それはまた、これらのタンパク質の融合が個々の成分の二次構造に大きな影響を持たないこと、および結果として、ＰＥおよびＰｉｌＡの折り畳みが、これらのタンパク質が分離状態であっても融合していても有意に異ならないことも示唆する。
融点評価：
融合物としての発現が個々のタンパク質の熱力学的特性に影響力を持つかどうかを評価するために、ＰＥ、ＰｉｌＡおよびＰＥ−ＰｉｌＡの融点を、温度によるαヘリックスの折り畳みの解除を円偏光二色性によってモニタリングすることにより評価した。

【0198】

αヘリックスの存在は、２２２ｎｍにおける円偏光二色性シグナルが最小であることを特徴とし、従って、温度上昇中の２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルの有意な増強は、タンパク質変性の指標となる。タンパク質が二次構造の欠如を受ける温度を決定することで、それらのタンパク質の半数がその構造を失ってしまう温度に相当する融点（Ｔｍ）の決定が可能となる。

【0199】

融点は、ＣＤ ２２２ｎｍプロットに対する温度から得られる熱変性曲線上の変曲点の同定により決定することができる。

【0200】

遠ＵＶ ＣＤにより決定されたＰｉｌＡおよびＰＥの融点は、それぞれ５２℃および６８℃である（図９、ＰｉｌＡの熱変性曲線；図１０、ＰＥの熱変性曲線）。

【0201】

ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質は、４８℃および７１℃に２つの明瞭に異なるＴｍを示す（図１１、ＰＥ−ＰｉｌＡの融合タンパク質熱変性曲線）。それらの値は、ＰＥおよびＰｉｌＡタンパク質がキメラ(chimer)中に結合されてもなお独立に折り畳まれること、およびそれらは分離状態であっても融合していても同様の温度で折り畳みを解くことを示す。４８℃でのＰｉｌＡ部分の折り畳み解除が沈殿を生じない、または７１℃におけるＰＥ部分のＴｍに影響を及ぼさないという所見は、融合物内でのＰＥとＰｉｌＡの間の相互作用が最小であること、およびそれらは互いに観察可能な大きな影響を持たないことを強く示唆する。タンパク質の融点は、バッファー組成物または相互作用分子の存在を含む様々な外部条件に感受性があり、ＰＥとＰｉｌＡの融合時に大きな変動が見られないということは、ＰＥとＰｉｌＡが相互に結合されている際に両者の構造および特性の大部分が保存されていることを強く示唆する。
実施例７：発酵プロセス
本発明の融合タンパク質は、当業者に公知の方法によって作製することができる。
実施例８：ＰＥ、ＰｉｌＡ、およびＬＶＬ３１７のタンパク質の精製
ｐＲＩＴ１６７６２からのＰＥタンパク質の精製：
ｐＲＩＴ１６７６２発現ベクターを作製するために、ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩ制限酵素を用いてｐＲＩＴ１６７１１ベクターを消化し、シグナル配列（ｐｅｌＢ）とＰＥの間の６個のアミノ酸残基を削除した。得られたベクターをｐＲＩＴ１６７１２と呼称した。このベクターでは、シグナル配列ｐｅｌＢとＰＥの間に３個のアミノ酸ＭＤＰが存在する。第２段階で、鋳型としてのｐＲＩＴ１６７１２をプライマーＭｎｏＮＴＨｉ−４４およびＭｎｏＮＴＨｉ−４５（表４に記載）とＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともに用いて部位特異的突然変異誘発を行い、アミノ酸配列をＭＤＰからＱＩＱへ変化させた。

【0202】

ＰＥ ＱＩＱ（ｐＲＩＴ１６７６２構築物由来）を含有する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のワーキングシードを−８０℃から解凍し、これを用い、３７℃、２１５ＲＰＭの振盪下で一晩インキュベートすることにより、ＬＢブロス中、１００ｍｌの前培養物を調製した。一晩インキュベートした後、８００ｍｌのＬＢ ＡＰＳを含有する８つのフラスコに１２．５ｍｌの前培養物を播種し、ＯＤ_６００は０．０６前後と測定された。これらの培養物を３７℃で振盪しながら３時間インキュベートした。ＯＤ_６００が０．９前後の際に、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、誘導を開始した。誘導中、培養物を２２℃で振盪しながら１９時間インキュベートした。誘導後、ＯＤ_６００は２．２前後であった。これらの細胞培養物を、１Ｌボトル内に入れた１Ｌ遠心バッグ中に移し、４℃で３０分間、６，０００ｘｇ遠心分離し、上清を廃棄した。誘導前後の培養物および上清の１ｍｌアリコートをさらなる分析のために保持した。
ＰＥ ＱＩＱで誘導したＢＬＲ（ＤＥ３）の溶解
遠心分離ボトルから遠心バッグを取り出し、開封し、ペレットをバックからビーカーに出した。８つのペレットを一緒にし、１００ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０１）に再懸濁させた。ＰＥ ＱＩＱ構築物を含有する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）をＣｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．製のＴＳ Ｓｅｒｉｅｓ Ｂｅｎｃｈ Ｔｏｐ細胞粉砕器（１×３０ｋＰｓｉ；１×１５ｋＰｓｉ）で粉砕した。溶解液を３０分間、６０００ＲＰＭ、４℃で遠心分離した。上清を維持し、ＩＭＡＣカラムにロードした。
ＰＥ ＱＩＱのＩＭＡＣ精製
ＩＭＡＣカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣカートリッジ５ｍｌ）を５ＣＶの結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０１）を５ｍｌ／分で用いて平衡化した。１００ｍｌの溶解液上清をＩＭＡＣに２．５ｍＬ／分でロードした。フロースルーをさらなる分析のために５０ｍｌ画分として回収した。カラムを３ＣＶの結合バッファーで洗浄して、結合していないタンパク質を除去した。結合していないタンパク質を含有するサンプルを５０ｍｌのチューブに１５ｍｌの１アリコートとして回収した。カラムを２ＣＶの洗浄バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０１）で洗浄し、９６ウェルプレートに２ｍｌ画分として回収した。次に、結合したタンパク質を６ＣＶの１００％溶出バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０１）で溶出した。溶出されたタンパク質を９６ウェルプレートに２ｍｌ画分として回収した。洗浄および溶出は５ｍｌ／分で行った。
ＰＥ ＱＩＱのＩＭＡＣプールに対するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＨＩＬＯＡＤ（商標）２６／６０ ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５分取グレード分取グレード、高さ６０ｃｍ 容積およそ３１９ｍｌ）を３ＣＶのＳＥＣバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．４９）で平衡化した。１１ｍｌのＩＭＡＣ溶出液を２．５ｍｌ／分の流速でカラムにロードした。０．３ＣＶ〜０．９ＣＶから２ｍｌ画分を回収した。２回実施した後に、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。Ｐｒｏｔ Ｅタンパク質を含有する２回の実施からの画分を一緒にプールした（「ＳＥＣプール」、総容量およそ４８ｍｌ）。５００ｍＭのアルギニンをＳＥＣプールに加えた。
上記ＳＥＣプロトコールで作製されたＰＥ ＱＩＱプールサンプルの用量
ＳＥＣプールに対して、製造者のプロトコールに従い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＲＣ ＤＣ（商標）キットからのＲＣＤＣ（還元剤およびＤｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）法を行った：
各供試サンプルおよび標品について、２５μＬをマイクロ遠沈管に二反復で分注した。１２５μＬのＢｉｏ−Ｒａｄ ＲＣ試薬Ｉを各遠沈管に加え、各遠沈管をボルテックスにかけ、室温で１分間インキュベートした。１２５μＬのＢｉｏ−Ｒａｄ ＲＣ試薬ＩＩを各遠沈管に加え、各遠沈管をボルテックスにかけた後、１４，０００ｘｇで５分間遠心分離する。きれいな吸収性のティッシュペーパー上に遠沈管を逆さに置き、遠沈管から液体を完全に排出させることによって上清を排出する。２５．４μＬの試薬Ａ（１ｍｌの試薬Ａにつき２０μＬの試薬Ｓを混合することにより予め調製）を各遠沈管に加え、各遠沈管をボルテックスにかけ、室温で５分間、または沈殿が完全に溶解するまでインキュベートする。ボルテックスにかけた後、次工程に進む。２００μＬのＤＣ試薬Ｂを各遠沈管に加え、すぐにボルテックスにかける。室温で１５分間インキュベートした。全てのサンプルを９６ウェルプレートに移し、７５０ｎｍでの吸光度を読み取り、各未知のタンパク質サンプルのタンパク質濃度を決定する。

【0203】

ＰｒｏｔＥ濃度は１．０６９ｍｇ／ｍｌであった。
ＰｉｌＡ Ｈｉｓタグを有するタンパク質の精製：
ＰｉｌＡは、下記の一般手順に従って精製した：
ＰｉｌＡまたはその断片をコードする構築物を含有する大腸菌細胞を、ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）およびＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼ（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））、例えば、１０ｍｌ ＢＵＧＢＵＳＴＥＲ（登録商標）および１０μｌ ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）ヌクレアーゼに懸濁させる。細胞溶解液を室温にて回転プラットフォーム上で、例えば１５分間混合する。細胞溶解液を４℃にて、例えば、１６，０００ｇにて２０分間遠心分離する。タンパク質を含有する上清を、Ｎｉ ＮＴＡ ＨＩＳ・ＢＩＮＤ（登録商標）樹脂を含むＮｉ ＮＴＡカラムに加え、４℃で、例えば、１時間混合する。このカラムは２ｍｌのＮｉ ＮＴＡ ＨＩＳ・ＢＩＮＤ（登録商標）樹脂（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標））および１０ｍｌ １×結合バッファー（ＮＯＶＡＧＥＮ（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡバッファーキット）からなり得る。次に、カラムフロースルーを回収する。樹脂を例えば、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５ｍＭイミダゾン、ｐＨ８．０を含有する１×洗浄バッファーで２回洗浄する。洗液を重力流により回収する。タンパク質をカラムから１×溶出バッファー、例えば、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２５０ｍＭイミダゾン、ｐＨ８．０で溶出させる。タンパク質は、結合バッファーで透析し、上記のようにＮｉ ＮＴＡカラムに再び流すことによりさらに精製することができる。
ＰｉｌＡのトロンビン切断
次に、ＰｉｌＡをトロンビン（１／５０希釈）とともに室温で１６時間インキュベートし、ヒスチジンタグを除去する。
トロンビンで切断したＰｉｌＡに対するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＨＩＬＯＡＤ（商標）２６／６０ ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）７５分取グレード、高さ６０ｃｍ 容積およそ３１９ｍｌ）を５ＣＶのＳＥＣバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５２）で平衡化した。およそ１０ｍｌの切断ＰｉｌＡをこのカラムに流速２．５ｍｌ／分でロードした。０．３ＣＶ〜０．９ＣＶから２ｍｌ画分を回収した。２回の流出を行った後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。切断ＰｉｌＡタンパク質を含有する２回の流出からの画分をプールした（「ＳＥＣプール」、総容量およそ５２ｍｌ）。
ＰｉｌＡ、ＳＥＣプールの量
ＳＥＣプールに対して上記のようにＲＣＤＣ法を行った。切断ＰｉｌＡの濃度は５．３７ｍｇ／ｍｌであった。
ＰＢＳ １×ｐＨ７．４によるＰｉｌＡ ＳＥＣプールの透析（透析倍率＝１６００）およびＲＣＤＣによる処理
ＲＣＤＣにより測定された透析後濃度は３．０ｍｇ／ｍｌであった。
ＬＶＬ３１７の精製
浸透圧ショック
ＬＶＬ３１７融合タンパク質は細菌周辺質で発現されプロセシングされるので、このタンパク質は浸透圧ショックにより抽出された。

【0204】

４Ｌのファーメンター培養物からの、ＬＶＬ３１７を含有する冷凍（−２０℃）採取した大腸菌Ｂ２４４８細胞ペーストをプールし、２４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１６％（ｗ／ｖ）スクロース、９．９％（ｗ／ｖ）グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０からなる高張バッファーに、最終容量が４Ｌとなるまで再懸濁させた。この懸濁液を、ＲＷ １６基本撹拌機に装備した３翼プロペラを用い、中速で室温にて３０分間穏やかに混合した。懸濁液を１５，９００ｘｇにて室温で３０分間遠心分離した。上清（ＳＮ１）をゲル分析用に保持した。

【0205】

得られたペレットを低張溶液；３８ｍＭ ＭｇＣｌ_２に再懸濁させ、室温で３０分間混合した。この混合物を室温にて１５，９００ｘｇで３０分間遠心分離し、上清（ＳＮ２）中に抗原を回収した。

【0206】

６００ｍｌ／分の流速で０．４５／０．２μｍポリエーテルスルホンＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＭｉｄｉＣａｐフィルターで濾過することにより、ＳＮ２の清澄化を行った。

【0207】

ＳＮ２を２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．０で１：３希釈し、必要であればｐＨを７．０に調整し、６００ｍｌ／分で０．４５／０．２μｍポリエーテルスルホンＳａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＭｉｄｉＣａｐフィルターでの濾過によりさらに清澄化を行った。
ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ファーストフロー（ＳＰ ＦＦ）クロマトグラフィー
希釈／濾過したＳＮ２を２ＣＶの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファーｐＨ７．０で平衡化した１４ｃｍ ＩＤ（内径）×２０ｃｍ長のカラム（カラム容積３１００ｍｌ）中の強陽イオン交換樹脂（ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、捕捉させた。カラムを５ＣＶの２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４／Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファーｐＨ７．０で洗浄した後、抗原（ＬＶＬ３１７内に含有）を、同じ洗浄バッファー中１００ｍＭまでＮａＣｌ濃度を高めることにより溶出させた。
典型的なＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ファーストフロークロマトグラムに関しては図１２を参照。
Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ファーストフロー（Ｑ ＦＦ）クロマトグラフィー
ＳＰ ＦＦ溶出液中に存在する抗原を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５で１：４希釈し、必要であればｐＨを８．５に調整し、２ＣＶの２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ ８．５で平衡化した１４ｃｍ ＩＤ×１１．８ｃｍ長のカラム（カラム容積１８００ｍｌ）中の強陰イオン交換樹脂（Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。抗原はフロースルー画分に回収された。

【0208】

典型的なＱ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ファーストフロークロマトグラムに関しては図１３を参照。
濃度、ダイアフィルトレーション、ポリソルベート８０の添加および濾過除菌
抗原を含有するＱ ＦＦフロースルーをクロマトグラムＵＶに基づいて０．７〜０．８ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−２（商標）１０ｋＤａカットオフメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、５ＤＶの１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４／Ｋ_２ＨＰＯ_４バッファーｐＨ６．５でダイアフィルトレーションを行った。

【0209】

５％保存溶液を用い、ポリソルベート８０（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）８０）を前記限外濾過保持液に加え、マグネチックスターラーを用いて１３０ｒｐｍ、４℃で３０分間撹拌した。ポリソルベート８０の終濃度は０．０４％であった。限外濾過保持液を０．４５／０．２μｍ酢酸セルロースメンブレン（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ３００、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濾過することにより除菌した。精製されたバルクを−２０℃または−８０℃で保存した。絶対タンパク質濃度はＡＡＡ（アミノ酸分析）により０．７３７ｍｇ／ｍｌで測定した。
実施例９：ポリソルベート８０の使用
滴定実験は、濾過除菌の前に精製バルクに終濃度０．０４％（ｗ／ｖ）までポリソルベート８０、具体的には、ＴＷＥＥＮ（商標）８０を加えると、微細線維粒子の形成および凝集が軽減されることを示した。

【0210】

ＤＳＣ分析によれば、ＴＷＥＥＮ（商標）８０は、−２０℃で保存した後の冷凍／解凍サイクル後、ならびに４℃、−２０℃および−８０℃および３７℃で４日間保存した後に見られる構造変化（３０〜４５℃）を軽減した。
実施例１０：ＬＶＬ３１７のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析：
ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４〜１２％ゲルに、９５℃で５分間加熱した、５０ｍＭ ＤＴＴを含有するＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー中、１０μｇのサンプルを下記のようにロードした（低濃度のサンプルに関しては２０μＬのサンプルをロードした）。泳動：ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳランニングバッファー中、室温（ＲＴ）、２００ボルトで３５分。ゲルをインスタントブルー（Ｎｏｖｅｘｉｎ ｃａｔ．：ＩＳＢ０１Ｌ）で２時間染色し、水中で一晩脱染した。
レーン内容：
１：ＭＷ標品（１０μＬ）
２：開始（全画分）（１０μｇ）
３：濾過なしのＳＮ１（１０μｇ）
４：濾過なしのＳＮ２（１０μｇ）
５：抽出なし（１０μｇ）
６：ロードＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
７：フロースルーＳＰ ＦＦ（６．９μｇ）
８：洗浄ＳＰ ＦＦ（２０μＬ）
９：溶出ＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１０：ストリップＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１１：ロードＱ ＦＦ（８．９μｇ）
１２：溶出Ｑ ＦＦ（９．８μｇ）
１３：ストリップＱ ＦＦ（４．８μｇ）
１４：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加前のＴＦＦ保持液（１０μｇ）
１５：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過しない精製バルク（１０μｇ）
１６：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（１０μｇ）
１７：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（２０μｇ＋添加大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ））
１８：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（２μｇ）
１９：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ）
２０：大腸菌細胞駅Ｒｉｘ（０．５μｇ）
ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の精製プロセスからのインプロセスサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥに関しては図１４を参照。

【0211】

ウエスタンブロットについては、タンパク質をＮＵＰＡＧＥ（登録商標）転写バッファー＋２０％メタノール、０．１％ＳＤＳ中、３０ボルト、４℃で一晩、ニトロセルロース膜に転写した。膜を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４＋５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングし、ブロッキングバッファーで希釈したウサギポリクローナル一次抗体（抗Ｐｒｏｔ−Ｅ １／５００００および抗大腸菌（ＢＬＲ）１／１０００）中で２時間インキュベートし、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で５分間３回洗浄し、二次抗体（ブロッキングバッファーで１／５０００希釈したアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ中で１時間インキュベートし、洗浄バッファー中で５分間３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（１錠／１０ｍｌ）に溶解した。インキュベーションは全て２５ｍｌ／膜で行った。

【0212】

ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質からの精製プロセスのインプロセスサンプルのウエスタンブロットに関しては図１５を参照。ウサギポリクローナル抗ＰＥを用いてブロットした。
レーン内容：
１：ＭＷ標品（１０μＬ）
２：開始（全画分）（１０μｇ）
３：濾過なしのＳＮ１（１０μｇ）
４：濾過なしのＳＮ２（１０μｇ）
５：抽出なし（１０μｇ）
６：ロードＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
７：フロースルーＳＰ ＦＦ（６．９μｇ）
８：洗浄ＳＰ ＦＦ（２０μＬ）
９：溶出ＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１０：ストリップＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１１：ロードＱ ＦＦ（８．９μｇ）
１２：溶出Ｑ ＦＦ（９．８μｇ）
１３：ストリップＱ ＦＦ（４．８μｇ）
１４：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加前のＴＦＦ保持液（１０μｇ）
１５：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過しない精製バルク（１０μｇ）
１６：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（１０μｇ）
１７：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（２０μｇ＋添加大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ））
１８：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（２μｇ）
１９：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ）
２０：大腸菌細胞駅Ｒｉｘ（０．５μｇ）
ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質からの精製プロセスのインプロセスサンプルのウエスタンブロットに関しては図１６参照。ウサギポリクローナル抗大腸菌（ＢＬＲ）を用いてブロットした。
レーン内容：
１：ＭＷ標品（１０μＬ）
２：開始（全画分）（１０μｇ）
３：濾過なしのＳＮ１（１０μｇ）
４：濾過なしのＳＮ２（１０μｇ）
５：抽出なし（１０μｇ）
６：ロードＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
７：フロースルーＳＰ ＦＦ（６．９μｇ）
８：洗浄ＳＰ ＦＦ（２０μＬ）
９：溶出ＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１０：ストリップＳＰ ＦＦ（１０μｇ）
１１：ロードＱ ＦＦ（８．９μｇ）
１２：溶出Ｑ ＦＦ（９．８μｇ）
１３：ストリップＱ ＦＦ（４．８μｇ）
１４：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加前のＴＦＦ保持液（１０μｇ）
１５：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過しない精製バルク（１０μｇ）
１６：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（１０μｇ）
１７：０．０４％ＴＷＥＥＮ（商標）８０添加後の濾過除菌した精製バルク（２０μｇ＋添加大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ））
１８：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（２μｇ）
１９：大腸菌細胞溶解液Ｒｉｘ（１μｇ）
２０：大腸菌細胞駅Ｒｉｘ（０．５μｇ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット図の説明： ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質は３０ｋＤａに移動する。浸透圧ショックによる抽出は、細菌の周辺質で発現され、プロセシングされた融合タンパク質を抽出し、細菌由来のコンタミネーションを軽減した。高張処理中の融合タンパク質の損失は小さい（レーン３）。低張処理により小さな割合ながら抽出されないものがあり、細胞との結合を維持する（レーン５）。ＳＰ ＦＦフロースルー（レーン７）および両カラムにおけるストリップ画分（レーン１０および１３）の損失は小さい。ストリップ画分の総容量は少ないので、融合タンパク質の損失は有意ではない。ストリップ画分には分解されたバンドが見られるが、最終産物には見られない。精製バルクには大腸菌宿主細胞タンパク質由来の有意なコンタミネーションはない（レーン１６）。

【0213】

ＬＶＬ７３５およびＬＶＬ７７８分析からＬＶＬ３１７と同様のプロファイルが得られた。
実施例１１：ＰＥ、ＰｉｌＡおよびＬＶＬ３１７の融点データ
ＰＥ−ＰｉｌＡ融合Ｈｉｓタグ不含タンパク質（ＬＶＬ３１７）の温度遷移を、上記のように精製したＰＥ ｈｉｓタグ含有（実施例８に記載の通り）タンパク質および切断型ＰｉｌＡ（実施例８に記載の通り）タンパク質の両方の温度遷移と比較した。

【0214】

ＤＳＣ前に、ＰＥおよびＰｉｌＡを１０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ６．５＋０．０４％Ｔｗｅｅｎ８０（１：２５０サンプル：バッファー容量比）中で一晩透析し、それらを融合タンパク質と同じバッファーとした。透析後、ＢＣＡによりタンパク質濃度を測定し、３００μｇ／ｍｌ（ＰＥ）および５００μｇ／ｍｌ（ＰｉｌＡ）に調整した。

【0215】

ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門）製のＶＰ（商標）−ＤＳＣで行った分析。最終的な透析バッファーを参照として用い、スキャンから差し引いた。ＤＳＣスキャン速度９０℃／時。配合後の最終容器（ＦＣ）にて温度遷移を測定する能力を評価するために、融合タンパク質をＦＣ濃度（６０μｇ／ｍｌ）まで希釈した。最終容器のデータは示されていない。
結果：
ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質およびＰＥおよびＰｉｌＡタンパク質の温度遷移に関しては図１７を参照。曲線：ＰｉｌＡ（１）、タンパク質Ｅ（Ｐｒｏｔ Ｅ、ＰＥ）（２）、無希釈のＰＥ−ＰｉｌＡ ＰＢ７３７μｇ／ｍｌ（３）、およびＦＣ濃度６０μｇ／ｍｌに希釈したＰＥ−ＰｉｌＡ ＰＢ（４）。
１−ＰｉｌＡ Ｔｍ：５３℃
２−タンパク質Ｅ Ｔｍ：６３
３−無希釈のＰＥ−ＰｉｌＡ ＰＢ（精製バルク）７３７μｇ／ｍｌ Ｔｍ_１：５３．７℃およびＴｍ_２：６６．１℃
４−ＦＣ濃度６０μｇ／ｍｌに希釈したＰＥ−ＰｉｌＡ ＰＢ Ｔｍ_１：５３．２℃およびＴｍ_２：６７．６℃
精製融合タンパク質（ＬＶＬ３１７）において２つの遷移が検出された（曲線３および４）。

【0216】

ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質のＴｍ_１（５３．７℃）は、ＰｉｌＡ遷移（５３℃）に類似している。

【0217】

ＰＥ遷移（６３℃）に比べてＰＥ−ＰｉｌＡのＴｍ_２（６６．１℃）は有意なシフトである。両ドメインの融合物はＰＥ断片を安定化すると思われる。

【0218】

無希釈に比べて希釈融合タンパク質のＴｍ_２のシフトは、濃度依存的である凝集に典型的な、急激に低下する勾配から生じる濃度の人為現象である。

【0219】

ＬＶＬ７３５およびＬＶＬ７７８の抗原折り畳み分析は、ＬＶＬ３１７の場合と同様である。
実施例１２：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質構築物ＬＶＬ２９１抗ＰｉｌＡの免疫原性応答
ＡＳ０３_Ａ中に配合した精製ＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質（異種シグナルペプチドを含まないＬＶＬ２９１融合タンパク質）に対する免疫応答をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて評価した。０、１４および２８日目に、動物（マウス２０個体／群）を、それぞれＡＳ０３_Ａ中に配合した１０μｇのＰＥ（ベクターｐＲＩＴ１６７６２由来）、ＰｉｌＡ（ベクターｐＲＩＴ１６７９０由来）またはＰＥ−ＰｉｌＡで筋肉内により免疫した。対照群にはＡＳ０３_Ａのみを接種した。各抗原に対する抗体応答を、４２日目に採取した個々の血清において測定した。抗体応答は陰性対照で得られた。図１８に示されるように、ＰｉｌＡに対する抗体応答は、一価ＰｉｌＡで免疫したマウスにおける抗体応答に比べてＰＥ−ＰｉｌＡ融合物で免疫したマウスで高かった。ＰＥに対する抗体応答は、融合タンパク質で免疫したマウスと一価ＰＥで免疫したマウスで同等であった。ＧＭＴ＝幾何平均力価。ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）下で実行するＳＯＦＴＭＡＸ（登録商標）Ｐｒｏソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデータを取り込んで解析し、４パラメーターロジスティック対数関数を用いて標準曲線を計算した。４パラメーターロジスティック対数関数は、濃度に対する光学密度（対数）スケール上にプロットした際に明白なＳ字型を示す参照血清の曲線を高精度で表す。抗体濃度は、マウス血清サンプルの各希釈において、標準曲線の補間によって計算した。品質管理血清および未知の血清サンプル中の抗体は、参照の希釈曲線の有効範囲（１０〜８０％）内にある全ての希釈からの値の平均を取ることによって得られる。結果は図１８に示すが、これはＢａｌｂ／ｃマウスモデルにおけるＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質に対する抗体応答および一価ＰＥおよびＰｉｌＡに対する抗体応答をグラフで示したものである。
実施例１３：マウス鼻咽頭定着モデル。ＰＥ−ＰｉｌＡによる免疫誘導。ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株およびＮＴＨｉ ３２２４Ａ株による抗原刺激
Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（２０／群）を鼻腔内に、０日目と１４日目に、ＬＴ（大腸菌(Escheria coli)の易熱性毒素）を配合した６μｇの精製ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質（８６−０２８ＮＰによる抗原刺激にはＬＶＬ２９１；３２２４Ａ株による抗原刺激にはＬＶＬ３１７）で、２８日目にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、６μｇの精製ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質で免疫を行った。対照マウス（２０／群）にはＬＴのみを接種した。次に、マウスの鼻腔内を５×１０^６ ＣＦＵ（コロニー形成単位）の同種ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株および異種ＮＴＨｉ ３２２４Ａ株で抗原刺激した。同種および異種は、マウスが免疫されたＮＴＨｉ株のリファレンスにより決定される。抗原刺激の１日後および２日後に取り出した鼻腔において細菌コロニーを計数した。Ｄ１＝１日目。Ｄ２＝２日目。ＰＥ−ＰｉｌＡ接種は、抗原刺激から１日後および２日後に、鼻咽頭におけるＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株および３２２４Ａ株のクリアランスを高めた。

【0220】

ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株で行った実験に関して： 応答として計数値のｌｏｇ１０値を用いて２要因固定ＡＮＯＶＡを行った。なお、これらの固定要因は群（４水準）および日（２水準）であった。変数の異種性の仮説は棄却され、異種変数を有するモデルをデータに当てはめた。これらの２つの要因の間には有意な相互作用は検出されなかった。ＰＥ−ＰｉｌＡ融合群（６μｇ／マウス）は、対照群（ＬＴ）に比べてＣＦＵを有意に低下させ、幾何平均比は０．０１、０．２５の９５％信頼区間で０．０６に相当した。

【0221】

ＮＴＨｉ ３２２４Ａ株で行った実験に関して： 応答としてｌｏｇ１０値を用いて３要因固定ＡＮＯＶＡを行った。なお、これらの固定要因は群、日および実験であった。Ｓｈａｐｉｒｏ−ＷｉｌｋおよびＬｅｖｅｎｅの検定では、変数の正規性および異種性の仮説は棄却されなかった。いずれの２要因の間にもまたは３要因の間にも有意な相互作用は検出されず、この分析では主要な要因のみが維持された。ＰＥ−ＰｉｌＡ／ＬＴは、対照群に比べてＣＦＵを有意に低下させ、幾何平均比は０．０２、０．６１の９５％信頼区間で０．１１に相当した。

【0222】

マウス鼻咽頭におけるＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株細菌クリアランスに対するＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質接種の効果に関しては図１９を参照。

【0223】

マウス鼻咽頭におけるＮＴＨｉ ３２２４Ａ株細菌クリアランスに対するＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質接種の効果に関しては図２０を参照。
実施例１４：マウス鼻咽頭定着モデル。ＰｉｌＡによる免疫誘導。ＮＴＨｉ ３２１９Ｃ株による抗原刺激。

【0224】

雌ＯＦ１マウス（２０マウス／群）の鼻腔内に０日目と１４日目にＬＴを配合した３μｇのＰｉｌＡ（ベクター１６７９０由来）で、２８日目にはＰＢＳ中３μｇのＰｉｌＡで免疫を行った。対照マウスにはＬＴのみを接種した。次に、マウスの鼻腔内を５×１０^６ ＣＦＵのＮＴＨｉ ３２１９Ｃ株で抗原刺激した。抗原刺激の３日後および４日後に取り出した鼻腔において細菌コロニーを計数した。Ｄ３＝３日目。Ｄ４＝４日目。

【0225】

マウス鼻咽頭における細菌クリアランスに対するＰｉｌＡ接種の効果に関しては図２１を参照。
実施例１５：マウス鼻咽頭定着モデル。ＰＥによる免疫誘導。ＮＴＨｉ ３２２４Ａ株による抗原刺激。

【0226】

Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（２０マウス／群）の鼻腔内に０日目と１４日目にＬＴを配合した３μｇのＰＥ（ベクターｐＲＩＴ１６７６２由来）で、２８日目にはＰＢＳ中３μｇのＰＥで免疫を行った。対照マウスにはＬＴのみを接種した。次に、マウスの鼻腔内を５×１０^６ ＣＦＵのＮＴＨｉ ３２２４Ａ株で抗原刺激した。抗原刺激の３日後および４日後に取り出した鼻腔において細菌コロニーを計数した。１０個体のマウスを３日目（Ｄ３）に調べた。１０個体のマウスを４日目（Ｄ４）に調べた。ＰＥ接種は、統計分析のためにダン(Dunn)検定を用いたところ、抗原刺激後４日目に鼻咽頭におけるＮＴＨｉのクリアランスを有意に増大させた（図２２）。

【0227】

マウスの鼻咽頭における細菌クリアランスに対するＰＥ接種の効果に関しては図２２を参照。
実施例１６：ビブロネクチン(vibronectin)結合。ＬＶＬ３１７およびＬＶＬ７３５ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質によるビブロネクチン(vibronectin)結合の阻害。

【0228】

精製されたＬＶＬ３１７ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質構築物における、ＰＥのビトロネクチンとの結合能を評価した。マイクロタイタープレート（ＰＯＬＹＳＯＲＰ（商標）、Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＥ（ベクターｐＲＩＴ１６７６２由来）または精製ＬＶＬ３１７ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ−ポリソルベート２０、０．０５％（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）で４回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ １％で１〜２時間ブロッキングした。４回の洗浄の後、ビトロネクチン（ヒト血漿由来ビトロネクチン、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））を加え（１０μｇ／ｍｌ）、２倍希釈し（１２種の希釈液）、これらのプレートを室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ−ポリソルベート２０、０．０５％（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）で４回洗浄した。洗浄後、結合したビトロネクチンを、ペルオキシダーゼヒツジ抗ヒトビトロネクチン（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いて検出した後、オルトフェニレンジアミン／Ｈ_２Ｏ_２基質を添加した。発色は、ビトロネクチンに固定された抗体の量に正比例する。

【0229】

（ａ）ビトロネクチンに結合したＬＶＬ３１７ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質ＰｉｌＡ＝ＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ由来ＰｉｌＡ（ｐＲＩＴ１６７９０に関して記載の通り）；ＰＥ＝タンパク質Ｅ（ｐＲＩＴ１６７６２に関して記載の通り）および（ｂ）ビトロネクチンに結合したＬＶＬ３１７およびＬＶＬ７３５ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質に関しては図２３を参照。
実施例１７：ビブロネクチン(vibronectin)結合。ＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質に対する抗体によるビブロネクチン(vibronectin)の阻害。

【0230】

マイクロタイタープレート（ＰＯＬＹＳＯＲＰ（商標）、Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＥ（ベクターｐＲＩＴ１６７６２由来）または精製ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質（１０μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ−ポリソルベート２０、０．０５％（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）で４回洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ １％で２時間ブロッキングした。洗浄後、ビトロネクチン（ヒト血漿由来ビトロネクチン、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））を５０μｇ／ｍｌで加え、精製抗体抗ＰＥ−ＰｉｌＡ（自家生産および精製）を２倍連続希釈し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ−ポリソルベート２０、０．０５％（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０）で４回洗浄した。４回の洗浄の後、結合したビトロネクチンを、ペルオキシダーゼヒツジ抗ビトロネクチン（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いて検出した後、オルトフェニレンジアミン／Ｈ_２Ｏ_２基質を加えた。発色は、ビトロネクチンに固定された抗体の量に正比例する。

【0231】

ＰＥ−ＰｉｌＡに対するポリクローナル抗体によるＰＥへのビトロネクチン結合の阻害を観察した。

【0232】

ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質に対するポリクローナル抗体によるビトロネクチン結合の阻害に関しては図２４を参照。
実施例１８：ＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の抗原性。ＥＬＩＳＡ。

【0233】

精製されたＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質を、対照として一価タンパク質を用いた抗原性試験でバリデートした。融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸２２〜１６０をコードするＰＥ遺伝子断片（ｐＲＩＴ１６７１１に関して記載の通り）に対して、またはＮＴＨｉ ８６−０２８ＮＰ株由来のＰｉｌＡ（ベクターｐＲＩＴ１６７９０由来）に対して作製されたポリクローナル抗体（ウサギおよびモルモット）で現像するサンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。

【0234】

ＰｉｌＡまたはＰＥは１００ｎｇ／ｍｌで加え、連続２倍希釈した。３０分のインキュベーションの後および洗浄の後、結合した抗原を、ＰＥまたはＰｉｌＡでの免疫誘導の後に得られたウサギポリクローナル血清により検出した。結合した抗体を、ペルオキシダーゼ抗ウサギＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて検出した後、オルトフェニレンジアミン／Ｈ_２Ｏ_２基質を加えた。発色は、存在する抗原の量に正比例する。マイクロタイタープレート用の分光光度計を用いて吸光度を測定した。サンプルの抗原性は、全長ＰＥまたは全長ＰｉｌＡ参照抗原の曲線との比較により決定し、μｇ／ｍｌで表す。参照は１００％の抗原性を示した。

【0235】

表６に見られるように、抗原性は、一価ＰＥおよびＰｉｌＡ抗原に比べて精製ＬＶＬ２９１ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質で見られた。

【0236】

【表6】

実施例１９：ＬＶＬ７３５ ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質の免疫原性
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３４）をＡＳ０１_ＥまたはＡｌＰＯ_４（リン酸アルミニウム）を配合していない１、０．２または０．０４μｇのＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質ＬＶＬ３１７またはＬＶＬ７３５を含有する０、１４および２８日目に５０μｌのワクチン製剤で、筋肉内経路により免疫した。４２日目に採取した個々の血清においてＰＥおよびＰｉｌＡに対する抗体応答を決定し、ＰＥおよびＰｉｌＡに対するＩｇＧレベルを測定し、μｇ／ｍｌで表した。

【0237】

ＬＶＬ３１７およびＬＶＬ７３５に対するＰＥおよびＰｉｌＡ抗体の応答に関しては図２７を参照。ＧＭＣ＝幾何平均濃度。ＧＭＴ＝幾何平均力価。ＩＣ＝信頼区間。
実施例２０：無莢膜型インフルエンザ菌鼻咽頭定着のマウスモデルにおけるＬＶＬ７３５およびＬＶＬ３１７融合タンパク質の防御有効性
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの鼻腔内に０日目と１４日目に０．５μｇの大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）と混合した５．８μｇのＬＶＬ７３５またはＬＶＬ３１７を含有する１０μｌのワクチン製剤で免疫を行った。２８日目に追加免疫用量５．８μｇのアジュバント不含ＬＶＬ７３５またはＬＶＬ３１７を投与した。対照マウスには０日目と１４日目にＬＴのみを、２８日目にはＰＢＳを接種した。４２日目に動物の鼻腔内を５×１０^６ ｃｆｕのＮＴＨｉ ３２２４Ａ株で抗原刺激した。抗原刺激の１日後および２日後に取り出した鼻腔において細菌コロニーを計数した（ｎ＝１０／時点）。

【0238】

鼻腔を媒体中でホモジナイズし、細菌の定量を行う。結果はＣＦＵ／ｍｌで良好に表される。

【0239】

無莢膜型インフルエンザ菌鼻咽頭定着のマウスモデルにおいて細菌クリアランスに対するＬＶＬ７３５およびＬＶＬ３１７接種の効果に関しては図２８を参照。
実施例２１：ＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質を含む多価ワクチンの調剤
３種類のワクチンを設計した：
１０Ｖ： 下記の１０種の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲート：タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型１由来の莢膜糖類（１−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型４由来の莢膜糖類（４−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型５由来の莢膜糖類（５−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型６Ｂ由来の莢膜糖類（６Ｂ−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型７Ｆ由来の莢膜糖類（７Ｆ−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型９Ｖ由来の莢膜糖類（９Ｖ−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型１４由来の莢膜糖類（１４−ＰＤ）、タンパク質Ｄにコンジュゲートされた血清型２３Ｆ由来の莢膜糖類（２３Ｆ−ＰＤ）、破傷風トキソイドにコンジュゲートされた血清型１８Ｃ由来の莢膜糖類（１８Ｃ−ＴＴ）およびジフテリア毒素にコンジュゲートされた血清型１９Ｆ由来の莢膜糖類（１９Ｆ−ＤＴ）を含有する１０価（１０Ｖ）のワクチン。
１２Ｖ： １０Ｖと同じ１０種の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含有し、さらに２つの肺炎球菌糖類コンジュゲート、すなわち、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた１９Ａ（１９ＡＣＲＭ）およびＣＲＭ１９７にコンジュゲートされた６Ａ（６ＡＣＲＭ）を含む１２価（１２Ｖ）のワクチン。
１２Ｖ＋タンパク質（１２Ｖ＋ｐｒｏｔ）： １２Ｖと同じ１２種の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートを含有し、さらにＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡ融合タンパク質を含むワクチン。
ｄＰｌｙの調製： 肺炎球菌ニューモリシンを調製し、ホルムアルデヒド無毒化を用い、国際公開第２００４／０８１５１５号および国際公開第２００６／３２４９９号に記載の通りに無毒化した。
ＰｈｔＤの発現および精製：
ＰｈｔＤの発現： ＰｈｔＤタンパク質は、ヒスチジントライアドの存在を特徴とする肺炎球菌ヒスチジントライアド（Ｐｈｔ）タンパク質ファミリーのメンバーである。ＰｈｔＤは、８３８ａａの分子であり、５つのヒスチジントライアドを有する（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ 国際公開第００／３７１０５号 アミノ酸配列は配列番号４およびＤＮＡ配列は配列番号５）。ＰｈｔＤはまた、中央（アミノ酸３４８〜３８０番）にプロリンリッチ領域を含む。ＰｈｔＤは２０ａａのＮ末端シグナル配列を有する。ＰｈｔＤの調製および精製は国際公開第２００７／０７１７１０号（例えば、実施例１ｂ参照）に記載されている。国際公開第００／３７１０５号からの配列番号４のアミノ酸２１〜８３８の配列は配列番号２２０に相当する。

タンパク質Ｄの発現
タンパク質Ｄは、国際公開第２００７／０７１７１０号に記載の通りに発現させた。
ＣＲＭ１９７大腸菌の発現および精製：
ＣＲＭ１９７の生産工程の収率を高めるために、選択的発現様式を、１０倍の工程収率の標的を用いて評価した。選択した構築物を大腸菌株（Ｂ８３４（ＤＥ３））で、大腸菌由来Ｆｌｇｌシグナル配列（１９ａａ）とＣＲＭ１９７（５３７ａａ）の間の融合物として発現させた。このシグナル配列は周辺質への輸送の際に切断される。ＣＲＭ１９７は浸透圧ショックにより抽出された後に精製される。この精製プロセスは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＸＬ工程とヒドロキシアパタイト工程の間に付加的なクロマトグラフィー工程（フェニルセファロース）が追加されること、および最後のオクチル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦでのクロマトグラフィー工程が除かれること以外は、国際公開第２００６／１００１０８号に開示されているものと同様である。
コンジュゲートの調製
精製された肺炎球菌多糖をいかにして調製するかは当技術分野で周知である。これらの実施例の目的で、多糖を本質的に欧州特許第０７２５１３号に記載の通りに、または密接に関連した方法により作製した。コンジュゲーション前に、多糖は下記のような微少溶液操作によってサイズ調整してもよい。

【0240】

活性化およびカップリング条件は、各多糖に特異的である。これらを表１に示す。サイズ調整済みの多糖（６Ｂおよび２３Ｆ以外）はＮａＣｌ ２Ｍ、ＮａＣｌ ０．２Ｍまたは注射水（ＷＦＩ）に溶かした。全ての血清型について最適多糖濃度を評価した。血清型１８Ｃ以外の全ての血清型は、下記に詳述するように、担体タンパク質に直接コンジュゲートした。

【0241】

アセトニトリルまたはアセトニトリル／水（５０％／５０％）溶液中１００ｍｇ／ｍｌの保存溶液から、ＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）（ＣＤＡＰ／ＰＳ比 ０．５〜１．５ｍｇ／ｍｇ ＰＳ）を多糖溶液に加えた。１．５分後に、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＯＨを加えて特定の活性化ｐＨとした。多糖の活性化はこのｐＨにて２５℃で３分間行った。活性化した多糖に精製タンパク質（タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７またはＤＴ）（この量は最初のＰＳ／担体タンパク質比に依存する）を加え、その特定のｐＨで最大２時間（血清型による）、ｐＨ調整下でカップリング反応を行った。未反応のシアン酸エステル基をクエンチするために、次に、２Ｍグリシン溶液をこの混合物に加えた。ｐＨをクエンチングｐＨ（ｐＨ９．０）に調整した。この溶液を２５℃で３０分間撹拌した後、ゆっくり連続撹拌しながら２〜８℃で一晩インキュベートした。
１８Ｃの調製：
１８Ｃを、リンカー−アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を介して担体タンパク質に連結した。

【0242】

コンジュゲーション前に多糖血清型１８Ｃに微少溶液操を行った。
ＥＤＡＣ（２−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）による破傷風トキソイドの誘導体化
破傷風トキソイドの誘導体化のため、精製したＴＴを０．２Ｍ ＮａＣｌ中で２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＡＤＨスペーサーを終濃度が０．２Ｍとなるように加えた。スペーサーの溶解が完了したところで、ｐＨを６．２に調整した。次に、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）を終濃度が０．０２Ｍとなるように加え、この混合物をｐＨ調整下で１時間撹拌した。この縮合反応を、ｐＨを２５℃で少なくとも３０分間９．０まで高めることによって停止させた。

【0243】

誘導体化されたＴＴに、次に、ダイアフィルトレーションを行い（１０ｋＤａ ＣＯ膜）、残留するＡＤＨおよびＥＤＡＣ試薬を除去した。

【0244】

ＴＴ_ＡＨ（ＡＤＨリンカーにコンジュゲートされた破傷風トキソイド）バルクを最後に濾過除菌し、カップリング工程まで−７０℃で保存した。
ＴＴ_ＡＨのＰＳ １８Ｃへの化学的カップリング
コンジュゲーションパラメーターの詳細は表１に見出すことができる。

【0245】

２グラムの微少溶液操済みＰＳを定義された濃度で水に希釈し、ＮａＣｌ粉末を加えることにより２Ｍ ＮａＣｌに調整した。

【0246】

ＣＤＡＰ溶液（１００ｍｇ／ｍｌ ５０／５０ｖ／ｖアセトニトリル／ＷＦＩ中に新たに調製）を、適当なＣＤＡＰ／ＰＳ比となるように加えた。

【0247】

０．３Ｍ ＮａＯＨを加えることによりｐＨを活性化ｐＨ９．０まで上昇させ、ＴＴ_ＡＨの添加までこのｐＨで安定させた。

【0248】

３分後、誘導体化されたＴＴ_ＡＨ（０．２Ｍ ＮａＣｌ中２０ｍｇ／ｍｌ）をＴＴ_ＡＨ／ＰＳ比が２となるように加え、ｐＨをカップリングｐＨ９．０に調整した。この溶液を１時間、ｐＨ調整下に置いた。

【0249】

クエンチングのため、２Ｍグリシン溶液をＰＳ／ＴＴ_ＡＨ／ＣＤＡＰ混合物に加えた。

【0250】

ｐＨをクエンチングｐＨ（ｐＨ９．０）に調整した。

【0251】

この溶液を２５℃で３０分間撹拌した後、ゆっくり連続撹拌しながら一晩２〜８℃に置いた。
肺炎球菌莢膜糖類−タンパク質Ｄ／ＴＴ／ＤＴ／ＰｈｔＤ／Ｐｌｙコンジュゲートの特定の活性化／カップリング／クエンチング条件
行ヘッダーに「μｆｌｕｉｄ」とある場合は、その糖類がコンジュゲーション前に微少溶液操作によりサイズ調整されたことを示す。微少溶液操作後の糖類のサイズは表２に示す。

【0252】

【表7】

コンジュゲートの精製：
コンジュゲートは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ただし、１８ＣではＳ５００ＨＲをバッファーとして使用し、１９Ａでは１．１５ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭ酢酸塩ｐＨ６．２を使用した）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ４００ＨＲゲル濾過カラムを用いたゲル濾過により小分子（ＤＭＡＰを含む）および非コンジュゲート糖類およびタンパク質を除去することで精製した。反応成分の分子サイズの違いに基づき、ＰＳ−ＰＤ、ＰＳ−ＴＴ、ＰＳ−ＣＲＭ１９７またはＰＳ−ＤＴコンジュゲートが最初に溶出し、遊離ＰＳ、次いで、遊離タンパク質担体、最後にＤＭＡＰおよび他の塩（ＮａＣｌ、グリシン）が続く。

【0253】

コンジュゲートを含有する画分はＵＶ_{２８０ｎｍ}により検出される。画分をそれらのＫｄに従ってプールし、濾過除菌し（０．２２μｍ）、＋２〜８℃で保存する。コンジュゲート調製物のＰＳ／タンパク質比を決定した。
ワクチンの調剤
１０Ｖワクチンは、リン酸アルミニウム上に、１、３、１、１、１、１、１、３、３、１μｇのヒト用量で吸着された肺炎球菌莢膜糖類血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆコンジュゲートを一緒に含有する（これらの糖類はリン酸アルミニウムに個々に吸着させた後、それらを一緒に混合し、リン酸アルミニウムのレベルを５００μｇに調整した）。

【0254】

１２Ｖワクチンは、リン酸アルミニウム上に吸着された２μｇ用量の血清型１９Ａおよび６Ａコンジュゲートを追加し、１０Ｖワクチンと同様にして作製した。

【0255】

１２Ｖ＋タンパク質ワクチンは、タンパク質ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥ−ＰｉｌＡを加えたこと以外は、１２Ｖワクチンと同様にして作製した。ＰＥ−ＰｉｌＡは本明細書に記載の通りに作製した。１２コンジュゲートと前記タンパク質を、１２Ｖに関しては上記した用量、タンパク質は各３０μｇ（注：これは３０μｇのＰＥ−ＰｉｌＡを表し、３０μｇのＰＥと３０μｇのＰｉｌＡを表すのではない）の用量を用いて一緒に混合した。
実施例２２：マウスにおける１０Ｖ、１２Ｖおよび１２Ｖ＋タンパク質ワクチンの免疫原性の比較
抗肺炎球菌多糖ＰＳ（多糖）ＥＬＩＳＡの説明
マイクロプレートを、莢膜多糖（ＣＰＳ）（ＰＢＳ中、２．５μｇ／ｍｌのＰＳ１およびＰＳ３、５μｇ／ｍｌのＰＳ４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖまたは１４；１０μｇ／ｍｌのＰＳ１９Ａおよび２３Ｆまたは４０μｇ／ｍｌのＰＳ１８ＣおよびＰＳ１９Ｆ、１００μｌ／ウェル）で３７℃にて２時間コーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ（０．９％）−ポリソルベート２０ ０．０５％で３回洗浄した。ＣＰＳ（２．５ｍｇ／ｍｌであった６Ａおよび６Ｂ以外は(except or) １ｍｇ ＣＰＳ／ｍｌの無希釈血清）Ｖ／Ｖを含有するＰＢＳ−ポリソルベート２０ ０．０５％中に血清を希釈し（６Ａおよび６Ｂに関しては１／２、他の血清型に関しては１／１０）、ＣＰＳに対する抗体を中和させるために３７℃で１時間インキュベートした。「マウスにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したマウス由来の血清または参照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅマウスＩｇＧで較正した内部参照）をマイクロウェルに加え、ＰＢＳ−ポリソルベート２０ ０．０５％で連続希釈して１００μｌとした（二倍希釈工程）。これらのプレートを振盪下、室温で３０分間インキュベートした。これらのプレートを上記のように洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体（１００μｌ／ウェル）を加え、プレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、基質（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５〜４．６および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ（オルトフェニレン−ジアミン））を各ウェルに加え（１００μｌ）、これらのプレートを暗所で１５分間インキュベートした。ＨＣｌ １Ｎ（５０μｌ）を添加することにより反応を停止させた。分光光度計を用い、４９０ｎｍまたは参照に関しては６２０ｎｍで吸光度を読み取った。発色は、血清中に存在する抗体の量に正比例する。
ＰＤ、ＰＥおよびＰｉｌＡ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡの説明
プレートを、１００μｌ／ウェルの、炭酸バッファーｐＨ９．６中、２μｇ／ｍｌのＰＤ（１ｍｇ／ｍｌ）、２μｇ／ｍｌのＰＥ（１５００μｇ／ｍｌ）、２μｇ／ｍｌのＰｉｌＡ（３６６０μｇ／ｍｌ）で４℃にて一晩コーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．９％ ポリソルベート２０ ０．０５％で４回洗浄した。ＰＥおよびＰｉｌＡ ＥＬＩＳＡに関しては、プレートを室温で３０分間（振盪しながら）ＰＢＳ−ＢＳＡ１％で飽和させた。洗浄後、「マウスにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したマウス由来の血清または参照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅマウスＩｇＧで較正した内部参照）をマイクロウェルに加え、ＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％（ＰＤアッセイの場合）およびＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％ ＢＳＡ ０．１％（ＰＥおよびＰｉｌＡアッセイの場合）で連続希釈して１００μｌとした（二倍希釈工程）。次に、これらのプレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体とともに（１００μｌ／ウェル）振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。次に、これらのプレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５〜４．６および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ（オルトフェニレン−ジアミン））を各ウェルに加え（１００μｌ）、暗所で１５分間置いた。ＨＣｌ １Ｎ ５０μｌの添加により反応を停止させ、４９０ｎｍ（参照に関しては６２０ｎｍ）で吸光度を読み取った。
ＰｈｔＤおよびｄＰｌｙ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡの説明
プレートを、１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのＰｈｔＤ（１０２１μｇ／ｍｌ）または４μｇ／ｍｌのＰｌｙ（３６７μｇ／ｍｌ）で３７℃にて２時間コーティングした。次に、これらのプレートをＮａＣｌ ０．０９％ ポリソルベート ０．０５％で３回洗浄した。洗浄後、「マウスにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したマウス由来の血清または参照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅマウスＩｇＧで較正した内部参照）をマイクロウェルに加え、ＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％で連続希釈して１００μｌとした（二倍希釈工程）。次に、これらのプレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗マウスＩｇＧ抗体とともに（１００μｌ／ウェル）振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。これらのプレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ（オルトフェニレン−ジアミン））を各ウェルに加え（１００μｌ）、暗所で１５分間置いた。ＨＣｌ １Ｎ ５０μｌの添加により反応を停止させ、４９０ｎｍ（参照フィルターに関しては６２０ｎｍ）で吸光度を読み取った。
オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）の説明
血清サンプルを５６℃で４５分間加熱して残存する内因性補体を不活性化した。各１：２希釈血清サンプルの２５μｌのアリコートを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル当たり２５μｌのＯＰＡバッファー（ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）−１４．４％不活性化ＦＣＳ（ウシ胎児血清））中に二倍連続希釈した。次に、活性化ＨＬ−６０細胞（１×１０^７細胞／ｍｌ）、新たに解凍した肺炎球菌ワーキングシードおよび新たに解凍したベビーウサギ補体の例えば、４／２／１比（ｖ／ｖ／ｖ）（ただし、血清型１、６Ｂおよび６Ａの場合、その比は４／２／２とした）の混合物２５μｌを希釈血清に加え、最終容量を５０μｌとした。このアッセイプレートを、オービタルシェーカー（２１０ｒｐｍ）を用い、３７℃で２時間インキュベートし、貪食作用プロセスを促進した。マイクロプレートを氷上に少なくとも１分間置くことにより反応を停止させ、プレートは使用するまで氷上で維持した。次に、プレートの各ウェルの２０μｌアリコートを９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、５０μｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス−０．９％寒天を各ウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした後、寒天内に現れた肺炎球菌コロニーを、自動画像解析システム（ＫＳ ４００、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて計数した。血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用し、ウェル当たりの肺炎球菌の数を決定した。対照ウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺傷活性の計算に用いた。血清サンプルのＯＰＡ力価は、肺炎球菌の５０％殺傷を促すことができる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン化貪食作用力価は、４パラメーター曲線当てはめ解析を用いて計算した。
マウスにおける３種のワクチン製剤の免疫原性
２試験区に分配した２群の２７個体雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０、１４および２８日目に１／１０ヒト用量の、タンパク質単独（ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥＰｉｌＡ）、Ｐｒｅｖｎａｒ １３（商標）（市販の連鎖球菌ワクチン−結果は示さず）、１０Ｖ、１２Ｖ（ＤＳＰ２Ａ０１７）および１２Ｖ＋タンパク質（ＤＳＰ２Ａ０１２）ＧＭＰロットを含む種々の製剤の筋肉内（ＩＭ）注射によって免疫した。マウスの違う肢に、１／１０ヒト用量のＩｎｆａｎｒｉｘ Ｈｅｘａ（商標）（ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、Ｂ型肝炎表面抗原、不活性化１、２および３型ポリオウイルスならびにインフルエンザ菌ｂ糖類（ＰＲＰ）を含むワクチン）を施した（臨床試験における乳幼児の異なる部位における併用投与を模倣）。

【0256】

４２日目に採取した個々の血清およびプールした血清においてそれぞれ抗ＩｇＧレベルおよびオプソニン化貪食作用力価を決定した。

【0257】

１２Ｖ＋タンパク質ワクチンの、ＩｇＧ抗体力価およびオプソニン化活性を誘導する能力を評価し、１２Ｖおよび１０Ｖワクチンの場合と比較した。

【0258】

種々の製剤を注射したマウス由来の血清を、多糖血清型およびタンパク質に対してＥＬＩＳＡ（上記のように）で試験し、また、１２の多糖血清型に対してＯＰＡで試験した。

【0259】

１２Ｖ＋タンパク質ワクチンは、ほとんどの血清型に対して１２Ｖに類似する応答を誘導した。

【0260】

図３１の結果は、１２Ｖ＋製剤および肺炎球菌糖類コンジュゲートを含まなかった製剤に関して測定されたＰＥ、ＰｉｌＡ、ＰｈｔＤ、ＰｌｙおよびＰＤ抗体応答間に統計学的な差は無かったことを示した。
実施例２３：モルモットにおける１０Ｖ、１２Ｖおよび１２Ｖ＋タンパク質ワクチンの免疫原性の比較
ＥＬＩＳＡ抗肺炎球菌多糖ＰＳの説明
マイクロプレートを、１００μｌ／ウェルの２．５μｇ／ｍｌのＰＳ１、５μｇ／ｍｌのＰＳ４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖまたは１４；１０μｇ／ｍｌのＰＳ１９Ａおよび２３Ｆ、４０μｇ／ｍｌのＰＳ１８ＣおよびＰＳ１９Ｆまたは参照ウェルに関してはＰＢＳ中２μｇ／ｍｌに希釈したＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗モルモットＩｇＧ（２．４ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて２時間コーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ １５０ｍＭ（０．９％）−ポリソルベート２０ ０．０５％で３回洗浄した。各群からプールした血清を、ＣＰＳ（２．５ｍｇ／ｍｌの６Ａおよび６Ｂ以外は１ｍｇ ＣＰＳ／ｍｌの無希釈血清）Ｖ／Ｖを含有するＰＢＳ−ポリソルベート２０ ０．０５％中に希釈し（ＰＳ ６Ａおよび６Ｂに関しては１／２、他の全ての血清型に関しては１／１０）、ＣＰＳに対する抗体を中和させるために３７℃で１時間インキュベートした。「モルモットにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したモルモット由来の血清をマイクロウェルに加え、ＰＢＳ−ポリソルベート２０ ０．０５％で連続希釈して１００μｌとするか（二倍希釈工程）、または参照（ＰＢＳ−ポリソルベート２０ ０．０５％で０．２５μｇ／ｍｌに希釈したＣｈｒｏｍｐｕｒｅモルモットＩｇＧ（１１ｍｇ／ｍｌ）を加えた。これらのプレートを振盪下、室温で３０分間インキュベートした。これらのプレートを上記のように洗浄し、ペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗モルモットＩｇＧ抗体（１００μｌ／ウェル）を加え、プレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、基質（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５〜４．６および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ）を各ウェルに加え（１００μｌ）、暗所で１５分間インキュベートした。ＨＣｌ １Ｎを添加することにより反応を停止させた。分光光度計を用い、４９０ｎｍ（参照に関しては６２０ｎｍ）で吸光度を読み取った。発色は、血清中に存在する抗体の量に正比例する。
抗ＰＤ、ＰＥ、およびＰｉｌＡ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡの説明
プレートを、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中の炭酸バッファーｐＨ９．６中、２μｇ／ｍｌのＰＤ（１ｍｇ／ｍｌ）、２μｇ／ｍｌのＰＥ（１５００μｇ／ｍｌ）、または２μｇ／ｍｌのＰｉｌＡ（３６６０μｇ／ｍｌ）または参照ウェルに関してはＰＢＳ中２μｇ／ｍに希釈したＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗モルモットＩｇＧ（２．４ｍｇ／ｍｌ）で３７℃にて２時間コーティングした。これらのプレートをＮａＣｌ ０．９％ ポリソルベート２０ ０．０５％で４回洗浄した。ＰＥおよびＰｉｌＡ ＥＬＩＳＡについては（この工程はＰＤおよびＰｌｙ ＥＬＩＳＡについては実施しなかった）、プレートを室温で３０分、ＰＢＳ−ＢＳＡ１％で飽和させた。洗浄後、「モルモットにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したモルモット由来の血清または参照血清サンプル（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅモルモットＩｇＧで較正した内部標準）をマイクロウェルに加え、ＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％（ＰＤ ＥＬＩＳＡの場合）およびＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％ ＢＳＡ ０．１％（ＰＥおよびＰｉｌＡ ＥＬＩＳＡの場合）中に連続希釈して１００μｌとした（二倍希釈工程）。これらのプレートを室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗モルモットＩｇＧ抗体（１００μｌ／ウェル）とともに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５〜４．６および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ）を各ウェルに加え（１００μｌ）、暗所で１５分間置いた。ＨＣｌ １Ｎ ５０μｌを添加することにより反応を停止させ、４９０ｎｍ（参照フィルターに関しては６２０ｎｍ）で吸光度を読み取る。
ＰｈｔＤおよびｄＰｌｙ抗体を測定するためのＥＬＩＳＡの説明
プレートを、１００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＰｈｔＤ（１０２１μｇ／ｍｌ）または２μｇ／ｍｌ Ｐｌｙ（３７６μｇ／ｍｌ）で３７℃にて２時間コーティングした。次に、これらのプレートをＮａＣｌ ０．９％ ポリソルベート２０ ０．０５％で４回洗浄した。洗浄後、「モルモットにおける３種のワクチン製剤の免疫原性」と題された節に記載の通りに免疫したモルモット由来の血清または参照（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅモルモットＩｇＧで較正した内部標準）をマイクロウェルに加え、ＰＢＳポリソルベート２０ ０．０５％中に連続希釈して１００μｌとした（二倍希釈工程）。これらのプレートを振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、プレートをペルオキシダーゼにコンジュゲートされた抗モルモットＩｇＧ抗体（１００μｌ／ウェル）とともに振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、基質コンジュゲート（１０ｍｌのクエン酸塩０．１Ｍ ｐＨ４．５〜４．６および５μｌのＨ_２Ｏ_２中、４ｍｇのＯＰＤＡ）を各ウェルに加え（１００μｌ）、暗所で１５分間置いた。ＨＣｌ １Ｎ ５０μｌを添加することにより反応を停止させ、４９０ｎｍ（参照フィルターに関しては６２０ｎｍ）で吸光度を読み取った。
オプソニン化貪食作用アッセイ
血清サンプルを５６℃で４５分間加熱して残存する内因性補体を不活性化した。各１：２希釈血清サンプルの２５μｌのアリコートを、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェル当たり２５μｌのＯＰＡバッファー（ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）−１４．４％不活性化ＦＣＳ（ウシ胎児血清））中に二倍連続希釈した。次に、活性化ＨＬ−６０細胞（１×１０^７細胞／ｍｌ）、新たに解凍した肺炎球菌ワーキングシードおよび新たに解凍したベビーウサギ補体の例えば、４／２／１比（ｖ／ｖ／ｖ）（ただし、血清型１、６Ｂおよび６Ａの場合、その比は４／２／２とした）の混合物２５μｌを希釈血清に加え、最終容量を５０μｌとした。このアッセイプレートを、オービタルシェーカー（２１０ｒｐｍ）を用い、３７℃で２時間インキュベートし、貪食作用プロセスを促進した。マイクロプレートを氷上に少なくとも１分間置くことにより反応を停止させた（プレートはさらなる使用まで氷上で維持しなければならない）。次に、プレートの各ウェルの２０μｌアリコートを９６ウェル平底マイクロプレートの対応するウェルに移し、５０μｌのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス−０．９％寒天を各ウェルに加えた。３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした後、寒天内に現れた肺炎球菌コロニーを、自動画像解析システム（ＫＳ ４００、Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて計数した。血清サンプルを含まない８ウェルを細菌対照として使用し、ウェル当たりの肺炎球菌の数を決定した。対照ウェルのＣＦＵの平均数を決定し、各血清サンプルの殺傷活性の計算に用いた。血清サンプルのＯＰＡ力価は、肺炎球菌の５０％殺傷を促すことができる血清の希釈率の逆数により決定した。オプソニン化貪食作用力価は、４パラメーター曲線当てはめ解析を用いて計算した。
モルモットにおける３種の製剤の免疫原性
２試験区に分配した２群の１７個体モルモットを、０、１４および２８日目に、１／４ヒト用量の、タンパク質単独（ＰｈｔＤ、ｄＰｌｙおよびＰＥＰｉｌＡ）、Ｐｒｅｖｎａｒ １３（商標）（市販の連鎖球菌ワクチン−結果は示さず）、１０Ｖ、１２Ｖ（ＤＳＰ２Ａ０１７）および１２Ｖ＋タンパク質（ＤＳＰ２Ａ０１２）ＧＭＰロットを含む種々の製剤の筋肉内（ＩＭ）注射によって免疫した。モルモットの違う肢に、ヒト用量の１／４のＩｎｆａｎｒｉｘ Ｈｅｘａ（商標）（ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、線維状ヘマグルチニン、パータクチン、Ｂ型肝炎表面抗原、不活性化１、２および３型ポリオウイルス、ならびにインフルエンザ菌ｂ糖類（ＰＲＰ）を含むワクチン）を施した（臨床試験における乳幼児の異なる部位における併用投与を模倣）。

【0261】

４２日目に採取した個々の血清およびプールした血清においてそれぞれ抗ＩｇＧレベルおよびオプソニン化貪食作用力価を決定した。

【0262】

ＩｇＧ抗体力価およびオプソニン化活性を評価し、１２Ｖ＋タンパク質、１２Ｖおよび１０Ｖワクチン間で比較した。

【0263】

種々の製剤を注射したモルモット由来の血清を、多糖血清型およびタンパク質に対してＥＬＩＳＡで試験し、また、製剤中の１２の多糖血清型に対してＯＰＡで試験した。

【0264】

１２Ｖ＋タンパク質は、１２Ｖ製剤に類似する応答を誘導した。

【0265】

図３４の結果は、ＰＥＰｉｌＡと組み合わせた場合に、１２価コンジュゲートの免疫原性に対して負の影響は無いことを示した。

【0266】

１２Ｖ＋タンパク質ＧＭＰ製剤で得られた結果は、１０Ｖ多糖ならびにタンパク質の免疫原性を実証し、この製剤の臨床評価を裏付ける。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25a】

【図25b】

【図25c】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]