特許 6238967 組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6238967

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセス

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/14 20060101AFI20171120BHJP

   C07K 14/445 20060101ALI20171120BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20171120BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20171120BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20171120BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20171120BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20171120BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/14

   C07K14/445

   A61K9/08

   A61K47/18

   A61P33/06

   !C12N15/00 AZNA

   !C12N1/21

【請求項の数】29

【全頁数】141

(21)【出願番号】特願2015-510319(P2015-510319)

(86)(22)【出願日】2013年4月22日

(65)【公表番号】特表2015-517464(P2015-517464A)

(43)【公表日】2015年6月22日

(86)【国際出願番号】US2013037656

(87)【国際公開番号】WO2013165732

(87)【国際公開日】20131107

【審査請求日】2016年4月20日

(31)【優先権主張番号】61/641,105

(32)【優先日】2012年5月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/844,261

(32)【優先日】2013年3月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512229012

【氏名又は名称】フェニックス インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】アレン，ジェフリー

(72)【発明者】

【氏名】カンティン，グレッグ

(72)【発明者】

【氏名】ハベルストック，ライアン

【審査官】 藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２０８０６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１１／１３９７１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０４−５０２７００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１３８２５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１５４１９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Journal of Chromatography B，２００１年，Vol.762，pp.77-86

【文献】 Protein Expression and Purification，１９９７年，Vol.11，pp.72-78

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００ − ４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００ − １９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセスであって、該プロセスは、
（ａ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む細菌細胞溶解物調製物を得る工程、
（ｂ）工程（ａ）の細菌細胞溶解物調製物を、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む可溶性画分と、不溶性画分とに分離する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の可溶性画分中の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、可溶性画分中の宿主細胞タンパク質から分離する工程、および、
（ｄ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得るために、選択的な還元条件に、工程（ｃ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を晒す工程であって、ここで選択的な還元条件は、ｒＣＳＰにおける分子間のジスルフィド結合を減らして分子内のジスルフィド結合を保存し、
選択的な還元条件は１２−２５μＭのＤＴＴと共に、ｐＨ ７．２−ｐＨ８．０で６−１８時間インキュベートする工程を含み、
それによって、変性又はリフォールディングする工程を含まずに精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得る工程であって、ここで得られた組み
換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて１０％は残基２５に分解され、クリッピングされ、タンパク質分解される工程、
を含むプロセス。

【請求項2】

（ｅ）工程（ｄ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を、宿主細胞タンパク質、Ｎ末端分解したｒＣＳＰ、および／または、他の望ましくないｒＣＳＰ種から分離する工程をさらに含む、請求項１記載のプロセス。

【請求項3】

精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が、１０％乃至７５％の全精製収率で得られる、請求項１記載のプロセス。

【請求項4】

得られる精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が、少なくとも９０％の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質単量体を含む、請求項１記載のプロセス。

【請求項5】

工程（ｃ）の分離がクロマトグラフィーを含み、クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーと混合モードクロマトグラフィーを含む、請求項１記載のプロセス。

【請求項6】

混合モードクロマトグラフィーがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、請求項５記載のプロセス。

【請求項7】

工程（ｅ）の分離が疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、請求項２記載のプロセス。

【請求項8】

選択的な還元条件は穏やかな還元剤を含む、請求項１記載のプロセス。

【請求項9】

穏やかな還元剤が、ＤＴＴ、システイン、アセチルシステイン、グルタチオン、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）塩酸塩、あるいは、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）である、請求項８記載のプロセス。

【請求項10】

穏やかな還元剤が、０．０１乃至０．０３ｍＭの濃度のＤＴＴ、または、０．５ｍＭ乃至１．５ｍＭの濃度のＭＴＧである、請求項９記載のプロセス。

【請求項11】

選択的な還元条件が、脱凝集剤をさらに含む、請求項８記載のプロセス

【請求項12】

脱凝集剤が尿素、アルギニン、グアニジンＨＣｌ、または、洗剤である、請求項１１記載のプロセス。

【請求項13】

請求項１の工程（ｄ）の後または請求項２の工程（ｅ）の後に０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのＭＴＧと、１０％〜２０％のアルギニンとを含む製剤バッファー中の１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌ、または、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を透析する工程、及び安定したタンパク質製剤を３℃〜２５℃の保存温度で保存する工程を含む、安定した液体の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質製剤を調製する工程をさらに含む、請求項１又は２記載のプロセス。

【請求項14】

細菌細胞溶解物が、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞から調製される、請求項１記載のプロセス。

【請求項15】

宿主細胞がシュードモナス科細胞である、請求項１４記載のプロセス。

【請求項16】

宿主細胞がシュードモナス属細胞である、請求項１５記載のプロセス。

【請求項17】

核酸配列によってコードされた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で説明されるようなアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で説明されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有している、請求項１４記載のプロセス。

【請求項18】

組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列が、ペリプラズム分泌シグナル配列に融合される、請求項１６記載のプロセス。

【請求項19】

０．５〜１．５ｍＭのＭＴＧと１０％〜２０％のアルギニンとを含む製剤バッファー中の１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、または、１〜５０ｍｇ／ｍｌの組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を含み、保存温度が３℃〜２５℃である、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の安定した液体製剤。

【請求項20】

製剤バッファーが０．５×または１×ＰＢＳを含む、請求項１９記載の安定した液体製剤。

【請求項21】

製剤バッファーが０．５×または１×ＰＢＳを含む、請求項１３記載のプロセス。

【請求項22】

製剤バッファーが、６．０〜７．５、６．４〜７．２、６．４〜７．０、６．６〜６．８、６．４、６．７、または、７．０のｐＨを有している、請求項２０記載の安定した液体製剤。

【請求項23】

製剤バッファーが、６．０〜７．５、６．４〜７．２、６．４〜７．０、６．６〜６．８、６．４、６．７、または、７．０のｐＨを有している、請求項２１記載のプロセス。

【請求項24】

１〜５ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、１．０ｍＭのＭＴＧ、１０％のアルギニン、１×ＰＢＳを含み、６．０〜７．５のｐＨを有し、保存温度が４℃〜６℃である、請求項２２記載の安定した液体製剤。

【請求項25】

製剤バッファーが、１．０ｍＭのＭＴＧ、１０％から２０％のアルギニン、１×ＰＢＳを含み、６．４〜７．５のｐＨを有し、保存温度が４℃〜６℃である、請求項２３記載のプロセス。

【請求項26】

安定した液体組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質製剤が、多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体；多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質高分子量の凝集体；および、多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質分解産物の少なくとも１つを含む、請求項１９記載の安定した液体製剤。

【請求項27】

安定した液体組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質製剤が、多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体；多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質高分子量の凝集体；および、多くて１％、多くて２％、多くて３％、多くて４％、多くて５％、多くて６％、多くて７％、多くて８％、多くて９％、または多くて１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質分解産物の少なくとも１つを含む、請求項１３記載のプロセス。

【請求項28】

安定した液体製剤中でｒＣＳＰを安定して維持するためのプロセスであって、該プロセスは、
６．０〜７．５のｐＨの１×ＰＢＳ中に、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、または１〜５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、０．５〜１．５ｍＭのＭＴＧ、および、１％〜２０％のアルギニンを含む安定した製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、最大２１日間、３℃〜２５℃の温度で安定して維持される、プロセス。

【請求項29】

安定した液体製剤中で精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を安定して維持する工程をさらに含み、６．０〜７．５のｐＨの０．５×または１×ＰＢＳ中に、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、または、１〜５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、０．５〜１．５ｍＭのＭＴＧ、および、１〜２０％のアルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、最大２１日間、３℃〜２５℃の温度で安定して維持される、請求項１又は２記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜関連出願への相互参照＞
本出願は、２０１２年５月１日に出願された、米国仮特許出願第６１／６４１，１０５号の利益を主張し、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８４４，２６１の一部継続出願であり、これらの文献は、全体として引用することで本明細書に組み込まれる。

【0002】

＜政府支援＞
本発明は、（微生物感染症部（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）／国立アレルギー研究所）によって与えられた契約ＡＩ−Ｎ０１−０５４２１０下で政府の支援をうけて作られた。政府は本発明において一定の権利を有している。

【0003】

本発明はタンパク質精製、とりわけ、組換え発現した熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の精製の分野にある。

【背景技術】

【0004】

マラリアはプラスモジウム属の寄生虫によって引き起こされる。防疫センターによれば、マラリアは、アフリカでは、ＨＩＶ／エイズに次いで感染症による第２の死因である。マラリアは、呼吸器感染症、ＨＩＶ／エイズ、下痢症、および結核に次いで、世界で第５位である。ヒトを攻撃する少なくとも１１の既知のマラリア原虫寄生虫の１つである熱帯熱マラリア原虫は、重要な臓器や、免疫系から逃れることが可能な深部組織に寄生虫を隔離することを特徴とする特に重症の感染を引き起こす。

【0005】

利用可能な有効なマラリアワクチンはない。最近の戦略は、寄生虫の病因にとって重大な意味を持つ熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）を標的としている。現在のところ、ＣＳＰの一部からできているＲＴＳ，Ｓ（グラクソスミスクライン）と呼ばれるワクチンが、第ＩＩＩ相臨床試験にある。ＣＳＰは、３つの領域−Ｎ末端領域、中央の反復領域、および、Ｃ末端領域を有していると広く描写可能なタンパク質単量体である。ＮおよびＣの末端領域は、寄生虫侵入にとって重要な重大な保護領域を包含しており、中央領域は、高度に保存された免疫優勢テトラペプチドを包含している。ワクチンＲＴＳ，Ｓは、ＣＳＰのＮ末端領域を含んでいない。ワクチンＲＴＳ，Ｓは、ＣＳＰの中央の反復領域とＢ型肝炎表面抗原に結合したＣ末端領域の一部からできている。ＣＳＰのＮ末端領域が免疫原性であることを示す最近の報告によれば、Ｎ末端領域を有するＣＳＰ分子を利用するワクチン戦略は優れているということが示唆されている。

【0006】

ワクチンの研究と産生の必要性を満たす量の組み換えＣＳＰを作るための製造規模の精製プロセスの開発は、困難な課題に直面する。ＣＳＰのＮ末端領域は分解に非常に弱い。さらに、ＣＳＰは、単量体のＮ末端の近くの遊離システインを含む共有分子間ジスルフィド結合の形成により、二量体化する。ＣＳＰは高分子量の凝集体も形成する。現在の精製スキームは、Ｎ末端領域を欠く組み換えＣＳＰ単量体を提供するか、あるいは、低収量の未処置のＣＳＰを生成する。二量体と凝集体を除去するための変性はリフォールディングすることを必要とし、これは、ＣＳＰのＣ末端領域に４つのシステイン残基を含む２つのジスルフィド結合の存在によって複雑になる。これらのジスルフィド結合は、Ｃ末端保護領域の構造と機能にとって重大であり、これらを破壊することは、肝細胞に結合するＣＳＰの能力を破壊することが分かっている。さらに、追加の変性とリフォールディングの工程は、面倒であり、高価であり、収量を減少させ、大きな発酵バッチと共に用いるためにスケールアップするのは困難である。したがって、高収量で高品質な組み換えＣＳＰを得る大規模に拡張可能な精製方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、細菌宿主細胞発現系で作られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ｒＣＳＰ）を精製するプロセスに関する。このプロセスは、タンパク質の変性やリフォールディンを必要とすることなく、高い収量でｒＣＳＰを提供する。本発明は、ｒＣＳＰの二量体化、凝集、およびＮ末端の分解を含む、当該技術分野でこれまでに遭遇した障害を克服するものである。本発明によって提供されるプロセスは、大規模に拡張可能であり、大きな発酵バッチに適用することができる。本発明はまた、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の安定した液体製剤と、安定した液体製剤中でｒＣＳＰを安定して維持するプロセスに関する。

【0008】

実施形態では、本発明は、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセスを提供し、前記プロセスは、（ａ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む細菌細胞溶解物調製物を得る工程、（ｂ）、工程（ａ）の細菌細胞溶解物調製物を、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む可溶性画分と不溶性画分とに分離する工程、（ｃ）工程（ｂ）の可溶性画分中の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、可溶性画分中の宿主細胞タンパク質から分離する工程、および、（ｄ）工程（ｃ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、選択的な還元条件に晒す工程であって、それによって、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得る工程、を含む。

【0009】

関連する実施形態において、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、約１０％から約７５％、約１０％−約７０％、約１０％−約６５％、約１０％−約６０％、１０％−約５５％、約１０％−約５０％、約１０％−約４５％、約１０％−約４０％、約１０％−約３５％、約１０％−約３０％、約１０％−約２５％、約１０％−約２０％、約２０％−約７５％、約２０％−約７０％、約２０％−約６５％、約２０％−約６０％、約２０％−約５５％、約２０％−約５０％、約２０％−約４５％、約２０％−約４０％、約２０％−約３５％、約２０％−約３０％、約２５％−約７５％、約２５％−約７０％、約２５％−約６５％、約２５％−約６０％、約２５％−約５５％、約２５％−約５０％、約２５％−約４５％、約２５％−約４０％、約２５％−約３５％、約２５％−約３０％、約３０％−約７５％、約３０％−約７０％、約３０％−約６５％、約３０％−約６０％、約３０％−約５５％、約３０％−約５０％、約３０％−約４５％、または、約３０％−約４０％の全精製収量で得られる。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が、Ｎ末端で分解される。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が、二量体化する。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約５％が、高分子量の凝集体として存在する。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が変性する。関連する実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、少なくとも約９０％の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質単量体を含む。

【0010】

本発明の実施形態では、細菌細胞溶解物はシュードモナス科細胞溶解物である。関連する実施形態では、シュードモナス科細胞は、シュードモナス属細胞であり、他の関連する実施形態では、シュードモナス属細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0011】

実施形態では、上記の工程（ｂ）の分離は、ディスクスタック遠心分離（ｄｉｓｋ−ｓｔａｃｋ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）および／または深層ろ過を含む。工程（ｃ）の分離はクロマトグラフィーを含むことができる。実施形態において、クロマトグラフィーは、下記の１以上を含む：陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および、混合モードクロマトグラフィー。混合モードクロマトグラフィーとしてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用することが企図される。特定の実施形態では、工程（ｂ）の分離は、ディスクスタック遠心分離と深層ろ過を含み、工程（ｄ）の分離は、陰イオン交換クロマトグラフィーと混合モードクロマトグラフィーを含む。

【0012】

本発明の実施形態では、選択的な還元条件は、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン、モノチオグリセロール、チオグリコレート、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｏｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、ジチオエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｉｔｏｌ）、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）塩酸塩、あるいは、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）。特定の関連する実施形態では、選択的な還元条件は、約０．０１０乃至約０．０３０ｍＭの濃度のＤＴＴを含む。バッファー交換は、約４ｋＤａ乃至約８ｋＤａの孔径を有する膜を用いて行われるタンジェンシャルフローろ過を含む。実施形態では、選択的な還元条件は、米国薬局方で公表されているような米国薬局方協会（メリーランド州ロックビル）の基準−国民医薬品集（ＵＳＰ−ＮＦ）、または、例えば、国際薬局方（世界保健機関）で公表されているような米国以外の国の似た基準を満たす成分を含む。

【0013】

請求項に係るプロセスは、約１グラム乃至約２０００グラムのｒＣＳＰを含む細菌細胞溶解物調製物に拡大可能である。関連する実施形態では、細菌細胞溶解物調製物中のｒＣＳＰの量は、約１グラムから約２０００グラムである。

【0014】

本発明は、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセスに関し、該プロセスは次のものを含む：（ａ）細菌宿主細胞の培養物を得る工程であって、細菌宿主細胞が、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換され、工程、（ｂ）細菌宿主細胞の培養物を成長させる工程であって、それによって、発現ベクターから熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を発現させる、工程、（ｃ）細菌細胞溶解物調製物を生成するために、工程（ｂ）で成長した細菌宿主細胞の培養物から細菌宿主細胞を分裂させる工程であって、細菌細胞溶解物調製物が熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む、工程、（ｄ）工程（ｃ）の細菌細胞溶解物調製物を、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む可溶性画分と不溶性画分とに分離する工程、（ｅ）工程（ｄ）の可溶性画分中の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、宿主細胞タンパク質から分離する工程、（ｆ）工程（ｅ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を選択的な還元条件に晒す工程であって、それによって、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質単量体を得る、工程、および、（ｇ）バッファー交換によって工程（ｆ）の選択的な還元条件で使用される還元試薬を取り除く工程であって、それによって、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得る、工程。

【0015】

関連する実施形態において、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、約１０％から約７５％、約１０％−約７０％、約１０％−約６５％、約１０％−約６０％、約２０％−約７５％、約２０％−約７０％、約２０％−約６５％、約２５％−約７５％、約２５％−約７０％、約２５％−約６５％、約２５％−約６０％、約３０％−約７５％、約３０％−約７０％、約３０％−約６５％、または、約３０％−約６０％の全精製収量で得られる。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が、Ｎ末端で分解される。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が二量体化する。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約５％は、高分子量の凝集体として存在する。実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が変性する。関連する実施形態では、得られた精製組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、少なくとも約９０％の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質単量体を含む。

【0016】

本発明の実施形態では、細菌細胞溶解物はシュードモナス科細胞溶解物である。関連する実施形態では、シュードモナス科細胞は、シュードモナス属細胞であり、の関連する実施形態では、シュードモナス属細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。特定の実施形態では、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列は、ペリプラズム分泌シグナル配列に融合される。ペリプラズム分泌シグナル配列は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ分泌シグナル配列、例えば、ＬＡＯ、ｐｂｐ、ｐｂｐＡ２０Ｖ、ｃｕｐＡ２であり得る。本明細書にさらに記載されているように、任意のＣＳＰの発現が企図される。特定の実施形態では、ｒＣＳＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で説明されるようなアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で説明されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する核酸配列によってコードされる。

【0017】

実施形態では、上記の工程（ｄ）の分離は、ディスクスタック遠心分離および／または深層ろ過を含む。工程（ｃ）の分離はクロマトグラフィーを含むことができる。実施形態において、クロマトグラフィーは、下記の１以上を含む：陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および、混合モードクロマトグラフィー。混合モードクロマトグラフィーとしてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用することが企図される。特定の実施形態では、工程（ｄ）の分離は、ディスクスタック遠心分離および深層ろ過を含み、工程（ｅ）の分離は陰イオン交換クロマトグラフィーと混合モードクロマトグラフィーを含む。

【0018】

発明の実施形態では、選択的な還元条件は、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン、モノチオグリセロール、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋で結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、または、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）を含む。特定の関連する実施形態では、選択的な還元条件は、約０．０１０乃至約０．０３０ｍＭの濃度のＤＴＴを含む。バッファー交換は、約４ｋＤａ乃至約８ ｋＤａの孔径を有する膜を用いて実行されるタンジェンシャルフローろ過を含む。

【0019】

請求項に係るプロセスは、約１グラム乃至約２０００グラムのｒＣＳＰを含む細菌細胞溶解物調製物に拡大可能である。関連する実施形態では、細菌細胞溶解物調製物中のｒＣＳＰの量は、約１グラム乃至約２０００グラムである。発明の実施形態では、工程（ｂ）で成長した細菌宿主細胞の培養物は、約１０リットル乃至約５００リットルである。

【0020】

本発明は下記を提供する：
１．組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセスであって、該プロセスは、（ａ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む細菌細胞溶解物調製物を得る工程、（ｂ）工程（ａ）の細菌細胞溶解物調製物を、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む可溶性画分と不溶性画分とに分離する工程、（ｃ）工程（ｂ）の可溶性画分中の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、可溶性画分中の宿主細胞タンパク質から分離する工程、および、（ｄ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得るために、選択的な還元条件に、工程（ｃ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を晒す工程であって、それによって、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得る、工程を含む。
２．（ｅ）工程（ｄ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を、宿主細胞タンパク質、Ｎ末端分解したｒＣＳＰ、および／または、他の望ましくないｒＣＳＰ種から分離する工程をさらに含む、１のプロセス。
３．精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が、約１０％乃至約７５％の全精製収率で得られる、１または２のプロセス。
４．組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が、約１０％−約７５％、約１０％−約７０％、約１０％−約６０％、約１０％−約５０％、約１０％−約４０％、約１０％−約３０％、約２０％−約７５％、約２０％−約５０％、約２０％−約４０％、または、約２０％−約３０％の全精製収量で得られる、１乃至３のいずれかのプロセス。
５．精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が、Ｎ末端で分解される、１乃至４のいずれかのプロセス。
６．精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が二量体化する、１乃至５のいずれかのプロセス。
７．得られる精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約５％が、高分子量の凝集体として存在する、１乃至６のいずれかのプロセス。
８．得られる精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の多くて約１０％が変性する、１乃至７のいずれかのプロセス。
９．得られる精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、少なくとも約９０％の熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質単量体を含む、１乃至８のいずれかのプロセス。
１０．細菌細胞溶解物はシュードモナス科細胞溶解物である、１乃至９のいずれかのプロセス。
１１．シュードモナス科細胞はシュードモナス属細胞である、１０のプロセス。
１２．シュードモナス属細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである、１１のプロセス。
１３．工程（ｂ）の分離はディスクスタック遠心分離を含む、１乃至１２のいずれかのプロセス。
１４．工程（ｂ）の分離は深層ろ過を含む、１乃至１３のいずれかのプロセス。
１５．工程（ｃ）の分離はクロマトグラフィーを含み、クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーと混合モードクロマトグラフィーを含む、１乃至１４のいずれかのプロセス。
１６．工程（ｃ）の分離は混合モードクロマトグラフィーを含み、混合モードクロマトグラフィーはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである、１乃至１５のいずれかのプロセス。
１７．工程（ｅ）の分離は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む、２乃至１６のいずれかのプロセス。
１８．選択的な還元条件は穏やかな還元剤を含む、１乃至１７のいずれかのプロセス。
１９．穏やかな還元剤は、ＤＴＴ、システイン、アセチルシステイン、グルタチオン、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）塩酸塩、あるいは、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）である、１乃至１８のいずれかのプロセス。
２０．穏やかな還元剤は、ＤＴＴ、ＭＴＧ、アセチルシステイン、グルタチオン、チオグリコレート、または、システインである、１９のプロセス。
２１．穏やかな還元剤は、約０．０１乃至約０．０３ｍＭの濃度のＤＴＴ、または、約０．５ｍＭ乃至約１．５ｍＭの濃度のＭＴＧである、２０のプロセス。
２２．選択的な還元条件は脱凝集剤（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）をさらに含む、１乃至２１のいずれかのプロセス。
２３．選択的な還元条件は脱凝集剤をさらに含み、尿素、アルギニン、グアニジンＨＣｌ、または、洗剤である、２２のプロセス。
２４．脱凝集剤は、約１．５乃至２．５Ｍの尿素である、２３のプロセス。
２５．穏やかな還元条件は、約０．０５乃至約１ｍＭのＭＴＧと、２Ｍの尿素を含む、１乃至２４のいずれかのプロセス。
２６．約０．５ｍＭ−約１．５ｍＭのＭＴＧと、約１０％−約２０％のアルギニンとを含む製剤バッファー中の約１ｍｇ／ｍｌ−約５０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ−約２５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ−約１０ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ−約５ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ−約５０ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ−約２５ｍｇ／ｍｌ、または、約５ｍｇ／ｍｌ−約１０ｍｇ／ｍｌの組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を透析（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）する工程を含む、安定した液体の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質製剤を調製する工程をさらに含む、１乃至２５のいずれかのプロセス。
２７．製剤バッファーは０．５×または１×ＰＢＳを含む、２６のプロセス。
２８．製剤バッファーは、約６．０−約７．５、６．４−約７．２、約６．４−約７．０、約６．６−約６．８、または、約６．７のｐＨを有している、２６または２７のプロセス。
２９．約４℃−約１５℃、約４℃−約１０℃、約４℃−約９℃、約４℃−約８℃、約４℃−約７℃、約４℃−約６℃、約４℃−約５℃、約５℃−約１０℃、約５℃−約９℃、約５℃−約８℃、約５℃−約７℃、または、約５℃−約６℃の保存温度含む、２６乃至２８のいずれかのプロセス。
３０．製剤バッファーは、約１．０ｍＭのＭＴＧ、約１０％−約２０％のアルギニン、１×ＰＢＳを含み、約６．４−約７．０のｐＨを有し、保存温度は約４℃−約６℃である、２６乃至２９のいずれかのプロセス。
３１．安定した液体の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質製剤は、
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体；
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質高分子量の凝集体；
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の変性した組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質；
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％のピログルタミン酸を含有する熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質種、および、
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質分解産物の少なくとも１つを含む、２６乃至３０のいずれかのプロセス。
３２．プロセスは、約１グラム乃至約２０００グラムのｒＣＳＰを含む細菌細胞溶解物調製物に拡大可能である、１乃至３１のいずれかのプロセス。
３３．細菌細胞溶解物調製物中のｒＣＳＰの量は、約１グラム乃至約２０００グラムである、１乃至３２のいずれかのプロセス。
３４．細菌細胞溶解物は、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞から調製される、１乃至３３のいずれかのプロセス。
３５．シュードモナス科細胞はシュードモナス属細胞である、１乃至３４のいずれかのプロセス。
３６．シュードモナス属細胞はシュードモナス・フルオレッセンスである、３５のプロセス。
３７．核酸配列によってコードされた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で説明されるようなアミノ酸配列、または、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３で説明されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有している、３４乃至３６のいずれかのプロセス。
３８．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞は、遺伝子型ΔｐｙｒＦ、ｌａｃＩ^Ｑ、および、ΔｈｔｐＸを有するＰｙｒＦ産生宿主株である、３６または３７のプロセス。
３９．組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質をコードする核酸配列は、ペリプラズム分泌シグナル配列に融合される、３４乃至３８のいずれかのプロセス。
４０．ペリプラズム分泌シグナル配列は、シュードモナス・フルオレッセンス分泌シグナル配列である、３９のプロセス。
４１．シュードモナス・フルオレッセンスペリプラズム分泌シグナル配列は、ＬＡＯ、ｐｂｐ、ｐｂｐＡ２０Ｖ、または、ｃｕｐＡ２である、４４のプロセス。
４２．シュードモナス・フルオレッセンスペリプラズム分泌シグナル配列はＬＡＯである、４１のプロセス。
４３．約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧと約１０％−約２０％のアルギニンとを含む製剤バッファー中の約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または、約１−約５０ｍｇ／ｍｌの組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を含む、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の安定した液体製剤。
４４．製剤バッファーは０．５×または１×ＰＢＳを含む、４３の安定した液体製剤。
４５．製剤バッファーは、約６．０−約７．５、約６．４−約７．２、約６．４−約７．０、約６．６−約６．８、約６．４、約６．７、または、約７．０のｐＨを有している、４３または４４の安定した液体製剤。
４６．約４℃−約１５℃、約４℃−約１０℃、約４℃−約９℃、約４℃−約８℃、約４℃−約７℃、約４℃−約６℃、約４℃−約５℃、約５℃−約１０℃、約５℃−約９℃、約５℃−約８℃、約５℃−約７℃、または、約５℃−約６℃の保存温度を含む、４３−４５のいずれかの安定した液体製剤。
４７．約１−約５ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約１．０ｍＭのＭＴＧ、約１０％のアルギニン、１×ＰＢＳを含み、約６．０−約７．５のｐＨを有し、保存温度が約４℃−約６℃である、４３乃至４６のいずれかの安定した液体製剤。
４８．安定した液体製剤は、下記の少なくとも１つを包含している：
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体；
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質高分子量の凝集体；および、
多くて約１％、多くて約２％、多くて約３％、多くて約４％、多くて約５％、多くて約６％、多くて約７％、多くて約８％、多くて約９％、または多くて約１０％の組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質分解産物の少なくとも１つを含む、４３−４７のいずれかの安定した液体製剤。
４９．安定した液体製剤中でｒＣＳＰを安定して維持するためのプロセスであって、該プロセスは、約６．０−約７．５のｐＨの０．５×または１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または、約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ、および、約２０％のアルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ、約３℃−約２５℃の温度で安定して維持される、プロセス。
５０．安定した液体製剤中でｒＣＳＰを安定して維持するプロセスであって、プロセスは、約６．４−約７．２のｐＨの１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ、および、約１０％−約２０％のアルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ、約３℃−約２５℃の温度で安定して維持される、プロセス。
５１．安定した液体製剤中でｒＣＳＰを安定して維持するためのプロセスであって、該プロセスは、約６．４−約７．２のｐＨの１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ、および、約１０％−約２０％のアルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ、約３℃−約２５℃の温度で安定して維持される、プロセス。
５２．安定した液体製剤中で精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を維持する工程をさらに含み、約６．０−約７．５のｐＨの０．５×または１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または、約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ、および、約２０％のアルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、
ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ、約３℃−約２５℃の温度で安定して維持される、１−４２のいずれかのプロセス。
５３．製剤は約６．４−７．０のｐＨで１×ＰＢＳ中に約１．０ｍＭのＭＴＧと約１０％のアルギニンを含み、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、
少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ、約３℃−約５℃の温度で安定して維持される、５２のプロセス。
５４．ｒＣＳＰの安定した維持は、検知されたｒＣＳＰの総量、対照と比較した際のｒＣＳＰ全体における相対的なパーセント差、または、対照と比較した際のｒＣＳＰ純度の相対的なパーセント差によって示される、４９乃至５３のいずれかのプロセス。
５５．ｒＣＳＰの安定した維持は、約７０％−約９５％の検知されたｒＣＳＰの総量、対照と比較した際の、約−５％−約５％、約−４％−約４％、約−３％−約３％、約−２％−約２％、約−２％−約１％、約−２％−約０．５％、約−２％−約０％、または、約０％−約２％のｒＣＳＰ全体におけるパーセント差、または、ｒＣＳＰ純度の相対的なパーセント差によって示される、５４のプロセス。
５６．ｒＣＳＰの合計はｒＣＳＰ単量体の測定値である、５４または５５のプロセス。
５７．対照はゼロ時点であるか、または、−８０℃で保存されたサンプルである、５４乃至５６のいずれかのプロセス。
５８．検知されたｒＣＳＰの総量は、約７０％−約９５％、約７０％−約９０％、約７０％−約８５％、約７０％−約８０％、約７５％−約９５％、約７５％−約９０％、約７５％−約８５％、約８０％−約９５％、
約８０％−約９０％、約８５％−約９５％、約７２％−約９２％、約７０％、約１１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％である、５４乃至５７のいずれかのプロセス。
５９．工程（ｃ）の前に溶解物を凍結させて融解する工程を含む、１−４２のいずれかのプロセス。

【0021】

＜参照による組み込み＞
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および、特許出願は、各々の個々の出版物、特許、または、特許出願が、参照されることによって具体的にかつ個別に組み込まれると意図される同程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

本発明の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられている実施形態と添付の図面とを明記する以下の詳細な図面を引用することによって得られるであろう。

【0023】

【図1】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰタンパク質構造。図は、ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３８９９８で説明されるタンパク質のドメイン、および、残基２５、３３４、３３８、３６９、および３７４のシステイン（それぞれＣで指定されている）を示す。

【図2A】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰアミノ酸配列。Ａ．熱帯熱マラリア原虫３Ｄ７ ＣＳアミノ酸配列；推定の未変性の分泌リーダーおよびＧＰＩアンカーを含むＧｅｎＢａｎｋエントリーＣＡＢ３８９９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。

【図2B】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰアミノ酸配列。Ｂ．非限定的な例として示された、Ｎ末端のメチオニン含み、および、未変性リーダーとＧＰＩアンカーのない、細胞質ＣＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）のアミノ酸配列。

【図2C】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰアミノ酸配列。Ｃ．非限定的な例として示された、未変性リーダー、Ｎ末端メチオニン、および、ＧＰＩアンカーのない、ペリプラズムＣＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）のアミノ酸配列。

【図3A】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ核酸配列。Ａ．熱帯熱マラリア原虫３Ｄ７ ＣＳヌクレオチド配列；ＧｅｎＢａｎｋエントリーＸＭ＿００１３５１０８６．１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。

【図3B】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ核酸配列。Ｂ．非限定的な例として示された、ペリプラズム分泌リーダーに融合されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯのＣＳＰアミノ酸配列をコードする最適化されたヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）。

【図3C】熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰ核酸配列。Ｃ．非限定的な例として示された、ペリプラズム分泌リーダーに融合したＣＳＰをコードする最適化されたヌクレオチド配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。

【図4A】様々な量の還元剤を追加した後の二量体ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ａ．０．５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０３ｍＭのＤＴＴ濃度と、ＤＴＴのない状態。

【図4B】様々な量の還元剤を追加した後の二量体ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｂ．０．０１ｍＭ、０．００３ｍＭのＤＴＴ濃度と、ＤＴＴのない状態。

【図5A】分解されたｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ａ．２Ｍ尿素とｐＨ７．２の様々な量のＤＴＴによる処置。

【図5B】分解されたｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｂ．２Ｍ尿素とｐＨ８．０の様々な量のＤＴＴによる処置。

【図6A】穏やかな還元処理の前後と最終的なバッファー交換のｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ａ．穏やかな還元処理前のバッチ５３３−２４１のＲＰ−ＨＰＬＣ分析。

【図6B】穏やかな還元処理の前後と最終的なバッファー交換のｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｂ．穏やかな還元処理後のバッチ５３３−２４１のＲＰ−ＨＰＬＣ分析と最終的なＴＦＦバッファー交換。

【図6C】穏やかな還元処理の前後と最終的なバッファー交換のｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｃ．内部参照標準５３３−１９１のＲＰ−ＨＰＬＣ。

【図7A】穏やかな還元処理後のｒＣＳＰのＳＥ−ＨＰＬＣ分析と最終的なバッファー交換。Ａ．穏やかな還元処理後のバッチ５３３−２４１のＳＥ−ＨＰＬＣ分析と、最終的なＴＦＦバッファー交換。

【図7B】穏やかな還元処理後のｒＣＳＰのＳＥ−ＨＰＬＣ分析と最終的なバッファー交換。Ｂ．内部参照標準５３３−１９１のＳＥ−ＨＰＬＣ。

【図8A】ｒＣＳＰの二量体形態のプロセスＲＰ−ＨＰＬＣ検出において。Ａ．疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＣＳＰ単量体と二量体の分離。

【図8B】ｒＣＳＰの二量体形態のプロセスＲＰ−ＨＰＬＣ検出において。Ｂ．単量体と二量体のｒＣＳＰ画分のＳＤＳ−ＣＧＥ分析（還元）。

【図8C】ｒＣＳＰの二量体形態のプロセスＲＰ−ＨＰＬＣ検出において。Ｃ．単量体と二量体のｒＣＳＰ画分のＳＤＳ−ＣＧＥ分析（非還元）。

【図8D】ｒＣＳＰの二量体形態のプロセスＲＰ−ＨＰＬＣ検出において。Ｄ．単量体と二量体のｒＣＳＰプールのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。

【図9A】ｒＣＳＰのための多角度レーザー光散乱を用いるサイズ排除ＨＰＬＣ方法。Ａ．ＭＡＬＳ検出を用いるｒＣＳＰ内部参照標準（バッチ５３３−１９１）のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図9B】ｒＣＳＰのための多角度レーザー光散乱を用いるサイズ排除ＨＰＬＣ方法。Ｂ．ＭＡＬＳ検出を用いるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図10A】ｒＣＳＰの凝集した二量体の形態のサイズ排除ＨＰＬＣ分析。Ａ．遠心濃縮後のｒＣＳＰサンプルのＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図10B】ｒＣＳＰの凝集した二量体の形態のサイズ排除ＨＰＬＣ分析。Ｂ．凝集したバッチ５３３−１２８のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図11A】ヘパリン結合のためのｒＣＳＰのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析。Ａ．ヘパリン・バイオセンサー構造。

【図11B】ヘパリン結合のためのｒＣＳＰのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析。Ｂ．ｒＣＳＰの様々な調製のためのヘパリン結合のＢＬＩ分析。

【図11C】ヘパリン結合のためのｒＣＳＰのバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）分析。Ｃ．ｒＣＳＰ結合速度の比較。

【図12A】ｒＣＳＰのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析。サンプルを２Ｍの尿素と１０ｍＭのＤＴＴがある状態で１時間インキュベートし、その後、１．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。Ａ．ｒＣＳＰ ５３３−１９１内部基準の分析。

【図12B】ｒＣＳＰのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析。サンプルを２Ｍの尿素と１０ｍＭのＤＴＴがある状態で１時間インキュベートし、その後、１．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。Ｂ．ｃＩＥＦ精度評価；バッチ５３３−１９１の５回の繰り返し注入の電気泳動図オーバーレイ。

【図13A】ｒＣＳＰの遠紫外線円偏光二色性分析。道具：Ｈｓｐ７０‐８１５；温度＝２０Ｃ；走査速度＝１００ｎｍ／ｍｉｎ；Ｄ．Ｉ．Ｔ．＝１秒；データピッチ＝１ｎｍ；蓄積＝５．Ａ．５３３−１９１の内部参照標準のＣＤスペクトル。

【図13B】ｒＣＳＰの遠紫外線円偏光二色性分析。道具：Ｈｓｐ７０‐８１５；温度＝２０Ｃ；走査速度＝１００ｎｍ／ｍｉｎ；Ｄ．Ｉ．Ｔ．＝１秒；データピッチ＝１ｎｍ；蓄積＝５．Ｂ．ソフトウェア分析：入力スペクトル対予想スペクトル。

【図14A】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ａ．還元されたサンプルのクロマトグラム（ＵＶ、上部パネル；および、ＭＳ ＴＩＣ（質量スペクトル総イオン電流、下部パネル））。

【図14B】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ｂ．１８．１分の標的ピーク領域からの合計質量スペクトル。

【図14C】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ｃ．１８．１分の領域の合計質量スペクトルに由来するデコンボリュートした（Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）スペクトル。

【図14D】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ｄ．非還元サンプルのクロマトグラム。

【図14E】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ｅ．１７．８分の標的ピーク領域からの合計質量スペクトル。

【図14F】ＬＣ−ＭＳ、還元（Ａ−Ｃ）、および、非還元（Ｄ−Ｆ）による調製物５３３−１９１の未処置の質量分析。Ｆ．１７．８分の領域の合計質量スペクトルに由来するデコンボリュートしたスペクトル。観察されたＭＷ（デルタＭＷ）と理論上のＭＷ（デルタＭＷ）の間の差は、還元または非還元サンプルについて、それぞれ１Ｄａおよび４Ｄａであった。

【図15A】ＬＣ−ＭＳによるアルキル化された５３３のサンプルの未処置の質量分析。アルキル化されたサンプルのデコンボリュートしたスペクトルが示される。Ａ．アルキル化した還元していない５３３−１９１は、１つのシステインアルキル化を含む５３３の理論上のｍＷと比較して、６．０Ｄａのデルタを有していることが分かった。

【図15B】ＬＣ−ＭＳによるアルキル化された５３３のサンプルの未処置の質量分析。アルキル化されたサンプルのデコンボリュートしたスペクトルが示される。Ｂ．還元してアルキル化した５３３−１９１は、５つのシステインアルキル化を備えた５３３の理論上のｍＷと比較して、３．９Ｄａのデルタを有していることが分かった。４つのシステインアルキル化を含有する５３３と相関するさらなる種があり、４３％までの全存在量で存在した。この観察は不完全なアルキル化が原因である可能性がもっとも高かった。

【図16A】還元していないＧｌｕ−Ｃ消化とその後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、５３３−１９１のＮ末端システインの分析。Ａ．結果として生じるデータは、方法について記載されたようなＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘで処理された。質量中心（ｃｅｎｔｒｏｉｄｅｄ）ＭＳクロマトグラムの一部を拡大することで、Ｇｌｕ−ＣペプチドＥ２＊（第１のもっともＮ末端のシステインＣ１を含有する）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）が同定され、そして、それがアルキル化されていることが分かる（＊によって表示される）。

【図16B】還元していないＧｌｕ−Ｃ消化とその後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、５３３−１９１のＮ末端システインの分析。Ｂ．同じ質量中心ＭＳクロマトグラムの一部を異なるように拡大することで、Ｇｌｕ−Ｃ生成されたジスルフィド結合Ｅ１−Ｅ２：Ｅ１−Ｅ２ジペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１として示されたコア配列）の同定が示される。Ｅ１−Ｅ２はペプチド内のグルタミン酸残基において失われた開裂を示している。

【図17A】還元してアルキル化した５３３−１２８のペプチドマッピング。Ａ．Ａｓｐ−Ｎ消化のＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ分析のための配列包括度（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（７５．４％）。

【図17B】還元してアルキル化した５３３−１２８のペプチドマッピング。Ｂ．トリプシン消化のＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ分析のための配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）範囲（５６．９％）。紫の枠のアミノ酸は同定を示す。薄い灰色の枠はまったく同定されていないことを示す。緑青色に強調されたシステインは、生体外のシステインアルキル化残基が同定されたことを示している。黄色に強調されたＮ／Ｑ残基は、脱アミドが同定されたことを示す。これらの脱アミドは可変的に探索されたため、同定のみでは、これらの残基の各々がどんな値で脱アミド化されるかは示されていない。実際には誤った同定があることもあり、これらの脱アミドを確認するためにさらなる分析が必要とされる。

【図17C】還元してアルキル化した５３３−１２８のペプチドマッピング。Ｃ．Ａｓｐ−Ｎ消化について同定されたペプチドに関連するピークを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラム。

【図17D】還元してアルキル化した５３３−１２８のペプチドマッピング。Ｄ．Ａｓｐ−Ｎ消化について同定されたペプチドに関連するピークを示すＬＣ−ＭＳクロマトグラム。

【図18A】ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅでは同定されない大きなペプチドの手動による同定。それぞれのピークからのＭＳのスペクトルを合計して、ＭａｘＥｎｔ１を用いてデコンボリュートした。Ａ．２９．１分のピークからデコンボリュートしたスペクトル。ペプチド１７９−２６７（ａ．ａ．）については、観察されたＭＷは、理論上のＭＷ（８，９７１．１５Ｄａ）から０．９Ｄａであった。

【図18B】ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ Ｓｏｆｔｗａｒｅでは同定されない大きなペプチドの手動による同定。それぞれのピークからのＭＳのスペクトルを合計して、ＭａｘＥｎｔ１を用いてデコンボリュートした。Ｂ．３０．５分のピークからデコンボリュートしたスペクトル。ペプチド１０７−１７８（ａａ）については、観察されたＭＷは、理論上のＭＷ（７，１７８．１９Ｄａ）から３．８Ｄａであった。

【図19A】バッチ５３３−４０６のＴＭＡＥ ＨｉＣａｐクロマトグラフィー。Ａ．クロマトグラムとカラムの実行条件。

【図19B】バッチ５３３−４０６のＴＭＡＥ ＨｉＣａｐクロマトグラフィー。Ｂ．画分のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様画像分析。

【図20A】バッチ５３３−４０７のＴＭＡＥ ＨｉＣａｐクロマトグラフィー。Ａ．クロマトグラムとカラムの実行条件。

【図20B】バッチ５３３−４０７のＴＭＡＥ ＨｉＣａｐクロマトグラフィー。Ｂ．画分のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様画像分析。

【図21A】バッチ５３３−４０６のＣｅｒａｍｉｃ ＨＡ Ｉ型クロマトグラフィー。Ａ．クロマトグラムとカラムの実行条件。

【図21B】バッチ５３３−４０６のＣｅｒａｍｉｃ ＨＡ Ｉ型クロマトグラフィー。Ｂ．画分のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様画像分析。

【図22A】バッチ５３３−４０７Ｃｅｒａｍｉｃ ＨＡ Ｉ型クロマトグラフィー。Ａ．クロマトグラムとカラムの実行条件。

【図22B】バッチ５３３−４０７Ｃｅｒａｍｉｃ ＨＡ Ｉ型クロマトグラフィー。Ｂ．画分のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様画像分析。

【図23】統合精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの実行。組み換えＣＳＰバッチ５３３−４０６および５３３−４０７は、ＭＯＰＳバッファーを含む１０％のＢｉｓ−トリスゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された；ＭＷ＝分子量マーカー；Ｌ＝カラム充填；Ｅｌｕｔ＝カラム溶出サンプル；Ｆｉｎａｌ＝最終精製ｒＣＳＰ。

【図24】統合精製のウエスタンブロット分析の実行。立体構造に特異的な４Ｃ２抗体を用いるウエスタンブロットによって分析された組み換えＣＳＰ、バッチ５３３−４０６、５３３−４０７および５３３−１９１。

【図25A】ｒＣＳＰのサイズ排除ＨＰＬＣ分析。Ａ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０６のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図25B】ｒＣＳＰのサイズ排除ＨＰＬＣ分析。Ｂ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０７のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図25C】ｒＣＳＰのサイズ排除ＨＰＬＣ分析。Ｃ．ｒＣＳＰ参照５３３−１９１のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図26A】ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ａ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０６のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図26B】ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｂ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０７のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図26C】ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。Ｃ．ｒＣＳＰ参照５３３−１９１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。

【図27A】ｒＣＳＰの未処理の質量分析。Ａ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０６のデコンボリュートしたスペクトル。

【図27B】ｒＣＳＰの未処理の質量分析。Ｂ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０７のデコンボリュートしたスペクトル。

【図27C】ｒＣＳＰの未処理の質量分析。Ｃ．ｒＣＳＰ参照５３３−１９１のデコンボリュートしたスペクトル。

【図28A】ｒＣＳＰのペプチドマッピング分析。Ａ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０６のＬＣ／ＭＳ ＧｌｕＣペプチドマップ。

【図28B】ｒＣＳＰのペプチドマッピング分析。Ｂ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０７のＬＣ／ＭＳ ＧｌｕＣペプチドマップ。

【図28C】ｒＣＳＰのペプチドマッピング分析。Ｃ．ｒＣＳＰ参照５３３−１９１のＬＣ／ＭＳ ＧｌｕＣペプチドマップ。

【図29A】ｒＣＳＰのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析。Ａ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０６のｃＩＥＦ分析。

【図29B】ｒＣＳＰのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析。Ｂ．ｒＣＳＰバッチ５３３−４０７のｃＩＥＦ分析。

【図29C】ｒＣＳＰのキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）分析。Ｃ．ｒＣＳＰ参照５３３−１９１のｃＩＥＦ分析。

【図30A】ｒＣＳＰの遠紫外線円偏光二色性分析、および、ｒＣＳＰの固有の蛍光分析。Ａ．ｒＣＳＰの遠紫外線円偏光二色性分析。道具：ＪＡＳＣＯ ８１５；温度＝２０℃；走査速度＝１００ｎｍ／ｍｉｎ；Ｄ．Ｉ．Ｔ．＝１秒；データピッチ＝０．１ｎｍ；蓄積＝５；示されるような、５３３−１９１（内部基準）、５３３−４０６、および、５３３−４０７のＣＤスペクトル。

【図30B】ｒＣＳＰの遠紫外線円偏光二色性分析、および、ｒＣＳＰの固有の蛍光分析。Ｂ．ｒＣＳＰの固有の蛍光分析。測定方法：Ｅｍ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ；感受性＝７４０Ｖ；Ｄ．Ｉ．Ｔ．＝１秒；帯域幅（Ｅｘ）２．００＝ｎｍ；帯域幅（Ｅｍ）＝１０ｎｍ；例えば、波長＝２８０ｎｍ；測定範囲＝２９５−３９５ｎｍ；データピッチ＝１ｎｍ；シャッター制御＝自動；ＣＤ検出器＝ＰＭＴ；蓄積＝３；溶媒＝ＰＢＳ；濃度１６６（ｗ／ｖ）％；温度増分２０℃。２５の重畳幅を含むＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙスムージングがスペクトルに適用された。示された様な５３３−１９１（内部基準）、５３３−４０６、および、５３３−４０７の蛍光スペクトル。

【図31】ｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ分析。群１−３のピークを示す、４℃、ｐＨ ７．５、時間０での１ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰのＲＰ−ＨＰＬＣ。ｐＥ＝ピログルタミン酸を含有しているショルダー。

【図32A】高分子量種に対する凍結後の保圧時間の効果。エンジニアリングラン（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｕｎ）のペーストと、ランスルー（Ｒｕｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ）のペーストから凍結融解した大量のろ液は、凍結融解後の保存時間（Ｔ）のラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）に対する効果を示していた。Ａ．融解後に保持されないサンプル（Ｔ＝０）。上方の３つの矢印によって示された高分子量種「ラダリング」。下方の矢印によって示されたｒＣＳＰ。

【図32B】高分子量種に対する凍結後の保圧時間の効果。エンジニアリングラン（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｕｎ）のペーストと、ランスルー（Ｒｕｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ）のペーストから凍結融解した大量のろ液は、凍結融解後の保存時間（Ｔ）のラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）に対する効果を示していた。Ｂ．サンプルは、融解後２．５時間、室温で保持された（Ｔ＝２．５）。

【図32C】高分子量種に対する凍結後の保圧時間の効果。エンジニアリングラン（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｕｎ）のペーストと、ランスルー（Ｒｕｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ）のペーストから凍結融解した大量のろ液は、凍結融解後の保存時間（Ｔ）のラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）に対する効果を示していた。Ｃ．サンプルは、融解後６時間、室温で保持された（Ｔ＝６）。すべてのパネル：レーン１＝ＭＷマーカー；レーン２＝ＰＲＴ（−２５２）２μｍのろ過前；レーン３＝ＰＲＴ（−４４５）２μｍのろ過後；レーン３＝ＥＲ１（−４４５）２μｍのろ過後。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）を精製する大規模に拡張可能な新しいプロセスを提供する。本発明の方法では、ｒＣＳＰは、タンパク質を変性させてリフォールディングする必要なく、高い収量で得られる。この実現は少なくとも以下の理由から重要である：完全長のＣＳＰは、二量体およびより高度な凝集体を形成する傾向があり、ＣＳＰ単量体のＮ末端は頻繁に分解される。二量体化は、単量体のＮ末端の近くの対になっていないシステイン残基の存在に関係している。二量体を除去するという以前の試みは、二量体を廃棄するか、タンパク質を変性させてリフォールディングする必要があった。本発明の方法は、変性およびリフォールディングの必要なく、二量体化したＣＳＰを利用する新しいプロセスを使用して上記の障害を克服する。本方法では、ＣＳＰ二量体は、変性しない条件下で精製され、その後、新しい選択的な還元条件にさらされる。これらの選択的な還元条件は、分子間のジスルフィド結合を減らして単量体を分離させ、その一方で、各単量体の分子内のジスルフィド結合を保存する。したがって、リフォールディングは必要ではなく、さもなければ廃棄されていた二量体を用いることによって、出力は大幅に増加する。請求項に係る方法の顕著な利点は、精製中に二量体として維持されたｒＣＳＰから得られたＣＳＰ単量体が、Ｎ末端で分解されないということである。
したがって、精製されたｒＣＳＰの質と量の両方が、本発明によって著しく改善される。

【0025】

実施形態では、本発明の精製プロセスは次の工程を含む：

【0026】

１）細菌細胞溶解物調製物を得る工程であって、細菌細胞溶解物調製物がｒＣＳＰ二量体を含む、工程；

【0027】

２）ｒＣＳＰ二量体を精製する工程；および、

【0028】

３）精製されたｒＣＳＰ二量体を選択的な還元条件にさらす工程であって、

【0029】

その結果として高品質のｒＣＳＰを得る工程。

【0030】

記載されたように、選択的な還元条件は、分子間のジスルフィド結合を減らして単量体を分離し、その一方で、各単量体の分子内のジスルフィド結合を保存する。

【0031】

実施形態では、精製プロセスは、分離したｒＣＳＰ単量体のさらなる精製を含む。実施形態において、宿主細胞タンパク質は、クロマトグラフィー、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、ｒＣＳＰ単量体から取り除かれる。

【0032】

実施形態では、精製プロセスは、バッファー交換によって、選択的な還元条件で開始された還元剤を除去する工程をさらに含む。これらの実施形態において、分解していないｒＣＳＰ単量体は凝集しない。

【0033】

特定の実施形態では、精製工程は、次のものを含む：ａ）細胞溶解物調製物を可溶性と不溶性の画分に分離することであって、可溶性画分はｒＣＳＰ二量体を含む、分離、
および、

【0034】

ｂ）可溶性画分中のｒＣＳＰ二量体の宿主細胞タンパク質からの分離。

【0035】

実施形態では、本発明は、ｒＣＳＰ ＨＭＷ凝集体を形成する必要なく、選択的な還元工程の後に、還元剤、脱凝集剤、および／または、望ましくない試薬を除去する方法をさらに提供する。

【0036】

本発明は、高濃度のｒＣＳＰ安定液体製剤を含む、ｒＣＳＰ安定液体製剤をさらに提供する。

【0037】

＜熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質発現＞
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質

【0038】

熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）は、３つの主な領域からなる単量体である：ヘパリン硫酸プロテオグリカンを結合するＮ末端、４つのアミノ酸反復領域（ＮＡＮＰ）、および、タンパク質のＣ末端部分のトロンボスポンディンのようなＩ型を反復領域（図１）。構造の研究は、反復領域が約２１−２５ｎｍの長さと１．５ｎｍの幅の桿状の構造を形成することを示す（Ｐｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２５ Ｓｅｐｔ ２００９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８４ ｎｏ． ３９： ２６９５１−２６９６３。参照により本明細書に組み込まれる）。

【0039】

ＣＳＰアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１−６で本明細書において、および、公開された文献、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＢ３８９９８（タンパク質）およびＸＭ＿００１３５１０８６．１（ヌクレオチド）；Ｈａｌｌ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｎａｔｕｒｅ ４１９（６９０６）， ５２７−５３１によって；および、米国特許番号７，７２２，８８９号「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｌｉｖｅｒ ｓｔａｇｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ」で、説明されており、これらの文献は参照によりすべて本明細書に組み込まれている。上に記載された、および、例えば、Ｐｌａｓｓｍｅｙｅｒｅｔ ａｌ，２００９によって記載された様な、非常によく似た配列および同じ構造特徴を有する多くのＣＳＰ多形が同定されている。

【0040】

ＣＳＰをターゲットとするワクチン開発は、Ｂ細胞エピトープを含有する中央の反復領域、ならびに、ＴＳＲ領域、Ｔ細胞エピトープ、および、Ｂ細胞エピトープを含有するＴＳＲ領域に集中していた（Ｐｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００９， ａｎｄ Ｒａｔｈｏｒｅ ａｎｄ ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ｖｏｌ． ９７ ｎｏ． １５： ８５３０−３５）。Ｎ末端領域は、肝細胞の接着と免疫原性で一定の役割を果たし、かつ、ヘパリン硫酸を介して肝細胞と相互に作用するエピトープを包含していることが示されている。Ｎ末端領域エピトープになるように作製した抗体はスポロゾイト侵入アッセイにおいて抑制的であることが分かった。例えば、Ｐｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００９； Ａｎｃｓｉｎ ａｎｄ Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ， ２００４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７９： ２１８２４−３２； Ｒａｔｈｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８０： ２０５２４−９； ａｎｄ Ｒａｔｈｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７： ７０９２−７０９８．を参照されたい。Ｒａｔｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２００２では、受容体結合中のアミノ酸残基２８−３３の関与が報告されており、Ｔ細胞エピトープを潜在的に形成する残基６５−１１０の認識は、疾患から保護するものであることがＢｏｎｇｆｅｎｅｔ ａｌ．，２００９（Ｖａｃｃｉｎｅ２７（２）：３２８−３５）で報告された。したがって、ワクチンの研究および製造で使用されるＮ末端領域を有するＣＳＰを得ることが最優先事項である。

【0041】

ＣＳＰには５つのシステイン残基がある。１つのシステイン残基は、図１および２Ａに示されるように、完全長のアミノ酸配列（リーダーを含む）の位置２５で、Ｎ末端の近くに位置する。図２Ｂおよび２Ｃで示されるリーダーのない配列では、このシステインは、それぞれ位置２５、６、および５にあり、「Ｃ２５」または「Ｃｙｓ２５」、「Ｃ６」または「Ｃｙｓ６」、あるいは、「Ｃ５」または「Ｃｙｓ５」と呼ぶことができる。Ｃｙｓ２５は、ＣＳＰ二量体を産生するＣＳＰ単量体の間のジスルフィド結合に関わる。典型的には、変性しないＣＳＰ精製スキームでは、二量体は、ｒＣＳＰの大部分を含む。二量体は、組み換え細菌溶解物中の測定されたＣＳＰの約４０パーセント以内で存在することが分かっている。

【0042】

ＣＳＰのＮ末端領域は、２つの主要な部位を含む、いくつかの特定の部位でクリッピングに晒されやすい。用いられる番号付けに依存して、タンパク質分解の１つの主要な部位は、Ｃ５とＹ６の間で生じて残基１−５（図２ＣのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３での番号付けを参照する）の除去をもたらし、Ｃ２５とＹ２６の間で生じて残基１−２５（図２ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１の番号付けを参照する）の除去をもたらし、または、Ｃ６とＹ７の間で生じて残基１−６（図２ＢのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２での番号付けを参照する）の除去をもたらす。第２の主要な部位は、Ｖ１４とＬ１５の間で生じて残基１−１４（図２ＣのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３での番号付けを参照する）の除去をもたらし、Ｖ３４とＬ３５の間で生じて残基１−３４（図２ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１での番号付けを参照する）の除去をもたらし、または、Ｖ１５とＬ１６の間で生じて残基１−１５（図２ＢのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２での番号付けを参照する）の除去をもたらす。高レベルのクリッピングが観察される調製物では、残基Ｎ２９／Ｅ３０とＳ４４／Ｌ４５（図２ＣのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３での番号付けを参照する）の間で、さらなるクリッピングが顕著である。

【0043】

Ｎ末端での「分解」または「タンパク質分解」は、特異的なクリッピングと同様に、非特異的な分解も指す。分解とタンパク質分解は、ｒＣＳＰの望ましくない種を生じさせることがある。Ｎ末端領域から特定の残基まで切断されていない、分解していない、または、タンパク質分解していないＣＳＰは、存在するもっともＮ末端の残基に未変化であると本明細書では呼ばれる。例えば、残基１、２および３を除去するために切断されたまたは非特異的に分解され、かつ、残基４を含むＣＳＰ種は、残基４に分解される、および、残基４に未変化であると呼ばれる。特定の例として、残基グルタミン４（Ｑ４）に分解され、および、残基Ｑ４を含む種は、残基Ｑ４に分解された、および、残基Ｑ４から未変化であると言われる。本発明の実施形態では、得られた精製ｒＣＳＰの多くて１０％は、指定された残基、例えば残基２−５０から選択された残基に分解される。関連する実施形態では、精製されたｒＣＳＰの少なくとも９０％は、残基１−５０から選択された残基に未変化である。本発明の実施形態において、任意の所定の精製工程の後に、例えば、ＨＩＣの後に、または、最終的なｒＣＳＰ調製において得られた、精製ｒＣＳＰの多くて１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはゼロが、残基２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および、５０から選択されたアミノ酸に分解される、クリッピングされる、タンパク質分解される。実施形態では、得られた精製ｒＣＳＰの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％が、残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および、５０から選択されたアミノ酸に未変化である。

【0044】

トロンボスポンディンのようなＩ型反復（ＴＳＲ）を含むＣ末端領域は、４つのシステイン残基を有する。例えば、図２ＡのＣＳＰ配列の位置番号３１５、３１９、３５０、および、３５５、ならびに、図２Ａの完全配列の位置３３４、３３８、３６９および３７４、図２Ｂの位置３１５、３１９、３５０、および、３５５、ならびに、図２Ｃの位置３１４、３１８、３４９および３５４を参照されたい。ジスルフィド結合は、図３Ｃの番号付けを用いてＣ_３１４とＣ_３４９、および、Ｃ_３１８とＣ_３５４の間で、または、図３Ｂの番号付けを用いてＣ_３１５とＣ_３５０、および、Ｃ_３１９とＣ_３５５の間で形成される。Ｃ末端領域システイン残基間のジスルフィド結合の破壊は、標的ＨｅｐＧ２細胞へのＣＳＰの結合に影響を与えることが報告された（Ｒａｔｈｏｒｅ， Ｄ．， ａｎｄ ＭｃＣｕｔｃｈａｎ， Ｔ．， ２０００， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ｖｏｌ． ９７ ｎｏ． １５： ８５３０−３５）。一般的に得られた二量体化または凝集ｒＣＳＰのほとんどの割合を変性するまたはリフォールディングすることを必要とする精製スキームは、Ｃ末端領域中の適切なジスルフィド結合（未変化のジスルフィド結合）を修復するという困難な課題に直面する。

【0045】

本発明の方法では、望ましくないＣＳＰ二量体は選択的に還元されることで、タンパク質を変性することなく、ＣＳＰ単量体を生成する。本発明の実施形態では、得られた未変性の精製ｒＣＳＰは、不適切なジスルフィド結合を有する約５％未満のＣＳＰを含む。Ｃ末端領域中の２つのジスルフィド結合の１つまたは両方が、不適切に対になった（例えば、システインが誤ったシステインと対になる、または、対にならない）際に、不適切なジスルフィド結合が生じる。不適切なジスルフィド結合は、当業者にとって周知な、または、本明細書に記載の任意の方法を用いて、評価することができる。

【0046】

実施形態において、任意の精製工程の後で、例えば、ＨＩＣの後で、または、最終的なｒＣＳＰ調製の後で得られた精製ｒＣＳＰは、例えば、不適切なジスルフィド結合を有する、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または、約１％未満の変性したｒＣＳＰを含む。Ｃ末端領域の２つの天然のジスルフィド結合の少なくとも１つが不対合であるかまたは対になっていない場合、不適切なジスルフィド結合が同定される。実施形態では、精製されたｒＣＳＰの少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％がそれぞれ、未変化のジスルフィド結合を有している。

【0047】

図２Ａは、推定上の天然の分泌シグナルペプチド（タンパク質の成熟した形態では存在しない）とＧＰＩアンカー領域を含む、ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３８９９８で提供されるような完全長のタンパク質を示している。実施形態では、本発明の方法を使用して得られた精製ｒＣＳＰは、ＧＰＩアンカーを含まない。Ｏｐｈｏｒｓｔ ｅｔ ａｌによれば、ＧＰＩアンカー領域を除去することで、タンパク質の発現または分泌物を変えることなく、熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰの免疫原性が改善される（Ｏｐｈｏｒｓｔ， ｅｔ ａｌ．， ９ Ｆｅｂ ２００７， Ｖａｃｃｉｎｅ ２５（８）： １４２６−３６）。実施形態では、ＧＰＩアンカー領域は含まれている。実施形態では、ＧＰＩアンカー領域はトランケートされ、すなわち、その一部が存在する。本発明の方法を用いて精製のために企図されたＣＳＰのアミノ酸配列の例が、図２Ｂおよび２Ｃで示される。図２Ｂは、ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３８９９８のアミノ酸２１−３８２に加えて、Ｎ末端メチオニンを有している細胞質種を描いている。図２Ｃは、ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ３８９９８のアミノ酸２１−３８２をさらに含む、図２Ｂの種に対応するペリプラズム種を描いている。実施形態では、分泌リーダーは、ＣＳＰのペリプラズム分泌のためにタンパク質のＮ末端へ融合される。

【0048】

図２ＡのＣＳＰは、約４２．６ｋＤａの分子量と５．３７の等電点を有する、３９７のアミノ酸の長さの単量体である。図２Ｃの成熟した形態（すなわち、分泌リーダーを含まない、アミノ酸１−２０）は、約３８．７ｋＤａの分子量と５．２１の等電点を有するタンパク質である。分子量は、（２つの天然の分子内ジスルフィド結合を用いて）完全に還元されると３８７２５．０Ｄａであり、還元されないと３８７２１．０Ｄａであることが分かった。

【0049】

＜ＣＳＰ変異体および修飾＞
上記のように、本発明の方法は、タンパク質のＮ末端領域の対になっていないシステインの存在により二量体化し集合するというｒＣＳＰの性質を含む、以前に遭遇したｒＣＳＰ精製の障害の克服を提供する。

【0050】

実施形態において、発明の方法はＣＳＰの任意の配列変異体または修飾を精製するために使用される。実施形態において、任意のＣＳＰ変異体または多形体の精製が検討され、それがタンパク質のＮ末端領域に、対になっていないチオール残基（例えばシステイン）を含む単量体間の相互作用によって二量体化することが提供される。ＣＳＰ多形性は、例えば上記の参考文献である Ｒａｔｈｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００５及び Ａｎｄｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， １９８９，「Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ」Ｂｌｏｏｄ ７４： １８６５によって記載されている。公表された文献に示された配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ２９５５５、ＡＡＮ８７５９４、ＡＡＡ２９５５４．１、ＡＡＡ２９５２４．１、ＡＡＡ６３４２１．１ ＡＣＯ４９５４５．１およびＡＡＡ６３４２２．１のタンパク質配列を含む。

【0051】

実施形態において、 Ｒａｔｈｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， ２００５によって記載されたように、本発明の方法を使用して精製することができるＣＳＰの二量体変異体または修飾は、Ｎ末端領域の対になっていないチオール残基および９３−１１３番目にあるＮ末端領域エピトープを含む（報告中で使用されているように番号付けした）。関連する実施形態において、これらのＣＳＰの二量体変異体または修飾は、Ｎ末端領域の対になっていないチオール残基およびＮ−末端領域のエピトープ配列ＥＮＤＤＧＮＮＥＤＮＥＫＬＲＫＰＫＨＫＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）またはＤＫＲＤＧＮＮＥＤＮＥＫＬＲＫＰＫＨＫＫＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を含む。

【0052】

本発明は、自然に発生する多形性と同様に、人工的に修飾されたｒＣＳＰの精製を検討する。修飾は、置換、挿入、伸長、欠失および誘導体化を単独でまたはその組み合わせを含む。実施形態において、ｒＣＳＰは非必須アミノ酸残基の１つ以上の修飾を含み得る。非必須アミノ酸残基は、タンパク質の活性又は機能（例えばタンパク質の免疫原性又は特定の抗体に結合する能力）を無効化させる又は実質的に減少させることなく新しいアミノ酸配列に変更（例えば欠失又は置換）することができる残基である。実施形態において、ｒＣＳＰは必須アミノ酸残基の１つ以上の修飾を含み得る。必須アミノ酸残基は、新しいアミノ酸配列に変更された（例えば欠失又は置換された）時に、参照ペプチドの活性が実質的に減少する又は無効化する残基である。置換、挿入および欠失はｒＣＳＰの任意の領域にあり得る。例えば、連続する様式において及び分子全体にわたって一定間隔で配置した様式においての両方で、ｒＣＳＰは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの置換を含み得る。ｒＣＳＰは、単独でまたは置換と組み合わせて、連続する様式において又はペプチド分子全体にわたって一定間隔で配置した様式において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの挿入を含みうる。ｒＣＳＰは、単独でまたは置換および／または挿入と組み合わせて、連続する様式において又はペプチド分子全体にわたって一定間隔で配置した様式において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くの欠失を含みうる。ｒＣＳＰは、単独でまたは置換、挿入および／または欠失と組み合わせて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くのアミノ酸の付加を含みうる。

【0053】

置換は保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基と、同様の側鎖を有する又は同様の物理化学的な性質（例えば静電、水素結合、等比体積（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ）、疎水性の性質）を有するアミノ酸残基が取り替えられるものである。アミノ酸は、自然にまたは非天然に生じ得る。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において知られている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ ｐｏｌａｒ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ）（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、システイン）、無極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を備えたアミノ酸を含む。置換はまた非保存的な変化を含み得る。

【0054】

「アミノ酸」、「アミノ酸残基」という用語は、天然なアミノ酸、非天然なアミノ酸および修飾されたアミノ酸を指す。別段の定めがない限り、これらの構造がそのような立体異性の形態を許容するなら、アミノ酸への言及は、ＤおよびＬ立体異性体の両方への言及を含む。天然のアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）を含む。非天然なアミノ酸は限定されないが、ホモリジン、ホモアルギニン、ホモセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノブタン酸、４−アミノブタン酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソブタン酸、３−アミノイソブタン酸酸、２−アミノピメリン酸、ｔｅｒｔｉａｒｙ−ブチルグリシン、２、４−ジアミノイソブタン酸、デスモシン、２、２’−ジアミノピメリン酸、２、３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチスアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフタラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸、ピログルタミン酸およびチオプロリンを含む。さらなる非天然アミノ酸は、Ｎ−末端アミノ基又はそれらの側鎖基上で、可逆的に又は不可逆的な状態で化学的にブロックされたもしくは修飾されたアミノ酸残基、例えばＮ−メチル化Ｄ及びＬアミノ酸又は残基であって側鎖官能基が別の官能基へ化学的に修飾されたものを含む。例えば、修飾されたアミノ酸はメチオニンスルホキシド；メチオニンスルホン；アスパラギン酸（ベータ−メチルエステル）（アスパラギン酸の修飾されたアミノ酸）；Ｎ−エチルグリシン（グリシンの修飾されたアミノ酸）；またはアラニンカルボキサミド（アラニンの修飾されたアミノ酸）を含む。組み込むことができる追加の残基はＳａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４１：２４８１−２４９１に記載されている。

【0055】

配列同一性は、当該技術分野において理解されているように、配列の比較により決定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。当該技術分野において、同一性はポリペプチド又はポリヌクレオチド配列のストリング間の一致によって決定される、そのような配列間の配列関連性の程度を指し得る。同一性は、限定されないがＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ． ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （１９９４）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９８７）； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）； 及びＣａｒｉｌｌｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ， ４８：１０７３ （１９８８）に記載されている方法を含む既知の方法によって計算することができる。同一性を決定する方法は、試験された配列間の最大の一致が起こるように設計されている。さらに、同一性を決定する方法は公に利用可能なプログラム中で体系化される。２つの配列間の同一性を決定するために使用することができるコンピュータプログラムは、限定されないが、ＧＣＧ （Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７； ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｆｉｖｅ ＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍｓ， ｔｈｒｅｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｑｕｅｒｉｅｓ （ＢＬＡＳＴＮ， ＢＬＡＳＴＸ， ａｎｄ ＴＢＬＡＳＴＸ） ａｎｄ ｔｗｏ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｑｕｅｒｉｅｓ （ＢＬＡＳＴＰ ａｎｄ ＴＢＬＡＳＴＮ） （Ｃｏｕｌｓｏｎ （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７６−８０； Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ １：５４３−５５９）を含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０）から公に利用可能である。Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた同一性を決定するために使用することができる。

【0056】

実施形態において、ｒＣＳＰ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１ （図２Ａに示す）、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２ （図２Ｂに示す）又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３（図２Ｃに示す）に記載されている配列と、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有する。実施形態において、ｒＣＳＰ変異体は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：４ （図３Ａに示す）又はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：５ （図３Ｂに示す）に記載されている配列と、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である核酸配列によってコード化される。

【0057】

＜熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の発現＞
本発明の方法は、細菌の過剰発現系で生産された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の精製を意図する。組み換えタンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、その発現ベクターを細菌宿主細胞に形質転換し、組み換えＣＳＰを発現するのにふさわしい状態下で形質転換された宿主細胞を増殖させる方法は、当業者の知識の範囲内である。適切な方法はまた本明細書及び文献に記載されている。

【0058】

本発明の方法に有用な他の宿主細胞と同様に、シュードモナス属宿主細胞中で、有用な調節配列（例えばプロモーター、分泌リーダーおよびリボソーム結合部位）を含む異種タンパク質を発現する方法は、例えば、ともに発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｈｏｓｔｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｙｉｅｌｄ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」である米国特許出願公開 ２００８／０２６９０７０及び２０１０／０１３７１６２， 発明の名称が「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ」である 米国特許出願公開２００６／００４０３５２及び発明の名称が「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒａｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」である米国特許出願公開２００６／０１１０７４７に記載されており、すべては引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる。また、これらの出版物には発明の方法を実行するのに役立つ細菌の宿主菌株を記載されており、ここで宿主株はフォールディングモジュレーターを過剰発現させるために組み換えられている、あるいはプロテアーゼ変異が異種タンパク質発現を増加させるために導入されている。

【0059】

＜調節エレメント＞
本発明の方法を実施するのに有用な発現コンストラクトは、タンパク質をコードする配列に加えて、そこへ操作可能に連結した以下の任意の調節エレメントを含みうる：プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーターおよび翻訳の開始および停止シグナル、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、シストロン制御因子、ポリシストロン性制御因子、及び発現されたポリペプチドの識別、分離、精製および／または単離を促進するヌクレオチド配列「タグ」および「タグ」ポリペプチドをコードする配列のようなタグ配列。

【0060】

有用なＲＢＳは、例えば米国特許出願公開２００８／０２６９０７０及び米国特許出願公開２０１０／０１３７１６２に基づく発現系において、宿主細胞として有用な任意の種から得ることができる。多数の特定なおよび様々な共通ＲＢＳが知られており、例えばＤ． Ｆｒｉｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ２３４（２）：２５７−６５ （８ Ｊｕｌ． １９９９）及びＢ． Ｅ． Ｓｕｚｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １７（１２）：１１２３−３０ （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１）に記載され、参照されている。加えて、天然又は合成ＲＢＳのいずれかを使用してもよく、例えばＥＰ ０２０７４５９ （合成ＲＢＳ）； Ｏ． Ｉｋｅｈａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８１（３）：５６３−７０ （１９８９） （天然ＲＢＳ配列 ＡＡＧＧＡＡＧ）に記載されている。本発明において有用な方法、ベクター、翻訳及び転写エレメント及びその他のエレメントのさらなる例は、例えばＧｉｌｒｏｙ の米国特許５，０５５，２９４及びＧｉｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許５，１２８，１３０； Ｒａｍｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許５，２８１，５３２； Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許４，６９５，４５５及び４，８６１，５９５； Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許４，７５５，４６５； 及びＷｉｌｃｏｘの米国特許５，１６９，７６０に記載されており、引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる。

【0061】

＜リーダー＞
実施形態において、分泌リーダーをコードする配列は、ＣＳＰをコードする配列に融合される。実施形態において、分泌リーダーはペリプラズム分泌リーダーである。実施形態において、分泌リーダーは天然の分泌リーダーである。

【0062】

実施形態において、可溶性タンパク質は、生成中細胞の細胞質またはペリプラズムのいずれかに局在する。異種タンパク質発現を最適化する際に分泌シグナルペプチドまたはリーダーを選択し使用する方法は、例えば、両方とも引用によってその全体が本明細書中に組み込まれている米国特許７，６１８，７９９「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」及び米国特許７，９８５，５６４「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｃ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ」に詳細に記載されており、上記参照の米国特許出願公開２００８／０２６９０７０及び２０１０／０１３７１６２も同様である。下記の表１は、本発明の方法で使用することが意図されている分泌リーダー配列の非限定的な例を提供する。

【0063】

実施形態において、使用された分泌リーダーはＬＡＯ、ｐｂｐ、ｐｂｐＡ２０ＶまたはｃｕｐＡ２である。特定の実施形態において、ＬＡＯ分泌リーダーが使用される。

【0064】

【表1】

【0065】

本発明に従って精製されたｒＣＳＰを発現するのに使用されるプロモーターは、構成的プロモーターまたは制御プロモーターであってよい。異種タンパク質の発現を制御するために有用なプロモーターを選択するための方法は、当該技術分野において周知であり、文献に幅広く記載されている。有用な制御プロモーターの共通の例は、ＤｅＢｏｅｒの米国特許４，５５１，４３３に記載されているｔａｃ及びｔｒｃプロモーターを包含する、ｌａｃプロモーター（すなわちｌａｃＺプロモーター）に由来するファミリーを含み、Ｐｔａｃ１６， Ｐｔａｃ１７， ＰｔａｃＩＩ， ＰｌａｃＵＶ５，及び Ｔ７ｌａｃプロモーターを同様に含む。１つの実施形態において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。実施形態において、プロモーターは大腸菌生物に由来する。

【0066】

誘導可能なプロモーター配列は、発明の方法に従ってＣＳＰの発現を制御するために使用することができる。実施形態において、本発明の方法に有用な誘導可能なプロモーターは、ｌａｃプロモーター（すなわちｌａｃＺプロモーター）に由来するファミリー、特にＤｅＢｏｅｒの米国特許４，５５１，４３３に記載されているｔａｃ及びｔｒｃプロモーターを含み、Ｐｔａｃ１６， Ｐｔａｃ１７， ＰｔａｃＩＩ， ＰｌａｃＵＶ５，及び Ｔ７ｌａｃプロモーターを同様に含む。１つの実施形態において、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態において、プロモーターは大腸菌生物に由来する。

【0067】

本発明に基づく発現系に有用な非ｌａｃプロモーターの共通の例は、例えば表２に列挙されたものを含む。

【0068】

【表2】

【0069】

例えば、Ｊ． Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ ＆ Ｖ． Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ （１９９９） Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａ． Ｄｅｍａｉｎ ＆ Ｊ． Ｄａｖｉｅｓ， ｅｄｓ．） ｐｐ． ４６０−７４ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）； Ｈ． Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ （２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２：４３９−４４５； 及びＲ． Ｓｌａｔｅｒ ＆ Ｒ． Ｗｉｌｌｉａｍｓ （２０００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｊ． Ｗａｌｋｅｒ ＆ Ｒ． Ｒａｐｌｅｙ， ｅｄｓ．） ｐｐ． １２５−５４ （Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＵＫ））を参照されたい。選択された細菌宿主細胞に固有のプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターは、標的ポリペプチドをコードするトランスジーンの発現を制御するために使用され得、例えばシュードモナス属アントラニル酸塩または安息香酸塩オペロンプロモーター（Ｐａｎｔ，Ｐｂｅｎ）である。配列が同一の又は異なる１つ以上のプロモーターが互いに共有結合した、タンデムプロモーターも使用でき、例えばＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター （プロモーター間ハイブリッド）又はＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーターであってもよく、あるいは同一の又は異なる生物に由来してもよい。

【0070】

制御プロモーターは、プロモーターがその一部分である遺伝子の転写を制御するために、プロモーター調節タンパク質を利用する。制御プロモーターが本明細書中で使用される場合、対応するプロモーター調節タンパク質もまた、本発明に従った発現系の一部となる。プロモーター調節タンパク質の例は、例えば、大腸菌カタボライト活性化タンパク質、ＭａｌＴタンパク質のような活性化タンパク質、ＡｒａＣファミリー転写活性化因子、例えば、大腸菌ＬａｃＩタンパク質のようなリプレッサータンパク質、及び例えば大腸菌ＮａｇＣタンパク質のような二重機能調節タンパク質（ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。多くの調節されたプロモーター／プロモーター調節タンパク質の対は、当該技術分野では既知である。１つの実施形態において、標的タンパク質のための発現コンストラクト及び目的の異種タンパク質は、同じ制御エレメントの制御下にある。

【0071】

プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物（すなわちプロモーターに制御される遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写制御領域に、タンパク質が放出又は結合することを可能にするように、調節タンパク質と可逆的に又は不可逆的に付随する化合物）と相互に作用し、それにより遺伝子の転写を開始する際にトランスクリプターゼ酵素の作用を許容又は遮断する。エフェクター化合物は、誘発因子又はコリプレッサーとして分類され、これら化合物は、天然のエフェクター化合物及び無償性（ｇｒａｔｕｉｔｏｕｓ）誘導物質化合物を含む。多くの制御プロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクター化合物の３つの組は、当該技術分野では既知である。エフェクター化合物は細胞培養又は発酵の全体にわたって使用され得るが、制御プロモーターが使用される好ましい実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量又は密度の増加の後、適切なエフェクター化合物は、目的のタンパク質又はポリペプチドをコード化する所望の遺伝子の発現を直接又は間接的にもたらすための培地に加えられる。

【0072】

ｌａｃファミリープロモーターが利用される実施形態において、ｌａｃＩ遺伝子はまたその系の中に存在し得る。通常構成的に発現する遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃファミリープロモーターのｌａｃオペレーターに結合する、Ｌａｃリプレッサータンパク質であるＬａｃＩタンパク質をコードする。したがって、ｌａｃファミリープロモーターが利用される場合、発現系においてｌａｃＩ遺伝子も含まれ、発現され得る。

【0073】

シュードモナス属に役立つプロモーター系は、文献、例えば、上記で引用されている米国特許出願公開第２００８／０２６９０７０号に記載されている。

【0074】

＜宿主細胞＞
本発明の方法は、限定されないがシュードモナス属及び大腸菌の宿主細胞を包含する、任意の細菌宿主細胞発現系で発現されたｒＣＳＰを精製するために使用することができる。実施形態において、ｒＣＳＰはシュードモナス属または密接に近縁である細菌性生物中で発現される。特定の実施形態において、シュードモナス属宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。実施形態において、宿主細胞は大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａである。本発明の方法を実行するのに役立つ宿主細胞及びコンストラクトは、当該技術分野では既知であり、例えば引用によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００９／０３２５２３０号、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」のような文献に記載されている試薬と方法を使用して同定又は作製することができる。この公報は、核酸コンストラクトを、染色体のｌａｃＩ遺伝子挿入を含む栄養要求性のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞に導入することによる、組み換え型ポリペプチドの生成を記載する。核酸コンストラクトは、宿主細胞における核酸の発現を方向付けることができるプロモーターに操作可能に結合された、組み換え型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列及び栄養要求性の選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。栄養要求性の選択マーカーは、原栄養性を栄養要求性の宿主細胞に回復させるポリペプチドである。実施形態において、細胞は、プロリン、ウラシル又はそれらの組み合わせのために栄養要求性である。実施形態において、宿主細胞はＭＢ１０１（ＡＴＣＣデポジットＰＴＡ−７８４１）に由来し、当業者に既知の方法及び科学文献に記載された方法を使用する。その両方が引用によりその全体が本明細書中に組み込まれる、米国特許出願第２００９／０３２５２３０号及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００５， 「Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｙｒＦ ａｎｄ ｐｒｏＣ ｃａｎ ｒｅｐｌａｃｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２１（２）： ３４３−８は、菌株ＭＢ１０１におけるｐｙｒＦ遺伝子を欠失させることにより構築された、生成宿主菌株のウラシルのための栄養要求性を記載する。原栄養性を回復させるためにｐｙｒＦ欠失を補足することができるプラスミドを生成するために、ｐｙｒＦ遺伝子は、菌株ＭＢ２１４（ＡＴＣＣデポジットＰＴＡ−７８４０）からクローン化された。

【0075】

特定の実施形態において、Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞における二重ＰｙｒＦ−ＰｒｏＣ二重栄養要求性（ｄｕａｌ ＰｙｒＦ−ＰｒｏＣ ｄｕａｌ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ）の選択マーカーシステムが使用される。記載されるようなＰｙｒＦ生成宿主菌株は、本発明の方法を実行するのに役立つものとして本明細書に記載のものを含む、他の所望のゲノムの変化を導入するためのバックグラウンドとして使用され得る。実施形態において、Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株は、遺伝子型ΔｐｙｒＦ、ｌａｃＩ^ＱおよびΔｈｔｐＸを有するＰｙｒＦ生成宿主株である。実施形態において、ｌａｃＩ^Ｑはｌｖｓ遺伝子（ｌｖｓ：ｌａｃＩＱ１）に挿入される。

【0076】

実施形態において、次亜種１株（ｂｉｏｖａｒ １ ｓｔｒａｉｎ）ＭＢ１０１に由来するＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株ＤＣ４６９（ΔｐｙｒＦ、ｌａｃＩ^Ｑ、ΔｈｔｐＸ）は、発明の方法に役立つｒＣＳＰの生産のために使用される。ＤＣ４６９株において、ｌａｃＩ^Ｑはｌｖｓ遺伝子（ｌｖｓ：ｌａｃＩＱ１）に挿入される。当業者に知られているように、ＬａｃＩ^Ｑ挿入は何れかの様々な適切な位置の中で一般になされる。

【0077】

実施形態において、宿主細胞はシュードモナス目である。宿主細胞がシュードモナス目である場合、それはシュードモナス属を含むシュードモナス科のメンバーであり得る。γプロテオバクテリアの宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種のメンバー及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ種のメンバーを含む。

【0078】

他のシュードモナス生物も有用であり得る。シュードモナス及びその近縁種は、「Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｒｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｃｃｉ 、 Ｒ． Ｅ． Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｎ．Ｅ． Ｇｉｂｂｏｎｓ （ｅｄｓ．）著， Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ２１７−２８９ （８ｔｈ ｅｄ．， １９７４） （Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍｄ．， ＵＳＡ） 」に記載の科及び／又は属に属するプロテオバクテリアのグループを包含する、グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１を含む。表３は、これら生物体の科及び属を示す。

【0079】

【表3】

【0080】

シュードモナス科及び密接に関連する細菌は一般に、「グラム（−）プロテオバクテリアサブグループ１」又は「グラム陰性好気性桿菌及び球菌」として定義されるグループの一部である（Ｂｕｃｈａｎａｎ ａｎｄ Ｇｉｂｂｏｎｓ （ｅｄｓ．） （１９７４） Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ２１７−２８９）。シュードモナス宿主菌株は、上記で引用される文献、例えば米国特許出願公報第２００６／００４０３５２号に記載される。

【0081】

「グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１」はまた、分類において使用される基準に従ったこの見出し（ｈｅａｄｉｎｇ）に分類されるプロテオバクテリアを含む。見出しはまた、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属， Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属， Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ属， Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属及びＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｘａｎｔｏｍｏｎａｓ属（以前にＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ種と呼ばれていた）に属する生物体を再編成することにより作られたＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属（及びそれに由来するＢｌａｓｔｏｍｏｎａｓ属）、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）に定義されるようなＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属に属する生物体を再編成することにより作られたＡｃｉｄｏｍｏｎａｓ属などの、このセクションにおいて以前に分類されたが、もはやそうではないグループを含む。加えて、宿主はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属からの細胞、すなわちそれぞれＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ及びＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとして再分類された、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎａｌｉａ（ＡＴＣＣ １４３９３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ（ＡＴＣＣ １９３７５）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ ８０７１）を含み得る。同様に、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ １５６６８）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（ＡＴＣＣ １１９９６）は、その後Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ及びＣｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉとしてそれぞれ再分類され；また、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ １９３７５）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ １５０５７）は、それぞれＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ及びＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｉｓｃｉｃｉｄａとして再分類された。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１」はまた、以下の科のいずれかに属すると分類されるプロテオバクテリアを含む：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科（現在はしばしば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の「Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ群」という同義語で呼ばれる）、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科及びＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科（現在はしばしば「Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ」という同義語で呼ばれる）。
従って、本明細書に記載のそれらの属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」内の他の場合には本明細書に記載されている、更なるプロテオバクテリア属は、以下のものを含む：１）Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ属のＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ群細菌；２）Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ、Ｏｌｉｇｅｌｌａ及びＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌；３）Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｓｉｆｅｒ属、Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ属（「Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ」とも呼ばれる）、及びＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属のＲｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ科細菌；及び４）Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ及びＭｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ属のＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科細菌。

【0082】

宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のシュードモナス種（ＡＴＣＣ又は典型的な株の他の寄託番号を括弧内に示す）のプロテオバクテリアのグループとして定義される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ （ＡＴＣＣ ７００６８９）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ （ＡＴＣＣ １０１４５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （ＡＴＣＣ １４９０９）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ （ＡＴＣＣ ３３６６０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ （ＡＴＣＣ １３６７４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ （ＡＴＣＣ ５１５５５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｎｄｏｃｉｎａ （ＡＴＣＣ ２５４１１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ （ＡＴＣＣ ３３６３４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ （ＡＴＣＣ ８０６２）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ （ＡＴＣＣ １７４４０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ （ＡＴＣＣ １４２３５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｒａｍｉｎｅａ （ＡＴＣＣ ３３６３６）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ （ＡＴＣＣ ２５９４１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｓｐｌｅｎｉｉ （ＡＴＣＣ ２３８３５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｅｌａｉｃａ （ＡＴＣＣ ２７１６２）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ （ＡＴＣＣ １９３７２）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ （ＡＴＣＣ ３３６６２）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ （ＡＴＣＣ ４３６５５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓａ （ＡＴＣＣ ５５７０３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒａｎｔｉａｃａ （ＡＴＣＣ ３３６６３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ （ＡＴＣＣ ９４４６， ＡＴＣＣ １３９８５， ＡＴＣＣ １７４１８， ＡＴＣＣ １７４６１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ （ＡＴＣＣ ４９７３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ （ＡＴＣＣ ４９９６８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ （ＡＴＣＣ ４６８３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｓｓｉｃｏｌａ （ＡＴＣＣ ３３６１６）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｎｇａｔａ （ＡＴＣＣ １０１４４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｅｃｔｅｎｓ （ＡＴＣＣ １２７７５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ （ＡＴＣＣ ２９７３６）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （ＡＴＣＣ ３５８５８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ （ＡＴＣＣ ７００８７１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ （ＡＴＣＣ １０８４４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ （ＡＴＣＣ ４６８５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ （ＡＴＣＣ ９８９０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ （ＡＴＣＣ ３３６１８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ （ＡＴＣＣ ７００４７４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ （ＡＴＣＣ １９３７４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｅｒｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｈｉｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ （ＡＴＣＣ １９８６７）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ （ＡＴＣＣ １４６７０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｊｅｓｓｅｎｉｉ （ＡＴＣＣ ７００８７０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ （ＡＴＣＣ １４６６９）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｎｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｔａ （ＡＴＣＣ ２５４１７）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｐｈｉｔｉｃａ （ＡＴＣＣ ３３６６５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ （ＡＴＣＣ １９２４４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ （ＡＴＣＣ １９０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｉｃｔｏｒｕｍ （ＡＴＣＣ ２３３２８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｌｖａ （ＡＴＣＣ ３１４１８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ （ＡＴＣＣ ７００４７６）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｓｓｅｌｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ （ＡＴＣＣ ４３２７２）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ （ＡＴＣＣ ７００３８３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ （ＡＴＣＣ １２６３３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅａｃｔａｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｉｎｏｓａ （ＡＴＣＣ １４６０６）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂａｌｅａｒｉｃａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｔｅｏｌａ （ＡＴＣＣ ４３２７３）；． Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ （ＡＴＣＣ １７５８８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｍｙｇｄａｌｉ （ＡＴＣＣ ３３６１４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｖｅｌｌａｎａｅ （ＡＴＣＣ ７００３３１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ （ＡＴＣＣ ３３６１５）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ （ＡＴＣＣ １０８５７）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ （ＡＴＣＣ ３５１０４）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｌｉａｅ （ＡＴＣＣ ３３０５０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ （ＡＴＣＣ １９３１０）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ （ＡＴＣＣ １３２２３）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ （ＡＴＣＣ ３５９６１）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ （ＡＴＣＣ ７００６８８）； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ；及び Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ。１つの実施形態において、宿主細胞はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。

【0083】

宿主細胞はまた、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば、以下のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種に属するものを含む「蛍光性シュードモナス科」として当該技術分野で既知のプロテオバクテリアのグループとして定義される：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｒｅｎｎｅｒｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｄｒｅｌｌａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｏｒｒｕｇａｔａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｓｓａｒｄｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｎｄｅｌｉｉ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｉｇｕｌａｅ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｈｏｄｅｓｉａｅ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔｈａ； Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ； 及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｉｉ。

【0084】

他の実施形態において、シュードモナス科宿主細胞は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現する。ＤｓｂＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ジスルフィド結合イソメラーゼであり、例えば、米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号に記載される。

【0085】

他の実施形態において、シュードモナス科宿主細胞は野生型であり、すなわち、プロテアーゼ発現の欠損が全く無く、任意のフォールディングモジュレーターを過剰発現しない。

【0086】

プロテアーゼの発現が欠損した宿主細胞は、野生型の宿主に関するそのプロテアーゼの正常な活性又は発現レベルの減少をもたらす、任意の修飾を有し得る。例えば、ミスセンス変異又はナンセンス変異は活性のないタンパク質の発現に通じ得、遺伝子欠失はタンパク質発現を全くもたらすことができない。遺伝子の上流の制御領域の変化は、タンパク質発現の減少をもたらす、又は全くタンパク質発現をもたらすことができない。他の遺伝子欠乏は、タンパク質の翻訳に影響を与え得る。プロテアーゼの処理に必要とされるタンパク質の活性が不完全な場合、プロテアーゼの発現もまた、不完全となり得る。

【0087】

本発明の方法に関連して有用なシュードモナス宿主細胞を生成するのに役立つプロテアーゼ及びフォールディングモジュレーターの例、及び宿主細胞を同定する方法は、例えば米国特許出願公報第 ２００８／０２６９０７０号及び２０１０／０１３７１６２号に記載されている。

【0088】

＜コドンの最適化＞
異種の発現系において、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善するためのコドンの最適化の方法が当該技術分野において知られており、文献に記載されている。例えば、シュードモナス属宿主株内での発現用コドンの最適化は、引用によってその全体が本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公報第２００７／０２９２９１８号「Ｃｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」等に記載されている。大腸菌において発現するためのコドン最適化は、例えば引用によって本明細書中に組み込まれているＷｅｌｃｈ， ｅｔ ａｌ．， ２００９， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，「Ｄｅｓｉｇｎ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」４（９）：ｅ７００２に記載されている。

【0089】

【表4】

【0090】

本発明は、使用されている宿主細胞における発現のために最適化された任意の配列を含む、ＣＳＰの任意のコード配列の使用が意図されている。使用のために意図された配列は、所望の通り任意の程度にまで最適化することができ、これらに限定されないが以下を除去する最適化を含む：シュードモナス属宿主細胞において５％未満しか生成されないコドン、シュードモナス属宿主細胞において１０％未満しか生成されないコドン、レアコドン誘発性の翻訳停止、推測上の内部ＲＢＳ配列、Ｇ又はＣヌクレオチドの長い繰り返し（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｐｅａｔ ）、二次構造への干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、制限酵素部位又はその組み合わせ。

【0091】

さらに、本発明の方法を実施するのに有用な任意の分泌リーダーのアミノ酸配列は、任意の適切な核酸配列によってコードされ得る。

【0092】

＜発酵様式（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒｍａｔ）＞
本発明による発現系は、任意の発酵様式において培養され得る。例えば、バッチ、流加バッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。発酵条件は、文献に記載されている方法を使用し、細菌の発現系における組み換えタンパク質（例えばＣＳＰ）の生成を当業者が状況に応じて最適化することができる。例えば、毒素タンパク質の生成を最適化する方法は、引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許出願公報第２０１１／０２８７４４３号「Ｈｉｇｈ Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｏｘｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」に記載されている。実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地及び無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地又は無機塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。

【0093】

無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、スクロース、又はグリセロールなどの炭素源からなる。例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ １７９）、及びＤａｖｉｓ−Ｍｉｎｇｉｏｌｉ培地（Ｂ Ｄ Ｄａｖｉｓ ＆ Ｅ Ｓ Ｍｉｎｇｉｏｌｉ （１９５０） Ｊ． Ｂａｃｔ． ６０：１７−２８を参照）を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム、及び鉄、銅、マンガン及び亜鉛の塩化カルシウム、ホウ酸塩及び硫酸塩などの微量金属の中から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸又は酵母抽出物など有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、気体のアンモニアの中から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコース又はグリセロールを含み得る。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン又は他の成分で補われ得、もっとも、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。培地は、当該技術分野において記載されている方法（例えば、上記で引用され、引用によって本明細書中に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号）によって調製し得る。本発明の方法において有用な培養手順及び無機塩培地の詳細は、「Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ， Ｄ ｅｔ ａｌ．， １９９１， 「Ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｔ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ」 Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０ （１）：１７−２７」に記載されている。

【0094】

＜発酵の規模＞
大量のタンパク質を処理するためにスケールアップすることができるので、本発明の精製方法は特に有用である。ｒＣＳＰのスケールアップした生成は、典型的にｒＣＳＰ凝集体をもたらす。本発明の方法は大規模処理と適合し、出発物質が大量のｒＣＳＰを含む場合に使用することが意図されている。また、本発明の精製方法は、任意のより小さな規模で生成された細菌細胞溶解物からタンパク質を得る際に使用することが意図されている。したがって、例えば、マイクロリットル規模、ミリリットル規模、センチリットル規模、及びデシリットル規模の発酵容量が使用され得る。実施形態において、１リットルの規模及びそれより大きな発酵容量が使用され得る。実施形態において、発酵容量は約１リットル、又はそれ以上である。特定の実施形態において、発酵容量は、少なくとも約２リットル、少なくとも約３リットル、少なくとも約４リットル、少なくとも約５リットル、少なくとも約６リットル、少なくとも約７リットル、少なくとも約８リットル、少なくとも約９リットル、少なくとも約１０リットル、少なくとも約２０リットル、少なくとも約２５リットル、少なくとも約５０リットル、少なくとも約７５リットル、少なくとも約１００リットル、少なくとも約２００リットル、少なくとも約５００リットル、少なくとも約１，０００リットル、少なくとも約２，０００リットル、少なくとも約５，０００リットル、少なくとも約１０，０００リットル又は少なくとも約５０，０００リットルである。実施形態において、発酵容量は、約１リットル乃至約５リットル、約１リットル乃至約１０リットル、約１リットル乃至約２０リットル、約１リットル乃至約２５リットル、約１リットル乃至約５０リットル、約１リットル乃至約７５リットル、約１０リットル乃至約２５リットル、約２５リットル乃至約５０リットル、又は約５０リットル乃至約１００リットルである。

【0095】

＜ハイスループットスクリーン＞
幾つかの実施形態において、ｒＣＳＰを発現するための最適条件を決定するためにハイスループットスクリーンを実施することができる。スクリーンの条件は多様であり、例えば宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景（例えば異なるプロテアーゼ遺伝子の欠失又はフォールディングモジュレーターの過剰発現）、発現コンストラクトにおけるプロモーターの種類、組換えタンパク質をコードする配列と融合した分泌リーダーの種類、増殖温度、誘導性プロモーターを使用した場合の誘導時のＯＤ、使用する誘導剤の濃度（例えばｌａｃＺプロモーターが使用する場合のＩＰＴＧ）、タンパク質誘発の持続時間、培地への誘導剤の追加後の増殖温度、培地の撹拌速度、プラスミド維持のための選択方法、容器における培地の体積等がある。

【0096】

株を異種のタンパク質の発現での改善された収量および／または品質と同定するために微生物の宿主を遮る方法は、米国の軽く叩くことに、例えば述べられている。承認済みのパブ。バッファーの追加をセンサーで検知し、カセットを１２０秒のカウントダウンの間装置へ回収した。

【0097】

＜誘導＞
本明細書中の他の記載箇所で記載されているように、組換えインターフェロン遺伝子の発現を制御するために誘導性プロモーターが発現コンストラクトにおいて使用され得る。例えばｔａｃプロモーターのようなｌａｃプロモーターの誘導体又はファミリーメンバーの場合、エフェクター化合物が、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクシド」とも呼ばれる）のような非代謝性誘導物質のような誘導物質である。実施形態において、ｌａｃプロモーター誘導体は使用され、細胞密度が約８０−約１６０のＯＤ_５７５により識別されるレベルに達したとき、さらにインターフェロン発現は、約０．０１ｍＭ−約１．０ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えることにより誘導される。
実施形態において、非ｌａｃ型プロモーターが使用される場合、文献に記載されているように、他の誘導剤又はエフェクターを使用し得る。１つの実施形態において、プロモーターは構成的なプロモーターである。プロモーターを誘導する方法は、当該技術分野において記載されており、例えばともに引用によって本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第７，７５９，１０９「Ｈｉｇｈ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｏｎ」及び米国特許出願公開第２０１１／０２１７７８４号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ」に記載されている。

【0098】

特定の実施形態において、ｒＣＳＰはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおいて発現され、発現はｌａｃプロモーターによって制御される。これらの実施形態において、発酵培地は５７５ｎｍでの１００−１６０ＡＵ（吸光度単位）誘導細胞密度で、２７−３２℃の温度、ｐＨ ６．５−７．２、０．１−０．２ｍＭ ＩＰＴＧによって誘導された。

【0099】

＜タンパク質精製＞
本発明の方法において、組み換え熱帯熱マラリア原虫ＣＳＰの二量体が、ｒＣＳＰを発現する細胞から調製された細菌細胞溶解物から精製される。実施形態において、精製はＣＳＰ二量体を包含する可溶性画分及び不溶性画分を生成するための宿主細胞の残骸、タンパク質及び他の不純物からのＣＳＰ二量体の分離を含む。可溶性画分におけるＣＳＰ二量体は、宿主細胞タンパク質および他の望まれない不純物から分離される。宿主細胞残骸から分離、宿主細胞タンパク質から分離、例えばＮ−末端が短縮された種（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ ｃｌｉｐｐｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）、高分子量凝集体、二量体化種及び変性種を含む望まれないｒＣＳＰ種からの分離、及びその他の不純物からの分離は、使用する分離方法に依存して異なる又は同一の工程において行うことができる。ｒＣＳＰを精製する発明の方法に基づいて有用な分離法は、文献に記載されており、例えばともに引用によってその全体が本明細書中に組み込まれるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９９０） ｖｏｌｕｍｅ １８２． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．， Ｂｒｅｔｔ， Ｒ．， Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， Ｒ． Ｅ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｄ． Ｄ．， Ｓｅｉｄｍａｎ， Ｊ．Ｇ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ａ．， ａｎｄ Ｓｔｒｕｈｌ， Ｌ． １９９１． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １． Ｗｉｌｅｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。

【0100】

＜拡張可能なプロセス＞
ｒＣＳＰのスケールアップ生成は、典型的にタンパク質凝集が結果として生じる。本発明の精製工程は拡張可能で、例えば大量のｒＣＳＰを含む細胞培養物又は細胞溶解物のような出発物質から、高い総精製工程収率のｒＣＳＰを精製するのに使用できる。実施形態において、前記工程は約１００ｍｇから約３０００グラムのｒＣＳＰを含むｒＣＳＰの開始量又は開始充填量にまでスケールアップされる。実施形態において、ｒＣＳＰの開始量は、約１グラム−約３０００グラム、約１００グラム−約３０００グラム、約２５０グラム−約３０００グラム、約５００グラム−約３０００グラム、約７５０グラム−約３０００グラム、約１０００グラム−約３０００グラム、約１００グラム−約２０００グラム、約２５０グラム−約２０００グラム、約５００グラム−約２０００グラム、約７５０グラム−約２０００グラム、約１０００グラム−約２０００グラム、約１００グラム−約１０００グラム、約１５０グラム−約１０００グラム、約２００グラム−約１０００グラム、約２５０グラム−約１０００グラム、約３００グラム−約１０００グラム、約４００グラム−約１０００グラム、約５００グラム−約１０００グラム、または約７５０グラム−約１０００グラムを含む。実施形態において、本発明の方法は任意の上記ｒＣＳＰの開始量から、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％のｒＣＳＰ、約１０％−約７５％、約１０％−約７０％、約１０％−約６５％、約１０％−約６０％、約２０％−約７５％、約２０％−約７０％、約２０％−約６５％、約２５％−約７５％、約２５％−約７０％、約２５％−約６５％、約２５％−約６０％、約３０％−約７５％、約３０％−約７０％、約３０％−約６５％、または、約３０％−約６０％の総精製工程収率を得るために使用される。実施形態において、上記の精製工程収率は１０％以下の変性ｒＣＳＰ、１０％以下の分解ｒＣＳＰ及び／又は１０％二量体ｒＣＳＰを含む。実施形態において、上記の精製工程収率５％以下の変性ｒＣＳＰ、５％以下の分解ｒＣＳＰ及び／又は５％以下の二量体ｒＣＳＰを含む。

【0101】

＜選択的な還元条件＞
本発明の方法において、発明の方法で宿主細胞タンパク質から分離されたｒＣＳＰ二量体は、選択的な還元条件にさらされる。これらの選択的な還元条件は、他には損傷を与えずに特定のジスルフィド結合を選択的に還元する。ｒＣＳＰが選択的な還元条件にさらされる場合、ｒＣＳＰ二量体の分子間にあるジスルフィド結合は、２つの単量体に二量体を分離するために還元される。例えば、Ｃ末端領域における２つの分子間のジスルフィド結合に代表されるような構造はそのままである。したがって、選択的な還元条件は高い総工程収率（二量体利用による）に重要で、従来使用されていた方法と比較して複雑さ（再フォールディングする工程の欠如および単量体から二量体を分離する必要性による）を軽減する。この戦略のさらなる利点は、精製中に二量体として維持されたｒＣＳＰの大部分が、完全なＮ末端を有する状態で得られるということである。したがって、回収されるｒＣＳＰの質と量が著しく向上した。実施形態において、選択的な還元条件は穏やかな還元剤を含む。

【0102】

実施形態において、穏やかな還元剤は、ＤＴＴ、アセチルシステイン、グルタチオン、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩又は２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）、あるいは当該技術分野において知られている任意の他の適切な還元剤である。特定の実施形態において、穏やかな還元剤は最終濃度が約０．００１−約０．１ｍＭであるジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。実施形態において、穏やかな還元剤は最終濃度が約０．０３０ｍＭ−約０．０１０ｍＭ、約０．０２０ｍＭ−約０．０１０ｍＭ、約０．０２５ｍＭ−約０．０１０ｍＭ、約０．０２５ｍＭ−約０．０２０ｍＭ、約０．０３０ｍＭ−約０．０２０ｍＭ、又は約０．０３０ｍＭ−約０．０２５ｍＭであるＤＴＴを含む。実施形態において、ＤＴＴの濃度は約２０μＭである。実施形態において、穏やかな還元剤は、最終濃度が約５ｍＭ−約０．５ｍＭであるモノチオグリセロール（ＭＴＧ）である。実施形態において、穏やかな還元剤は最終濃度が、約０．５ｍＭ−約４ｍＭ，約０．５ｍＭ−約３ｍＭ，約０．５ｍＭ−約２ｍＭ，約０．５ｍＭ−約１ｍＭ，約０．６ｍＭ−約２ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１．５ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１．４ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１．３ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１．２ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１．１ｍＭ、約０．６ｍＭ−約１．０５ｍＭ，約０．６ｍＭ−約１ｍＭ，約０．７ｍＭ−約２ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．５ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．４ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．３ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．２ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．１ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１．０５ｍＭ，約０．７ｍＭ−約１ｍＭ，約０．８ｍＭ−約２ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．５ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．４ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．３ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．２ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．１ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１．０５ｍＭ，約０．８ｍＭ−約１ｍＭ，約０．９ｍＭ−約２ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．５ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．４ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．３ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．２ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．１ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１．０５ｍＭ，約０．９ｍＭ−約１ｍＭ，約１ｍＭ−約１．５ｍＭ，約１ｍＭ−約１．４ｍＭ，約１ｍＭ−約１．３ｍＭ，約１ｍＭ−約１．２ｍＭ，約１ｍＭ−約１．１ｍＭ，約０．５ｍＭ，約０．６ｍＭ，約０．７ｍＭ，約０．８ｍＭ，約０．９ｍＭ，約１．０ｍＭ，約１．１ｍＭ，約１．２ｍＭ，約１．３ｍＭ，約１．４ｍＭ，約１．５ｍＭ，約１．６ｍＭ，約１．７ｍＭ，約１．８ｍＭ，約１．９ｍＭ，約２．０ｍＭ，約３．０ｍＭ，約４．０ｍＭ，又は約５．０ｍＭであるＭＴＧ又はシステインを含む。実施形態において、穏やかな還元剤は約１ｍＭの最終濃度でＭＴＧまたはシステインを含む。

【0103】

実施形態において、穏やかな還元剤および脱凝集剤は、バッファー（例えばＰＢＳ，トリス又はＨＥＰＥＳ）中の精製された二量体化ＣＳＰ又は凝集されたＣＤＰに加えられ、室温（約２１℃）で撹拌された。実施形態において、脱凝集剤はアルギニン、グアニジンＨＣｌ、洗剤または任意の他の既知の脱凝集剤である。実施形態において、穏やかな還元剤はＭＴＧであり、脱凝集剤は尿素である。実施形態において、選択的な還元条件はバッファー中のＭＴＧおよび尿素を含む。実施形態において、バッファーはＨｅｐｅｓ、ＰＢＳ、トリスまたは他の適切なバッファーである。実施形態において、選択的な還元条件はＨｅｐｅｓ中の１．０ｍＭ ＭＴＧおよび２Ｍ尿素を含む。実施形態において、本明細書中の他の箇所に記載されているように、脱凝集剤は、精製工程の初期に（例えば細胞破壊前に）加えられる。これらの実施形態において、脱凝集剤は、ｒＣＳＰ二量体の選択的な還元を開始するために穏やかな還元剤が加えられた時、十分な濃度ですでに存在する。例えば、脱凝集剤は、約０．５Ｍ−約４Ｍの濃度で存在する尿素である。実施形態において、尿素の濃度は約２．５Ｍ、約３Ｍ、約１−約２Ｍ、約１−約２．５Ｍ、約１−約３Ｍ、約１．５−約２Ｍ、約１．５−約２．５Ｍ、約１．５−約３Ｍ、約２−約２．５Ｍ、約２−約３Ｍ、又は約２．５Ｍ−約３Ｍである。

【0104】

実施形態において、混合は約２１℃で約８−約４８時間実行される。実施形態において、混合は約１２−約２４時間又は約１６−約１８時間の間実行される。混合は、例えばマグネティックスターラーバー及び撹拌プレート、ロッキングプラットフォーム、オーバーヘッドミキサーを用いた迅速な撹拌、又はぜん動ポンプを使用して二量体ＣＳＰ及び還元剤を再循環させるバッグにおいて、行うことができる。実施形態において、選択的な還元条件は、約１ｍＬ−約２５Ｌの全容量中で使用される。実施形態において、容量は約１００ｍＬ−約１Ｌである。実施形態において、選択的な還元条件は約２００−６００ｍＬの容量において使用される。

【0105】

特定の実施形態において、選択的な還元条件はブチル６５０Ｓクロマトグラフィーで精製された二量体ｒＣＳＰを用いて使用される。他の実施形態において、選択的な還元条件は、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから溶出されたｒＣＳＰ二量体画分に対して使用される。

【0106】

＜細菌細胞溶解物＞
細菌細胞溶解物の調製物は、組み換えタンパク質を発現する細菌細胞を、物理的又は機械的な細胞破砕方法及び非機械的細胞破砕方法を含む任意の適切な既知の細胞破砕方法によって破壊することによって得られる。破砕方法は破砕プロセスの程度、必要とされる機器及び／又は試薬、及び使いやすさに違いがある。細胞破砕方法は、例えば特定の細胞を破砕することの困難さ及び加工される材料の量に基づいて選択される。細菌細胞を破砕する好ましい方法は、変性しておらず分解されていない組み換えタンパク質を得るための下流精製工程で使用できる細菌細胞溶解物を生成する方法である。

【0107】

＜破砕のために提供される細胞培養物＞
本発明の実施形態において、組換えタンパク質を発現する培養物から細菌細胞は、例えば、全体の細胞培養液、細胞懸濁液、細胞スラリー、または細胞ペーストとして破砕に提供される。実施形態において、細胞は、ＣＳＰ凝集体形成を防ぐのに十分な脱凝集剤を含む溶液の中に存在する。これらの実施形態において、ＣＳＰは変性しておらず、よってＣＳＰのＣ−末端領域ジスルフィド結合は完全な状態である。実施形態において、細菌細胞は細胞：培地又は細胞：希釈液の体積を調節するために希釈される。

【0108】

実施形態において、細菌宿主細胞の培養物が、本発明の方法に基づく破砕のための細胞ペーストを作るために使用される。細胞ペーストは、当該技術分野において既知の、及び文献に記載された方法に基づいて培養物から調製することができる。例えば、細胞ペーストは、遠心分離によって発酵培養液全体から集菌し、結果として生じた細胞ペレット及び細胞のない培養液を分離することによって作製できる。実施形態において、発酵物を集菌するために、発酵培養液全体は１０，０００ｇ×ｇで９分間遠心分離することで集菌される。細胞ペーストは−７０から−８０℃で凍結されてもよい。実施形態において、細胞ペーストは破砕の前に、ＣＳＰを変性させることなくＣＳＰ凝集を防ぐのに十分な脱凝集剤の濃度を備えた溶液中で再構成される。変性していないＣＳＰにおいて、Ｃ末端領域ジスルフィド結合は完全な状態である。いくつかの実施形態において、脱凝集剤は尿素である。実施形態において、脱凝集剤は、例えばアルギニン、グアニジンＨＣｌ、洗剤又は当該技術分野において既知の他の適切な脱凝集剤である。実施形態において、脱凝集剤は、米国薬局方で公表されているような米国薬局方協会（メリーランド州ロックビル）の基準−国民医薬品集（ＵＳＰ−ＮＦ）、又は例えば国際薬局方（世界保健機関）で公表されているような米国以外の国の同様の基準を満たす成分である。特定の実施形態において、脱凝集剤は２Ｍ尿素である。実施形態において、脱凝集剤は最終濃度が約０．５Ｍ−約４Ｍである尿素を含む。実施形態において、尿素の濃度は約２．５Ｍで、約３Ｍ、約１−約２Ｍ、約１−約２．５Ｍ、約１−約３Ｍ、約１．５−約２Ｍ、約１．５−約２．５Ｍ、約１．５−約３Ｍ、約２−約２．５Ｍ、約２−約３Ｍ又は約２．５−約３Ｍである。特定の実施形態において、２Ｍ尿素および２０ｍＭトリスの溶液、ｐＨ８．１±０．２が細胞ペーストの再構成に使用される。実施形態において、細胞ペーストは２０％の固体（ｗ／ｖ）に再構成される。実施形態において、細胞ペーストは２０％未満の固体（ｗ／ｖ）に再構成される。本発明のプロセスの全体にわたる脱凝集剤の使用が意図されている。

【0109】

本明細書中の実施例において記載されているように、細胞ペースト及び脱凝集剤バッファー溶液は、全ての細胞が融解されて溶液が均一になるまで溶液がボルテックスされないように、例えばステンレス鋼インペラ（Ｂａｒｎａｎｔ Ｍｉｘｅｒ Ｓｅｒｉｅｓ ２０， Ｂａｒｎａｎｔ Ｃｏ．， Ｂａｒｒｉｎｇｔｏｎ， ＩＬ 又はＬａｂＭａｓｔｅｒ， ０−１８００ ｒｐｍ， Ｌｉｇｈｔｎｉｎ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ ）で撹拌され得る。細胞破砕の所望の方法のための細胞を調製するのに適した再構成の条件を同定するのは、当業者の技能の範囲内である。マイクロフルダイザーを用いて細胞が機械的に破砕される実施形態において、粒径はマイクロフルダイザーのチャネルが目詰まりする可能性を防ぐためのものである。

【0110】

実施形態において、ＣＳＰを発現する細菌宿主細胞の培養物は細胞培養液全体として存在する。実施形態において、培養液は２０％（ｖ／ｖ）混合物を作製するために希釈される。実施形態において、希釈バッファーは脱凝集剤を含む。特定の実施形態において、脱凝集剤を含む希釈バッファーは３．１Ｍ尿素、３１ｍＭトリス、ｐＨ８．１±０．２であり、２０％（ｖ／ｖ）細胞の２Ｍ尿素および２０ｍＭトリスのものを作製するために加えられる。

【0111】

＜細胞破砕＞
細菌細胞溶解物の調製物は、当該技術分野において既知の任意の適切な方法を使用して、細胞を破砕させることにより作製することができる。方法の同定は、例えば処理の規模、再現性、破砕による組み換えタンパク質への潜在的なダメージ及び予定されている分離工程のための特定の溶解物の性質に基づいて当業者が行うことができる。当業者は、最小限の力で最も高品質のものを作製できる破砕方法を確立できる。タンパク質の品質の態様は、限定されないがタンパク質二量体化又はより高次の凝集、タンパク質分解あるいはタンパク質変性を含む。これらの態様は本明細書中に記載されていて当該技術分野において既知の方法によって評価することができる。下流の分離工程に必要な細胞溶解物の調製物の特徴は、特定の分離方法についての公表された文献中のガイダンスを使用して同定することができる。実施形態において、ディスクスタック遠心分離を含む方法（例えば本明細書中に記載されているような）では固体は多くて１０％である。実施形態において、個体は多くて１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％がある。分離工程において潜在的に重要なその他の溶解物の性質は、限定されないがバッファー組成、溶液の粘性、溶解物の温度（これらは遠心分離における分離に影響するため）を含む。

【0112】

培養物は破砕前にＯＤで標準化することができる。例えば、細胞はＯＤ_６００において約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、又は約２０に標準化できる。

【0113】

細胞を破砕する方法は、物理的な破砕（例えば機械的な細胞溶解、液体の均質化、超音波処理、凍結／融解および手動のすりつぶし）および透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（例えば化学的破砕、浸透圧ショックによる破砕、酵素的破砕および熱破砕）を含む。本発明の方法に有用な細菌細胞溶解物は、可溶性画分を放出するために細胞を破砕する任意の適切な方法を使用することにより作製することができ、そのような方法は引用によってその全体が本明細書中に組み込まれているＧｒａｂｓｋｉ， Ａ．Ｃ．， ２００９， 「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ４６３：２８５−３０３、Ｈｏｐｋｉｎｓ， Ｔ．Ｒ．， １９９１， 「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」 Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ５７−８３及びＨａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｔ．， １９９１， 「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ： ａ ｋｅｙ ｕｎｉｔ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｓ」 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ９ （２）： ２１７−２４０に記載されている。利用可能な方法の長所と短所を知り、細胞及び精製の規模に基づいて適切な方法を選択することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、激しい機械的な処理は細胞溶解物の粘性を減少させるが、熱または酸化によって不安定なタンパク質の不活性化を結果的にもたらす一方、機械的でない処理（例えば細胞透過処理）は細胞から標的タンパク質が放出されないことがあり、粘着性の細胞溶解物を生産することができる。組み換えタンパク質を発現するために使用する細胞型に依存して、細胞抽出物は様々な量で核酸、リボソームの材料、脂質、分散した細胞壁多糖類、炭水化物、キチン、小分子及び望まれないタンパク質（例えば宿主タンパク質）を含みうる。組み換えタンパク質が不活性化又は分解されることなく、下流の精製工程において効果的に取り扱える細菌細胞溶解物の作製は重要である。

【0114】

機械的な細胞破砕方法は、例えば混合機又はミキサー、ビーズミル及びビーズビートの使用を含む。液体の均質化方法は、微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）及び例えばＣｏｎｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ， Ｎｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ， ＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ， Ｄｏｕｎｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ， Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ又はフレンチプレスを使用した均質化を含む。他の物理的な破壊手順は超音波処理、凍結／融解および手動のすりつぶしを含む。物理的な破砕に役立つ機器は市販で入手可能である。

【0115】

特定の実施形態において、細胞は、例えば本明細書中の実施例に記載されている方法に基づいて、当該技術分野において知られているように及び文献に公表されているように、マイクロフルダイザーを使用して機械的に破砕される。これらの実施形態において、細胞を破砕するために、１０，０００±１，０００ｐｓｉで使用されるＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍ−１１０Ｙマイクロフルダイザーを用いることができる。マイクロフルダイザーからの溶解物は、溶液を≦１２℃に冷却する管形熱交換器を通り、当該技術分野において知られている任意の方法に基づいて回収され得る。

【0116】

実施形態において、任意の適切なマイクロフルダイザーが使用される。実施形態において、少なくとも１つの薬剤は細胞破砕プロセスを促進するために加えられる。例えば、細胞は低張な緩衝剤中で懸濁することができる。例えば２００μｇ／ｍｌで加えられたリゾチームは、細菌細胞壁の多糖類成分を消化する。実施形態において、細胞は細胞壁の破砕を促進するためにガラスビーズで処理される。実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は、精製工程の間いつでも加えられる。特定の実施形態において、プロテアーゼ阻害剤は溶解の前に、またはその溶解中に加えられる。

【0117】

＜浸透圧ショックによるペリプラズム放出＞
実施形態において、ｒＣＳＰは本明細書中に記載されているようにペリプラズムリーダーを使用してペリプラズムに方向づけられ、細菌細胞溶解物は細胞壁を透過処理することにより生成される。例えば、実施形態において、細胞壁溶菌酵素およびＥＤＴＡのような化学的および／または酵素的細胞溶解剤は使用することができる。凍結された培養物または以前に保存されていた培養物の使用も、発明の方法において意図されている。細胞は、例えば、本明細書中の実施例に記載されているように、または当該技術分野において知られている及び文献中で報告されているような浸透圧ショックによって透過化することができる

【0118】

＜組み換えＣＳＰ二量体の精製＞
本発明の方法において、細菌細胞溶解物の調製物におけるｒＣＳＰ二量体は、宿主細胞残骸および宿主細胞タンパク質を含む不純物から分離される。実施形態において、精製は、細胞残屑および宿主細胞タンパク質からｒＣＳＰを連続して分離するために行なわれる。例えば、溶解産物は、最初に可溶性及び不溶性画分に分離することができ、次に可溶性画分中に存在するｒＣＳＰ二量体は宿主細胞タンパク質および他の不純物から分離することができる。他の実施形態において、ｒＣＳＰ二量体は同じ工程または一連の工程で細胞残骸および宿主細胞タンパク質から分離される。実施形態において、溶解物が細胞残骸と宿主細胞タンパク質の両方を分離するクロマトグラフ担体ベッドを通る拡張床クロマトグラフィー（Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｂｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）が使用される。さらなる精製工程は、残りの汚染物質を除去するために拡張床クロマトグラフィーの次に行われ得る。

【0119】

＜細菌細胞溶解物の調製物の可溶性及び不溶性画分への分離＞
本発明の精製方法において、組換えタンパク質を含む細菌細胞溶解物の調製物は、可溶性および不溶性画分に分離される。このプロセスは、組換え型タンパク質を包含している可溶性画分を浄化するために残骸を除去する。実施形態において、可溶性及び不溶性画分へ分離される細菌細胞溶解物の調製物は、溶解されたばかりの細胞を含む。他の実施形態において、細菌細胞溶解物の調製物は、可溶性および不溶性画分へ分離される前に１つ以上の操作または処理にさらされる。これらの操作あるいは処理前の浄化は、その後の操作を促進するか、あるいは希望通りに組換え型タンパク質の回収率又は品質を向上させるための処理を含み得る。例えば、細菌細胞溶解物の調製物は希釈、又は例えば少なくとも１つの試薬（例えば凝集剤または凝固剤）で処理することができる。硫酸アンモニウムとＰＥＧを含む凝集剤は、細菌細胞溶解物の調製物の不溶性画分の沈澱反応を増強し、その結果可溶性画分からの不溶性画分の分離を促進する。実施形態において、例えばＤＮａｓｅ（２５−５０μｇ／ｍｌ）及び／又はＲＮａｓｅ（５０μｇ／ｍｌ）のようなヌクレアーゼは、粘性を減少させるために細菌細胞溶解物の調製物に加えられる。

【0120】

細菌細胞溶解物を可溶性タンパク質を含む可溶性画分、及び細胞残骸を含む不溶性画分に分離する方法は、当該技術分野においてよく知られている。当業者によって適切と判断された、液体及び固体を分離するための任意の方法及びその方法の組み合わせは、本発明の方法と関連して使用されることが意図される。有用な方法は限定されないが、遠心分離、ろ過、沈澱および他の浄化方法並びにそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態において、遠心分離は組換え型タンパク質からより大きな細胞残屑粒子を分離するために実行され、その後より小さな残骸粒子を分離するためのろ過方法が実行される。特定の実施形態において、精密ろ過は、遠心分離または他の方法を使用しない状態で行なわれる。

【0121】

＜分離方法−可溶性及び不溶性画分＞
＜遠心分離＞
１つ以上の遠心分離方法は、細菌細胞溶解物を可溶性（液体）および不溶性（固体）画分に分離するために使用することができる。細菌細胞溶解物を可溶性と不溶性画分に分離するのに役立つ遠心分離方法は、例えば固定角遠心分離、ディスクスタック遠心分離、管状ボウル遠心分離、床遠心分離機（ｆｌｏｏｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を使用するバッチ遠心分離を含む。

【0122】

遠心分離は任意の適切な機器および方法を使用して行なうことができる。不溶性画分から可溶性画分を分離する目的のための細胞培養液または溶解物の遠心分離は、当該技術分野において周知で、Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒが編集し、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９１が書いたＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９９０）のような文献に幅広く記載されている。例えば、溶解した細胞は２０，８００×ｇで２０分間（４℃で）遠心分離し、手動又は自動の液体取扱装置を使用して上清を取り除いてもよい。ペレット（不溶性）画分は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４のような緩衝液中で再懸濁されてもよい。再懸濁は、例えばオーバーヘッドミキサー、マグネティックスターラ―バー、ロッキングシェーカーなどに接続されたインペラのような機器を使用して行うことができる。

【0123】

本発明の実施形態において、細菌細胞溶解物は、一連の手順（例えば１つ以上の追加の遠心分離手順または１つ以上のろ過が後に続く遠心分離あるいは沈澱手順）を使用して、可溶性と不溶性画分へ分離される。手順はそれぞれさらに可溶性画分を浄化する。

【0124】

実施形態において、分離は本明細書中に記載されているようにディスクスタック遠心分離を使用して行なわれる。ディスクスタック遠心分離において、ディスクスタック遠心分離機は連続工程で固体および１つまたは２つの液相に互いに分離させる。より密度の高い固体は遠心力により強制的に押し出される一方、より密度の低い液相は内部に同心円層を形成する。液相が最大の分離効率に到達したところで、特別のプレートが挿入される。固体は、手動で、断続的にまたは連続的に除去することができる。浄化された液体は、ボウルの上の出口領域でオーバーフローする。異なる液相は、チャンバーを分離するために方向づけられ、相互汚染を防ぐために互いから密封することができる。ディスクスタック遠心分離機は最小の密度差を備えた相を分離するために使用することができる。

【0125】

本発明の実施形態において、ディスクスタック遠心分離は細菌細胞溶解物を可溶性及び不溶性画分に分離するために使用され、２０パーセント（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）溶解物はＳｕｐｅｒ Ｑ精製水又は２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０で１：１になるように希釈され、ぜん動ポンプ又はステンレス鋼インペラで再循環させることで完全に混合し、均一な１０％（ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）溶解物が作製される。例えば、ＳＣ−６遠心分離機（ＧＥＡ Ｗｅｓｔｆａｌｉａ、Ｏｌｅｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のようなディスクスタック遠心分離機は１５，０００×ｇで使用される。ぜん動ポンプおよび白金で硬化させた（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｃｕｒｅｄ）シリコーン管類を使用して、１０％および２０％の溶解物は、１５−２２℃の温度で０．３−１．０ｌ／ｍｉｎの流量の遠心分離機に供給される。遠心分離液の背圧は７５−８５ｐｓｉｇで維持される。遠心分離液は、１２−３０℃で熱交換とともに及び熱交換なしでＳＣ−６を出ることが可能であり、ポリプロピレン管またはＦｌｅｘｂｏｙ（登録商標）バッグへ回収してもよい。不溶性画分／粒子は、決められた間隔で断続的に放出され、サイクルは繰り返される。リアルタイムのインライン濁度は、ＡＦ１６ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｎｎｅｌ ｎｅａｒ ｉｎｆｒａｒｅｄ （ＮＩＲ） ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍｅｔｅｒ（Ｏｐｔｅｋ−Ｄａｎｕｌａｔ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＷＩ）を介して遠心分離液上でまとめてもよく、観測した範囲のパーセント濃度単位（ＣＵ）として記録される。遠心分離液の瞬間的な及び大量のサンプルはＨａｃｈ ２１００ｐ（Ｌｏｖｅｌａｎｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を備えた比濁計濁度単位（ＮＴＵ）測定から得ることができる。濁度減少（１−ＮＴＵ遠心分離液／ＮＴＵ供給（ｆｅｅｄ））は、遠心分離機の性能を評価するのに有用で、＞９０％減少はさらなる最適化を始めるための良好なレベルである。

【0126】

＜深層ろ過＞
実施形態において、細菌細胞溶解物の調製物は浄化される、又は深層ろ過を使用した遠心分離の後さらに浄化される。実施形態において、可溶性と不溶性画分の分離は、深層ろ過が後に続くディスクスタック遠心分離によって行われる。深層ろ過が使用される実施形態において、０．２μｍまでの粒子は深層不フィルターおよび無菌フィルターの組み合わせを使用して除去される。特定の実施形態において、深層フィルターとメンブレンフィルターは上清と遠心分離液をろ過する際のこれらの適応性が評価される。
実施形態において、上清および遠心分離液（例えば１０％細胞ペースト又は細胞培養液全体の溶解物）は、１８−２８℃で５０−１００ＬＭＨのデプス・フィルターにポンプで通される。実施形態において、遠心分離方法（例えばディスクスタック遠心分離）を使用して分離された細菌細胞溶解物の調製物の可溶性画分は、Ｖ_ｍａｘ値を確立するために１０ｐｓｉｇでメンブレンフィルターにポンプで通される。

【0127】

細菌細胞溶解物の調製物を深層ろ過を使用して可溶性と不溶性画分へ分離する本発明の方法に有用な深層フィルターの限定しない例は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ０ＨＣ、Ａ１ＨＣ、Ｂ１ＨＣおよびＸ０ＨＣ深層フィルターＣＵＮＯ ６０ＺＡおよびＣＵＮＯ ９０ＺＡである。フィルターは、例えば＜２０Ｌ／ｍ^２供給充填での圧力の限界又は濁度減少に基づいて評価され得る。実施形態において、本発明の方法に従って深層ろ過するのに有用な深層フィルターには、小さな孔および高い電荷密度を有するマトリックスがあり、しばしば詰まって圧力障害をもたらす０．１μｍ基準膜がない。実施形態において、使用したフィルターは、≦３０ｐｓｉの圧力低下および／または４０Ｌ／ｍ^２の供給充填への濁度減少を示す。実施形態において、発明の方法に従って深層ろ過を実行するのに使用される深層フィルターは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｘ０ＨＣフィルターである。

【0128】

＜精密ろ過＞
精密ろ過（ＭＦ）は、１つの単位操作で固体を除去し、クロマトグラフィーに直接使用することができる供給流を提供する、１つの単位操作になっている拡張可能なプロセスである。実施形態において、可溶性と不溶性画分の分離は、事前の遠心分離のない精密ろ過を使用して行われる。実施形態において、精密ろ過はミクロンからサブミクロン範囲の孔を備えた薄膜を使用するタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）を含む。実施形態において、孔は０．２２から０．４５μｍである。理想的には、細胞残骸のような薄膜の孔径より小さな粒子は保持（残余物）する一方、孔径よりも小さいものは他の溶質及び溶媒とともに薄膜を通って拡散する（透過物）。ｒＣＳＰの回収については、残余物中に細胞残骸を保持し、濃縮およびバッファー交換を通じて透過物中のｒＣＳＰを集めることが必要となる。

【0129】

５−２０％（ｗ／ｖ）固体の細菌細胞溶解物の調製物は、タンジェンシャルフローフィルトレーションを介して４０％（ｗ／ｖ）固体に濃縮され、２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス／２０ｍＭ ＭＥＳ／２０ ｍＭ ビストリス ｐＨ ６−８で１から３ＤＶ（透析容量）へ透析ろ過してもよい。

【0130】

＜凍結融解プロセス＞
実施形態において、溶解物はさらなる処理工程（例えば宿主細胞タンパク質を除去する工程）の前に凍結融解される。体積に依存して溶解物は、より効率的な凍結のための一定分量に分けることができる。実施形態において、溶解物の分量はそれぞれ約１９時間以下で１００％固体になる。実施形態において、溶解物の分量はそれぞれ約１８時間以下、約１８．１時間以下、約１８．２時間以下、約１８．３時間以下、約１８．４時間以下、約１８．５時間以下、約１８．６時間以下、約１８．７時間以下、約１８．８時間以下または約１８．９時間以下で１００％固体になる。実施形態において、溶解物の分量はそれぞれ約７時間以下、約６．９時間以下、約６．８時間以下、約６．７時間以下、約６．６時間以下、約６．５時間以下、約６．４時間以下、約６．３時間以下、約６．２時間以下、約６．１時間以下または約６時間以下で少なくとも約６５％固体になる。実施形態において、溶解物の分量はそれぞれ約５時間以下、約４．９時間以下、約４．８時間以下、約４．７時間以下、約４．６時間以下、約４．５時間以下、約４．４時間以下、約４．３時間以下、約４．２時間以下、約４．１時間以下または約４時間以下で少なくとも約２５％固体になる。実施形態において、溶解物の分量は約１Ｌから約２Ｌである。実施形態において、溶解物は１Ｌまたは２ＬのＰＥＴＧボトルにおいて凍結される。

【0131】

実施形態において、溶解物が融解された後、凍結融解プロセスは室温保持を含む。実施形態において、溶解物は、少なくとも約４から少なくとも約７時間、少なくとも約４．５から少なくとも約７時間、少なくとも約５から少なくとも約７時間、少なくとも約５．５から少なくとも約７時間、少なくとも約６から少なくとも約７時間、少なくとも約６．５から少なくとも約７時間、少なくとも約４から少なくとも約６時間、少なくとも約４．５から少なくとも約６時間、少なくとも約５から少なくとも約６時間、または少なくとも５．５から少なくとも約６時間、室温で保持される。実施形態において、溶解物は融解の後に約６時間室温で保持される。

【0132】

実施形態において、凍結融解プロセスは、溶解物中の高分子タンパク質種又は「ラダリング」の存在を著しく減少させる。ラダリングの存在は、その後のクロマトグラフィー工程における低いｒＣＳＰ収量を予想させる。

【0133】

実施形態において、例えばＴＭＡＥクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程を成功裏に完了することができるレベルにまで沈殿を減少させる処理によって、凍結融解プロセス後及びさらなる処理工程前に沈澱レベルは減少した。例えば、沈澱レベルは正常なクロマトグラフィーが可能となるよう十分に低くなければならない。実施形態において、沈澱反応を許容可能なレベルにするために使用される方法は、沈殿を減少させる処理をしない使用と比較した時のＮ−末端切断の増加を結果として生じない。実施形態において、溶解物の沈殿レベルは、融解後又は融解後室温で保持した後の薄膜ろ過で減少した。実施形態において、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ（０．４５μｍ／０．２μｍ）薄膜フィルターは、溶解物の薄膜ろ過に使用される。実施形態において、そのようなろ過手順は精製プロセス間の任意の工程で行なわれる。実施形態において、ｒＣＳＰは、最後のカラムの後及びバッファー交換工程前に薄膜ろ過を受ける。

【0134】

＜可溶性画分中の宿主タンパク質からのｒＣＳＰの分離＞
宿主細胞タンパク質から組換え型タンパク質を分離する方法、及び組み換えタンパク質の性質に基づいて選択された１つ以上の分離方法の使用は、当該技術分野において知られており、例えばＭ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒによって編集されたＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９９０）のような文献に詳細に記載されている。分離方法は、組換えタンパク質および汚染物質の特性（例えば大きさ、電荷、結合特性、溶解度）の差に基づいて選択することができる。これらのパラメーターに基づいたプロトコルは、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーを含み得る。実施形態において、分離方法は組換え型タンパク質を濃縮するのに有用である。

【0135】

典型的な分離法は本明細書中に記載されているが、実施形態において、ｒＣＳＰを宿主細胞タンパク質、望まれないｒＣＳＰ種又は他の不純物から分離するために及び／又は組み換えタンパク質を濃縮するのにふさわしい任意の既知の方法及びそれら方法の組み合わせが使用される。望ましい分離方法は、本明細書中に記載されているように、ｒＣＳＰ二量体の好ましい減少に続いて、分解しておらず、変性していないＣＳＰ単量体の精製を結果としてもたらす。実施形態において、得られたｒＣＳＰ（単量体）は、宿主細胞タンパク質を含む残った不純物からさらに分離される。

【0136】

＜クロマトグラフィー＞
実施形態において、細菌細胞溶解物の調製物を分離することによって得られた可溶性画分に存在する宿主細胞タンパク質、望まれないｒＣＳＰ種又は他の不純物からｒＣＳＰ二量体を分離するのにクロマトグラフィーが使用される。実施形態において、二量体（単量体をつなぐ）中の分子内ジスルフィド結合が還元されることなく、さらにＣＳＰの分子内ジスルフィド結合を変性することなく凝集を防ぐために、低濃度の脱凝集剤がクロマトグラフィーの間存在する。実施形態において、低濃度の脱凝集剤は約２Ｍである。特定の実施形態において、細菌細胞溶解物の可溶性画分は、２０ｍＭトリス、ｐＨ ８．０および２Ｍ尿素の中に存在する。

【0137】

多くの種類のクロマトグラフィーが当該技術分野において知られており、例えばＭ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒによって編集されたＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （１９９０）のような文献に記載されている。

【0138】

実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーが使用される。イオン交換クロマトグラフィー（例えば陰イオン交換、陽イオン交換クロマトグラフィー）において、組換え型タンパク質は、例えばカラムのような基質上で、固定電荷に結合する。組換えタンパク質が固定される一方、固定されない汚染物質が除去される。組換えタンパク質は後で固定電荷から溶出される又は置き換えられる。本発明の方法を実施するのに有用な基質またはイオン交換剤は、当該技術分野において知られており、限定されないがセルロース、デキストラン、アガロースおよびポリスチレンを含む。イオン交換クロマトグラフィーに有用な任意の大きさのカラム、または他の適切な既知の系（例えばバッチイオン交換クロマトグラフィー）は、本発明の方法で使用されることが意図されている。実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは両方が使用される。

【0139】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、固定相と分離される成分の間の疎水的相互作用に基づく。ＨＩＣ法は疎水性の固定相および極性の移動相を含む。極性成分は移動相を好み、最初に溶出される。化合物の疎水性の性質が増加するにつれ、保持時間がより長くなる。一般に、移動相の極性が低いほど、その溶出剤の強度は高い。吸着と脱着は、液体の塩濃度をそれぞれ増加させること及び減少させることによって、あるいはｐＨを変えることでリガンド及び／又は吸着／脱着される物質の電荷を変えることによって支えられている。ＨＩＣ法は、例えば引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる国際公開第９６／００７３５号 「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｒｅｓｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｇｒｏｕｐｓ」、国際公開第９６／０９１１６号及び米国特許第５，６５２，３４８ 「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｒｅｓｉｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」のような文献に記載されている。疎水性相互作用分離方法は、例えば引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第８，１３８，３０６号「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ」に記載されているように、チオフィリック吸着剤に基づいていてもよい。米国特許第８，１３８，３０６号にもまた、四極子または双極モーメントを有する、荷電されていないリガンドを含む分離マトリックスの使用が記載されている。

【0140】

本発明の実施形態において、ｒＣＳＰ二量体または単量体のＨＩＣは、任意の適切な疎水基（例えばヘキシル、フェニル、オクチル、ブチル）を使用して行なわれる。疎水性の樹脂剤は市販で入手可能で、例えばＨｅｘｙｌ ６５０Ｃ （Ｔｏｓｏｈ ＵＳＡ）， Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ （ＧＥ， １７−５１９５−０１）， Ｂｕｔｙｌ ＨＰ （ＧＥ， ２８−４１１０−０１）， ＰＰＧ ６００Ｍ （Ｔｏｓｏｈ ＵＳＡ）及びＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ （Ｐａｌｌ）を含む。実施形態において、ＨＩＣは、穏やかな還元工程（選択的な還元条件の下での）を開始した後に実施される。実施形態において、ＨＩＣ精製工程は、宿主細胞タンパク質のレベルを、多くて５００ｐｐｍ、多くて４５０ｐｐｍ、多くて４００ｐｐｍ、多くて３５０ｐｐｍ、多くて３００ｐｐｍ、多くて２５０ｐｐｍ、多くて２００ｐｐｍ、多くて１５０ｐｐｍ、多くて１００ｐｐｍ、多くて５０ｐｐｍ、多くて４０ｐｐｍ、多くて３０ｐｐｍ、多くて２０ｐｐｍ、多くて１０ｐｐｍ、多くて５ｐｐｍ、あるいは検知できない値に成功裏に減少させる。実施形態において、ＥＬＩＳＡによって検知されるように、ＨＩＣ精製工程は、多くて５０ｐｐｍ、多くて４０ｐｐｍ、多くて３０ｐｐｍ、多くて２０ｐｐｍまたは多くて１０ｐｐｍに宿主細胞タンパク質のレベルを減少させる。実施形態において、ＨＩＣ精製工程後に観察されるｒＣＳＰのＮ−末端切断は、多くて５％、多くて４％、多くて３％、多くて２％、多くて１．５％、多くて１％、多くて０．５％あるいは検知可能でない。実施形態において、ＨＩＣ精製工程は、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、または、少なくとも９９．５％純度のｒＣＳＰを結果として生じる。実施形態において、ＨＩＣ精製工程は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ濃度を結果としてもたらす。実施形態において、ＨＩＣ精製工程は、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｍｌ−約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．１５ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．３５ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．４５ｍｇ／ｍｌ−約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ濃度を結果としてもたらす。特定の実施形態において、ＨＩＣ精製工程は、多くて５０ｐｐｍにまで宿主細胞タンパク質レベルを減らし、Ｎ末端切断は多くて１％である。

【0141】

実施形態において、ＨＩＣは、望まれないｒＣＳＰ種を分離するために、例えば完全長の種からＮ−末端切断種を分離するために使用される。実施形態において、除去される望まれない種は、例えば高分子量凝集体、二量体種及び変性種を含む。実施形態において、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定されるように、ＨＩＣは、総ｒＣＳＰ量を約５から約１５％にまで増加させる。実施形態において、前記増加は、約８％から約１２％、約９から約１１％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１％または少なくとも約１２％である。

【0142】

実施形態において、ＨＩＣは、Ｈｅｘａｌ６５０Ｃカラムを使用した勾配溶出または段階的溶出によって行われる。実施形態において、ＨＩＣは、ＭＴＧによる還元後、Ｈｅｘａｌ６５０Ｃカラムを使用した、０．５から０Ｍ又は１．０から０Ｍの硫酸アンモニウム勾配溶出によって行われる。

【0143】

クロマトグラフィー方法はまた、リガンドおよび分離される化合物の間のアフィニティに基づき得る。有用なアフィニティの例は、抗体−抗原アフィニティ、金属イオンアフィニティおよび受容体−リガンドアフィニティである。タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーによって、大きさに基づいて分離することができる。サイズ排除方法は、例えばゲルろ過を含む。

【0144】

混合モードクロマトグラフィー方法は、分離パラメーターの組み合わせに基づいてタンパク質を分離する。例えば、既知のイオン交換分離原理の２つ以上の組み合わせは、混合モードイオン交換体を意味する。例えば、混合モード陰イオン交換体が記載されている国際公開第９７／２９８２５号「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｃｈｒｏｍｏｔａｇｒａｐｈｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ， ａｎｄ Ｎｅｗ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ ＭＡｔｒｉｘ」を参照されたい。

【0145】

例えば米国特許第８，１３８，３０６号に記載されている高塩リガンド（ＨＳＬ）は、混合モード陽イオン交換リガンドとして機能し得、高い塩濃縮に耐えることができ、よってサンプルの実質的な希釈を必要としないので、タンパク質精製のような工業的用途において注目されている。

【0146】

本発明の実施形態において、混合モードクロマトグラフィーは、宿主細胞タンパク質からｒＣＳＰを分離するために使用される。具体的な実施形態において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが使用される。実施形態において、ＣＳＰのＮ末端切断の原因である宿主細胞プロテアーゼは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによってｒＣＳＰから分離される。実施形態において、ＴＭＡＥ充填がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて使用される。

【0147】

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、不溶性の水酸化されたリン酸カルシウム［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］を利用した、タンパク質を精製する方法であり、マトリックスとリガンドの両方を形成する。官能基は、陽電気を荷電したカルシウムイオン（Ｃ−部位）および陰電気を荷電したリン酸基（Ｐ部位）のクラスターの対からなる。ヒドロキシアパタイトとタンパク質の間の相互作用は複雑でマルチモードである。相互作用させる方法の１つにおいて、陰電気を荷電したＰ−部位を伴うタンパク質の陽電気を荷電したアミノ基及びタンパク質のカルボキシル基をＣ−部位に配位錯体化して相互作用させる。酸性および塩基性タンパク質は、通常異なる機構によってｃＨＡ樹脂と相互に作用する：酸性タンパク質は、通常カルボキシル基への配位結合によってＣ−部位へ結合する。その一方で塩基性タンパク質はアミン基で電荷相互作用することによってＰ部位に結合する。セラミックのヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーは、制限のある流量のような結晶のヒドロキシアパタイトに関連したいくつかの障害を克服する。セラミックのヒドロキシアパタイトは、高い耐久性、良好なタンパク質結合キャパシティーを有しており、結晶のハイドロキシアパタイトより高い流量および圧力で使用することができる。ｃＨＡを使用するクロマトグラフィーの分離は、方法、または組み合わせ流動によって、結合モード、素通りモード、又はその組み合わせである結合／素通りモードのようないくつかの別個のモードで行なうことができる。セラミックのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する方法は、例えば引用によってその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第８，０５８，４０７号「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｃｅｒａｍｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」に記載されている。

【0148】

＜バッファー交換＞
実施形態において、バッファー交換は優先的な還元処理の開始後に行われる。バッファー交換は、例えば望まれない還元試薬のような特定の望まれない試薬を除去することができる。実施形態において、バッファー交換は塩類、尿素、および／またはＤＴＴを除去する。ｒＣＳＰが容易に高分子量凝集体（例えば四量体、六量体およびオリゴマー）を形成することを不可能にするバッファー交換の任意の方法が、本発明の方法において有用である。実施形態において、バッファー交換は、例えばゲルろ過（脱塩）クロマトグラフィーのような透過方法、又はＵＦ／ＤＦ膜を用いたタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によって実行される。実施形態において、バッファー交換は、約５から約１０ｋＤａ ＭＷＣＯのＵＦ／ＤＦ薄膜を備えたＴＦＦを使用して実行される。実施形態において、ＵＦ／ＤＦ薄膜は、約５から約９ｋＤａ ＭＷＣＯ、約５から約８ｋＤａ ＭＷＣＯ、約５から約７ｋＤａ ＭＷＣＯ、又は約５から約６ｋＤａ ＭＷＣＯである。特定の実施形態において、バッファー交換は、約５ｋＤａ ＭＷＣＯのＵＦ／ＤＦ薄膜を備えたＴＦＦを使用して実行される。実施形態において、薄膜は生成物を導入する前に１×ＰＢＳで平衡化される。実施形態において、ｒＣＳＰは、ｒＣＳＰが安定するバッファーへ交換される。

【0149】

実施形態において、穏やかに還元された（単量体化された）ｒＣＳＰは、約２１℃から２３℃で、３２４ＬＭＨ（リットル／ｍ^２／時間）および７２０ＬＭＨで薄膜を通して再循環される。実施形態において、ｒＣＳＰの安定を維持する製剤バッファーを、薄膜を通して再循環させる。実施形態において、１×ＰＢＳ、１０％（ｗ／ｖ）アルギニン−ＨＣｌ（０．５Ｍアルギニン−ＨＣｌ）（例えばＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ部分番号２０６７から入手可能）、１ｍＭモノチオグリセロール（例えばＭＰ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ、カタログ番号１５５７２７、又はＲｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ、カタログ番号０１７８Ｍ）、ｐＨ ６．４は、室温（２１−２３℃）で、３２４ＬＭＨで薄膜を通して再循環させる。実施形態において、５ｋＤａ薄膜上にある間、２１−２４ｐｓｉのＴＭＰが残余物（透析された充填）に適用される。実施形態において、５ｋＤａ薄膜上にある間、１０−１５ｐｓｉ及び２１−２４ｐｓｉのＴＭＰが残余物に適用される。実施形態において、一定容量の透析が、例えば５−１０残余物容量（透析容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ））のような複数の容量のために行われる。実施形態において、例えば３−１０のようないくつかの透析容量後、残余物は２倍に濃縮され、さらに例えば３−１０のようないくつかの透析容量のために透析される。残余物は濃縮され、１．０ｍｇ／ｍＬまで希釈される。最終的に精製されたｒＣＳＰは、−８０℃で凍結して保存される。

【0150】

＜ｒＣＳＰの安定した液体製剤＞
最終的に精製されたｒＣＳＰは、ｒＣＳＰの安定した液体製剤を生成するために液体製剤バッファーへ透析され得る。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、ｒＣＳＰが高濃度で安定して維持されることを可能にする。実施形態において、液体製剤バッファー中のｒＣＳＰは、保存中にその物理的および化学安定性を保持する。ｒＣＳＰ液体製剤の安定は、与えられた温度で選択された時間の後に評価することができる。ｒＣＳＰ安定性の負の指示薬（又は不安定性の指示薬）は、例えばｒＣＳＰ単量体（総ｒＣＳＰの％）の量またはパーセントの減少、二量体の量またはパーセントの増加、凝集体の増加、分解産物の増加、変性の増加、活性であると決定されたｒＣＳＰのパーセントまたは画分の減少を含む。実施形態において、本明細書中に記載されているように、ｒＣＳＰ品質の指示薬は、安定が長期間にわたる品質の基準と考えることができるため、安定を示すために使用される。同様に、ｒＣＳＰ安定の指示薬はｒＣＳＰ品質を示すために使用することができる。実施形態において、安定した液体製剤中でのｒＣＳＰ安定は、例えば全タンパクの少なくとも約８０％から約１００％のｒＣＳＰ単量体の最小限の存在または維持によって示される。実施形態において、ｒＣＳＰ安定性は、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年のあいだ保存された場合、以下の割合のｒＣＳＰ単量体の存在又は維持によって示される：約８１％−約１００％、約８２％−約１００％、約８３％−約１００％、約８４％−約１００％、約８５％−約１００％、約８６％−約１００％、約８７％−約１００％、約８８％−約１００％、約８９％−約１００％、約９０％−約１００％、約９１％−約１００％、約９２％−約１００％、約９３％−約１００％、約９４％−約１００％、約９５％−約１００％、約９６％−約１００％、約９７％−約１００％、約９８％−約１００％、約９９％−約１００％、約８０％−約９９％、約８１％−約９９％、約８２％−約９９％、約８３％−約９９％、約８４％−約９９％、約８５％−約９９％、約８６％−約９９％、約８７％−約９９％、約８８％−約９９％、約８９％−約９９％、約９０％−約９９％、約９１％−約９９％、約９２％−約９９％、約９３％−約９９％、約９４％−約９９％、約９５％−約９９％、約９６％−約９９％、約９７％−約９９％、約９８％−約９９％、約８０％−約９８％、約８１％−約９８％、約８２％−約９８％、約８３％−約９８％、約８４％−約９８％、約８５％−約９８％、約８６％−約９８％、約８７％−約９８％、約８８％−約９８％、約８９％−約９８％、約９０％−約９８％、約９１％−約９８％、約９２％−約９８％、約９３％−約９８％、約９４％−約９８％、約９５％−約９８％、約９６％−約９８％、約９７％−約９８％、約８０％−約９７％、約８１％−約９７％、約８２％−約９７％、約８３％−約９７％、約８４％−約９７％、約８５％−約９７％、約８６％−約９７％、約８８％−約９７％、約８９％−約９７％、約８７％−約９７％、約９０％−約９７％、約９１％−約９７％、約９２％−約９７％、約９３％−約９７％、約９４％−約９７％、約９５％−約９７％、約９６％−約９７％、約８０％−約９６％、約８１％−約９６％、約８２％−約９６％、約８３％−約９６％、約８４％−約９６％、約８５％−約９６％、約８６％−約９６％、約８７％−約９６％、約８８％−約９６％、約８９％−約９６％、約９０％−約９６％、約９１％−約９６％、約９２％−約９６％、約９３％−約９６％、約９４％−約９６％、約９５％−約９６％、約８０％−約９５％、約８１％−約９５％、約８２％−約９５％、約８３％−約９５％、約８４％−約９５％、約８５％−約９５％、約８６％−約９５％、約８７％−約９５％、約８８％−約９５％、約８９％−約９５％、約９０％−約９５％、約９１％−約９５％、約９２％−約９５％、約９３％−約９４％、約９４％−約９５％、約８０％−約９５％、約８１％−約９４％、約８２％−約９４％、約８３％−約９４％、約８４％−約９４％、約８５％−約９４％、約８６％−約９４％、約８７％−約９４％、約８８％−約９４％、約８９％−約９４％、約９０％−約９４％、約９１％−約９４％、約９２％−約９４％、約９３％−約９４％、約８０％−約９３％、約８１％−約９３％、約８２％−約９３％、約８３％−約９３％、約８４％−約９３％、約８５％−約９３％、約８６％−約９３％、約８７％−約９３％、約８８％−約９３％、約８９％−約９３％、約９０％−約９３％、約９１％−約９３％、約９２％−約９３％、約８０％−約９２％、約８１％−約９２％、約８２％−約９２％、約８３％−約９２％、約８４％−約９２％、約８５％−約９２％、約８６％−約９２％、約８７％−約９２％、約８８％−約９２％、約８９％−約９２％、約９０％−約９２％、約９１％−約９２％、約８０％−約９１％、約８１％−約９１％、約８２％−約９１％、約８３％−約９１％、約８４％−約９１％、約８５％−約９１％、約８６％−約９１％、約８７％−約９１％、約８８％−約９１％、約８９％−約９１％、約９０％−約９１％、約８０％−約９０％、約８１％−約９０％、約８２％−約９０％、約８３％−約９０％、約８４％−約９０％、約８５％−約９０％、約８６％−約９０％、約８７％−約９０％、約８８％−約９０％、約８９％−約９０％、約８０％−約８９％、約８１％−約８９％、約８２％−約８９％、約８３％−約８９％、約８４％−約８９％、約８５％−約８９％、約８６％−約８９％、約８７％−約８９％、約８８％−約８９％、約８０％−約８８％、約８１％−約８８％、約８２％−約８８％、約８３％−約８８％、約８４％−約８８％、約８５％−約８８％、約８６％−約８８％、約８７％−約８８％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％。ｒＣＳＰ単量体の量は、本明細書中に記載されているような又は例えばＳＥ−ＨＰＬＣのような当該技術分野において既知の任意の適切な方法によって測定することができる。保存前のｒＣＳＰ単量体の量は比較に使用することができる。

【0151】

実施形態において、安定した液体製剤中でのｒＣＳＰ安定性は、約９日から一年にわたる保存における、例えば約１０％以下の減少のようなｒＣＳＰ単量体減少の最大の割合によって示される。実施形態において、安定した液体製剤中のｒＣＳＰ単量体の量は、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月又は少なくとも約１年の間保存した後の、多くて約０％ ０．５％ １％ １．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％減少する。特定の実施形態において、ｒＣＳＰ安定性は、約９日から約２５日保存された場合、約１％から約３％以下、または約１％から約５％以下のｒＣＳＰ単量体減少の最大の割合によって示される。特定の実施形態において、約９日から約２５日保存された場合、約１％以下のｒＣＳＰ単量体減少の最大の割合によって示される。

【0152】

実施形態において、安定した液体製剤中でのｒＣＳＰ安定性は、例えば最大の増加以下のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の量によって示される。実施形態において、安定した液体製剤中のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の量は、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または少なくとも約１年保存した場合、多くて約０％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する。特定の実施形態において、安定した液体製剤中のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の最大増加率は、少なくとも約２０日又は２５日保存した場合、約１％から約３％、又は約１％から約５％以下である。特定の実施形態において、安定した液体製剤中のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の最大増加率は、少なくとも約２０日又は２５日保存した場合、約１％以下である。特定の実施形態において、安定した液体製剤中のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の最大増加率は、少なくとも約２０日又は２５日保存した場合、約５％以下である。実施形態において、ｒＣＳＰ安定性は１０％未満のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の存在によって示される。実施形態において、ｒＣＳＰ安定性は全タンパク質又は得られた精製ＣＳＰ中のｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の存在が多くて１０％、多くて９％、多くて８％、多くて７％、多くて６％、多くて５％、多くて４％、多くて３％、多くて２％または多くて１％であることによって示される。ｒＣＳＰ二量体、凝集体種、変性種又は分解された種の量は、本明細書中に記載されている方法又は例えばＳＥ−ＨＰＬＣのような当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって決定することができる。保存前の量（例えばＴ＝０）は比較のために使用することができる。

【0153】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した維持は、検出される総ｒＣＳＰ量、対照と比較した時の総ｒＣＳＰ量の相対的な割合の違い、又は対照と比較した時のｒＣＳＰ純度の相対的な割合の違いによって示される。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した維持は、約７０％から約９５％の検出された総ｒＣＳＰ量、多くて約−５％から約５％の対照と比較した時の総ｒＣＳＰ量の相対的な割合の違い、又は多くて約−５％から約５％の対照と比較した時のｒＣＳＰ純度の相対的な割合の違いによって示される。実施形態において、対照と比較した時の総ｒＣＳＰ量の相対的な割合の違い又はｒＣＳＰ純度の相対的な割合の違いは約−５％−約５％、約−４％−約４％、約−３％−約３％、約−２％−約２％、約−２％−約１％、約−２％−約０．５％、約−２％−約０％又は約０％−約２％である。実施形態において、対照は０時点又は−８０℃で保存されたサンプルである。

【0154】

実施形態において、検出されたｒＣＳＰの総量は、約７０％−約９５％、約７０％−約９０％、約７０％−約８５％、約７０％−約８０％、約７５％−約９５％、約７５％−約９０％、約７５％−約８５％、約８０％−約９５％、約８０％−約９０％、約８５％−約９５％、約７２％−約９２％、約７０％、約１１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％である。

【0155】

実施形態において、ｒＣＳＰは、約４℃から約２５℃で安定した液体製剤中で安定して維持される。実施形態において、ｒＣＳＰは、約４℃から約２５℃、約４℃から約２４℃、約４℃から約２３℃、約４℃から約２２℃、約４℃から約２１℃、約４℃から約２０℃、約４℃から約１９℃、約４℃から約１８℃、約４℃から約１７℃、約４℃から約１６℃、約４℃から約１５℃、約４℃から約１４℃、約４℃から約１３℃、約４℃から約１２℃、約４℃から約１１℃、約４℃から約１０℃、約４℃から約９℃、約４℃から約８℃、約４℃から約７℃、約４℃から約６℃又は約４℃から約５℃で、安定した液体製剤中で維持される。特定の実施形態において、ｒＣＳＰは、約４℃で安定した液体製剤中で安定して維持される。

【0156】

実施形態において、ｒＣＳＰは、例えば少なくとも約１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの濃度のような高濃度で安定した液体製剤内で維持される。実施形態において、ｒＣＳＰは、少なくとも約１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約６ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌ少なくとも約３０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ、約２から約５０ｍｇ／ｍｌ、約３から約５０ｍｇ／ｍｌ、約４から約５０ｍｇ／ｍｌ、約５から約５０ｍｇ／ｍｌ、約１０から約５０ｍｇ／ｍｌ、約１５から約５０ｍｇ／ｍｌ、約２０から約５０ｍｇ／ｍｌ、約３０から約５０ｍｇ／ｍｌ、約４０から約５０ｍｇ／ｍｌ、約２から約４０ｍｇ／ｍｌ、約３から約４０ｍｇ／ｍｌ、約４から約４０ｍｇ／ｍｌ、約５から約４０ｍｇ／ｍｌ、約１０から約４０ｍｇ／ｍｌ、約１５から約４０ｍｇ／ｍｌ、約２０から約４０ｍｇ／ｍｌ、約３０から約４０ｍｇ／ｍｌ、約２から約３０ｍｇ／ｍｌ、約３から約３０ｍｇ／ｍｌ、約４から約３０ｍｇ／ｍｌ、約５から約３０ｍｇ／ｍｌ、約１０から約３０ｍｇ／ｍｌ、約１５から約３０ｍｇ／ｍｌ、約２０から約３０ｍｇ／ｍｌ、約２から約２０ｍｇ／ｍｌ、約３から約２０ｍｇ／ｍｌ、約４から約２０ｍｇ／ｍｌ、約５から約２０ｍｇ／ｍｌ、約１０から約２０ｍｇ／ｍｌ、約１５から約２０ｍｇ／ｍｌ、約２から約１５ｍｇ／ｍｌ、約３から約１５ｍｇ／ｍｌ、約４から約１５ｍｇ／ｍｌ、約５から約１５ｍｇ／ｍｌ、約１０から約１５ｍｇ／ｍｌ、約２から約１０ｍｇ／ｍｌ、約３から約１０ｍｇ／ｍｌ、約４から約１０ｍｇ／ｍｌ、約５から約１０ｍｇ／ｍｌ、約６から約１０ｍｇ／ｍｌ、約７から約１０ｍｇ／ｍｌ、約８から約１０ｍｇ／ｍｌ、約９から約１０ｍｇ／ｍｌ、約１から約９ｍｇ／ｍｌ、約２から約９ｍｇ／ｍｌ、約３から約９ｍｇ／ｍｌ、約４から約９ｍｇ／ｍｌ、約５から約９ｍｇ／ｍｌ、約６から約９ｍｇ／ｍｌ、約７から約９ｍｇ／ｍｌ、約８から約９ｍｇ／ｍｌ、約１から約８ｍｇ／ｍｌ、約２から約８ｍｇ／ｍｌ、約３から約８ｍｇ／ｍｌ、約４から約８ｍｇ／ｍｌ、約５から約８ｍｇ／ｍｌ、約６から約８ｍｇ／ｍｌ、約７から約８ｍｇ／ｍｌ、約１から約７ｍｇ／ｍｌ、約２から約７ｍｇ／ｍｌ、約３から約７ｍｇ／ｍｌ、約４から約７ｍｇ／ｍｌ、約５から約７ｍｇ／ｍｌ、約６から約７ｍｇ／ｍｌ、約１から約６ｍｇ／ｍｌ、約２から約６ｍｇ／ｍｌ、約３から約６ｍｇ／ｍｌ、約４から約６ｍｇ／ｍｌ、約５から約６ｍｇ／ｍｌ、約１から約５ｍｇ／ｍｌ、約２から約５ｍｇ／ｍｌ、約３から約５ｍｇ／ｍｌ、約４から約５ｍｇ／ｍｌ、約１から約４ｍｇ／ｍｌ、約２から約４ｍｇ／ｍｌ、約３から約４ｍｇ／ｍｌ、約１から約３ｍｇ／ｍｌ、約２から約４ｍｇ／ｍｌ又は約１から約２ｍｇ／ｍｌで安定した液体製剤内で維持される。

【0157】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、例えばＤＴＴ、システイン、アセチルシステイングルタチオン、モノチオグリセロール、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、又は２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）のような穏やかな還元剤あるいは当該技術分野において知られている任意の他の適切な還元剤を含む。実施形態において、穏やかな還元剤はＤＴＴ、ＭＴＧ、アセチルシステイン、グルタチオン、チオグリコレートまたはシステインである。実施形態において、穏やかな還元剤はＭＴＧ、システインまたはアセチルシステインである。実施形態において、穏やかな還元剤は以下の最終濃度のＭＴＧである：約０．５ｍＭから約４ｍＭ、約０．５ｍＭから約３ｍＭ、約０．５ｍＭから約２ｍＭ、約０．５ｍＭから約１ｍＭ、約０．６ｍＭから約２ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．４ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．３ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．２ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．１ｍＭ、約０．６ｍＭから約１．０５ｍＭ、約０．６ｍＭから約１ｍＭ、約０．７ｍＭから約２ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．４ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．３ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．２ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．１ｍＭ、約０．７ｍＭから約１．０５ｍＭ、約０．７ｍＭから約１ｍＭ、約０．８ｍＭから約２ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．４ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．３ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．２ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．１ｍＭ、約０．８ｍＭから約１．０５ｍＭ、約０．８ｍＭから約１ｍＭ、約０．９ｍＭから約２ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．５ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．４ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．３ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．２ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．１ｍＭ、約０．９ｍＭから約１．０５ｍＭ、約０．９ｍＭから約１ｍＭ、約１ｍＭから約１．５ｍＭ、約１ｍＭから約１．４ｍＭ、約１ｍＭから約１．３ｍＭ、約１ｍＭから約１．２ｍＭ、約１ｍＭから約１．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭ、又は約５．０ｍＭ。

【0158】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は脱凝集剤を含む。実施形態において、脱凝集剤は、アルギニン、グアニジンＨＣｌ、洗剤、尿素または当該技術分野において既知の他の適切な脱凝集剤である。実施形態において、製剤は少なくとも約１％から約２５％ｗ／ｖアルギニンを含む。実施形態において、保存または製剤バッファーは、約１％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約１１％ｗ／ｖアルギニンへ、約１％から約１０％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約９％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約８％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約７％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約６％ｗ／ｖアルギニン、約１％から約５％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１１％ｗ／ｖアルギニン、約５％から約１０％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１１％ｗ／ｖアルギニン、約７％から約１０％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１１％ｗ／ｖアルギニン、約８％から約１０％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１８％ｗ／ｖアルギニンへ、約９％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１１％ｗ／ｖアルギニン、約９％から約１０％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約１０％から約１１％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１３％ｗ／ｖアルギニン、約１１％から約１２％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約２４％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約２３％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約２２％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約２１％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約２０％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１９％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１８％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１７％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１６％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１５％ｗ／ｖアルギニン、約１２％から約１４％ｗ／ｖアルギニン、または約１２％から約１３％ｗ／ｖアルギニンを含む。特定の実施形態において、保存バッファーは約１０％アルギニンを含む。

【0159】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤はバッファーを含む。実施形態において、バッファーはＰＢＳ、Ｈｅｐｅｓ、ヒスチジンまたはトリス緩衝液である。実施形態において、バッファーは１×ＰＢＳまたは０．５×ＰＢＳである。実施形態において、安定したｒＣＳＰ製剤は約６．０から約７．５のｐＨを有する。実施形態において、安定したｒＣＳＰ製剤は、約ｐＨ ６．０、約ｐＨ ６．１、約ｐＨ ６．２、約ｐＨ ６．３、約ｐＨ ６．４、約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ７．４又は約ｐＨ ７．５のｐＨを有する。実施形態において、安定したｒＣＳＰ製剤は、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．４、に、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．２に、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．１からｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ６．９、約６．１から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．１から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．２から約ｐＨ ６．６に、約ｐＨ ６．０から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．３からｐＨ ７．１、ｐＨ 約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ７．０、約６．３から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．３から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ７．０、約６．４から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．４から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．５から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ７．０、約６．６から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．６から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．２に、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ６．６、約ｐＨ ６．７から約ｐＨ ６．５、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ６．９、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ６．８、約ｐＨ ６．８から約ｐＨ ６．７、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．２、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．１、約ｐＨ ６．９から約ｐＨ ７．０、約ｐＨ ７．０から約ｐＨ ７．５、約ｐＨ ７．０から約ｐＨ ７．４、約ｐＨ ７．０から約ｐＨ ７．３、約ｐＨ ７．０から約ｐＨ ７．２、または約ｐＨ ７．０から約ｐＨ ７．１のｐＨを有する。

【0160】

ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．４−約７．２のｐＨの１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、または約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ及び約１０％−約２０％のアルギニンを含む。特定の実施形態において、安定したｒＣＳＰ製剤は、約６．４−約７．２のｐＨの１×ＰＢＳ中に、１ｍＭ ＭＴＧおよび１０％のアルギニンを含む。実施形態において、ｐＨは約６．４から７．０である。特定の実施形態において、ｐＨは約６．７である。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は約４℃の保存温度で保存される。

【0161】

ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．０−約７．５のｐＨの０．５×又は１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０、又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ及び約２０％のアルギニンを含む。

【0162】

ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．４−約７．２のｐＨの０．５×又は１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１０−約４０又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ及び約２０％のアルギニンを含む。

【0163】

ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．４−約７．０のｐＨの０．５×または１×ＰＢＳ中に、約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１０−約４０又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５−約１．５ｍＭのＭＴＧ、および、約２０％のアルギニンを含む。

【0164】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．４−約７．０のｐＨの１×ＰＢＳ中に、約１から約５ｍｇ／ｍｌ又は約１から約１０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．８から約１．２ｍＭ ＭＴＧ及び約５％から約１５％のアルギニンを含む。

【0165】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約６．４−約７．０のｐＨの１×ＰＢＳ中に、約１から約５ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約１．０ｍＭ ＭＴＧ及び約１０％のアルギニンを含む。

【0166】

他の実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、ｐＨ ７．５で１０ｍＭトリスベース、４．２％マンニトール、２％アルギニン−ＨＣｌ、１００μＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＭＴＧを含む。実施形態において、安定したｒＣＳＰ製剤はｐＨ ７．０で、１０ｍＭヒスチジン、４．２％マンニトール、２％アルギニン−ＨＣｌ、１００μＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＭＴＧを含む。

【0167】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約ｐＨ６．４から約ｐＨ ７．０のＰＢＳ中に、約１．０ｍＭ ＭＴＧ、及び約０．２Ｍの約０．７Ｍのアルギニンを含む。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約ｐＨ６．４から約ｐＨ ７．０のＰＢＳ中に、約０．５Ｍから約１．５ｍＭ ＭＴＧ、及び約０．３Ｍの約０．７Ｍのアルギニンを含む。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約ｐＨ６．４から約ｐＨ ７．０のＰＢＳ中に、１ｍＭグルタチオンまたは１ｍＭシステイン、及び１％ｗ／ｖアルギニンを含む。実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は、約ｐＨ ７．０のＰＢＳ中に、１ｍＭ ＭＴＧ、及び１％ｗ／ｖアルギニン又は約０．５Ｍアルギニンを含む。

【0168】

さらなる実施形態において、本発明の安定した液体製剤は、患者に投与されるために、例えばワクチンのような生成物の生産のためのｒＣＳＰの使用を促進する。実施形態において、選択的な製剤は、米国薬局方で公表されているような米国薬局方協会（メリーランド州ロックビル）の基準−国民医薬品集（ＵＳＰ−ＮＦ）又は例えば国際薬局方（世界保健機関）で公表されているような米国以外の国の似た基準を含む。

【0169】

さらにｒＣＳＰの安定した液体製剤中で長期間にわたって安定してｒＣＳＰを維持する方法に関する。ｒＣＳＰの安定した液体製剤中でのｒＣＳＰの安定した維持は、例えば安定性の維持は、製剤中に所定の時間後存在する％総ｒＣＳＰによって陽性に示され、％ｒＣＳＰ二量体、％ｒＣＳＰ凝集体、％変性ｒＣＳＰ及び／又は％分解されたｒＣＳＰによって陰性に示されるように、上記の安定性の指示薬を使用して長期間にわたって評価される。実施形態において、総ｒＣＳＰのパーセントは、所定の時間の後に存在するｒＣＳＰ（ｒＣＳＰ単量体）のパーセントである。したがって、安定した維持は、安定した液体製剤において所定の時間後に存在する特定の最小量のｒＣＳＰによって示され得る。実施形態において、総ｒＣＳＰのパーセントは、ｒＣＳＰの開始量と比較した、安定した液体製剤において所定の時間後に存在するｒＣＳＰのパーセントによって示され得る。他の実施形態において、総ｒＣＳＰのパーセントは所定の時間後に存在するｒＣＳＰのパーセントである。本明細書中の他の部分に記載されるように、ｒＣＳＰの量は既知の方法によって評価することができる。例えば、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはＳＥ−ＨＰＬＣ及び本明細書中の実施例に記載されている方法によって決定されるように、総ｒＣＳＰ％は、ｒＣＳＰ単量体％と等しい。実施形態において、総ｒＣＳＰ％は、天然ｒＣＳＰおよびピログルタミン酸ｒＣＳＰ単量体種を含む。

【0170】

実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤中において安定して維持されたｒＣＳＰは、例えば組み換え 熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を精製するプロセスのように、本明細書及び特許請求の範囲の中で記載されている方法によって調製される。前記プロセスは、（ａ）組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む細菌細胞溶解物の調製物を得る工程；（ｂ）熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を含む可溶性画分、及び不溶性画分に工程（ａ）の細菌細胞ライセート調製物を分離する工程；（ｃ）工程（ｂ）の可溶性画分における組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、可溶性画分中の宿主細胞タンパク質から分離する工程；（ｄ）熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得るために、工程（ｃ）で得られた組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質二量体を、選択的な還元条件にさらす工程；及び（ｅ）工程（ｄ）で得られた熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を宿主細胞タンパク質から分離し、精製された組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を得る工程、を含む。実施形態において、工程（ｅ）の分離は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。

【0171】

これらの方法において、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日間、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月または少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃で安定して維持される。

【0172】

実施形態において、本発明は、安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法はｒＣＳＰの安定した液体製剤を提供する又は調製する工程を含み、ここでｒＣＳＰは約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0173】

実施形態において、本発明は安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法は約６．０から約７．５のｐＨの０．５×又は１×ＰＢＳにおいて約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５から約１．５ｍＭ ＭＴＧ及び約１％から約２０％アルギニンを含む製剤を提供する又は調製する工程を含み、ここで、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２か月、、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0174】

本発明は安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法は約６．４から約７．２のｐＨの１×ＰＢＳにおいて約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５から約１．５ｍＭ ＭＴＧ及び約１０％から約２０％アルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、ここで、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２か月、、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0175】

本発明は安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法は約６．４から約７．０のｐＨの１×ＰＢＳにおいて約１−約５、約１−約１０、約１−約２０、約１−約３０、約１−約４０又は約１−約５０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．５から約１．５ｍＭ ＭＴＧ及び約１０％から約２０％アルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、ここで、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２か月、、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0176】

本発明は安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法は約６．４から約７．０のｐＨの１×ＰＢＳにおいて約１−約５又は約１−約１０ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約０．８から約１．２ｍＭ ＭＴＧ及び約５％から約１５％アルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、ここで、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２か月、、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0177】

本発明は安定した液体製剤においてｒＣＳＰを安定して維持する方法に関し、該方法は約６．４から約７．０のｐＨの１×ＰＢＳにおいて約１−約５ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約１．０ｍＭ ＭＴＧ及び約１０％アルギニンを含む製剤を提供する工程を含み、ここで、ｒＣＳＰは、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または、少なくとも約１年の間、約３℃から約２５℃の温度で安定して維持される。

【0178】

特定の実施形態において、ｒＣＳＰの安定した液体製剤は約６．４から約７．０のｐＨの１×ＰＢＳにおいて約１−約５ｍｇ／ｍｌのｒＣＳＰ、約１．０ｍＭ ＭＴＧ及び約１０％又は０．５Ｍアルギニンを含む。実施形態において、少なくとも約１２０時間２−８℃で保存された時、この製剤は、約８５から約９５％の総ｒＣＳＰを含むことが観察された。実施形態において、少なくとも約２４時間２５℃で保存された時、この製剤は約８５から約９５％の総ｒＣＳＰ、約８５％から約９０％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約８５％のの総ｒＣＳＰ、少なくとも約８６％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約８７％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約８８％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約８９％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約９０％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約９１％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約９２％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約９３％の総ｒＣＳＰ、少なくとも約９４％の総ｒＣＳＰまたは少なくとも約９５％の総ｒＣＳＰを含むことが観察された。

【0179】

＜プロセス＞
実施形態において、精製方法はＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの発酵培養液全体を使用して実施される。培養液は、例えば３．１Ｍ尿素、３１ｍＭトリス、ｐＨ８．２において≦２０固体である均一な供給を達成するために、脱凝集剤の存在下でバッファーによって希釈される。希釈された発酵培養液は微溶液化によって溶解され、細胞溶解物を生成する。溶解物は２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．２で１：１に希釈され、１０％固体溶解物を作製する。溶解物中のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ固体は、ディスクスタック遠心分離および深層ろ過によってｒＣＳＰ含有バッファーから分離される。 ｒＣＳＰ−含有バッファーは、さらに０．２―μｍでろ過され、凍結される。実施形態において、ろ過されたｒＣＳＰ−含有バッファー（溶解物）は、１Ｌまたは２Ｌのボトル（例えばＮａｌｇｅｎｅ（登録商標）ＰＥＴＧボトル）において凍結される。実施形態において、溶解物は少なくとも７時間−７２℃で１ＬのＰＥＴＧボトルにおいて凍結される。実施形態において、溶解物は少なくとも７時間から少なくとも１８時間、又は約７から１８時間の間に位置する約２から約６時間凍結される。実施形態において、溶解物は、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間または少なくとも約１７時間凍結される。ｒＣＳＰの浄化された細胞抽出液が融解され、次に陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製される。実施形態において、融解された溶解物は、クロマトグラフィーの前に室温で保持される。実施形態において、融解された溶解物は融解後、およびＡＥＸ前にろ過にさらされる。特定の実施形態において、ろ過は薄膜ろ過である。実施形態において、ろ過は０．２−０．４５μｍ薄膜ろ過である。ｒＣＳＰ−含有ＡＥＸ溶離液は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）によって回収され、さらに精製され、ｒＣＳＰ−含有ＨＡ溶出液は回収され、２−８℃で保存される。ＨＡ溶出液は周囲温度に戻され、０．２−μｍでろ過され、ｒＣＳＰは選択的な還元条件にさらされる。バッファーに二量化したＣＳＰを包含しているクロマトグラフィー溶出画分は、最終容量２００−６００ｍＬにプールされる。
プールは、最終濃度２０μＭのジチオスレイトール還元剤又は最終濃度１ｍＭのＭＴＧ還元剤の追加によって選択的な還元にさらされ、マグネティックスターラ―バー及び撹拌プレートによって、室温で１２−２４時間急激に撹拌された。代替的に、ＰＢＳ中の凝集されたｒＣＳＰは、選択的な還元を受ける前の材料に最初に２Ｍ尿素を加えることにより、同じプロセスにさらされる。実施形態において、ｒＣＳＰはその後ＨＩＣによってさらに精製される。

【0180】

ＨＩＣ精製の後に選択的な還元条件および／またはにさらされた後、ｒＣＳＰはＴＦＦによって製剤バッファーへ濃縮され、透析される。

【0181】

代替的に、製剤バッファーに透析する又はＨＩＣに充填するいずれかの前に、ＨＡ溶出液は室温で選択的な還元条件にさらされ、その後濃縮され、透析される。

【0182】

実施形態において、製剤バッファーは１ｍＭ ＭＴＧおよび１０％のアルギニンを含む。製剤バッファー中の透析されたｒＣＳＰは、大量の原薬を産出するために最終の０．２−μｍフィルターでろ過される。精製された熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の

【0183】

＜分析＞
＜製品の詳細＞
タンパク質の収量および／または品質を評価するための多数のアッセイ方法が当該技術分野において知られている。組換えタンパク質を特徴づける任意の適切な方法の使用が、本明細書中で意図されている。

【0184】

＜タンパク質収量＞
精製されたｒＣＳＰの精製収量全体またはプロセス収量全体は、出発材料において存在すると測定されたｒＣＳＰの量と比較して、本発明を使用して得られた精製されたｒＣＳＰの総量である。それは、収量パーセントとして一般に示される。また、収量パーセントの測定は、細胞培養物、細菌細胞溶解物の調製物又は可溶性画分（浄化前又は後）のような出発材料で測定されたタンパク質量に依存するだけではなく、各工程で使用される充填量にも依存する。実施形態において、例えば回収工程のような工程の全収量が、例えば細胞破砕工程のような次の工程で加工されていない場合、プロセス収量全体は工程の充填及び収量を使用して算出されなければならない。すべての工程の全収量が使用される場合、プロセス収量全体は、出発物質中のｒＣＳＰの量で最終収量を割ることにより算出することができる。当該技術分野において既知の又は本明細書中に記載されているタンパク質を測定する任意の適切な方法を使用することができ、例えばＳＤＳ−ＣＧＥおよびウエスタンブロット分析を含むＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用することができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは還元条件または非還元条件下で実行することができる。非還元条件下で実行されたＳＤＳ−ＰＡＧＥは、単量体種、二量体種および凝集体種（ＨＭＷ凝集体）の個々の比較を可能にする。例えば、そのような比較は、出発材料におけるｒＣＳＰ単量体又は出発材料におけるｒＣＳＰ二量体、単量体及び凝集体種と比較した、精製されたｒＣＳＰ単量体の収量を決定するために使用できる。還元条件下の評価は、すべてのｒＣＳＰ種の基準を与える。例えば本明細書中に記載されている又は当該技術分野において既知の結合アッセイのような活性アッセイもタンパク質収量に関する情報を提供できる。

【0185】

典型的には、ｒＣＳＰの開始量又は最初のｒＣＳＰ充填量は、細胞培養液、細菌細胞溶解物、可溶性画分又は浄化された溶解物画分の一部のタンパク質濃度を測定することにより決定される。その後、精製工程にさらされたタンパク質の総量は、その後部分データからの次の工程で加工される材料の容量（「充填量」）の補外（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって算出された。
実施形態において、最初の充填量はプロセス収量全体の決定において使用される。実施形態において、ｒＣＳＰの開始量は、約１グラムから約３０００グラム、約１００グラム−約３０００グラム、約２５０グラム−約３０００グラム、約５００グラム−約３０００グラム、約７５０グラム−約３０００グラム、約１０００グラム−約３０００グラム、約１００グラム−約２０００グラム、約２５０グラム−約２０００グラム、約５００グラム−約２０００グラム、約７５０グラム−約２０００グラム、約１０００グラム−約２０００グラム、約１００グラム−約１０００グラム、約１５０グラム−約１０００グラム、約２００グラム−約１０００グラム、約２５０グラム−約１０００グラム、約３００グラム−約１０００グラム、約４００グラム−約１０００グラム、約５００グラム−約１０００グラム、または約７５０グラム−約１０００グラムを含む。

【0186】

得られた精製されたｒＣＳＰの総量と出発材料中の測定されたｒＣＳＰの量の比較によって、精製プロセス全体の収量がパーセント収量（又は画分収量）として得られる。本発明の実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰの精製工程全体の収量パーセントは約１０％から約７５％である。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰの収量パーセントは少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約１０％−約７０％、約１０％−約６５％、約１０％−約６０％、約２０％−約７５％、約２０％−約７０％、約２０％−約６５％、約２５％−約７５％、約２５％−約７０％、約２５％−約６５％、約２５％−約６０％、約３０％−約７５％、約３０％−約７０％、約３０％−約６５％、約３０％−約６０％、約３０％−約６５％、約３０％−約６０％、、約３０％−約６５％又は約３０％−約６０％である。実施形態において、これらのプロセス収量は、変性された、分解された、二量体化された又は凝集されたｒＣＳＰの制限された量を含むｒＣＳＰの収量である。実施形態において、これらのプロセス収量は、多くて１０％の変性ｒＣＳＰ、多くて１０％の分解ｒＣＳＰ、１０％の凝集ｒＣＳＰ及び／又は１０％の二量体化されたｒＣＳＰを含む。実施形態において、これらのプロセス収量は、多くて５％の変性ｒＣＳＰ、多くて５％の分解ｒＣＳＰ、５％の凝集ｒＣＳＰ及び／又は５％の二量体化されたｒＣＳＰを含む。

【0187】

タンパク質収量も、細胞タンパク質総量（ｔｃｐ）のパーセント又は画分、タンパク質／細胞の量又は乾燥バイオマスのパーセント又は部分として示される。収量が培養物容量の単位として示される実施形態において、特に異なる培養物間の収量が比較されている場合、培養物細胞密度が考慮され得る。精製プロセスの各工程又は複数の工程についての回収量が（精製収量全体を記載するのと反対に）測定される。

【0188】

＜タンパク質の品質＞
関連する実施形態において、ｒＣＳＰは精製プロセスの任意の工程でのタンパク質の品質に関して記載されている。本明細書中に記載されているように実施形態において、タンパク質の品質は、二量体化した又は二量体化していない、Ｎ−末端において分解された又は分解されていない（又は切断された）、変性された又は変性されていない、すなわちＣ−末端領域に完全なままのジスルフィド結合を有する、あるいはこれらの組み合わせのｒＣＳＰの量又は割合に応じて記載される。品質の測定は、例えば結合アッセイによって活性であると決定されたＣＳＰのパーセント又は画分も含む。これらの実施形態において、活性は、アッセイされたタンパク質の総量と活性であると決定されたタンパク質の量を比較することによって示されても良い。例えば二量体化している又は二量体化していない、凝集している又は凝集していない、分解している又は分解していない、変性している又は変性していない、不活性又は活性であると決定された精製の任意の工程のタンパク質量は、同じ工程でのタンパク質の総量と比較されてもよい。例えば、得られた精製されたタンパク質における二量体化していない、凝集していない、分解していない、変性していない又は活性なｒＣＳＰ量は、得られた精製されたタンパク質の総量と比較でき、その結果二量体化していない、凝集していない、分解していない、変性されていない又は活性なｒＣＳＰ量等のパーセント又は画分値に至る。代替的に、得られた精製されたタンパク質における二量体化していない、凝集していない、分解していない、変性していない又は活性なｒＣＳＰ量等は、出発材料における二量体化していない、凝集していない、分解していない、変性していない又は活性なｒＣＳＰ量等と比較でき、その結果二量体化していない、凝集していない、分解していない、変性されていない又は活性なｒＣＳＰの回収量等のパーセント又は画分値に至る。

【0189】

本明細書中に記載されている又は当該技術分野において既知の、ｒＣＳＰ二量体形成を評価する任意の方法は、ｒＣＳＰ二量体形成のパーセントを決定するために使用することができる。その方法は、例えばＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣを含む）を含みうる。ＨＭＷ凝集体形成を評価する方法は、例えばＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む。

【0190】

本発明の実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、約１２％未満の二量体を含む。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満の二量体を含む。関連する実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、少なくとも８８％の単量体を含む。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％の単量体を含む。

【0191】

本明細書中に記載されているまたは当該技術分野において知られているようなｒＣＳＰ分解を評価する任意の方法が、ｒＣＳＰ分解のパーセントを決定するために使用されてもよい。
この方法は、例えばＬＣ−ＭＳ／完全な質量（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣを含む）及びＮ末端シーケンシングを含みうる。

【0192】

本発明の実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、約１０％未満のＮ末端で分解されたｒＣＳＰ種の総量を含む。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％または約１％未満のＮ末端で分解されたｒＣＳＰ種の総量を含む。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰはどれもＮ末端で分解されない。実施形態において、分解パーセントは、Ｃ５／Ｙ６またはＶ１４／Ｌ１５で切断されたもののパーセントである。実施形態において、分解パーセントは、Ｃ５／Ｙ６およびＶ１４／Ｌ１５の両方で切断されたもののパーセントである。実施形態において、分解パーセントは、Ｃ５／Ｙ６、Ｖ１４／Ｌ１５、および／またはＮ２９／Ｅ３０で切断されたもののパーセントである。他の実施形態において、分解パーセントは、Ｃ５／Ｙ６、Ｖ１４／Ｌ１５、Ｎ２９／Ｅ３０、および／またはＳ４４／Ｌ４５で切断されたもののパーセントである。実施形態内において、分解パーセントは非特異的に分解された、得られたｒＣＳＰのパーセントである。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、Ｎ末端で非特異的に分解された約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％または約１％未満のｒＣＳＰを含む。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰはどれもＮ末端で非特異的に分解されていない。実施形態において、分解パーセントは、Ｃ５／Ｙ６、Ｖ１４／Ｌ１５、Ｎ２９／Ｅ３０および／またはＳ４４／Ｌ４５で切断されて得られたｒＣＳＰのパーセントと、Ｎ末端で非特異的に分解されたｒＣＳＰのパーセントを組み合わせたものである。関連する実施形態において、得られたｒＣＳＰの少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％が、Ｎ末端において非特異的に又はＣ５／Ｙ６、Ｖ１４／Ｌ１５、Ｎ２９／Ｅ３０、および／またはＳ４４／Ｌ４５で切断されるといういずれによっても分解されていない。

【0193】

本発明の実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰの多くて１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又は０％が、残基２， ３， ４， ５， ６， ７， ８， ９， １０， １１， １２， １３， １４， １５， １６， １７， １８， １９， ２０， ２１， ２２， ２３， ２４， ２５， ２６， ２７， ２８， ２９， ３０， ３１， ３２， ３３， ３４， ３５， ３６， ３７， ３８， ３９， ４０， ４１， ４２， ４３， ４４， ４５， ４６， ４７， ４８， ４９及び５０ から選択されたアミノ酸（ここで残基１は、例えば図２ＣのＱ、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３及び図２ＢのＭ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のような、リーダーを含まない、発現したタンパク質の最初の残基である）で分解、切断又はタンパク質分解されている。実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％は、残基１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０から選択されたアミノ酸に損傷があってはいけない。

【0194】

特定の実施形態において、精製されたｒＣＳＰは、精製プロセス収量全体の約１０％から約７５％で得られ、ここで精製されたｒＣＳＰは約５％未満の二量体、１０％未満のＣ５／Ｙ６およびＶ１４／Ｌ１５切断種の総量及び約５％未満の変性ｒＣＳＰを含む。

【0195】

本明細書中に記載されている又は当該技術分野において知られているような、ｒＣＳＰ変性を評価する任意の方法は、変性タンパク質のパーセントを決定するために使用することができる。例えば、二次構造を分析する方法（例えばＣＤ及び内因性の蛍光）及びジスルフィド結合を分析する方法（例えばペプチドマッピング、アルキル化／完全な質量／Ｇｌｕ−Ｃ消化）を使用することができる。

【0196】

実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の、例えば適切でないジスルフィド結合を有するｒＣＳＰのような変性ｒＣＳＰを含む。適切でないジスルフィド結合は、Ｃ−末端領域の２つの天然のジスルフィド結合の内少なくとも１つが誤対合又は対合していない時を特定している。実施形態において、それぞれの精製されたｒＣＳＰは、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の完全なジスルフィド結合を有している。他の実施形態において、変性は、参照基準ｒＣＳＰと精製されたｒＣＳＰの二次構造の１つ以上の基準を比較することによって決定される。

【0197】

切断又はシステイン及びジスルフィド結合部位を記載するために使用される番号付け（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）は、ｒＣＳＰアミノ酸配列に依存して変化し得ると理解される。

【0198】

＜ピログルタミン酸−含有種＞
特定の実施形態において、例えばグルタミンがグルタミン酸に脱アミド化され、その後グルタミン酸がピログルタミン酸（グルタミン→グルタミン酸→ピログルタミン酸）に環化されたｒＣＳＰのようなピログルタミン酸−含有ｒＣＳＰ種が限定的であることが望ましい。本明細書中に記載されているように、ｒＣＳＰの非ピログルタミン酸−含有種は、一定期間にわたるピログルタミン酸−含有種の増加に伴って、一定時間にわたり減少することが観察された。ピログルタミン酸は当該技術分野において既知の任意の方法（例えばＲＰ−ＨＰＬＣ）によって測定することができる。

【0199】

幾つかの実施形態において、精製されたｒＣＳＰは２０％未満、１８％未満、１５％未満、、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満のピログルタミン酸−含有ｒＣＳＰを含む。

【0200】

実施形態において、プロセス収量は多くて約２０％、１８％、１５％、１０％、５％または１％のピログルタミン酸−含有ｒＣＳＰを含む。

【0201】

実施形態において、ｒＣＳＰの製剤におけるピログルタミン酸−含有種の量は、少なくとも約７日、少なくとも約８日、 少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約６０日、少なくとも約７０日、少なくとも約８０日、少なくとも約９０日、少なくとも約６か月、または少なくとも約１年保存された場合、多くて約０％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％増加する。特定の実施形態において、ピログルタミン酸−含有種の増加の最高率は、約９日から約２５日まで保存された場合、約１％から約３％、または約１％から約５％である。保存前の量（例えばＴ＝０の）は比較に使用することができる。

【0202】

実施形態において、ｒＣＳＰ品質は、約１０％未満のｒＣＳＰ ピログルタミン酸−含有種の存在によって示される。実施形態において、ｒＣＳＰ品質はピログルタミン酸−含有種の欠如によって示され、ここでこれらの種は、全タンパクまたは得られた精製されたＣＳＰの多くて約１０％、多くて約９％、多くて約８％、多くて約７％、多くて約６％、多くて約５％、多くて約４％、多くて約３％、多くて約２％または多くて約１％で存在する。

【0203】

＜タンパク質純度＞
実施形態において、ｒＣＳＰの純度は、精製工程の任意の工程におけるＳＤＳ−ＣＧＥおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびそれに従って割り当てられた純度値によって評価される。純度は、電気泳動図における標的タンパク質（例えばｒＣＳＰ単量体）のピーク面積を、他のピークの面積で割る、ＳＤＳ−ＣＧＥ装置ソフトウェアによって計算することができる。実施形態において、本発明の方法を使用することで得られた精製されたｒＣＳＰの純度は、約８５％から１００％である。実施形態において、純度は少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約８５％−約９９％、約８５％−約９８％、約８５％−約９７％、約８５％−約９６％、約９０％−約９９％、約９０％−約９８％、約９０％−約９７％、約９０％−約９６％又は約９０％−約９５％である。

【0204】

特定の実施形態において、得られた精製されたｒＣＳＰは９６％の純度を有し、多くて５％の二量体を包含し、検知可能な高分子量（ＨＭＷ）凝集体を包含せず、１０ＥＵ／ｍｇ未満の菌体内毒素を包含し、検知可能なタンパク質分解切断を有しない。
実施形態において、菌体内毒素は多くて約１０ＥＵ／ｍｇ、多くて約２５ＥＵ／ｍｇ、多くて約５０ＥＵ／ｍｇ、多くて約１００ＥＵ／ｍｇ、多くて約２５０ＥＵ／ｍｇ、多くて約４００ＥＵ／ｍｇ、または多くて約５００ＥＵ／ｍｇで存在する。

【0205】

＜製品分析＞
本発明の実施形態において、組み換えＣＳＰは、本発明の精製プロセスの任意の工程で、収量、純度、品質及び安定性のいずれかが、本明細書中に記載されているような、文献で報告されているような及び当該技術分野において既知の方法によって評価される。ｒＣＳＰを評価するためのアッセイは、非限定的な例として本明細書で提供されている。

【0206】

＜タンパク質収量の決定＞
本発明は精製されたｒＣＳＰの高い精製収量の全量を得るのに有用なプロセスを提供する。例えばＳＤＳ−ＣＧＥ、ウエスタン法のようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、収量を決定し、且つ精製工程の任意の工程で適切にｒＣＳＰ純度をモニターするために使用することができる。実施形態において、収量測定に含まれるタンパク質は、ｒＣＳＰ単量体を含み、二量体又は凝集したｒＣＳＰを含まない。実施形態において、工程収量および／または全収量が測定される。実施形態において、ｒＣＳＰを選択的な還元条件にさらす工程は、ｒＣＳＰ二量体からのｒＣＳＰ単量体への変換による、ｒＣＳＰ単量体の増加した工程収量を結果としてもたらす。

【0207】

収量を決定するのに適した方法は、当業者にとって既知であり、例えばタンパク質サンプルは、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２ ｃｈｉｐ及び対応する試薬 （部品番号 がそれぞれ７６０４９９及び７６０３２８， Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ 装置 （Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を使用した ＨＴＰマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって分析し得る。サンプルは、製造社のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ． ４５０５８９， Ｒｅｖ． ３）に従い、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけられて調製される。分離の後、ゲルは染色され、脱染色され、デジタル画像化される。

【0208】

精製されたｒＣＳＰサンプルのタンパク濃度は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２８０ｎｍでの吸光度（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって決定される１ｍｇ／ｍｌ＝０．６１ＡＵのＡ_２８０）によって決定することができる。

【0209】

収量または純度を決定するウエスタンブロット分析は、当該技術分野において知られている任意の適切な方法によって行なうことができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離したＣＳＰをニトロセルロース薄膜へ転写し、モノクローナルの抗−Ｐｆ ＣＳＰ抗体と薄膜をインキュベートすることによって行うことができる。

【0210】

本明細書中に記載の任意の分析法において有用なＣＳＰ抗体は、当業者に既知の適切な手順によって生成することができる。有用な抗体は、文献に記載されており、市販で入手可能である。ＣＳＰの立体構造に特異的な適切なモノクローナル抗体として、例えば抗体４Ｃ２， ４Ｂ３及び１Ｇ１２が特徴付けられており、Ｐｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００９によってＣＳＰ変性に感受性があることが報告されている。
望ましい結合特性を有するＣＳＰ抗体は、例えばＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００９のような文献に記載されている方法に基づいて生成し、選択することができる。

【0211】

＜タンパク質変性の決定＞
実施形態において、本発明の精製工程は、変性されておらず、再フォールディングの必要がない、精製されたｒＣＳＰ単量体を得るために使用される。変性されていないｒＣＳＰは、例えば内部参照基準と比較して、評価をすることができる天然の構造を有する。実施形態において、変性は、Ｃ末端領域の適切なジスルフィド結合の存在に基づいて分析される。タンパク質二次構造または三次構造、およびＣ末端領域の適切なジスルフィド結合の存在は、当該技術分野において既知の又は本明細書中に記載されている方法によって分析することができる。

【0212】

タンパク質二次構造は、例えば円偏光二色性（ＣＤ）又は固有の蛍光を使用して分析することができる。ＣＤは分光偏光計（例えばＪａｓｃｏ Ｊ−８１５、ＪＡＳＣＯ）を使用することができる。１８５−２５０ｎｍの遠紫外線ＣＤ領域は、二次構造（すなわちα−へリックス、β−シートおよびランダムコイル）の差異をモニターする。遠紫外線ＣＤ分光（２４０−１９０ｎｍ）は、０．１ｍｍ光路長キュベットを使用して、バンド幅が１ｍｍに、スキャン速度が１００ｎｍ／分に、デジタル集積時間（ＤＩＴ）＝１秒に設定され、５×蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を備えたＪａｓｃｏ Ｊ−８１５分光偏光計上で行うことができる。サンプルは、２０℃で×５ｍＭトリス（Ｓｉｇｍａ， カタログ番号Ｔ７８１８−２５０Ｇ）／１６．７ｍＭ硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ， カタログ番号Ｓ９６２７−５００Ｇ）、ｐＨ７．５バッファー中で分析され得る。タンパク質中のアルファへリックス及びベータ鎖のパーセントを評価するために、例えばＰｅｒｅｚ−Ｉｒａｔｘｅｔａ， ｅｔ ａｌ．， ２００８， 「Ｋ２Ｄ２： ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒａ」 ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：２５ （ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６８０７−８−２５）に記載されているＫ２Ｄ２のような分析ソフトウェアを使用し得る。ＣＳＰは、５％アルファヘリックスおよび２７％ベータ鎖を包含することが報告される（例えばＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ２００９）。

【0213】

固有の蛍光については、分光偏光計温度は最初２０℃に、その後段階的に４０、４５、５５、６５、および７５℃まで徐々に増加し、次に２０℃に戻るように設定され得る。蛍光は蛍光読み込みとともに設定された各温度で読み込まれ、以下のように設定される：２８０ｎｍで励起、２９５−３９５ｎｍの発光、感受性＝７９０Ｖ、データピッチ＝１ｎｍ、デジタル積分時間（ＤＩＴ）＝１秒、帯発光幅（Ｂａｎｄ ｗｉｄｔｈ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）＝１０ｎｍ、スペクトル蓄積＝３、スターラ―バーｒｐｍ＝２００。

【0214】

得られたｒＣＳＰの変性／立体構造は、選択された標的へのｒＣＳＰの結合を測定する、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して評価することができる。実施形態において、立体構造に特異的な抗体（例えば変性タンパク質に結合しない抗体）および／またはヘパリンへの結合が測定される。機能的な結合アッセイは、ｒＣＳＰ立体構造の差をモニターするのに有用で、代理効力アッセイ（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｓｓａｙ）として使用することができる。これらの方法に有用な立体構造に特異的な抗体の例は、本明細書中及びＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．， ２００９に記載されている。ヘパリンおよび立体構造に特異的な抗体を使用するバイオセンサー構造の例は、本明細書中の実施例において記載されている。

【0215】

球状に折りたたまれた構造は、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を使用して分析することができる。サイズ排除は、より大きいタンパク質の方がより小さいタンパク質よりも早く溶出されるように、サイズに基づいてタンパク質を分離する。実施形態において、サイズ排除（ＳＥ）ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用して行なわれる。特筆すべきは実施例に記載されているように、ｒＣＳＰ（−３８ｋＤａである）は期待されていたより短い保持時間を有する。

【0216】

ジスルフィド結合は、本明細書中の実施例に記載されているペプチドマッピングを使用して分析することができる。ｒＣＳＰは最初にトリプシン、その後エラスターゼというように、二重プロテアーゼ消化にさらすことができる。二重消化はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析され、結果として生じたデータは、２つのジスルフィド結合ジペプチドを特定するためにＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して処理された。陰性対照の手順として、同じデータが、Ｃ_３１４−Ｃ_３５４及びＣ_３１８−Ｃ_３４９である上記ジスルフィド結合と逆のもの（すなわち正しくないもの）を含む方法ファイルを使用して処理される。

【0217】

＜タンパク質分解の決定＞
本発明はＮ末端領域で分解されない、精製されたｒＣＳＰを得るのに有用な精製工程を提供する。実施形態において、ＬＣ−ＭＳはタンパク質分解を生ずる切断、脱アミド、酸化および断片化をモニターするために使用され、Ｎ末端領域システインが対になっていないことを確認する。

【0218】

実施形態において、遊離Ｎ末端システインは、例えば本明細書中の実施例に記載されているようなアルキル化とペプチドマッピングによって特定される。

【0219】

実施形態において、ＲＰ−ＨＰＬＣは切断、脱アミドおよび酸化を検出するために使用される。

【0220】

ＨＰＬＣは、ｒＣＳＰを特徴づけるために使用することができ、単量体及び二量体の含有量を含む構造的な情報を提供する。実施形態において、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）は、単量体および二量体含有量、切断、脱アミドおよび酸化を評価するために使用される。還元剤（例えば２０μＭ ＤＴＴ）の追加は、観察された二量体を単量体へ変えることおよび二量体または単量体への凝集により、種の識別を補助することができる。逆相（ＲＰ）カラムを含むＲＰ−ＨＰＬＣのための適切な方法は、当該技術分野において知られており、文献に記載されている。特定の実施形態において、Ｃ_４ Ｊｕｐｉｔｅｒカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が使用される。

【0221】

実施形態において、前処理（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）の疎水性クロマトグラフィーが、ｒＣＳＰの単量体および二量体形態を分解するために使用される。

【0222】

実施形態において、タンパク質電荷の不均一性は、例えばキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）、又は画像化されたキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を使用して分析される。これらの実施形態において、例えばｒＣＳＰ内部参照基準のような標準が比較のために使用される。本明細書中の実施例に記載されているように、ｃＩＥＦを使用して評価されたｒＣＳＰ内部参照標準は、主要なピークをｐＩ ５．２０およびｐＩ ５．７６に示し、より小さなピークをｐＩ ４．９９、５．０８および５．５２に示す。

【0223】

実施形態において、ＣＳＰ微不均一性は、ペプチドマッピング質量分析法を使用して分析される。

【0224】

＜タンパク質純度の決定＞
実施形態において、宿主細胞タンパク質および核酸を含む汚染物質は、当該技術分野において周知の方法を使用して評価される。

【0225】

収量決定に関して記載されているように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法は汚染する二量体及びＨＭＷ凝集種を特定するのに有用である。実施形態において、ＳＥ−ＨＰＬＣは凝集種を特定するために使用される。

【0226】

実施形態において、ＥＬＩＳＡ法が宿主細胞タンパク質を測定するために使用される。
例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡは、製造社のプロトコルに従って、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．のカタログ番号 Ｆ４５０， 「Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」キットを使用して行なうことができる。プレートはＳｏｆｔｍａｘ Ｐｒｏ ｖ３．１．２ ソフトウェアを使用した、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取ることができる。

【0227】

実施形態において、菌体内毒素はカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）検査によって評価される。ＬＡＬ検査は当該技術分野において周知で、血液と接触する薬物、デバイスおよび他の生成物を試験するためにＦＤＡによって承認されている。実施形態において、溶出画分中の菌体内毒素の量は、１−０．０１ＥＵ／ｍＬ（ＣＨＬ、部品番号ＰＴＳ２００１Ｆ）および１０−０．１ＥＵ／ｍＬ（ＣＨＬ、部品番号ＰＴＳ２０１Ｆ）の感受性範囲を備えたカートリッジを使用し、製造社に供給された操作手順に従ってＥｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳｐｏｒｔａｂｌｅ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＨＬ））を使用して分析される。

【0228】

実施形態において宿主細胞ＤＮＡは、Ｑ−ＰＣＲを使用して分析される。宿主細胞ＤＮＡは、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して評価することができる。発現株の発現プラスミドの骨格配列（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）は、リアルタイムの定量的ＰＣＲによって検出される。リアルタイムＰＣＲは、例えばＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＣＦＤ−３２００ Ｏｐｔｉｃｏｎ）によって行うことができる。

【0229】

＜ｒＣＳＰ内部参照標準の精製＞
実施形態において、ｒＣＳＰ内部参照基準は本発明の方法と共同で行った分析において使用される。参照基準は当該技術分野において既知の又は本明細書に記載された方法によって作製することができる。例えば、ｒＣＳＰを発現する宿主細胞から細胞ペーストは微溶液化し、固体の細胞残骸を除去するために分離され、宿主細胞タンパク質を除去するために分離することができる。最終的に精製されたｒＣＳＰは、ゲルろ過によってＰＢＳ（ｐＨ７．２）へバッファー交換でき、フィルター滅菌し、−８０℃で保存された。内部参照基準の純度は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。実施形態において、ｒＣＳＰ内部参照基準の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９０％であることが決定される。実施形態において、標準物質は１０％未満の二量体を包含している。ウエスタンブロット分析は、ｒＣＳＰの性質を確認し、且つ断片化した種の存在を明らかにするために使用することができる。立体構造に特異的な抗体アッセイは、例えば２つの天然ジスルフィド結合が完全な状態で、適切に対になっているＣ末端領域に高感度な抗体を使用することで行うことができる、適切な抗体は例えばＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．，２００９のような文献に記載されている。還元されアルキル化されたサンプルは、精製されたｒＣＳＰ標準物質が正しいジスルフィド構造を有していることを示すシグナルの損失のために分析することができる。実施形態において、ｒＣＳＰ標準物質の濃度は２８０ｎｍでの吸光度によって決定される。実施形態において、参照材料は、動物研究における効力を実証した。

【0230】

本発明の実施形態において、主要回収プロセスは２つの選択肢を有している。細胞は遠心分離機にかけることおよび冷凍の細胞ペーストにより回収することができる。その後、細胞ペーストは細胞ホモジェネートを生成するために融解し、微溶液化することができる。代替的に、細胞培養液は保持する工程なしで細胞ホモジェネートを生成するために希釈され、直接微溶液化することができる。

【0231】

特定の実施形態において、細胞をペースト状にする選択肢が使用される。
ホモジェネートはその後ディスクスタック遠心分離を使用して浄化され、次に０．２μｍろ過と平行してＸ０ＨＣ薄膜を使用した深層ろ過を行った。その後、材料は保持する工程として冷凍され、次に融解し、ＴＭＡＥ ＨｉＣａｐ捕捉カラムに充填された。
溶出された材料は、０．２μｍフィルターを通され、次にセラミックのヒドロキシアパタイトタイプＩ（ＣＨＴ）カラムに直接充填された。その後、ＣＨＴカラム溶出液は、室温で保持される間に０．２μｍろ過および穏やかな還元処理にさらされた。穏やかな還元処理後の材料は、その後ＴＦＦによってバッファー交換され、０．２μｍでろ過され、−８０℃で凍結保存された。

【0232】

実施形態において、本発明の方法を使用して得られた、精製されたｒＣＳＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって決定された９０％よりも高い純度を有し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された１０％未満の二量体を有し、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出可能な高分子量（ＨＭＷ）凝集体を有さず、ＬＣ／ＭＳによって検出可能な断片を５％未満有し、１００ＥＵ／ｍｇ未満の菌体内毒素を有する。

【0233】

本発明の好ましい実施形態が本明細書中で示され記載されているが、このような実施形態はほんの一例として提供されることが当業者には明らかであろう。当業者は、多くの変更、変化および置換を、本発明から逸脱することなく想到し得るであろう。当然のことながら、本明細書に記載される発明の実施形態に対する様々な代替物が本発明を実行するために用いられてもよい。請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。

【実施例】

【0234】

精製プロセスの工程が特定され、本発明の方法での使用に関し試験された。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析はタンパク質収量および純度を評価するために使用された。タンパク質サンプルは、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ２ ｃｈｉｐ及び対応する試薬 （部品番号 がそれぞれ７６０４９９及び７６０３２８， Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ 装置 （Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ）を使用した ＨＴＰマイクロチップＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）によって分析された。サンプルは、製造社のプロトコル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ Ｎｏ． ４５０５８９， Ｒｅｖ． ３）に従って調製される。

【0235】

精製されたｒＣＳＰサンプルのタンパク濃度は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２８０ｎｍでの吸光度（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって決定される１ｍｇ／ｍｌ＝０．６１ＡＵのＡ_２８０）によって決定することができる。

【0236】

プロセス開発およびアッセイ開発の中で使用される細胞ペーストバッチは、本明細書中に記載されている方法を使用してＣＳＰを発現するように組み換えられた細菌宿主細胞から調製される。細胞ペーストバッチを調製するために使用されたＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ 株によって発現されたＣＳＰヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５として記載されている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として記載されているアミノ酸配列に対応する）、最適化されたヌクレオチド配列を含んでいた。ＣＳ５３３−１２９株は、ＬＡＯ分泌リーダーと融合した、ＣＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をコードした発現ベクターを含むＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４６９（ΔｐｙｒＦ、ｌａｃＩ^Ｑ、ΔｈｔｐＸ）である。ＣＳ５３３−２１１株は、ＣｕｐＡ２リーダーと融合した、ＣＳＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）をコードした発現ベクターを含むＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＣ４８８（ｄｅｇＰ２欠失）である。

【0237】

＜実施例１：組み換えによって生成された熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質の、ｒＣＳＰ二量体から単量体への変換の選択的な還元＞
この実施例には、Ｃ−末端領域の分子内ジスルフィド結合及びＣＳＰ免疫原性に必要な天然の構造を保存する一方、二量体化したｒＣＳＰの分子内ジスルフィド結合を選択的に還元するのに有用である、選択的な還元条件を特定するために行われた実験が記載されている。

【0238】

議論されるように、分子内ジスルフィド結合を形成することができるＮ−末端領域の遊離システインに起因して、ｒＣＳＰは容易に二量体化される。その後、二量体は時間、濃度及び温度に依存して高分子量凝集体を形成する。組み換えＣＳＰは、ＣＳＰの効力に重要だと思われる２つのジスルフィド結合をそのＣ−末端領域にさらに含む。単量体ｒＣＳＰの回収を増加させるために、我々は、分子内ジスルフィド結合を還元し、二量体を単量体に変換する条件を研究した。条件は、Ｃ−末端領域の分子内ジスルフィド結合が還元されないことが要求される。

【0239】

ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は還元剤として試験され、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓ クロマトグラフィー画分からの様々な濃度の二量体化ｒＣＳＰの１ｍＬサンプルに加えられた。サンプルは、室温で磁気撹拌プレートの上で一晩撹拌された。その後、ＲＰ−ＨＰＬＣによってサンプルの単量体および二量体含有量が分析された（図４）。パネルＡは、０．５ｍＭ（最も低い単量体ピーク及び二番目に高い二量体ピークによって示される）、０．１ｍＭ（０．０３ピークと重複する二番目に高い単量体ピーク、二番目に低い二量体ピーク）、０．０３ｍＭ（０．０３ピークと重複する二番目に高い単量体ピーク、最も低い二量体ピーク）及びＤＴＴなし（最も高い単量体ピーク、最も高い二量体ピーク）のＤＴＴ濃度に対応する結果を示す。パネルＢは、０．０１ｍＭ（最も高い単量体ピーク、最も低い二量体ピーク）、０．００３ｍＭ（中程度の単量体ピーク、中程度の二量体ピーク）及びＤＴＴなし（最も低い単量体ピーク、最も高い二量体ピーク）のＤＴＴ濃度に対応する結果を示す。

【0240】

ｒＣＳＰを分析する場合、慣例的に観察されるＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムの３つの特徴がある：単量体形態の主なｒＣＳＰ、主なｒＣＳＰピークの外に引きずるショルダーピーク（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｓｈｏｕｌｄｅｒ ｐｅａｋ ｏｆｆ）、及びｒＣＳＰの二量体形態である主なピークの１．４分後に溶出されるピークである。図４に示されるように、ＤＴＴの追加は一般に二量体の濃度を減少させて、単量体ピークの濃度を増加させた；しかしながら、ＤＴＴ濃度が高すぎた（図４Ａにおける０．５ｍＭ）又は低すぎた（図４Ｂにおける０．００３ ｍＭ）場合、二量体の単量体への変換は最小だった。変換のためのＤＴＴの最良の選択的な還元濃度範囲は、０．０１０−０．０３０ｍＭ ＤＴＴに決定された。

【0241】

実験は、二量体及び二量体のＨＭＷ凝集体を含むｒＣＳＰのバッチを使用して繰り返された。約３ｇのバッチ５３３−１２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定されるような＞９０％純度になるよう、複数サイクルの小規模精製プロセスを使用して生成された。バッチ５３３−１２８はその後凝集していると決定された。２Ｍ尿素の追加は、ＨＭＷ凝集体を壊し、二量体形態にまで分裂させることが観察された（データ未記載）。ＤＴＴは、２Ｍ尿素を含む５３３−１２８の１ｍＬのサンプルに、ｐＨ７．２及び８．０で様々な濃度で加えられ、室温で６時間インキュベートされた。サンプルは室温で磁気撹拌プレート上で６時間撹拌された。
サンプルのＲＰ−ＨＰＬＣ分析は図５に示される。図５Ａおよび図５Ｂにおいて試験に使用されたＤＴＴ濃度は、表５および表６にそれぞれ示される。

【0242】

【表5】

【0243】

【表6】

【0244】

ｐＨ７．２において、変換に最適なＤＴＴ濃度は１２μＭ及び２５μＭであり、ｐＨ８．０における最良の濃度は２５μＭであると決定された。ＤＴＴの最も高い濃度（１０ｍＭ）は、ｐＨ７．２およびｐＨ８．０のサンプルの両方の二量体ピークを完全に減少させ、保持時間の変化を引き起こし（より短い保持時間）、恐らくこれがｒＣＳＰの完全に還元された形態である。

【0245】

行なわれた試験に基づいて、穏やかな還元プロセスの中で使用されるＤＴＴの最適な濃度は２０μＭであると決定された。一晩（１６−１８時間）還元工程を行なうことは、ｒＣＳＰの品質に悪影響を及ぼさなかった。したがって、この工程は最終ＵＦ／ＤＦバッファー交換を始める前の保持時点として使用された。

【0246】

図６は、Ｂｕｔｙｌ ６５０Ｓクロマトグラフィーからの１２０ｍｇ以下の二量体ｒＣＳＰ（ｒＣＳＰバッチ５３３−２４１）を、１６時間２０μＭＤＴＴで処理され、撹拌した例を示す。処置前のバッチは、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析による９２．１％の二量体を含み（図６Ａ）、ＴＦＦによる最終のバッファー交換処置後は９４．２％の単量体を含む。最終的なバッファーで交換された材料は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析され、ＨＭＷ凝集体は観察されなかった（図７）。穏やかな還元方法は非常に強く、塩基性バッファー組成の小さな差によって影響を受けないように見えた。以下に議論されるように、セラミックのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーから溶出する組み換えＣＳＰ二量体画分も、穏やかな還元処置に成功裏にさらされた。

【0247】

詳細に本明細書中に記載されているように、Ｎ末端のシステインが遊離していて、Ｃ末端ジスルフィドが完全な状態だったことを実証するために、穏やかな還元処理にさらされたｒＣＳＰのバッチは、ＬＣ／ＭＳおよびペプチドマッピングによって分析された。

【0248】

＜実施例２：選択的に還元された、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を分析するためのアッセイの開発＞
製造プロセスおよび最終生成物の分析方法は、組み換え熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質を評価するために開発された。これらの方法は、実施例１に記載された又はその他の方法に記載された、選択的な還元条件を使用することによって得られたｒＣＳＰの評価における使用が意図される。

【0249】

＜１．ｒＣＳＰ内部参照基準の精製＞
内部基準として使用されるｒＣＳＰ（バッチ５３３−１９１）の精製は以下のように行なわれた。

【0250】

＜精製のための溶解物の調製＞
培養されたＣＳ５３３−１２９細胞からの凍結された細胞ペースト（７０ｇ以下）を融解し、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０バッファー（１モーラー原液、ｐＨ８．０、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水によって５０倍に希釈された１ＭＴＲＩＳストック、カタログ番号Ｔ１０８０、Ｔｅｋｎｏｖａ， Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ， ＣＡ）にプロテアーゼ阻害剤を入れずに再懸濁し、１５，０００ ｐｓｉのＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ Ｍ−１１０Ｙに一度通すことで均質化した。溶解物は１２，０００ｇで６０分間遠心分離され、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ ０．４５／０．２ μｍ ｆｉｌｔｅｒ ｃａｐｓｕｌｅ （カタログ番号 ５２３５３０７Ｈ８−０−Ａ， Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ， Ｂｏｈｅｍｉａ， ＮＹ）を通すことでろ過された。ろ過された溶解物は、８．０Ｍ尿素原液（カタログ番号４２０３−０８、ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）を使用して、２．０Ｍ尿素に調節された。

【0251】

＜クロマトグラフィー＞
高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）操作は、Ｆｒａｃ−９５０ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを装備したＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ） を使用して行なわれた。３０ｍｇの精製されたＣＳＰを調製するために使用された精製ランの条件は、以下の表７に要約される。使用された材料：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（カタログ番号１７−０５１０−０１， ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）；ＡＫ２６／２０カラム（部品番号２８−９８８９−４８、ＧＥヘルスケア）；Ｂｕｔｙｌ６５０Ｓ（カタログ番号、ＴｏｓｏｈＵＳＡ、Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＪ １４７０１）；ＮａＣｌ（カタログ番号１３４２３、Ｓｉｇｍａ／Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；ＮａＯＨ（カタログ番号５６７４−０３、 ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）；硫酸アンモニウム（カタログ番号ＢＤＨ９００１、ＶＷＲ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）；及び尿素（カタログ番号４２０３−０８、ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）。

【0252】

【表7-1】

【0253】

【表7-2】

【0254】

＜ｒＣＳＰ二量体の単量体への変換＞
バッファーに二量化したＣＳＰを包含している疎水性相互作用クロマトグラフィー溶出画分［溶出バッファー：２Ｍ尿素、２００−６００ｍＭ硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ ８．０］は、２００−６００ ｍＬの最終的な体積にプールされた。プールは、２０μＭの最終濃度のジチオスレイトール還元剤（ＪＴ Ｂａｋｅｒ， ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ ＪＴ−Ｆ７８０−２， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）を加え、マグネティックスターラ―バー及び撹拌プレートで１２−２４時間室温で撹拌することで選択的な還元にさらされた。代替的に、ＰＢＳ中の凝集したｒＣＳＰ（例えばバッチ５３３−１２８）は、選択的な還元を行う前に最初に２Ｍ尿素を材料に加えることで同じプロセスにさらされた。
あるいは、ＰＢＳ（例えばバッチ５３３−１２８）内での凝集のｒＣＳＰは、減胎手術を受ける前に材料にまず２Ｍの尿素を加えることにより、同じプロセスにさらされた。

【0255】

＜最終バッファー交換＞
穏やかに還元されたｒＣＳＰプールは、脱塩クロマトグラフィー（ＰＤ−１０カラム、カタログ番号１７−０８５１−０１、ＧＥヘルスケア）により、１×ＰＢＳバッファーに交換された。より大規模な調製について、選択的に還元されたｒＣＳＰプールは、タンジェンシャルフローろ過によって１×ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｐ０１９１、２０ｘ濃度）で透析された。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬ（１０ｋＤａ、５０ ｃｍ^２）およびＰｅｌｌｉｃｏｎ ２（５ｋＤａ、０．１ｍ^２および１０ｋＤａ、５０ｃｍ^２および０．１ ｍ^２）再生セルロース薄膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）が、バッファー交換中にＣＳＰを保持するために使用された。ＦｉｌｔｅｒＴｅｃおよびＳｃｉＰｒｅｓ（Ｓｃｉｌｏｇ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ユニットは、膜内外の圧力（ＴＭＰ）を集め、且つバランスからマスデータを行き渡らせるために使用された。ＦｉｌｔｅｒＴｅｃまたはＭａｓｔｅｒｆｌｅｘのＬ／Ｓ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ）ぜん動ポンプが、残余物の再循環に使用された。ポリプロピレンとＰＥＴＧの容器が、混合と再循環の容器として使用された。Ｔｙｇｏｎ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）および白金で硬化したシリコーン（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ； ＡｄｖａｎｔａＰｕｒｅ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＰＡ）管類は、流体の流れを方向づけるために使用された。充填（穏やかに還元されたＣＳＰ）および残余物（透析した充填量）は、Ｍｉｌｌｉｐａｋ Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標） Ｐ（Ａｕｂａｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）滅菌用０．２２μｍ薄膜でろ過された。

【0256】

薄膜は生成物の導入前に１×ＰＢＳで平衡化された。選択的に還元されたＣＳＰを、室温（２１−２３℃）で１平方メートルあたり１時間３２４リットル（ＬＭＨ）及び６４８ＬＭＨで薄膜を通して再循環させた。それぞれ１０ｋＤａ及び５ｋＤａ薄膜上にある一方で、１０−１５ｐｓｉ及び２１−２４ｐｓｉのＴＭＰを残余物に適用した。一定容量の透析を６残余物容量（透析用量）について行った。質量充填比（標的÷薄膜領域）は、２．６−１４．６ｇ／ｍ^２だった。１つの実験において、３透析容量の後、残余物は２倍に濃縮され、さらに３透析容量の透析を行った。残余物はマグネティックスターラ―バーおよび撹拌プレートで混合された。薄膜は、０．１Ｎ ＮａＯＨを室温で≧６０分間再循環させることで浄化された。薄膜の再生は、標準化された透水性測定によって確認された。

【0257】

方法の開発に伴って、この材料の様々な再生されたバッチが分析され、以下の複数のセクションで議論される。

【0258】

２．ＨＰＬＣ
＜逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）＞
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）方法は、ｒＣＳＰ単量体および二量体の含有量、切断、脱アミドおよび酸化を評価するために開発された。

【0259】

分離は、オートサンプラー、クォートナリポンプ及び複数波長（ＵＶ−ｖｉｓ）検出モジュールを装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ） 上で行われた。移動相試薬は、分析用グレードまたは利用可能な最良のものだった。使用されるアセトニトリルは、ＨＰＬＣグレード（Ｊ．Ｔ． Ｂａｋｅｒ， Ｂａｋｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｄ（登録商標） ＨＰＬＣ ｓｏｌｖｅｎｔ， ≧９９．９％， カタログ番号９０１７−３３）だった。ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）がＰｉｅｒｃｅ（カタログ番号２８９０４）から得られた。イオン置換水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して得られ、使用前にＰＥＳフィルターユニット、１０００ｍｌ、９０ｍｍ、０．２μｍろ過滅菌装置（Ｎａｌｇｅｎｅ、カタログ番号５６７−００２０）でろ過された。移動相Ａは水（ｖ／ｖ）に０．１％ＴＦＡを含んでいた；溶媒Ｂはアセトニトリル（ｖ／ｖ）に０．１％ＴＦＡを含んでいた。サンプルは、ＰＢＳ，ｐＨ７．２（カタログ番号１４２００，ＧＩＢＣＯ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈され、ガードカートリッジ（ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ，４×３ｍｍ，カタログ番号ＫＪＯ−４２８２）を装備したＪｕｐｉｔｅｒ Ｃ_４（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，部品番号００Ｇ−４１６７−Ｅ０）カラム（３００Ａ孔径，５μｍ粒径，４．６×２５０ｍｍ）に３０−６０μｌを注入した。勾配条件は２０分で２２％−３２％移動Ｂだった。カラム温度は５０℃だった。流速は１ｍｌ／分だった。検出は２１４ｎｍおよび２８０ｎｍだった。

【0260】

図８に示されているのは、ｒＣＳＰの二量体及び単量体の形態を決定するための製造プロセスのサンプルの分析である。調製用疎水性クロマトグラフィーは、ｒＣＳＰの単量体及び二量体形態を決定し、還元又は非還元ＳＤＳ−ＣＧＥ分析によって決定した（図８Ａ−Ｃ）。ＲＰ−ＨＰＬＣによる単離形態の分析は、上記の単量体及び二量体の混合物と一貫性のある、異なる保持時間の単一のピークを示した（図８Ｄ）。

【0261】

＜サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）＞
ＳＥ−ＨＰＬＣ方法は、凝集種を特定し、且つｒＣＳＰの球状構造を分析するために開発された。

【0262】

サイズ排除クロマトグラフィーは、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔテクノロジーズ社）に装備をされた、Ｇｕａｒｄ ＴＳＫｇｅｌ ＳＷ_ＸＬ（Ｔｏｓｏｈ、カタログ番号８５４３）を備えたＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ_ＸＬ、７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５ミクロン（Ｔｏｓｏｈ、カタログ番号８５４１）上で行った。移動相は、ＭｉｌｌｉＱ水で１０倍濃縮（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、カタログ番号４６−０１３−ＣＭ）から希釈されたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４であり、使用前にＰＥＳフィルターユニット、１０００ｍｌ、９０ｍｍ、０．２μｍろ過滅菌装置（Ｎａｌｇｅｎｅ（カタログ番号５６７−００２０））でろ過した。流量は０．５ｍｌ・ｍｉｎ−１だった；注入体積は５０−１００μｌだった；及び吸光度は２８０ｎｍでモニターされた。

【0263】

図９Ａは、最良の性能を提供するＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを使用した、ｒＣＳＰのＳＥクロマトグラムを示す。サイズ排除は、より大きなタンパク質がより小さなタンパク質よりも早く溶出されるという、サイズに基づいてタンパク質を分離する。ｒＣＳＰの分子量（３８ｋＤａ以下）に基づいて、保持時間は観察されたものより長くあるべきである。例えば、６７ｋＤａ以下の分子量（サイズでｒＣＳＰよりも−１．８倍大きい）を有するＢＳＡのような校正標準を同じカラムでクロマトグラフィーにかけると、ｒＣＳＰよりも１．６６分遅い保持時間に溶出された（図１１Ｂ）。これに対する説明の１つは、ｒＣＳＰの高度に拡張した非球状の構造であって、それはＳＥ−ＨＰＬＣのサイズによる分類を誤った方向に導き得る。ｒＣＳＰの分子量は、ＳＥ−ＨＰＬＣと連結した多角レーザー光散乱（ＭＡＬＳ）検出機によって測定され、４２−４６ ｋＤａであるために決定され、これは実際の分子量に近い（図示せず）。ＭＡＬＳによって測定されたＢＳＡの大きさは７０．５ ｋＤａであり、これもまたその分子量に近い。

【0264】

ｒＣＳＰに関する強制分解試験は、品質の低い他の方法によって決定されたサンプルとともに、ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された。図１０に示されるように、ｒＣＳＰの凝集形態が分析された。図１０Ａは、ｒＣＳＰの場合二量体および高分子量（ＨＭＷ）の凝集体を生成する遠心濃縮デバイスを使用して濃縮されたサンプルを示す。図１０Ｂは、高度に凝集していることがわかったｒＣＳＰバッチ５３３−１２８のＳＥ−ＨＰＬＣ分析を示す。

【0265】

３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法はｒＣＳＰ純度および分解フラグメントを分析するために展開された。サンプルはＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， カタログ番号１６１−０７３７）で１：１に希釈され、その後サーモサイクラ―において５分間９５℃で加熱された。サンプルは室温に放置され、次に１８ウェルＢｉｏ−ｒａｄ １０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｂｉｏ ｒａｄ、カタログ番号３４５−０１１２）に充填され、１×ＭＯＰＳバッファー（Ｂｉｏ ｒａｄ、カタログ番号１６１−０７８８）中で２０分間１００Ｖで、続いて２００Ｖで６０分間電気泳動にかけられた。ランニングバッファーはＰＡＧＥ分離の間に１０℃に冷却された。分離の後、ゲルはＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２４５９２）で染色され、脱染色され、デジタル画像装置を使用して撮像された。

【0266】

４． ウエスタンブロット
ウエスタンブロッティング法はｒＣＳＰ純度分解フラグメントをモニターするために展開された。

【0267】

タンパク質は、６０分間１００ＶでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから０．２μｍニトロセルロース薄膜（Ｂｉｏ Ｒａｄ，カタログ番号１６２ ０２３２）に、２０％メタノールとともに１× ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， カタログ番号ＮＰ０００６−１）を使用して転写された。いくつかのサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ前にアルキル化にさらされた。この分析については、還元されたサンプルにヨードアセトアミド（シグマ、ｐ／ｎ Ｉ６１２５）が５ｍＭの最終濃度になるよう過剰に加えられ、室温で３０分間暗い場所でインキュベートした。薄膜は、ＰＢＳ中のＢｌｏｃｋｅｒ（商標）Ｃａｓｅｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，３７５２８）において室温で１時間ブロックされた。検出については、希釈剤が捨てられ、モノクローナル抗−ＰｆＣＳＰの１：２０００希釈を含むより多くの希釈剤が加えられた。ブロットは４℃で一晩振とうしながらインキュベートされた。ブロットはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回それぞれ５分間洗浄され、その後ヤギに由来する１：５０００希釈された抗−マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）−ペルオキシダーゼ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ， １０３０−０５）を含む、より薄い希釈液中で、室温で１時間インキュベートされた。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ Ｍｅｔａｌ Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＡＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ （Ｐｉｅｒｃｅ， ３４０６５）を使用した、室温で１分間の発色現象の前に、ブロットはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ， Ｐ３５６３）で３回それぞれ５分間洗浄された。画像化は、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒで行なわれた。

【0268】

５．バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）
ｒＣＳＰのための結合アッセイは、検出方法としてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して展開された。ＢＬＩは、ｒＣＳＰの構造特異的な抗体及び／又はヘパリンに結合する能力によってフォールディング及び機能をモニターするのに使用することができる。したがって、機能的な結合アッセイは、ｒＣＳＰ立体構造の差異を発見するのに有用であり、活性アッセイとして使用することができる。関連する１つのヘパリン（ここでＣＳＰが肝細胞ヘパリン硫酸塩プロテオグリカン類に結合する機能の一部としてヘパリンに結合し）及び２つの他の関連する構造特異的なモノクローナル抗体という、３つの戦略が展開された。

【0269】

方法：モノクローナル抗ＣＳＰ抗体ＩＧ１２又は４Ｃ２（上で参照されたＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．，２００９に記載されており、この文献はＣＳＰを認識する抗体を単離する方法も記載している）は、抗体に対して２．５：１のモル比であるＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ， カタログ番号２１３４３）を使用した、ＦｏｒｔｅＢｉｏ （Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ） Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｎｏｔｅ： 「Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｎｓｏｒｓ」に記載されている方法でビオチン化された。
Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（カタログ番号３７５０９５、ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍはＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪの１部門である）からのヘパリンは、上記のようにビオチン化された。バイオセンサー（ストレプトアビジンバイオセンサー、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−０００９）は、少なくとも１０分間１×ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０×ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０３２）のＰＢＳ中の１０倍希釈液）中で水和された。センサーは、サンプル希釈剤（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０２８）で希釈された１０μｇ／ｍｌのビオチン化された基質とともに、室温で９０分間充填され、Ｓｉｄｅｋｉｃｋ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）シェーカー／ミキサーで１０００ｒｐｍ又は撹拌せず４℃で一晩放置した。

【0270】

サンプルはサンプル希釈剤または１×ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒのいずれかで希釈された。サンプルと標準は、１００μｌの用量でｈａｌｆ ａｒｅａ ｐｌａｔｅ （Ｅ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， カタログ番号 ＥＫ−７８０７６） に、又は２００μｌを標準サイズ９６−ウェルプレート （Ｅ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， カタログ番号 ＥＫ−２５２０９）に充填された。

【0271】

センサーは５分以下の間１×ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｂｕｆｆｅｒに浸され、次に試験サンプルの適切な総タンパク質濃度を有する空の（ｎｕｌｌ）可溶性画分の希釈液において、Ｓｉｄｅｋｉｃｋ（商標）シェーカー／ミキサーで１０００ｒｐｍ、４０分間予め平衡化（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ）した。サンプルプレートは、アッセイを始める前に、Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩ装置で３０℃、１０分間予め平衡化した。サンプルは１０００ｒｐｍ、３０℃で１８０秒読み込まれ、６４、３２、１６、８、４、２、１および０．５μｇ／ｍｌの基質の標準曲線から量が計算された。

【0272】

結果：ｒＣＳＰ結合のためにヘパリンを使用するバイオセンサー構造が、図１１Ａに示される。それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるｒＣＳＰを発現する細胞から調製された、ｒＣＳＰの３つの調製物（バッチ５３３−０３６、内部参照基準として精製されたバッチ５３３−１９１、及びバッチ５３３−１２８）は、ヘパリン結合のためにアッセイされた。図１１Ｂに示されるのは、様々な濃度でのこれら調製物の結合率の結果である。各サンプル濃度の結合率は、互いに全く異なっていた（図１１Ｂ及びＣ）。

【0273】

６．キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）
キャピラリー等電点電気泳動分析方法は、ｒＣＳＰ電荷不均一性をモニターするために展開された。

【0274】

サンプル調製：サンプルは、２Ｍ尿素（ＪＴ Ｂａｋｅｒ，カタログ番号４２０３−０８）及び１０ｍＭ ＤＴＴ中で２時間インキュベートすることで還元され、次に１０ｋＤａＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ （カタログ番号 ４２４０７）を使用して、＞１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮された。その後３０マイクロリットルのサンプルは、５μｌの４０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、ｐＨ ２．５−５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， カタログ番号１７−０４５１−０１）、５μｌの４０％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ、ｐＨ５−８（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号１７−０４５３−０１）、３５μｌの１％メチルセルロース（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，カタログ番号１０１８７６）、２５μｌの８Ｍ尿素並びにｐＩマーカー４．２２及び６．１４（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ，カタログ番号それぞれ１０２３５０及び１０２２２０）と混合された。

【0275】

方法：捕捉と分析は、ＣＦＲ ソフトウェアバージョン ２．３．６， ｃＩＥＦ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ−ＦＣ ｃｏａｔｉｎｇ （Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， カタログ番号１０１７００）， 及びＰｒｉｎＣＥ ＭｉｃｒｏＩｎｊｅｃｔｏｒ （Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｓ／ｎ ５４−２０−０７−４−０４８）を装備したｉＣＥ２８０アナライザー（Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｃａｎａｄａ， Ｓ／Ｎ １３４８）で行われた。以下のアナライザー設定が使用された：焦点時点１＝１．０分間１５００Ｖ；焦点時点２＝７．０分間３０００Ｖ；
サンプル転送時間＝１３５秒；洗浄時間＝０秒；平均スキャン＝１６；露光時間＝７３ミリ秒；脱塩電流（Ｄｅｓａｌｔ Ｃｕｒｒｅｎｔ）＝１０１μＡＭＰ；転送時間の遅れ＝０．０分；検出＝２８０ｎｍ。

【0276】

ｐＩマーカーの校正はｉＣＥソフトウェアで行われ、次にデータの変換及び処理はＣｈｒｏｍＰｅｒｆｅｃｔ バージョン５．５．６で行われた。電解槽試薬は０．１％メチルセルロース中に０．０８％リン酸、及び０．１％メチルセルロース中の０．１Ｍ水酸化ナトリウム（両方の試薬はＳｉｍｐｌｅＰｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔの一部、部品番号１０２５０６）を含む。

【0277】

ｒＣＳＰの電荷不均一性を分析する方法は、ｃＩＥＦを使用して展開され、結果は図１２に示される。内部標準ｒＣＳＰバッチ５３３−１９１は、ｐＩ５．２０及び５．７６で主なピークを示し、ｐＩ４．９９、５．０８及び５．５２でより小さなピークを示した（図１２Ａ）。主要なアミノ酸配列に基づいて算出されたｐＩは、ｐＩ ５．２１だった。より低いｐＩピークは、恐らく負の電荷を作りｐＩを低下させた、ｒＣＳＰ中のアスパラギン残基の脱アミド化によるものである。

【0278】

７．円偏光二色性および固有蛍光
円偏光二色性（ＣＤ）方法がｒＣＳＰのために展開された。１８５−２５０ｎｍからの遠紫外線ＣＤ領域は、二次構造の差異（すなわちα−へリックス、β−シートおよびランダムコイル）をモニターする。固有蛍光は三次構造の差異をモニターするために評価された。

【0279】

方法：遠紫外線ＣＤ分光（２４０−１９０ｎｍ）は、０．１ｍｍ光路長キュベットを使用して、バンド幅が１ｍｍに、スキャン速度が１００ｎｍ／分に、デジタル集積時間（ＤＩＴ）＝１秒に設定され、５×蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ）を備えたＪａｓｃｏ Ｊ−８１５分光偏光計（ＪＡＳＣＯ）上で行うことができる。サンプルは、２０℃で×５ｍＭトリス （Ｓｉｇｍａ， カタログ番号Ｔ７８１８−２５０Ｇ）／１６．７ｍＭ硫酸ナトリウム （Ｓｉｇｍａ， カタログ番号Ｓ９６２７−５００Ｇ） 、ｐＨ７．５バッファー中で分析され得る。

【0280】

結果：図１３Ａは、リン酸緩衝生理食塩水中で０．３７ｍｇ／ｍＬのｒＣＳＰ参照材料のＣＤ線スペクトルを示す。ＣＤスペクトルは、他に顕著な最小又は最大を示すことなく２００ｎｍで最少を示した。これらの特徴は、アルファヘリックスの低い割合を示唆する。分析は、Ｋ２Ｄ２ソフトウェアを使用して行われ、８％のアルファヘリックスおよび２９％のベータス鎖との結果を示した（図１６Ｂ）。最大の誤差は０．２３だった。これらの値は、文献で報告された結果（例えばＰｌａｓｓｍｅｙｅｒ， Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ， ａ Ｌｅａｄｉｎｇ Ｍａｌａｒｉａ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ， ＪＢＣ ２８４ （３９）： ２６９５１−２６９６３における５％アルファへリックス及び２７％ベータ鎖）と一致する。

【0281】

ｒＣＳＰの螢光スペクトルは、参照基準５３３−１９１のために測定された。分析のための最初の温度設定は２０℃で、次に段階的に４０および７５℃に上り、その後２０℃に戻る。螢光スペクトルは各温度設定で読み込まれた。発光の最大値は３４０ｎｍで、温度の上昇とともに著しく変わらなかった。しかしながら、ベースラインは明らかでない理由で上った。発光の最大値における強度は、変性によって７５℃で著しく低下した。２０℃に戻る際、発光強度は最初の読み込みよりも高いレベルに戻っており、これはベースラインの上方向への変化が原因かもしれない。

【0282】

８．質量分析
＜ＬＣ−ＭＳによる完全な状態の（ｉｎｔａｃｔ）質量分析＞
方法：調製物５３３−１９１は完全な状態の質量分析にさらされた。完全な状態の質量分析は、タンパク質分解を生ずる切断（例えばＮ末端の脱アミド、酸化および切断）をモニターするのに有用である。このサンプルは、非還元及び還元条件下でＬＣ−ＭＳによって分析された。

【0283】

結果：還元分析のため、精製された５３３サンプルは等量のＵＴＤバッファー（７．２Ｍ尿素、１００ｍＭトリス、ｐＨ７、１００ｍＭ ＤＴＴ）と混合された。その後、還元されたサンプルは、分析前に３０分間３７℃で加熱された。非還元分析のために、サンプルはきちんと実行された（ｒｕｎ ｎｅａｔ）。アルキル化されたサンプルについては、以下を参照されたい。サンプル（１０μｇ）は、相互に連結したオートサンプラー、カラムヒーター、ＵＶ検出器及び電子噴霧インターフェイスを有するＱ−Ｔｏｆｍｉｃｒｏ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ （Ｗａｔｅｒｓ）と連結したＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）を使用したＬＣ−ＭＳ分析にさらされた。実行前に、質量分析計はＮａＣｓＩを使用して６００−２６００ｍ／ｚで校正された。ガードカラム （Ｚｏｒｂａｘ ５ μｍ， ３００ＳＢ−ＣＮ， ４．６ ｘ １２．５ ｍｍ， Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｐ／Ｎ ８２０９５０−９２３）とともに固定されたＣＮカラム（Ｚｏｒｂａｘ ５ μｍ， ３００ＳＢ−ＣＮ， ２．１× １５０ ｍｍ， Ａｇｉｌｅｎｔ， Ｐ／Ｎ ８８３７５０−９０５）は、５０℃で分離に使用された。使用されたＨＰＬＣバッファーは、バッファーＡ（０．１％ギ酸）およびバッファーＢ（９０％アセトニトリル、０．１％ギ酸）だった。開発された新しい方法において、５％Ｂにおけるサンプル注入後、カラムは５％から３０％Ｂの１７分勾配で直ちに展開され、その後５分間１００％Ｂに達し、５分間の５％Ｂで終了した。流速は０．３ｍｌ／ｍｉｎであり、流れはサンプル脱塩を可能にするためにＭＳ切り替え弁を用いて最初の１０分間は廃棄に転換した。５３３標的タンパク質（ＣＳＰ）は１７．９分までに溶出された。

【0284】

ＵＶ吸光度はＭＳ前に１８０−５００ｎｍから回収された。ＥＳＩ−ＭＳ源は２．５ｋＶの陽性モードで使用された。ＭＳスキャンは、毎秒２回のスキャンで様々な６００−２６００ｍ／ｚを使用して行われた。ＭＳとＵＶのデータはＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して分析された。ＵＶクロマトグラムおよびＭＳ総イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムが生成された。標的ピークのＭＳスペクトルが合計された。合計されたスペクトルは、チャネルごとに１Ｄａの解像度及び０．２５Ｄａのガウシアン幅を有する、１０，０００−８０，０００の範囲の分子量をスキャンするＭａｘＥｎｔ １ （Ｗａｔｅｒｓ）を使用してデコンボリュートされた。完全に処理された５３３の理論上のＭＷは、還元及び非還元においてそれぞれ３８７２５．０Ｄａ及び３８７２１．０Ｄａに決定された。

【0285】

観察されたＭＷと理論上のＭＷの差（デルタＭＷ）は還元及び非還元サンプルにおいてそれぞれ１及び４Ｄａだった。これは５０００の解像度を有する装置を使用したこのサイズのタンパク質分析における４Ｄａ＋／−４Ｄａの予期された質量精度内である。装置の質量正確性の限界に起因し、完全な状態の質量分析のみによってジスルフィド結合形成の状態を決定することはできない。この分析の結果を図１４に示す。

【0286】

＜完全な状態の質量分析の前のシステインアルキル化＞
ジスルフィド結合形成の状態を研究するために、調製物５３３−１９１はシステインアルキル化試験にさらされた。

【0287】

方法：精製された５３３−１９１のサンプルは、天然タンパク質中の遊離システインの分析用のアルキル化にさらされた。この分析において、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ，ｐ／ｎ Ｉ６１２５）は、天然の還元されていない５３３サンプルに最終濃度５ｍＭで加えられ、暗い部屋で３０分間室温でインキュベートされた。その反応は、その後完全な状態での質量分析のためにＰＢＳ中で、又はサイズ排除スピンカラム（０．７ｍｌ，Ｐｉｅｒｃｅ，ｐ／ｎ ８９８４９）を使用した消化のために２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中で脱塩された。

【0288】

精製された５３３−１９１のサンプルも、すべてのジスルフィド結合の変性および完全な還元の後にすべてのシステインのアルキル化にさらされた。変性及び還元サンプルのアルキル化において、尿素は最終濃度２Ｍとなるように加えられ、ＤＴＴは最終濃度１０ｍＭになるように加えられ、サンプルは３７℃で３０分間インキュベートされた。次に、ヨードアセトアミドが最終濃度３０ｍＭになるよう加えられ、暗い中室温で３０分間インキュベートされた。その後、完全な状態の質量分析または消化のために、サンプルは上記のように脱塩された。

【0289】

結果：ヨードアセトアミドは上記のように非還元及び還元されたサンプルの両方に加えられた。これらのサンプルはＬＣ−ＭＳによる完全な状態での質量分析にさらされ、結果は図１５に示される。還元されずアルキル化されたサンプルについては、観察された質量は１つのシステインアルキル化を含む５３３−１９１と一致する（図１５Ａ）。Ｎ−末端システインはアルキル化されていると思われるが、この実験ではどのシステインが実際にアルキル化されているのか確認できなかった。還元されアルキル化されたサンプルの分析は、５３３−１９１が完全に還元された場合、５つのシステイン全てがアルキル化されたことを示した（図１５Ｂ）。

【0290】

アルキル化された還元されていない５３３−１９１は、１つのシステインアルキル化を有する５３３の理論上のＭＷと比較して６．０Ｄａのデルタを有することが観察された。アルキル化され還元された５３３−１９１は、５つのシステインアルキル化を有する５３３の理論上のＭＷと比較して３．９Ｄａのデルタを有することが観察された。４つのシステインアルキル化を有する５３３と相関するさらなる種があり、全存在量の４３％以下で存在していた。この観察結果は、不完全なアルキル化が原因である可能性がもっとも高かった。

【0291】

＜アルキル化とペプチドマッピングによる遊離Ｎ末端のシステインの識別＞
ペプチドマッピング分析方法は、ｒＣＳＰ微不均一性を評価し、且つｒＣＳＰのＮ末端領域の利用可能なシステインを識別するために展開された。

【0292】

方法：天然の、非還元−アルキル化及び還元−アルキル化された５３３サンプルは、上記のように２５ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３中で脱塩された。個々の消化について、脱塩されたサンプルの５−２０μｇが異なるプロテアーゼで消化された。トリプシン（Ｓｉｇｍａ， プロテオミクスグレード， ｐ／ｎ Ｔ６５６７）およびＧｌｕ−Ｃ（Ｒｏｃｈｅ、シーケンシンググレード、ｐ／ｎ １１４２０３９９００１）消化については、各プロテアーゼはそれぞれ１：５０（ｗｔ：ｗｔ）（酵素：基質）で加えられ、３７℃で一晩インキュベートした。
トリプシンとエラスターゼの二重消化も実行された。最初に、サンプルは上記のようにトリプシンで消化された。トリプシン消化の後、エラスターゼ（Ｓｉｇｍａ、ＩＶ型、ｐ／ｎ Ｅ０２５８）は異なる比率（１：２０、１：１００および１：５００）で加えられ、３７℃で７時間インキュベートされた。上記の消化はすべて、最終濃度１−５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のギ酸の追加で停止された。

【0293】

２μｇの各消化が下記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにさらされた。実行前に、質量分析計はＮａＣｓＩを使用して２００−２０００ｍ／ｚが校正された。分離にＣ１８カラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢ Ｃ１８，２．１×２５０ｍｍ，５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ，部品番号８８１７５０−９０２）を使用したことを除いて、上記のＬＣ−ＭＳのセットアップが消化の分析に使用された。カラムは以下のＬＣ部品で展開された：５％Ｂで１０分間、５０分間の５−４０％Ｂの勾配、２０分間の４０−６０％Ｂの勾配、５分間の１００％Ｂ、及び５分間の５％Ｂ；０．３ｍｌ・ｍｉｎ−１、５０℃で実行。ＵＶ吸光度は、ＭＳの前に１８０−５００ｎｍから回収された。ＭＳ源は、２．５ｋＶで陽性モード中に使用された。調査ＭＳスキャン及び後に続くデータから独立したＭＳ／ＭＳスキャンを含むＭＳ／ＭＳスキャン戦略が使用された。スキャンは、１００−２０００ｍ／ｚの範囲および０．５秒のスキャン時間を使用して実行された；調査スキャンは６Ｖの衝突エネルギーであり、データから独立したＭＳ／ＭＳスキャンは２８Ｖだった。捕捉後、それぞれの生ファイルは、特定の保持時間で以前観察された特定のペプチドを使用して基準物質（ｌｏｃｋ−ｍａｓｓ）による校正を行った。

【0294】

ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）はＬＣ−ＭＳ／ＭＳの結果を分析するために使用された。個別のトリプシンＡｓｐ−ＮおよびＧｌｕ−Ｃ消化のために、以下のパラメーターが使用された：６０ｐｐｍ質量耐性、２つの誤った開裂（ｍｉｓｓｅｄ−ｃｌｅａｖａｇｅｓ）の許容、および半特異性（ペプチドの１つの末端が非特異性であることを許容した）；Ａｓｐ−ＮおよびＧｌｕ−Ｃは、Ａｓｐ−およびグルタミン酸の両方で開裂を有することが許容された（特異性の観点から）。配列包括度（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の測定のために、２％強度フィルターが使用され（すなわち、識別されたとみなすためには、ペプチドイオンは強度が最も高い強度で識別されたペプチドイオンの強度の２％より大きくなければならない）、さらにＮとＱの脱アミドが可変性のために探索された。還元されていない消化について、５３３（Ｃ_３１４−Ｃ_３４９およびＣ_３１８−Ｃ_３５４）の予期されたジスルフィド結合は、単量体調製の研究に使用され；例えば二量化を捜す場合、５３３配列の２つのコピーが加えられ、上記のジスルフィド結合が使用され、さらにＣ_５−Ｃ_５分子間にあるジスルフィド結合が方法ファイルに加えられた。還元されアルキル化された消化について、システインの固定された修飾（カルバミドメチル−Ｃｙｓ）は、タンパク質配列中の任意のジスルフィド結合なしで探索に使用された。還元されずアルキル化されたサンプルについて、システインの可変的なアルキル化はタンパク質配列の任意のジスルフィド結合なしで探索に使用された。二重消化（トリプシンとエラスターゼ）のサンプルについて、１００ｐｐｍおよび酵素特異性は探索に使用されなかった。２つのジスルフィド結合とのタンパク質配列全体の非特異的な探索は、終了するのに異常に時間がかかり、非実用的なものにしている。したがって、２つのジスルフィド結合を構築する４つのシステインを包含する５３３配列の３つの短い部分のみが使用された。これらの配列はアミノ酸３０３−３２５、３４８−３５０および３５４−３６２からなり、トリプシン作用のジスルフィド−結合トリペプチドを構築するペプチド配列である。これらの配列は方法ファイル中に個別のタンパク質配列として加えられ、上記の正確なジスルフィド結合が使用された。

【0295】

結果：ペプチドマッピングは、前述のアルキル化された還元されていない５３３−１９１サンプルのどのシステインがアルキル化されているかを決定するために実行された。生成されるペプチド（Ｅ２）のＮ−末端ペプチド近傍のサイズが適切であるため、Ｇｌｕ−Ｃがプロテアーゼとして使用された。このペプチドは、予期された遊離システインである第１のシステイン（Ｃ_５）を包含する。消化されたサンプルは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析にさらされた。アルキル化されたＥ２ペプチドは、方法のセクションに記載されているＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘソフトウェアを使用して識別された（図１６Ａ）。このペプチドは、識別された最も強度の高いペプチドの１つであり、２２ｂ−及びｙ−イオンを有することが確認された（データ未記載）。Ｇｌｕ−Ｃ消化も、第二及び第三のシステイン（Ｃ_３１４及びＣ_３１８）を含むＥ１８及び第五のシステインを含むＥ２３（Ｃ_３５４）の２つの他の非常に目立つペプチドを生成し得る。これらの２つのペプチドは、完全に還元されアルキル化されたサンプルにおいて高い強度で観察することができる。しかしながら、これらのペプチドは、還元されずアルキル化されたサンプル５３３−１９１の前述の分析での有意水準で識別されなかった。これは、これらのペプチド中のシステインが主としてジスルフィド結合に関係することを示唆する。最後に、我々は同じサンプル中のＣ５とＣ５の分子間にあるジスルフィド結合を識別することを試みた。ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘは同じデータを探索するために使用されたが、Ｃ１によって５３３の２つのコピー間のジスルフィド結合を可能にしていた。このジスルフィド−結合ジペプチド（Ｅ１−Ｅ２：Ｅ１−Ｅ２）は、この研究で識別された（図１６Ｂ）。Ｅ１−Ｅ２はペプチド中のグルタミン酸残基における誤った開裂を示している。この場合、誤った開裂は、隣接したジスルフィド結合によって引き起こされたプロテアーゼの制限された接近（ａｃｃｅｓｓ）によるかもしれない。これは、この調製物における二量体は単量体と比較して少数成分であることを示す他のデータ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ）と一致して、低強度イオンだった。要するに、還元されずアルキル化された５３３−１９１のＧｌｕ−Ｃ分析は、近いＮ末端システイン（Ｃ_５）が唯一の遊離システインで、これが５３３−１９１の主要な形態だったことを示唆した。したがって、選択的な還元方法は、分子内のジスルフィド結合ではなくＣ_５−Ｃ_５の分子間にあるジスルフィド結合のみを還元するように見えた。

【0296】

＜ペプチドマッピングによるジスルフィド結合分析＞
Ｐｆｅｎｅｘが製造した５３３中のジスルフィド結合の性質は、ペプチドマッピングによって分析された。５３３−１２８は連続する二重消化にさらされ、最初にトリプシン、その後エラスターゼにさらされた。エラスターゼ消化は３つの異なる酵素：基質の比で試験された。すべての二重消化はＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析され、結果として生じるデータはＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘを使用して処理された。まず、予期されたジスルフィド結合（Ｃ３１４−Ｃ３４９およびＣ_３１８−Ｃ_３５４）は、探索パラメーターに含まれていた。その結果、多数のジスルフィド−結合ジペプチドが３つの二重消化すべてにおいて識別された。両方のジスルフィド結合を構築するこれら２つのジペプチドは、表８に示される。陰性対照の手順として、上記のジスルフィド結合（Ｃ_３１４−Ｃ_３５４及びＣ_３１８−Ｃ_３４９）の逆（又は誤った）を含む方法ファイルを用いて同じデータが処理された。この探索から、いくつかのジスルフィド−結合ジペプチドが識別された。しかしながら、これらの識別は、正しいジスルフィド結合を使用した以前の探索と比較して、イオン強度、デルタ質量およびｂ／ｙフラグメントイオンに関して著しく低い品質だった（データ未記載）。要するに二重消化からデータは、５３３−１２８の主要な形態又は可能な唯一の形態は予期されたジスルフィド結合（Ｃ_３１４−Ｃ_３４９及びＣ_３１８−Ｃ_３５４）を含むことを示唆した。

【0297】

【表8】

【0298】

＜完全なアミノ酸配列包括度＞
ペプチドマッピングによる完全なアミノ酸配列包括度について、多数のプロテアーゼが還元されたアルキル化されたサンプル（５３３−１２８）上で試験された。各消化はＬＣ−ＭＳ／ＭＳにさらされ、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘによって分析された。Ａｓｐ−Ｎおよびトリプシン（またはＬｙｓ−Ｃ）消化からデータを組み合わせることで、最良の結果が得られた。図１７Ａ中に示されるのは、Ａｓｐ−Ｎで達成された配列包括度は７５．４％だったことである。図１７Ｂ中に示されるトリプシンについて、達成された配列包括度は５６．９％だった。これらの分析の各々で識別されたペプチドは、表９および１０にそれぞれ示される。Ａｓｐ−Ｎおよびトリプシン消化用の関連するＬＣ−ＭＳクロマトグラムは、図１７Ｃおよび１７Ｄでそれぞれ示される。Ｌｙｓ−Ｃの配列包括度は６６．９％だった（データ未記載）。Ａｓｐ−Ｎおよびトリプシン／Ｌｙｓ−Ｃ消化からの結果を組み合わせることにより達成された配列包括度は、１００％未満である。これはＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘの大きなペプチドを識別する障害による。５３３の大きな反復領域により、Ａｓｐ−Ｎから期待された２つのペプチドはアミノ酸１０７−１７８と１７９−２６７である。これらの２つのペプチドの理論上の分子量はそれぞれ７，１７８．２ｄａおよび８，９７１．２ｄａである。手動で生データを試験することによって、我々は、Ａｓｐ−Ｎ消化のクロマトグラムにおいて両方のペプチドを観察した。これらのペプチドは質量分析機（ＭａｘＥｎｔ１を使用して）によって識別され、それぞれ３０．５および２９．１分で溶出された。それぞれのピークからデコンボリュートされたスペクトルは、図１８に示される。要するに、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘを使用した自動処理および手動処理を組み合わせることで、Ａｓｐ−Ｎ及びトリプシン／Ｌｙｓ−Ｃタンパク質消化は１００％の配列包括度を可能にした。

【0299】

【表9】

【0300】

表９は、出現順に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９−３４、３４−４８、４７−５０、５０−５９、５９−６６および６６−７６をそれぞれ示す。

【0301】

【表10】

【0302】

表１０は、出現順に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７７−７８、７８、７８−７９、７８、８０−８１、８１−８６、８６−９４、９４−１０１、１０１−１０２、１０２−１０３、１０３−１０５および１０４−１０９をそれぞれ示す。

【0303】

９．宿主細胞分析
＜宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）アッセイ＞
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ＥＬＩＳＡは、「Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」 キット（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， カタログ番号Ｆ４５０）を使用して行なわれた。
アッセイは製造社のプロトコルを使用して行なわれた。

【0304】

＜Ｑ−ＰＣＲ宿主細胞ＤＮＡアッセイ＞
宿主細胞ＤＮＡを分析するにあたって、リアルタイム定量的ＰＣＲによってＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＤＮＡの検出のために、ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子および発現プラスミド骨格配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーが設計された。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．によって合成され、リアルタイムＰＣＲはＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＣＦＤ−３２００ Ｏｐｔｉｃｏｎ）を用いて行われた。

【0305】

１０． 菌体内毒素アッセイ
製造社によって提供された操作手順を、１−０．０１ＥＵ／ｍＬ（ＣＨＬ， 部品番号 ＰＴＳ２００１Ｆ）及び１０−０．１ＥＵ／ｍＬ（ＣＨＬ、部品番号ＰＴＳ２０１Ｆ）の感度範囲を有するカートリッジを使用して行った後に、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ ｐｏｒｔａｂｌｅ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ａｎａｌｙｚｅｒ （Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＣＨＬ））を使用して溶出画分における菌体内毒素は分析された。

【0306】

＜実施例３：ｒＣＳＰの精製およびｒＣＳＰ二量体の選択的な還元＞
精製された組み換えＣＳＰは、実施例２に記載された結果に基づいて識別された方法を使用して得られ、ここで精製されたｒＣＳＰ二量体は選択的な還元条件にさらされ、単量体に分離された。全ての実験において総プロセス収量の３６％が得られ、ＬＣ−ＭＳによって分解された種は観察されなかった（０％）。

【0307】

概観：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発酵培養液全体（１０リットル）は、主要な回収用の回収容器に移された。発酵培養液全体は、≦２０％固体の均一な供給を達成するためにまず３．１Ｍ尿素、３１ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．２で希釈された。希釈された発酵培養液は、微溶液化によって溶解され、細胞溶解物を生成する。溶解物は２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．２で１：１に希釈され、１０％固体溶解物が作製された。溶解産物中のＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの固体は、ディスクスタック遠心分離および深層ろ過によってｒＣＳＰ−含有バッファーから分離された。ｒＣＳＰ−含有バッファーはその後さらに０．２−μｍろ過され、凍結された。ｒＣＳＰの浄化された細胞抽出物の一部は一度融解され、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製された。ｒＣＳＰ−含有ＡＥＸ溶出液は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡ）によって回収され、さらに精製された。ｒＣＳＰ−含有ＨＡ溶出液は回収され、２−８℃で保存された。一旦ＨＡ溶出液が周囲温度に戻され、０．２−μｍでろ過された後、ｒＣＳＰは選択的な還元条件にさらされた。バッファーに二量化したＣＳＰを包含しているクロマトグラフィー溶出画分は、２００−６００ ｍＬの最終容量にプールされた。プールは、最終濃度２０μＭのジチオスレイトール還元剤（ＪＴ Ｂａｋｅｒ，部品番号ＪＴ−Ｆ７８０−２，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）の追加によって選択的な還元にさらされ、マグネティックスターラ―バー及び撹拌プレートによって、室温で１２−２４時間急速に撹拌された。代替的に、ＰＢＳ中の凝集ｒＣＳＰ（例えばバッチ５３３−１２８）は、選択的な還元を受ける前に、材料にまず２Ｍ尿素を加えることにより、同じプロセスにさらされた。

【0308】

選択的な還元条件にさらされた後に、ｒＣＳＰはＴＦＦによって製剤バッファーへ回収され、透析された。その後透析されたｒＣＳＰは、大量の原薬を産出するために、最終の０．２−μｍフィルターを通してろ過された。

【0309】

２つの統合された精製のための精製の概要が表１１に示される。第一次回収工程は、５００ｇの凍結細胞ペースト上で行なわれ、深層ろ過によって処理され、８％純度を有する約８５％の回収収量だった。その後この材料は、ＴＭＡＥカラム上でクロマトグラフィーにかけられ（ラン５３３−４０２及びラン５３３−４０４）、平均回収率８３％及び７８％純度であった（図１９及び２０）。その後、ＴＭＡＥプールはセラミックヒイドロキシアパタイトＩ型（ラン５３３−４０３及びラン５３３−４０５）を通され、ＳＤＳ−ＣＧＥによる平均回収率６９％および９６％純度だった（図２１及び２２）。その後ＣＨＴ材料は、穏やかな還元プロセスさらされ、ＴＦＦによってＰＢＳにバッファー交換され、ＳＤＳ−ＣＧＥによる収量が７５％以下で最終純度は９６％であった。ｒＣＳＰ濃度はバッチ５３３−４０６および５３３−４０７についてそれぞれ２８０ｎｍの吸光度によって１．０ｍｇ／ｍｌおよび１．２ｍｇ／ｍｌであると決定された（表１１）。その後、以下に議論されるように、精製されたｒＣＳＰ（バッチ５３３−４０６および５３３−４０７）は等分され、追加の分析および特徴付けのために８０℃で保存された。両方の統合ランのための総精製収量は、精製工程の初期段階に対しておよそ１０倍の改善を示し、およそ３６％だった。例えば、陰イオン交換を使用したプロセスの初期段階は、その後疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い、小規模（開始材料中のｒＣＳＰを０．５ｇ以下で）で実行され、ＣＳ５３３−１２９の総プロセス容量の３．２％、ＣＳ５３３−２１１の総プロセス容量の６．５％、及びＣＳ５３３−２４９の総プロセス容量の３．１％（ｐｂｐリーダーと融合したＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：３のｒＣＳＰを発現する）を結果としてもたらした。

【0310】

図２３に示されるように、精製された材料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、純度はＳＤＳ−ＣＧＥ（＞９５％純度）と一致していることが決定された。ウエスタンブロット分析は同一性を確認し、低い断片化を示した（図２４）。２つのジスルフィドを包含しているＣ末端領域に高感度な立体構造特異的な抗体（４Ｃ２）は、強力なシグナルを示した（２）。還元されアルキル化されたサンプルは、精製されたｒＣＳＰが正確なジスルフィド構造を有していることを示唆する、シグナルの損失を示した（図２４）。菌体内毒素は両方のバッチにおいて＜１０ＥＵ／ｍｇだった（表１１）。ＨＣＰ−ＥＬＩＳＡは、両方の精製物の４０００ｐｐｍ以下の宿主タンパク質を測定し（表１１）、これはＳＤＳ−ＣＧＥによって測定された９６％純度と一致している。宿主ＤＮＡ（ゲノム）はＱ−ＰＣＲによって７８−９８ｐｇ／ｍｇであると測定された（表１１）。ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析は、両方の調製物において＜５％の二量体及びＨＭＷ凝集体がないことを示した（図２５及び表１１）。ＲＰ−ＨＰＬＣは、両方の調製物において１１％の二量体（表１１）及び５３３−１９１参照と一致するピークプロファイルを示した（図２６）。完全な状態の質量は、５３３−４０６と５３３−４０７の両方の理論上の分子量と一致し、Ｎ−末端で検出可能な切断はなかった（図２７）。両方の調製物のＧｌｕ−Ｃタンパク質分解を使用するペプチドマッピング分析は、５３３−１９１参照と比較された（図２８）。この分析は、Ｎ末端近傍のシステインが遊離しており、ジスルフィド結合が完全な状態だったことを実証した（図示せず）。調製物の電荷不均一性は、５３３−１９１内部基準プロファイルと一致した（図２９）。ｐＩピーク強度のわずかな差が観察され、これはサンプル濃度の差による。両方の調製物のための遠紫外線ＣＤ分析は参照材料と同様だった（図３０Ａ）。Ｋ２Ｄ２ソフトウェアを使用する分析は、バッチ５３３−４０６について１０％アルファ−へリックス及び２９．０９％のベータ鎖、バッチ５３３−４０７について１０．４５％アルファ−へリックス及び２９．０９％ベータ鎖、並びに５３３−１９１参照についてアルファ−へリックス１０．０４％及びベータ鎖２９．６５％を算出した。両方の調製物用の固有の蛍光スペクトルは参照材料と一致した（図３０Ｂ）。

【0311】

要約すると、統合精製ランからのバッチ５３３−４０６および５３３−４０７は高品質高純度であり、この段階のプロジェクトの分析的な詳細にすべて合っていた。
比較分析は、５３３−１９１参照品と比較した時と同様に、調製物間の最小の差を示した。

【0312】

【表11】

【0313】

【表12】

【0314】

＜実施例４：５リットルの発酵物からのｒＣＳＰ精製＞
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含む発現ベクターを有するＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現株の５リットルの発酵液から精製されたｒＣＳＰを得るために実施例３に記載されているような本発明の精製方法が使用された。Ｎ−末端の分解は５．１％であると決定された。
総プロセス収率は６０％だった。

【0315】

＜実施例５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６によってコードされたｒＣＳＰの精製＞
実施例３で使用されているように、本発明の精製方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６を含む発現ベクターを有するＰ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現株の培養液からｒＣＳＰを得るために使用される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、ｒＣＳＰをコードするＣＳＰヌクレオチド配列を最適化したもので、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３として記載されている。ＣＳＰ遺伝子はｐｂｐ分泌リーダーをコードする配列に融合された。

【0316】

＜実施例６：選択的な還元バッファーで使用される還元剤濃度の最適化＞
実施例１に記載されている一般的な戦略に従って、ｒＣＳＰを変性させることなく二量体から単量体形態に選択的に還元するのに最適な濃度を確認するために、ＤＴＴで行ったように他の還元剤が試験された。

【0317】

試験された他の還元剤は、ＤＴＴ、システイン、グルタチオン、モノチオグリセロール、チオグリコレート、ジチオレイトール、ジチオエリトリトール、アセチルシステイン、２−メルカプトエタノール（Ｂ−メルカプトエタノール）、ＴＣＥＰ−ＨＣｌ（純粋な結晶のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）塩酸塩又は２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）を含む。

【0318】

＜実施例７：還元剤としてのモノチオグリセロールの評価＞
他の還元剤／還元条件は、ｒＣＳＰ単量体の生成を最適化するために評価された。これは、バッファー製剤を試験し、液体形態でｒＣＳＰの安定性をさらに向上させるための手順も含む。試薬は、ｒＣＳＰの分解、二量化および凝集に対するそれらの効果に基づいた活発な単量体としてｒＣＳＰを保存するための性能のために評価された。これらの研究は、ｒＣＳＰがモノチオグリセロールとアルギニンを包含しているＰＢＳバッファーにおいて、４℃で２３日まで、＞８５％単量体含有量で維持されることを示した。

【0319】

アルギニンの安定効果は、アルギニン単独及び還元剤モノチオグリセロールを伴うアルギニンを、ＰＢＳ中のｒＣＳＰサンプルに注入する（ｓｐｉｋｅ ｉｎｔｏ）実験において実証された。さらなる研究において、モノチオグリセロールとアルギニンを包含しているＰＢＳ中への限外ろ過／透析によるバッファー交換後、８０パーセントのｒＣＳＰ単量体含有率が測定された。安定性のこのレベルは、ｒＣＳＰの濃度が１ｍｇ／ｍＬから＞５ｍｇ／ｍＬまでの場合で実証された。一方、マンニトール、モノチオグリセロールおよびアルギニンを包含しているトリスとヒスチジンのバッファーは、総ｒＣＳＰの内およそ１１％の凝集体の形成を示した。

【0320】

化学構造における分子量および差を決定するために、逆相−ＨＰＬＣ溶出画分は、液体クロマトグラフィー／質量分光（ＬＣ／ＭＳ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。これらの研究は、ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出液の一部が、ピログルタミン酸部分を有するｒＣＳＰを包含することを示した。３つのｐＨレベルで１ｍＭモノチオグリセロールおよび１０％ｗ／ｖアルギニンを含むＰＢＳ中の組み換えＣＳＰを比較した研究は、ピログルタミン酸−含有画分は時間がたつにつれ増加し、ピログルタミン酸を包含していなかった天然ｒＣＳＰの画分は減少したことを示した。２１及び２３日後の総ｒＣＳＰの４℃及びｐＨ６．４での安定性レベルは、ｐＨ７．０、２５℃での安定性に匹敵し、安定性は同じ期間の間著しく減少した。

【0321】

これらの研究は、実施例２で内部参照標準のために記載された方法を使用して株ＣＳ５３３−１２９から調製されたｒＣＳＰを使用して行なわれた。全ての方法は別段の定めがない限り実施例２に記載された通りである。

【0322】

＜注入研究（Ｓｐｉｋｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ）＞
活発な単量体としてｒＣＳＰを安定させるために、多くの製剤バッファー賦形剤が、ｒＣＳＰの二量化、凝集および全面的な分解を減少させる又は防ぐそれらの能力のために評価された。

【0323】

＜注入実験１：ｒＣＳＰ安定において還元剤およびアルギニンの効果＞
一連（ｐａｎｅｌ）の還元剤が、ｒＣＳＰ二量体形成を防ぐ有効性に関して試験された。試験された還元剤は、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、Ｌ−システイン、アセチルシステイン、グルタチオンおよびチオグリコレートだった。アルギニンはｒＣＳＰ凝集の速度を減少させるための組み合わせとして各還元剤と結合して試験された。試薬は、１％アルギニンの存在下及び非存在下でｒＣＳＰの個々のサンプル（ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）に６つの還元剤の内１つを注入する小規模安定性試験に使用された。

【0324】

サンプルは室温（２５℃）で３、６、又は１４日間放置され、その後ＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された。実施例２に記載のようにＨＰＬＣを行った。４つの別個のピーク領域が観察された：第１の領域は高分子量（ＨＭＷ）ｒＣＳＰ凝集体を含んでいた；第２のピーク領域はｒＣＳＰ二量体を含んでいた；第３のピーク領域はｒＣＳＰ単量体を含んでいた；最後の溶出されたピーク領域は低分子量分解産物を含んでいた。

【0325】

モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、システインまたはアセチルシステインを注入され、ＰＢＳ中で保持されたｒＣＳＰサンプルは、他の賦形剤で同期間保存されたサンプルと比較して、６日目及び１４日目に、主要な（単量体）ピークにおいてタンパク質を最も高い割合で有し、高分子量（凝集体）ピーク及び低分子量（分解産物）ピークにおいて最も低い割合でタンパク質を有していた（表１２Ａ−Ｃ）。「主要なピーク」カラムはｒＣＳＰ単量体の割合を示す。

【0326】

【表13-1】

【0327】

【表13-2】

【0328】

【表14-1】

【0329】

【表14-2】

【0330】

【表15-1】

【0331】

【表15-2】

【0332】

１％アルギニンのみを注入したサンプルは、３日目及び１４日目において二量体ピーク及び高分子量凝集体ピークのサイズの増加及び単量体ピークのサイズの減少を示した。他の賦形剤とアルギニンの組み合わせも評価された。

【0333】

アルギニンの追加は、３日目及び６日目の単量体の割合に対する効果がほとんどなく、還元剤及びアルギニンは単量体の量が還元剤のみよりも９％から２３％高かった。アルギニンとモノチオグリセロールは、システインとアルギニンよりも２％高く、且つアセチルシステインとアルギニンよりも５％高い材料の量を維持した。

【0334】

＜注入実験２：ｒＣＳＰ安定性へのモノチオグリセロールおよびアルギニンの効果＞
ＭＴＧ及びより広い濃度範囲のアルギニンが注入されたＰＢＳ（ｐＨ７．２）中のｒＣＳＰ安定性を評価するための一連の実験が行われた。サンプルは、３日間又は１２日間ＰＢＳのみ、１ｍＭ ＭＴＧのみ又は１ｍＭ ＭＴＧ及び１、５、１０又は２０％アルギニン中で保持された。タンパク質安定性はＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された。ＭＴＧのみでは、３日目から１２日目において主要な単量体ピークの相対的なサイズが減少し、低分子量ピークの相対的なサイズが増加した。アルギニンの濃度の増加は、結果として主要な単量体ピークの総タンパク質の割合の増加をもたらした。アルギニンの濃縮の増加はまた、各サンプルの低分子量（ＭＷ）ピークが徐々により高い割合になり、高ＭＷピークが徐々により低い割合になる結果をもたらし、これはアルギニンの凝集体形成阻害効果を示している。ＭＴＧ中の全てのサンプルが、二量体ピークにおいて材料がないことを示し、ＰＢＳのみで保持されたサンプルだけが二量体化を示した。

【0335】

【表16】

【0336】

【表17】

【0337】

１０％アルギニンを伴うモノチオグリセロールが、後の濃度及びｐＨ安定性実験における使用のために選択された。２０％アルギニンを含む製剤は、わずかにより良い安定性の結果を示した。試験された賦形剤の製剤のＳＥ−ＨＰＬＣデータは、表１３に要約される。注入実験１及び２からのどのサンプルもＳＤＳ−ＣＧＥにおいて著しい断片化を示さず、全てのサンプルが主なバンドをｒＣＳＰの予期されたＭＷで示した。

【0338】

＜濃度研究＞
１０％アルギニンと１ｍＭ ＭＴＧ中の、５ｍｇ／ｍＬにまで濃縮されたｒＣＳＰの安定性が評価された。１ｍＭ ＭＴＧおよび１０％アルギニンを備えたＰＢＳ、またはＰＢＳのみ中のｒＣＳＰのサンプルは、遠心濃縮器で８倍に濃縮された。ＳＥ−ＨＰＬＣは、開始濃度が０．８ｍｇ／ｍＬで、４℃で１６時間の保持工程があったもの又はなかったもので６．４ｍｇ／ｍＬのサンプルで行われた。ＰＢＳのみでは、単量体は８倍に濃縮した後８６％から５０％まで減少し、濃縮後１６時間の保持を追加すると単量体のピークは２９％に減少した。１０％アルギニンを備えた１ｍＭ ＭＴＧ中のｒＣＳＰのサンプルは、さらに高い安定性を示した。主な単量体ピークは８倍の濃縮とともに８６％から８０％にまで減少し、１６時間の保持で全く減少しなかった。相対的なピークサイズデータは表１４に要約される。これらのデータは、注入研究の結果を裏付けるものであり、５ｍｇ／ｍＬへの濃縮がｒＣＳＰ単量体の急激な減少を起こすことなく達成できることを示した。

【0339】

【表18】

【0340】

＜バッファー交換を使用した非ＰＢＳバッファー＞
４．２％マンニトール、２％アルギニン、１ｍＭ ＭＴＧおよび１０μＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を包含する製剤は、トリスとヒスチジンのバッファー中で試験された（表１５）。これらの実験はｒＣＳＰにおけるバッファー系の安定性効果を試験するために実行された。安定性は、限外ろ過／透析（ＵＦ／ＤＦ）による以下のバッファー交換によって評価された。

【0341】

【表19】

【0342】

実験ＡおよびＢの両方において、セラミックのヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムからの溶出液は穏やかな還元にさらされ、次にＵＦ／ＤＦによって試験賦形剤バッファーへ交換された。ＵＦ／ＤＦプロセスについて、穏やかに還元されたＣＨＴ溶出液は、１．０ｍｇ／ｍＬにまで限外ろ過によって濃縮され、特定の製剤の６透析容量に対して透析された。残余物は、５．０ｍｇ／ｍＬ以下にさらに濃縮され、バッファー系から回収され、０．２２μｍろ過にさらされた。ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析は、両方の賦形剤製剤において、２日間又はより長く保持されたサンプルは１１％の凝集体形成を示した。１０ｍＭトリスベース、４．２％マンニトール、２％アルギニン−ＨＣｌ、１００μＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭモノチオグリセロール、ｐＨ７．５に交換された穏やかに還元されたＣＨＴ溶出液中のタンパク質のＳＥ−ＨＰＬＣデータは、表１６に要約される（ＵＦ１＝０．０時間から−１．０時間、ＤＦ＝１．０時間から４．５時間、ＵＦ２＝４．５時間から５．０時間）。

【0343】

１０ｍＭヒスチジン、４．２％マンニトール、２％アルギニン−ＨＣｌ、１００μＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭモノチオグリセロール、ｐＨ７．０に交換された穏やかに還元されたＣＨＴ溶出液中のタンパク質のＳＥ−ＨＰＬＣデータは、表１７に要約される（ＵＦ１＝０．０時間から１．０時間、ＤＦ＝１．０時間から４．５時間、ＵＦ２＝４．５時間から５．０時間）。

【0344】

【表20-1】

【0345】

【表20-2】

【0346】

【表21】

【0347】

＜ｐＨ安定性研究＞
１×ＰＢＳ、０．５Ｍアルギニンおよび１ｍＭモノチオグリセロールを含む製剤バッファーは、２−８℃および室温（２５℃以下）で２１日間３つの異なるｐＨレベルで試験された。−７０℃で凍結された対照もまた各時点で分析された。サンプルはタンジェンシャルフローろ過によってバッファー交換された。その後、ｒＣＳＰはＵＦ／ＤＦによって１および５ｍｇ／ｍＬまで濃縮され、６Ｎ ＨＣｌで６．４４にｐＨを調節され１ＬにＱＳ’ｄされ（バッチ１、５３３−５５１）、１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．０に調節され１ＬにＱＳ’ｄされ（バッチ２、５３３−５５０）又は１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節され１ＬにＱＳ’ｄされた（バッチ３、５３３−５４９）。時点は、２１４ｎｍのＲＰ−ＨＰＬＣ、および２８０ｎｍのＳＥ−ＨＰＬＣによって分析された。ＳＥ−ＨＰＬＣサンプルは、終了時点で直ちに分析された。ＲＰ−ＨＰＬＣサンプルはそれらの終了時点で−８０℃に凍結され、その後融解して分析された。データはｐＨ ７．０、２５℃、２１日目において得られなかった。

【0348】

ＲＰ−ＨＰＬＣは、３つの異なるｐＨレベル（６．４、７．０及び７．５）のｒＣＳＰ ｐＨ安定性研究サンプルにおいて行われた。これらの試験において分析されたサンプルは、天然のｒＣＳＰを含む主要なピークを示し、この時そのわずかに後に溶出した、上で議論されたようなピログルタミン酸部分を有するｒＣＳＰからなるショルダー（ｓｈｏｕｌｄｅｒ）を示した。天然ＣＳＰピーク及びピログルタミン酸−含有ショルダーの面積の合計が、総ｒＣＳＰを示すクロマトグラムの面積を構成した。およそ１０分のグループ１、主要なピークのすぐ先のグループ２及びピログルタミン酸−含有ショルダーのすぐ後のグループ３の、その他３つのグループのピークが観察された。図３１は、４℃、ｐＨ７．５で保存された１ｍｇ／ｍｌ ｒＣＳＰのＴ０対照安定性サンプルにおいて観察された、グループ１−３の相対的な位置を示す。

【0349】

１ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬのいずれかのｒＣＳＰを含むｐＨ７．５でのサンプル（バッチ３）が、Ｔ＝０で、あるいは４℃又は２５℃のいずれかで保存され、５日目、１４日目又は２１日目にＲＰ−ＨＰＬＣで分析された。継時的な分析が、ｐＨ ７．０（バッチ２）およびｐＨ ６．４（バッチ１）のサンプルにおいて同じ方法で行なわれた。３つ全てのｐＨレベルで、天然ＣＳＰ画分中の材料は継時的に減少した一方、ピログルタミン酸−含有画分中の材料は継時的に増加した；これは、４℃で保持されたサンプルと比較して、２５℃で保持されたサンプルにおいて著しくより大きな範囲で見られた。

【0350】

安定性データの並べた（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）比較が、総ＣＳＰ画分又はピログルタミン酸−含有ショルダーを除いた天然（主要）ＲＰ−ＨＰＬＣピークでのみ溶出された材料のいずれかの１及び５ｍｇ／ｍＬ、４℃及び２５℃での３つのｐＨレベルにおいて長期間にわたってなされた（表１８−２０）。４℃での１ｍｇ／ｍＬおよび５ｍｇ／ｍＬのサンプルについて、ｐＨ６．４及びｐＨ７．０のバッファーは、ｐＨ７．５のバッファーと比較して１４／１５日目及び２１／２３日目でのより高いレベルの安定性を提供する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、天然ｒＣＳＰの２１／２３日目におけるｐＨ６．４及びｐＨ７．０の、１ｍｇ／ｍＬではおよそ２％の、５ｍｇ／ｍＬでは１．６％の安定性における差異を示した。２５℃、ｐＨ６．４及びｐＨ７．０の両方の濃度における天然及び総ＣＳＰサンプルは、５／６日目におけるｐＨ７．５より高く、１４／１５日目及び２１／２３日目と同等の安定性を提供する。ｐＨ ７．５で維持された５ｍｇ／ｍＬのサンプルは、ｐＨ６．４及びｐＨ７．０で保持されたサンプルと比較して、２１日目のグループ１ピークにおける材料のより大きな増加を示した。

【0351】

５ｍｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬ ｒＣＳＰのいずれかを含むサンプルはｐＨ６．４、ｐＨ７．０又は７．５のバッファーにおいて、４℃又は２５℃のいずれかで保持され、１／３日目、５／６日目、１４／１５日目及び２１／２３日目にＳＥ−ＨＰＬＣで分析された（表２１及び２２）。同じ期間２５℃で保持されたサンプルにおいて、より明確なピークのテーリングの増加が観察された。この傾向は４℃及び２５℃で保持された１ｍｇ／ｍＬサンプルにおいても同様だった。

【0352】

１ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬサンプルの４℃及び２５℃での３つのｐＨレベルのデータを並べた比較が、１／３日目、５／６日目、１４／１５日目及び２１／２３日目に行われた。
最も安定したサンプルは、１ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの両方の、４℃及び２５℃の両方でのｐＨ７．０のバッファー中のサンプルだった。ＲＰ−ＨＰＬＣと同様に、ＳＥ−ＨＰＬＣは、２５℃でｐＨ６．４バッファーを有する５ｍｇ／ｍＬサンプルの、ｐＨ７．５のものと比較したより高い安定性を、１、５及び１４日目に示した。２１日目の終了時点で、ｐＨ６．４よりも多少高い安定性がｐＨ７．０において測定された。

【0353】

【表22-1】

【0354】

【表22-2】

【0355】

表１８にリストされたＲＰ−ＨＰＬＣサンプルはすべて、分析まで−８０℃で凍結されていた。天然ｒＣＳＰはピログルタミン酸を包含していない。ｐＥ−ＣＳＰはピログルタミン酸種である。

【0356】

【表23-1】

【0357】

【表23-2】

【0358】

表１９にリストされたＲＰ−ＨＰＬＣサンプルはすべて、分析まで−８０℃で凍結されていた。

【0359】

【表24-1】

【0360】

【表24-2】

【0361】

表２０にリストされたＲＰ−ＨＰＬＣサンプルはすべて、分析まで−８０℃で凍結されていた。

【0362】

【表25-1】

【0363】

【表25-2】

【0364】

【表25-3】

【0365】

表２１中のイタリック体でリストされたサンプルは、０日−８０℃で凍結された。
他のすべてのサンプルは分析の時まで液体（凍結されず）として保持された。

【0366】

【表26-1】

【0367】

【表26-2】

【0368】

【表26-3】

【0369】

表２２中のイタリック体でリストされたサンプルは、０日−８０℃で凍結されていた。
他のすべてのサンプルは分析の時まで液体（凍結されず）として保持された。

【0370】

ｒＣＳＰ調製物中の宿主細胞タンパク質量が、さらなる疎水性相互作用クロマトグラフィー工程（例えば本明細書中の実施例９に記載されているような工程）を使用して減少したものの安定性研究が行われた。安定した製剤バッファー中で１２０時間２−８℃で保持した後ＲＰ−ＨＰＬＣで検出された総ｒＣＳＰは、９１．４％と高い割合が観察され（表２３及び２４参照）、０．２％ＲＤＰを示した。これらの研究において、１ｍＭ ＭＴＧおよび０．５Ｍアルギニンを含むＰＢＳ、ｐＨ６．７中のｒＣＳＰの２つのバッチ（バッチ５３３−６１６および５３３−６１８）は、−８０、２−８、２５および４０℃で６、１６、２４、４８、７２、１２０時間目に評価された。

【0371】

本明細書中に記載されているように、逆相ＨＰＬＣが行なわれた。サンプルの分析の前に、カラムは、１ｍＬ／分の速度で３０ｍＬ移動相Ａを流すことにより調整された。３０μｇ ｒＣＳＰ参照基準（ＰＢＳ中、０．５Ｍアルギニン−ＨＣＬ、１ｍＭモノチオグリセロール、ｐＨ ７．０）の注入は、再現性と保持時間を評価するためにサンプルと同じ濃度と注入容量で分析された。希釈剤バッファー（ＰＢＳ、０．５Ｍアルギニン−ＨＣＬ、１ｍＭモノチオグリセロール、ｐＨ７．０）のみを包含するブランクの注入は、系の適応性評価のために行なわれた。大量の原薬サンプルは３連で注入された。移動相Ｂの勾配は２０分で２２％から３２％だった。サンプル、基準及びブランクは、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍでモニターされ、面積情報が得られた。ピークの面積はｒＣＳＰの品質および純度を決定するために使用された。ＲＰ分析は、ＣＳＰ（天然ＣＳＰ及びピログルタミン酸−ＣＳＰ）および３つのピークグループ１−３の含有量を追跡した。各データポイントの反復平均（時間／保存条件）は表２３および２４に示される。サンプルバッチは対照及び対応するストレスを与えたサンプルの別々の時点−特有のランにおいて分析された。生成物変化／分解はクロマトグラフィーの領域および純度（領域％）によってそれらの間でＲＰＤ（相対的な百分率差）によって追跡された。

【0372】

【表27-1】

【0373】

【表27-2】

【0374】

【表27-3】

【0375】

【表28-1】

【0376】

【表28-2】

【0377】

【表28-3】

【0378】

バッチ特異的なチャートは、クロマトグラフィーの純度（対時間／保存条件）および分解速度直線性（アレニウスプロット）を記載して作成された。２つのバッチの相対的な変化（純度または合計％ｒＣＳＰの相対的な割合差）に基づいて、生成物は４℃で５日間安定していること（＜２％の純度減少）が観察された。６％までの純度損失が同じ期間の２５℃で生じた。４０℃での生成物の著しい分解（５％）が、２４時間の分解曲線補間によって起こることが予期された。３つの処理条件（温度）にける分解運動速度のためのアレニウスプロット（ｒ＝−０．９９６）は単一の速度に限定されたプロセス（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ）を示唆する。各バッチのプロットは一致しており、バッチ間の分解は類似していることが実証された。

【0379】

結論：安定性研究は、本明細書中に記載されているように生成された組み換えＣＳＰの調製物が、１ｍＭモノチオグリセロール及び０．５Ｍアルギニンを含むｐＨ６．４から７．０のＰＢＳの賦形剤バッファーに保存されていた場合、単量体含有率を４℃で２３日目まで＞８５％で維持したことを示した。８０％単量体からなるｒＣＳＰのＰＢＳ、１ｍＭ ＭＴＧ、１０％アルギニンバッファーは、５ｍｇ／ｍＬに濃縮した後４℃で１６時間維持される一方、ＰＢＳのみの濃縮されたサンプルは４℃で１６時間後２９％の単量体を含んでいた。ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＨＰＬＣ分析において、ｐＨ ７．５のバッファー中のｒＣＳＰは、ｐＨ６．４又はｐＨ７．０のいずれかのバッファー中のｒＣＳＰと比較してほぼ全ての時点においてより低い安定性を示した。

【0380】

上記の結果によって確認され、改良されたさらなる安定性研究は、総ＣＳＰの約１０％増加を示した。これらの研究で使用されたｒＣＳＰ調製物中の宿主細胞タンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用によって還元された。

【0381】

＜実施例８：エンジニアリングラン＞
実施例３に記載されているように、プロセスのより大きな容量への拡張を試験するために４つのエンジニアリングランが行われた。

【0382】

発酵槽培養物のための接種は、選択された株の凍結された培養物ストックを含み、酵母エキス及びグリセロールが追加された６００ｍＬの既知組成の培地を含む振とうフラスコを接種することによって行われた。およそ２１時間３２℃で振とう培養した後、振とうフラスコ培養物は、高いバイオマスを補助するために設計された既知組成の培地を含む２０Ｌバイオリアクター （Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＩＦ−２０Ｌ）へ無菌的に移された。溶存酸素は、圧縮された大気の散布流量及び撹拌速度を調整することで液体培地において肯定的なレベルで維持された。ｐＨはアンモニア水の追加を通じて所望の設定なるように制御された。流加培養の高細胞密度発酵プロセスは、初期増殖期、組み換え遺伝子発現を誘導するために０．３８ｇのＩＰＴＧが加えられる（誘導時の推定８Ｌ容量に基づいて培養液中に０．２ｍＭの濃度で）その後の遺伝子発現（誘導）期に分割された。細胞はｐＨ ６．８５−７．２の２７−３２℃で増殖した。その後発酵の誘導期は、２４時間行われた。この期の間の時点において、細胞密度を決定するためにサンプルは発酵槽から下ろされ、その後標的遺伝子発現を測定するために１００μＬの部分を−２０℃で凍結させた。２４時間の最終の時間点において、発酵培養液全体（各２０Ｌバイオリアクター中のおよそ１０Ｌ）は、１Ｌ部分として１５，９００×ｇで９０分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０）によって回収された。細胞ペーストは−８０℃で凍結された。４つのラン全てで、以前に凍結された細胞ペーストは２Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０において２０％濃度となるように融解され、均一な溶液となるよう再懸濁され、微溶液化された。

【0383】

エンジニアリングラン１：このランにおいて、ＴＭＡＥは新鮮な（以前に凍結されていない）溶解物に対して実行された。回収、微溶液化、ディスクスタック遠心分離及び０．２μｍろ過の後、９．９ｇの未精製ｒＣＳＰが回収され、２０％細胞溶解物からの総収率は８１％だった。１０ｇＣＳＰが、ＳＤＳ−ＣＧＥで測定されたように０．３１ｍｇ／ｍＬの濃度及び７％の純度でＴＭＡＥカラムに充填された。３ｇＣＳＰタンパク質は、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度および４０％の純度で溶出された。

【0384】

セラミックのヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）上のクロマトグラフィーの研磨（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）がＴＭＡＥ溶出液において行なわれた。ＳＤＳ−ＣＧＥによると、ＣＨＴカラムに充填されたＴＭＡＥ溶出液の純度は４５％であり、ＣＨＴ溶出液の純度は７５％だった。ＣＨＴ溶出液の濃度は、０．０４ｍｇ／ｍｌ（０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＭＡＥ溶出液から）だった。その収量は全て溶出液に含まれており、８１％だった。算出されたＣＳＰバランスは９６％（溶出で回収できなかったＣＳＰの残部は溶出液以外の画分を構成しているかもしれない）だった。

【0385】

エンジニアリングラン１のＴＭＡＥカラムからの回収はＳＤＳ−ＰＡＧＥによると２７％だった。このランで得られた材料の、上の実施例３に記載されているラン（１０リットル）と比較して低い収率及び純度の原因を決定するための研究が行われた。

【0386】

レジン（調整された対新しいレジン）、レジン充填、溶解物ペースト（成功したランによって実証されたペースト対エンジニアリングラン１ペースト）、伝導性、レジン充填及び組み合わせられた直線的な流量（滞留時間）及び成功したランの全ての条件の反復は、凍結した溶解物の使用を含む。

【0387】

新鮮な溶解物及び凍結／融解溶解物サンプルのＳＤＳ−ＣＧＥは、全ての新鮮な溶解物サンプルにおける、ｒＣＳＰバンド上の高分子量バンドの「ラダリング」を明らかにした。
ラダリングを示す溶解物サンプルはすべて、ＴＭＡＥ上の許容できない収量および純度を示した。融解され、直ちに電気泳動で分析された凍結サンプルもラダリングを示した；しかしながら、融解され、分析の前に室温で６時間保持された凍結サンプルはラダリングを示さなかった。凍結後のろ過及び保持時間はラダリングに対する効果を評価された。ろ過はラダリングに著しい影響を与えない一方、凍結後の６時間の保持時間はラダリングを著しく減少させた。凍結／融解後の保持時間である１時間、３時間、６時間、７．５時間及び１４時間が評価された。４Ｍ尿素に溶解したサンプルは、同じ保持時間の間２Ｍ尿素にあったサンプルと比較して著しく少ないラダリングを示すことが発見された。さらに、６時間までの保持時間の増加は、２Ｍ及び４Ｍ尿素サンプルにおいて直接的にラダリングを減少させた；６時間を超えた保持時間は、４Ｍ尿素サンプルにおいて識別可能な効果を示さなかったが、２Ｍ尿素サンプルのラダリングは減少した。

【0388】

要約すると、ＳＤＳ−ＣＧＥにおける高ＭＷバンドの「ラダリング」によって証拠づけられたように、ＴＭＡＥカラムに充填されたサンプル中の凝集体の存在と弱い陰イオン交換クロマトグラフィーの結果との間には強力な関連が見られた。多くの可能なプロセス変数の排除において、凍結融解後の保持時間が、溶解物サンプル中の凝集体の検出に影響する主要なパラメーターであると決定された。この結果は、凍結融解後の６時間の保持時間が凝集体形成を大幅に減少させることを示唆する。エンジニアリングラン及びプロセスランの間で評価された他の因子−伝導性、レジン充填、直線的な流量、細胞ペーストの差、及びレジンが新しいものか又は調整されたものか−は、弱い陰イオン交換クロマトグラフィー結果の原因から除外された。

【0389】

エンジニアリングラン２：このランでは、深層ろ過及びＴＭＡＥクロマトグラフィー間の溶解物の６時間の保持を伴う凍結／融解サイクルが行われ、良い結果をもたらした。深層ろ過後のＱ−ＰＡＧＥによって測定された一次回収は１２．８ｇｒＣＳＰだった；２０％の細胞溶解物からの全収率は９１％だった。ＳＤＳ−ＣＧＥによって測定されるように、陰イオン交換捕捉カラムに、０．３０ｍｇ／ｍＬ濃度および５％純度で溶解物が充填された。ｒＣＳＰは、０．５８ｍｇ／ｍＬ濃度および７８％純度で溶出された。ＴＭＡＥカラムは、汚染のいくつかの兆候を示したが、実施に影響されなかった。沈澱反応が充填した溶解物において検出されたが、これはろ過されていなかった。ＴＭＡＥ溶離液は０．２μｍでろ過され、ろ液はＣＨＴによってクロマトグラフィーの研磨にさらされた。ＴＭＡＥ溶出液の０．２のμｍろ過後のＨＡ（ＣＨＴ）充填の純度は、８２％だった。ＣＨＴ溶出液の純度は９７％であり、濃度は０．７５ｍｇ／ｍｌで、ＳＤＳ−ＣＧＥによって測定されるように、収量は１１３％だった。

【0390】

ＣＨＴ溶出液（５３３−５１１）の０．２μｍろ過および１２時間の室温保持後に、ＤＴＴによる穏やかな還元が実行された（５３３−５１２）。最終濃度が２０μＭになるように、１０ｍＭ ＤＴＴがろ過された溶出液に注入された。その後溶出液は、ぜん動ポンプを備えた２０Ｌバッグにおいて１９時間１．５−２．５Ｌ／分で再循環された（１６．６Ｌ ＣＨＴ＠バッグ中の０．７２ｇ／Ｌ ＣＳＰ）。この工程からの回収率は１０２％だった。還元前及び後のＣＨＴ溶出液のサイズ排除−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析は、単量体含有率の明確な増加、８５から１００％を示した。

【0391】

塩類、尿素およびＤＴＴを除去するために、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）によるバッファー交換が、穏やかに還元された材料上で行なわれた。ＣＳＰ単量体は１×ＰＢＳで透析された。ＣＳＰを保持するために、５ｋＤａ分子量遮断、０．１ｍ^２再生セルロース薄膜が使用された。バッファー交換工程からの回収は、透過物中の７．３％のＣＳＰ及び系の中で保持された０．４％を含む８６．２％だった。最終生成物の分析は、Ａ_２８０において０．６６ｇ／Ｌ、１０．３ＥＵ／ｍＬの菌体内毒素レベル、ＨＣＰ−ＥＬＩＳＡによる４７００ｐｐｍの宿主細胞タンパク質及びＳＤＳ−ＣＧＥによる９７％純度を示した。ＬＣ／ＭＳは、ｒＣＳＰの５．１％がＮ−末端で切断されていることを明らかにした。ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間はＣＳＰ標準物質と一致していた。１０．６ｇのＣＳＰはＵＦ／ＤＦの後に回収され、−８０℃で凍結された。大量のＵＦ／ＤＦ原薬後のサイズ排除クロマトグラフィー（５３３−５１３）は、対照（５３３−４０７）と比較した工程中のこのｒＣＳＰの二量体化及び凝集の低いレベルを示し、結果的な含有率として９０％単量体、７％二量体及び３％凝集体を示した。

【0392】

このランは、目的の純度、収率、濃度、単量体含有率、切断及び菌体内毒素レベルと一致する精製されたｒＣＳＰが、発酵槽及び記載されているような統合された精製プロセスを使用する規模で生成できることを確認した。

【0393】

エンジニアリングラン３：
このランにおいて、エンジニアリングラン２と同じプロトコルに基づいて溶解物の回収、細胞破砕及び浄化が行われた。溶解物はＴＭＡＥカラムに充填される前に−８０℃で６時間保持され、室温で６時間放置されたが、不完全な溶解物の凍結が観察された。深層ろ過後にＱ−ＰＡＧＥで測定された一次回収は１４．８ＣＳＰであり、２０％細胞溶解物からの総収率は９８％だった。融解された溶解物において、充填プロセスの初期に激しい沈澱反応及び重度のカラム汚染が観察され、ランが進むにつれ徐々に悪化した。エンジニアリングラン３の純度及び収率は、エンジニアリングラン２と比較して顕著に減少した。ＳＤＳ−ＣＧＥにより、ｒＣＳＰバランスはＥＲ３において４１％、溶出において２３％、洗浄において４％、流動において１３％だった。クロマトグラフィーおよびバッファー交換の研磨は行なわれなかった。

【0394】

エンジニアリングラン４：このランにおいて、エンジニアリングラン２と同じプロトコルに基づいて溶解物の回収、細胞破砕及び浄化が再度行われたが、ＴＭＡＥクロマトグラフィーのために低温のバッファーが使用された。

【0395】

深層定ろ過後の量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｑ−ＰＡＧＥ）によって測定された一次回収は、１３．７ｇのＣＳＰであり、２０％細胞溶解物からの全収率は８１％だった。融解後に、沈澱反応は観察され、溶解物はＴＭＡＥカラム上に充填する前に０．４５μｍろ過によってろ過された。カラムの汚染は観察されなかった。このカラムに使用されるバッファーは、使用時６−１２℃だった。純度はＳＤＳ−ＣＧＥによると６５％だった。充填した溶解物の濃度は、溶出液において０．３４ｎｇ／ｍＬおよび０．２４ｎｇ／ｍＬだった。収率は溶出において５４％、洗浄において４％、流動において１％、ストリップにおいて３％だった。ＣＳＰ質量バランスは６２％だった。これらの結果はエンジニアリングラン２よりも著しく低く、低温のバッファーを使ったことに起因すると思われる。

【0396】

ＣＨＴ上のクロマトグラフィーの研磨が行われた。充填したＴＭＡＥ溶出液は、ＳＤＳ−ＣＧＥによると６５％純粋であり、ＣＨＴ溶出液の純度は９４％だった。充填した材料の濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬであり、溶出液は０．２７ｍｇ／ｍＬだった。ＳＤＳ−ＣＧＥによる収率は１１２％で、全てのタンパク質が溶出液に出ていった。７．２ｇのＣＨＴ溶出液が回収され、−８０℃で保存された。ＥＲ２よりも若干低い純度の最も可能性の高い原因は、潜在的に低いＴＭＡＥ溶出液濃度及び純度だった。

【0397】

結論：発酵と精製プロセスは、純度、収量、単量体含有率、Ｎ−末端切断および菌体内毒素の目標値に等しい又は超過する、複数グラム量を成功裏に生産した。エンジニアリングラン２は１０．６ｇの精製されたＣＳＰの大量の原薬を生成した。エンジニアリングラン４は７．２ｇのＣＨＴ溶出液を生成した。これらのエンジニアリングランの両方によって生成された材料の純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣによると目標値に等しい。より大きなランで観察された沈澱反応は、より大容量の溶解物を凍結するのにさらなる時間が必要だったことに潜在的に依存しており、これは結果として溶解物の一部が凍結しない又は結果として脱凝集に必要な凍結時間が短くなる。

【0398】

＜実施例９：宿主細胞タンパク質分離のための方法＞
さらに宿主細胞タンパク質を除去する方法が展開された。２つのサイズ排除レジンおよび５つの疎水的相互作用レジンが、大量の原薬中の宿主細胞タンパク質の量を減らす第３のクロマトグラフィー工程で使用されるために評価された。Ｔｏｙｏ Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃを使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーは、宿主細胞タンパク質を１００ｐｐｍよりも少なくし、良好なｒＣＳＰ純度、濃度、収率及び完全な質量（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ）であることが見出された。穏やかな還元条件におけるＭＴＧの使用はさらにその出力（ｏｕｔｐｕｔ）を改善した。

【0399】

４．５６ヘキシル−６５０Ｃの第３のクロマトグラフィー工程を含む、改善されたプロセス手順を利用した大規模エンジニアリングが行われた。このランは、実施例に記載されている最終的な賦形剤バッファー製剤中の、７．６ｇの大量の原薬（単量体含有率９６．３％及び宿主細胞タンパク質１５２ｐｐｍ）を生成した。

【0400】

＜宿主細胞タンパク質を除去する方法の評価＞
ＨＣＰ減少のための分析的な分離方法が評価された。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＨＣＰからｒＣＳＰを取り出すために使用され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＣＰ−ＥＬＩＳＡの分析のために回収（微溶液化）された。５３３−４０７のＳＥ−ＨＰＬＣ分析（内部ｒＣＳＰ参照基準は、実施例２に記載された方法を使用して株５３３−１２９から調製された）は、ＥＬＩＳＡによる主要ＳＥ−ＨＰＬＣ画分におけるＨＣＰの顕著に減少した値を示した：３５０ｐｐｍのＳＥ−ＨＰＬＣピーク対４１００ｐｐｍ予備ＳＥ−ＨＰＬＣ。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合、ＨＣＰバンドは、ＳＥ−ＨＰＬＣ後５３３−４０７からの主要ｒＣＳＰピークサンプルにおいて明確には見えなかった。

【0401】

＜ＨＣＰ減少のための予備疎水性相互作用クロマトグラフィーの評価＞
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による第３のカラム精製のためにＨｅｘｙｌ ６５０ Ｃ， Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ， Ｂｕｔｙｌ ＨＰ， 及びＰＰＧ ６００Ｍが評価された。試験された疎水的相互作用レジンの相対的な結合強度および保持時間は、最も強力（最長の滞留）ものから、最も弱い（最短の滞留）ものまで次のとおりである：Ｈｅｘｙｌ６５０Ｃ＞ブチルＨＰ＞フェニルＨＰ＞ＰＰＧ ６００Ｍ。５．１３ ｍＬカラムを使用するベンチスケールランは、試験されたすべてのレジンについて行なわれた。ＭＴＧ（５３３−５６５と５３３−５６３）およびＤＴＴ（５３３−５２３）で還元されたＣＨＴ溶出液サンプルは、１．０Ｍから０Ｍ硫酸アンモニウムまでの２０ＣＶ溶出勾配を使用して比較された。高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）操作は、Ｆｒａｃ−９５０ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒを装備したＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｙｓｔｅｍｓ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ） を使用して行われた。使用された材料：Ｔｏｓｏｈ ｒｅｓｉｎ Ｈｅｘｙｌ ６５０Ｃ （ロット番号６５ＨＥＣＢ５０１ＮＯ）；ＨＥＰＥＳ酸（カタログ番号４０１８−０６、ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）；Ｈｅｐｅｓ Ｎａ塩（カタログ番号４１５３−０５、ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）；ＮａＣｌ（カタログ番号１３４２３、Ｓｉｇｍａ／Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）；硫酸アンモニウム（カタログ番号ＢＤＨ８００１−１２Ｋｇ、ＢＤＨ）；尿素（カタログ番号４２０３−６０、ＪＴ Ｂａｋｅｒ， Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ， ＮＪ）；モノチオグリセロール（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓカタログ番号１５５７２７）；Ｈｅｘｙｌ６５０ＣおよびＰＰＧ ６００Ｍ（カタログ番号２１３９９、Ｔｏｓｏｈ ＵＳＡ， Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ， ＮＪ）ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）；Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥ、１７−５１９５−０１）；Ｂｕｔｙｌ ＨＰ（ＧＥ、２８−４１１０−０１）。

【0402】

第３カラムのために試験されたカラムレジンの内、Ｈｅｘｙｌ６５０−Ｃは、低いＮ−末端切断及び高い純度、収率及び二量体からの単量体の分離とともにＨＣＰの最も低い値（＜１００ｐｐｍ）を生成した。Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃは、より大規模な製造の性能の十分な予測を提供するために、１１２．５ｍＬカラムを使用する中規模に最適化された。
クロマトグラフィーのパラメーターを表２５に示す。

【0403】

【表29-1】

【0404】

【表29-2】

【0405】

【表29-3】

【0406】

【表29-4】

【0407】

１．ベンチスケールでのＨｅｘｙｌ−６５０Ｃラン：ＭＴＧ（５３３−５９７及び５３３−５９４）を備えた１．０Ｍから０Ｍへの硫酸アンモニウム勾配
Ｔｏｙｏ−Ｈｅｘｙｌ ６５０−Ｃカラム（直径０．６６ｃｍ×高さ１５ｃｍ）は、１ｍＭ ＭＴＧ−還元ＣＨＴ溶出液（５３３−５６５）ランであり、１ｍＭ ＭＴＧとともに１Ｍから０Ｍまでのアンモニウム勾配で１５カラム容量（ＣＶ）溶出され、その後１ｍＭ ＭＴＧとともに０Ｍ硫酸アンモニウムで３ＣＶ溶出された。カラム溶出液を５３３−５９７と称す。ＳＤＳ−ＣＧＥが溶出された画分について行われ、ＨＣＰ−ＥＬＩＳＡによってＨＣＰ値が決定された。溶出ピークの初期の画分は、後の画分よりＨＣＰの高いレベルを示し、全ての画分は１００ｐｐｍをはるかに下回った。ｒＣＳＰ単量体の一部及び二量体のほぼ全てがカラム水ストリップ（ｃｏｌｕｍｎ ｗａｔｅｒ ｓｔｒｉｐ）に溶出された。５３３−５９７のために使用された同じサンプル材料（ＣＨＴ溶出液５３３−５６５）は、溶出液５３３−５９４を得るために充填され、同じ条件下で溶出された。５３３−５９４のＳＤＳ−ＣＧＥ分析は、ｒＣＳＰ画分のピークの少し前に溶出された画分が、ＨＣＰの存在を示す二重のバンドを示す一方、ｒＣＳＰ溶出画分のピークはＳＤＳ−ＣＧＥにおいて二重のバンドを示さないことを明らかにした。最も著しいのは、ピーク画分中のＨＣＰの量は、ＥＬＩＳＡによって測定されたように５０ｐｐｍだった。選択された画分の電気泳動図は、溶出範囲の中心近くのそれらの画分中の単一のピークを示した。５３３−５９４のＲＰ−ＨＰＬＣによる分析は、二重のバンドをＳＤＳ−ＣＧＥで示したＦ２画分がグループ２の不純物に集積され、主要なＣＳＰピークよりも先に溶出されたことを示した。「画分＃２」（実施例７を参照）と称される主要なＣＳＰピークのテーリングショルダーは、Ｎ末端のピログルタミン酸と一致する完全な質量（ｉｎｔａｃｔ ｍａｓｓ）測定を有するｒＣＳＰ種を包含していた。溶出画分７は、溶出ピークの中心の近くで、ピログルタミン酸−ＣＳＰをほとんど示さなかった；同様にピークの中心近くの画分Ｆ１２は、Ｆ７と比較して、より多くのピログルタミン酸−ＣＳＰ及びより少ないグループ２不純物を示した。カラムストリップは、溶出勾配の任意の部分よりも多くのｐＥ−ＣＳＰ及びグループ３二量体を含む。表２６は、Ｈｅｘｙｌ６５０−Ｃ溶出ピーク５３３−５９４画分を比較し、これらの画分における３ＲＰピークグループの相対的な集積を示す。分析された画分は、サンプルカラム中で示される。グループ１、２および３のピークは実施例７に記載されている通りである。ＬＣ／ＭＳによる完全な質量分析は、還元されたＨｅｘｙｌ Ｇ２画分中の２％切断を測定した。

【0408】

【表30】

【0409】

２．ベンチスケールのＨｅｘｙｌ−６５０Ｃラン：ＭＴＧ及び段階的な溶出を備えた、０．５Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム勾配
さらなる勾配−溶出Ｈｅｘｙｌ６５０−Ｃカラムラン３−６は、０．５Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム勾配を使用した。より狭い勾配範囲は、ｒＣＳＰ溶離範囲中のよりよい分解を可能にした。ラン３及び４は、ＣＨＴ溶出液の、０．５Ｍから０Ｍまでのアンモニウム勾配で溶出されたカラムで１ｍＭ ＭＴＧで還元されたもの（５３３−６０６）と１００ｍＭ ＤＴＴで還元されたもの（５３３−６１０）を比較した。個々の溶出画分及び５３３−６１０からの溶出プールのＨＣＰレベルの比較は、溶出ピーク近くのより高いＨＣＰ濃度を示したが、充填された材料（５３３−５２３）における７０００ｐｐｍと比較しておよそ９００ｐｐｍのより低いＨＣＰレベルを示した。Ｈｅｘｙｌ溶出液（画分Ｅ２−Ｆ２）の主要なピーク画分中の切断は６．２％である一方、充填した材料中の切断は１５％だった。ラン５及び６はそれぞれＭＴＧによって還元されたＣＨＴ溶出液を伴った、０．１ｍＭ硫酸アンモニウムの３ＣＶの段階的溶出を使用した（５３３−６０７と５３３−６１１）。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析は、勾配溶出が、段階的な溶出よりも二量体及びＨＣＰからの単量体のより良い分離を達成したことを示す。表２７は、これらのカラムランから分析データを示す。低い切断及び高い純度を伴う最も低いＨＣＰ値は、５３３−６０６で達成された；したがって、１ｍＭ ＭＴＧ還元後の０．５から０Ｍまでの硫酸アンモニウム勾配を伴うＨｅｘｙｌ−６５０Ｃクロマトグラフィーが、次の中規模及び大規模ランのために選択された。

【0410】

＜中規模のＨｅｘｙｌ−６５０Ｃラン（５３３−６１５）および大量の原薬（５３３−６１６）＞
ベンチスケールのヘキシル密度勾配カラムから得られた結果に基づき、１１２．６ｍＬのカラム容量を備えた大規模なＨｅｘｙｌ−６５０Ｃの予備カラムに、ＭＴＧで還元されたＣＨＴ溶出液（５３３−５６３）が充填され、０．５Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム勾配で溶出された；溶出液は５３３−６１５（ラン７）と称す。５３３−６１５からのＥＬＩＳＡによるＨＣＰは１５２ｐｐｍであり、ｒＣＳＰ純度は９９．２％だった。５３３−６０６，−６１０，−６０７，及び−６１１とともに５３３−６１５のＳＤＳ−ＣＧＥによる純度、２８０ｎｍの吸光度による総タンパク質濃度、ＬＣ／ＭＳによるアミノ酸切断及びＥＬＩＳＡによる宿主細胞タンパク質レベルのデータは、表２７に要約された。
逆相ＨＰＬＣによって測定された総ｒＣＳＰ（天然にピログルタミン酸形態を加えた）のは、ＣＨＴ後８２．４％からＨｅｘｙｌ６５０後９１．５％にまで増加した。

【0411】

【表31-1】

【0412】

【表31-2】

【0413】

＜ＵＦ／ＤＦバッファー交換（５３３−６１６）＞
５３３−６１６Ｈｅｘｙｌ溶出プールはタンジェンシャルフローろ過によって濃縮され、透析され、１×ＰＢＳ、０．５Ｍアルギニン−ＨＣｌ、１ｍＭモノチオグリセロール、ｐＨ６．７からなる最終賦形剤バッファーを得た。

【0414】

薄膜は生成物導入前に１×ＰＢＳで平衡化した。１×ＰＢＳ、１０％（ｗ／ｖ）アルギニン−ＨＣｌ（５３３−６１６では０．５Ｍアルギニン−ＨＣｌ）（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、部品番号２０６７）、１ｍＭモノチオグリセロール（ＭＰ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳカタログ番号１５５７２７）、ｐＨ ６．４は、室温（２１−２３℃）、３２４ＬＭＨで薄膜を通して再循環した。５ｋＤａ薄膜上に存在する間、１０−１５ｐｓｉおよび２１−２４ｐｓｉのＴＭＰが、残余物に適用された。滞留容量は６０．２ｍＬのバッファーから算出された。５３３−６１６については、溶出液の濃縮は、０．１７３ｍｇ／ｍｌの１５３２ｍＬの原容量から１．４ｍｇ／ｍＬの１８９．３ｍＬの容量までだった。濃縮後に、定容量透析が８残余物容量で行われた：１８９．３ｍＬ×８＝１５１４．４ｍＬ。
その後、それは１６３．４ｍＬに濃縮され、１．０ｍｇ／ｍＬの２２１．９ｍＬ（５３３−６１６の２０９．５ｍＬ）の最終的な容量に希釈された。薄膜は５２．３ｍＬバッファーで洗い流され、室温で０．１Ｎ ＮａＯＨを６０分間再循環させることにより浄化された。薄膜の再生は正常化された透水性測定によって確認された。最終の精製されたＣＳＰは−８０℃で凍結されて保存された。

【0415】

バッファー交換工程からの回収率は８７．６％であり、ＳＤＳ−ＣＧＥによる純度は９９．８％だった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、最終的なバッファー交換の後に二量体の量の減少を示し、単量体はＳＥＣ−ＨＰＬＣによると９７．６％だった。還元後のＮ−末端切断はＬＣ／ＭＳによると２．７％であり、ｒＣＳＰはＲＰ−ＨＰＬＣによると９０．３％だった。最終生産物の分析は、Ａ２８による１．０５ｍｇ／ｍＬ、４ＥＵ／ｍｇの菌体内毒素レベルおよびＨＣＰ−ＥＬＩＳＡによる２１６ｐｐｍの宿主細胞タンパク質値を示した。分析データは表２８に要約される。

【0416】

【表32】

【0417】

＜最終的な大量の原薬：測定された分析データの概要＞
＜２０ｃｍのＨｅｘｙｌ−６５０Ｃの第３カラムを使用する規模での生成（５３３−６１８）＞
Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃのベンチスケール及び１１２ｍＬ規模での使用によるＨＣＰおよび二量体の十分な減少を示す結果の達成で、大規模な技術移転製造ランが２０ｃｍ、４．５６Ｌ Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃカラムを使用して試みられた。−８０℃に凍結された、濃縮された（Ｃｅｎｔｒａｔｅ）材料は、１４日後に融解され、ＴＭＡＥ及びＣＨＴによって精製された。１ｍＭ ＭＴＧによる還元は、ＴＭＡＥとＣＨＴの精製還元と同じ日に始めた。Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ精製は翌日始めた（ヘキシル溶出液：５３３−６１７）。翌日、５３３−６１７Ｈｅｘｙｌ−６５０Ｃ溶出液が、ＵＦ／ＤＦによって１ｍＭ ＭＴＧ、０．５Ｍアルギニンを伴う１×ＰＢＳ（ｐＨ６．７）からなる大量のバッファーに移され、５３３−６１８と称された。５３３−６１７のＡ_２８０クロマトグラムは、カラムから流れた小分子のピークを示す。２０ｃｍのカラムからの５３３−６１８ ＢＤＳの分析は、明細書中にすべてある重要な性能基準を示した。

【0418】

【表33-1】

【0419】

【表33-2】

【0420】

結論：宿主細胞タンパク質は質量分析法ペプチドデータベース分析によって同定された。有毒なものとして識別された宿主細胞タンパク質はどれも同定されなかった。ＨＣＰ−含有ｒＣＳＰバッチの量の「高い」（２−カラム精製）及び「低い」（３−カラム精製）を比較した免疫原性研究は、ｒＣＳＰ調製物中のＨＣＰの異なるレベルの結果として生じる、ｒＣＳＰおける免疫原性の差を示さなかった。

【0421】

大量の原薬中のＨＣＰレベルは、第３のクロマトグラフィー工程によって下がった。低い切断率と高い純度を備えた最も低いＨＣＰ値は、１ｍＭ ＭＴＧを含む穏やかな還元条件の後、０．５Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム勾配を備えたＨｅｘｙｌ−６５０Ｃクロマトグラフィーを使用して達成された。

【0422】

＜実施例１１：溶解物中の沈澱反応を少なくする方法＞
陰イオン交換クロマトグラフィー前に溶解物中の沈澱反応を少なくする方法は、ｒＣＳＰ収量および純度に対するその方法の効果のために評価された。

【0423】

記載されたように、ＴＭＡＥ陰イオン交換カラムに充填する前に溶解物を凍結することは、ｒＣＳＰ純度、濃度及び収率の増加をもたらすことができる。２Ｌボトル中の溶解物の凍結は、より高い表面積／体積比のため、より大きな容器の代わりとして評価された。１０％溶解物が、エンジニアランで記載されたプロセスで調製された。１０％溶解物の上清（５３３−５５５、細胞ペースト５３３−４４６から作製された）を含む２Ｌ ＰＥＴＧボトル１つ及び脱イオン水を含む５×２Ｌ ＰＥＴＧボトルは、Ｒｅｖｃｏ −８０℃冷凍庫に放置された。表３０は、凍結の進行を時間にわたって概説する。

【0424】

【表34】

【0425】

融解にかかると予想される時間を確立するために、１０％凍結溶解物（５３３−５５５）を含む２Ｌ ＰＥＴＧボトル、ＤＩ水を含む６×２Ｌ ＰＥＴＧボトル及び≦−７６℃で凍結された液体を含むたくさんの１Ｌと５００ｍＬ ＰＥＴＧボトル（合計２４Ｌの凍結された液体）を２５℃に設定されたＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ２７０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ｗａｔｅｒ ｂａｔｈに配置し、ウォーターバスの温度は２２℃を下回らないようにした。３．２５時間後、いくつかの緩やかな混合物のボトルで、１０％凍結溶解物は、２２−２３℃で完全に融解された。

【0426】

さらなる沈澱反応を少なくするために、完全に凍結された溶解物を融解してろ過したものが評価された。エンジニアリングラン３のための溶解物を作製するのに使用された、同じ細胞ペーストから作製された１０％溶解物（５３３−５５８）は、記載されたプロセスによって調製され、２Ｌ ＰＥＴＧボトルにおいて凍結され、２時間３５分で記載の通り融解された。遠心分離に必要なさらなる時間の間にＮ−末端切断が増加した可能性を考慮し、もし沈殿量を十分に減らすことができるのであれば、遠心分離なしのろ過が必要であると考えられた。遠心分離に必要な時間および力を決定するために、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ（０．４５のμｍ／０．２μｍ）メンブレンフィルターによる融解された溶解物のろ過は、遠心分離なし、１５，０００×ｇ１５分間及び３０，０００×ｇ３０分間の３つの異なる条件下で評価された。フィルター許容量を決定するために、Ｖ_ｍａｘ方法をその後行った。７５％閉塞での流速が初期の流速のおよそ２５％であったため、Ｖ７５値が実質的な許容量の限界であると考えられた。遠心分離のない薄膜ろ過は生産に適切なＶ７５値を生成することが見出された（表３１）。遠心分離なしで実際的であると決定された０．４５μｍ（ＴＭＡＥレジンの汚染を防ぐのに十分小さいサイズ）ろ過で、ＴＭＡＥクロマトグラフィーが、凍結／融解溶解物の遠心分離をせずにろ過とともに行われた。遠心分離無し対遠心分離ありの溶解物に必要とされるより大きなろ過面積は、増加したタンパク質切断率の潜在力を比較検討した時に調整される。遠心分離機にかけなかったサンプルに必要なフィルター処理能力によるｒＣＳＰ濃度の明白な減少はなかった。

【0427】

【表35】

【0428】

ＴＭＡＥカラムを汚染から保護するために適切な微粒子の分離を提供すると知られている大きさの組み合わせである０．６５μｍ／０．４５μｍメンブレンフィルターが使用された。
２５Ｌ／ｍ^２の処理能力が遠心分離機にかけられていない溶解物で達成され、ＴＭＡＥカラムの汚染は生じなかった。

【0429】

結果は、２Ｌボトルの溶解物の凍結融解後、遠心分離なしの０．２／０．４５μｍ又は０．６５μｍ／０．４５μｍ薄膜ろ過を使用することを示唆した。この追加の工程は、沈殿物を少なくすることで良好なクロマトグラフィーを可能にし、短くなった処理時間と関連してｒＣＳＰのＮ−末端切断の低い値を結果としてもたらした。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23】

【図24】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30A】

【図30B】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]