特許 6239243 自動分析装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6239243

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】自動分析装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/76 20060101AFI20171120BHJP

   G01N 35/08 20060101ALI20171120BHJP

   G01N 21/05 20060101ALI20171120BHJP

【ＦＩ】

   G01N21/76

   G01N35/08 D

   G01N21/05

【請求項の数】12

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2013-22799(P2013-22799)

(22)【出願日】2013年2月8日

(65)【公開番号】特開2014-153178(P2014-153178A)

(43)【公開日】2014年8月25日

【審査請求日】2015年8月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(72)【発明者】

【氏名】信木 俊一郎

(72)【発明者】

【氏名】前嶋 宗郎

(72)【発明者】

【氏名】田村 輝美

(72)【発明者】

【氏名】今井 健太

【審査官】 伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】 特開平１０−３３２５９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表平１０−５０９７９８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３０１８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−２４２３９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１５５４８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００４／００１３８０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／２２８５１３（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２１／００−２１／８３

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３

Ｇ０１Ｎ ３５／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

標識物質が結合された磁性体粒子を含む流体が、流体入口から流体出口へ流れるフローチャンバーと、
前記フローチャンバー内に導入された流体に磁性体粒子を捕捉するための磁気トラップ手段、ここで前記磁気トラップ手段は磁場を印加する磁石を含む、と、
前記磁気トラップ手段により捕捉された磁性体粒子に対して電圧を印加して発光させる作用電極及び対向電極と、
前記フローチャンバー内に捕捉された磁性体粒子上の標識物質からの発光を検出する光検知素子と、
前記磁気トラップ手段により捕捉された磁性粒子のうちの、上流側の一部の磁性粒子上の標識物質からの発光を検出するよう、前記光検知素子が発光を検出する領域を規制する規制手段、を備えたことを特徴とし、
前記規制手段は、前記磁気トラップ手段により磁性体粒子が捕捉されるフローチャンバー内面壁の上流側の一部に露出するように形成された作用電極である、分析装置。

【請求項2】

請求項１に記載の分析装置において、
前記作用電極が露出する領域の面積は、前記磁気トラップ手段の頂上部の面積の１／３以下であることを特徴とする分析装置。

【請求項3】

請求項１または２に記載の分析装置において、
前記作用電極が露出する領域の重心は、前記磁気トラップ手段の頂上部の重心より、前記フローチャンバー内の上流側にあることを特徴とする分析装置。

【請求項4】

請求項１に記載の分析装置において、
前記作用電極が露出する部分の形状は、下流側に凹部を有することを特徴とする分析装置。

【請求項5】

請求項１に記載の分析装置において、
前記作用電極が露出する部分の形状は、上流側のフローチャンバーの側壁近傍に凹部を有することを特徴とする分析装置。

【請求項6】

標識物質が結合された磁性体粒子を含む流体が、流体入口から流体出口へ流れるフローチャンバーと、
前記フローチャンバー内に導入された流体に磁性体粒子を捕捉するための磁気トラップ手段、ここで前記磁気トラップ手段は磁場を印加する磁石を含む、と、
前記磁気トラップ手段により捕捉された磁性体粒子に対して電圧を印加して発光させる作用電極及び対向電極と、
前記フローチャンバー内に捕捉された磁性体粒子上の標識物質からの発光を検出する光検知素子と、
前記磁気トラップ手段により捕捉された磁性粒子のうちの、上流側の一部の磁性粒子上の標識物質からの発光を検出するよう、前記光検知素子が発光を検出する領域を規制する規制手段、を備えたことを特徴とし、
前記規制手段は、前記磁気トラップ手段により捕捉された磁性粒子上の標識物質から発せられた発光のうち、上流側の一部を通過させ他の発光を通過させない窓である、分析装置。

【請求項7】

標識物質が結合された磁性体粒子を含む流体が導入される流体入口と、
前記流体が排出される流体出口と、
導入された磁性体粒子を捕捉する捕捉領域と、
前記捕捉領域に捕捉された磁性粒子上の標識物質に電圧を印加して発光させる作用電極及び対向電極と、
前記捕捉領域に対向して設けられ、標識物質からの発光を通過させる窓と、を有するフロースルーセルであって、
前記窓を通過する発光が、前記捕捉領域に捕捉された磁性体粒子のうちの上流側の一部の磁性体粒子上の標識物質からの発光となるよう、規制する規制手段を備えたことを特徴とし、
前記規制手段は、前記捕捉領域の上流側の一部に露出するように形成された作用電極である、フロースルーセル。

【請求項8】

請求項７に記載のフロースルーセルにおいて、
前記作用電極が露出する領域の面積は、前記捕捉領域の面積の１／３以下であることを特徴とするフロースルーセル。

【請求項9】

請求項７に記載のフロースルーセルにおいて、
前記作用電極が露出する領域の重心は、前記捕捉領域の重心より上流側にあることを特徴とするフロースルーセル。

【請求項10】

請求項７に記載のフロースルーセルにおいて、
前記作用電極が露出する領域の形状は、下流側に凹部を有することを特徴とするフロースルーセル。

【請求項11】

請求項７に記載のフロースルーセルにおいて、
前記作用電極が露出する領域の形状は、上流側の流路側壁近傍に凹部を有することを特徴とするフロースルーセル。

【請求項12】

標識物質が結合された磁性体粒子を含む流体が導入される流体入口と、
前記流体が排出される流体出口と、
導入された磁性体粒子を捕捉する捕捉領域と、
前記捕捉領域に捕捉された磁性粒子上の標識物質に電圧を印加して発光させる作用電極及び対向電極と、
前記捕捉領域に対向して設けられ、標識物質からの発光を通過させる窓と、を有するフロースルーセルであって、
前記窓を通過する発光が、前記捕捉領域に捕捉された磁性体粒子のうちの上流側の一部の磁性体粒子上の標識物質からの発光となるよう、規制する規制手段を備えたことを特徴とし、
前記規制手段は、前記捕捉領域の上流側の一部からの発光のみを通過させるように形成された窓であることを特徴とするフロースルーセル。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）と抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）の反応を利用する免疫分析（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）のための装置に係わり、特に免疫反応用の固相として、磁性体粒子を使用する分析装置に関する。

【背景技術】

【0002】

血清または尿の如き生体試料内の抗体または抗原を同定するために免疫複合体を形成せしめる免疫反応が用いられる。固相と液相を反応させる場合、標識された抗体が試薬として使用され、反応後に液相を検知素子でもって測定することが一般的である。標識は、放射性同位体（ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）、酵素、着色された粒子、蛍光物質、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を生じる物質、等が知られている。

【0003】

従来技術の電気化学発光フロースルーセルでは、極微量の測定対象物に高確率で発光試薬を結合させるために、測定対象物の量に対して過剰量の発光試薬を加えるので、測定対象物と結合していない発光試薬（フリー成分）が溶液中に多く存在し、フリー成分に由来するノイズ信号によりＳＮ比が低下するという問題があった。

【0004】

従来例として、特許文献１には次のような技術が開示されている。即ち、フロースルーセルの壁面の外部に磁石を配置し、測定対象物（ホルモン、腫瘍マーカー、薬物、酵素、サイトカイン、核酸等）を抗原抗体結合により磁性ビーズに保持し、磁性ビーズを磁石により作用電極の面に保持して、作用電極の面に保持されない成分でありノイズの原因となる成分を、水流の力で洗い流して測定精度を向上させることの記載がある。作用電極の面に保持された成分（結合成分（Ｂｉｎｄ；Ｂ））と、作用電極の面に保持されない成分（フリー成分（Ｆｒｅｅ；Ｆ））との分離は、Ｂ／Ｆ分離と呼ばれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特表平４−５０２２０７号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、特許文献１に記載の構成では、測定対象物とは直接結合しない標識物質を励起させる誘引物質（ＴＰＡ等、後述）が、作用電極と電気化学反応することに由来する不要発光は除去できない。特に作用電極表面の磁性体粒子の密度が相対的に小さい領域は、標識物質を励起させる誘引物質（ＴＰＡ等）による不要発光が出てくる割合が、目的としている発光標識からの発光の割合に対して大きく、局所的に（相対的に）ＳＮ比の低い領域となってしまう。このために高いＳＮ比を得ることが難しい。

【0007】

本発明はこのような作用電極表面の磁性体粒子の密度が相対的に小さい領域を減らすことにより、局所的に（相対的に）ＳＮ比の低い領域を低減し、高いＳＮ比を得ることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記課題を解決するための本発明の特徴は、以下の通りである。

【0009】

本発明の分析装置は、磁性体粒子を含んでいる流体が流れるフローチャンバーと、フローチャンバーを有するフロースルーセルと、フローチャンバー内に設けられた作用電極及び対向電極と、磁性体粒子を含んでいる流体がフローチャンバー内に導入されたときに、フローチャンバー内で磁性体粒子を捕捉するための磁場を印加する磁石と、フローチャンバー内に留まる磁性体粒子上の標識物質からの発光を検出する光検知素子と、を有し、作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域の面積は、磁石の頂上部の面積より小さいことを特徴としている。

【発明の効果】

【0010】

本発明により、磁性体粒子を利用した免疫分析のための方法及び装置において、作用電極表面の磁性体粒子の密度が相対的に小さい領域からの測光量を減らすことにより、局所的に（相対的に）ＳＮ比の低い領域を低減し、高いＳＮ比を得ることができる。上記以外の課題、構成及び効果は以下の実施形態の説明により明らかにされる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明の一実施例による免疫分析装置の全体の概略構成を示す図である。

【図2】図１に示す装置におけるフロースルーセルユニットの構成を示す縦断面図である。

【図3】図２のフロースルーセルユニットのIII−III線部分拡大図である。

【図4】図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。

【図5】比較例におけるフロースルーセルの図３と同じ方向からの断面図である。

【図6】実施例２におけるフロースルーセルの図３と同じ方向からの断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

分析対象とする成分（分析対象物）は、試料が血清の場合、抗原、ペプチドホルモン、ステロイドホルモン、薬剤、ウィルス抗体、各種の腫瘍マーカー、抗体、抗体複合物、単一タンパク質などである。

【0013】

固相としての磁性体粒子は、粒径が０．５〜１０μｍであり、比重が１．２〜１．５である。この粒子は、液内に沈降し難く、懸濁しやすい。粒子の表面には抗体が固定されている。磁性粒子は、たとえば鉄、酸化鉄、ニッケル、コバルト、酸化クロム等の磁気吸引物質の粉末をマトリクス内にうめ込んで形成されており、このマトリクス自体は、多くの合成及び天然の重合性物質（たとえばセルロース、ポリエステル、ポリスチレン、シリカ、デキストラン、アルブミン等）からなる広い範囲の物質からなる。

【0014】

免疫反応によって分析対象物（抗原）及び発光標識物質を含む免疫複合体が、磁性体粒子上に結合される。この免疫複合体は、反応混合物中の他の共存物質とともに懸濁液の形でフロースルーセルのフローチャンバーに導入される。

【0015】

磁性体粒子は、フローチャンバー内において平面的に広げられた状態で、磁力によって所定の場所に捕捉される。発光を測定するときには磁力が解除されるが、このときフローチャンバー内の液体の流れが停止されているため、磁性体粒子は捕捉されたままの状態でフローチャンバー内にとどまっている。

【0016】

フローチャンバーは、深さ（すなわち厚さ）に対し幅が２〜２０倍になるように形成されており、流体の流れに乗って導入された粒子が流れの横方向に広がるのを容易にする。磁性体粒子の広がり方は、理想的には、単一層であるのが望ましいが、実際には粒子同士の重なりが多少生ずる。本発明ではこのような重なりがある場合も平面的な広がりと称す。フローチャンバー内における平面的な広がりは、磁力の強さに加えて、反応混合物を含む懸濁液の導入時の流速にも影響される。流速による力が磁力によって粒子を捕捉する力を上回った場合には、粒子が離脱されるので、適正な流速を選ぶ必要がある。

【0017】

フローチャンバーに磁場を印加するための磁石の磁束密度（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｌｕｘ ｄｅｎｓｉｔｙ）は、好ましくは０．５〜３Ｔである。フロースルーセルは、フローチャンバーと光検出素子の間に光透過性の窓を有する。窓は、ガラス、石英、アクリル、ポリカーボネート等の光内部透過率９０％以上のプラスチックのうちから選ばれた何れか１つの材料でできている。光検知素子は、光電子増倍管、アバランシェフォトダイオード、フォトダイオード、ストリーク管のうちから選ばれた何れか１つのものである。前記窓は凸レンズの形状になっていてもよい。

【0018】

フロースルーセルにおいて、懸濁液の液相からの反応生成物の分離は磁気トラップ手段を用い導管中の所定の位置におかれたフロースルーセル内のフローチャンバーで行われる。前記懸濁液は、導管にそってそれらを吸引あるいは吐出する手段からなる送液手段によってフロースルーセル内のフローチャンバーに導かれ、作用電極下あるいは上に配置された磁石による局部的磁界の領域に達するとその磁力により作用電極上に捕捉される。

【0019】

この懸濁液をフロースルーセル内のフローチャンバーに導入し、反応生成物を作用電極上に捕捉させる工程で求められる条件は、以下の通りになる。即ち、標識物質による発光の感度（ＳＮ比）をより高いものにするため、作用電極表面の磁性体粒子の密度が相対的に小さい領域を減らすことである。作用電極表面の磁性体粒子の密度が相対的に小さい領域は、標識物質を励起させる誘引物質（ＴＰＡ等）による不要発光が出てくる割合が、目的としている発光標識からの発光の割合に対して大きく、局所的に（相対的に）ＳＮ比の低い領域となってしまう。このために高いＳＮ比を得ることが難しいため好ましくない。

【0020】

フローチャンバー形状は上面からみて紡錘形であり、その紡錘形の最大幅部の幅が入口径（最小幅部）に対し１０倍以内、入口から見て最大幅部への開口角が３０°以内、その厚さが０．２〜１．０ｍｍとなるような構造である。不適切な形状の場合には、チャンバー側面付近で流れの剥離、気泡の滞留が起き易くなり、懸濁液中の反応生成物の作用電極上への捕捉妨害を引き起こすとともに、一度捕捉した反応生成物を洗浄する際に洗浄液がフローチャンバー側面部まで廻り込まないため、発光反応後の反応生成物の洗浄が困難となってしまう。

【0021】

また、フローチャンバーを形成する部材の材質は試料中の蛋白成分などによる汚れの付着しにくさ及び洗浄液などによる劣化を極力防止するため、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂、ブチルゴム、シリコンゴム、ガラス、及びアクリル樹脂等の電気非導電性物質から選ばれる。

【0022】

磁性体粒子の粒径が０．７５〜３μｍの場合、フローチャンバー内に反応生成物を含む懸濁液を導入する際、その線速度を１０〜１００ｍｍ／ｓとすることにより流れの状態を最適化でき、より多くの反応生成物を作用電極上により分散した形で捕捉することができる。ここで、線速度１０ｍｍ／ｓ以下では懸濁液中の反応生成物は作用電極上の一点に集中して捕捉されるため電気化学的発光を行なう際に高い発光効率を確保することが困難となる。また線速度１００ｍｍ／ｓ以上では、反応生成物は作用電極上に捕捉されにくくほとんどの部分が流れさってしまうため発光量が低下する。

【0023】

前記懸濁液がフロースルーセル内のフローチャンバーを通過する際に作用電極上に捕捉された反応生成物よりなる固相は、導管を通じてフローチャンバー内に洗浄用液体を流すことにより洗浄することができる。固相は作用電極上に捕捉されたまま残るがその反応生成物は流れる洗浄液体に露出し、これにより洗浄が行われる。

【0024】

洗浄液体は、次工程の発光反応を考慮すれば標識物質を励起させる誘引物質を含む緩衝液が望ましい。その目的は、固相から懸濁液液相の残留痕跡を除くこと、及び標識物質の励起を誘引する物質を反応生成物のまわりに再現性良く供給することにある。

【0025】

磁性体粒子は作用電極がフローチャンバー上面におかれた時は作用電極上、あるいはその逆の場合は下におかれた磁石により生ずる局部的な磁気トラップにより捕捉される。作用電極はフローチャンバー上面または下面のどちらに配置されてもよいが、捕捉効率及び配置の容易さを考慮すると下面に配置されるのが望ましく、かつ紡錘形の最大幅部近傍に配置されるのが望ましい。

【0026】

ここで「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域の面積」は「磁石の頂上部の面積」より小さいことが望ましく、更に望ましくは「磁石の頂上部の面積」の２／３以下であること、更に望ましくは「磁石の頂上部の面積」の１／３倍以下であることが装置のＳＮ比を向上するためには好ましい。理由は以下のとおりである。即ち、磁性体粒子の個数密度は磁石の磁束密度（及び流速等）により決まる。一般的に磁石の磁束密度が空間分布を有するため磁性体粒子の個数密度は均一にならず、磁石の大きさに対して凡そ２／３程度の領域は磁束密度が大きく、磁性体粒子がやや高濃度となる領域が形成され、更に１／３程度の領域においては特に磁束密度が大きく、磁性体粒子の個数密度は特に高くなる。従って、作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域の面積を前段落で記したように決定することが望ましい。

【0027】

他方で、検体濃度検出に有効な磁性体粒子数を保持するためには、作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域の面積は、磁石の頂上部の面積の１％以上あることが望ましく、更に望ましくは磁石の頂上部の面積の５％以上あることが望ましい。

【0028】

なお、磁石の「頂上部」とは、フローチャンバーに対向する磁石の一部分が平坦な場合は頂上部そのものであり、頂上部が平坦ではない場合、例えば凹凸や段差を有する場合は、光検出素子側からみた際の磁石の見かけの領域を意味する。

【0029】

更に「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域」の重心は、磁石の頂上部の重心より、フローチャンバー内の上流側にあることが望ましい。これはフローチャンバー内を流れてきた磁性体粒子は、まず磁束密度の特に大きい磁石のエッジ部分に対応する上流側で捕捉されるため、一般的に上流側の方が下流側よりも磁性体粒子の個数密度が高くなるためである。ここで本明細書における重心とは、指定した領域の２次元面内における、密度一様とした際の平均的な位置、を意味する。

【0030】

「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域」の基本形状は、磁石の形にあわせて、円形、楕円形、方形から選ばれる。更に「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域」の形状は、上記した基本形状に加え、フローチャンバー内の下流側に下流側凹部を有することが望ましい。これはフローチャンバーの流路中央部は特に流速が大きく、他方で壁面近傍は流速が小さいために流路中央部は壁面近傍に比べ磁性体粒子の個数密度が高い領域が小さくなりやすい為である。このとき、フローチャンバーの吸引口が１つであれば、下流側凹部は流路中央に１つあれば十分磁性体粒子の個数密度分布を反映して、ＳＮ比の高い発光を実現できる。他方で、フローチャンバーの吸引口が２つ以上ある場合は、実際の磁性体粒子の濃度分布に合わせて、複数置いてもよく、吸引口の数と同数の下流側凹部を設けることが望ましい。

【0031】

また「作用電極の前記フローチャンバー内に露出されている領域」は、フローチャンバー内の上流側両端部に上流側凹部を有することが望ましい。これは作用電極の下に磁石を配置した場合、一般的にフローチャンバーの流路中央部は、壁面近傍に比べ、磁束密度がやや高いために、流路中央部は壁面近傍に比べ磁性体粒子の個数密度が高い領域が、よりフローの上流側にくるためである。他方で壁面近傍では、磁性体粒子の個数密度が高い領域はよりフローの下流側にくる。

【0032】

このとき壁面がフローの方向から見て左右の２か所に存在するため、両側（「作用電極の前記フローチャンバー内に露出されている領域」の両端部）に上流側凹部を有することが望ましい。

【0033】

また「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域」は、フローチャンバー内の上流側にある上流側作用電極露出領域と、フローチャンバー内の下流側にある下流側作用電極露出領域とに分かれていてもよい。これは磁石のエッジ近傍の磁束密度が他の領域よりも大きくなることに由来して、フローの上流側及び下流側にそれぞれ磁束密度の大きい領域ができるためである。従って、まず既に説明したように、上流側に（「作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域」の重心は「磁石の頂上部」の重心より、フローチャンバー内の上流側にあるように）作用電極を形成することが望ましい。即ち、上流側作用電極露出領域の重心は、磁石の頂上部の重心より、フローチャンバー内の上流側にあることが望ましい。また、他方で下流側にも作用電極を設けることでこの領域においても効率よく磁性体粒子を捕捉することができるため、下流側作用電極露出領域の重心は、磁石の頂上部の重心より、フローチャンバー内の下流側にあることが望ましい。このような構成とすることでＳＮ比を大きく下げることなく、発光強度を向上することができる。

【0034】

この作用電極及び対向電極の材料は、金、白金、パラジウム、タングステン、イリジウム、ニッケル及びそれらの合金のうちいずれか１つから選ばれる。これは電極反応により生じる表面の摩耗、あるいは電極上に流される各試薬による腐食を極力防止するためである。

【0035】

対向電極と作用電極は同一平面上、又は互いにフローチャンバー内で対向する位置に配置される。

【0036】

局部的磁気トラップは、作用電極を挟んでフロースルーセル内フローチャンバーの反対側に設置された少なくとも１個の磁石により生成される。この磁石は、作用電極表面上から０．５〜３ｍｍまで近接でき、かつ磁界を最低値から最高値へ必要に応じて変更できることが望ましい。これは、永久磁石を用いた場合は、作用電極面上へ磁界が生じないよう磁石を遠ざける方向で動かしたり近接させたりすることにより、電磁石を用いた場合は消磁したり励磁したりすることにより実施される。これにより、作用電極上に捕捉された磁性体粒子に結合された反応生成物に対し、電気化学的発光反応終了後、作用電極上に残存する反応生成物を効率良く洗浄することが可能となる。また、磁石の磁束密度を０．５〜３Ｔとし、また作用電極面との距離を０．５〜３ｍｍまで近接させることができるように配置することにより、導管を通ってフローチャンバー内を流れてくる懸濁液中の反応生成物に対し局部的に最適な磁界を与えることができるため、懸濁液中のより多くの反応生成物を再現性よく、より均一かつ広範囲な分布をもって捕捉することが可能となる。

【0037】

また作用電極面上への反応生成物捕捉後、この条件下でフローチャンバー内にさらに緩衝液を流すことにより、より迅速にかつ高効率をもって未反応の試薬を洗い流すことができるため、キャリーオーバーを極少としたＢ／Ｆ分離を簡便に行うことが可能となる。

【0038】

作用電極上に捕捉された反応生成物は、緩衝液により洗浄され未反応の液相と分離された後、作用電極−対向電極間に印加される一定シーケンスに従った電圧により、緩衝液中に含まれる標識物質を励起させる誘引物質が還元され、その還元された誘引物質により励起された標識物質が基底状態に遷移する際に所定の波長を持った光が発せられることになる。その光は、フロースルーセル内のフローチャンバーをはさんで、作用電極と反対側に設けられた透明な窓に入射し、この窓に接して（場合によってはある距離をおいて）配置された光検知素子の検知部に導入されてその発光強度が計測される。

【0039】

以上の構造をもつフロースルーセルにより、血清、尿等の生体液試料中の特定成分を、より迅速かつ簡便な方法で高感度かつ再現性よく分析することが可能となる。

【0040】

以下、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態は本願発明の内容の具体例を示すものであり、本願発明がこれらの実施形態に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において当業者による様々な変更および修正が可能である。また、実施形態を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する。

【0041】

図１は本発明の一実施例による免疫分析装置の全体の概略構成を示す図である。図２は図１に示す装置におけるフロースルーセルユニットの構成を示す縦断面図である。図３は図２のフロースルーセルユニットのIII−III線部分拡大図である。図４は図３のＩＶ−ＩＶ線断面図である。図５は比較例におけるフロースルーセルの図３と同じ方向からの断面図である。図６は実施例２におけるフロースルーセルの図３と同じ方向からの断面図である。図７はＴＳＨを含む緩衝液（シグナルに相当）、並びにＴＳＨを含まず標識物質の励起を誘引させる物質（ＴＰＡ）を含む緩衝液（ノイズに相当）それぞれの発光量（任意単位）を比較例１、実施例１及び実施例２で比較した表である。
次に、本発明を実施例によって具体的に説明する。

【実施例1】

【0042】

以下、図１〜図４を用いて本発明の一実施例による免疫分析方法及び装置を説明する。先ず、本実施例の分析装置のシステム構成を図１により説明する。

【0043】

図１において、本実施例の分析装置は、試料を入れたサンプルボトル３１と、磁性体粒子を含むビーズ（Ｂｅａｄｓ）溶液を入れたビーズボトル３２と、磁性体粒子を試料中の特定成分に結合させる第１試薬を入れた第１試薬ボトル３３と、電気化学的反応により発光を生じる標識物質をラベルしかつ試料中の特定成分と結合する第２試薬を入れた第２試薬ボトル３４と、標識物質の電気的な化学発光を誘引する物質を含む緩衝液を入れた緩衝液ボトル３と、洗浄液を入れた洗浄液ボトル４と、反応生成物を含む懸濁液を得るためのベッセル（反応容器）１と、ベッセル１に試料、ビーズ、第１試薬、第２試薬、緩衝液を分注するサンプリングプローブ３０と、ベッセル１の懸濁液を送液するシッパープローブ２と、シッパープローブ２の先端部を洗浄する洗浄槽５と、シッパープローブ２から送液された懸濁液が導入されるフロースルーセルユニット１０と、懸濁液、洗浄液、緩衝液の吸引及び吐出を行うシリンジ１１と、廃液を収容する廃液ボトル１３と、蒸留水が収容される蒸留水ボトル１４と、蒸留水ボトル１４の蒸留水を洗浄槽５に送液するポンプ１２とを備えている。

【0044】

サンプリングプローブ３０は、既知のピペッティング機構を有しており、図示しないシリンジに導管Ｐ１を介して接続されている。シッパープローブ２は、導管Ｐ２を介してフロースルーセルユニット１０に接続されている。フロースルーセルユニット１０は導管Ｐ３、第１ピンチ弁７、導管Ｐ４を介して、シリンジ１１に接続されている。また、導管Ｐ４は、導管Ｐ５、第２ピンチ弁８、導管Ｐ６を介して、廃液ボトル１３に接続されている。一方、蒸留水ボトル１４は、導管Ｐ９、ポンプ１２、導管Ｐ１０を介して洗浄槽５に接続され、洗浄槽５は、導管Ｐ１１を介して廃液ボトル１３に接続されている。また、導管Ｐ１０の途中から導管Ｐ８が分岐し、この導管Ｐ８は第３ピンチ弁９、導管Ｐ７を介しシリンジ１１に接続されている。

【0045】

サンプルボトル３１内の試料は、例えば特定成分であるＴＳＨ（甲状腺ホルモン）を含む血清、尿等の生体液由来の試料である。ビーズボトル３２内のビーズ溶液は粒子状磁性物質をポリスチレン等からなるマトリックス内に埋め込んだビーズ（Ｂｅａｄｓ）、すなわち磁性体粒子（比重１．４、平均粒径２．８μｍ）を緩衝液中に分散させたものであり、このマトリックスの表面にはビオチンと結合可能なストレプトアビジンが結合されている。磁性体粒子としてはマトリックス中に複数個の粒子状磁性物質を包含したものを用いてもよい。

【0046】

第１試薬ボトル３３内の第１試薬は、末端をビオチン処理したＴＳＨ抗体を含むものである。第２試薬ボトル３４内の第２試薬は、末端をビオチン処理し、かつ励起により化学発光を生じる標識物質を結合させたＴＳＨ抗体を含むものである。この実施例では、標識物質として例えばＲｕ（ｂｐｙ）₃、すなわちルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）を用いる。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃は緩衝液中ではＲｕ（ｂｐｙ）₃²⁺の形で存在する。緩衝液ボトル３内の緩衝液は、電圧の印加により還元され、標識物質の励起を誘引する物質を含むｐＨ７．４前後のものである。この実施例では、その誘引物質としてトリプロピルアミン（ＴＰＡ）を用いる。

【0047】

次にフロースルーセルユニットの構造を図２〜図４により説明する。

【0048】

フロースルーセルユニット１０はセル基板１８と、光電子倍増管１９を収納したＰＭＴケース２１と、セル基板１８とＰＭＴケース２１との間に位置する受光窓２２とを有し、セル基板１８と受光窓２２とはスペーサ１８Ａを介して一体化され、それらの間にフロースルーセルユニット１０内に導入された反応生成物を含む懸濁液が流れるフローチャンバー１７が形成されている。なお本明細書では特に、受光窓２２、スペーサ１８Ａ、セル基板１８、フローチャンバー１７、シート部材１８ｂ、作用電極１５、対向電極１６ａ、１６ｂ、流路入口３５、流路出口３６、ニップル５０，５１等からなる部材をフロースルーセル６と称している。フローチャンバー１７は図４に示すように上方から見て紡錘形をしており、紡錘形の一方の端部に流路入口３５が位置し、他方の端部に流路出口３６が位置し、流路入口３５及び流路出口３６はセル基板１８に取付けられたニップル５０，５１を介してそれぞれ導管Ｐ２，Ｐ３に接続されている。また、フローチャンバー１７の紡錘形の最大幅部中央下面には作用電極１５が配置され、作用電極１５の両側の同一平面上には一対の対向電極１６ａ，１６ｂが対称な形で配置されている。作用電極１５及び対向電極１６ａ，１６ｂはセル基板１８上に設けられたシート部材１８Ｂ上に取付けられ、かつそれらの一端はセル基板１８の外に延出し、図示しない電源及び制御装置に接続されている。作用電極１５の下方には磁石２４が位置し、磁石２４は、作用電極１５に接近し得るようセル基板１８に形成された凹所１８Ｃ内に配置されている。また、磁石２４は、磁石ホルダ２５に取付けられ、磁石ホルダ２５はレバー２５Ａの一端に取り付けられている。レバー２５Ａの他端はステッピングモータ２６に取付けられ、支点２８を中心にして回動可能であり、ステッピングモータ２６を動作させることにより、磁石２４は凹所１８Ｃ内の図示の作動位置とその外に出た二点鎖線で示す後退位置との間で出入可能である。

【0049】

光電子倍増管１９はフローチャンバー１７で発生し、受光窓２２を透過した光を計測するものであり、ここではＲ１８７８浜松ホトニクス社製を使用する。光電子倍増管１９は、磁気による倍増効率の低下を防ぐためにシールド管２０に覆われてＰＭＴケース２１内に収納されている。光電子倍増管１９の上方にはソケット２７が取付けられこのソケット２７を介して光電子倍増管１９の検出信号が図示しない制御装置に送られ、光強度が計測される。

【0050】

フローチャンバー１７の側面を形成するスペーサ１８Ａ及び下面を形成するシート部材１８Ｂはポリテトラフルオロエチレンからなる。またフローチャンバー１７は紡錘形の両端の最小幅Ｗ１は１ｍｍ、中央の最大幅Ｗ２は５ｍｍ、フローチャンバー長さＬは３３ｍｍ、開口角αは１６．２゜、厚さｔは０．５ｍｍである。またフローチャンバー１７の流路入口３５及び流路出口３６の直径は最小幅Ｗ１と等しくそれぞれ１ｍｍである。

【0051】

作用電極１５は白金からなり、図３及び図４に示すように、フローチャンバーに露出されている領域では、上辺長さ４．１ｍｍ、下辺長さ５ｍｍ、高さ（幅）３ｍｍの台形をなし面積は約１３．６ｍｍ²である。

【0052】

対向電極１６も作用電極１５と同様に白金からなり、作用電極１５と２ｍｍの間隔をあけて配置されている。

【0053】

フローチャンバー１７に対向する磁石２４の面は４．６ｍｍ×５ｍｍの方形であり、面積は２３ｍｍ²である。従って作用電極のフローチャンバー内に露出している領域の面積は、磁石の頂上部面積より小さく、前者の後者に対する比率は１３．６／２３＝５９％（２／３以下である）である。なお前者の後者に対する比率を１／３以下にする為には、例えば作用電極がフローチャンバーに露出されている台形領域の高さ（幅）を１．５ｍｍとすればよい。更に作用電極のフローチャンバー内に露出している領域の重心９１は磁石の頂上部の重心９２よりもフローの上流側にある。なお、今フローは流路入口３５から流路出口３６へ流れているため、流路入口３５に近いほうが上流側に相当する。

【0054】

また磁石は永久磁石であり、作用電極１５側にＮ極が着磁され、磁束密度０．８５Ｔを有している。この磁石２４は凹所１８Ｃ内の作動位置では作用電極１５の表面に対して１ｍｍ離れた距離に置かれる。受光窓２２は、光透過率９０％以上の非電導性プラスチック材料であるアクリルからなり、厚さ４ｍｍ、有効直径２５ｍｍの円板状である。

【0055】

次に、上記のように構成した本実施例の免疫分析装置の動作を説明する。

【0056】

サンプルボトル３１内の特定成分であるＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）を含む血清、尿等の生体液由来の試料５０μｌと、ビーズボトル３２内の緩衝液中に分散させたビーズ溶液５０μｌと、第１試薬ボトル３３内の末端をビオチン処理したＴＳＨ抗体を含む第１試薬５０μｌと、第２試薬ボトル３４内の末端をビオチン処理し、かつ励起により化学発光を生じる前記の標識物質を結合させたＴＳＨ抗体を含む第２試薬５０μｌと、緩衝液ボトル３内の前記誘引物質を含むｐＨ７．４前後の緩衝液５０μｌとをサンプリングプローブ３０により所定の順番に従って順にベッセル１内に分注する。ここではサンドイッチ法により分析するため、ビーズ溶液、第１試薬、試料、第２試薬の順番で分注する。

【0057】

また、分注動作中は、ベッセル１内を一定温度（この実施例では３７℃）に保温しながら図示しない振動装置により撹拌して反応を進行させ、分注動作後一定時間（この実施例では１５分間）保温と撹拌を継続する。これにより、磁性体粒子、第１試薬、試料中のＴＳＨ、及び第２試薬が結合した反応生成物を含む懸濁液がベッセル１内に生成される。

【0058】

次にベッセル１内の懸濁液をフロースルーセルユニット１０のフローチャンバー１７内に導入する。この操作は次のようにして行う。まず、図２において、ステッピングモータ２６を駆動して磁石２４を図２に実線で示す作動の位置に移動させておく。次に、図１において、第１ピンチ弁７を開け、第２ピンチ弁８及び第３ピンチ弁９を閉じる。この状態で、まずシッパープローブ２を図示しない駆動装置によりベッセル１の上方に水平移動した後下方に移動させ、その先端部をベッセル１内の懸濁液内に挿入する。

【0059】

次に、シリンジ１１によりベッセル１内の前記反応生成物を含む２５０μｌの懸濁液のうち２００μｌの懸濁液をシッパープローブ２内に吸引した後、シッパープローブ２を上方に移動させその先端部を懸濁液の外に出し、その後再びシリンジ１１によりシッパープローブ２内の懸濁液を吸引する。この吸引により２００μｌの懸濁液が導管Ｐ２を介してフロースルーセルユニット１０内に導入され、フローチャンバー１７内を流れる。このとき、懸濁液は流路入口３５から線速度５０ｍｍ／ｓでフローチャンバー１７内を流れるようにシリンジ１１の操作を制御する。懸濁液が作用電極１５上に達すると、磁石２４により局部的に形成される磁場により、反応生成物と未反応の磁性体粒子のみが作用電極１５上に捕捉され、その他の未反応の第１試薬と第２試薬はフローチャンバー１７を通過してシリンジ１１へと吸引される。このようにして、２００μｌの懸濁液に含まれていた全ての反応生成物をフローチャンバー１７内に集められＢ／Ｆ分離が行われる。

【0060】

次に、シッパープローブ２を洗浄槽５の上方に水平移動した後下方に移動し、その先端部を洗浄槽５内に位置させ、この状態で、ポンプ１２を駆動し、蒸留水ボトル１４内の蒸留水を導管Ｐ９、ポンプ１２、導管Ｐ１０を介して洗浄層５内に吐出させ、挿入されたシッパープローブ２の先端部の外側を洗浄する。洗浄槽５内に吐出された使用済みの蒸留水は廃液として洗浄槽５の底部から導管Ｐ１１を介して廃液ボトル１３に送液させる。

【0061】

次に、シッパープローブ２を上方に移動して先端部を洗浄槽５の外に出した後、緩衝液ボトル３の上方に水平移動させ更にシッパープローブ２を下方に移動してその先端部を緩衝液ボトル３内の緩衝液に挿入する。次にシリンジ１１により緩衝液ボトル３内の緩衝液を吸引し１０００μｌの緩衝液をフロースルーセルユニット１０内に導入する。この緩衝液の導入により、フロースルーセルユニット１０のフローチャンバー１７内に残存していた未反応の第２試薬が洗い流されＢ／Ｆ分離が完了する。このとき、洗浄に用いられた緩衝液と未反応の試薬は、フローチャンバー１７から導管Ｐ３、第１ピンチ弁７及び導管Ｐ４を通ってシリンジ１１内に吸入される。

【0062】

以上の操作によりフローチャンバー１７内は、作用電極１５上に反応生成物と未反応の第１試薬（磁性体粒子）が捕捉されており、それらの周囲すなわちフローチャンバー１７全体は、標識物質の励起を誘引するために用いられるＴＰＡを含む緩衝液によって満たされることになる。一方、シリンジ１１中に吸引されていた緩衝液と未反応の試薬は第１ピンチ弁７を閉じた後、第２ピンチ弁８を開けて、シリンジ１１により廃液ボトル１３中に吐出される。

【0063】

上記工程終了の後、作用電極１５とその同一平面上両側に配置された対向電極１６間に定められたシーケンスに基づいた電圧を印加し、下記の反応を行わせる。
１）ＴＰＡ→ＴＰＡ⁺ ＋ｅ^-
２）ＴＰＡ⁺ →ＴＰＡ^* ＋Ｈ⁺
３）Ｒｕ（ｂｐｙ）₃²⁺→Ｒｕ（ｂｐｙ）₃³⁺＋ｅ^-
４）Ｒｕ（ｂｐｙ）₃³⁺＋ＴＰＡ^* →Ｒｕ（ｂｐｙ）₃^2+*
５）Ｒｕ（ｂｐｙ）₃^2+* →Ｒｕ（ｂｐｙ）₃²⁺＋ｐｈｏｔｏｎ（６２０ｎｍ）
すなわち、電圧の印加により緩衝液中のＴＰＡが還元され、反応生成物中の標識物質であるＲｕ（ｂｐｙ）₃²⁺が発光する。この反応によって発生した光は、フローチャンバー１７上に設けられた透明の受光窓２２を通じて光電子倍増管１９の光電面に導入されてその発光量が計測され、ＴＳＨ濃度既知のコントロール物質を測定した際の発光量と比較して試料中のＴＳＨ濃度が算出される。

【0064】

上記反応工程に際して、作用電極１５上に磁性体粒子と結合してなる反応生成物を捕捉する目的で、配置した磁石２４は、光電子増倍管の増倍効率に対する磁界の影響を少なくするため、電圧の印加による電気化学的反応により発光を行わせる直前あるいは、できうるならば直後にステッピングモータ２８を駆動して作用電極１５面上に磁界の影響が及ばぬ後退位置に移動する。

【0065】

発光反応終了後、フローチャンバー１７内の洗浄を行う。まず、第１ピンチ弁７を開け、第２ピンチ弁８及び第３ピンチ弁９を閉じ、先に説明したのと同様に予め蒸留水により先端を洗浄しておいたシッパープローブ２を洗浄水ボトル４の上方に水平移動した後に、下方に移動し、その先端部を洗浄液ボトル４内の洗浄液内に挿入し、この状態で、シリンジ１１にて洗浄液ボトル４内の洗浄液の吸引を開始する。この際、洗浄効率を上げる目的でシリンジ１１により洗浄液を吸引している間にシッパープローブ２を上下させて洗浄液及び空気を一定量ずつ交互に吸引するのがよい。このように吸引された洗浄液は、導管Ｐ２を通じてフロースルーセルユニット１０内のフローチャンバー１７内に導びかれ、フローチャンバー１７内に残った反応終了後の緩衝液、反応生成物及び未反応の第１試薬（磁性体粒子）を洗い流す。この後、シリンジ１１内に吸引された廃液及び洗浄液は、第１ピンチ弁７を閉じ、第２ピンチ弁８を開け、シリンジ１１を押し出すことにより廃液ボトル１３内に吐出される。

【0066】

上記工程終了後、再び第２ピンチ弁８を閉じて第１ピンチ弁７を開け、予め蒸留水により先端を洗浄しておいたシッパープローブ２により緩衝液ボトル３内からＴＰＡを含む緩衝液をシリンジ１１を用いて１０００μｌ吸引し、導管Ｐ２及びフロースルーセルユニット１０のフローチャンバー１７内に残された洗浄液を洗い流した後、導管Ｐ２及びフローチャンバー１７内を緩衝液で置換する。この操作にて一試料に対するＴＳＨの測定が完了する。

【0067】

以上の操作及びフロースルーセル６を用いて、実際のＳＮ比の向上を検討する為、シグナルに相当するものとしてＴＳＨを含む緩衝液（濃度：１ｕＩＵ／ｍｌ）を、又ノイズに相当するものとして、ＴＳＨを含まず、標識物質の励起を誘引させる物質（ＴＰＡ）を含む緩衝液をそれぞれ測定し、発光量(任意単位）の比較を行った。その結果を表１に示す。

【0068】

【表1】

【0069】

表１では比較例１として図５に示す作用電極形状のフロースルーセルを用いた場合の測定結果を併記した。図５に示す作用電極１５−２はフローチャンバーに露出されている領域の面積は磁石の頂上部とほぼ一致しており、約２３．１ｍｍ²である。それ以外の構成は図４と同様である。従って作用電極のフローチャンバー内に露出している領域の面積は磁石の頂上部の面積よりわずかに大きく、前者の後者に対する比率は２３．１／２３＞１００％である。更に作用電極のフローチャンバー内に露出している領域の重心９１は磁石の頂上部の重心９２と一致している。

【0070】

表１から分かるように、本実施例１は比較例１よりＳＮ比（表１中のＳｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ）が高い。これは磁性体粒子を補足する領域に選択的に作用電極を配置したことで、ＴＳＨに由来する目的としている発光標識からの発光の割合に対して、発光誘引物質の発光の割合を向上することができた為と考えられる。

【実施例2】

【0071】

図６には本発明の別の実施形態を示す。

【0072】

フロースルーセルの構成は、作用電極形状以外は実施例１で作製したフロースルーセルと同様である。作用電極１５−３はフローチャンバーに露出されている領域では二股に分かれている。フローチャンバーの上流側にある露出領域を上流側作用電極露出領域、また下流側にある露出領域を下流側作用電極露出領域と称す。

【0073】

上流側作用電極露出領域はその上流側両端部に上流側凹部９４を有する。また上流側作用電極露出領域はその下流側に下流側凹部９５を有する。また上流側作用電極露出領域の重心９１−３は、磁石の頂上部の重心９２よりも上流側にあり、下流側作用電極露出領域の重心９３は、磁石の頂上部の重心９２よりも下流側にある。

【0074】

図６に示す作用電極１５−３はフローチャンバーに露出されている領域の面積は上流側作用電極露出領域と下流側作用電極露出領域を合わせて１４．５ｍｍ²とした。従って作用電極のフローチャンバー内に露出している領域の面積は磁石の頂上部の面積より小さく、前者の後者に対する比率は１４．５／２３＝６３％（２／３より小さい）である。

【0075】

表１から分かるように、本実施例２の方が比較例１更には実施例２よりもＳＮ比が高いことが分かる。これは作用電極形状をより磁性体粒子を補足する領域に近い形状とすることで、ＴＳＨに由来する目的としている発光標識からの発光の割合に対して、発光誘引物質の発光の割合を向上することができる為と考えられる。

【実施例3】

【0076】

本発明の他の実施例を示す。

【0077】

本実施例においては、作用電極の形状は従来と同様であるとする。受光窓２２は、捕捉領域の下流側から生じた発光が光電子増倍管に入らないよう、受光窓の一部が覆われている。これにより、ノイズ成分が多い領域からの発光が光電子増倍管に入らないので、ＳＮ比の向上につながる。また受光窓を覆うことで、電極形状の細かい加工・制御が不要となる（比較例と同じより簡便な形状でよい）。従って、電極形状を加工する際の電極端部等の加工精度ばらつきに由来する電気化学反応効率のばらつきを抑制することができる。即ち、フロースルーセル又は分析装置の有する精度を低下させることなく、ＳＮ比を向上することができる。

【符号の説明】

【0078】

１ ベッセル
２ シッパープローブ
３ 緩衝液ボトル
４ 洗浄液ボトル
５ 洗浄槽
６ フロースルーセル
７ 第１ピンチ弁
８ 第２ピンチ弁
９ 第３ピンチ弁
１０ フロースルーセルユニット
１１ シリンジ
１２ ポンプ
１３ 廃液ボトル
１４ 蒸留水ボトル
１５ 作用電極
１６ａ，１６ｂ 対向電極
１７ フローチャンバー
１８ セル基板
１８ａ スペーサ
１８ｂ シート部材
１８ｃ 凹所
１９ 光電子増倍管
２０ シールド管
２１ ＰＭＴケース
２２ 受光窓
２４ 磁石
２５ 磁石ホルダ
２５Ａ レバー
２６ ステッピングモータ
２７ ソケット
２８ 支点
３０ サンプリングプローブ
３１ サンプルボトル
３２ ビーズボトル
３３ 第１試薬ボトル
３４ 第２試薬ボトル
３５ 流路入口
３６ 流路出口
５０、５１ ニップル
８１ 磁石の頂上部に対応する領域
９１ 作用電極のフローチャンバー内に露出されている領域の重心
９１−３ 上流側作用電極露出領域の重心
９２ 磁石の頂上部の重心
９３ 下流側作用電極露出領域の重心
９４ 上流側凹部
９５ 下流側凹部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】