特許 6239383 食品防腐剤としての抗微生物ペプチドを含む組成物の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6239383

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】食品防腐剤としての抗微生物ペプチドを含む組成物の使用

(51)【国際特許分類】

   A23L 3/3526 20060101AFI20171120BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20171120BHJP

   A01N 65/20 20090101ALI20171120BHJP

   A01N 25/00 20060101ALI20171120BHJP

   A01N 37/44 20060101ALI20171120BHJP

【ＦＩ】

   A23L3/3526ZNA

   A01P3/00

   A01N65/20

   A01N25/00 101

   A01N37/44

【請求項の数】10

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-533202(P2013-533202)

(86)(22)【出願日】2011年10月12日

(65)【公表番号】特表2013-540442(P2013-540442A)

(43)【公表日】2013年11月7日

(86)【国際出願番号】EP2011067821

(87)【国際公開番号】WO2012049213

(87)【国際公開日】20120419

【審査請求日】2014年10月14日

(31)【優先権主張番号】1017283.1

(32)【優先日】2010年10月13日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】105331

(32)【優先日】2010年10月12日

(33)【優先権主張国】PT

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】513086452

【氏名又は名称】コンスモ エム ヴェルデ ビオテクノロジア ダス プランタス ソシエダット アノニマ

【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＵＭＯ ＥＭ ＶＥＲＤＥ − ＢＩＯＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ ＤＡＳ ＰＬＡＮＴＡＳ， Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】100167623

【弁理士】

【氏名又は名称】塚中 哲雄

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドラ マヌエラ ローレンソ カレイラ

(72)【発明者】

【氏名】サラ アレクサンドラ ヴァラダス ダ シルヴァ モンテイロ

(72)【発明者】

【氏名】リカルド マニュエル デ セイシャス ボアヴィダ フェレイラ

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５０５６３７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０８−１１９９９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／０１０１９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−０９５４７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／０９０４３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 アサマNEWSパートナー, (2000), [75], p.1-4

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｌ ３／００−３／３５９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微生物による食品の腐敗を防止または抑制するための、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるＢｌａｄ配列またはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用であって、前記活性異変体は抗菌作用を持ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも９０％の同一性を持つ配列を含む、組成物の使用であって、前記食品が植物食品であるときは、収穫された食品である、
使用。

【請求項2】

前記微生物が細菌または真菌である、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記細菌がシュードモナスまたはバチルス属からの食品腐敗種である、請求項２に記載の使用。

【請求項4】

前記真菌が以下の属：アルテルナリア、アスペルギルス、フザリウム、ボトリチス、コレトトリカム、サッカロマイセス、クルイベロマイセスおよびチゴサッカロマイセスの１つからの食品腐敗種である、請求項２に記載の使用。

【請求項5】

前記食品が果物、堅果、野菜、種子、糖、乳製品、液状もしくはペースト状食品、肉、魚またはパンから得られる、これらをもたらす、またはこれらそのものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記食品がイチゴである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

前記微生物がボトリチス・シネレアまたはコレトトリカム・アキュタタムである、請求項６に記載の使用。

【請求項8】

前記微生物がボトリチス・シネレアである、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

前記組成物がキレート剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。

【請求項10】

微生物による食品の腐敗の防止または抑制方法であって、それを必要とする食品に効果的な量の、請求項１または９に記載の組成物を投与するステップを含む、方法であって、前記食品が植物食品であるときは、収穫された食品である、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は食品を腐敗させる微生物を標的とする抗微生物剤の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

［序論］
食品保存は、内因性化学／酵素分解により引き起こされる、および／または微生物により引き起こされる、もしくは加速される、食品の腐敗を防止または抑制するための食品処理プロセスである。食品を保存するための多数の技術が存在するが、そのいくつかは内因性プロセスを抑制し（例えば抗酸化剤）、そのいくつかは微生物プロセスを抑制し（例えば抗微生物剤）、そのいくつかは両方のタイプのプロセスを抑制する（例えば冷凍）。食品の腐敗を抑制するのに用いられる化合物は一般的には防腐剤と称され、これは例えば抗酸化剤または抗微生物剤であってもよい。

【0003】

特定の食品保存技術としては、乾燥、加熱、冷蔵または冷凍、浸透抑制（例えばシロップまたは塩の使用）、真空包装、缶詰および瓶詰、ゼリー化、ポッティング、ジャギング、イオン化照射、パルス電界処理、高圧食品保存、および超高水圧食品保存、抗酸化剤の使用、ならびに／または抗微生物防腐剤（例えば二酸化硫黄、二酸化炭素、エタノール、酢酸、クエン酸、乳酸、ソルビン酸、安息香酸塩、硝酸塩および亜硝酸塩、亜硫酸塩、プロピオン酸カルシウムならびにメチルクロロイソチアゾリノン）の使用が挙げられる。

【0004】

比較的多数の食品保存技術が現在用いられているにもかかわらず、新しい抗微生物防腐剤を開発する必要性がある。これは、多くの既存の技術が微生物を効果的に標的とすることができないことならびに、とくに多くの既存の抗微生物防腐剤の効力および／または安全性の問題のためである。

【0005】

微生物の増殖に好ましくない条件を作り出そうとする多くの食品保存技術は、極限条件で生存する有機体に対しては非効果的である（例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種は非常に低温で増殖することができる；バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）は耐熱性かつ耐酸性である；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の多くの種は貧栄養性を示す；チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種は耐キセロ性を有する）。

【0006】

多くの既存の抗微生物防腐剤は、とくに自然または獲得耐性を有する微生物に対して、中程度の活性、および／または狭いスペクトルを有する。例えば、チゴサッカロマイセス種は、エタノール、酢酸、ソルビン酸、安息香酸および二酸化硫黄に高い耐性を有する。また、多数の既存の抗微生物防腐剤は、呼吸器の問題またはＡＤＤのような各種副作用に関連している。特定の例では、二酸化硫黄は喘息患者の気管支管には刺激性であり、亜硝酸塩は潜在的に発癌性であり、安息香酸塩は各種アレルギー、喘息、皮膚発疹および脳損傷に関連している。

【0007】

さらに、低ｐＨまたは低水分活性のような、食品における微生物増殖の効果的な抑制技術は、消費者にとって許容できない（例えば酸味を与える）ものが多く、または健康への悪影響（例えば高い塩分または糖分）を有する。

【0008】

本発明の目的は、これらの問題の解決を試みることであり、とくに、例えば低い毒性を有しつつ、微生物に対して強力で広スペクトルな活性を有する新規抗微生物剤を提供することである。

【発明の概要】

【0009】

本発明者らは、驚くべきことに、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ、ハウチワマメ）からのＢｌａｄポリペプチドが食品の腐敗を引き起こす多数の多様な細菌および真菌有機体に対して強力な抗微生物活性を示すことを見出した。本発明者らは、Ｂｌａｄポリペプチドが非毒性であり、従ってＢｌａｄが抗微生物食品防腐剤として用いるのに優れた化合物となることも見出した。

【0010】

従って、本発明者らは、微生物による食品の腐敗を防止または抑制するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。好適には、前記微生物は細菌（好適にはシュードモナスまたはバチルス属からの食品腐敗種）または真菌（好適には以下の属：アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびチゴサッカロマイセスの１つからの食品腐敗種）である。

【0011】

好適な実施形態では、食品は、果物、堅果、野菜、種子、糖、乳製品、液状もしくはペースト状食品、肉、魚またはパンから得られる、これらをもたらす、またはこれらそのものである。

【0012】

好適な実施形態では、食品はイチゴであり、好適にはこの場合微生物はボトリチス・シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）またはコレトトリカム・アキュタタム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ）、好適にはボトリチス・シネレアである。

【0013】

好適な実施形態では、前記組成物はキレート剤をさらに含む。

【0014】

本発明者らは、それを必要とする食品に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、微生物による食品の腐敗の防止または抑制方法も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】ルピナス・アルバス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ、シロバナハウチワマメ）β−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。

【図2】Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列の内部断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0016】

Ｂｌａｄ
Ｂｌａｄ（「ｂａｎｄａ ｄｅ Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ ｄｏｃｅ」―スイートＬ．アルバスからのバンド）は、β−コングルチン、ルピナス属の種中に存在する主要な貯蔵タンパク質の、安定した中間分解生成物に与えられた名称である。１７３個のアミノ酸残基からなり、ルピナスからのβ−コングルチンの前駆体をエンコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＡＳ９７８６５で公表される、１７９１個のヌクレオチド）の内部断片（ＧｅｎＢａｎｋにおいてアクセッション番号ＡＢＢ１３５２６で登録される、５１９個のヌクレオチド）によりエンコードされる２０ｋＤのポリペプチドとして特徴づけられる。Ｂｌａｄ末端配列をエンコードするプライマーを用いてゲノムルピナスＤＮＡからの配列を増幅する場合、〜６２０ｂｐの生成物が得られ、Ｂｌａｄをエンコードする遺伝子断片中のイントロンの存在を示す。自然発生Ｂｌａｄは、発芽の開始後４〜１２日の間、ルピナス種の子葉のみに（β−コングルチンの集中的かつ限定的なタンパク質分解の後）蓄積する、２１０ｋＤのグリコオリゴマーの主成分である。前記オリゴマーはグリコシル化しているが、自然発生Ｂｌａｄはグルコシル化していない。Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーは、いくつかのポリペプチドを含み、主なものは１４、１７、２０、３２、３６、４８および５０ｋＤの分子量を示す。２０ｋＤのポリペプチド、Ｂｌａｄは、オリゴマー中でもっとも豊富なポリペプチドであり、レクチン活性を有する唯一のものであると考えられる。自然発生Ｂｌａｄは８日齢の植物体中の総子葉タンパク質の約８０％を占める。

【0017】

Ｌ．アルバスβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を図１に示す。β−コングルチン親サブユニットをコードする配列は残基７０〜１６６８に位置する。エンコードされた、５３３個のアミノ酸残基のβ−コングルチン親サブユニット（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は：

である。

【0018】

Ｂｌａｄに対応するβ−コングルチン前駆体をエンコードする配列の内部断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を図２に示す。Ｂｌａｄポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）は：

である。

【0019】

本発明は、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物に関する。従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリペプチド配列またはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物に関する。代替実施形態では、組成物は本質的にＢｌａｄもしくはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドからなる、および／または抗微生物ポリペプチドは本質的にＢｌａｄもしくはその活性変異体からなる。さらなる実施形態では、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれらからなる）抗微生物ポリペプチドは分離形態で用いることができる。

【0020】

Ｂｌａｄの活性変異体は、抗微生物剤として作用する能力を保持する（すなわち、抗微生物活性を有する―こうした活性のレベルおよびどのように測定するかの説明は以下参照）Ｂｌａｄの変異体である。「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片を含む。好適な実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の長さの少なくとも１０％、好適には少なくとも２０％、好適には少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、好適には少なくとも５０％、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも９０％、もっとも好適にはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の長さの少なくとも９５％であるものが選択される。Ｂｌａｄまたはその変異体は一般的には、少なくとも１０個のアミノ酸残基、例えば少なくとも２０、２５、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０または１７３個のアミノ酸残基の長さを有する。

【0021】

「Ｂｌａｄの活性変異体」は、その範囲内に、例えば全配列について、または少なくとも２０個、好適には少なくとも３０個、好適には少なくとも４０個、好適には少なくとも５０個、好適には少なくとも６０個、好適には少なくとも８０個、好適には少なくとも１００個、好適には少なくとも１２０個、好適には少なくとも１４０個、もっとも好適には少なくとも１６０個以上の隣接するアミノ酸残基の領域について、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４との相同性、例えば少なくとも４０％の同一性、好適には少なくとも６０％、好適には少なくとも７０％、好適には少なくとも８０％、好適には少なくとも８５％、好適には少なくとも９０％、好適には少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、もっとも好適には少なくとも９９％同一性を有するポリペプチド配列も含む。タンパク質相同性の測定方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、本文脈では相同性はアミノ酸同一性（「ハード相同性」と称されることもある）に基づいて計算されることを理解するだろう。

【0022】

相同活性Ｂｌａｄ変異体は一般的には、置換、挿入または削除、例えば１、２、３、４、５〜８個以上の置換、挿入または削除によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のポリペプチド配列とは異なる。置換は好適には「保守的」である、すなわちアミノ酸を同様のアミノ酸で置換することができ、それによって同様のアミノ酸は以下の群：芳香族残基（Ｆ／Ｈ／Ｗ／Ｙ）、非極性脂肪族残基（Ｇ／Ａ／Ｐ／Ｉ／Ｌ／Ｖ）、極性非荷電脂肪族（Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ／Ｎ／Ｑ）および極性荷電脂肪族（Ｄ／Ｅ／Ｋ／Ｒ）の１つを共有する。好適な亜群は：Ｇ／Ａ／Ｐ；Ｉ／Ｌ／Ｖ；Ｃ／Ｓ／Ｔ／Ｍ；Ｎ／Ｑ；Ｄ／Ｅ；およびＫ／Ｒを含む。

【0023】

（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端にいずれかの数のアミノ酸残基を付加したＢｌａｄまたはその活性変異体からなり得るが、ただしポリペプチドは抗微生物活性を保持する（同様に、こうした活性のレベルおよびこれをどのように測定するかの説明は以下参照）。好適には、３００個以下のアミノ酸残基、より好適には２００個以下のアミノ酸残基、好適には１５０個以下のアミノ酸残基、好適には１００個以下のアミノ酸残基、好適には８０個、６０個または４０個以下のアミノ酸残基、もっとも好適には２０個以下のアミノ酸残基をＢｌａｄまたはその活性変異体の一端または両端に付加する。

【0024】

（上述のような）Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドは、本発明において（例えば植物、動物または微生物供給源から取り出した）精製および／または組換えタンパク質の形態で用いることができる。組換え形態の製造はＢｌａｄの活性変異体の製造を可能にする。

【0025】

自然発生Ｂｌａｄの精製方法は当技術分野においてすでに説明されている（例えばＲａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ ２０３（１）：２６−３４およびＭｏｎｔｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（１）：ｅ８５４２）。自然発生Ｂｌａｄの適切な供給源は、好適には発芽の開始後約４〜約１４日の間に採取された、より好適には発芽の開始後約６〜約１２日の間（例えば発芽の開始から８日後）に採取された、ルピナス・アルバスのようなルピナス属の植物、好適には該植物の子葉である。当技術分野では、Ｂｌａｄを含む粗抽出物をもたらす総タンパク質抽出方法、およびこうした抽出物の、例えばＢｌａｄを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーを含む部分精製抽出物をもたらすタンパク質精製方法が開示されている。

【0026】

Ｂｌａｄそのものを分離するには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／または、好適にはＣ−１８カラム上での逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣを用いることができる。

【0027】

Ｂｌａｄを含むグリコオリゴマーを含む部分精製抽出物を得る代替方法は、Ｂｌａｄのキチン結合活性を用いることである。グリコオリゴマーは、キチン親和性クロマトグラフィー精製の一部として、キチンカラムと非常に強く結合し、０．０５ＮのＨＣｌで溶離される。この精製方法の一例の詳細は以下のとおりである：

【0028】

８日齢のルピナス属植物から子葉を採取し、１０ｍＭのＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２を含有するＭｉｌｌｉ−Ｑ ｐｌｕｓ水（ｐＨは８．０に調節）中に均質化する。そのホモジェネートをチーズクロスに通してろ過し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。ペレットをその後、１０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するｐＨ７．５の１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤中に懸濁させ、４℃で１時間撹拌し、４℃で、１時間３０，０００ｇで遠心分離する。浮遊物に含まれる総グロブリン画分を硫酸アンモニウム（５６１ｇ／ｌ）で沈殿させ、冷却しながら１時間撹拌しつづけ、４℃で、３０分間３０，０００ｇで遠心分離する。得られたペレットを、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤に溶解し、同じ緩衝剤で平衡化したＰＤ−１０カラム中で脱塩し、同じ緩衝剤で予め平衡化したキチン親和性クロマトグラフィーカラムに通す。カラムをｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で洗浄し、結合タンパク質を０．０５ＮのＨＣｌで溶離する。溶離した画分をすぐに２Ｍのトリスで中和し、ピーク画分を溜め、凍結乾燥させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。

【0029】

キチンカラムの製造について、粗キチンをＳｉｇｍａから入手し、以下のとおり処理する：キチン試料をＭｉｌｌｉ−Ｑ ｐｌｕｓ水のみで、その後０．０５ＮのＨＣｌで洗浄する。次に１％（ｗ／ｖ）の炭酸ナトリウムで、次にエタノールで、洗浄剤の吸収度が０．０５未満になるまで洗浄する。キチンを次にピペット先端に充填し、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝剤で平衡化する。

【0030】

組換えタンパク質の製造方法は当技術分野において周知である。ここで適用されるこうした方法は、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含むポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入するステップ、該ポリヌクレオチドの１つ以上のプロモーター（例えばＴ７ｌａｃのような誘導性プロモーター）との、および対象の他のポリヌクレオチドまたは遺伝子との並置を可能にするステップ、発現ベクターを適切な細胞または有機体（例えばエシェリキア・コリ）中に導入するステップ、形質転換細胞または有機体においてポリペプチドを発現するステップ、ならびに発現した組換えポリペプチドをその細胞または有機体から取り出すステップを含む。こうした精製を補助するため、発現ベクターは、ポリヌクレオチドが、例えば精製を補助することができる末端タグ：例えば、親和性精製のためのヒスチジン残基のタグをさらにエンコードするように構成することができる。組換えポリペプチドを精製した後、精製タグは、例えばタンパク質分解開裂により、ポリペプチドから取り出すことができる。

【0031】

Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物では、該ポリペプチドは好適には部分精製形態、より好適には精製形態である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する１つ以上の他のポリペプチドを有さない環境中に存在する、および／または存在する総タンパク質の少なくとも約１０％に相当する場合、部分精製である。前記ポリペプチドは、これに自然と関連する他のポリペプチドをすべて、またはほとんどの有さない環境中に存在する場合、精製である。例えば、精製Ｂｌａｄとは、Ｂｌａｄが組成物中の総タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％に相当することを意味する。

【0032】

Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物では、ルピナスタンパク質分は本質的にＢｌａｄまたはその活性変異体を含む（または本質的にこれからなる）ポリペプチドを含むＢｌａｄ含有グリコオリゴマーからなり得る。

【0033】

Ｂｌａｄを含む（または本質的にこれからなる）抗微生物ポリペプチドを含む組成物は、当業者により組成物に添加された別の化合物を含む製剤とすることもできる。

【0034】

食品腐敗および食品
微生物による食品の腐敗とは、その栄養および／または商業的価値を低下させる、例えば味、臭いまたは外観（例えば形、色、質感、硬度）の変化をもたらす、微生物による食品のいずれかの変質を意味する。食品の語により、栄養または楽しみを理由にヒトまたは動物により消費されるいずれかの液体または固体物質を意味することを意図している。食品は直接または間接的に（例えば、穀類の精製のように、調理または加工後に）消費され得る。

【0035】

適用できる場合、食品は好適には、収穫された植物食品（例えば果物、野菜、種子）および動物から分離された製品（例えば肉、魚、乳）のように、その自然環境から分離された形態で考慮される。

【0036】

食品は、果物、堅果、野菜、種子、糖、乳製品、液状もしくはペースト状食品、肉、魚またはパンから得ることができる、これらをもたらすことができる、またはこれらそのものとすることができる。果物から得られる食品としてはワインおよびフルーツジュースが挙げられる。種子をもたらす植物としては、穀類（例えばトウモロコシ、小麦、大麦、モロコシ、キビ、米、カラス麦およびライ麦）およびマメ科植物（例えばマメ、エンドウマメおよびレンズマメ）が挙げられる。糖類、好適にはスクロースは、テンサイまたはサトウキビから得ることができる。乳製品としては、ミルク、クリーム、チーズおよびヨーグルトが挙げられる。液状またはペースト状食品としては、スープ、ソース、ピクルス、マヨネーズ、サラダクリームおよび他のサラダドレッシング、ジャム、シロップならびに乳児食品が挙げられる。考慮される肉および／または魚食品は加工されていてもいなくてもよく、調理されていてもされていなくてもよい。さらに考慮される特定の食品は次のセクションで説明するが、ここでは本発明の使用および方法において標的とすることができる微生物により腐敗され得る食品の例について記載する。

【0037】

食品は、サンドイッチ、パイ、キッシュ等のような調理済み複合食品、とくに現在チルド保存用にデザインされているものも含む。

【0038】

微生物標的
本発明者らは、微生物による食品の腐敗を防止または抑制するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。食品の腐敗を引き起こし得る微生物―食品腐敗微生物―としては、とくに、細菌および真菌が挙げられる。こうした使用では、抗微生物ポリペプチドは抗微生物食品防腐剤とみなすことができる。

【0039】

抗微生物ポリペプチドを用い、グラム陽性またはグラム陰性細菌による食品の腐敗を防止または抑制することができる。とくに好適な細菌標的（括弧内にはそれらが腐敗させ得る食品の例を記載）としては：食品腐敗シュードモナス種、例えばシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、シロイヌナズナおよびレタス）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ、各種植物性食品、例えばビート、小麦および大麦）、シュードモナス・トラシイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｌａａｓｉｉ、キノコ）、シュードモナス・アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｇａｒｉｃｉ、キノコ）、シュードモナス・フラジ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、乳製品）およびシュードモナス・ルンデンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ、ミルク、チーズ、肉および魚）、もっとも好適にはＰ．アエルギノサ；ならびに食品腐敗バチルス種、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、トマト、ジャガイモ、パン）およびバチルス・コアグランス（ミルク、トマトジュース）が挙げられる。

【0040】

抗微生物ポリペプチドを用い、単細胞（酵母）または多細胞（糸状）真菌による食品の腐敗を防止または抑制することができる。とくに好適な酵母菌標的（括弧内にはそれらが腐敗させ得る食品の例を記載）としては：食品腐敗サッカロマイセス種、例えばサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、糖、液糖、ワイン、およびフルーツジュースのようなソフトドリンク）；食品腐敗クルイベロマイセス種、例えばクルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、チーズ）；ならびに食品腐敗チゴサッカロマイセス種、例えばチゴサッカロマイセス・バイリ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、ワイン、フルーツジュース、サラダドレッシングおよびトマトソース）およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、液糖、フルーツジュース、ジャムおよびサラダドレッシング）が挙げられる。とくに好適な糸状菌標的（括弧内にはそれらが腐敗させ得る食品の例を記載）としては：食品腐敗アルテルナリア種、例えばアルテルナリア・アルテルナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、ジャガイモ）、アルテルナリア・アルボレセンス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ、トマト）、アルテルナリア・アルブスチ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｒｂｕｓｔｉ、ナシ）、アルテルナリア・ブラシカエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ、野菜）、アルテルナリア・ブラシシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ、アブラナ属作物）、アルテルナリア・カロチインクルタエ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃａｒｏｔｉｉｎｃｕｌｔａｅ、ニンジン）、アルテルナリア・コンジャンクタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｃｏｎｊｕｎｃｔａ、パースニップ）、アルテルナリア・ダウシ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｄａｕｃｉ、ニンジン）、アルテルナリア・ユーフォルビイコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｅｕｐｈｏｒｂｉｉｃｏｌａ、アブラナ属作物）、アルテルナリア・ガイセン（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｇａｉｓｅｎ、セイヨウナシ）、アルテルナリア・インフェクトリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｏｒｉａ、小麦）、アルテルナリア・ジャポニカ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ、アブラナ属作物）、アルテルナリア・ペトロセリニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｉ、パセリ）、アルテルナリア・セリニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｅｌｉｎｉ、パセリ）、アルテルナリア・ソラニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ、ジャガイモ、トマト）およびアルテルナリア・スミルニ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｍｙｒｎｉｉ、アレクサンダース、パセリ）；食品腐敗アスペルギルス種、例えばアスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、堅果、ジャガイモ、米およびパン）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、果物および野菜、例えばブドウおよびタマネギ）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、穀物、ピーナツ）；食品腐敗フザリウム種、例えばフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、果物）およびフザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、大麦、小麦およびトウモロコシ）；食品腐敗ボトリチス種、例えばボトリチス・シネレア（イチゴ、ブドウおよびトマト）；ならびに食品腐敗コレトトリカム種、例えばコレトトリカム・アキュタタム（イチゴ、セロリ、リンゴ、アボカド、ナス、コーヒーおよびグアバ）、コレトトリカム・ココデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｄｅｓ、トマト、ジャガイモ）、コレトトリカム・カプシシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｐｓｉｃｉ、バジル、ヒヨコマメ、コショウ）、コレトトリカム・クラシペス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｒａｓｓｉｐｅｓ、パッションフルーツ）、コレトトリカム・グロエスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、野菜および果物、例えばマルメロおよびリンゴ）、コレトトリカム・グラミニコラ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、穀類）、コレトトリカム・カハワエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｋａｈａｗａｅ、コーヒー）、コレトトリカム・リンデムチアヌム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ、マメ）、コレトトリカム・ムサエ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｍｕｓａｅ、バナナ）、コレトトリカム・ニグラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｎｉｇｒｕｍ、トマト）、コレトトリカム・オルビクラレ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ、メロン、キュウリ）、コレトトリカム・ピシ（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｐｉｓｉ、エンドウマメ）およびコレトトリカム・サブリネオラム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｕｂｌｉｎｅｏｌｕｍ、米）が挙げられる。

【0041】

好適な実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、微生物による果物、好適にはイチゴの腐敗を防止または抑制するために用いられ、好適にはこの場合微生物はボトリチス・シネレアまたはコレトトリカム・アキュタタム、好適にはボトリチス・シネレアである。

【0042】

当業者であれば、日常的な方法によって、抗微生物ポリペプチドを用いていずれかの特定の背景における腐敗を防止または抑制するのに適した濃度（すなわち効果的な濃度）を識別することができるだろう。好適には、例えば、Ｂｌａｄは少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、または少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、および３５０μｇ／ｍｌまで、５００μｇ／ｍｌまで、６００μｇ／ｍｌまで、１ｍｇ／ｍｌまで、２．５ｍｇ／ｍｌまで、５ｍｇ／ｍｌまでまたは１０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で用いられる。好適には、選択されるＢｌａｄの濃度は１０μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、より好適には５０μｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌ、より好適には１００μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好適には１５０μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ（例えば約２５０μｇ／ｍｌ）である。本発明者らは、Ｂｌａｄが少なくとも４００μｇ／ｍｌまでは動物に非毒性である証拠（実施例４および５を参照）を提供した。

【0043】

本発明者らは、驚くべきことに、Ｂｌａｄのキレート剤（例えばＥＤＴＡ）との組み合わせが相乗的な抗微生物効果を生むことを見出した。従って、好適には、キレート剤は抗微生物ポリペプチドの抗微生物活性を向上させるのに用いられ、こうしたキレート剤の使用は特定のレベルの腐敗の防止または抑制を達成するのに必要な抗微生物ポリペプチドの濃度を低下させることができる。キレート剤（別名、金属イオン封鎖剤）は、金属イオンと結合し、非共有複合体を形成し、イオンの活性を低減するいずれかの化合物である。適切なキレート剤としては、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）およびＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）のようなポリアミノカルボキシレートが挙げられる。好適には、ＥＤＴＡはキレート剤として、好適には少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、または少なくとも１００μｇ／ｍｌ、および５００μｇ／ｍｌまで、１ｍｇ／ｍｌまで、５ｍｇ／ｍｌまで、１０ｍｇ／ｍｌまで、または２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度で用いられる。好適には、ＥＤＴＡは０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0044】

成果
抗微生物ポリペプチドを用い、食品上で食品腐敗微生物の増殖を阻害する（静微生物活性を有することを意味する）、および／または該微生物を殺滅する（殺微生物活性を有することを意味する）ことができ、微生物による該食品の腐敗が防止または抑制される。当業者であれば、微生物のとくに所望の増殖阻害または殺滅を達成するのに適した用量および／または濃度を識別することができる。

【0045】

好適には、静微生物剤として用いる場合、抗微生物ポリペプチドは、抗微生物ポリペプチドが存在しない同等の条件と比べて、増殖率を１０％、より好適には５０％、より好適には７５％、より好適には９０％、より好適には９５％、より好適には９８％、より好適には９９％、さらにより好適には９９．９％低減する。もっとも好適には、抗微生物ポリペプチドは微生物のいかなる増殖も防止する。

【0046】

好適には、殺微生物剤として用いる場合、抗微生物ポリペプチドは、抗微生物ポリペプチドが存在しない同等の条件と比べて、微生物の集団の１０％、より好適には該集団の５０％、より好適には該集団の７５％、より好適には該集団の９０％、より好適には該集団の９５％、より好適には該集団の９８％、より好適には該集団の９９％、さらにより好適には該集団の９９．９％を殺滅する。もっとも好適には、抗微生物ポリペプチドは微生物の集団のすべてを殺滅する。

【0047】

微生物による食品の腐敗を防止または抑制するのに用いる場合、抗微生物ポリペプチドは好適には効果的な量、すなわち、好適には抗微生物ポリペプチドが存在しない同等の条件と比べて、検出可能なレベルの腐敗防止または抑制（例えば腐敗率の低下）が達成されるレベルの微生物の増殖阻害および／または殺滅をもたらす量で用いられる。好適には、効果的な量の抗微生物ポリペプチドはヒトまたは動物に非毒性である。

【0048】

使用および方法
本発明者らは、微生物による食品の腐敗を防止または抑制するための、Ｂｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物の使用を提供する。この目的のため、彼らは、それを必要とする食品に効果的な量のＢｌａｄまたはその活性変異体を含む抗微生物ポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、微生物による食品の腐敗の防止または抑制方法も提供する。好適には、効果的な量の抗微生物ポリペプチドはヒトまたは動物に非毒性である。腐敗の防止または抑制は、食品の貯蔵、輸送、取扱、加工または陳列中に起こり得る。

【0049】

抗微生物ポリペプチドを含む組成物は例えば食品中に混合することができ、または例えば食品の表面に（例えば液膜または噴霧として）塗布してもよい。また食品は前記組成物中に浸漬し（および任意でその中に維持し）てもよい。いずれかの特定の食品について、防腐剤としての前記組成物の使用は、乾燥、加熱、冷蔵または冷凍、浸透抑制（例えばシロップまたは塩の使用）、真空包装、缶詰および瓶詰、ゼリー化、ポッティング、ジャギング、イオン化照射、パルス電界処理、高圧食品保存、および超高水圧食品保存、抗酸化剤の使用、ならびに／または他の抗微生物防腐剤（例えば二酸化硫黄、二酸化炭素、エタノール、酢酸、クエン酸、乳酸、ソルビン酸、安息香酸塩、硝酸塩および亜硝酸塩、亜硫酸塩、プロピオン酸カルシウムならびにメチルクロロイソチアゾリノン）の使用を含む、その他の周知の食品保存技術、抗微生物剤等と組み合わせることができる。

【実施例】

【0050】

以下の実施例では、ＢＬＡＤは、Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔａ ２０３（１）：２６−３４：文献のＭａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓセクションの“Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ”および“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”部分参照、に従って精製した２０ｋＤのＢｌａｄポリペプチドを含む自然発生Ｂｌａｄ含有グリコオリゴマーを示す。

【0051】

定義：
ＭＩＣ―最小阻害濃度：微生物の目に見える増殖を阻害するもっとも低い抗微生物剤の濃度
ＭＦＣ／ＭＢＣ―最小殺真菌／殺細菌濃度（または最小致死濃度）：標準の条件下、２４時間後に初期接種の９９．９％を殺滅するのに必要なもっとも低い抗微生物剤の濃度

【実施例1】

【0052】

ＢＬＡＤの殺細菌活性
［各種細菌種についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＢＣ（ミューラー・ヒントン培地を用いる）］

【表1】

【0053】

とくに、Ｐ．アエルギノサおよびＢ．サブチリスは食品の腐敗を引き起こし得る。ＢＬＡＤは、Ｐ．アエルギノサに対して、１００μｇ／ｍｌで静細菌性であり、２５０μｇ／ｍｌで殺細菌性であることが見出された。Ｐ．アエルギノサに対して、ＢＬＡＤは５０μｇ／ｍｌで、またはＥＤＴＡは１ｍｇ／ｍｌで増殖を阻害する（すなわち両方とも静細菌性である）が、２つの組み合わせは殺細菌性である。

【実施例2】

【0054】

ＢＬＡＤの殺真菌活性
［各種糸状真菌についてのＢＬＡＤのＭＩＣおよびＭＦＣ（ＲＰＭＩ培地を用いる）］

【表2】

【0055】

［各種糸状真菌についてのＢＬＡＤのＭＩＣ（各種培地を用いる）］

【表3】

【0056】

［０．６％または０．９％ｗ／ｖのポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）（２５℃で３日培養）上でのボトリチス・シネレアＢＭに対するＢＬＡＤの阻害ハロ直径データ］

【表4】

【0057】

０．６％寒天上、Ｂ．シネレアの増殖は、ＢＬＡＤの量を２０μｇから２００μｇまで増加させることによりますます阻害された。０．９％寒天上で５ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌでは顕著な阻害は見られなかった。

【0058】

［０．９％（ｗ／ｖ）の寒天を有するＰＤＡ（２５℃で３〜５日培養）上での各種酵母菌に対する２００μｇ／ディスクのＢＬＡＤの阻害ハロ（直径）データ］

【表5】

【0059】

ＢＬＡＤは２００μｇ／ディスクで、すべて食品の腐敗を引き起こし得る、これらの酵母菌のすべての顕著な増殖阻害を示した。

【実施例3】

【0060】

イチゴ防腐／除染試験
ＢＬＡＤでの処理後、Ｂ．シネレア汚染に対するイチゴの感受性を調べた。商業的な供給業者より供給される無処理のイチゴの３８％までが汚染されることが見出され（サンプルサイズ：５００ｇの箱１０個）、イチゴ汚染の問題を示した。

【0061】

試験プロトコル
１．均質な代表となるサンプルを用意する。
２．水中で洗浄し、７０％ｖ／ｖエタノールを用いて除染する。
３．水中で２回すすぐ。
４．各種濃度のＢＬＡＤで処理する（対照については省略した）：処理溶液中に１分間浸漬させた後、（滅菌水を含んで湿ったスポンジ、ろ紙およびプラスチックメッシュを含有する）培養ペトリ皿において乾燥させる。
５．各イチゴに１〜５×１０^６胞子／ｍｌのＢ．シネレア胞子溶液１０μｌを接種する。
６．以下の条件下で５日間培養する：
温度：２５℃（＋／−３℃）
相対湿度：８０〜９０％
光：直射日光から保護
７．間を置いて、１ｇのサンプルを収集し、ボルテックスを用いて均質化する。
８．一連の１０進希釈を行う。
９．固体培地上に分散させ、コロニー数測定を行う。

【0062】

すべての取扱技術は、オートクレーブ材料を用い、滅菌条件下で行われた。

【0063】

以下のデータは、Ｂ．シネレア胞子溶液を接種した後Ｂ．シネレアに感染したイチゴの割合を表す。

【表6】

【0064】

ＢＬＡＤは１５０μｇ／ｍｌ〜３５０μｇ／ｍｌの濃度で、Ｂ．シネレアでの汚染の開始を顕著に遅延させ、対照と比べて汚染イチゴの合計割合を低減させた。

【実施例4】

【0065】

モルモットにおけるＢＬＡＤの経皮毒性実験
化学物質の試験のためのＯＥＣＤガイドライン、Ｎｏ．４０２、急性経皮毒性を用いて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｄｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉａによりリスボン工科大学獣医学部で行われた機密実験（２００６年７月１８日〜２００６年８月１日）。実験は優良実験室規範および動物福祉に従って行われた。

【0066】

ＢＬＡＤの急性経皮毒性は、経皮毒性実験に適した動物として広く受け入れられている、モルモットへの単回投与後に評価された。ＢＬＡＤを、各１０匹の２群の無毛皮膚に、それぞれ２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌ投与した。投与後、動物を１５日間観察し続け、その間の体重、罹患率および死亡率を記録した。

【0067】

材料および方法
１．材料
試験項目：ＢＬＡＤを５ｍｇ／ｍｌで用意し（黄色がかった不透明な液体、０〜４℃）、−８０℃で保存した。
動物：アルビノモルモット；系統：バルセロナのＨａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａによるダンキン・ハートレイ（ＨｓｄＰｏｃ：ＤＨ）
用いた動物の数：３０
体重：４００〜４４９ｇ
齢：６週
ハウス：動物を消毒した木粉（リグノセル）が入ったポリエチレンの箱に個別に入れた。
周囲条件：
ａ）光周期：１２時間毎の明／暗のサイクル
ｂ）制御環境：１９／２２℃の平均温度および６０％の平均湿度
適応：動物は試験の開始前の７日間、試験の環境条件下に置いた。
食糧：バルセロナのＨａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａにより供給されるＧｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ２０１４、Ｒｏｄｅｎｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｄｉｅｔ；水、適宜

【0068】

２．方法
投与：動物を試験の４８時間前に剃毛し、病変のない皮膚を持つ動物のみに実験を行った。１ｍｌのアリコート（２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌ）を各動物の剃毛した皮膚に投与した。
実験デザイン：実験の３０匹の動物を４つの群、各１０匹の２群および各５匹の２群に分けた。１つの群の１０匹には２００μｇ／ｍｌでＢＬＡＤを投与し（試験群１）、もう１つの群の１０匹にはＢＬＡＤを４００μｇ／ｍｌで投与した（試験群２）。５匹の２群は対照とした：１つの群には水（１ｍｌアリコート）を投与し、もう１つの群はすべての他の群と同様に扱ったが、いずれの投与も行わなかった。
成果：投与後、動物を１５日間毎日観察し、罹患のいずれかの兆候、または死亡を記録した。罹患に関して、投与部位での皮膚病変の発症および正常な行動パターンの変化のような一般的な毒性の兆候にとくに注意を払った。体重は投与前および試験期間の終わりに個別に測定した。

【0069】

結果
どちらの濃度のＢＬＡＤでも、経皮投与領域におけるいずれかの物理的な変化または飲水／摂食もしくは一般行動の変化の兆候は見られなかった。ＢＬＡＤ投与後、副作用も死亡も起こらなかった。体重の増加はすべての群において同様だった（こうした幼齢の動物の成長から予想される増加と一致していた）。

【0070】

結論
４００μｇ／ｍｌまでの（あるいはこれより高い）濃度のＢＬＡＤは経皮毒性を示さない。

【実施例5】

【0071】

アルビノラットにおけるＢＬＡＤの経口毒性実験
化学物質の試験のためのＯＥＣＤガイドライン、Ｎｏ．４０１、急性経口毒性を用いて、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｄｅ Ａｇｒｏｎｏｍｉａによりリスボン工科大学獣医学部で行われた機密実験。実験は優良実験室規範および動物福祉に従って行われた。

【0072】

ＢＬＡＤの急性経口毒性は、経口毒性実験に適した動物として広く受け入れられている、ラットへの単回投与後に評価された。ＢＬＡＤは強制給餌により、各１０匹の２群に、それぞれ２００μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌで投与した。投与後、動物を１５日間観察し続け、その間の体重、罹患率および死亡率を記録した。観察期間後、動物は安楽死させ、剖検を行った。

【0073】

材料および方法
１．材料
試験項目：ＢＬＡＤを５ｍｇ／ｍｌで用意し（黄色がかった不透明な液体、０〜４℃）、−８０℃で保存した。
動物：ラタス・ノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）；系統：バルセロナのＨａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａからリスボンの獣医学部の動物飼育場が入手したウィスター・ハノーバー
用いた動物の数：３０
体重：２５０〜３００ｇ
齢：１０週
ハウス：動物は消毒した木粉（リグノセル）が入ったポリエチレンの箱に個別に入れた。
周囲条件：
ａ）光周期：１２時間毎の明／暗のサイクル
ｂ）制御環境：１９／２２℃の平均温度および６０％の平均湿度
適応：動物は試験の開始前の７日間、試験の環境条件下に置いた。
食糧：バルセロナのＨａｒｌａｎ Ｉｂｅｒｉｃａより供給されるＧｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔ２０１４、Ｒｏｄｅｎｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｄｉｅｔ；水、適宜

【0074】

２．方法
投与：１ｍｌのアリコート（２００μｇ／ｍｌまたは４００μｇ／ｍｌ）を各動物に、胃一般的には強制給餌として知られる経口（経口腔食道）挿管法により投与した。投与は用いた動物の種に適した金属プローブで行った。動物は投与前の１８時間は絶食させ、投与の３時間後に給餌した。
実験デザイン：実験の３０匹の動物を４つの群、各１０匹の２群および各５匹の２群に分けた。１つの群の１０匹には２００μｇ／ｍｌでＢＬＡＤを投与し（試験群１）、もう１つの群の１０匹にはＢＬＡＤを４００μｇ／ｍｌで投与した（試験群２）。５匹の２群は対照とした：１つの群には水（１ｍｌアリコート）を投与し、もう１つの群はすべての他の群と同様に扱ったが、いずれの投与も行わなかった。
成果：投与後、動物を１５日間毎日観察し、罹患の兆候、または死亡を記録した。体重は投与前および試験期間の終わりに個別に測定した。観察期間後、動物は、その後の剖検のため、（二酸化炭素で飽和した雰囲気下での窒息により）安楽死させた。

【0075】

結果
どちらの濃度のＢＬＡＤでも、いずれかの物理的な変化または飲水／摂食もしくは一般行動の変化の兆候も見られなかった。ＢＬＡＤ投与後、副作用も死亡も起こらなかった。体重の増加はすべての群において同様だった（こうした幼齢の動物の成長から予想される増加と一致していた）。剖検／胸腔および腹腔の器官の肉眼観察でそれに変化がないことがわかった。

【0076】

結論
４００μｇ／ｍｌまでの（あるいはこれより高い）濃度のＢＬＡＤは経口毒性を示さない。

【図1】

【図2】