特許 6239568 乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6239568

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20171120BHJP

   A23L 29/269 20160101ALI20171120BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20171120BHJP

   C12R 1/25 20060101ALN20171120BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   A23L29/269

   A61K35/747

   C12N1/20 A

   C12R1:25

【請求項の数】4

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-208257(P2015-208257)

(22)【出願日】2015年10月22日

(62)【分割の表示】特願2014-91690(P2014-91690)の分割

【原出願日】2014年4月25日

(65)【公開番号】特開2016-73283(P2016-73283A)

(43)【公開日】2016年5月12日

【審査請求日】2016年7月29日

(31)【優先権主張番号】特願2013-93238(P2013-93238)

(32)【優先日】2013年4月26日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-1496

(73)【特許権者】

【識別番号】398018537

【氏名又は名称】株式会社ピックルスコーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】特許業務法人 大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中西 愛美

(72)【発明者】

【氏名】高橋 恵理子

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１０−０２９１１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１０２９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５３３２９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本家政学会誌，２００７年，vol.58, no.6，pp.337-341

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４９６）。

【請求項2】

請求項１に記載の乳酸菌を含む食品添加剤。

【請求項3】

請求項１に記載の乳酸菌を含む食品。

【請求項4】

請求項１に記載の乳酸菌を含む薬剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤に関し、特に、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、食品、薬剤に関する。

【背景技術】

【0002】

植物性乳酸菌として、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）が知られている（特許文献１、２）。ラクトバチルス・プランタラムをはじめとする乳酸菌は、腸内細菌叢（腸内フローラ）を良好な状態に保つヒトに有益な生理機能を発揮することが知られている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００９−８２１２７号公報

【特許文献2】特開２０１２−９３号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

乳酸菌が腸内細菌叢を良好な状態に保つ生理機能を発揮するためには、乳酸菌が胃酸によって死滅することなく胃内を経て腸内に到達する必要がある。つまり、乳酸菌が腸内で有効に機能するためには、乳酸菌の胃酸耐性が高いことが要求される。ヒトの胃内のｐＨ（水素イオン指数）は、空腹時で１〜２程度で、食後で２〜４程度であるから、この程度の酸濃度における胃酸耐性が強い乳酸菌は、腸内に到達して腸内細菌叢を良好な状態に保つ生理機能を十分に発揮し、このことに対して有用な乳酸菌と云う事ができる。

【0005】

本発明が解決しようとする課題は、胃酸耐性が強く、高い生存率（対胃酸環境生存率）をもって腸内に到達する新規な乳酸菌及びそれを用いた食品添加剤、漬物用発酵調味物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明による乳酸菌は、一つの側面から見れば、ラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１４９６）である。

【0007】

本発明による乳酸菌は、他の側面から見れば、ｐＨ３．５の対胃酸環境生存率が２６０％以上、より好ましくはｐＨ３．５の対胃酸環境生存率が２６０％以上で且つｐＨ３．０の対胃酸環境生存率が１００％以上のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌である。

【0008】

本発明による乳酸菌は、他の側面から見れば、糖資化性が少なくとも下記のラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌である。
グリセロール 陰性
Ｄ−アラビノース 陰性
Ｌ−アラビノース 陽性
リボース 陽性
Ｄ−キシロース 陰性
ガラクトース 陽性
グルコース 陽性
フルクトース 陽性
マンノース 陽性
ラムノース 陰性
イノシトール 陰性
Ｄ−マンニトール 陽性
ソルビトール 陽性
Ｎ−アセチルグルコサミン 陽性
アミグダリン 陽性
アルブチン 陽性
エスクリン 陽性
サリシン 陽性
セロビオース 陽性
マルトース 陽性
ラクトース 陽性
メリビオース 陰性
スクロース 陽性
トレハロース 陽性
ラフィノース 陰性
ゲンチオビオース 陽性

【0009】

本発明による食品添加剤は、上述の発明による乳酸菌を含むものである。

【0010】

本発明による食品は、上述の発明による乳酸菌を含むものである。

【0011】

本発明による漬物の製造方法は、発酵様香気を持った漬物を製造する方法であって、漬物の原料である野菜にスターターとして上述の発明による乳酸菌を添加し、前記乳酸菌によって前記野菜を発酵させる。

【発明の効果】

【0012】

本発明による乳酸菌は、胃酸耐性が高く、高い生存率をもって腸内に到達する。このことにより、本発明による乳酸菌は、腸内細菌叢を良好な状態に保つ有益な生理機能を顕著に発揮する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株（ＰＩＣ−ＮＢＮ乳酸菌）および比較例の乳酸菌の胃酸耐性測定試験の試験結果を示すグラフ。（（Ａ）はｐＨ３．５の対胃酸環境生存率、（Ｂ）はｐＨ３．０の対胃酸環境生存率、（Ｃ）はｐＨ２．５の対胃酸環境生存率）

【図2】ＡＴＰアーゼ活性の測定結果を示すグラフ。

【図3】（Ａ）は乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を用いて発酵を行った漬物用発酵調味液のガスクロマトグラフィーによる分析結果を示すグラフ、（Ｂ）は発酵を行わない比較例の同等の分析結果を示すグラフ。

【図4】２０℃での温度環境での発酵４２時間後におけるｐＨ５．５およびｐＨ４．５の発酵液の濁度増加率を示すグラフ。

【図5】菌体膜脂肪酸中のトランスバクセン酸の比率の測定結果を示すグラフ。

【図6】ＩｇＡ含量の変化量の測定結果を示すグラフ。

【図7】ヘリコバクター・ピロリ菌の共培養の試験結果を示す写真。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明者らは、鋭意研究の結果、ラクトバチルス・プランタラムに属する新規の乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を見出した。本発明では、この乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を使用する。

【0015】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、２０１２年（平成２４年）１２月２５日付けで寄託されており、その受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−１４９６である。

【0016】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株の主な菌学的性質は以下の通りである。この菌学的性質と１６ＳｒＤＮＡ塩基配列より、分類学的にＰＩＣ−ＮＢＮ２２株がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属することが示される。

【0017】

＜形態学的性状＞
細胞形態：桿菌
大きさ：０．５×１．０〜２．０μｍ
胞子形成：−
運動性：−
カタラーゼ：−
オキシダーゼ：−
３７℃での生育：+
４５℃での生育：−
グラム染色性：陽性
コロニーの色：乳白色
コロニーの形：円形

【0018】

＜糖資化性（炭水化物発酵性）＞
グリセロール 陰性
Ｄ−アラビノース 陰性
Ｌ−アラビノース 陽性
リボース 陽性
Ｄ−キシロース 陰性
ガラクトース 陽性
グルコース 陽性
フルクトース 陽性
マンノース 陽性
ラムノース 陰性
イノシトール 陰性
Ｄ−マンニトール 陽性
ソルビトール 陽性
Ｎ−アセチルグルコサミン 陽性
アミグダリン 陽性
アルブチン 陽性
エスクリン 陽性
サリシン 陽性
セロビオース 陽性
マルトース 陽性
ラクトース 陽性
メリビオース 陰性
スクロース 陽性
トレハロース 陽性
ラフィノース 陰性
ゲンチオビオース 陽性

【0019】

＜胃酸耐性の評価＞
本実施形態では、以下に説明する方法、条件による試験によって、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および既知のラクトバチルス・プランタラム（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１５８９１、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８）の胃酸耐性を評価した。

【0020】

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ（ＢＤ社製）を基礎培地とし、終濃度０．３％（ｗ／ｖ）となるように濃ペプシン(ミクニ化学産業社製)を添加し、各々被験乳酸菌培養液２ｍｌと合わせ、塩酸を用いて酸濃度をｐＨ３．５、ｐＨ３．０、ｐＨ２．５に計１０ｍｌとなるよう調整した３種類の培地を用いた。これを３７℃の温度環境で３時間インキュベートし、培養開始前の乳酸菌数に対する培養後の乳酸菌数を生存率（％）として算出した。

【0021】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１５８９１、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８）の乳酸菌の生存率（対胃酸環境生存率）は、表１および図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す通りであった。なお、図１（Ａ）はｐＨ３．５の対胃酸環境生存率を、図１（Ｂ）はｐＨ３．０の対胃酸環境生存率を、図１（Ｃ）はｐＨ２．５の対胃酸環境生存率を各々示している。

【表1】

【0022】

この試験結果から明らかなように、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、ｐＨ３．５の対胃酸環境生存率が２６０．００で、且つｐＨ３．０の対胃酸環境生存率が１０１．２５であり、ｐＨ３．０でも死滅する乳酸菌を生じることなく全ての乳酸菌が腸内に到達し、その到達過程で菌数の増加が見られた。このように、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、比較例（受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１５８９１、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８）に比して際だって良好なスコアを示し、腸内細菌叢を良好な状態に保つ有益な生理機能（整腸作用）を顕著に発揮することを期待できる。
＜ＡＴＰアーゼ活性＞

【0023】

近年、漬物市場の多くを占めるのが浅漬やキムチであり、これらの漬物は、比較的低塩で製造されるので、大腸菌などの有害菌の繁殖が起こりやすい。低塩環境下での有害菌の繁殖を抑えるために、工場内を２０℃以下の低温環境にコントロールすることや、調味液のｐＨを４．０〜５．５にすることが有効とされている。

【0024】

しかしながら、２０℃以下と云う低温環境やｐＨ４．０〜５．５という環境は、有用菌である乳酸菌にとっても生育に厳しいものであり、スターターとして添加したとしても死滅してしまうことが多い。

【0025】

このことに対して、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、２０℃以下かつｐＨ４．０〜５．５でも死滅することなく優れた発酵性を示す漬物用乳酸菌であり、漬物製造環境に多い低温域である２０℃以下での発酵性に優れている。

【0026】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、ｐＨ４．０〜５．５という環境下でも優れた発酵性を示す。この理由として、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株のＡＴＰアーゼ活性の特性が挙げられる。ＡＴＰアーゼはＡＴＰの合成や分解反応の触媒として作用する酵素である。このとき、同時にプロトンＨ^＋の膜内外への輸送が行われる。ＡＴＰを合成する際には、ＡＤＰ＋Ｐｉ＋３Ｈ^＋ｏｕｔ→ＡＴＰ＋３Ｈ^＋ｉｎとなり、プロトンは膜内に取り込まれる。この反応は、可逆的であり、ＡＴＰを分解させる際には、ＡＴＰ＋３Ｈ^＋ｉｎ→ＡＤＰ＋Ｐｉ＋３Ｈ^＋ｏｕｔとなり、プロトンは膜外に排出される。

【0027】

低ｐＨの環境に耐えられない菌は、ＡＴＰアーゼ活性が低く、自身の膜内へのプロトン侵入を許してしまうため、体内ｐＨが下がり、生育のための活動ができなくなる。低ｐＨの環境に強い菌は、ＡＴＰアーゼの活性が高く、プロトンの膜内侵入を阻止することができる。このため、低ｐＨの環境に耐性をもつ菌はＡＴＰアーゼ活性が高いという特徴を持つ。

【0028】

＜ＡＴＰアーゼ活性の評価＞
以下に説明するプロトコルに従って、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および既知のラクトバチルス・プランタラム（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１１、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１０１９７３、ＮＢＲＣ１０１９７４、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８、ＮＢＲＣ１５８９１）のＡＴＰアーゼ活性を評価した。

【0029】

（１）ＡＴＰアーゼの作成
（ａ）各ラクトバチルス・プランタラムをＭＲＳ液体培地に培養し、遠心分離により菌体を回収する。
（ｂ）菌体０．１ｇに対し、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ・５ｍＭＭｇＣｌ_２・ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を０．１ｍｌ、アルミナを０．２５ｇ、プロテアーゼインヒビターを４．５μｌ加え、乳鉢ですりつぶす。
（ｃ）０．９ｍlの２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ・５ｍＭＭｇＣｌ_２・ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加え、乳鉢内の菌体をよく懸濁させて１０００ｇ×１０分、４℃で遠心分離する。
（ｄ）上清を再度３０００ｇ×１０分、４℃で遠心分離する。上清を粗ＡＴＰアーゼとする。

【0030】

（２）ＡＴＰアーゼ活性の測定
５ｍＭ・ＡＴＰＮａ／５ｍＭ・ＭｇＣｌ_２を含む５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ・ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）１０００μｌと粗ＡＴＰアーゼ２００μｌとを３７℃で１０分間に亘って反応させ、その後、氷冷した０．１Ｎ・ＨＣｌ：６００μｌを１００００ｇ×１０分間遠心分離し、上清：１．６ｍｌと発色液４．４ｍｌとを１８℃で１０分間に亘って反応させ、６６０ｎｍ吸光度測定を行った。発色液は、５Ｎ硫酸：１０ｍｌ、２．５％モリブデン酸アンモニウム：１０ｍｌ、３％硫酸水素Ｎａ−１％パラメチルアミノフェノール硫酸：１０ｍｌ、水：４０ｍｌの水溶液とした。

【0031】

粗ＡＴＰアーゼ、基質にも遊離リン酸が含まれるため、０．１Ｎ・ＨＣｌを先に添加させる空試験を設け、差し引いた値から遊離リン酸量を求めた。また、検量線はリン酸２水素カリウムを用いて行い、ＡＴＰアーゼ比活性を算出するためのタンパク質の定量にはＬｏｗｒｙ法を用いた。測定結果を表２および図２に示す。

【0032】

【表2】

【0033】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、非常に高いＡＴＰアーゼ活性を示し、ｐＨ４．０に於ける培養下でのＡＴＰアーゼ活性は５．７ｎｍｏｌ／ｍｇ／ｍｉｎ以上と高値であった。

【0034】

＜漬物用発酵調味液の評価＞
乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、野菜をペーストに加工したものを発酵させ、複雑な香気成分を付与することができる。また、これをあらゆる漬物（浅漬け、古漬け、ぬか漬け、キムチ）に添加することで、発酵様香気を持った漬物を製造することができる。

【0035】

（１）スターターの作成
（２％（ｗ／ｖ）ブドウ糖＋１％（ｗ／ｖ）酵母エキス水溶液（滅菌済））に、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株のグリセロールストック品から釣菌したものを添加し、３０℃の温度環境で、２０時間培養してスターターを作成した。

【0036】

（２）漬物用発酵調味液の製造
白菜ペースト１０．０ｇ、上白糖４．０ｇ、酵母エキス０．２ｇ、ブドウ糖２．０ｇ、スターター２．０ｇ、水１８１．８ｍｌを混合したものを、３０℃の温度環境で、７０時間発酵させた。また比較例のために、０℃の温度環境で保存し、発酵させていないものを用意した。

【0037】

（３）ガスクロマトグラフィーによる香気成分の分析
下記の条件でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を行った。
ＧＣ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ６８９０Ｓｅｒｉｅｓ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＣサンプラ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ７６９４ Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｓａｍｐｌｅｒ
インテグレータ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ６８９０Ｓｅｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
カラム：アジレント社製ＤＢ−ＷＡＸ １２５−７０３２ ３０ｍ×０．５３ｍｍ １．００μｍ
カラム温度：４０℃〜２３０℃
昇温条件：４０℃で５分保温後に１０℃／ｍｉｎで昇温、その後２３０℃で５分保温
キャリアガス：Ｈｅ
キャリアガス流速：５０ｃｍ／ｓｅｃ
検出器：水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）

【0038】

図３（Ａ）は乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を用いて発酵させた漬物用発酵調味液のＧＣ分析結果を、図３（Ｂ）は発酵させていないものＧＣ分析結果を各々示している。このＧＣ分析結果より、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を用いて発酵させた漬物用発酵調味液は、発酵させていないものと比較して様々な香気成分のピークが出現しており、白菜ペーストの香味の複雑化に貢献していることが分かった。

【0039】

このように、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、腸内細菌叢を良好な状態に保つ有益な生理機能を有する漬物用発酵調味液として、美味でヒトが摂取し易い形態で提供することができる。また、漬物の原料である白菜等の野菜にスターターとして乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を添加し、乳酸菌によって野菜を発酵させると、香気種類が多く、複雑な風味を持った漬物を迅速に製造することができる。

【0040】

＜野菜に対する発酵性の評価＞
以下に説明するプロトコルに従って、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および既知のラクトバチルス・プランタラム（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１１、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１０１９７３、ＮＢＲＣ１０１９７４、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８、ＮＢＲＣ１５８９１）の漬物製造における発酵性を評価した。

【0041】

（１）スターターの作成
ブドウ糖１ｇと酵母エキス１ｇと水４８ｍｌとを攪拌し、オートクレーブ後、各菌のコロニーを接種し、３０℃で２０時間培養後、発酵前液に添加するまで５℃で冷蔵庫に保存した。

【0042】

（２）発酵前液の作成
白菜ペースト５ｇとブドウ糖０．５ｇと酵母エキス０．５ｇと大豆ペプチド０．１ｇと水４２．４ｍｌとを攪拌し、オートクレーブ後、５℃で冷蔵保存した。白菜ペーストは、芯を除いた白菜をミキサーでペースト化したものを耐熱袋によって包装し、９５℃で３０分加熱後、流水で２０分冷却し、冷蔵保存したものである。

【0043】

（３）発酵前液の培養
発酵前液（オートクレーブ後）に各スターターを１．５ｍｌ添加し、３０℃で培養した。培養２４時間目のサンプルについてヘッドスペースをＧＣで分析し、香気成分の組成を調べた。

【0044】

（４）ガスクロマトグラフィーによる香気成分の分析
下記の条件でガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を行った。
ＧＣ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ６８９０Ｓｅｒｉｅｓ ＧＣ Ｓｙｓｔｅｍ
ＧＣサンプラ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ７６９４ Ｈｅａｄｓｐａｃｅ Ｓａｍｐｌｅｒ
インテグレータ：ヒューレット・パッカード社製ＨＰ６８９０Ｓｅｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ
カラム：アジレント社製ＤＢ−ＷＡＸ １２５−７０３２ ３０ｍ×０．５３ｍｍ １．００μｍ
カラム温度：４０℃〜２３０℃
昇温条件：４０℃で５分保温後に１０℃／ｍｉｎで昇温、その後２３０℃で５分保温
キャリアガス：Ｈｅ
キャリアガス流速：５０ｃｍ／ｓｅｃ
検出器：水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）

【0045】

表３は乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株、受託番号、ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１１、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１０１９７３、ＮＢＲＣ１０１９７４、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８、ＮＢＲＣ１５８９１を用いて発酵させた漬物用発酵調味液のＧＣ分析結果をピーク面積比で示している。

【0046】

【表3】

【0047】

このように、香気成分を分析したところ、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を用いて発酵させた漬物（白菜）では、香気を示すピークの個数が２１で最も多く、つまり香気種類が最も多く、ラクトバチルス・プランタラムの中でも白菜を発酵させる際により複雑な風味の付与に貢献することがわかった。

【0048】

＜漬物製造環境下における発酵適性の評価＞
以下に説明するプロトコルに従って、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および既知のラクトバチルス・プランタラム（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１１、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１０１９７３、ＮＢＲＣ１０１９７４、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８、ＮＢＲＣ１５８９１）の漬物製造環境下における発酵適性を評価した。

【0049】

（１）スターターの作成
ブドウ糖１ｇと酵母エキス１ｇと水４８ｍｌとを攪拌し、オートクレーブ後、各菌のコロニーを接種し、３０℃で２０時間培養後、発酵前液に添加するまで５℃で冷蔵庫に保存した。また、添加量を算出するために培養液の濁度を吸光度６２０ｎｍにて測定した。

【0050】

（２）発酵前液の作成
白菜ペースト５ｇとブドウ糖０．５ｇと酵母エキス０．５ｇと大豆ペプチド０．１ｇと水４２．４ｍｌとを攪拌し、オートクレーブ後、５℃で冷蔵保存した。白菜ペーストは、芯を除いた白菜をミキサーでペースト化したものを耐熱袋によって包装し、９５℃で３０分加熱後、流水で２０分冷却し、冷蔵保存したものである。発酵前液は、１株につき２つ作成し、一方はｐＨ５．５、もう一方は塩酸でｐＨ４．５に調整した。

【0051】

（３）発酵前液の培養
スターターの添加菌数が一定となるよう、最も濁度の低かったスターター添加量を１．５ｍｌとしてその他のスターター添加量を算出し、２種の発酵前液に添加した。発酵液全体量を合わせるため、スターター添加後に蒸留水を発酵前液に添加した。そして、２０℃で４２時間培養後にサンプリングした。各発酵液を４倍に希釈し、分光光度計で吸光度６２０ｎｍにて濁度を測定し、乳酸菌の増殖率を測定した。

【0052】

（４）濁度測定
２０℃での温度環境での発酵４２時間後におけるｐＨ５．５およびｐＨ４．５の発酵液の濁度を測定し、増加率を算出した。その結果を図４および表４（Ａ）、（Ｂ）に示す。なお、表４（Ａ）はｐＨ４．５の発酵液の濁度増加率を、表４（Ｂ）はｐＨ５．５の発酵液の濁度増加率を、各々示している。

【0053】

【表4】

【0054】

図４および表４（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌は、２０℃、ｐＨ５．５およびｐＨ４．５という厳しい環境下において優れた発酵性を示した。このことから、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌は低温、低ｐＨという漬物製造環境下での発酵性に優れており、漬物製造環境下での発酵に適していることが分かった。

【0055】

＜菌体膜脂肪酸組成トランス-バクセン酸の評価＞
（１）乳酸菌菌体からの脂肪酸抽出手順
（ａ）下記ラクトバチルス・プランタラムを４．０％ＮａＣｌ含有ｐＨ４．５調整済みのＭＲＳ液体培地に培養し、遠心分離により菌体を回収する。

【0056】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株および既知のラクトバチルス・プランタラム（比較例 受託番号ＮＢＲＣ３０７４、ＮＢＲＣ３０７５、ＮＢＲＣ１２００６、ＮＢＲＣ１４７１１、ＮＢＲＣ１４７１２、ＮＢＲＣ１４７１３、ＮＢＲＣ１０１９７３、ＮＢＲＣ１０１９７４、ＮＢＲＣ１０１９７７、ＮＢＲＣ１０１９７８、ＮＢＲＣ１５８９１）

【0057】

（ｂ）生理食塩水を５ｍｌ加え、激しく撹拌し、再度遠心分離して菌体を回収する。
（ｃ）菌体1gに酸化アルミニウム１ｇを加え、乳鉢ですりつぶす。
（ｄ）生理食塩水を１ｍｌ加え、テフロン（登録商標）製遠沈管に移し替える。
（ｅ）５ｍｌメタノールを加える。
（ｆ）２．５ｍｌクロロホルムを加える。
（ｇ）２分間激しく振とうし、１０分間室温で静置する。
（ｈ）２．５ｍｌクロロホルムを加えて３０秒間激しく振とうする。
（ｉ）２．５ｍｌ生理食塩水を加えて３０秒間激しく振とうする。
（ｊ）３０００ｒｐｍ、5分間遠心分離する。
（ｋ）下層のクロロホルム層をパスツールピペットで採取し、テフロン（登録商標）製の遠沈管に移す。
（ｌ）３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離する。
（ｍ）下層のクロロホルム層をパスツールピペットで慎重に採取し、ナスフラスコに入れる。
（ｎ）３５℃以下の湯浴で減圧乾固する。
（ｏ）乾固物を１ｍｌのヘキサンに溶解し、バイアル瓶に移し、硫酸マグネシウムを少量加え、１晩脱水する。
（ｐ）脱水完了後、ヘキサン溶液を脂肪酸抽出物とした。

【0058】

（２）脂肪酸のメチル化
（ａ）ヘキサン溶液０．５ｍｌに０．５ｍｇ／ｍｌのヘプタデカン酸/ヘキサン溶液を１．０ｍｌ、ヘキサンを０．５ｍｌ加え混ぜる。
（ｂ）２Ｍ水酸化カリウム／メタノール溶液を０．２ｍｌ加え、２分間激しく振とうさせる。
（ｃ）上層のヘキサン層を０．５ｍｌ採取し、ヘキサンで５ｍｌに定容したものを１μｌガスクロマトグラフィーに注入する。

【0059】

（３）ガスクロマトグラフィーによる分析条件
ガスクロマトグラフ：ジーエルサイエンス ＧＣ−４０００Ｐｌｕｓ／ＦＩＤ
カラム：ＴＣ−２５６０ ０．２５ｍｍＩ．Ｄ．×１００ｍ ｄｆ＝０．２０μｍ
カラム温度：１００℃で５分保温後に１０℃／ｍｉｎで２３０℃まで昇温
キャリアガス：Ｈｅ
スプリット：５０ｍｌ／ｍｉｎ

【0060】

その結果を図５および表５に示す。

【表5】

【0061】

乳酸菌は生育に厳しい環境下に曝されると菌体膜脂肪酸組成を変え、環境に合った膜を作りあげる。特に低ｐＨ環境に対しては、トランスバクセン酸を消費して菌体膜の耐酸性を上げる。乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、低ｐＨ環境下で培養すると、他のラクトバチルス・プランタラムと比較してトランスバクセン酸の割合が低く、より高い耐酸性を得るために菌体膜の脂肪酸組成を構築することが分かった。

【0062】

このように、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株が低ｐＨ環境への馴化機構を持ち合わせていることで、低ｐＨでの調味を余儀なくされる漬物製造工程環境でも容易に生育できる。

【0063】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、摂食によって、腸管内ＩｇＡ分泌誘導による免疫賦活機能、胆汁酸吸着能およびコレステロール吸着能（血圧降下機能）、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖を抑制する機能を有し、機能性乳酸菌としての用途がある。乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、これらの健康増進の機能を有する食品添加剤として有用である。また、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株を添加された食品は、健康増進の機能性食品として有用である。上述の健康増進機能についての評価を以下に記載のように行った。

【0064】

＜腸管内ＩｇＡ分泌誘導の評価＞
（１）ＰＩＣ−ＮＢＮ乳酸菌の投与
３匹ずつ２群に群分けした６週齢のＢＡＬＢ／ｃ・Ｃｒ・Ｓｌｃ雄性マウスの一方の群には粉末化したＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌の粉末を注射用水を用いて懸濁したものを投与し、もう一方の群には対照群としてプラセボ（媒体）を投与した。投与期間は両群とも１週間で、強制経口投与し、投与液量は１０ｍｌ／ｋｇとした。

【0065】

ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌の粉末は、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を培養し、菌体を回収後、真空凍結乾燥機にて乾燥させ、４×１０^１０ｃｅｌｌｓ／ｇのＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を含有する粉末である。

【0066】

（２）ＩｇＡの測定
投与前と投与最終日とに糞の採取を行い、以下の要領でＩｇＡ含量の測定を行った。

【0067】

糞の重量を測定し、糞に１ｍｌの抽出液を加え、４℃で１時間インキュベートしたものを３０分間激しく混和した。それを３０００ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を２倍に希釈し、ＥＬＩＳＡ・ＫＩＴを用いてＩｇＡ濃度を測定した。そして、測定したＩｇＡ濃度と使用した糞の重量とから糞中のＩｇＡ含量を算出した。

【0068】

使用した抽出液の組成は、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ・Ｂｕｆｆｅｒｅｄ・Ｓａｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）４９ｍｌ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）５００μｌ、ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ）５００μｌ、ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌである。

【0069】

ＩｇＡ含量の算出結果（変化量）を図６に示す。このように、マウスに１週間に亘ってＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を与えたところ、対照摂取群よりもＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌摂取群のほうがＩｇＡ増加量が有意に大きかった。このことから、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌は免疫賦活効果を有することが分かった。

【0070】

＜胆汁酸吸着能およびコレステロール吸着能の評価＞
（１）被験物質の調製
ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌をＭＲＳ液体培地に接種し、３２℃で１８時間培養し、前培養液とした。新しいＭＲＳ液体培地に前培養液を１％接種し、３２℃で１８時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収し、滅菌水で２回洗浄した後、凍結乾燥処理を行った。

【0071】

（２）胆汁酸吸着能の測定
凍結乾燥菌体１２ｍｇを１．２５ｍｍｏｌ／Ｌタウロコール酸ナトリウム溶液（１０ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８））０．８ｍｌに懸濁し、３７℃で２．５時間インキュベートした。１００００ｇ、４℃で５分間遠心分離後、上清中の胆汁酸濃度を総胆汁酸テストワコー（和光純薬工業製）を用いて測定し、菌体に吸着した胆汁酸の割合を求めた。胆汁酸吸着率（％）は４７．６±０．９（ｎ＝３)であった。

【0072】

（３）コレステロール吸着能の測定
凍結乾燥菌体１２ｍｇをコレステロール溶液（１００μｇ/ｍｌ６０％エタノール）０．４ｍｌに懸濁し、３７℃で１時間インキュベートした。１００００ｇ、４℃で５分間遠心分離を行った。その上清０．１ｍｌに３３％ＫＯＨ０．３ｍｌおよび９９．５％エタノール３ｍｌを加え、６０℃で１５分間インキュベートした。冷却後、ヘキサン５ｍｌおよび純水３ｍｌを加え、１分間攪拌した。

【0073】

攪拌後にヘキサン層３ｍｌを採取、窒素気流下で蒸発乾固した後、０．０５％フタルアルデヒド−氷酢酸溶液２ｍｌを加え、乾固物を溶解した。室温で１０分間静置後、濃硫酸１ｍｌを加え、吸光度（５５０ｎｍ）を測定し、コレステロール量を求め、菌体に吸着したコレステロールの割合を算出した。コレステロール吸着率（％）は２１．４±１．４（ｎ＝３)であった。

【0074】

このように、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌はコレステロールおよび胆汁酸を吸着することがわかった。このことから、体内への過剰なコレステロール吸収を抑える効果を持つことが明らかとなった。

【0075】

＜ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖抑制能の評価＞
（１）細菌株の培養
ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌はＭＲＳ培地を用いて、３０℃で嫌気的に培養した。ピロリ菌は１０％非働化ウシ胎仔血清を含有するＢＨＩ培地を用いて微好気環境下で培養した。

【0076】

（２）培養液の調整
ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌前培養液を１０倍に希釈し、１日間上記条件下で培養した溶液を乳酸菌培養液とした。６００ｎｍ吸光度に基づき、本溶液を４×１０^８ｃｆｕ／ｍｌとなるように調整し、共培養試験に供した。ピロリ菌前培養液を２５０倍に希釈し、１日間上記条件下で培養した溶液をピロリ菌培養液とした。６００ｎｍ吸光度に基づき、本溶液を７×１０^６ｃｆｕ／ｍｌとなるように調整し、共培養試験に供した。

【0077】

（３）共培養試験
５ｍｌのＦＣＳ含有ＢＨＩ培地に上述した乳酸菌培養液とピロリ菌培養液を添加し、微好気条件下で３７℃、２２時間培養した。対照群には、乳酸菌培養液を添加しないものを用意し、同様に培養した。培養前後のピロリ菌数は、ヘリコバクター寒天培地を用いて算出した。その結果を表６に示す。

【0078】

【表6】

【0079】

図７の左側はＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を添加した群の共培養試験の結果を写真撮影したものであり、右側はＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を添加していない対照群の共培養試験の結果を写真撮影したものである。対照群ではピロリ菌が３００倍程度まで増殖したのに対し、ＰＩＣ−ＮＢＮ２２乳酸菌を添加した群ではピロリ菌の増殖がほとんど見られなかった。

【0080】

まとめとして、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株と他のラクトバチルス・プランタラムとの特性を表７に一覧にして示している。この表における評価基準は、以下の通りである。

【0081】

【表7】

【0082】

ＡＴＰアーゼ活性：５．０ｎｍｏｌ／ｍｇ/ｍｉｎ以上は○
５．０ｎｍｏｌ／ｍｇ/ｍｉｎ未満は×
トランスバクセン酸の比率：０．３％以下は○
０．３％より高いは×
漬物の製造環境下における発酵適性：２０℃、ｐＨ５．５およびｐＨ４．５環境下における４２時間培養後の濁度増加率が３００％以上は○
２０℃、ｐＨ５．５およびｐＨ４．５環境下における４２時間培養後の濁度増加率が３００％未満は×
野菜発酵時の香気成分種類の豊富さ：２０種類以上は○
２０種類未満は×
胃酸耐性：ｐＨ３．５での対胃酸環境生存率が２６０％以上かつｐＨ３．０での対胃酸環境生存率が１００％以上は○
ｐＨ３．５での対胃酸環境生存率が２６０％未満もしくはｐＨ３．０での対胃酸環境生存率が１００％未満は×

【0083】

このように、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、ＡＴＰアーゼ活性、トランスバクセン酸の比率、低温発酵性、野菜発酵時の香気成分種類の豊富さ、胃酸耐性の全てのことが優れている。

【0084】

なお、乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、漬物用発酵調味液以外に、パン類、パスタ類、食用粉類、ごはん類、寿司、惣菜、ふりかけ、スープのもと、鍋料理のたれ、調味料、香辛料、茶、菓子、飲料等の食品への添加剤、ヨーグルトなどの乳酸菌発酵食品への添加剤の形態で提供することができる。

【0085】

乳酸菌ＰＩＣ−ＮＢＮ２２株は、整腸作用、免疫賦活作用、血圧降下作用、胆汁酸吸着能、コレステロール吸着能、ヘリコバクター・ピロリ菌の増殖抑制作用を有する薬剤として、粉末剤、顆粒剤、錠剤、液剤による口腔投与剤等の様々な形態で提供することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】