特許 6239654 タンパク質スクリーニング法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6239654

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】タンパク質スクリーニング法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171120BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20171120BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20171120BHJP

   C40B 40/08 20060101ALN20171120BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20171120BHJP

   C40B 30/04 20060101ALN20171120BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALN20171120BHJP

   C12P 21/00 20060101ALN20171120BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/00

   C07K16/00

   !C40B40/08

   !C40B40/10

   !C40B30/04

   !C12Q1/68 A

   !C12P21/00 C

【請求項の数】29

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2016-14207(P2016-14207)

(22)【出願日】2016年1月28日

(62)【分割の表示】特願2011-520232(P2011-520232)の分割

【原出願日】2009年7月24日

(65)【公開番号】特開2016-127845(P2016-127845A)

(43)【公開日】2016年7月14日

【審査請求日】2016年2月26日

(31)【優先権主張番号】61/170,029

(32)【優先日】2009年4月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/083,813

(32)【優先日】2008年7月25日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/090,111

(32)【優先日】2008年8月19日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511197822

【氏名又は名称】エックス−ボディ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ワグナー リチャード ダブリュ．

(72)【発明者】

【氏名】リトブチック アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】チェン ヤン

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００４／０５３１２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Nucleic Acids Res. (2006) vol.34, no.20, e140

【文献】 Chem. Biol. (2002) vol.9, no.6, p.691-698

【文献】 FEBS Lett. (2002) vol.532, issue 3, p.455-458

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997) vol.94, no.23, p.12297-12302

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）第1の高親和性リガンドに共有結合している、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）ペプチド受容体を介して第2の高親和性リガンドにC末端残基で共有結合している、該核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該ペプチド受容体が、ピューロマイシン、ピラゾロピリミジン、フェニルアラニル−アデノシン、チロシルアデノシン、アラニルアデノシン、フェニルアラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、アラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、およびチロシル３’デオキシ３’アミノアデノシンからなる群より選択される、ポリペプチドと、
（ｃ）その異なるリガンド結合部位で該第1および第2の高親和性リガンドの両方に非共有結合的かつ直接的に結合し、それによって、該核酸分子と該ポリペプチドを非共有結合させる、単一の多量体リガンド受容体タンパク質と
を含む、Ｘディスプレイ複合体。

【請求項2】

前記ペプチド受容体がピューロマイシンである、請求項1記載の複合体。

【請求項3】

前記第1の高親和性リガンドがビオチンである、請求項1記載の複合体。

【請求項4】

前記第2の高親和性リガンドがビオチンである、請求項1記載の複合体。

【請求項5】

前記第1および第2の高親和性リガンドがビオチンである、請求項1記載の複合体。

【請求項6】

前記多量体リガンド受容体タンパク質がストレプトアビジンである、請求項1記載の複合体。

【請求項7】

前記ポリペプチドが親和性タグをさらに含む、請求項1記載の複合体。

【請求項8】

前記親和性タグが、FLAGタグ、mycタグ、ヒスチジンタグ、またはHAタグである、請求項7記載の複合体。

【請求項9】

前記核酸分子がソースタグを含む、請求項1記載の複合体。

【請求項10】

前記ポリペプチドが、抗体、VHドメイン、VLドメイン、Fab断片、一本鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ、アドネクチン、アフィボディ、DARPin、アンチカリン、アビマー、¹⁰Fn3ドメイン、およびバーサボディからなる群より選択される、請求項1記載の複合体。

【請求項11】

前記核酸分子が、ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNAハイブリッド、dsDNA、およびdsDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、請求項1記載の複合体。

【請求項12】

前記核酸分子が、ポリペプチドコード配列の3’にインフレームの停止コドンを含有しない、請求項1記載の複合体。

【請求項13】

リボソームを含有しない、請求項1記載の複合体。

【請求項14】

前記ペプチド受容体がリンカーを介して第2の高親和性リガンドに結合される、請求項1記載の複合体。

【請求項15】

前記リンカーがポリエチレングリコールを含む、請求項14記載の複合体。

【請求項16】

前記リンカーがポリシアル酸を含む、請求項14記載の複合体。

【請求項17】

（ａ）その3’領域が第1のビオチン分子に共有結合している、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）ペプチド受容体を介して第2のビオチン分子にC末端残基で共有結合している、該核酸分子によってコードされるポリペプチドであって、該ペプチド受容体が、ピューロマイシン、ピラゾロピリミジン、フェニルアラニル−アデノシン、チロシルアデノシン、アラニルアデノシン、フェニルアラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、アラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、およびチロシル３’デオキシ３’アミノアデノシンからなる群より選択される、ポリペプチドと、
（ｃ）その異なるリガンド結合部位で該第1および第2のビオチン分子の両方に非共有結合的かつ直接的に結合し、それによって、該核酸分子と該ポリペプチドを非共有結合させる、単一の多量体ビオチン結合タンパク質と
を含む、Ｘディスプレイ複合体。

【請求項18】

前記ポリペプチドが、抗体、VHドメイン、VLドメイン、Fab断片、一本鎖抗体、ナノボディ、ユニボディ、アドネクチン、アフィボディ、DARPin、アンチカリン、アビマー、¹⁰Fn3ドメイン、およびバーサボディからなる群より選択される、請求項17記載の複合体。

【請求項19】

前記核酸分子が、ssRNA、ssDNA、ssDNA/RNAハイブリッド、dsDNA、およびdsDNA/RNAハイブリッドからなる群より選択される、請求項17記載の複合体。

【請求項20】

前記核酸分子が、ポリペプチドコード配列の3’にインフレームの停止コドンを含有しない、請求項17記載の複合体。

【請求項21】

リボソームを含有しない、請求項17記載の複合体。

【請求項22】

前記ペプチド受容体がリンカーを介して第2の高親和性リガンドに結合される、請求項17記載の複合体。

【請求項23】

前記リンカーがポリエチレングリコールを含む、請求項22記載の複合体。

【請求項24】

前記リンカーがポリシアル酸を含む、請求項22記載の複合体。

【請求項25】

前記ペプチド受容体がピューロマイシンである、請求項17記載の複合体。

【請求項26】

前記多量体ビオチン結合タンパク質がストレプトアビジンである、請求項17記載の複合体。

【請求項27】

前記ポリペプチドが親和性タグをさらに含む、請求項17記載の複合体。

【請求項28】

前記親和性タグが、FLAGタグ、mycタグ、ヒスチジンタグ、またはHAタグである、請求項27記載の複合体。

【請求項29】

前記核酸分子がソースタグを含む、請求項17記載の複合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、２００８年７月２５日出願の米国仮出願第６１／０８３８１３号、２００８年８月１９日出願の米国仮出願第６１／０９０１１１号、および２００９年４月１６日出願の米国仮出願第６１／１７００２９号に対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

ディスプレイおよび選択の技術の使用において、さらなる多様性へのアクセスは、最大の親和性、特異性、安定性、および／または他の望ましい特徴を有する分子のより効果的な選択を可能にすることが十分理解されている。

【0003】

開発されてきた過去の方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイを含む。近年、インビボスクリーニングを使用して分子を特定することへの関心が増大してきている（Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００３ Ａｕｇ ２８；９１（１−２）：１８３−６（非特許出願１））。このアプローチは、ファージディスプレイを使用して可能となっているが、ファージディスプレイ技術によって得られる多様性は限られているという問題がある。リボソームディスプレイまたはｍＲＮＡディスプレイは、ＲＮＡ種の不安定性により、この用途では不十分である。したがって、種の安定の増大に起因して、ＤＮＡ−タンパク質融合の開発が強く求められている。

【0004】

３種類のＤＮＡ−タンパク質融合が説明されている。ＣＩＳディスプレイは、転写および翻訳される際にＤＮＡに共有結合するｄｓＤＮＡ結合タンパク質を生成するために、連動したインビトロ転写／翻訳が使用される、１つの方法である（ＰＮＡＳ，１０１（９）：２８０６−２８１０（非特許出願２））。しかしながら、この技術の主な制限のうちの１つは、転写／翻訳過程中に、合成タンパク質が隣接する任意の近隣ＤＮＡに結合し、誤って標識された融合をもたらし得ることである。第２の方法は、ＫｕｒｚおよびＬｏｈｓｅの方法である（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００１ Ｓｅｐ ３；２（９）：６６６−７２（非特許出願３））。この方法は、翻訳されたタンパク質と共有結合し、ＲＮＡ上の共有結合付加体においてリボソーム一時停止を作成し、かつ逆転写のためのプライマーとしての機能を果たすことができる、多官能性種を使用した、ｍＲＮＡとの共有結合付加体の形成を伴う。この方法の制限は、ソラレンを使用したＲＮＡとの共有結合工程の非効率性である。第３の方法は、Ｙｏｎｅｚａｗａらの方法である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １；３１（１９）：ｅ１１８（非特許出願４））。この方法では、ストレプトアビジンおよび多様なペプチドの領域をコードするＤＮＡがビオチン化され、翻訳機構を有する合成ミクロスフェアに配置され、ストレプトアビジン（四量体）がビオチン化ＤＮＡに結合するように翻訳される。この方法の制限は、結果として生じた種が四量体であり、１つの粒子上に複数の結合種（再結合効果）があることにより、親和性選択にとって面倒となり得ることである。

【0005】

本明細書では、核酸とタンパク質との間で非共有結合を採用し得、ＤＮＡ−タンパク質融合を可能にする、所望の核酸タンパク質融合の簡単で効率的な生成方法を説明する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２００３ Ａｕｇ ２８；９１（１−２）：１８３−６

【非特許文献2】ＰＮＡＳ，１０１（９）：２８０６−２８１０

【非特許文献3】ＫｕｒｚおよびＬｏｈｓｅ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００１ Ｓｅｐ ３；２（９）：６６６−７２

【非特許文献4】Ｙｏｎｅｚａｗａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔｏｂｅｒ １；３１（１９）：ｅ１１８

【発明の概要】

【0007】

本発明は、タンパク質および核酸の所望の特性を選択し、かつ発展させる、組成物および方法を提供する。種々の実施形態では、本発明は、核酸または修飾核酸に結合される小分子を含む。他の実施形態は、修飾アミノ酸を有するペプチドを含むポリペプチドを産生するための方法と、所望の特性を有する集団のうちの個別構成要素の選択を可能にするための分析法と、改善した特性を有するポリペプチドの新規変異型を生成するための方法とを含む。

【0008】

一態様では、本発明は、
（ａ）ポリペプチドコード配列を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）第１の核酸分子の一部分に相補的である核酸配列を含む、第２の核酸分子と
を含み、第１の核酸分子は、相補的核酸塩基対合を介して第２の核酸分子に結合され、第２の核酸分子は、前記ポリペプチドに非共有結合される、ヘテロ二官能性複合体を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態では、このヘテロ二官能性複合体はさらに、
（ａ）第２の核酸分子に共有結合される高親和性リガンドと、
（ｂ）ペプチド受容体に結合されるリガンド受容体と
を含み、前記高親和性リガンドは、前記リガンド受容体に結合され、前記ペプチド受容体は、前記ポリペプチドに共有結合される。いくつかの実施形態では、このヘテロ二官能性複合体はさらに、第２の高親和性リガンドを含み、第２の高親和性リガンドは、前記ペプチド受容体に共有結合され、第２の高親和性リガンドは、前記リガンド受容体に結合される。いくつかの実施形態では、このヘテロ二官能性複合体内のペプチド受容体は、リンカーを介して第２の高親和性リガンドに結合される。１つの好ましい実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコールを含む。別の好ましい実施形態では、リンカーはさらに、ポリシアル酸リンカーを含む。いくつかの実施形態では、このヘテロ二官能性複合体内のリガンド受容体は、ペプチド受容体に共有結合される。

【0010】

いくつかの実施形態では、このヘテロ二官能性複合体はさらに、
（ａ）第２の核酸分子に共有結合されるリガンド受容体と、
（ｂ）ペプチド受容体に結合される高親和性リガンドと
を含み、前記リガンド受容体は、前記高親和性リガンドに結合され、前記ペプチド受容体は、前記ポリペプチドのＣ末端に共有結合される。

【0011】

他の実施形態では、このヘテロ二官能性複合体はさらに、第２の核酸分子の一部分に相補的である核酸配列を含む、第３の核酸分子を含み、第３の核酸分子は、相補的核酸塩基対合を介して第２の核酸分子に結合され、第３の核酸分子は、前記ペプチド受容体に共有結合され、前記ペプチド受容体は、前記ポリペプチドに共有結合される。

【0012】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体内の第２の核酸分子は、分岐核酸分子である。いくつかの実施形態では、上で説明される複合体内の第２の核酸分子は、第１の核酸分子の逆転写のためのプライマーの役割を果たすことができる。

【0013】

別の態様では、本発明は、
（ａ）第１の高親和性リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）前記核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）ペプチド受容体に結合されるリガンド受容体と
を含み、前記高親和性リガンドは、前記リガンド受容体に結合され、前記ペプチド受容体は、前記ポリペプチドのＣ末端に共有結合される、
Ｘディスプレイ複合体（例えば、核酸ポリペプチド複合体）を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態では、このＸディスプレイ複合体内のリガンド受容体は、前記ペプチド受容体に共有結合される。いくつかの実施形態では、このＸディスプレイ複合体はさらに、第２の高親和性リガンドを含み、第２の高親和性リガンドは、前記ペプチド受容体に共有結合され、第２の高親和性リガンドは、前記リガンド受容体に結合される。

【0015】

別の態様では、本発明は、
（ａ）第１の高親和性リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）第２の高親和性リガンドに共有結合される第１のリガンド受容体と、
（ｃ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと
を含み、前記ポリペプチドは、第２のリガンド受容体を含み、第１の高親和性リガンドは、第１のリガンド受容体に結合され、第２の高親和性リガンドは、第２のリガンド受容体に結合される、
Ｘディスプレイ複合体を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体に結合される第１または第２の高親和性リガンドは、ビオチンである。

【0017】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体に結合される第１または第２の高親和性リガンドは、ＦＫ５０６、メトトレキサート、ＰＰＩ−２４５８、ビオチン、ヒルジン、ＺＦＶｐ（Ｏ）Ｆ、フルオレセイン−ビオチン、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）、１８ｂｐ ＤＮＡ、ＲＮＡｓｅ Ａ、クロロアルカン、アリール（ベータ−アミノエチル）ケトン、およびプロテインＡを含む群から選択される。

【0018】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体内の第１または第２のリガンド受容体は、ＦＫＢＰ１２、ジヒドロ葉酸還元酵素、メチオニンアミノペプチダーゼ、二量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジン四量体、トロンビン、カルボキシペプチダーゼ、一価抗体、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｚｎフィンガー、ｈＲＩ（ＲＮａｓｅインヒビター）、突然変異ハロアルカン脱ハロゲン酵素、ｈａｌｏＴａｇ、およびソルターゼを含む群から選択される。

【0019】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体内の第１または第２のリガンド受容体は、ストレプトアビジンである。

【0020】

いくつかの実施形態では、上で説明されるポリペプチドは、抗体、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、^１０Ｆｎ３ドメイン、およびバーサボディ（ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）を含む群から選択される。

【0021】

別の態様では、本発明は、
（ａ）リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと
を含み、前記ポリペプチドは、リガンド受容体を含み、前記リガンドは、該リガンド受容体に結合される、Ｘディスプレイ複合体を提供する。

【0022】

いくつかの実施形態では、Ｘディスプレイ複合体に結合されるリガンドは、ＦＫ５０６であり、核酸−ポリペプチド複合体内のリガンド受容体は、ＦＫＢＰのＦＫ５０６結合ドメインである。

【0023】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体に結合される第１の核酸分子は、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｄｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから成る群より選択される。

【0024】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体に結合される第１の核酸分子のポリペプチドコード配列は、インフレームの停止コドンを含有しない。

【0025】

いくつかの実施形態では、上で説明されるポリペプチドは、結合タンパク質である。１つの好ましい実施形態では、結合タンパク質は、抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインである。

【0026】

いくつかの実施形態では、上で説明される核酸−ポリペプチド複合体は、リボソームを含有しない。

【0027】

別の態様では、本発明はまた、上で説明される複数のＸディスプレイ複合体を含むライブラリも提供し、複合体の少なくとも一部分は、異なるポリペプチドコード配列を含有する。

【0028】

別の態様では、本発明はまた、核酸−ポリペプチド複合体のライブラリの方法であって、
−第１の核酸リンカーと相補的である配列エレメントを含むｍＲＮＡ配列のライブラリを提供する工程と、
−第１の核酸リンカーが相補的核酸塩基対合を介してｍＲＮＡに結合するように、第１の高親和性リガンドに機能的に結合した第１の核酸リンカーを提供する工程と、
−ペプチド受容体に機能的に結合した第２の高親和性リガンドを提供する工程と、
−少なくとも２つの結合部位を有する前記リガンド受容体を提供する、または、少なくとも、前記リガンド受容体が第１の高親和性リガンドおよび第２の高親和性リガンドに結合するように提供する工程と、
−翻訳されたタンパク質にペプチド受容体が結合し、それによってｍＲＮＡをタンパク質に結合する核酸−ポリペプチド複合体が形成されるように、ｍＲＮＡの翻訳が起こるのを可能にする工程と
を含む、方法も提供する。

【0029】

いくつかの実施形態では、本方法はさらに、
−ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成されるように、Ｘディスプレイ複合体内の第１の核酸リンカーをプライマーとして使用して、ｍＲＮＡの逆転写を可能にすることを含む。

【0030】

１つの好ましい実施形態では、本方法はさらに、
−ｍＲＮＡを分解し、かつ相補的ＤＮＡ鎖を合成して、それにより、核酸−ポリペプチド複合体内にＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成することを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、ライブラリの中のｍＲＮＡはさらに、ＴＭＶエンハンサーを含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ライブラリの中のｍＲＮＡはさらに、Ｃμ配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、ライブラリの中のｍＲＮＡはさらに、ＦＬＡＧタグを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、ライブラリの中のｍＲＮＡはさらに、ＳＡディスプレイ配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、ライブラリの中のｍＲＮＡはさらに、Ａ２０末端を含む。

【0036】

別の態様では、本発明はまた、本発明で説明される方法によって産生される、核酸−ポリペプチド複合体のライブラリも提供する。

【0037】

別の態様では、本発明はまた、関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドをコードする、単離核酸分子を選択する方法であって、
（ａ）本発明で説明されるＸディスプレイ複合体のライブラリを提供する工程と、
（ｂ）前記ライブラリを関心対象の抗原と接触させる工程と、
（ｃ）前記ライブラリから、関心対象の抗原に結合する少なくとも１つのＸディスプレイ複合体を選択する工程と、
（ｄ）選択されたＸディスプレイ複合体のポリペプチドコード配列を単離する工程と
を含む、方法も提供する。

【0038】

別の態様では、本発明はまた、コードされたポリペプチドが産生されるように、本発明で説明される方法によって特定されたポリペプチドコード配列を、発現環境に導入することを含む、関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドを産生する方法も提供する。

【0039】

別の態様では、本発明はまた、本発明で説明される方法によって選択された、関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドをコードする、単離核酸分子も提供する。

【0040】

別の態様では、本発明はまた、
（ａ）ポリペプチドコード配列を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）第１の核酸分子の一部分に相補的である核酸配列を含む、第２の核酸分子と、
（ｄ）第２の核酸分子に共有結合される第１の高親和性リガンドと、
（ｅ）第１のリガンド受容体と、
（ｆ）１つ以上の結合分子を介してペプチド受容体に共有結合される、第２の高親和性リガンドと
を含み、第１の核酸分子は、相補的核酸塩基対合を介して第２の核酸分子に結合され、
第１の高親和性リガンドは、第１の結合部位においてリガンド受容体に非共有結合され、
第２のリガンドは、第２の結合部位においてリガンド受容体に非共有結合され、かつ
１つ以上の結合分子は、ポリエチレングリコール分子である、
Ｘディスプレイ複合体も提供する。

【0041】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第１の高親和性リガンドは、ビオチンであり、リガンド受容体は、ストレプトアビジン、二量体ストレプトアビジン、および四量体ストレプトアビジンを含む群より選択される。

【0042】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第２の高親和性リガンドは、ビオチンであり、リガンド受容体は、ストレプトアビジン、二量体ストレプトアビジン、および四量体ストレプトアビジンを含む群より選択される。

【0043】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第１または第２の高親和性リガンドは、ＦＫ５０６、メトトレキサート、ＰＰＩ−２４５８、ビオチン、ヒルジン、ＺＦＶｐ（Ｏ）Ｆ、フルオレセイン−ビオチン、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）、１８ｂｐ ＤＮＡ、ＲＮＡｓｅ Ａ、クロロアルカン、アリール（ベータ−アミノエチル）ケトン、およびプロテインＡを含む群から選択される。

【0044】

いくつかの実施形態では、この複合体はさらに、第２のリガンド受容体を含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、上で説明される複合体内の第２のリガンド受容体は、ＦＫＢＰ１２、ジヒドロ葉酸還元酵素、メチオニンアミノペプチダーゼ、二量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジン四量体、トロンビン、カルボキシペプチダーゼ、一価抗体、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｚｎフィンガー、ｈＲＩ（ＲＮａｓｅインヒビター）、突然変異ハロアルカン脱ハロゲン酵素、ｈａｌｏＴａｇ、およびソルターゼを含む群から選択される。

【0046】

いくつかの実施形態では、この複合体内のペプチド受容体は、ピューロマイシンである。

【0047】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第１または第２の核酸分子はさらに、ソラレンを含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、抗体、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、^１０Ｆｎ３ドメイン、およびバーサボディを含む群から選択される。

【0049】

別の態様では、本発明は、
（ａ）核酸分子に共有結合される第１の高親和性リガンドと、
（ｂ）ペプチド受容体に共有結合される第２の高親和性リガンドと、
（ｃ）２つ以上のリガンド結合部位を含む、リガンド受容体と
を含み、第１および第２のリガンドは、異なるリガンド結合部位において前記リガンド受容体に結合される、ヘテロ二官能性複合体を提供する。

【0050】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第１および第２の高親和性リガンドは、同一である。

【0051】

いくつかの実施形態では、この複合体内の第１および第２の高親和性リガンドは、ビオチンである。

【0052】

いくつかの実施形態では、この複合体内の核酸分子は、ソラレン部分を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、この複合体内のペプチド受容体は、ピューロマイシンである。

【0054】

いくつかの実施形態では、この複合体内のリガンド受容体は、多量体タンパク質である。

【0055】

いくつかの実施形態では、この複合体内のリガンド受容体は、ストレプトアビジンである。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
［１］
（ａ）ポリペプチドコード配列を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）該第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）該第１の核酸分子の一部分と相補的である核酸配列を含む、第２の核酸分子と
を含み、該第１の核酸分子が相補的核酸塩基対合を介して該第２の核酸分子に結合され、かつ該第２の核酸分子が該ポリペプチドに非共有結合される、
Ｘディスプレイ複合体。
［２］
（ａ）前記第２の核酸分子に共有結合される高親和性リガンドと、
（ｂ）ペプチド受容体に結合されるリガンド受容体と
をさらに含み、該高親和性リガンドが該リガンド受容体に結合され、かつ該ペプチド受容体が前記ポリペプチドに共有結合される、
［１］記載の複合体。
［３］
第２の高親和性リガンドをさらに含み、該第２の高親和性リガンドが前記ペプチド受容体に共有結合され、該第２の高親和性リガンドが前記リガンド受容体に結合される、［２］記載の複合体。
［４］
前記ペプチド受容体がリンカーを介して前記第２の高親和性リガンドに結合される、［３］記載の複合体。
［５］
前記リンカーがポリエチレングリコールを含む、［４］記載の複合体。
［６］
前記リンカーがポリシアル酸リンカーを含む、［４］記載の複合体。
［７］
前記リガンド受容体が前記ペプチド受容体に共有結合される、［２］記載の複合体。
［８］
（ａ）前記第２の核酸分子に共有結合されるリガンド受容体と、
（ｂ）ペプチド受容体に結合される高親和性リガンドと
をさらに含み、該リガンド受容体が該高親和性リガンドに結合され、かつ該ペプチド受容体が前記ポリペプチドのＣ末端に共有結合される、
［１］記載の複合体。
［９］
前記第２の核酸分子の一部分と相補的である核酸配列を含む、第３の核酸分子をさらに含み、該第３の核酸分子が相補的核酸塩基対合を介して該第２の核酸分子に結合され、該第３の核酸分子がペプチド受容体に共有結合され、かつ前記ペプチド受容体が前記ポリペプチドに共有結合される、［１］記載の複合体。
［１０］
前記第２の核酸分子が分岐核酸分子である、［１］〜［９］のうちいずれか一項記載の複合体。
［１１］
前記第２の核酸分子が、前記第１の核酸分子の逆転写のためのプライマーの役割を果たすことができる、［１］〜［９］のうちいずれか一項記載の複合体。
［１２］
（ａ）第１の高親和性リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）該核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）ペプチド受容体に結合されるリガンド受容体と
を含み、該高親和性リガンドが該リガンド受容体に結合され、かつ該ペプチド受容体が該ポリペプチドのＣ末端に共有結合される、
Ｘディスプレイ複合体。
［１３］
前記リガンド受容体が前記ペプチド受容体に共有結合される、［１２］記載の複合体。
［１４］
第２の高親和性リガンドをさらに含み、該第２の高親和性リガンドが前記ペプチド受容体に共有結合され、かつ該第２の高親和性リガンドが前記リガンド受容体に結合される、［１２］記載の複合体。
［１５］
（ａ）第１の高親和性リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）第２の高親和性リガンドに共有結合される第１のリガンド受容体と、
（ｃ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと
を含み、該ポリペプチドが第２のリガンド受容体を含み、該第１の高親和性リガンドが該第１のリガンド受容体に結合され、かつ該第２の高親和性リガンドが該第２のリガンド受容体に結合される、
Ｘディスプレイ複合体。
［１６］
前記第１の高親和性リガンドまたは第２の高親和性リガンドがビオチンである、前記［1］〜［15］のいずれか一項記載の複合体。
［１７］
前記第１の高親和性リガンドまたは第２の高親和性リガンドが、ＦＫ５０６、メトトレキサート、ＰＰＩ−２４５８、ビオチン、ヒルジン、ＺＦＶｐ（Ｏ）Ｆ、フルオレセイン−ビオチン、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）、１８ｂｐ ＤＮＡ、ＲＮＡｓｅ Ａ、クロロアルカン、アリール（ベータ−アミノエチル）ケトン、およびプロテインＡを含む群から選択される、前記［1］〜［16］のいずれか一項記載の複合体。
［１８］
前記第１のリガンド受容体または第２のリガンド受容体が、ＦＫＢＰ１２、ジヒドロ葉酸還元酵素、メチオニンアミノペプチダーゼ、二量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジン四量体、トロンビン、カルボキシペプチダーゼ、一価抗体、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｚｎフィンガー、ｈＲＩ（ＲＮａｓｅインヒビター）、突然変異ハロアルカン脱ハロゲン酵素、ｈａｌｏＴａｇ、およびソルターゼを含む群から選択される、前記［1］〜［17］のいずれか一項記載の複合体。
［１９］
前記第１のリガンド受容体または第２のリガンド受容体がストレプトアビジンである、前記［1］〜［18］のいずれか一項記載の複合体。
［２０］
前記ポリペプチドが、抗体、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、^１０Ｆｎ３ドメイン、およびバーサボディ（ｖｅｒｓａｂｏｄｙ）を含む群から選択される、前記［1］〜［19］のいずれか一項記載の複合体。
［２１］
（ａ）高親和性リガンドに共有結合される、ポリペプチドコード配列を含む核酸分子と、
（ｂ）第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと
を含み、該ポリペプチドがリガンド受容体を含み、該リガンドが該リガンド受容体に結合される、
Ｘディスプレイ複合体。
［２２］
前記リガンドがＦＫ５０６であり、かつ前記リガンド受容体がＦＫＢＰのＦＫ５０６結合ドメインである、［２１］記載の複合体。
［２３］
前記第１の核酸分子が、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドｄｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから成る群より選択される、［１］〜［２２］のうちいずれか一項記載の複合体。
［２４］
前記第１の核酸分子の前記ポリペプチドコード配列が、インフレームの停止コドンを含有しない、［１］〜［２２］のうちいずれか一項記載の複合体。
［２５］
前記ポリペプチドが結合タンパク質である、［１］〜［２２］のうちいずれか一項記載の複合体。
［２６］
前記結合タンパク質が抗体の前記ＶＨドメインまたはＶＬドメインである、［１］〜［２５］のうちいずれか一項記載の複合体。
［２７］
リボソームを含有しない、［１］〜［２２］のうちいずれか一項記載の複合体。
［２８］
前記［1］〜［27］のいずれか一項記載の前記Ｘディスプレイ複合体を複数含むライブラリであって、該複合体の少なくとも一部分が、異なるポリペプチドコード配列を含有する、ライブラリ。
［２９］
Ｘディスプレイ複合体のライブラリを産生する方法であって、
（ａ）第１の核酸リンカーと相補的である配列エレメントを含む、ｍＲＮＡ配列のライブラリを提供する工程と、
（ｂ）該第１の核酸リンカーが相補的核酸塩基対合を介して該ｍＲＮＡに結合するように、第１の高親和性リガンドに機能的に結合した第１の核酸リンカーを提供する工程と、
（ｃ）ペプチド受容体に機能的に結合した第２の高親和性リガンドを提供する工程と、
（ｄ）リガンド受容体が該第１の高親和性リガンドおよび該第２の高親和性リガンドに結合するように、少なくとも２つの結合部位を有する該リガンド受容体を提供する工程と、
（ｅ）該ペプチド受容体が翻訳されたタンパク質に結合し、それによって該ｍＲＮＡを該タンパク質に結合する核酸−ポリペプチド複合体が形成されるように、該ｍＲＮＡの翻訳が起こるのを可能にする工程と
を含む、方法。
［３０］
ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成されるように、前記核酸−ポリペプチド複合体内の前記第１の核酸リンカーをプライマーとして使用して、前記ｍＲＮＡの逆転写を可能にすることをさらに含む、［２９］記載の方法。
［３１］
前記ｍＲＮＡを分解し、かつ相補的ＤＮＡ鎖を合成して、それにより、前記核酸−ポリペプチド複合体内にＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成することをさらに含む、［３０］記載の方法。
［３２］
前記ｍＲＮＡがさらに、ＴＭＶエンハンサーを含む、［２９］記載の方法。
［３３］
前記ｍＲＮＡがさらに、Ｃμ配列を含む、［２９］記載の方法。
［３４］
前記ｍＲＮＡがさらに、ＦＬＡＧタグを含む、［２９］記載の方法。
［３５］
前記ｍＲＮＡがさらに、ＳＡディスプレイ配列を含む、［２９］記載の方法。
［３６］
前記ｍＲＮＡがさらに、Ａ２０末端を含む、［２９］記載の方法。
［３７］
［２９］〜［３５］のうちのいずれか一項記載の方法によって産生される、核酸−ポリペプチド複合体のライブラリ。
［３８］
関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドをコードする、単離核酸分子を選択する方法であって、
（ａ）［２９］記載の核酸−ポリペプチド複合体のライブラリを提供する工程と、
（ｂ）該ライブラリを関心対象の抗原と接触させる工程と、
（ｃ）該ライブラリから、該関心対象の抗原に結合する少なくとも１つの核酸−ポリペプチド複合体を選択する工程と、
（ｄ）該選択された核酸−ポリペプチド複合体の該ポリペプチドコード配列を単離する工程と
を含む、方法。
［３９］
関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）［３８］記載の方法を使用して選択される、ポリペプチドコード配列を提供することと、
（ｂ）該ポリペプチドコード配列によってコードされる、該ポリペプチドを発現させることと
を含む、方法。
［４０］
［２９］記載の方法によって選択された関心対象の抗原に結合することができるポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
［４１］
（ａ）ポリペプチドコード配列を含む、第１の核酸分子と、
（ｂ）該第１の核酸分子によってコードされるポリペプチドと、
（ｃ）該第１の核酸分子の一部分と相補的である核酸配列を含む、第２の核酸分子と、
（ｄ）該第２の核酸分子に共有結合される第１の高親和性リガンドと、
（ｅ）第１のリガンド受容体と、
（ｆ）１つ以上の結合分子を介してペプチド受容体に共有結合される、第２の高親和性リガンドと
を含み、該第１の核酸分子が相補的核酸塩基対合を介して該第２の核酸分子に結合され、該第１の高親和性リガンドが第１の結合部位において該リガンド受容体に非共有結合され、該第２のリガンドが第２の結合部位において該リガンド受容体に非共有結合され、該１つ以上の結合分子がポリエチレングリコール分子である、
Ｘディスプレイ複合体。
［４２］
前記第１の高親和性リガンドがビオチンであり、かつ前記リガンド受容体が、ストレプトアビジン、二量体ストレプトアビジン、および四量体ストレプトアビジンを含む群より選択される、［４１］記載の複合体。
［４３］
前記第２の高親和性リガンドがビオチンであり、かつ前記リガンド受容体が、ストレプトアビジン、二量体ストレプトアビジン、および四量体ストレプトアビジンを含む群より選択される、［４１］記載の複合体。
［４４］
前記第１の高親和性リガンドまたは第２の高親和性リガンドが、ＦＫ５０６、メトトレキサート、ＰＰＩ−２４５８、ビオチン、ヒルジン、ＺＦＶｐ（Ｏ）Ｆ、フルオレセイン−ビオチン、ＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）、１８ｂｐ ＤＮＡ、ＲＮＡｓｅ Ａ、クロロアルカン、アリール（ベータ−アミノエチル）ケトン、およびプロテインＡを含む群から選択される、 ［４１］記載の複合体。
［４５］
第２のリガンド受容体をさらに含む、［４１］記載の複合体。
［４６］
前記第２のリガンド受容体が、ＦＫＢＰ１２、ジヒドロ葉酸還元酵素、メチオニンアミノペプチダーゼ、二量体ストレプトアビジン、ストレプトアビジン四量体、トロンビン、カルボキシペプチダーゼ、一価抗体、ＨＳＡ（アルブミン）、Ｚｎフィンガー、ｈＲＩ（ＲＮａｓｅインヒビター）、突然変異ハロアルカン脱ハロゲン酵素、ｈａｌｏＴａｇ、およびソルターゼを含む群から選択される、［４５］記載の複合体。
［４７］
前記ペプチド受容体がピューロマイシンである、［４１］記載の複合体。
［４８］
前記第１または第２の核酸分子がさらに、ソラレンを含む、［４１］記載の複合体。
［４９］
前記ポリペプチドが、抗体、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、Ｆａｂ断片、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、^１０Ｆｎ３ドメイン、およびバーサボディを含む群から選択される、［４１］記載の複合体。
［５０］
（ａ）核酸分子に共有結合される第１の高親和性リガンドと、
（ｂ）ペプチド受容体に共有結合される第２の高親和性リガンドと、
（ｃ）２つ以上のリガンド結合部位を含む、リガンド受容体と
を含み、該第１および第２のリガンドが、異なるリガンド結合部位において該リガンド受容体に結合される、
ヘテロ二官能性複合体。
［５１］
前記第１の高親和性リガンドおよび第２の高親和性リガンドが同一である、［５０］記載の複合体。
［５２］
前記第１の高親和性リガンドおよび第２の高親和性リガンドがビオチンである、［５０］記載の複合体。
［５３］
前記核酸分子がソラレン部分を含む、［５０］記載の複合体。
［５４］
前記ペプチド受容体がピューロマイシンである、［５０］記載の複合体。
［５５］
前記リガンド受容体が多量体タンパク質である、［５０］記載の複合体。
［５６］
前記リガンド受容体がストレプトアビジンである、［５０］記載の複合体。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】本明細書で説明される方法の一実施形態を図示する。

【図2】ｃＤＮＡを都合良くプライミングし、反対末端上のピューロマイシンまたは誘導体または小分子を運ぶことができる、２つの３’末端を有する逆極性プライマーである、先進プライマーを使用した、同実施形態を図示する。

【図3】ステムループ変種であり、ｃＤＮＡを折り畳み、都合良くプライミングすることができる、先進プライマーを使用した、同実施形態を図示する。

【図4】抗体重鎖可変領域の構造／機能を改善または進化させるために採用されている方法の一実施形態を図示し、ポリペプチドは、核酸結合ＦＫ５０６小分子に非共有結合することができるＦＫ１２ＢＰタンパク質に融合され、それにより、改善（進化）した表現型（ポリペプチド）を、それをコードする遺伝子型（核酸）と結合する。

【図5】分岐オリゴヌクレオチドリンカー、および共有結合したペプチド受容体を含む相補的オリゴヌクレオチドを使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示する。

【図6】ペプチド受容体に共有結合された分岐オリゴヌクレオチドリンカーを使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示する。

【図7】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示する。

【図8】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示し、リガンド受容体は、ペプチド受容体に共有結合されている。

【図9】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示し、リガンド受容体は、ペプチド受容体に非共有結合されている。

【図10】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態を図示し、第１のリガンド受容体分子は、第２の（同族でない）高親和性リガンドに共有結合され、第１のリガンド受容体分子は、核酸に共有結合された同族の第１の高親和性リガンドに結合することができ、第２の高親和性リガンドは、核酸によってコードされるポリペプチドに融合された、同族の第２のリガンド受容体に結合することができる。

【図11】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態で使用される、個々の成分の非限定的な例を図示する。

【図12】高親和性リガンドおよびリガンド受容体を使用した、インビトロディスプレイの方法の一実施形態に対する、核酸／タンパク質複合体の非限定的なアセンブリ順を図示する。

【図13】好ましいＸディスプレイ複合体の設計を図示する。

【図14】ＶＨライブラリをプライミングし、ディスプレイ複合体をアセンブリし、ディスプレイ複合体を選択し、そして精製するための、例示的スキームを図示する。

【図15】ＶＨライブラリ用の単一クローンの実例を図示する。説明図は、転写および翻訳開始配列、ＶＨ配列、Ｃｕ配列、ＦＬＡＧタグ配列、リンカー（例えば、ＮＡリンカー）と相補的であるＤＮＡセグメントを示す。

【図16A】図１６Ａ〜Ｂは、ディスプレイ方法の好ましい実施形態の工程を図示する。図１６Ａは、まず、相補的鎖対合およびソラレン結合を介してリンカー／ＲＴプライマー（ＮＡリンカー）に付着される、ｍＲＮＡ分子（適切なリンカー、タグ、相補領域、およびポリＡ末端を含有する）を含むＸディスプレイ複合体を描写する。ＮＡリンカーはさらに、ストレプトアビジン分子に結合するビオチン（Ｂ）分子に共有結合される。ストレプトアビジンは、翻訳されたタンパク質に付着されているピューロマイシンにそれ自体が共有結合される、第２のビオチン分子に結合する。図１６Ａは、逆転写（工程１）およびＲＮＡ分解（工程２）を描写する。

【図16B】図１６Ｂは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを作成する、第２の鎖合成（工程４）を描写する。１６Ｂの最後の図は、最後のｄｓＤＮＡ Ｘディスプレイ複合体（すなわち、Ｘディスプレイ複合体）である。

【図17】潜在的なライブラリ構成要素と、いくつかの実施形態において、どのようにプライマーが４５４配列決定法とともに採用され得るかを描写する。

【図18】ＶＨライブラリ構成要素の例示的セグメントを描写する。

【図19】ディスプレイライブラリ構成要素の例示的セグメントを描写し、さらに、プライマーからの末端配列をディスプレイする（図１７参照）。

【図20】ディスプレイライブラリ構成要素の例示的セグメントを描写し、さらに、プライマーからのＴＭＶ ＵＴＲおよびＣ−ｍｕ領域を提供する。

【図21】配列決定のために選択されたクローンを増幅するためのプライマーの可能な配置を描写する。

【図22】選択を通したライブラリからの本発明の一実施形態の進展を図示し、１回で選択された核酸／タンパク質が、後続の複数回のＸディスプレイ複合体形成および選択用のライブラリを生成するために使用され得るように、本方法が繰りされてもよいことを図示する。

【図23】本発明の一実施形態を図示し、それにより、ライブラリを再生成することなく、または選択生成物を増幅することなく、数回の選択が採用される。

【図24】ｍＲＮＡからのＶＨおよびＶＬライブラリ設計の１つの方法を図示する。

【図25】選択方法の１つの例示的実施形態を図示し、親和性選択で使用される標的分子は、固体支持体上で固定化される。

【図26】選択方法の１つの例示的実施形態を図示し、親和性選択で使用される標的分子は、細胞表面上で発現される。そのような実施形態では、ディスプレイ複合体は、（例えば、細胞に結合するが関心対象の標的には結合しない複合体を除去するために）複合体を発現しない細胞に対して選択され、次いで、（例えば、特定のバインダーを特定するように）関心対象の標的を発現する細胞に対して選択される。

【図27】ＤＮＡ Ｘディスプレイ複合体（すなわち、ＤＮＡタンパク質融合体）を図示し、ソース標識が、（例えば、コードＤＮＡのソースを特定するように）核酸に組み込まれており、一定のソースコード化が、異なる複数回の選択からの核酸を標識化するために使用されている（例えば、１回の配列決定の実行のための異なる複数回の選択からの核酸をプールする時に有用である）。

【図28】ＤＮＡ Ｘディスプレイ複合体（すなわち、ＤＮＡ−タンパク質融合体）、およびＮ６プライマーの追加を図示する。

【図29】配列分析スキームの一実施形態を示すフローチャートを描写する。

【図30】ｍＲＮＡ転写、精製、および架橋結合の過程の例示的結果を図示する。

【図31】ｍＲＮＡ転写、精製、およびストレプトアビジンのローディングの過程の例示的結果を図示する。

【図32】ＲＮａｓｅＨ処理および溶出の過程の後の例示的結果を図示する。

【図33】ＲＮａｓｅＨ処理および溶出の過程の後の例示的結果を図示する。

【図34】ＲＴ−ＰＣＲおよび第２鎖合成の過程の後の例示的結果を図示する。

【図35】複数回の選択を１回の配列決定の実行にプールすることを可能にするために、ライブラリ設計で使用され得る、プール標識法を図示する。

【図36】ＶＨライブラリのプライミングのための例示的ドナー細胞を図示する。

【発明を実施するための形態】

【0057】

本発明は、タンパク質および核酸の所望の特性を選択し、進化させる組成物および方法を提供する。本方法は、本明細書では「Ｘディスプレイ」と呼ばれ、ストレプトアビジンを用いたいくつかの実施形態では、「ＳＡディスプレイ」と呼ばれうる。種々の実施形態では、本発明は、核酸または修飾核酸に結合される、小分子を含む。他の実施形態は、修飾アミノ酸を有するペプチドを含む、ポリペプチドを産生するための方法と、所望の特性を有する集団のうちの個別構成要素の選択を可能にするための分析と、改善した特性を有するポリペプチドの新規変異型を生成するための方法とを含む。

【0058】

「選択」とは、集団の中で他の分子から１つの分子を実質的に区分化することを意味する。本明細書で用いられる、「選択」工程は、該選択工程に従って、集団の中の望ましくない分子と比較して、所望の分子の少なくとも２倍、いくつかの実施形態では、３倍、５倍、１０倍、２０倍、好ましくは３０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは１０００倍の濃縮を提供する。選択工程は、任意の回数で繰り返されてもよく、異なる種類の選択工程が、所与のアプローチで組み合わせられてもよい。

【0059】

「タンパク質」は、１つ以上のペプチド結合によって連結された任意の２つ以上の天然または修飾アミノ酸を意味する。「タンパク質」および「ペプチド」は、本明細書では同義に使用される。

【0060】

「ＲＮＡ」は、２つ以上の共有結合された、天然または修飾リボヌクレオチドの配列を意味する。この用語に含まれる修飾ＲＮＡの一例は、ホスホロチオエートＲＮＡである。

【0061】

「ＤＮＡ」は、２つ以上の共有結合された、天然または修飾デオキシリボヌクレオチドの配列を意味する。

【0062】

「核酸」は、任意の２つ以上の共有結合された、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの類似体もしくは誘導体を意味する。本明細書で使用されるこの用語は、限定するものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡを含む。「核酸」という用語は、修飾核酸を含み得、したがって、核酸および修飾核酸は、同義に使用され得る。

【0063】

本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオチド誘導体」または「修飾核酸」という用語は、５−プロピニルピリミジン（すなわち、５−プロピニル−ｄＴＴＰおよび５−プロピニル−ｄＴＣＰ）、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ）等の、修飾または非天然ヌクレオチドを指す。ヌクレオチド類似体は、塩基類似体を含み、デオキシリボヌクレオチドならびにリボヌクレオチドの修飾形態を含む。

【0064】

「ペプチド受容体」は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ機能の触媒活性によって、成長タンパク質鎖のＣ末端に付加されることが可能な任意の分子を意味する。典型的には、そのような分子は、（ｉ）ヌクレオチドまたはヌクレオチド様部分（例えば、アデノシンまたはアデノシン類似体（Ｎ−６アミノ位置におけるジメチル化が許容可能である））、（ｉｉ）アミノ酸またはアミノ酸様部分、例えば、２０種のＤ−またはＬ−アミノ酸のうちのいずれか、あるいはその任意のアミノ酸類似体（例えば、Ｏ−メチルチロシン、またはＥｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３０１，１９９１によって説明されている類似体のうちのいずれか）、および（ｉｉｉ）それらの２つの間の結合（例えば、３’位置、または、あまり好ましくないが２’位置における、エステル、アミド、またはケトン結合）を含有し、好ましくは、この結合は、天然リボヌクレオチド立体構造由来の環の襞（ｐｕｃｋｅｒ）を有意に乱さない。ペプチド受容体はまた、限定するものではないが、アミノ基、ヒドロキシル基、またはスルフヒドリル基であり得る求核物質を保有してもよい。加えて、ペプチド受容体は、ヌクレオチド模倣体、アミノ酸模倣体、または組み合わされたヌクレオチド−アミノ酸構造の模倣体から成ってもよい。

【0065】

本明細書で使用される「Ｘディスプレイ複合体」、「核酸−ポリペプチド複合体」、および「核酸−タンパク質融合体」という用語は、同義で使用でき、核酸と該核酸によってコードされるタンパク質（またはペプチドあるいはその断片）との相互作用から直接または間接的に形成される複合体を指すように意図される。場合によっては、Ｘディスプレイ複合体は、「ディスプレイ複合体」または「ディスプレイ融合体」と呼ばれてもよく、当業者であれば、そのような使用の文脈によって、本明細書で参照され得る他の種類のディスプレイシステムと混同されるべきではないことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡである。他の好ましい実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡである。したがって、ＤＮＡを含有する複合体をディスプレイすることが目標であるいくつかの実施形態では、Ｘディスプレイ複合体は、「ＤＮＡ-タンパク質融合体」または「ＤＮＡディスプレイ融合体」と呼ばれてもよい。「融合体」という用語の使用は、核酸がペプチドまたはタンパク質に共有結合されることを暗示または示唆するものではないことに留意することが重要である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡまたはＤＮＡは、修飾または改変されてもよい。好ましい実施形態では、核酸とタンパク質との間の相互作用は、非共有結合的である（例えば、該相互作用は、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用、リンカー分子、および本明細書で説明されるような同等物によって仲介され得る）。好ましい実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡである。

【0066】

「機能改変」は、分子の機能の任意の定性的または定量的変化を意味する。

【0067】

本明細書で使用される「結合パートナー」は、所望のＤＮＡ−タンパク質融合体の一部分に対する特異的な、共有的な、または非共有的な親和性を有する、任意の分子を意味する。結合パートナーの例は、限定するものではないが、抗原／抗体の対、タンパク質／阻害物質の対、受容体／リガンドの対（例えば、ホルモン受容体／ペプチドホルモンの対などの細胞表面受容体／リガンドの対）、酵素／基質の対（例えば、キナーゼ／基質の対）、レクチン／炭水化物の対、オリゴマーまたはヘテロオリゴマータンパク質凝集体、ＤＮＡ結合タンパク質／ＤＮＡ結合部位の対、ＲＮＡ／タンパク質の対の構成要素、および核酸２本鎖、ヘテロ２本鎖、またはライゲーション鎖、ならびに、Ｘディスプレイ複合体の任意の部分との１つ以上の共有または非共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を形成することが可能な任意の分子を含む。

【0068】

「固体支持体」は、限定するものではないが、直接または間接的に（例えば、他の抗体またはプロテインＡ等の他の結合パートナー中間体を介して）親和性複合体が結合され得る、または（例えば、受容体またはチャネルを介して）親和性複合体が埋め込まれ得る、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、または金のチップ）、または膜（例えば、リポソームまたは小胞の膜）を意味する。

【0069】

Ｘディスプレイ複合体を仲介するための核酸または修飾核酸リンカー
本発明の一様態では、核酸の３’末端においてハイブリダイズされる核酸または修飾核酸リンカー（「ＮＡリンカー」）の使用によって、翻訳の終わりに、核酸（例えば、天然ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡ）が、そのコードされたタンパク質に付着され得る。そのような実施形態では、ＮＡリンカーは、２つの３’末端を効果的に有するように該リンカーにおける逆極性を有し、そのうちの非ハイブリダイズ末端は、ピューロマイシンまたは関連類似体、あるいは高親和性でポリペプチドタンパク質に共有または非共有結合することが可能な小分子に付着している。したがって、いくつかの実施形態では、Ｘディスプレイ複合体は、ＮＡリンカーによるタンパク質および核酸の相互作用によって形成される。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＮＡリンカーは、ソラレンリンカーである。いくつかの好ましい実施形態では、リンカーは、ＸＢ−ＰＢＩである。いくつかの実施形態では、ＸＢ−ＤＤＢを使用することができる。いくつかの好ましい実施形態では、リンカー（例えば、ＰＢＩリンカーまたはＤＤＢリンカー）は、高親和性リガンド（例えば、ビオチン）に付着され、すなわち、リンカーは、高親和性リガンドを含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、核酸（例えば、天然ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡ）は、ＮＡリンカーに架橋結合され、それは、ペプチド受容体または高親和性リガンドにさらに付着される。そのような架橋結合は、当技術分野で知られている任意の方法によって達成することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６４１６９５０号は、そのような架橋結合を行う方法を説明している（例えば、米国特許第６４１６９５０号の図９−１３を参照）。

【0072】

さらなる実施形態では、本発明は、核酸、例えば、ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡテンプレートにハイブリダイズできるように、リンカー中に逆の５’−３’極性を有する二重機能ＮＡリンカーを含み、ハイブリダイズは、コード化領域外のｍＲＮＡの３’末端の一方で起こり、核酸／修飾リンカーは、その他方の３’末端上に、ピューロマイシンまたはその機能的類似体（例えば、ピラゾロピリミジンであるが、それに限定されない）、あるいは、ポリペプチドタンパク質に高親和性結合または共有結合することができる小分子等のペプチド受容体を持つ。

【0073】

いくつかの実施形態では、核酸、好ましくはｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡは、３’末端においてＮＡリンカーにハイブリダイズされ、それ自体が、共有結合を介して、または高親和性非共有結合によって、ポリペプチド（または修飾ポリペプチド）に、共有結合または高親和性結合される。

【0074】

さらなる実施形態では、ＮＡリンカーは、ｍＲＮＡを逆転写するプライマーとしての機能を果たすことができる。

【0075】

付加的な実施形態は、ピューロマイシンまたは関連する類似体あるいは小分子をその３’末端上に持つＮＡリンカーにステムループ構造を介して結合する能力に加えて、コードする核酸のテンプレート上で重合のためのプライマーとしての機能を果たすことができるように、その「５’末端」（重合を指図するための３’極性を効果的に有するので、引用符で囲まれている）において逆極性核酸部分を持つＮＡリンカーに機能的に結合した、コードする核酸を含む（図２および３参照）。

【0076】

いくつかの実施形態では、コードする核酸は、分岐ＮＡリンカーに機能的に結合され、ＮＡリンカーの一部分は、コードする核酸の３’末端と相補性を有する（図５参照）。分岐ＮＡリンカーを生成する、当技術分野で認識されている任意の手段が意図されている。分岐点は、ＮＡリンカー内の任意の場所で発生することができる。そのような分岐ＮＡリンカーはまた、それらが結合される、コードする核酸、例えば、ｍＲＮＡの逆転写のためのプライマーとしての機能を果たすこともできる。

【0077】

いくつかの実施形態では、コードする核酸は、分岐ＮＡリンカーに機能的に結合され、リンカーは、ペプチド受容体に共有結合される（図６参照）。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＮＡリンカーは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、例えば、リボヌクレオシドが２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン単位と結合される、二環式核酸を含む。特定の実施形態では、コードする核酸と相補的であるＮＡリンカーの領域は、少なくとも部分的に核酸２本鎖の安定性を増加させるように、ＬＮＡを含む（Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７−５５を参照）。

【0079】

リガンド／受容体結合
別の態様では、Ｘディスプレイ複合体（例えば、コードする核酸およびコードされたポリペプチド）は、高親和性リガンドとその同種結合パートナー（リガンド受容体）との高親和性結合または共有結合を介して形成される。そのような実施形態では、核酸は、高親和性リガンドに共有または非共有結合され得、それは次いで、リガンド受容体に非共有または共有結合する。好ましい実施形態では、相互作用は非共有結合的である。いくつかの実施形態では、リガンド受容体はさらに、第２の高親和性リガンドと会合し、それは次いで、ペプチド受容体に結合される。

【0080】

高親和性リガンド／リガンド受容体の対の非限定的な例は、ＦＫ５０６／ＦＫＢＰ１２、メトトレキサート／ジヒドロ葉酸還元酵素、およびＰＰＩ−２４５８／メチオニンアミノペプチダーゼ２を含むが、それらに限定されない。リガンド／リガンド受容体の対のさらなる非限定的な例を、表１に示す。いくつかの実施形態では、リガンド／リガンド受容体の対は、ビオチン／ストレプトアビジンである。単量体ストレプトアビジン、二量体ストレプトアビジン、四量体ストレプトアビジン、およびそれらの化学修飾または遺伝子修飾変異体を含むがそれらに限定されない、任意の形態のストレプトアビジンが、本発明の方法での使用で考慮される。いくつかの実施形態では、リガンド受容体は、四量体ストレプトアビジンである。特定の実施形態では、四量体ストレプトアビジンは、安定性を増加させるように化学的に架橋結合される。

【0081】

（表１）高親和性リガンド／リガンド受容体の対の非限定的な例

【0082】

いくつかの実施形態では、高親和性リガンドが、核酸（リガンド／核酸分子）に共有結合される。高親和性リガンドを核酸に結合させる、当技術分野で認識されている任意の方法が意図される。一実施形態では、高親和性リガンドは、ｍＲＮＡ分子の３’末端に共有結合される。

【0083】

いくつかの実施形態では、高親和性リガンド受容体分子が、ペプチド受容体に共有結合され、それは次いでリボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性によって、翻訳されたタンパク質に共有結合することができる（図８参照）。ペプチド受容体への高親和性リガンド受容体の結合は、直接的、またはリンカー分子を介したものとなり得る。当技術分野で認識されている任意のリンカー分子が、本発明の方法で使用するために意図される。一実施形態では、高親和性リガンド受容体は、ポリエチレングリコールリンカー分子を使用して、ペプチド受容体に結合される。

【0084】

いくつかの実施形態では、高親和性リガンドが、ペプチド受容体に共有結合され、それは次いでリボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性によって、翻訳されたタンパク質に共有結合することができる（図９参照）。いくつかの好ましい実施形態では、そのようなリガンド／ペプチド受容体分子は、多量体リガンド受容体、例えば、四量体ストレプトアビジンを介して、リガンド／核酸分子に非共有結合することができる。ペプチド受容体への高親和性リガンド受容体の共有結合は、直接的、またはリンカー分子を介したものとなり得る。当技術分野で認識されている任意のリンカーが、本発明の方法で使用するために意図される。特定の実施形態では、高親和性リガンドは、ポリエチレングリコールリンカー分子を使用して、ペプチド受容体に結合される。

【0085】

いくつかの実施形態では、リガンド受容体分子が、核酸によってコードされるポリペプチドに融合される（図４および１０参照）。そのような融合は、化学架橋剤を使用して化学的に、または遺伝的に、行うことができる。リガンド受容体分子は、任意の領域において、コードされたポリペプチドに融合することができる。特定の実施形態では、リガンド受容体分子は、コードされたポリペプチドのＮ末端領域に遺伝的に融合される。

【0086】

いくつかの実施形態では、第１のリガンド受容体分子が、第２の（同族でない）高親和性リガンドに共有結合される。そのような実施形態では、第１のリガンド受容体分子は、核酸に共有結合される、同族の第１の高親和性リガンドに結合してもよい。第２の高親和性リガンドは、核酸によってコードされるポリペプチドに融合される、同族の第２のリガンド受容体に結合してもよい。

【0087】

好ましい実施形態では、リガンド受容体分子、好ましくは、多価リガンド受容体（例えば、多価ストレプトアビジン）が、第１の高親和性リガンド（例えば、ビオチン）に非共有結合し、それが、ｍＲＮＡ分子に相補的である核酸に共有結合される。多価リガンド受容体はまた、第２の高親和性リガンド（例えば、ビオチン）にも非共有結合し、それが、ペプチド受容体（例えば、ピューロマイシン）に共有結合される。第２の高親和性リガンドは、直接、またはリンカー（以下で説明されるように、例えば、ポリエチレングリコール）を介して、ペプチド受容体に接続されてもよい。好ましい実施形態では、第１の高親和性リガンドに付着される核酸は、ｍＲＮＡの３’末端と相補的である。核酸（例えば、ＮＡリンカーの中の核酸）は、少なくとも、Ｘディスプレイ複合体の、タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に安定して結合するのに十分な長さがあるべきである。いくつかの実施形態では、第１の高親和性リガンドに付着される核酸は、１５から１００ヌクレオチド長、１５から８０ヌクレオチド長、１５から５０ヌクレオチド長、５から４０ヌクレオチド長、１５から３０ヌクレオチド長、１５から２０ヌクレオチド長、１０から２０ヌクレオチド長、または１５から１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第１の高親和性リガンドに付着される核酸は、１５ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、または８７ヌクレオチド長である。

【0088】

本発明のいくつかの実施形態は、ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡ、ピューロマイシンまたは類似体あるいは小分子に機能的に結合されるＮＡリンカー、およびｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドを安定して結合して、結合されたｍＲＮＡ−ポリペプチド複合体を形成する方法を含む。

【0089】

好ましい実施形態では、ＮＡリンカーは、ｍＲＮＡ−ポリペプチド複合体上の核酸の第２鎖を重合して、ポリペプチドに結合された核酸２本鎖を形成するために、プライマーとして使用される。好ましい実施形態では、この重合は、ＤＮＡ（または修飾ＤＮＡ）ハイブリッドを形成する逆転写である。

【0090】

本発明のいくつかの実施形態は、複数の異なるＸディスプレイ複合体を含み、所望の結合特徴を有するリガンドを提供し、複合体をリガンドと接触させ、非結合複合体を除去し、およびリガンドに結合された複合体を回収する方法を含む。

【0091】

本発明のいくつかの方法は、核酸分子および／またはタンパク質の進化を伴う。一実施形態では、本発明は、回収された複合体の核酸成分を増幅することと、核酸の配列に変異を導入することとを含む。他の実施形態では、本方法はさらに、増幅および変異された核酸からポリペプチドを翻訳することと、核酸／修飾リンカーを使用して、それらをともに結合することと、結合複合体の別の新規集団を選択するように、それらをリガンドと接触させることとを含む。本発明のいくつかの実施形態は、インビトロでの進化の過程、特に、選択されたｍＲＮＡが変異を伴って複製され、翻訳され、選択のために同種タンパク質に再び接続される、反復過程において、選択されたタンパク質−ｍＲＮＡ複合体を使用する。

【0092】

リンカー部分
いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のリンカー部分（上で説明されるＮＡリンカーとは別）を採用する。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、核酸をペプチド受容体に接続するために用いることができる。他の実施形態では、リンカー部分は、高親和性リガンド（例えば、ビオチン）またはリガンド受容体（例えば、ストレプトアビジン）をペプチド受容体に接続するために使用することができる。別の実施形態では、リンカー部分は、核酸を高親和性リガンドに接続するために使用することができる。本明細書で使用される、「リンカー部分」という用語は、１つ以上のリンカー部分またはサブユニットを含んでもよい。

【0093】

いくつかの好ましい実施形態では、リンカー部分は、ポリ（アルキレンオキシド）部分であり、それは、ポリエーテル骨格を有する化合物の属である。本発明で用いられるポリ（アルキレンオキシド）種は、例えば、直鎖および分岐鎖種を含んでもよい。例えば、ポリ（エチレングリコール）は、反復するエチレンオキシドサブユニットから成るポリ（アルキレンオキシド）であり、いずれか一方の末端において付加的な反応部分、活性化可能部分、または不活性部分を含んでも含まなくてもよい。ヘテロ二官能性である直鎖ポリ（アルキレンオキシド）種の誘導体も、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、リンカー部分は、５から５０のサブユニットのポリ（アルキレンオキシド）、１０から３０のサブユニットのポリ（アルキレンオキシド）、１０から２０単位のポリ（アルキレンオキシド）、１５から２０単位のポリ（アルキレンオキシド）、または、いくつかの実施形態では１８のサブユニットのポリ（アルキレンオキシド）から成り得る。当業者であれば、Ｘディスプレイ複合体を形成することが依然として可能である限り、任意の数のリンカー部分を使用してもよいことを理解するであろう。

【0094】

ポリ（エチレングリコール）リンカーは、ポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）骨格またはメトキシ−ＰＥＧ（「ｍＰＥＧ」）骨格を有する部分であり、ＰＥＧおよびｍＰＥＧ誘導体を含む。多種多様のＰＥＧおよびｍＰＥＧ誘導体が、当技術分野で知られており、市販されている。例えば、Ｎｅｋｔａｒ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．）は、求核反応基、カルボキシル反応基、求電子的活性化基（例えば、活性エステル、炭酸ニトロフェニル、イソシアン酸塩等）、スルフヒドリル選択基（例えば、マレイミド）、およびヘテロ官能基（ＰＥＧまたはｍＰＥＧの両端に２つの反応基を有する）、ビオチン基、ビニル反応基、シラン基、リン脂質基、および同等物を随意で有する、リンカーまたは修飾基として有用なＰＥＧおよびｍＰＥＧ化合物を提供する。

【0095】

他の実施形態では、リンカー部分は、核酸、または当技術分野で認識される任意の他のリンカーであってもよい。例えば、ポリシアル酸（ＰＳＡ）およびＰＳＡ誘導体を用いることができる（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４６，９５１号、米国特許公報第ＵＳ２００８０２６２２０９号、ＰＣＴ出願ＷＯ２００５／０１６９７３およびＷＯ−Ａ−０１８７９２２１を参照）。

【0096】

好ましいペプチド受容体はピューロマイシンであるが、ピューロマイシンと同様に作用する他の化合物が使用されてもよい。タンパク質受容体に対する他の可能な選択肢は、ピラゾロピリミジンまたは関連する任意の誘導体、およびｔＲＮＡ様構造、ならびに当技術分野で知られている他の化合物を含む。そのような化合物は、限定されないが、アミノ酸ヌクレオチド、フェニルアラニル−アデノシン（Ａ−Ｐｈｅ）、チロシルアデノシン（Ａ−Ｔｙｒ）、およびアラニルアデノシン（Ａ−Ａｌａ）等の、アデニンまたはアデニン様化合物に結合されたアミノ酸を保有する任意の化合物、ならびに、フェニルアラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、アラニル３’デオキシ３’アミノアデノシン、およびチロシル３’デオキシ３’アミノアデノシン等のアミド結合構造を含み、これらの化合物のうちのいずれも、天然Ｌ−アミノ酸またはそれらの類似体のうちのいずれもが利用され得る。加えて、複合ｔＲＮＡ様３’構造−ピューロマイシンコンジュゲートも、本発明で使用されてもよい。

【0097】

翻訳系
本発明のいくつかの実施形態は、終結因子を有さないインビトロ翻訳系においてｍＲＮＡが翻訳される好ましい方法を利用する。それにより、リボソームは、停止コドンにおいて失速し、ピューロマイシンまたは類似体あるいは小分子がポリペプチドタンパク質に共有結合または高親和性結合することを可能にする。

【0098】

本発明のいくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの終結因子の機能が終結因子阻害物質によって阻害されるインビトロ翻訳系において翻訳される。好適な阻害物質は、抗終結因子抗体を含むが、それらに限定されない。

【0099】

本方法は、好ましくはインビトロ翻訳系を使用して実行されるので、修飾アミノ酸を翻訳機構に組み込んで、化学的修飾を有するポリペプチドを作成できることが、当技術分野で知られている。

【0100】

網状赤血球溶血系、小麦胚芽抽出系、または他の好適なインビトロ転写系等の、種々のインビトロ翻訳系が使用されてもよい。１つの好ましい実施形態では、ＰＵＲＥＳｙｓｔｅｍ（ｃｏｓｍｏｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｘｐｏｒｔ＿ｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ＰＧＭ＿２００６０９０７＿０６．ａｓｐ）が採用される。所望であれば、ライブラリ構成要素の総収量を増加させるため、または使用の便宜上、Ｓｐｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１１６２の無細胞連続流（ＣＦＣＦ）翻訳系が使用されてもよい。静的インビトロタンパク質合成システムを使用することができる。このシステムでは、タンパク質合成は、概して、１時間後に停止し、したがって、ライブラリの作成のための時間間隔が制限される。ＣＦＣＦ技術の利点は、タンパク質の高レベルおよび長期合成が、はるかに大きく多様なタンパク質−ＲＮＡ複合体のライブラリをもたらすと考えられることである。ＣＦＣＦ技術は、２４時間以上の長期間にわたるタンパク質の高レベル合成のための方法として、Ｓｐｉｒｉｎらによって説明されている。加えて、ＣＦＣＦ技術は、翻訳装置からの新規に合成されたタンパク質の分画をもたらし、したがって、タンパク質−核酸複合体を迅速に隔離することを実現可能にする。ＣＦＣＦ技術の他の用途は、ペプチドを合成するための効率的な方法を含む。例えば、高親和性で標的に結合するペプチド融合の識別後、ＣＦＣＦ技術を使用して、遊離ペプチドを直接合成し、結合分析で使用することができる。

【0101】

例えば、Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ（商標）などの、ポリヌクレオチドをポリペプチド（すなわち、表現型）に結合するため他の無細胞技法も使用することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３４８，３１５号、第６，２６１，８０４号、第６，２５８，５５８号、および第６，２１４，５５３号を参照）。

【0102】

プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を適宜含む適切な調節配列を含有する、好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、例えば、特定の発現またはインビトロ翻訳系に応じて適宜、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、またはファージミドであってもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多くの既知の技法およびプロトコルが、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２で詳細に説明されている。ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0103】

いくつかの実施形態では、例えば、発現されるＤＮＡがＰＣＲ増幅ＤＮＡ鎖のみに存在する時には、プラスミドまたはウイルスベクター等の発現ベクターが採用されない。

【0104】

さらなる実施形態では、本発明の方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０７８，１９７号、第６，４２９，３００号、第５，９２２，５４５号、第７，１９５，８８０号、第６，４１６，９５０号、第６，６０２，６８５号、第６，６２３，９２６号、第６，９５１，７２５号、または米国特許出願第１１／５４３，３１６号、第１０／２０８，３５７号で説明されている、方法および／または組成物を採用することができる。

【0105】

１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの結合に適した、無傷の停止コドンおよび３’未翻訳ＲＮＡの領域を含有するｍＲＮＡが、終結因子を有さないインビトロ翻訳系において翻訳される（例えば、ＰＵＲＥＳｙｓｔｅｍ、ｃｏｓｍｏｂｉｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｅｘｐｏｒｔ＿ｅ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｐｒｏｔｅｉｎｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ＰＧＭ＿２００６０９０７＿０６．ａｓｐ）。終結因子は、ペプチジル−ｔＲＮＡの中のエステル結合の加水分解、およびリボソームからの新規に合成されたタンパク質の放出を誘起する。終結因子がない場合、リボソームは、ｍＲＮＡ上で失速する。次に、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが混合物に追加される。このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡの３’末端と相補的であり、ペプチド受容体種をリボソームの中に送達して、結合翻訳タンパク質とともに共有結合付加体を形成することができるリンカーで官能基化される。いくつかの実施形態では、それは、追加されるＮＡリンカーである。リンカーが付着する部位は、３’末端を除く、オリゴヌクレオチドに沿ったいかなる場所ともなり得る。リンカーは、リボソームの中へ到達するのに十分な長さである必要がある。付加体を形成する種は、好ましくは、ピューロマイシンまたはピラゾロピリミジンあるいは関連する任意の誘導体である。

【0106】

新生タンパク質へのリンカーの共有結合による追加後、リボソームを放出するようにＥＤＴＡが追加され、後に、ｍＲＮＡ−オリゴヌクレオチド−タンパク質種が単離され、ＤＮＡ−タンパク質融合体を作成するように逆転写を受ける。最終的に、任意のＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡの第２鎖が追加される。そのような実施形態では、ｍＲＮＡ−オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＡリンカー）種が共有結合されてもよいが、ＮＡリンカーは、Ｘディスプレイ複合体内のいずれの中間種にも共有結合される必要はない（例えば、ｍＲＮＡをタンパク質に架橋するためにビオチン／ストレプトアビジンが使用される場合）。

【0107】

結果として生じるＤＮＡ−タンパク質融合体は、インビボまたはインビトロでのスクリーニングに、または診断用途に使用することができる。

【0108】

使用法
本発明の方法および組成物は、治療、診断、または産業上の問題を解決するためにタンパク質技術が使用される、任意の分野での商業的用途を有する。このＸディスプレイ技術は、既存のタンパク質を改善または改変させるため、ならびに所望の機能を有する新規のタンパク質を単離するために有用である。これらのタンパク質は、天然配列であってもよく、改変形態の天然配列であってもよく、または、部分的または完全に合成配列であってもよい。

【0109】

本発明の方法は、例えば、抗体、結合断片またはそれらの類似体、一本鎖抗体、触媒抗体、ＶＬおよび／またはＶＨ領域、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ’断片、Ｄａｂ等のイムノバインダーのポリペプチドを開発または改善するために使用することができる。いくつかの実施形態では、改善されるポリペプチドは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１２５７、およびＢａｒｃｌａｙ（２００３）Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５（４）：２１５−２２３で考察されているように、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様ドメインを有する任意のポリペプチド、例えば、インターフェロン、プロテインＡ、アンキリン、Ａ−ドメイン、Ｔ細胞受容体、フィブロネクチンＩＩＩ、ガンマ−クリスタリン、ＭＨＣクラス分子の抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤ８のアルファおよびベータ抗原結合ドメイン）、ユビキチン、免疫グロブリンスーパーファミリーの構成要素、および他多数であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーから導出される免疫グロブリンライブラリのように、単一のライブラリは、骨格として多くの異なるＶ領域配列を使用するが、それらは全て、基本免疫グロブリン群を共有する。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様群は、ジスルフィド結合によってともに保持される、いくつかの（例えば、ＩｇＧの軽鎖Ｃドメインの場合は７つ）逆平行β鎖を含む２つのβシートを含む、樽状タンパク質構造である。したがって、任意の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様タンパク質（その複数部分または断片を含む）の改善または選択が意図される。

【0110】

別の用途では、本明細書で説明されるＸディスプレイ技術は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様ドメインがあってもなくてもよい、特異的結合（例えば、リガンド結合）特性を有するタンパク質の単離に有用である。極めて特異的な結合相互作用を示すタンパク質は、非抗体認識試薬として使用されてもよく、これにより、Ｘディスプレイ技術が従来のモノクローナル抗体技術を回避することを可能にする。この方法によって単離される抗体型試薬は、診断および治療用途を含む、従来の抗体が利用される任意の分野で使用することができる。

【0111】

好ましい実施形態では、本方法は、イムノバインダーの改善、例えば、抗体分子の可変領域および／またはＣＤＲの領域、すなわち、重鎖（ＶＨ）から１つおよび軽鎖（ＶＬ）から１つといった、２つの鎖の可変領域から構成される、抗原結合活性に関与する構造を標的化する。いったん所望の抗原結合特徴が特定されると、可変領域を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ等の適切な抗体クラスに操作することができる。本方法は、ヒトイムノバインダーおよび／または他の種からのイムノバインダー、例えば、任意の哺乳類または非哺乳類イムノバインダー、ラクダ抗体、サメ抗体等を改善および／または選択するために採用されてもよいことが理解される。

【0112】

本発明は、多数の疾患のうちのいずれかの治療のためのヒトまたはヒト化抗体（またはそれらの断片）を改善するために使用することができる。この用途では、抗体ライブラリが作製されて、インビトロでスクリーニングされ、細胞融合またはファージディスプレイ等の技法の必要性を排除する。１つの重要な用途では、本発明は、一本鎖抗体ライブラリを改善するために有用である（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４（１９８９）；およびＧｏｕｌｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３：６１７（１９９０））。この用途のために、可変領域は、（レシピエントの起こり得る有害免疫反応を最小化するように）ヒト供給源から構築されてもよく、または（ライブラリの複雑性を最大化するように）完全ランダム化カセットを含有してもよい。改善された抗体分子についてスクリーニングするために、候補分子プールが標的分子への結合について検査される。次いで、選択が１回から次回に進行するにつれて、より高いレベルの厳密性が結合工程に適用される。厳密性を増加させるために、洗浄工程の数、過剰な競合物の濃度、緩衝条件、結合反応時間の長さ、固定化マトリクスの選択等の条件が、変更され得る。一本鎖抗体は、治療のために直接、または標準抗体の設計のために間接的に使用されてもよい。そのような抗体は、抗自己免疫抗体の単離、免疫抑制、およびＡＩＤＳ等のウイルス性疾患用のワクチンの開発を含む、多数の潜在的用途を有する。

【0113】

以下で詳説されるように、今では多種多様な抗体断片および抗体模倣物技術が開発されており、当技術分野で広く知られている。ドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディ等の、多数のこれらの技術が、従来の抗体構造の断片または他の修飾を利用する一方で、従来の抗体結合を模倣するが、異なる機構から生成され、かつ異なる機構を介して機能する結合構造を採用する、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディ等の代替技術もある。これらの代替構造のうちのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｄａｍｌｅ（２００６）１７：６５３−６５８で考察されている。上述の抗体誘導体およびバインダーの全ては、本発明の方法によって改善および／または選択することができる。いくつかの実施形態では、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ＵｎｉＢｏｄｙ）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、およびバーサボディを生成する当技術分野で知られている方法を、本発明の方法に従って産生および選択され得るライブラリの生成の基礎として機能し得る初期結合タンパク質を発見するために使用することができる。代替として、当技術分野で既知のバインダーを、本明細書で説明される方法で使用するための新規ライブラリを作成するために、直接使用することができる。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）の改善を目的とする。ドメイン抗体は、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応する、抗体の最も小さい機能的結合単位である。ドメイン抗体は、約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨおよびＶＬ ｄＡｂの一連の大型で極めて機能的なライブラリ（各ライブラリの中に１００億以上の異なる配列）を開発しており、治療標的に特異的なｄＡｂを選択するために、これらのライブラリを使用する。多くの従来の抗体とは対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母、および哺乳類細胞系でよく発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２９１，１５８号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，１７２，１９７号、第６，６９６，２４５号、米国第２００４／０１１０９４１号、欧州特許出願第１４３３８４６号、ならびに米国特許第０３６８６８４号および第０６１６６４０号、ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９、およびＷＯ０３／００２６０９を参照することによって得ることができる。

【0115】

他の実施形態では、本明細書で説明される方法は、ナノボディの改善を目的とする。ナノボディは、天然重鎖抗体の独自の構造および機能的特性を含有する、抗体由来の治療用タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含有する。重要なことには、クローニングされて単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内部に持つ、完璧に安定したポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、活性の損失を伴わずに、さらにヒト化することができる。重要なことには、ナノボディは低い免疫原性を有し、このことは、霊長類でのナノボディリード化合物の研究で確認されている。

【0116】

ナノボディは、従来の抗体の利点を、小分子薬剤の重要な特徴と組み合わせる。従来の抗体のように、ナノボディは、高い標的特異性、それらの標的に対する高い親和性、および低い固有毒性を示す。しかしながら、小分子薬剤と同様に、酵素を阻害し、受容体の間隙に容易にアクセスすることができる。さらに、ナノボディは、極めて安定しており、注入以外の手段によって投与することができ（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０４／０４１８６７を参照）、製造しやすい。ナノボディの他の利点は、それらの小さいサイズの結果として、まれな、または隠れたエピトープを認識すること、タンパク質標的の空洞または活性部位に高親和性で結合すること、ならびに、独自の３次元、薬剤形式の融通性、半減期の調整、および創薬の容易性および速度による選択性を含む。

【0117】

ナノボディは、単一遺伝子によってコードされ、ほぼ全ての原核生物および真核生物宿主、例えば、大腸菌（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．６，７６５，０８７を参照）、カビ（例えば、アスペルギルス属およびトリコデルマ属）、および酵母（例えば、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、ハンセヌラ属、およびピキア属）（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｕ．Ｓ．６，８３８，２５４を参照）において効率的に産生される。産生過程は、大規模に実現可能であり、複数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比較して優れた安定性を示すため、保管期間が長い、すぐに使用できる溶液として処方することができる。したがって、本発明の方法は、それらの標的分子に対するナノボディの親和性を改善するために使用することができる。

【0118】

当技術分野で知られている方法を、ナノボディ（または本明細書で説明される他のバインダー／イムノバインダー）を生成するために使用することができる。次いで、そのようなバインダーは、本発明の方法に従って産生および選択され得るライブラリの生成の基礎としての機能を果たしてもよい。例えば、ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ０６／０７９３７２を参照）は、Ｂ細胞の自動化した高スループットの選択に基づいて、所望の標的に対するナノボディを生成するための独自の方法であり、本発明の文脈で使用され得る。ナノクローン法による首尾よいナノボディの選択は、最初の一連のナノボディを提供し得、本明細書で説明される方法によってさらに改善することができる。

【0119】

他の実施形態では、本明細書で説明される方法は、ユニボディの改善を目的とする。ユニボディは、別の抗体断片技術であるが、これは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づく。ヒンジ領域の欠失は、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの本質的に半分であり、従来のＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく、一価結合領域を有する分子をもたらす。また、ＩｇＧ４抗体は、不活性であり、したがって、免疫系と相互作用しないことも周知であり、これは、免疫応答が所望されない疾患の治療に有利であり得、この利点は、ユニボディに受け継がれる。例えば、ユニボディは、それらが結合される細胞を阻害するか、または活性を抑制することができるが、死滅させることはない。加えて、癌細胞に結合するユニボディは、増殖するようにそれらを刺激しない。さらに、ユニボディは、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの約半分であるため、潜在的に有利な有効性で、より大型の固形腫瘍にわたって、より良好な分布を示し得る。ユニボディは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から取り除かれ、それらの抗原に対して、全抗体と同様の親和性で結合することができる。ユニボディのさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、特許出願ＷＯ２００７／０５９７８２を参照することにより得ることができる。

【0120】

他の実施形態では、本明細書で説明される方法は、フィブロネクチンまたはアドネクチン分子の改善を目的とする。アドネクチン分子は、フィブロネクチンタンパク質の１つ以上のドメインに由来する、操作された結合タンパク質である（Ｗａｒｄ Ｍ．，ａｎｄ Ｍａｒｃｅｙ，Ｄ．，ｃａｌｌｕｔｈｅｒａｎ．ｅｄｕ／Ａｃａｄｅｍｉｃ＿Ｐｒｏｇｒａｍｓ／Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ＢｉｏＤｅｖ／ｏｍｍ／ｆｉｂｒｏ／ｆｉｂｒｏ．ｈｔｍを参照）。典型的には、フィブロネクチンは、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型モジュールの、３つの異なるタンパク質モジュールでできている。フィブロネクチンの機能の構造の考察については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐａｎｋｏｖ ａｎｄ Ｙａｍａｄａ（２００２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．；１１５（Ｐｔ ２０）：３８６１−３，Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ（２００２）２１：１１５−１２８、およびＬｕｃｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ Ｃｌｉｎ．４８：２４９−２６２を参照されたい。

【0121】

由来する組織に応じて、フィブロネクチンは、例えば、^１ＦｎＳ、^２Ｆｎ３、^３Ｆｎ３等と表され得る、複数のＩＩＩ型ドメインを含有し得る。^１０Ｆｎ３ドメインは、インテグリン結合モチーフを含有し、さらに、ベータ鎖を接続する３つのループを含有する。これらのループは、ＩｇＧ重鎖の抗原結合ループに対応するものと考えられ得、それらは、関心対象の標的を特異的に結合するフィブロネクチンおよびアドネクチン分子を選択するように、本明細書の以下で述べる方法によって改変することができる。改善されるアドネクチン分子はまた、単純な単量体^１０Ｆｎ３構造ではなく、^１０Ｆｎ３関連分子のポリマーに由来することができる。

【0122】

天然^１０Ｆｎ３ドメインは、典型的にはインテグリンに結合するが、アドネクチン分子になるように適合された^１０Ｆｎ３タンパク質は、関心対象の抗原を結合するよう改変される。したがって、当業者に利用可能な方法を、本発明の方法に適合する^１０Ｆｎ３変異体および突然変異配列を作成する（それにより、ライブラリを形成する）ために使用することができる。例えば、^１０Ｆｎ３の改変は、エラープローンＰＣＲ、部位特異的突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリング、または本明細書で参照されている他の種類の組み換え突然変異誘発を含むがそれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の方法によって行うことができる。一例では、^１０Ｆｎ３配列をコードするＤＮＡの変異体を、インビトロで直接合成することができる。代替として、天然^１０Ｆｎ３配列を、標準的方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７００８２３６５号で行われているような）を使用して、ゲノムから単離またはクローニングし、次いで、当技術分野で知られている突然変異誘発方法を使用して、突然変異させることができる。

【0123】

一実施形態では、標的タンパク質は、カラム樹脂またはマイクロタイタープレートのウェル等の、固体支持体上に固定化されてもよい。次いで、標的は、本明細書で説明される、可能性のある結合タンパク質またはＸディスプレイ複合体のライブラリと接触させられる。ライブラリは、^１０Ｆｎ３配列の突然変異誘発／ランダム化による、または^１０Ｆｎ３ループ領域（ベータ鎖ではない）の突然変異誘発／ランダム化による、野生型^１０Ｆｎ３由来の^１０Ｆｎ３クローンまたはアドネクチン分子を含み得る。選択／突然変異誘発過程は、標的への十分な親和性を有するバインダーが得られるまで、繰り返すことができる。本発明で使用するためのアドネクチン分子は、Ａｄｎｅｘｕｓ社、Ｂｒｉｓｔｏｎ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社で採用されたＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）技術を使用して操作することができる。ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ（商標）技術は、上記で参照される技法に基づいて創成された（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）９４：１２２９７−１２３０２）。改変された^１０Ｆｎ３ドメインのライブラリを生成し、本発明で使用され得る適切なバインダーを選択する方法は、以下の米国特許および特許出願書で完全に説明されており、参照により本明細書に組み込まれる：米国特許第７，１１５，３９６号、第６，８１８，４１８号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３号、第７，１９５，８８０号、第６，４１６，９５０号、第６，２１４，５５３号、第６６２３９２６号、第６，３１２，９２７号、第６，６０２，６８５号、第６，５１８，０１８号、第６，２０７，４４６号、第６，２５８，５５８号、第６，４３６，６６５号、第６，２８１，３４４号、第７，２７０，９５０号、第６，９５１，７２５号、第６，８４６，６５５号、第７，０７８，１９７号、第６，４２９，３００号、第７，１２５，６６９号、第６，５３７，７４９号、第６，６６０，４７３、および米国特許出願第２００７００８２３６５号、第２００５０２５５５４８号、第２００５００３８２２９号、第２００３０１４３６１６号、第２００２０１８２５９７号、第２００２０１７７１５８号、第２００４００８６９８０号、第２００４０２５３６１２号、第２００３００２２２３６号、第２００３００１３１６０号、第２００３００２７１９４号、第２００３００１３１１０号、第２００４０２５９１５５号、第２００２０１８２６８７号、第２００６０２７０６０４号、第２００６０２４６０５９号、第２００３０１００００４号、第２００３０１４３６１６号、および第２００２０１８２５９７号。また、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下の参考文献の方法も参照されたい：Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６８：１０２４−１０４１；Ｓｅｒｇｅｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．５８：１６２２−１６５４；Ｐｅｔｔｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：７−１５；Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．６：１７７−１８７；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５−１１１６。

【0124】

本発明の方法を使用して改善することができるさらなる分子には、限定されないが、ヒトフィブロネクチンモジュール^１ＦｎＳ〜^９ＦｎＳおよび^１１Ｆｎ３〜^１７Ｆｎ３、ならびにヒト以外の動物および原核生物からの関連Ｆｎ３モジュールが含まれる。加えて、テネイシンおよびウンドゥリン等の^１０Ｆｎ３との配列相同性を有する他のタンパク質からのＦｎ３モジュールも、使用され得る。免疫グロブリン様群を有する（しかしＶＨドメインと無関係の配列を有する）他の例示的タンパク質は、Ｎ−カドヘリン、ＩＣＡＭ−２、タイチン、ＧＣＳＦ受容体、サイトカイン受容体、グリコシダーゼ阻害物質、Ｅ−カドヘリン、および抗生物質色素タンパク質を含む。関連する構造を有するさらなるドメインを、ミエリン膜付着分子ＰＯ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２、クラスＩ ＭＨＣ、Ｔ細胞抗原受容体、ＶＣＡＭ−ＩのＣＤ１、Ｃ２、およびＩ−セットドメイン、ミオシン結合タンパク質ＣのＩ−セット免疫グロブリン群、ミオシン結合タンパク質ＨのＩ−セット免疫グロブリン群、テロキン、テリキン、ＮＣＡＭ、トゥイッチン、ニューログリアンのＩ−セット免疫グロブリン群、成長ホルモン受容体、エリスロポエチン受容体、プロラクチン受容体、ＧＣ−ＳＦ受容体、インターフェロン−ガンマ受容体、ベータ−ガラクトシダーゼ／グルクロニダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、およびトランスグルタミナーゼから得ることができる。代替として、本明細書で説明される方法によって改善されてもよい、アドネクチン様結合部分を作成するために、１つ以上の免疫グロブリン様群を含む任意の他のタンパク質が利用されてもよい。そのようなタンパク質は、例えば、プログラムＳＣＯＰを使用して、特定することができる（Ｍｕｒｚｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２４７：５３６（１９９５）；Ｌｏ Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５７（２０００））。

【0125】

他の実施形態では、本発明の方法は、アフィボディ分子を改善するために用いることができる。アフィボディ分子は、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ−結合ドメインのうちの１つに由来する、５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく、新規クラスの親和性タンパク質を表す。この３へリックスバンドルドメインは、組み合わせファージミドライブラリの構築のための骨格として使用されており、そこから、ファージディスプレイ技術を使用して、所望の分子を標的化するアフィボディ変異体を選択することができる（Ｎｏｒｄ Ｋ，Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ Ｅ，Ｒｉｎｇｄａｈｌ Ｊ，Ｓｔａｈｌ Ｓ，Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｎｙｇｒｅｎ ＰＡ，Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ａｎ α−ｈｅｌｉｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９７；１５：７７２−７．Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ，Ｇｒｏｎｌｕｎｄ Ｈ，Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｎｙｇｒｅｎ ＰＡ，Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２；２６９：２６４７−５５）。当技術分野で知られている方法によって産生され得る、同様のライブラリを、本明細書で説明されるＸディスプレイ技術を使用して選択することができる。アフィボディ分子の単純で頑丈な構造は、その低分子量（６ｋＤａ）と相まって、アフィボディ分子を、例えば、検出試薬として（Ｒｏｎｍａｒｋ Ｊ，Ｈａｎｓｓｏｎ Ｍ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００２；２６１：１９９−２１１）、および受容体相互作用を阻害するための（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ Ｋ，Ｘｕ Ｚ，Ｆｏｒｓｂｅｒｇ Ｇ，Ｎｙｇｒｅｎ ＰＡ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ２８−ＣＤ８０ ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｂｙ ａ ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｆｆｉｂｏｄｙ ｌｉｇａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００３；１６：６９１−７）、多種多様な用途に好適なものとする。アフィボディおよびその産生方法のさらなる詳細は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８３１，０１２号を参照することによって得ることができる。

【0126】

他の実施形態では、本発明の方法は、ＤＡＲＰｉｎを改善するために用いることができる。ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能力を利用するために開発された、抗体模倣ＤＲＰ（設計された反復タンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンが豊富な反復タンパク質等の反復タンパク質は、抗体と違って、細胞内または細胞外で発生する、遍在する結合分子である。それらの独自のモジュール構造は、可変およびモジュール式の標的結合表面をディスプレイする、細長い反復ドメインを形成するように積み重なる、反復構造単位（反復）を特色とする。このモジュール性に基づいて、極めて多様な結合特異性を有するポリペプチドの組み合わせライブラリを生成することができる。この戦略は、可変表面残基をディスプレイする自己適合性反復部分のコンセンサス設計、および反復ドメインへのランダムアセンブリを含む。

【0127】

ＤＡＲＰｉｎは、細菌発現系において、非常に高い収量で産生することができ、それらは、知られている最も安定したタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルス、および膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対する、極めて特異的な高親和性ＤＡＲＰｉｎが選択されている。１桁のナノモルからピコモル範囲の親和性を有するＤＡＲＰｉｎを得ることができる。

【0128】

ＤＡＲＰｉｎは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ塗布、親和性精製、またはウェスタンブロット法を含む、広範囲の用途で使用されている。ＤＡＲＰｉｎはまた、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質として、細胞内区画の中で極めて活性であることも証明されている。ＤＡＲＰｉｎはさらに、ｐＭ範囲のＩＣ５０でウイルス侵入を阻害するために使用された。ＤＡＲＰｉｎは、タンパク質−タンパク質相互作用を阻止するためだけでなく、酵素を阻害するために理想的である。プロテアーゼ、キナーゼ、および輸送体の阻害が成功しており、最も頻繁にはアロステリック阻害様式である。腫瘍上での非常に高速かつ特異的な濃縮、および非常に有利な腫瘍対血液の比により、ＤＡＲＰｉｎはインビボ診断および治療アプローチによく適している。

【0129】

ＤＡＲＰｉｎおよび他のＤＲＰ技術に関する追加情報は、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００４／０１３２０２８号および国際特許出願公報第ＷＯ０２／２０５６５号で見出すことができる。

【0130】

他の実施形態では、本発明の方法は、アンチカリンを改善するために用いることができる。アンチカリンは、付加的な抗体模倣技術であるが、この場合、結合特性は、ヒト組織および体液において自然かつ豊富に発現される低分子量タンパク質である、リポカリンに由来する。リポカリンは、化学的に感受性または不溶性の化合物の物理的輸送および保管と関連する、一連のインビボ機能を果たすように進化させられている。リポカリンは、タンパク質の１つの末端において４つのループを支持する、極めて保存されているβ−バレルを含む、頑丈な固有構造を有する。これらのループは、結合ポケットへの入口を形成し、この部分での分子の立体構造の違いが、個々のリポカリン間の結合特異性の差異を説明する。

【0131】

保存的β−シート骨格によって支持される超可変ループの全体構造は、免疫グロブリンに類似している一方で、リポカリンは、サイズに関して抗体とは有意に異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい、１６０〜１８０個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖から成る。

【0132】

リポカリンは、クローニングされ、それらのループは、アンチカリンを作成するために操作を受ける。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンディスプレイは、結合機能の選択およびスクリーニングを可能にし、その後に、原核細胞または真核細胞系におけるさらなる分析のために、可溶性タンパク質の発現および産生が続く。そのようなアンチカリンライブラリを、本発明のＸディスプレイ技術に従って用いることができる。単離することができる、事実上あらゆるヒト標的タンパク質に特異的であるアンチカリンを開発することができ、ナノモルまたはより高い範囲の結合親和性を得ることができることが、研究によって成功裏に実証されている。

【0133】

アンチカリンはまた、二重標的化タンパク質、いわゆるデュオカリン（Ｄｕｏｃａｌｉｎ）として形式化することもできる。デュオカリンは、２つの結合ドメインの構造的配向にかかわらず、標的と特異性および親和性を保持しながら、標準的な製造過程を使用して、１つの容易に産生された単量体タンパク質の中の２つの別個の治療標的に結合する。本発明の方法によって選択されるアンチカリンは、デュオカリン分子に組み立てることができる。

【0134】

単一の分子を通した複数の標的の調節は、１つより多くの原因因子が関与することが知られている疾患において、特に有利である。また、デュオカリン等の二価または多価結合形式は、疾患における細胞表面分子を標的化すること、シグナル伝達経路に対するアゴニスト効果を仲介すること、または細胞表面受容体の結合およびクラスタ化を介して強化した内部化効果を誘発することにおいて、有意な潜在能力を有する。さらに、デュオカリンの高い固有安定性は、単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンの融通性のある処方および送達の可能性を提供する。アンチカリンに関する追加情報は、いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２５０，２９７号および国際特許出願公報第ＷＯ９９／１６８７３号で見出すことができる。

【0135】

他の実施形態では、本発明の方法は、アビマーを改善するために用いることができる。本発明の文脈で有用な別の抗体模倣技術は、アビマーである。アビマーは、インビトロエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって、結合および阻害特性を有する多ドメインタンパク質を生成して、ヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化させられる。複数の独立した結合ドメインを結合することは、親和力を生じることが示されており、従来の単一エピトープ結合タンパク質と比較して、改善した親和性および特異性をもたらす。他の潜在的利点は、大腸菌中での多標的特異性分子の単純かつ効率的な産生、改善した耐熱性、およびプロテアーゼへの耐性を含む。ナノモル以下の親和性を有するアビマーが、種々の標的に対して得られており、これらは、本明細書で説明される方法によって、さらに改善され得る。

【0136】

アビマーに関する追加情報は、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００６／０２８６６０３号、第２００６／０２３４２９９号、第２００６／０２２３１１４号、第２００６／０１７７８３１号、第２００６／０００８８４４号、第２００５／０２２１３８４号、第２００５／０１６４３０１号、第２００５／００８９９３２号、第２００５／００５３９７３号、第２００５／００４８５１２号、第２００４／０１７５７５６号で見出すことができる。

【0137】

他の実施形態では、本発明の方法は、バーサボディを改善するために用いることができる。バーサボディは、本発明の文脈で使用することができる、別の抗体模倣技術である。バーサボディは、高ジスルフィド密度の骨格を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアに取って代わる、１５％超のシステインを有する３〜５ｋＤａの低分子タンパク質である。疎水性コアを含む、多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドによる置換は、より小さいタンパク質、より疎水性（少ない凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対するさらなる耐性をもたらし、最もＭＨＣ表現に貢献する残基が疎水性であるため、より低い密度のＴ細胞エピトープを有する。これらの４つの特性の全ては、免疫原性に影響を及ぼすことが周知であり、それらはともに、免疫原性の大きな減少を引き起こすことが期待される。

【0138】

バーサボディへの着想は、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネによって産生される天然の注射用生物薬剤に由来する。選択された天然タンパク質ファミリーから開始して、設計によって、かつサイズをスクリーニングすることによって、疎水性、タンパク質分解抗原処理、およびエピトープ密度は、天然の注射用タンパク質の平均をはるかに下回るレベルまで最小化される。

【0139】

バーサボディの構造を考慮すると、これらの抗体模倣物は、多価性、多特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュール、および抗体Ｆｃ領域の欠如を含む、多用途形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量にて大腸菌で製造することができ、それらの親水性および小さいサイズにより、バーサボディは、極めて可溶性であり、高濃度に処方することができる。バーサボディは、きわめて熱安定性であり（沸騰させることができる）、長期の保管期間を提供する。本明細書で説明されるバインダーのあらゆる性質（例えば、熱安定性、塩安定性、保管期間、免疫原性、標的親和性等）は、本明細書で説明されるディスプレイおよび選択方法（Ｘディスプレイ方法）によって改善することができる。

【0140】

バーサボディに関する追加情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００７／０１９１２７２号で見出すことができる。

【0141】

他の実施形態では、本発明の方法は、ＳＭＩＰ（商標）分子を改善するために用いることができる。ＳＭＩＰ（商標）（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ−Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、標的結合、エフェクター機能、インビボ半減期、および発現レベルを維持および最適化するように操作されている。ＳＭＩＰは、３つの異なるモジュールドメインから成る。第１に、それらは、特異性を与える任意のタンパク質（例えば、細胞表面受容体、一本鎖抗体、可溶性タンパク質等）から成り得る結合ドメインを含有する。第２に、それらは、結合ドメインとエフェクタードメインとの間の融通性のあるリンカーとしての機能を果たし、また、ＳＭＩＰ薬剤の多量体化の制御にも役立つヒンジドメインを含有する。最後に、ＳＭＩＰは、Ｆｃドメインまたは他の特別に設計されたタンパク質を含む、種々の分子に由来し得るエフェクタードメインを含有する。種々の異なる結合ドメイン、ヒンジドメイン、およびエフェクタードメインを有するＳＭＩＰの単純な構築を可能にする、設計のモジュール性は、迅速かつカスタマイズ可能な薬剤設計を提供する。ＳＭＩＰ（商標）分子の結合ドメインはまた、本明細書で説明される方法（例えば、Ｘディスプレイ方法）に従ったディスプレイおよび選択に好適なライブラリの基礎としての役割を果たし得る。

【0142】

ＳＭＩＰを設計する方法の例を含む、ＳＭＩＰについてのさらなる情報は、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ １１０：２５６９−７７、および以下の米国特許出願第２００５０２３８６４６号、第２００５０２０２５３４号、第２００５０２０２０２８号、第２００５０２０２０２３号、第２００５０２０２０１２号、第２００５０１８６２１６号、第２００５０１８０９７０号、および第２００５０１７５６１４号で見出され得る。

【0143】

上で提供される抗体断片および抗体模倣技術は、本明細書の文脈で使用することができる全ての技術を網羅することを目的としない。例えば、および、限定としてではなく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５（８）９２１−９２９（２００７）で概説されているように、相補的結合領域の融合等の代替ポリペプチド系技術を含む、種々の付加的な技術を、本発明の文脈で使用することができる。

【0144】

本明細書で説明されるＸディスプレイ複合体（例えば、核酸−タンパク質融合体またはＤＮＡ−タンパク質融合体）は、ＲＮＡ−タンパク質融合体について以前に説明または構想された任意の用途に使用することができる。商業的利用は、インビトロでの進化の技法を通した、所望の特性を有するポリペプチドの単離（例えば、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，米国特許第０９／００７，００５号および米国特許第０９／２４７，１９０号、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，ＷＯ９８／３１７００；Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）ｖｏｌ．９４，ｐ．１２２９７−１２３０２）を参照）、細胞ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリのスクリーニング（例えば、１９９８年８月１７日出願、Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ，米国特許第６０／０９６，８１８号を参照）、およびタンパク質−タンパク質相互作用に基づく新規遺伝子のクローニング（Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，米国特許第０９／００７，００５号および米国特許第０９，２４７，１９０号、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／３１７００）、ならびにタンパク質ディスプレイ実験におけるこれらの融合体の使用（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第６０／０８０，６８６号および米国特許第０９／２８２，７３４号）を含む。本発明のＸディスプレイ複合体（例えば、ＤＮＡ−タンパク質融合体）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４１６，９５０号、第６，４２９，３００号、第６，１９４，５５０号、第６，２０７，４４６号、および第６，２１４，５５３号で開示されているもの等の、前述のディスプレイ技術について以前に説明または構想された任意の用途に使用することができる。これらのＸディスプレイ複合体（例えば、ＤＮＡ−タンパク質融合体）は、特に、製薬および農業分野において、任意の適切な治療、診断、または研究目的で使用され得る。

【0145】

新規触媒の単離
本発明はまた、新規触媒タンパク質を選択するために使用することができる。インビトロ選択および進化が、新規の触媒ＲＮＡおよびＤＮＡの単離のために以前に使用されており、本発明では、新規タンパク質酵素（例証のために提供されるにすぎない非限定的例は、多糖類をより有用な生物燃料に変換するため等、入力ポリマーのより小さく、かつ即座に有用な副産物への代謝を実行するために好適な酵素）の単離のために使用される。このアプローチの１つの特定の例では、触媒の遷移状態の化学類似体への結合に関して選択することによって、触媒を間接的に単離することができる。別の特定の例では、基質との共有結合形成に関して選択することによって（例えば、親和性タグに結合された基質を使用して）、または開裂によって（例えば、特異的結合を切断し、それにより、固体支持体からライブラリの触媒構成要素を解放する能力に関して選択することによって）、直接的な単離が実行され得る。

【0146】

新規触媒の単離のためのこのアプローチは、触媒抗体技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｎｇ．Ｎｅｗｓ ６８：２６（１９９０）で論評されている）と比べて、少なくとも２つの重要な利点を有する。第１に、触媒抗体技術では、初期プールは概して、免疫グロブリン群に限定される。対照的に、Ｘディスプレイ複合体（ＤＮＡ−タンパク質融合体）の開始ライブラリは、完全にランダムであってもよく、または、制限するものではないが、既知の酵素構造またはタンパク質骨格の変異体から成ってもよい。加えて、触媒抗体の単離は概して、遷移状態反応類似体への結合に関しての初期選択に依存し、その後に活性抗体の困難なスクリーニングが続く。ここでも対照的に、ＲＮＡライブラリを使用して以前に実証されたように、Ｘディスプレイライブラリアプローチを使用して、触媒作用のための直接選択が可能である。タンパク質酵素を単離するための代替アプローチでは、遷移状態類似体および直接選択アプローチを組み合わせることができる。

【0147】

この方法によって得られる酵素は、極めて価値がある。例えば、現在、改善した化学過程が開発されることを可能にする、新規かつ効果的な工業触媒の差し迫った必要性が存在する。本発明の主な利点は、任意の条件で選択を実行することができ、例えば、インビボの条件に限定されないことである。したがって、本発明は、所定の環境、例えば、上昇した温度、圧力、または溶媒濃度の環境の中で機能しながら、極めて特異的な変換を実行することができる（それにより、望ましくない副産物の形成を最小化する）、新規の酵素または既存の酵素の改善変異体の単離を促進する。

【0148】

インビトロ相互作用トラップ
Ｘディスプレイ技術はまた、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし、タンパク質−タンパク質相互作用に基づいて新規遺伝子をクローニングするためにも有用である。この方法によって、ｃＤＮＡライブラリが所望の供給源から生成される（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらの方法によって、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９４；特に第５章を参照）。候補ｃＤＮＡのそれぞれは、本明細書で説明される技法を使用してＸディスプレイ複合体（例えば、ＤＮＡ−タンパク質融合体）に処方され得、次いで、これらの複合体（または融合体の改善版）が特定の分子と相互作用する能力が検査される。

【0149】

相互作用工程がインビトロで行われるという事実は、非特異的競合物、温度、およびイオン条件を使用した、反応厳密性の慎重な制御を可能にする。非加水分解性類似体を用いた正常小分子の改変（例えば、ＡＴＰ対ＡＴＰｇＳ）は、同じ分子の異なる立体異性体を区別する選択を提供する。このアプローチは、選択された結合パートナーの核酸配列が関連付けられ、したがって、容易に単離されてもよいため、多くのタンパク質のクローニングおよび機能的特定の両方に有用である。加えて、該技法は、任意のヒト遺伝子の機能および相互作用を特定するために有用である。

【0150】

本方法はまた、改善した半減期、親和性、または溶解性のためにポリペプチドリガンドを開発または改善するために使用することもできる。本明細書で説明されるＸディスプレイ複合体（例えば、ＤＮＡ−タンパク質融合体）は、分子進化および認識アプローチを含む、所望のタンパク質に対する任意の選択方法で使用することができる。例示的な選択方法は、例えば、参照により本明細書に全て組み込まれる、Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，米国特許第０９／００７，００５号および米国特許第０９／２４７，１９０号；Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，ＷＯ９８／３１７００；Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９７）ｖｏｌ．９４，ｐ．１２２９７−１２３０２；Ｌｉｐｏｖｓｅｋ ｅｔ ａｌ，米国特許第６０／０９６，８１８号および米国特許第０９／３７４，９６２号；およびＫｕｉｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第６０／０８０，６８６号および米国特許第０９／２８２，７３４号で説明されている。

【0151】

ライブラリ生成、スクリーニング、および親和性成熟
いくつかの実施形態では、所望の質（例えば、特定の抗原への結合）を有する、または本発明の方法に従って改善または修飾されているペプチドを特定するように、ペプチドまたは遺伝子ライブラリをスクリーニングすることができる。関連する実施形態では、本明細書で説明される方法によって産生または選択された特定のペプチドは、親和性成熟または突然変異誘発によってさらに改変され得、それにより、関連ペプチドまたは核酸のライブラリを産生することができる。したがって、本発明の一態様は、抗原に結合する能力、より高い結合親和性等の望ましい質を有する、可能性のあるペプチド（または該ペプチドをコードする核酸）を特定するために、大きなライブラリをスクリーニングすることに関与し得る。当技術分野で知られている、または本明細書で説明される、ライブラリ生成および標的選択のための任意の方法を、本発明に従って使用することができる。

【0152】

（例えば、適切なタグ、相補的配列等を追加するための）本明細書で説明される方法による、当技術分野で知られているライブラリ生成の方法は、本明細書で説明される方法で使用するために好適なライブラリを作成するために用いることができる。ライブラリ生成のためのいくつかの方法が、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第０９／００７，００５号および第０９／２４７，１９０号；Ｓｚｏｓｔａｋ ｅｔ ａｌ，ＷＯ９８９／３１７００；Ｒｏｂｅｒｔｓ＆Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）９４：１２２９７−１２３０２；米国特許第６０／１１０，５４９号、米国特許第０９／４５９，１９０号、およびＷＯ００／３２８２３で説明されている。

【0153】

一実施形態では、ライブラリは、ＶＨドメイン、好ましくは、ヒトＶＨドメインを含む。任意の細胞が、ライブラリの供給源として使用されてもよい。いくつかの好ましい実施形態では、ライブラリ用の細胞の供給源は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脾臓細胞、または骨髄細胞であってもよい（例えば、ある種類のドナー細胞からのライブラリにおいて得ることができる、ＶＨライブラリ多様性を説明する、図３６を参照）。

【0154】

本発明の方法は反復様式で用いられ得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、本明細書で説明される方法のうちの１つによって選択された核酸またはタンパク質は、そこから過程を再び始めることができる、新規のライブラリの生成の基礎としての役割を果たし得る。そのようなスキームの例が図２２に図示され、そこでは、１回の選択の生成物が、新規のライブラリを再生成するために使用される。

【0155】

本明細書で説明されるＸディスプレイの方法は、選択の間、分子内ジスルフィド結合がペプチドに存在するような条件下で実行することができる。他の実施形態では、所望であれば、ジスルフィド結合の形成が妨げられてもよい。開始ライブラリは、例えば、直接ＤＮＡ合成によって、インビトロまたはインビボ突然変異誘発を介して、得ることができ、または、当技術分野で知られている任意の利用可能な開始ライブラリを使用することができる。例えば、本明細書で引用される参考文献、および、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下の参考文献で説明される、ライブラリおよび該ライブラリを作製する方法を、本発明にしたがって使用することができる：米国特許第５，９２２，５４５号、第７，０７４，５５７号。

【0156】

好ましい実施形態では、ライブラリは、ＶＨまたはＶＬライブラリである。表２は、ＶＨドメインを増幅するために使用されてもよい、一式の非限定的なプライマーの例を提供する。

【0157】

（表２）ＶＨドメインＸディスプレイライブラリ生成のための例示的プライマー。Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ

【0158】

好ましい実施形態では、ライブラリの核酸構築物は、Ｔ７プロモーターを含有する。ライブラリの中の核酸は、核酸、その翻訳生成物、またはＸディスプレイ複合体の産生、選択、または生成に有用である、適切なプロモーター、エンハンサー、スペーサー、またはタグを追加するように、当業者に知られている任意の手段によって操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ライブラリの中の配列は、ＴＭＶエンハンサー、ＦＬＡＧタグをコードする配列、ＳＡディスプレイ配列、またはポリアデニル化配列あるいはシグナルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリ配列はさらに、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列のソースを特定するように、固有のソースタグを含んでもよい。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリ配列は、プールタグを含んでもよい。プールタグは、特定の１回の選択中に選択される配列を特定するために使用することができる。これは、例えば、複数回の選択からの配列が、どの回の選択に由来したかということを見失うことなく、単回でプールされて配列決定されることを可能にする。

【0159】

次いで、２本鎖ＤＮＡライブラリがインビトロで転写され、本明細書で説明されるように、ペプチド受容体に会合させられる。１つの好ましい実施形態では、次いで、ＮＡリンカーまたは高親和性リガンドに付着したＮＡリンカー（例えば、ビオチン化ＮＡリンカー）が、アニールされる（例えば、ＤＤＢ−１）。いくつかの実施形態では、ＮＡリンカーは、ｍＲＮＡに光架橋結合される。特定の実施形態では、次いで、リガンド受容体、例えば、ストレプトアビジンが負荷される。さらなる実施形態では、ペプチド受容体に付着される第２の高親和性リガンドが、ストレプトアビジンに結合される。いくつかの実施形態では、第２の高親和性リガンド／ペプチド受容体は、ビオチン-ピューロマイシンリンカー、例えば、ＢＰＰである。

【0160】

次いで、インビトロ翻訳が実行されてもよく、ここではペプチド受容体は、新生翻訳生成物と反応する。

【0161】

精製後の結果は、ペプチド−核酸Ｘディスプレイ複合体のライブラリである。次いで、そのようなＸディスプレイ複合体は、好ましい実施形態では、精製された後に逆転写を受けてもよい。Ｘディスプレイ複合体は、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、親和性クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、密度勾配遠心分離、親和性タグ捕捉等によって、精製することができる。好ましい実施形態では、オリゴ−ｄＴセルロース精製が用いられ、そこでは、Ｘディスプレイ複合体は、ポリ−Ａ末端を有するｍＲＮＡを含むように設計されている。そのような実施形態では、オリゴ−ｄＴは、カラムまたは精製機器の中でセルロースに共有結合される。オリゴ−ｄＴは、Ｘディスプレイ複合体内のｍＲＮＡのポリ−Ａ末端との相補的塩基対合に関与し、それにより、精製機器を通したその進行を妨げる。Ｘディスプレイ複合体は、後に水または緩衝剤とともに溶出されてもよい。

【0162】

逆転写は、ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを生成し、それは、好ましい実施形態では、ＮＡリンカー、高親和性リガンド、リガンド受容体、ペプチド受容体（おそらく第２の高親和性リガンドに結合される）、またはそれらの機能的な組み合わせとの会合を介して転写ペプチドに非共有結合される。

【0163】

次いで、結果として生じる、精製されたＸディスプレイ複合体は、残存ｍＲＮＡを分解するようにＲＮＡｓｅで処理することができ、その後に、完全ｃＤＮＡを生成するための第２鎖ＤＮＡ合成が続く。好ましい実施形態では、ＮＡリンカーの中の核酸が逆転写のためのプライマーとしての機能を果たし得ることに留意されたい。したがって、ｃＤＮＡは、高親和性リガンドおよびＸディスプレイ複合体の一部に付着したままである。

【0164】

Ｘディスプレイ複合体は、意図されるように、Ｘディスプレイ複合体がタグを含有するように操作される場合、さらに精製されてもよい。当技術分野で知られている任意のタグを、Ｘディスプレイ複合体を精製するために使用することができる。例えば、とりわけ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）、またはＨＡタグを使用することが可能である。好ましい実施形態では、最終転写タンパク質がＦＬＡＧタグを含有するように、ＦＬＡＧタグをコードする配列が、元のＤＮＡ配列へと遺伝子操作される。

【0165】

次いで、結果として生じるＸディスプレイ複合体は、当技術分野で知られている任意の選択方法を使用することによって選択される。好ましい実施形態では、親和性選択が使用される。例えば、所望の結合標的または抗原は、親和性カラムで使用するために固体支持体上で固定化され得る。親和性クロマトグラフィにおいて有用な方法の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４３１，５４６号、第４，４３１，５４４号、第４，３８５，９９１号、第４，２１３，８６０号、第４，１７５，１８２号、第３，９８３，００１号、第５，０４３，０６２号で説明されている。結合活性は、標準的な免疫学的検定および／または親和性クロマトグラフィによって評価することができる。触媒機能、例えば、タンパク質分解機能についてのＸディスプレイ複合体のスクリーニングは、例えば、米国特許第５，７９８，２０８号で説明されているような標準的なヘモグロビンプラーク検定を使用して達成することができる。候補ペプチド（例えば、抗体、一本鎖抗体）の治療標的に結合する能力を判定することは、例えば、所与の標的または抗原への抗体の結合率を測定するＢｉａｃｏｒｅ機器を使用して、インビトロで分析することができる。

【0166】

好ましい実施形態では、選択されたＸディスプレイ複合体は、ＤＮＡ成分の配列決定によって特定することができる。例えば、４５４配列決定法、サンガー配列決定法、合成による配列決定法、または、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５５４７８３５号、第５１７１５３４号、第５６２２８２４号、第５６７４７４３号、第４８１１２１８号、第５８４６７２７号、第５０７５２１６号、第５４０５７４６号、第５８５８６７１号、第５３７４５２７号、第５４０９８１１号、第５７０７８０４号、第５８２１０５８号、第６０８７０９５号、第５８７６９３４号、第６２５８５３３号、第５１４９６２５号で説明されている方法といった、当技術分野で知られている任意の配列決定技術を使用することができる。

【0167】

いくつかの実施形態では、選択は、より高い親和性のバインダーを特定するように複数回行われてもよく、さらに、競合バインダーまたはより厳密な洗浄条件とともに実施してもよい。当業者であれば、本明細書で説明される手順の変形を用いてもよいことを理解するであろう。

【0168】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、図１４で描写されるように実行される。

【0169】

他の好ましい実施形態では、Ｘディスプレイ複合体は、図１３または図１６で描写されるように設計される。

【0170】

本発明のペプチドまたはそれらの模倣物を含有する医薬組成物
別の態様では、本発明は、組成物、例えば、薬学的に容認可能な担体とともに処方される、本発明の方法によって生成される１つのペプチドまたはペプチドの組み合わせ（例えば、２つ以上の異なるペプチド）を含有する、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はまた、併用療法において投与し、すなわち、他の薬剤と組み合わせることができる。例えば、併用療法は、特定の疾患または適応症を治療するために有用な他の適切な医薬品と組み合わせた、本発明のペプチドまたはその模倣物を含むことができる。

【0171】

本明細書で使用される、「薬学的に容認可能な担体」は、生理学的に適合する、任意の溶媒、分散媒体、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄および表皮投与（例えば、注射または注入による）に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、本発明のペプチドまたはその模倣物は、化合物を非活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護する材料で被覆してもよい。

【0172】

本発明の医薬化合物は、１つ以上の薬学的に容認可能な塩を含んでもよい。「薬学的に容認可能な塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いずれの望ましくない毒性効果も付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのような塩の例は、酸添加塩および塩基添加塩を含む。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の非毒性無機酸に由来するもの、ならびに、脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等物等の非毒性有機酸を含む。塩基添加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属に由来するもの、ならびに、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性有機アミンに由来するものを含む。

【0173】

特定の実施形態では、本発明の方法によって選択されるペプチドまたはそれらの模倣物は、生理学的等張塩条件を達成するように、塩化ナトリウムとともに水中で溶解してもよい。

【0174】

本発明の医薬組成物で用いることのできる、好適な水性または非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射用有機エステルを含む。適正な流動性は、例えば、レシチン等の被覆材料の使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。

【0175】

これらの組成物はまた、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントを含有してもよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順と、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の包含との両方によって、確保することができる。また、糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物の中に含むことが望ましい場合がある。さらに、注射用医薬形態の持続的吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の、吸収を遅延する作用物質を含むことによって引き起こすことができる。

【0176】

薬学的に容認可能な担体は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。薬学的活性物質用のそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で知られている。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と非混合性である場合を除いて、本発明の医薬組成物でのその使用が意図される。補助的な活性化合物も、組成物に組み込むことができる。

【0177】

錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬、および顆粒といった固体製剤を、腸溶被覆および製材処方技術分野で周知である他の被覆等の、被覆および外殻を用いて調製することができる。それらは、随意で、乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある部分の中で、随意で遅延して、活性成分のみを放出するかまたは優先的に活性成分を放出する組成物となり得る。使用することができる包理組成物は、ポリマー物質および蝋を含む。ペプチドはまた、適切であれば、１つ以上の賦形剤を有するマイクロカプセル化形態となり得る。

【0178】

治療用組成物は、典型的には、製造および保管条件下で無菌かつ安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬剤濃度に好適な他の秩序構造として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体となり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被覆の使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール等の多価アルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましくなる。例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチン等の、吸収を遅延する作用物質を組成物に含むことによって、注射用組成物の持続的吸収を引き起こすことができる。

【0179】

溶液として処方される組成物は、例えば、適切な量の塩を含有するように溶液を調製することによって、点眼器による目への投与のために好適にされてもよい。

【0180】

本発明の方法によって選択される、ペプチドまたはその模倣物を含有するリポソームは、その全体で参照により内容が本明細書に組み込まれる、Ｅｐｓｔｅｉら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５））、Ｈｗａｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０３０−４０３４（１９８０））、ＥＰ５２，３２２、ＥＰ３６，６７６、ＥＰ８８，０４６、ＥＰ１４３，９４９、ＥＰ１４２，６４１、日本特許出願８３−１１８００８、およびＥＰ１０２，３２４、ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号によって説明されているもの等の周知の方法のうちのいずれかに従って調製することができる。リポソームは、脂質含有量が約１０モルパーセントコレステロール超、好ましくは、１０〜４０モルパーセントコレステロールの範囲であり、最適なペプチド療法のために調整されている選択された割合である、小さな（約２００〜８００オングストローム）単層型であってもよい。しかしながら、本開示を読むと当業者によって理解されるように、リポソーム以外のリン脂質小胞も使用することができる。

【0181】

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上で列挙される１つの成分または成分の組み合わせとともに、必要量の適切な溶媒に活性化合物を組み込むことによって調製することができ、その後に滅菌精密濾過が続く。概して、分散液は、塩基性分散媒体と、上で列挙されるものからの他の必要な成分とを含有する賦形剤に、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、その以前に滅菌濾過された溶液からの任意の所望の成分に加えて、活性成分の粉末を生じる、真空乾燥および冷凍乾燥（凍結乾燥）である。

【0182】

単一剤形を産生するように担体材料と組み合わせることができる、活性成分の量は、治療されている対象、および特定の投与様式に応じて変化する。単一剤形を産生するように担体材料と組み合わせることができる、活性成分の量は、概して、治療効果を生じる組成物の量となる。概して、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に容認可能な担体と組み合わせた、約０．０１パーセントから約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントの活性成分の範囲である。

【0183】

投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラス投与されてもよく、いくつかの分割投与量が経時的に投与されてもよく、または、治療状況の緊急要件によって示されるように、投与量を比例的に低減または増加させてもよい。投与の容易性および投与量の均一性のために、投与単位で非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与形態単位は、治療される対象に対する単一投与量として適した、物理的に不連続な単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるように計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個人の感受性の治療のためにそのような化合物を構成する技術分野に固有の制限によって決定付けられ、かつそれらに直接依存する。

【0184】

本発明のペプチドまたはその模倣物の投与のために、投与量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は宿主体重の１ｋｇにつき０．０１〜５ｍｇの範囲である。例えば、投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内となり得る。例示的な治療計画は、週１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、月に１回、３ヶ月毎に１回、または３〜６ヶ月毎に１回の投与を伴う。本発明の構成成分に対する好ましい投与計画は、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、以下の投薬スケジュールのうちの１つを使用して抗体が与えられる：（ｉ）６回投与量について４週間毎、次いで３ヶ月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後に、３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ体重。

【0185】

代替として、本発明の方法によって選択されるペプチドまたはその模倣物は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、頻度のより低い投与が要求されることとなる。投与量および頻度は、患者における投与物質の半減期に応じて変化する。投与量および投与の頻度は、処置が予防であるか治療であるかに応じて変化し得る。予防用途では、比較的低頻度の間隔で長期間にわたって、比較的低い投与量が投与される。一部の患者は、治療を一生受け続ける。治療用途では、疾患の進行が低減または終結されるまで、好ましくは、患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が必要とされることがある。その後、患者に予防投薬計画を投与することができる。

【0186】

本発明の組成物の中の活性成分および小分子の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性となることなく、かつ特定の患者に対する所望の治療反応、組成物、および投与様式を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように、変化させることができる。選択された投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、またはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、および／または物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および既往歴、および医療技術分野で周知である他の同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存する。

【0187】

本発明の方法によって選択されるペプチドまたはその模倣物の「治療的有効投与量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の減少、疾患の症状がない期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛による障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療のために、「治療的有効投与量」は、好ましくは、未治療の対象に対して、少なくとも約１０％または２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、なおもさらに好ましくは少なくとも約８０％、細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルシステムにおいて評価することができる。代替として、組成物のこの特性は、化合物の阻害能力を調べることによって評価することができ、そのようなインビトロ阻害は、熟練の従事者に知られている分析によって評価することができる。治療用化合物の治療的有効投与量は、腫瘍のサイズを減少させることができ、あるいは対象における症状を改善することができる。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択された特定の化合物または投与経路等の因子に基づいて、そのような量を判定できるであろう。

【0188】

本発明の組成物は、当技術分野で知られている種々の方法のうちの１つ以上を使用して、１つ以上の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の結合部分のための好ましい投与経路は、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路を含む。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、腸内および局所投与以外の、通常は注射による、投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入を含む。

【0189】

代替として、本発明のペプチドまたはその模倣物は、局所、表皮、または粘膜投与経路等の非経口経路を介して、例えば、鼻腔内、経口、経膣、経直腸に、舌下、または局所投与することができる。

【0190】

活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤等の、急速放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の、生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法が、特許を有し、または当業者に概して知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。

【0191】

治療用化合物は、当技術分野で知られている医療機器を用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の治療用化合物は、米国特許第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号、または第４，５９６，５５６号で開示されている機器等の、無針皮下注射器を用いて投与することができる。本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬物を分注するための埋込型マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬剤を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続薬剤送達のための可変流量埋込型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多重チャンバ区画を有する浸透圧薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透圧薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号を含む。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが当技術分野で知られている。

【0192】

本発明はさらに、以下の実施例において例証されるが、それらは限定的と解釈されるべきではない。

【0193】

例示
実施例の全体を通して、特に記述がない限り、以下の材料および方法を使用した。

【0194】

材料および方法
一般に、本発明の実践は、特に示されない限り、当技術分野の範囲内であり、かつ文献で説明されている、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）、発現系（例えば、無細胞発現、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびＰｒｏｆｕｓｉｏｎ）、および任意の必要な細胞培養の従来の技法を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＶｏＩｓ．１ ａｎｄ ２，（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＭＪ． Ｇａｉｔ，Ｅｄ．１９８４）；ＰＣＲ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９９）（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｏｘｆｏｒｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎｅｉｄｌｅ， Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；ＰＣＲ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｂｕｒｋｅ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ Ｌｔｄ （１９９６）；Ｉｋｅ ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：ＲＴ−ＰＣＲ，Ｓｉｅｂｅｒｔ，Ｅｄ．，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９９８）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，ＩｒＩ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）；Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ，Ａ．，Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｐｕｂ．，（１９９０）を参照されたい。

【0195】

本発明の組成物および方法は、いくつかの実施形態では、任意の他の当技術分野で認識されているインビトロディスプレイシステム、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１９５，８８０号、第６，９５１，７２５号、第７，０７８，１９７号、第７，０２２，４７９号、第６，５１８，０１８号、第７，１２５，６６９号、第６，８４６，６５５号、第６，２８１，３４４号、第６，２０７，４４６号、第６，２１４，５５３号、第６，２５８，５５８号、第６，２６１，８０４号、第６，４２９，３００号、第６，４８９，１１６号、第６，４３６，６６５号、第６，５３７，７４９号、第６，６０２，６８５号、第６，６２３，９２６号、第６，４１６，９５０号、第６，６６０，４７３号、第６，３１２，９２７号、第５，９２２，５４５号、第６，１９４，５５０号、第６，２０７，４４６号、第６，２１４，５５３号、および第６，３４８，３１５号で説明されているものと併せて使用することができる。

【実施例】

【0196】

本開示はさらに、以下の実施例によって例証されるが、それらは、さらに限定的と解釈されるべきではない。

【0197】

実施例１
ナイーブ抗体ライブラリの設計および構築
細胞の供給源
ライブラリの多様性を確保するように、合計６２４名の異なる健康な個人の全骨髄（１０名のドナー）、脾臓細胞（１３名のドナー）、および末梢単核球（６０１名のドナー）から、ｍＲＮＡを取得した。ＶＨライブラリの計算された多様性は１０^９〜１０^１０であり、ＶＬライブラリは１０^６〜１０^７である。

【0198】

ライブラリ構築
ＶＨおよびＶＬライブラリ構築にＲＴ−ＰＣＲを使用した。

【0199】

ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡのＨ鎖定常領域（Ｃμ１、Ｃγ１、およびＣα１）、カッパおよびラムダのＬ鎖定常領域（Ｃκ１およびＣλ１）からの特異的プライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。

【0200】

可変Ｈ鎖ライブラリ構築のために、複数のセンスプライマー（縮重プライマー）を、上流ＵＴＲ配列（ＶＨ１−７ＵＴＲ）を有するＶＨ１−７ファミリーの構成要素のＦＲ１領域から設計した。ＶＨに対するアンチセンスプライマーを、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーにネスト化した定常領域（Ｃμ２、Ｃγ２、およびＣα２）から設計した。可変軽鎖ライブラリ構築のために、複数のセンスプライマーを、一本鎖Ｆｖシャッフリングを可能にするように、リンカー配列の上流の１２個のアミノ酸を有する各ファミリーのＶκおよびＶλＦＲ１領域から設計した。κおよびλ遺伝子増幅のためのアンチセンスプライマーを、同じＣκ２下流（ＪλＣκ２）を有するＣκ１（Ｃκ２）またはＪλにネスト化した定常領域から設計した。全てのＩｇＭおよびＩｇＧファミリーのアセンブリされたｓｃＦｖは、必要であれば、下流末端において同じＣκ２配列を有する。

【0201】

ＶＨライブラリ構築のために、Ｂ細胞および精製されたゲルの３つ全ての供給源に対する個々のペアとして、Ｃμ２、Ｃγ２、Ｃα２、およびＶＨ１−７ＵＴＲを用いて、ＰＣＲを行った。精製後、３つの供給源から増幅された個別のファミリーをプールし、７つの（ＶＨ１−７）ＩｇＭライブラリ、７つの（ＶＨ１−７）ＩｇＧライブラリ、および７つのＩｇＡライブラリ（ＶＨ１−７）を生成した。ＶＬライブラリ構築のために、Ｂ細胞の３つの供給源に対するＣκ２およびＶκまたはＪλＣκ２混合物およびＶλを用いて、ＰＣＲを行った。ゲル精製後、ＶκおよびＶλライブラリを生成するように、異なる供給源からのＶκおよびＶλライブラリをプールした。

【0202】

ライブラリ修飾
また、インビトロ転写、５’末端における翻訳シグナル配列、および３’末端におけるタグ配列を保有するように、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ ＶＨライブラリおよびＶＬライブラリを修飾した。これらのＶＨライブラリは、ストレプトアビジンディスプレイライブラリにする準備ができている。

【0203】

ライブラリ構築のためのオリゴ配列
ＶＨおよびＶＬ Ｘディスプレイライブラリを生成するために、表２に示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。

【0204】

実施例２
ストレプトアビジンディスプレイライブラリの産生および使用
この実施例は、本発明のストレプトアビジンディスプレイライブラリの産生および使用を説明する。

【0205】

材料および方法
一般に、本発明の実践は、特に示さない限り、化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、例えば、抗体技術）の従来技法、およびポリペプチド調製の標準技法を用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），５１０，Ｐａｕｌ，Ｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ，１６９），ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｅｄ．，ＩｒＩ Ｐｒ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｈ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｐｕｂ．（１９９９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９２）を参照されたい。

【0206】

緩衝剤
１０Ｘ化学的ライゲーション緩衝剤：２５０ｍＭトリスｐＨ７および１Ｍ ＮａＣｌ
１ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤：１００ｍＭトリスｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
２ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤：２００ｍＭトリスｐＨ８、２Ｍ ＮａＣｌ、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
１Ｘ ｆｌａｇ結合緩衝剤：５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００または１Ｘ ＰＢＳおよび０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
５Ｘ ｆｌａｇ結合緩衝剤：２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００または５Ｘ ＰＢＳおよび０．１２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００

【0207】

使用された試薬の供給源
Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ Ｔ７：Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）ＰＨ１３３４
Ｒｅｔｉｃ ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ：Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）ＰＨ１２００
ＵＣ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ−ｍｅｔ：Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）ＰＨ１２２３Ｇ
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ− ＲＴ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）＃１８０６４−０１４
ＮＡＰ−２５カラム：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）＃１７−０８５２−０１
第７型オリゴｄＴセルロース：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）＃２７−５５４３−０３
抗ｆｌａｇＭ２アガロースアフィニティーゲル：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）＃Ａ２２２０
Ｆｌａｇペプチド：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）＃Ｆ３２９０
ｄＮＴＰ：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）＃２７−２０３５−０１
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）６００３１２−５１
ミニスピンカラム：Ｂｉｏｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）＃７３２−６２０４
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＢＳＡ：Ａｍｂｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）＃２６１６
剪断サケ精子ＤＮＡ：Ａｍｂｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）＃９６８０
リンカー：ＰＢＩ、ＤＤＢ、ＢＰＰ：Ｔｒｉｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
Ｈ_２Ｏ：ＯｍｎｉＰｕｒ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）＃９６１０
２Ｍ ＫＣｌ：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃７５８９６
１Ｍ ＭｇＣ１２：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃７８６４１
０．５Ｍ ＥＤＴＡ：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃１５６９４
１ＭトリスｐＨ８：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃２２６３８
１ＭトリスｐＨ７：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃２２６３７
５Ｍ ＮａＣｌ：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃７５８８８１Ｍ ＨＥＰＥＳ：Ｕｓｂ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）＃１６９２４
Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット：Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）＃２８７０６
６％ ＴＢＥ−Ｕｒｅａ ｇｅｌｓ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）ＥＣ６８６５ＢＯＸ
４−１６％ ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ Ｇｅｌ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）

【0208】

特殊試薬の調製
オリゴｄＴセルロース（最終濃度：１００ｍｇ／ｍｌ）
２．５ｇのオリゴｄＴセルロースを、５０ｍｌ管の中で２５ｍｌの０．１Ｎ ＮａＯＨと混合した。混合物を１５００ｒｐｍで３分間回転させた後、結果として生じた上清を廃棄した。結果として生じたオリゴｄＴセルロースを含有するペレットを、２５ｍｌの１ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤で洗浄し、１５００ｒｐｍで３分間回転させることによって、再び沈殿させた。結果として生じた上清を再びペレットから分離し、廃棄した。この洗浄工程をさらに３回繰り返した。最後の洗浄後、結果として生じた上清のｐＨを測定した。ｐＨは、洗浄緩衝剤と同じとなるべきである（約ｐＨ８．５）。次いで、オリゴｄＴセルロースを含有するペレットを上清から分離し、２５ｍｌの１ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤に再懸濁した後、４℃で保管した。

【0209】

Ｍ２アガロースの調製
２５ｍｌのＭ２アガローススラリーを５０ｍｌの管の中に移した。Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機の中で１０００ｒｐｍにて５分間回転させた後、上清を分離して廃棄した。結果として生じたＭ２アガロースを含有するペレットを、１０ｍＭ、ｐＨ３．５のグリシンの１カラム容量で再懸濁し、１０００ｒｐｍで５分間回転させた。結果として生じた上清を再び廃棄した。次いで、アガロースペレットを１Ｘｆｌａｇ結合緩衝剤の１カラム容量で再懸濁した。混合物を１０００ｒｐｍで５分間回転させ、結果として生じた上清を廃棄した。この洗浄工程をさらに３回繰り返し、次いで、ペレットを１Ｘ結合緩衝剤の１カラム容量（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび１００μｇ／ｍｌのｓｓｓＤＮＡを有する）で再懸濁した。混合物を、４℃で１時間または一晩回転させた後、２ｍｌ分画のアリコートに分離して４℃で保管した。

【0210】

ＶＨライブラリの増幅
ＶＨライブラリを増幅するための例示的方法を以下に挙げる。

【0211】

プライマー：
５’プライマー：Ｓ７（Ｔ７ＴＭＶＵＴＲ）
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡ−３’（配列番号：５２）
５’プライマー：Ｓ７ａ（Ｔ７ＴＭＶＵＴＲ ＡＵＧ）
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号：５３）
３’プライマー：ＸＢ−Ｓ５−１（Ｃμ２ｆｌａｇＡ２０＋ＳＡディスプレイ付加配列）
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＡＡ ＧＧＡ ＣＧＡ
ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ ＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：５４）
リバースフレーム１（プライマーと相補的なコード鎖の翻訳）：１ Ｇ Ｓ Ａ Ｓ Ａ Ｐ Ｔ Ｄ Ｙ Ｋ Ｄ Ｄ Ｄ Ｄ Ｋ Ｓ Ｓ Ｌ Ａ Ｓ Ａ Ｉ （ＳＴＯＰ）Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ Ｋ（配列番号：５５）

【0212】

反応構成：

【0213】

温度サイクルプログラム：

５０℃のＴｍは、概算であり、ＰＣＲプライマーの選択に依存する。

【0214】

ライブラリの精製：
増幅したＶＨライブラリＤＮＡを２％アガロースゲル上で分離した。Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＃２８７０６，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）および３００μｌのＨ_２Ｏの中での再構成を使用して、ゲルスライスからのＤＮＡ抽出のために、紫外線光の下で４００ｂｐバンドを切り取った。５μＬの精製ＤＮＡを、２％Ｅ−ゲル上での電気泳動のために適用した。回収率は約８０％と見込まれた。

【0215】

転写
反応構成（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ（商標），Ａｍｂｉｏｎ ＰＨ１３３４，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）
第１回のライブラリ産生に関しては、フルスケースのＲＮＡ転写（５００μｌ）が推奨される。反応容量は、後で縮小することができる。

【0216】

インキュベーション
上記のような反応混合物を、１〜２時間、好ましくは最大で一晩、３７℃でインキュベートした。

【0217】

精製
例示的精製方法は、以下で挙げられるＮＡＰ−２５カラム上の分画である。ＮＡＰ１０およびＮＡＰ５カラムを小規模産生の精製に使用することができ、その場合、分画容量はそれに応じて変化させられるべきである。

【0218】

ＮＡＰ−２５カラムを使用する精製過程のために、５００μｌの転写反応ごとに２５μＬのＤｎａｓｅ Ｉを添加することができる。５００μＬのフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールが混合物に添加される、フェノール抽出の前に、混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。次いで、混合物を３０秒間ボルテックスすることができる。次いで、混合物を５分間微量遠心分離した後に、水相を回収することができる。この水相の装填の前に、カラムを通して１０ｍＬのｄＨ_２Ｏを滴下することによって、ＮＡＰ−２５カラムを予洗することができる。次いで、抽出された転写混合物を、洗浄されたカラムに装填し、カラムに流し込むことができる。次いで、８００μＬのｄＨ_２Ｏをカラムに添加し、通過物を収集することができる。この溶出過程を５回繰り返すことができ（Ｅ１−Ｅ５）、収集したサンプルのＲＮＡ濃度を分光光度計上のＡ_２６０によって測定することができる。２μＬのサンプルを、ＱＣに対する２％Ｅ−ゲル上での電気泳動のために適用することができる。最も多くのＲＮＡを含有する分画をライゲーションに使用することができる（Ｅ３は少量しか含有せず、Ｅ４はピーク分画であり、Ｅ５はＲＮＡおよび遊離ＮＴＰの混合物を含有する）。

【0219】

ＲＮＡの濃度を計算するために、５μｌの各溶出物を９９５μｌのＨ_２Ｏと混合した後、混合物のＯＤを測定することができる。

【0220】

代替的なＲＮＡ精製手順（ＬｉＣｌ沈殿）を以下に例示する。

【0221】

５００μｌの転写反応ごとに５００μＬの１０Ｍ ＬｉＣｌを添加した後、混合物を−２０℃で３０分から１時間凍結させることができる。次いで、混合物を最大速度で２０分間遠心分離するために適用することができる。結果として生じる上清が廃棄される一方で、５０μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃおよび５０μＬのｄＨ_２Ｏにペレットを再懸濁することができる。標準的ＥｔＯＨ沈殿を実施することができる。結果として生じるペレットは、１００μＬのｄＨ_２Ｏに溶解させることができ、次いで、Ｑｕｂｉｔを使用してＲＮＡ濃度を測定することができる。

【0222】

光架橋
ストレプトアビジンのアセンブリに使用されるビオチン部分を含有する、２’０−Ｍｅ ＲＮＡリンカーＰＢＩおよびＤＮＡリンカーＤＤＢ−１の、２種類のソラレンリンカーを使用する。

ＸＢ−ＰＢＩ（ＳＡ／ＤＮＡディスプレイリンカーＯＭｅ ＲＮＡ／ＤＮＡ）：
５’−（ソラレンＣ６）ｕ ａｇｃ ｇｇａ（ビオチン−ｄＴ）ｇｃ ｕａａ ｇｇＡ ＣＧＡ−３’

ＸＢ−ＤＤＢ−１（ＤＮＡディスプレイリンカー）：
５’−（ソラレンＣ６）（Ｃ７−ＮＨ２−ＥＺビオチン）Ｔ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＡＡ ＧＧＡ ＣＧＡ −３’

ソラレン Ｃ６
ｕ，ａ，ｇ，ｃ＝２−ＭｅＯ−ＲＮＡ
Ａ，Ｃ，Ｇ＝標準デオキシアミダイト
Ｃ７−ＮＨ２-アミノスペーサー７
ＥＺ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＺ−リンクＴＦＰ−スペーサー−ビオチン

リバースフレーム１（コード鎖に出現するようなリンカー領域の翻訳）：Ｓ Ｓ Ｌ Ａ Ｓ Ａ
^＊＊リンカーは感光性であり、アルミニウム箔等により光から保護される必要がある。

【0223】

反応構成では、リンカー／ＲＮＡの比は、１．５：ｌ（最大）から１．１：１（十分）となり得る。

【0224】

第１回の反応では、多様性を網羅するように、大規模産生が提案される（１〜２ｎｍｏｌのＲＮＡ）。以降の回では、ＲＮＡ入力は、１００〜６００ｐｍｏｌに低減されてもよい。

（ライゲーションにおけるＲＮＡの最終濃度は、３〜１５ｐｍｏｌ／ｕｌになる。ライゲーション容量は変化させることができる。）

【0225】

ＰＣＲサーモサイクラーでアニールするために、サンプルを８５℃で３０秒間、そして０．３℃／秒の速度で４℃までインキュベートすることができる。

【0226】

照射するために、１μＬの１００ｍＭ ＤＴＴをアニールしたライゲーション混合物に添加することができる。この混合物を、薄壁０．５ｍｌエッペンドルフチューブに移すか、または同じＰＣＲ管の中で保持することができる。照射過程は、室温で６分間、「長波」（３６５ｎｍ）で手持ち式多波長ＵＶランプ（Ｕｖｐ．ｃｏｍ（Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）＃ＵＶＧＬ−２５）を用いて行うことができる。約５０〜９０％のＲＮＡが精製の必要とともにライゲーションされることが予期される。

【0227】

ライゲーションしたＲＮＡのＱＣのために、ライゲーション効率をチェックするように、サンプルを６％ＴＢＵゲル上での電気泳動のために適用することができる。具体的には、６％ＴＢＵゲルを３００Ｖの下で１５分間予備作動させることができ、その後に、コームを除去し、ウェルを徹底的に洗浄する。次いで、各ウェルに対して、約１０〜１５ｐｍｏｌの遊離ＲＮＡまたはライゲーションＲＮＡを、（転写キットからの）２Ｘローディングバッファーと混合し、９０℃で３分間ともに加熱することができ、その後に氷の上で冷蔵する。次いで、予熱した遊離またはライゲーションＲＮＡの両方を、青色色素が底に到達するまで、３００Ｖで電気泳動するために予熱したゲルのウェルに装填することができる。

【0228】

例示的実験を図３０のように実行した。具体的には、ＫＤＲ ｍＲＮＡをインビトロ転写し、ＬｉＣｌ沈殿によって反応から精製した。８５℃まで加熱し、その後に、１ｘ Ｘ−リンク緩衝剤中で４℃まで徐々に冷却することによって、１等量のＰＢＩリンカーをｍＲＮＡサンプルにアニールした。ＤＴＴを１ｍＭの最終濃度に添加した。サンプルを異なる時間量にわたって３６５ｎｍ波長でインキュベートし、次いで、６％ＴＢＵ変性ゲル上で分解した。画像は、ゲルの紫外線陰影である。図３０に示されるように、５分間の照射後に架橋結合が観察される（レーン７）。さらに、光架橋のために６分間の照射を使用した。

【0229】

ストレプトアビジンの負荷
ストレプトアビジンは、１０^−１５ＭのＫｄというきわめて高親和性でそのリガンドビオチンに結合する、顕著に安定した四量体タンパク質である。

【0230】

Ａ．ＰＢＩリンカーを用いる
ＲＮＡに対するＰＢＩリンカーのＯ−Ｍｅ ＲＮＡ部分の高いＴｍにより、水による５〜１０倍希釈である、元の１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝剤（１ｘ Ｘ−結合緩衝剤中など）を１０〜２０ｍＭ塩に希釈することが推奨される。１／２から１／４等量のストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）溶液を、ＰＢＳまたは１ｘ Ｘ−結合緩衝剤に添加することができ、例えば、４μＭ Ｘ−結合ＲＮＡに対して１〜２μＭ最終濃度のストレプトアビジンを添加することができる。次いで、１μＬのＲＮＡｓｉｎｅを添加することができ、混合物をヒートブロックの中で４８℃にて１時間インキュベートすることができる。

【0231】

Ｂ．ＤＤＢリンカーを用いる
ＤＤＢリンカーは全ＤＮＡ分子であるため、１ｘ Ｘ−結合緩衝剤（１００ｍＭ ＮａＣｌ）の希釈は必要とされない。ＤＤＢリンカーは、より良好なＳＡ負荷に適応することができ、ストレプトアビジンに対して、わずか１．５〜２倍過剰量の架橋ｍＲＮＡを使用することが可能である。１／２または１：１．５等量のストレプトアビジン（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）溶液を、ＰＢＳまたは１ｘ Ｘ−結合緩衝剤に添加することができ、例えば、４μＭ Ｘ−結合ＲＮＡに対して２〜２．５μＭ最終濃度のストレプトアビジンを添加することができる。次いで、１μＬのＲＮＡｓｉｎｅを添加することができ、混合物をヒートブロックの中で４８℃にて１時間インキュベートすることができる。

【0232】

それぞれの場合（ＡまたはＢ）において、少なくとも５０％以上で最大８０％のストレプトアビジンが負荷されることが予期できる。

【0233】

ピューロマイシンリンカーＢＰＰの負荷
ＢＰＰ：５’ビオチン−ＢＢ Ｃｙ３−（スペーサー１８）４−ＣＣ Ｐｕ
ＢＰＰ−８：５’ビオチン−ＢＢ Ｃｙ３−（スペーサー１８）８−ＣＣ Ｐｕ
Ｃｙ３色素
４または８単位のスペーサー１８
Ｐｕ＝ピューロマイシン−ＣＰＧ

【0234】

ＢＰＰリンカーは、３’末端におけるペプチド受容体分子である、ピューロマイシンを含有する（このペプチド受容体は、リボソームのＡ部位に進入し、新生ポリペプチド鎖のＣＯＯＨ末端に共有結合する）。リンカーは、各Ｘ−結合ｍＲＮＡ分子上に負荷されたストレプトアビジン分子に結合する５’末端においてビオチンを有する。このペプチド受容体は、最終的に、このｍＲＮＡ（表現型）によってコードされるタンパク質へのｍＲＮＡ（遺伝子型）の非共有の緊密な会合を可能にする。各種のＢＰＰリンカー（より短い４ｘスペーサー−１８を有する、またはより長い８ｘスペーサー１８を有する）は、可視化のための蛍光Ｃｙ−３色素部分（Ｅｘ．５５０、Ｅｍ．５７０ｎｍ）を含有する。Ｃｙ−３の代わりに、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ−５、ローダミン等の、他の蛍光染料を使用することができる。

【0235】

具体的には、（ストレプトアビジンの量に対して）１等量の対応ＢＰＰリンカーを、負荷したストレプトアビジン−ｍＲＮＡアセンブリに添加することができる。混合物は、室温で１５分間インキュベートすることができる。ストレプトアビジンに対するほぼ１００％のＢＰＰリンカーが結合に対して予期できる。

【0236】

例示的実験を図３１のように実行した。具体的には、ＫＤＲ ｍＲＮＡをインビトロ転写し、ＬｉＣｌ沈殿によって反応から精製した。８５℃まで加熱することによって１等量のＰＢＩまたはＤＤＢリンカーをｍＲＮＡサンプルにアニールし、その後に、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する１ｘ Ｘ−結合緩衝剤中で４℃までゆっくりと冷却した。次いで、ＰＢＩ−ｘ−結合ｍＲＮＡのサンプルを、２０ｍＭの最終ＮａＣｌ濃度まで５倍希釈した。ＤＤＢ−ｘ−結合ｍＲＮＡのサンプルは、未希釈で使用した。ストレプトアビジン負荷のために、約１／２等量のストレプトアビジンを各サンプルに添加し、その後に、室温または５０℃で１時間インキュベートした。次いで、ＢＰＰ−Ｃｙ３リンカーを、ストレプトアビジンと同等の量で、各サンプルに添加した。室温での１５分間のインキュベーション後、結果として生じたアセンブリを４〜１６％ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ上で分解した。

【0237】

任意の工程：オリゴｄＴカラム上のＳＡアセンブリの精製
ｍＲＮＡは２０Ａ末端を含有するため、この工程においてオリゴｄＴカラム上で精製することができる。この精製は、必須ではないが、次の工程で融合体収率をある程度改善する場合がある。

【0238】

アセンブリ精製
等容量の２ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤（２００ｍＭトリス、ｐＨ８、２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ）を、調製したｍＲＮＡ−ＳＡアセンブリに添加することができる。次いで、オリゴ−ｄＴセルロースを混合物の中に添加した後、４℃で３０〜６０分間振動させることができる（１００ｍｇの処理／洗浄済みオリゴｄＴセルロース（１ｍＬのスラリー）が、最大１ｎｍｏｌのＲＮＡ入力を捕捉するのに十分である）。混合物は、４℃にて１５００ｒｐｍで３分間、卓上遠心分離機の中で回転させることができる。結果として生じる上清は廃棄される。結果として生じるペレットは、７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤（１００ｍＭトリス、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ無し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）に再懸濁し、ドリップ／スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ ＃７３２−６２０４，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に装填し、次いで、１０００ｒｐｍで１０秒間、マイクロフュージの中で回転させることができる。カラムは、７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤で洗浄し、１０００ｒｐｍでさらに１０秒間回転させることができる。洗浄工程は、８回繰り返すことができる（各洗浄中、洗浄緩衝剤を通して回転させることが困難となっている場合は、遠心分離ｒｐｍおよび時間が増加させられてもよいが、１５００ｒｐｍを超えない）。５μＬの最終洗浄物を、計数のために収集することができる。次いで、ｍＲＮＡ−ＳＡアセンブリをｄＨ_２Ｏで溶出することができる。６０μＬのｄＨ_２ＯをＥ１に使用することができ、その後に、１５００ｒｐｍで１０秒間回転させる（５μＬが集計に使用される）。Ｅ２については、５００μＬのｄＨ_２Ｏをカラムに添加することができる。室温で５分間のインキュベーション後、４０００ｒｐｍで２０秒間回転させた後にＥ２を収集することができる（５μＬが集計に使用される）。Ｅ３については、３００μＬのｄＨ_２Ｏをカラムに添加し、室温で５分間インキュベートすることができる。次いで、４０００ｒｐｍで２０秒間回転させた後にＥ３を収集することができる（５μＬが集計に使用される）。この実施例では、Ｅ２は８０％のｍＲＮＡ−ＳＡアセンブリを含有する。

【0239】

翻訳
翻訳容量は、ＲＮＡ入力の量に基づいて変化し得る。例示的条件を以下に挙げる。

【0240】

翻訳構成（３００μＬ）

【0241】

混合物は、水浴またはインキュベータの中（水ブロックの中）で３０℃にて４５分から１時間、インキュベートすることができる。

【0242】

融合体形成
１００μＬの２Ｍ ＫＣｌ（最終５００ｍＭ）を、２０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２（最終５０ｍＭ）と混合し、室温で１時間インキュベートすることができる。結果として生じる混合物は、随意で凍結させ、−２０℃で最大数日間保管することができる。また、凍結は融合体収率をある程度改善する。

【0243】

次いで、リボソームを分解し、リボソームを含まない融合体を産生するように、５０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを、この混合物に添加することができる（１０μＬがＱＣのために保存される）。

【0244】

選択のための例示的翻訳規模として、第１回については１．２ｎｍｏｌのＲＮＡ（１０×３００μＬ）、第２回については６００ｐｍｏｌのＲＮＡ（５×３００μＬ）、および第３回およびそれ以降については１２０〜６００ｐｍｏｌのＲＮＡ（１〜５×３００μＬ）である。

【0245】

オリゴｄＴセルロースによる融合体精製：ＰＢＩリンカー
オリゴｄＴ精製は、ＲＮＡ融合体分子（プラスＲＮＡ）の精製を可能にし、インビトロ翻訳によって生成された遊離タンパク質分子を除去する。この手順およびそれに続く逆転写工程は、ＰＢＩリンカーアセンブリが翻訳される時には使用されるべきである。ＤＤＢ−リンカーアセンブリの場合は、異なる手順が推奨される。

【0246】

融合体の精製
等容量の２ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤（２００ｍＭトリス、ｐＨ８、２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ）を、翻訳／融合体混合物に添加することができる。次いで、オリゴ−ｄＴセルロースを混合物に添加した後、４℃で３０〜６０分間振動させることができる（１００ｍｇの処理／洗浄済みオリゴｄＴセルロース（１ｍＬのスラリー）が、最大１ｎｍｏｌのＲＮＡ入力の翻訳／融合体を捕捉するのに十分である）。４℃にて１５００ｒｐｍで３分間、卓上遠心分離機の中で回転させた後、結果として生じる上清は廃棄される。結果として生じるペレットは、７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤（１００ｍＭトリス、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ無し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）に再懸濁し、ドリップ／スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ ＃７３２−６２０４，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に装填することができ、その後に、１０００ｒｐｍで１０秒間、マイクロフュージの中で回転させる。結果として生じるペレットは、７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤に再懸濁させた後に、１０００ｒｐｍで１０秒間回転させてペレットを再沈殿させることができる。この洗浄工程は、８回繰り返すことができる（各洗浄中、洗浄緩衝剤を通して回転させることが困難となっている場合は、遠心分離ｒｐｍおよび時間が増加させられてもよいが、１５００ｒｐｍを超えない）。５μＬの最終洗浄を、集計のために収集することができる。洗浄後、ｄＨ_２Ｏを溶出に使用することができる。例えば、６０μＬのｄＨ_２ＯをＥ１に使用することができ、その後に、１５００ｒｐｍで１０秒間回転させる（５μＬが集計に使用される）。Ｅ２については、５００μＬのｄＨ_２Ｏをカラムに添加することができる。室温で５分間のインキュベーション後、４０００ｒｐｍで２０秒間回転させた後にＥ２を収集することができる（５μＬが集計に使用される）。Ｅ３については、３００μＬのｄＨ_２Ｏをカラムに添加し、室温で５分間インキュベートすることができる。次いで、４０００ｒｐｍで２０秒間回転させた後にＥ３を収集することができる（５μＬが集計に使用される）。この実施例では、Ｅ２は８０％のｍＲＮＡ−ＳＡアセンブリを含有する。

【0247】

融合体産生の推定：
オリゴｄＴセルロースからの融合体の溶出は、当技術分野で知られている方法、例えば、ゲル電気泳動、蛍光密度測定、または放射性標識集計等によって、さらに分析することができる。

【0248】

逆転写：ＰＢＩリンカー
ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドは、ＲＮＡを安定させ、その２次構造を低減するように、および選択後のＰＣＲに対するテンプレートとしての機能を果たすように作製される。ＰＢＩリンカーの場合、逆転写は、外部プライマー（Ｓ６）からが好ましいが、より低い効率では、リンカーの４つの３’ヌクレオチドがＤＮＡであるため、ＰＢＩリンカーから行うことができる。これは、潜在的にアセンブリをＤＮＡディスプレイ融合体に変換することができるが、我々は、その目的で、異なる全ＤＮＡリンカーであるＤＤＢを使用する。

【0249】

外部ＲＴプライマー：
ＸＢ−Ｓ６−１：５’−ＴＴＡＡＡＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＡＡ ＧＧＡ ＣＧＡ
ＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣ ＧＧＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣ−３’（配列番号：５６）
リバースフレーム１：Ｇ Ｓ Ａ Ｓ Ａ Ｐ Ｔ Ｄ Ｙ Ｋ Ｄ Ｄ Ｄ Ｄ Ｋ Ｓ Ｓ Ｌ Ａ Ｓ Ａ Ｉ（ＳＴＯＰ）（配列番号：５７）

【0250】

反応構成：（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ逆転写キット）
オリゴ−ｄＴ溶出は、残留セルロースを除去するように、１００００ｒｐｍで３０秒間回転させることができる。

【0251】

【0252】

３７℃で４５〜６０分間インキュベートする（１０μＬを除去してゲル上で実行する）。

【0253】

ＱＣ：ｃＤＮＡ合成は、ＮａｔｉｖｅＰａｇｅを使用するゲル電気泳動によって観察し、Ｃｙ−３色素の蛍光によって検出することができる。

【0254】

逆転写およびＲＮＡｓｅＨ消化と連動した、オリゴｄＴセルロースによる融合体精製：ＤＤＢリンカー
ＤＤＢリンカーとのｍＲＮＡ−ＳＡアセンブリにおいて、カラム上でオリゴｄＴ精製および逆転写を行うことによって、ＤＮＡディスプレイ融合体を生成する。この場合のＤＤＢは、ＲＴプライマーとしての機能を果たす。これも内部ＲＴプライマーとしての機能を果たすように設計される、ＰＢＩリンカーに、同じ手順を適用することができたが、ＤＤＢと比較して低い効率を示した。

【0255】

ＤＮＡディスプレイ融合体は、ヌクレアーゼ消化に対する優れた安定性を示し、細胞に基づいた選択およびインビボ選択に使用される。

【0256】

オリゴｄＴセルロース上での融合体の固定化
等容量の２ＸオリゴｄＴ結合緩衝剤（２００ｍＭトリス、ｐＨ８、２Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ）を、翻訳／融合体混合物に添加することができる。次いで、オリゴｄＴセルロースをさらに添加した後、４℃で３０〜６０分間振動させることができる（１００ｍｇの処理／洗浄済みオリゴｄＴセルロース（１ｍＬのスラリー）が、最大１ｎｍｏｌのＲＮＡ入力の翻訳／融合体を捕捉するのに十分である）。４℃にて１５００ｒｐｍで３分間、卓上遠心分離機の中で回転させた後、結果として生じる上清は廃棄される。結果として生じるペレットは、７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤（１００ｍＭトリス、ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ無し、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００）に再懸濁し、ドリップ／スピンカラム（ＢｉｏＲａｄ ＃７３２−６２０４，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に装填することができ、その後に、１０００ｒｐｍで１０秒間、マイクロフュージの中で回転させる。カラムを７００μＬのオリゴｄＴ洗浄緩衝剤で洗浄し、その後に、１０００ｒｐｍで１０秒間回転させる。結果として生じるペレットは、繰り返し８回洗浄することができる（各洗浄中、洗浄緩衝剤を通して回転させることが困難となっている場合は、遠心分離ｒｐｍおよび時間が増加させられてもよいが、１５００ｒｐｍを超えない）。５μＬの最終洗浄が、集計のために収集される。

【0257】

オリゴｄＴセルロース上での逆転写
固定化融合体を有するオリゴｄＴ樹脂を、１ｘ第１鎖緩衝剤（別個に調製する）の中で平衡を保つことができる。緩衝剤は、樹脂からの融合体の溶出を防止する、７５ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する。

【0258】

混合物は、以下のように逆転写のために調製し、次いで、３７〜３９℃で６０〜７５分間インキュベートすることができる。

（この実施例では、外部ＲＴプライマーが添加されていない。増加した量のｄＮＴＰおよびＳＳＩＩ逆転写酵素がある。）

【0259】

この工程において、ビオチン部分に共有結合され、それは、次いでストレプトアビジン−ＢＰＰ−融合体サンドイッチに緊密に非供給結合される、ｃＤＮＡの鎖が構築され、このようにして、ＤＮＡ−ディスプレイ融合体に対する前駆体を形成する。

【0260】

ＲＮＡ鎖のＲＮＡｓｅ Ｈ消化およびオリゴｄＴセルロースからの溶出
逆転写工程後、同カラムに、対応する量のＲＮＡｓｅ Ｈを添加することができる（上で説明される１０００μＬ反応については１０μＬのＲＮＡｓｅ Ｈ（２Ｕ／μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））。３７℃でさらに１時間インキュベートする。

【0261】

オリゴｄＴカラムを２０００ｒｐｍで１分間回転させることによって、一本鎖ＤＮＡ融合体を溶出し、次いで、５００μＬの１ｘ第１鎖緩衝剤で洗浄することができる。この実施例では、約８０〜９５％の物質をカラムから溶出することができる。

【0262】

例示的実験を図３２および３３のように実行した。図３２に示されるように、ＤＮＡディスプレイアセンブリ（ＤＤＢリンカーとｍＲＮＡ−ｘ結合されている）を、２００ｎＭのｍＲＮＡ濃度で３０℃にて１時間、ＲＲＬにおいて翻訳させた。生成物をオリゴｄＴカラム上に装填した（レーン２〜３）。カラムを１ｘオリゴｄＴ緩衝剤で数回洗浄し、次いで、１ｘＲＴ緩衝剤で２回洗浄し、その後に、３７℃で１時間のｄＮＴＰ添加およびＳＳＩＩ ＲＴが続いた。さらに、ＲＮａｓｅＨ処理を３７℃でさらに１時間実行した。カラムを回転させることによって溶出した（スピンフィルタ）。レーン４および５では、ＰＢＩリンカーとのｍＲＮＡアセンブリを上記と同様に翻訳し、その後に、オリゴｄＴ樹脂による処理、およびｐＨ７．０の５ｍＭトリスによる溶出が続いた。

【0263】

図３３では、ＤＮＡディスプレイアセンブリ（ＤＤＢリンカーとｍＲＮＡ−ｘ結合されている、レーン１、２、および３、またはＢＰＰリンカー、レーン４および５（ＢＰＰ−８リンカー））を、２００ｎＭのｍＲＮＡ濃度で３０℃にて１時間、ＲＲＬにおいて翻訳した。生成物をオリゴｄＴカラム上に装填した。カラムを１ｘオリゴｄＴ緩衝剤で数回洗浄し、次いで、１ｘＲＴ緩衝剤で２回洗浄し、その後に、３７℃で１時間のｄＮＴＰ添加およびＳＳＩＩ ＲＴが続いた。さらに、ＲＮａｓｅＨ処理を３７℃でさらに１時間実行した。カラムを回転させることによって溶出した（スピンフィルタ）。次いで、融合体を抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロース上で精製した（レーン２、３、および５）。

【0264】

第２鎖合成およびＤＮＡディスプレイ融合体アセンブリの完成
ＸＢ＿Ｓ７（Ｔ７ＴＭＶＵＴＲ２ ４２−ｍｅｒ；ＶＨ ＩｇＭ、ＩｇＧライブラリの両方に対する５’ＰＣＲプライマー）：
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡ−３’（配列番号：５２）
ＸＢ＿Ｓ７ａ（追加ＡＴＧを有するＴ７ＴＭＶプライマー４５ｍｅｒ、Ｔｍを３℃向上させる）：
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号：５８）

【0265】

先の工程からの溶出物に、１〜１．５等量のＴＭＶ−Ｔ７プライマーＳ７またはＳ７ａとともに、余分のｄＮＴＰおよびＳＳＩＩ ＲＴを添加することができる。
例示的反応は、上で説明されるように、１５００μＬ反応につき追加試薬の混合を含む。
Ｓ７またはＳ７ａ １〜１．５等量
ＳＳＩＩ ＲＴ １０μＬ
ｄＮＴＰ １０μＬ

【0266】

混合物は、３７〜３９℃でさらに１時間インキュベートすることができる。第２鎖の合成後、ＤＮＡディスプレイ融合体アセンブリが完了し、抗ＦＬＡＧ抗体樹脂上での追加精製後に、融合体を細胞に基づいた選択またはインビボ選択に使用することができる。

【0267】

例示的実験を図３４に示す。ｍＲＮＡアセンブリを以下のように実行した。４μＭのＲＮＡおよび４μＭのリンカー（ＤＤＢまたはＰＢＩ）を、１ｘ Ｘ−結合緩衝剤中で８５〜４℃でアニールし、次いで、ＤＴＴを１ｍＭとし、加えて６分間にわたっておよびＵＶ３６５を添加した。次いで、０．６７ｘ Ｘ−結合緩衝剤中のＳＡを、４８℃で１時間にわたって１：２の比として負荷した（最終ｍＲＮＡ ２μＭ、およびＳＡ １μＭ）。ピューロマイシンＣｙ３リンカー（ＢＰＰ−４ ｘＣ１８スペーサー）を、ＲＴ（室温）で１０分間にわたって１μＭでアセンブリに添加した。オリゴｄＴ精製は行わなかった。次のＲＴ反応を以下のように実行した。ＲＴプライマーとしてのＤＤＢ、ＲＴプライマーとしてのＰＢＩ、およびＰＢＩアセンブリのみにおけるＳ６（外部プライマー）の、３つの条件を使用して、標準ＲＴを４２℃でｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（ＳＳＩＩ）を使用した。ＲＴ反応物それぞれを、３７℃で１時間、ＲＮＡｓｅ Ｈ（２Ｕ）によって処理した。さらに、４２℃で１時間にわたってＹ７プライマー（Ｔ７−ＴＭＶ）１：１および余分なＳＳＩＩ ＲＴ酵素および余分なｄＮＴＰを添加することによって、第２鎖を合成した（Ｋｕｒｔｚ， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ ２００１から得られた条件）。

【0268】

ＦＬＡＧタグの精製
Ｆｌａｇ精製は、全長タンパク質分子のみを回収し、インビトロ翻訳によって生成されたあらゆる遊離ＲＮＡおよび短縮タンパク質分子を除去する。

【0269】

結合および洗浄：
５００μＬのＭ２アガロース（事前剥離され、１ｘ結合緩衝剤中で事前遮断された１０ｍＭ Ｇｌｙ ｐＨ３．５）懸濁を、２ｍｌ管に移すことができる。１５００ｒｐｍで１分間、マイクロフュージの中で回転させた後、結果として生じる上清を廃棄する。アガロースはさらに、１ｍＬのｆｌａｇ結合緩衝剤で２回洗浄することができる。次いで、洗浄したＭ２アガロースを、調製した化学修飾ライブラリ（５μｌが集計に使用される）および１／４ライブラリ容量の５Ｘｆｌａｇ結合緩衝剤と混合し、４℃で１時間から一晩振動させることができる。１５００ｒｐｍで１分間、マイクロフュージの中で回転させた後、結果として生じる上清を未使用の管に移す一方で、結果として生じるＭ２アガロースペレットを、０．７ｍＬのｆｌａｇ結合緩衝剤に懸濁し、ドリップスピンカラム上に装填する。装填したカラムは、１０００ｒｐｍで１０秒間マイクロフュージの中で回転させ、さらに、０．７ｍｌのｆｌａｇ結合緩衝剤で６回洗浄することができ、その後に、１０００ｒｐｍで１０秒間の回転が続く。次いで、カラムを０．７ｍｌの１ｘ結合緩衝剤で洗浄することができ、その後に、１０００ｒｐｍで１０秒間の回転が続く（５μＬの最終洗浄を集計のために収集することができる）。

【0270】

溶出：
１Ｘ結合緩衝剤中の５００μＬの１００μｇ／ｍＬ ＦＬＡＧペプチドを、カラムに添加することができる。５分間インキュベートした後、カラムを３０００ｒｐｍで回転させてから、溶出物を収集することができる。溶出過程は、３００μｌのｆｌａｇペプチドを用いて繰り返すことができる（５μＬの各溶出物を集計のために収集することができる）。

【0271】

回収の推定：
通常、回収率は１０〜３０％となり得る。回収は、蛍光または当技術分野で知られている他の方法によって測定することができる。

【0272】

ＰＣＲ
目的に応じて、Ｔａｑポリメラーゼまたは高忠実度ポリメラーゼを増幅に使用することができる。ＰＣＲサイクルをチェックして、通常は過剰増幅によって引き起こされるＰＣＲアーチファクトを防止するように、小規模ＰＣＲが推奨される。

【0273】

反応構成：

【0274】

注：先の工程、例えば、貫流、最終洗浄、溶出１、および溶出２で収集された分画をＰＣＲのためのテンプレートとして使用することができる。具体的には、２．５〜５μＬのテンプレートを、このＰＣＲ反応で、特に初期回数の選択（例えば、第１〜３回）のために使用することができる。しかしながら、より少量を使用することが有益であり得る。例示的なＰＣＲ条件を以下に記載する。

【0275】

Ｔｍについての注意：Ｔｍはプライマーに対して計算される。この実施例では、プライマーは、５０℃超のＴｍ、または５２℃から６５℃のＴｍを有し得る。

【0276】

ＰＣＲ反応後、５μＬの反応混合物を、２％Ｅゲル上での電気泳動に使用することができる。約４００ｂｐのサイズを有する主要バンドがゲル上で予期できる。小規模ＰＣＲの質が容認可能であれば、残りの溶出物を同様の条件下で大規模ＰＣＲのためのテンプレートとして使用することができる。

【0277】

ＤＮＡ精製：
時には、ＰＣＲ生成物を精製する必要があること場合もある。電気泳動後、ＰＣＲ生成物を含有する２％アガロースゲル上のゲルスライス（４００ｂｐバンド）を、紫外線光の下で切り取ることができる。次いで、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ ＃２８７０６，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、ＤＮＡをゲルスライスから抽出することができる。５μＬの精製ＤＮＡを、２％Ｅゲル上での電気泳動に使用することができる。通常は、約８０％回収を期待することができる。

【0278】

４５４配列決定のための標識付加：ＤＮＡディスプレイ
非増幅選択工程における個々の分子の標識付加のために、以下の第２鎖プライマーを使用する：
ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＧＧＧＡＣＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＣＡ ＡＴＧ（配列番号：５９）

【0279】

このプライマーは、ＴＭＶ配列、４５４アダプタ配列、およびＮ６ランダムタグを含有する。３’末端に対する対応ＰＣＲプライマー（第２の４５４アダプタを含有する、遺伝子特異的部分のＴｍは５０．４℃である）
ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＡＴＧＣＴＡＡＧＣＡＣＧＡ（配列番号：６０）

アダプタプライマーのみを使用して、アンプリコン調製を行う：

前方：Ｔｍ６４．７℃
ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号：６１）
逆：Ｔｍ６５．７℃
ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ（配列番号：６２）
両方のＴｍは約６５℃であり、したがって、ＲＡＣＥ型のＰＣＲが３’プライマーに対して可能である。

【0280】

同等物
本発明の多数の改変および代替実施形態が、先述の説明を考慮すると当業者にとって明白となるであろう。したがって、この説明は、例証的にすぎないものとして解釈され、本発明を実行するための最善の様態を当業者に教示する目的のためになされる。構造の詳細は、本発明の精神から逸脱することなく大幅に変化し得、添付の請求項の範囲内である全ての修正の専属的利用が留保される。本発明は、添付の請求項および適用可能な法規制によって規定される範囲のみに限定されることが意図される。

【0281】

特許、特許出願、論説、本、論文、論述、ウェブページ、図、および／または付属書を含む、本願で引用される全ての文献および同様の資料は、そのような文献および同様の資料の形式にかかわらず、その全体が参照により明示的に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、説明された技法等を含む、組み込まれた文献および同様の資料のうちの１つ以上が、本願とは異なる、または矛盾する場合は、本願が優先となる。そのような同等物は、以下の請求項によって包含されることを目的とする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]