特許 6239979 ＲＡＳの調節因子としての水素結合代替大環状分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6239979

(24)【登録日】2017年11月10日

(45)【発行日】2017年11月29日

(54)【発明の名称】ＲＡＳの調節因子としての水素結合代替大環状分子

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/00 20060101AFI20171120BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20171120BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171120BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/00

   A61K38/12

   A61P35/00

【請求項の数】11

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2013-556666(P2013-556666)

(86)(22)【出願日】2012年3月2日

(65)【公表番号】特表2014-513059(P2014-513059A)

(43)【公表日】2014年5月29日

(86)【国際出願番号】US2012027617

(87)【国際公開番号】WO2012122059

(87)【国際公開日】20120913

【審査請求日】2015年2月26日

(31)【優先権主張番号】61/449,472

(32)【優先日】2011年3月4日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】511060836

【氏名又は名称】ニューヨーク・ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】アロラ パラムジット

(72)【発明者】

【氏名】バー−サギ ダフナ

(72)【発明者】

【氏名】パッジーリ アヌパム

(72)【発明者】

【氏名】ヤーダヴ カムレシ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０３３８７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY，２０１０年，V8 N8，P1773-1776

【文献】 NATURE PROTOCOLS，２０１０年，V5 N11，P1857-1865

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

安定な、内部拘束型αヘリックスを有し、かつ、ＲａｓのＳｏｓ介在性グアニンヌクレオチド交換の阻害活性を有するペプチドであって、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつ、以下を含む、ペプチド：
(i) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
(ii) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、
(iii) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＡＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(iv) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(v) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＬＬＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(vi) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＡＥＥＡＮ、
(vii) 配列Ｘ'ＦＥＡＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮ、または、
(viii) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ；
ここで、Ｘ'は4-ペンテノイル基であり、かつ、
該ペプチドは前記アミノ酸配列の１番目から４番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有し、ここで、該１番目の残基はＸ'であり、該４番目の残基はＧまたはＡである。

【請求項2】

安定な、内部拘束型αヘリックスを有し、かつ、ＲａｓのＳｏｓ介在性グアニンヌクレオチド交換の阻害活性を有するペプチドであって、前記αヘリックスが、該ペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基に付加された4-ペンテノイル基と、該ペプチドの３番目のアミノ酸残基のアミノ基に付加されたアリル基との間の炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつ、以下を含む、ペプチド：
(i) 配列ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
(ii) 配列ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、
(iii) 配列ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＡＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(iv) 配列ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(v) 配列ＦＥＧＩＹＲＬＥＬＬＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(vi) 配列ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＡＥＥＡＮ、
(vii) 配列ＦＥＡＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮ、または、
(viii) 配列ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ。

【請求項3】

前記ペプチドが以下からなる群より選択される、請求項１に記載のペプチド：
(i) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
(ii) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、
(iii) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＡＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(iv) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(v) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＬＬＫＸＥＥＸＮ； ここで、Ｘはα-アミノイソ酪酸、
(vi) 配列Ｘ'ＦＥＧＬＬＲＬＷＬＲＫＡＥＥＡＮ、
(vii) 配列Ｘ'ＦＥＡＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮ、および、
(viii) 配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ；
ここで、Ｘ'は4-ペンテノイル基である。

【請求項4】

前記ペプチドが以下を含む、請求項１に記載のペプチド：
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、
配列Ｘ'ＦＥＡＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮ、または、
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ。

【請求項5】

前記ペプチドが以下を含む、請求項２に記載のペプチド：
配列ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
配列ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、
配列ＦＥＡＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮ、または
配列ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ。

【請求項6】

前記ペプチドが以下からなる群より選択される、請求項１または３に記載のペプチド：
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、および
配列Ｘ'ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ。

【請求項7】

前記ペプチドが以下からなる群より選択される、請求項２または５に記載のペプチド：
配列ＦＥＧＩＹＲＴＤＩＬＲＴＥＥＧＮ、
配列ＦＥＧＩＹＲＴＥＬＬＫＡＥＥＡＮ、および
配列ＦＥＧＩＹＲＬＥＫＬＫＡＥＥＡＮＲＲ。

【請求項8】

前記内部拘束型αヘリックスが下記式を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド：

または

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学上許容可能な媒体を含む、医薬組成物。

【請求項10】

請求項1〜８のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学上許容可能な媒体を含む、細胞中のＲａｓシグナル伝達を阻害するための医薬組成物。

【請求項11】

請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学上許容可能な媒体を含む、それを必要とする対象における癌の治療のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１１年３月４日に出願され、「ＲＡＳの調節因子としての水素結合代替大環状分子（Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅｓ ａｓ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｒａｓ）」という名称の米国仮特許出願第６１／４４９，４７２号の利益を主張し、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。

【0002】

連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所より付与された助成金、認可番号Ｒ０１ＧＭ０７３９４３およびＲ０１ＧＭ０７８２６６の下、政府の支援を受けて行われた。政府はこの発明に一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）シグナル伝達の異常は、様々な発達障害や過剰増殖性疾患の根底にある、主要な原因の１つである（Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ"．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１，３５５（非特許文献1））。ＲＴＫの信号が細胞内経路へと伝搬される主要な伝達機構には、低分子グアニンヌクレオチド結合タンパク質であるＲａｓのリガンド依存的な活性化が含まれる（図１）（Ｂｕｄａｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｍａｎｙ ｆａｃｅｓ ｏｆ Ｒａｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．"Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００８，１７８６，１７８（非特許文献2））。従って、Ｒａｓシグナル伝達経路阻害剤の設計は、抗癌治療に関し、盛んに研究が行われてきた分野である（Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００３，３，１１（非特許文献3））。Ｒａｓ活性化過程の律速段階は、Ｒａｓに特異的なグアニンヌクレオチド交換因子であるＳｏｓによって触媒される交換反応を介した、Ｒａｓ−ＧＤＰからＲａｓ−ＧＴＰへの変換である（図２）。高度に保存されているＳｏｓの触媒ドメイン（Ｒｅｍ＋ｃｄｃ２５）はα−Ｈヘリックスとα−Ｉヘリックスから構成されるヘリックスヘアピンでＲａｓと相互作用する（図３）。ヘリックスヘアピンがヌクレオチドをＲａｓから解離させ、その後、Ｒａｓ経路を下方制御し得る（Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｈａｉｒｐｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ Ｃｄｃ２５（Ｍｍ） ｒｅｔａｉｎｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ ｈａｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．"Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．２００５，５７９，６８５１（非特許文献4））。この複合体の高分解能構造は、ヘリックスヘアピンの中でもＲａｓと直接接触している部分はα−Ｈヘリックスだけであり、α−Ｉヘリックスは、α−Ｈの立体配座の安定化にのみ役立っているようである、ということを示唆している（Ｂｏｒｉａｃｋ−Ｓｊｏｄｉｎ， ｅｔ ａｌ． "Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ ｂｙ Ｓｏｓ．"Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９４，３３７（非特許文献5））。

【0004】

Ｒａｓ−Ｓｏｓ相互作用の阻害剤は、この複雑なシグナル伝達経路を詳細に分析するためのツールとして、また、抗がん剤の創薬の手がかりとして価値があるだろう。しかしながら、Ｒａｓ／Ｓｏｓ複合体の高分解能結晶構造が１９９８年から利用可能だったにもかかわらず、この複合体の直接の阻害剤は報告されていない。そのため、Ｒａｓタンパク質に関連する望ましくない活性を阻害すること、例えばＲａｓ／Ｓｏｓ複合体を阻害することによって、発達障害や過剰増殖性疾患を治療するための方法および組成物に関する需要は現在でもある。本発明は、これらの需要や他の需要に取り組むものである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｂｌｕｍｅ−Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ"．Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１１，３５５

【非特許文献2】Ｂｕｄａｙ ｅｔ ａｌ．，"Ｍａｎｙ ｆａｃｅｓ ｏｆ Ｒａｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．"Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２００８，１７８６，１７８

【非特許文献3】Ｄｏｗｎｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．"Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２００３，３，１１

【非特許文献4】Ｓａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｈａｉｒｐｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ Ｃｄｃ２５（Ｍｍ） ｒｅｔａｉｎｓ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｕｔ ｈａｓ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．"Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．２００５，５７９，６８５１

【非特許文献5】Ｂｏｒｉａｃｋ−Ｓｊｏｄｉｎ， ｅｔ ａｌ． "Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ ｂｙ Ｓｏｓ．"Ｎａｔｕｒｅ １９９８，３９４，３３７

【発明の概要】

【0006】

一態様において本発明は、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを提供する。前記αヘリックスは、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドは、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。いくつかの実施形態では、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質はＳｏｓである。例えば、このペプチドは、ＳｏｓのαＡ、αＢ、αＣ、αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ、αＪ、またはαＫヘリックスの少なくとも一部分を模倣している。いくつかの例では、ペプチドは、Ｓｏｓのα−Ｈヘリックスの少なくとも一部分を模倣している。一実施形態においてペプチドは、Ｓｏｓのα−Ｈ配列の９２９番目から９４４番目のアミノ酸を模倣する。例えばペプチドは、式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮ（SEQ ID NO: 1）の配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である。他の実施形態では、ペプチドは表１のアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸配列の１番目から４番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する。

【0007】

いくつかの実施形態においてペプチドは、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは１または２であり；
ｍは０または任意の正の整数であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立して水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である。

【0008】

例えば、ｍは１または２である。他の実施形態では、ｎは１または２である。

【0009】

本発明はまた、本発明によるペプチドおよび薬学上許容可能な媒体を含有する医薬組成物も提供する。

【0010】

別の態様において本発明は、細胞中のＲａｓシグナル伝達を阻害する方法を提供する。この方法は、有効量の、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを含有する組成物と、細胞を接触させる工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。いくつかの実施形態では、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質はＳｏｓである。例えば、ペプチドは、ＳｏｓのαＡ、αＢ、αＣ、αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ、αＪ、またはαＫへリックスの少なくとも一部分を模倣している。いくつかの例では、ペプチドは、Ｓｏｓのα−Ｈヘリックスの少なくとも一部分を模倣している。一実施形態においてペプチドは、Ｓｏｓのα−Ｈ配列の９２９番目から９４４番目のアミノ酸を模倣する。例えばペプチドは、式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮ（SEQ ID NO: 1）の配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である。他の実施形態においてペプチドは、表１のアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸配列の１番目から４番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する。

【0011】

いくつかの実施形態においてペプチドは、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは１または２であり；
ｍは０または任意の正の整数であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立して水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である。

【0012】

例えば、ｍは１または２である。他の実施形態では、ｎは１または２である。

【0013】

本発明はさらに、それを必要とする対象における癌の治療方法を提供する。この方法は、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを前記対象に投与する工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。例えばペプチドは、式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮ（SEQ ID NO: 1）の配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である。他の実施形態においてペプチドは、表１のアミノ酸配列を含み、かつ、アミノ酸配列の１番目から４番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する。いくつかの実施形態においてペプチドは、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは１または２であり；
ｍは０または任意の正の整数であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立して水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である。
参照による援用

【0014】

本明細書中で述べる全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、および特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されるかのように同程度に、参照により本明細書中に組み込まれる。
[本発明1001]
安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドであって、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している、ペプチド。
[本発明1002]
Ｒａｓタンパク質と相互作用可能な前記タンパク質がＳｏｓである、本発明1001のペプチド。
[本発明1003]
ＳｏｓのαＡ、αＢ、αＣ、αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ、αＪ、またはαＫヘリックスの少なくとも一部分を模倣している、本発明1002のペプチド。
[本発明1004]
Ｓｏｓの前記α−Ｈヘリックスの少なくとも一部分を模倣している、本発明1003のペプチド。
[本発明1005]
Ｓｏｓの前記α−Ｈ配列の929番目〜944番目のアミノ酸を模倣している、本発明1004のペプチド。
[本発明1006]
式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮの配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である、本発明1001のペプチド。
[本発明1007]
表1のアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列の1番目から4番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する、本発明1001のペプチド。
[本発明1008]
下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは1または2であり；
ｍは0または任意の正の整数であり；
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である、本発明1001のペプチド。
[本発明1009]
ｍが1である、本発明1008のペプチド。
[本発明1010]
ｍが2である、本発明1008のペプチド。
[本発明1011]
ｎが1である、本発明1008のペプチド。
[本発明1012]
ｎが2である、本発明1008のペプチド。
[本発明1013]
本発明1001のペプチドおよび薬学上許容可能な媒体を含む、医薬組成物。
[本発明1014]
細胞中のＲａｓシグナル伝達を阻害する方法であって、有効量の、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを含有する組成物と、前記細胞を接触させる工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している、方法。
[本発明1015]
Ｒａｓタンパク質と相互作用可能な前記タンパク質がＳｏｓである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記ペプチドが、ＳｏｓのαＡ、αＢ、αＣ、αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ、αＪ、またはαＫへリックスの少なくとも一部分を模倣している、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記ペプチドが、Ｓｏｓの前記α−Ｈヘリックスの少なくとも一部分を模倣している、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記ペプチドが、Ｓｏｓの前記α−Ｈ配列の929番目〜944番目のアミノ酸を模倣している、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記ペプチドが、式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮの配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
前記ペプチドが表1のアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列の1番目から4番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する、本発明1014の方法。
[本発明1021]
前記ペプチドが、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは1または2であり；
ｍは0または任意の正の整数であり；
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である、本発明1014の方法。
[本発明1022]
ｍが1である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
ｍが2である、本発明1021の方法。
[本発明1024]
ｎが1である、本発明1021の方法。
[本発明1025]
ｎが2である、本発明1021の方法。
[本発明1026]
それを必要とする対象における癌の治療方法であり、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを前記対象に投与する工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している、方法。
[本発明1027]
前記ペプチドが式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮの配列を含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記ペプチドが表1のアミノ酸配列を含み、かつ、前記アミノ酸配列の1番目から4番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記ペプチドが、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは1または2であり；
ｍは0または任意の正の整数であり；
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である、本発明1026の方法。
[本発明1030]
ＦＥＧＩＹＲＬＥＬＬＫＡＥＥＡＮまたはＦＥＡＩＹＲＬＥＬＬＫＡＥＥＡＮの配列を含まない、本発明1001〜1005のいずれかのペプチド。
[本発明1031]
前記アミノ酸配列の1番目から4番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する、本発明1030のペプチド。
[本発明1032]
下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは1または2であり；
ｍは0または任意の正の整数であり；
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である、本発明1031のペプチド。
[本発明1033]
ｍが1である、本発明1032のペプチド。
[本発明1034]
ｍが2である、本発明1032のペプチド。
[本発明1035]
ｎが1である、本発明1032のペプチド。
[本発明1036]
ｎが2である、本発明1032のペプチド。
[本発明1037]
前記ペプチドが、ＦＥＧＩＹＲＬＥＬＬＫＡＥＥＡＮまたはＦＥＡＩＹＲＬＥＬＬＫＡＥＥＡＮの配列を含まない、本発明1014〜1018のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記ペプチドが、前記アミノ酸配列の1番目から4番目の残基にわたる内部拘束型αヘリックスを有する、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記ペプチドが、下記式

を含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは1または2であり；
ｍは0または任意の正の整数であり；
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は独立して、水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
ｍが1である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
ｍが2である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
ｎが1である、本発明1039の方法。
[本発明1043]
ｎが2である、本発明1039の方法。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本発明の新規な特徴は、詳細には別添の特許請求の範囲により示される。本発明の原理を利用した例示的な実施形態および添付の図面について述べる下記の詳細な説明を参照することにより、本発明の特徴および利点はより深く理解される。

【0016】

【図1】Ｒａｓシグナル伝達経路の模式図を示す。

【図2】ＲａｓとＳｏｓの関係を示す。Ｒａｓの活性は、特異的グアニンヌクレオチド交換因子であるＳｏｓによって促進される。活性型Ｒａｓは、多数のシグナル伝達経路を制御する。

【図3】ＲａｓとＳｏｓの間の、重要なα−ヘリックス接合面を示す（ＰＤＢ受託番号１ＢＫＤ）。

【図4】本発明の組成物による、Ｓｏｓ介在性グアニンヌクレオチド交換活性の阻害を示す。

【図5A】３当量および５当量のＨＢＳ７を添加した際の^１５Ｎで標識したＲａｓ共鳴の^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルのうちの選択した変化を示す。

【図5B】添加したＨＢＳ７の量を増やした場合の変化を示している、化学シフトの平均値の差のプロットである。

【図6】４０ｎＭのＳｏｓと１００ｎＭのＧＳＴ−Ｒａｓ存在下で行ったＧＳＴプルダウンアッセイによって評価した、ＨＢＳ７によるＲａｓ／Ｓｏｓ複合体の阻害を示す。

【図7】遺伝子の発現に至る、ＲＴＫ／Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナル伝達ネットワークの模式図を示す。

【図8a】細胞培養を用いた実験によって決定した、本発明のＨＢＳペプチドのＲＴＫ／Ｒａｓ経路タンパク質に及ぼす効果を示す。ＨＢＳ７によるＥＧＦ誘導性のＲａｓ活性化の減衰を示す。

【図8b】細胞培養を用いた実験によって決定した、本発明のＨＢＳペプチドのＲＴＫ／Ｒａｓ経路タンパク質に及ぼす効果を示す。Ｒａｓ／Ｓｏｓ複合体を直接干渉することによる、Ｒａｓ活性化の下方制御を示す。

【図8c】細胞培養を用いた実験によって決定した、本発明のＨＢＳペプチドのＲＴＫ／Ｒａｓ経路タンパク質に及ぼす効果を示す。ＨＢＳ７によるＥＧＦ誘導性のＥＲＫ活性化の抑制を示す。

【図8d】細胞培養を用いた実験によって決定した、本発明のＨＢＳペプチドのＲＴＫ／Ｒａｓ経路タンパク質に及ぼす効果を示す。ＨＢＳ７で処理した後のＥＧＦ誘導性のＥＲＫ活性化の強度の低下および期間の短縮を示す。

【図9】ＨＢＳペプチドの円二色性スペクトルおよびらせん性を示す。

【図10】蛍光偏光法によって決定した、ＨＢＳペプチドのＲａｓに対する結合親和性を示す。

【図11】ＨＢＳペプチドのＨｅＬａ生細胞への細胞内取り込みを示す。

【図12】ＨＢＳ１３および関連化合物を調製するための合成経路を示す。

【図13】ＨＢＳ７および関連化合物を調製するための合成経路を示す。

【図14】本発明の様々なＨＢＳペプチドを調製するための合成経路を示す。

【図15】Ｎ−末端から３番目の位置にグリシン残基を含んでいるＨＢＳペプチドを調製するための合成経路を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明は、Ｒａｓシグナル伝達経路を攪乱することができる、水素結合代替（「ＨＢＳ」）に由来するαヘリックスに関する。これらのＨＢＳヘリックスは、Ｒａｓ／Ｓｏｓ相互作用のインビボでの阻害剤として機能する可能性がある。

【0018】

本発明の第一の態様は、安定な、内部拘束型ＨＢＳα−ヘリックスを１つ以上有するペプチドに関し、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。例えばペプチドは、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質のα−ヘリックス部分を模倣する。

【0019】

用語「模倣する」とは、天然のタンパク質、例えばＳｏｓと同様の活性をもたらす、本発明の組成物の能力を指す。「模倣物」は、そのようなタンパク質の機能および構造の両方を模倣しているものを包含する。例えば模倣物とは、標的タンパク質の一定の割合の相同性（例えば６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の相同性）を共有しているタンパク質である。あるいは、模倣物は、やはり機能的に同じような方法で、例えば、同じ活性部位に相互作用することで、Ｒａｓと相互作用可能な、別の配列に由来する。

【0020】

本発明によるペプチドは、例えば、グアニン−ヌクレオチド−交換因子、例えばＳｏｓタンパク質の配列の一部分を模倣する。他のヌクレオチド交換因子としては、Ｃｄｃ２５、Ｓｄｃ２５およびＲａｓＧＲＦが挙げられる。Ｓｏｓタンパク質は、２つのαヘリックス構造ドメインを含み、これらのドメインには、Ｎ末端ドメイン（アミノ酸５６８〜７４１、α−ヘリックスα１からα６を含む）とＣ末端ドメイン（アミノ酸７５２〜１０４４、α−ヘリックスαＡからαＫを含む）が含まれる。Ｓｏｓタンパク質のＣ末端ドメインは主に、Ｒａｓとの相互作用に関わっている。具体的には、αＨヘリックスがヌクレオチド交換機構において重要な役割を果たしている。

【0021】

いくつかの実施形態では、好適な本発明のペプチドは、少なくとも１つのα−ヘリックスを模倣し、それは、ＳｏｓのαＡ、αＢ、αＣ、αＤ、αＥ、αＦ、αＧ、αＨ、αＩ、αＪ、またはαＫヘリックスである。例えばペプチドは、ＳｏｓのαＨまたはαＩヘリックスを模倣する。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、Ｓｏｓタンパク質の９２９番目から９４４番目のアミノ酸を模倣する。

【0022】

これら人工のα−ヘリックスは、ＳｏｓのヘリックスがＲａｓと結合するのを競合的に干渉し、それによって、ＲａｓおよびＳｏｓの相互作用を調節すると予想される。

【0023】

一例として、本発明の人工のα−ヘリックスは、表１に示したＳｏｓタンパク質の少なくとも一部分を模倣することができる。

【0024】

（表１）Ｒａｓ／Ｓｏｓヘリックスの例

ペプチドおよびＳｏｓ_{９２９−９４４}α−Ｈ配列を模倣するＨＢＳヘリックスの設計。「＾」は、Ｋ^＊およびＥ^＊残基の間にラクタム架橋を含むペプチド（例えばＨＢＳ１５）を指す。「阻害％」は、ＲａｓによるＳｏｓ介在性ヌクレオチド交換の阻害を表している。値は、Ｓｏｓ存在下および非存在下でのＲａｓによるヌクレオチドの交換に対して正規化したものである。

【0025】

通常、本発明の好適なペプチドは、下記式

を含むペプチドを含み、式中、

は一重または二重の炭素間結合であり；

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；
ｎは１または２であり；
ｍは０または任意の正の整数であり；
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立して水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である。

【0026】

変数ｍは、０または任意の正の整数、例えば１、２、３、４もしくは５であってよい。いくつかの実施形態においてｍは０、１または２である。いくつかの実施形態ではｍは０である。他の実施形態では、ｍは１または２である。

【0027】

変数ｎは１または２であってよい。他の実施形態ではｎは１である。さらに他の実施形態では、ｎは２である。

【0028】

置換基Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は独立して水素、アミノ酸側鎖、アルキル基、またはアリール基である。例えば、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４はアミノ酸側鎖である。いくつかの実施形態では、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は天然に存在するアミノ酸側鎖である。他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸側鎖は天然に存在しない側鎖である。

【0029】

いくつかの実施形態では、Ｒ_３は、式ＦＸＧＺＺＸＺＸＺＬＸＺＥＸＸＮ（SEQ ID NO: 1）の配列を含むペプチドであり、式中、Ｘは任意のアミノ酸残基であり、かつ、Ｚは疎水性残基である。別の実施形態では、本発明のペプチドは表１のアミノ酸配列を含み、かつ、表１のアミノ酸配列の１番目から４番目の残基にわたる内部拘束型α−ヘリックス領域を有する。

【0030】

当業者には明らかなように、本発明の方法を使用して、非常に安定した、内部拘束型α−ヘリックスを有するペプチドを調製してもよい。拘束は、Ｎ−末端だけでなく、ペプチド中のどこに配置されてもよい。例えば、本発明の方法に従って調製された化合物は、下記式

を有する場合がある。

【0031】

本発明の方法に従って生成されたペプチドは、例えば、４０、３０、２５、２０、または１５個未満のアミノ酸であってよく、例えば、１０個未満のアミノ酸残基を含む。

【0032】

本発明はまた、安定な、内部拘束型α−ヘリックスを１つ以上有するペプチドに関する。この１つ以上の安定な、内部拘束型二次構造は、下記のモチーフ

を含み、式中、

は一重結合または二重結合であり、

は一重結合であり、かつ、

が二重結合の場合にはシスまたはトランスであり；ｎは１または２であり；かつｍは任意の数である。そのようなモチーフの例としては、

が挙げられる。

【0033】

本発明のＨＢＳ型α−ヘリックスは、図２に示すように、Ｎ末端主鎖ｉとｉ＋４水素結合を、閉環複分解反応を介して炭素間結合で置換することにより得られる（Ａｒｏｒａらに付与された米国特許第７，２０２，３３２号、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ａｒｏｒａ，"Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ： Ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｈｅａｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｕｂｂｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，"Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−８ （２００６）、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ，"Ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｓｈｏｒｔ α−Ｈｅｌｉｘ Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｂｙ ａ Ｍａｉｎ−ｃｈａｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１２２５２−３（２００４）、Ｄｉｍａｒｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ α−Ｈｅｌｉｃｅｓ，"Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．７：２３８９−９２（２００５）、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。水素結合代替物は、α−ターンを前もって組織化して、ペプチド配列をα−ヘリックス配座に安定させる。様々な短いペプチド配列から、ＨＢＳ型α−ヘリックスが、安定なα−へリックス配座をとることが分かっている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｓｈｏｒｔ α−Ｈｅｌｉｃｅｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ａ Ｍａｉｎ−ｃｈａｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：９２４８−５６（２００６）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。また、これらの人工α−ヘリックスが、それらの予想されるタンパク質受容体を、高い親和性で標的とし得ることも示されている（最初はＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１１７：６６８３−７（２００５）で出版された、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ α Ｈｅｌｉｃｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｃｌ−ｘＬ，"Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ'ｌ Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４４：６５２５−９（２００５）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0034】

別の態様では、本発明の化合物の調製には、ペプチドの前駆化合物を提供する工程および、安定な、内部拘束型αヘリックスを得るために、炭素間結合の形成を促進する工程が含まれる。

【0035】

一実施形態において、この前駆物質は、下記式

を有する。

【0036】

上記式の化合物を、炭素間結合の形成を促進するのに有効な条件下で、反応させてもよい。そのような反応は例えば、複分解であり得る。非天然の炭素間拘束を容易に導入するためのオレフィン複分解触媒が、ペプチド模倣物の調製中に示すひときわ優れた官能基寛容性は、ＸおよびＹが、模式図２で示すように、オレフィン複分解反応によって連結される２個の炭素原子である可能性を示唆している（Ｈｏｖｅｙｄａ ｅｔ ａｌ．，"Ｒｕ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ Ｂｅａｒｉｎｇ Ｂｉｄｅｎｔａｔｅ Ｃａｒｂｅｎｅｓ： Ｆｒｏｍ Ｉｎｎｏｃｅｎｔ Ｃｕｒｉｏｓｉｔｙ ｔｏ Ｕｎｉｑｕｅｌｙ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ，"Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｃｈｅｍ．２：８−２３（２００４）、Ｔｒｎｋａ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｌ２×２Ｔｕ ＝ ＣＨＲ Ｏｌｅｆｉｎ Ｍｅｔａｔｈｅｓｉｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ： Ａｎ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｓｕｃｃｅｓｓ Ｓｔｏｒｙ，"Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：１８−２９（２００１）、参照することによりそれらの全体は本明細書に組み込まれる）。

【0037】

本発明のこの態様は例えば、閉環オレフィン複分解反応を含み得る。オレフィン複分解反応によって２つの二重結合がカップリングし（オレフィン）、２つの新しい二重結合が得られる（このうちの１つは通常、エチレンガスである）。閉環オレフィン複分解は、オレフィンの複分解反応を利用して大環状分子を形成する。この反応では、鎖中の２つの二重結合が連結される。この反応は複分解触媒、例えば、下記式

の触媒を使って実施してもよい。

【0038】

他の実施形態では、複分解触媒は、下記式

である。

【0039】

複分解反応は例えば、約２５℃〜１１０℃の間の温度で行ってもよく、より好ましくは約５０℃の温度で実施してもよい。

【0040】

複分解反応は、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、またはトルエンなどの有機溶媒と共に実施してもよい。

【0041】

本明細書で開示される反応は、例えば、固体支持体上で行ってもよい。好適な固体支持体としては、粒子、鎖、沈殿物、ゲル、シート、管、球体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、ディスク、膜などが挙げられる。これらの固体支持体は、ポリマー、プラスチック、セラミック、多糖、シリカもしくはシリカをベースとする材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、またはそれらの複合材料を包含する多種多様な材料から作成することができる。基板は、平らであることが好ましいが、様々な他の表面形状をとることができる。例えば、基板は、盛り上がった領域またはへこんだ領域であって、その領域で合成が起きる、領域を含有してもよい。基板およびその表面は、強固な支持体であって、その上で本明細書に記載の反応を行う、支持体を形成することが好ましい。他の基板材料は、本開示を吟味することにより当業者に容易に明らかであろう。

【0042】

行われる複分解反応によって、新しく形成される炭素間結合は二重結合である、化合物を最初に生じ得る。この二重結合はその後、当該分野で既知の水素化法により、一重結合へと変換することができる。

【0043】

別の態様では、本発明は、細胞中のＲａｓシグナル伝達を阻害する方法を提供し、この方法は、細胞を、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを含有する有効量の組成物と接触させる工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。いくつかの実施形態では、細胞は生体内の細胞である。細胞は例えば、液体腫瘍細胞または固形腫瘍細胞などの癌細胞であり得る。本発明はさらに、それを必要とする対象における癌の治療方法を提供する。この方法は、安定な、内部拘束型αヘリックスを有するペプチドを前記対象に投与する工程を含み、ここで、前記αヘリックスが、炭素間結合形成反応により形成される架橋によって拘束されており、かつさらに、前記ペプチドが、Ｒａｓタンパク質と相互作用可能なタンパク質の少なくとも一部分を模倣している。

【0044】

当業者には明らかなように、投与は、一般的に知られている方法によって行うことができる。

【0045】

投与は、対象に全身投与することによっても、あるいは罹患している細胞に標的投与することのいずれによっても達成することができる。投与経路の例としては、これらに限定するものではないが、気管内接種、吸引、気道への点滴投与、エアロゾール投与、噴霧投与、鼻腔内への点滴投与、経口または経鼻胃への点滴投与、腹腔内注入、血管内注射、局所投与、経皮投与、非経口投与、皮下投与、静脈内注射、動脈内注射（例えば肺動脈を介した）、筋内注射、胸膜内注入、心室内投与、病巣内投与、粘膜（例えば、鼻、喉、気管支、性器、および／または肛門の粘膜）への投与、または持続放出媒体の移植が挙げられる。

【0046】

通常、本発明のペプチドは、医薬製剤として哺乳類に投与される。医薬製剤は治療薬および任意の薬学上許容可能な補助剤、担体、賦形剤、および／または安定剤を含み、また、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、または乳剤などの固体または液体の剤形であってよい。組成物は好ましくは約０．０１〜約９９重量パーセント、より好ましくは約２〜約６０重量パーセントの治療薬を、補助剤、担体および／または賦形剤と共に含む。そのような治療に有効な組成物に含まれる活性化合物の量は、適切な投与単位が得られるようなものである。

【0047】

薬剤は、例えば、不活性な希釈剤または同化性の食用の担体と共に経口投与してもよく、あるいは硬カプセルもしくは軟カプセル中に封入して、または錠剤に圧縮して、または食事の食品に直接組み込んでもよい。経口治療投与用には、これらの活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、カプセル、エリキシール、懸濁液、シロップなどの剤形で使用することができる。このような組成物および調整物は、薬剤を少なくとも０．１％含有していなければならない。当然のことながら、これらの組成物に含まれる薬剤の割合は変わってもよく、単位の重量の約２％〜約６０％の範囲が都合よいだろう。そのような治療に有効な組成物に含まれる薬剤の量は、適切な用量が得られるようなものである。

【0048】

錠剤やカプセルなどはさらに、結合剤（例えばトラガカントゴム、アカシアゴム、トウモロコシデンプン、またはゼラチン）、賦形剤（例えば二リン酸カルシウム）、崩壊剤（例えばトウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、またはアルギン酸）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、および甘味料（例えばショ糖、乳糖、またはサッカリン）を含んでいてもよい。単位用量形態がカプセルの時には、上述した種類の材料に加えて、油脂などの液体担体が含まれ得る。

【0049】

多様な他の材料もコーティング剤として、または用量単位の物理的な形状を改造するために存在し得る。例えば、錠剤を、シェラック、糖、またはその両方でコーティングしてもよい。シロップは、活性成分（複数可）に加えて、甘味料としてのショ糖、防腐剤としてのメチルパラベンやプロピルパラベン、色素、ならびにさくらんぼ香料またはオレンジ香料のような矯味剤を含んでいてもよい。

【0050】

また、薬剤を非経口投与することもできる。薬剤の溶液または懸濁液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水の中で調製することができる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、および油に溶解したそれらの混合物の中で調製することもできる。油の例としては、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、または鉱油が挙げられる。一般に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射用液剤にとって、好ましい液体担体である。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。

【0051】

注射用使用に適している医薬形態は、無菌の水性の液剤または分散剤、および無菌の注射用液剤または分散剤をその場で調製するための無菌の散剤を包含する。すべての場合において、形態は、無菌でなければならず、容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流動性でなければならない。形態は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、それらの適当な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。

【0052】

本発明のこの態様による薬剤は、エアゾールの形態で気道に直接投与することもできる。エアゾール剤として使用するために、溶液または懸濁液に溶解している本発明の化合物を、適切な噴射剤、例えば、プロパン、ブタン、またはイソブタンのような炭化水素噴射剤、および標準的な補助剤と共に、加圧エアロゾル容器内に包装することができる。本発明の材料は、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧形態で投与することもできる。

【0053】

本発明の薬剤は、標的組織、例えば治療する条件に感受性のある組織に直接投与することができる。これに加えておよび／またはあるいは、薬剤を、標的組織、器官、または細胞への薬剤の移動（および／または標的組織、器官、または細胞による取り込み）を促進する、１種類以上の薬剤と共に非標的領域に投与してもよい。当業者には明らかなように、治療薬自体を修正し、望まれる組織、器官、または細胞への輸送（および、望まれる組織、器官、または細胞による取り込み）を容易にすることができる。

【0054】

送達装置の例としては、これらに限定されるものではないが、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム、経皮パッチ、インプラント、埋め込み用または注射用タンパク質デポ組成物、および注射器が挙げられる。当業者に知られている他の送達系を使用して、治療薬をインビボの望まれる器官、組織、または細胞へと望ましく送達し、本発明のこの態様を達成することもできる。

【0055】

本発明のこの態様を実施するには、薬剤を送達するのに適したいかなる方法をも利用することができる。典型的には、薬剤（複数可）を標的細胞、組織、または器官に送達する媒体に溶解された状態で、薬剤は患者に投与される。

【0056】

細胞中に薬剤を送達するための方法の１つに、リポソームの使用がある。リポソームの使用には基本的に、送達するべき薬剤（複数可）を包含するリポソームを提供する工程、次いで、標的細胞、組織、または器官を、細胞、組織、または器官に薬剤を送達するのに効果的な条件下でリポソームと接触させる工程を含む。

【0057】

リポソームは、水相を被包する１つ以上の同心円状に並んだ脂質二重層からなる小胞である。それらは、通常は漏出性ではないが、穴または細孔が膜に生じる場合、膜が溶かされるか分解する場合、または膜温度が相転移温度まで増加する場合に漏出性になることがある。リポソームを介する現行の薬物送達法は、リポソーム担体が、最終的に透過性になり、被包された薬物を標的部位で放出することを必要とする。このことは、例えば、体内の様々な物質の作用によってリポソーム二重層が時間と共に分解する、受動的な様式で達成することができる。あらゆるリポソーム組成物は、循環中または体内の他の部位で特徴的な半減期を有するため、リポソーム組成物の半減期を制御することにより、二重層が分解する速度を幾分かは調節することができる。

【0058】

受動的な薬物放出とは対照的に、能動的な薬物放出には、リポソーム小胞の透過性の変化を誘導する薬剤の使用が含まれる。リポソーム膜は、リポソーム膜の近くの環境が酸性になる場合に、それらが不安定化するように構築することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，"ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｔａｒｇｅｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ，"Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−５（１９８７）を参照のこと）。例えば、リポソームが標的細胞によってエンドサイトーシスされる場合、リポソームは、リポソームを不安定化して薬物を放出させる酸性エンドソームに送られることがある。

【0059】

あるいは、リポソーム膜を、酵素が膜上にコーティングとして配置されるように化学修飾することができ、酵素は、リポソームをゆっくりと不安定化する。薬物放出の制御は、膜内に最初に配置された酵素の濃度に依存することから、薬物放出を調節するか変化させて、薬物を「要求に応じて」送達するための真に有効な方法はない。同じ問題は、リポソーム小胞が標的細胞と接触するとすぐに、リポソーム小胞が飲み込まれ、ｐＨの低下が薬物放出につながるという点で、ｐＨ感受性リポソームについても存在する。

【0060】

このリポソーム送達系を作成し、能動的標的化を介して標的器官、組織、または細胞に蓄積することができる（例えば、リポソーム媒体の表面上に抗体またはホルモンを組み入れることにより）。このことは、既知の方法に従って達成することができる。

【0061】

様々な種類のリポソームを、Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｉｖａｌｅｎｔ Ｉｏｎｓ Ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ Ｌａｍｅｌｌａｅ ｏｆ Ｓｗｏｌｌｅｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−５２（１９６５）、Ｈｓｕに付与された米国特許第５，６５３，９９６号、Ｌｅｅらに付与された米国特許第５，６４３，５９９号、Ｈｏｌｌａｎｄらに付与された米国特許第５，８８５，６１３号、ＤｚａｕおよびＫａｎｅｄａに付与された米国特許第５，６３１，２３７号、およびＬｏｕｇｈｒｅｙらに付与された米国特許第５，０５９，４２１号に従って調製することができ、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする。

【0062】

これらのリポソームは、本発明の治療薬に加えて、それらが、抗炎症剤などの他の治療薬を含み、次いで、標的部位で放出するように製造することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，"Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ−Ｔｈｙ１ ＩｇＧ１ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ＡＫＲ−Ａ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ，"Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８０２：２５９−７３（１９８４））。

【0063】

タンパク質またはポリペプチド製剤（例えば、本発明のペプチド）を送達するための別の方法には、所望のタンパク質またはポリペプチドをポリマーと抱合させる工程を含み、ここでポリマーは、抱合したタンパク質またはポリペプチドの酵素分解を避けるために安定化されている。この種の抱合型タンパク質または抱合型ポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｅｋｗｕｒｉｂｅに付与された米国特許第５，６８１，８１１号に記載されている。

【0064】

タンパク質またはポリペプチド製剤を送達するためのさらに別の手法には、Ｈｅａｒｔｌｅｉｎらに付与された米国特許第５，８１７，７８９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によるキメラタンパク質の調製がある。キメラタンパク質は、リガンドドメインとポリペプチド製剤（例えば、本発明の人工α−ヘリックス）を含むことができる。リガンドドメインは、標的細胞上に位置している受容体に特異的である。従って、キメラタンパク質が静脈内に送達されるか、あるいは血液またはリンパ内に導入される場合、キメラタンパク質は標的化細胞に吸着し、標的化細胞の内部に取り込まれるだろう。

【0065】

投与は、必要に応じた頻度で、有効な治療を提供するのに適した期間にわたって行うことができる。例えば、単一の持続放出用量製剤で投与することも、または複数の１日投与量で投与することもできる。

【0066】

言うまでもなく、投与量は治療計画に応じて変化する。通常、患者の状態の改善に有効な量（すなわち治療上有効量）になるように、薬剤を投与する。従って、癌の例では、治療上有効量とは、腫瘍の大きさを少なくとも部分的に縮小させる、体内の癌細胞の数を低下させる、または体内での癌細胞の増加を遅らせることができる量であり得る。有効量を達成するのに必要とされる用量は、薬剤、製剤、癌、および薬剤が投与される個体に応じて変わり得る。

【0067】

有効量の決定には、インビボで必要とされる濃度を計算するために、様々な投与量の薬剤を培養液中の細胞に投与し、癌細胞の成長を阻害するのに有効な薬剤の濃度を決定するインビトロアッセイもまた含まれ得る。有効量は、インビボ動物試験に基づくものであってもよい。治療上有効量は、当業者が経験的に決定してもよい。
治療方法

【0068】

いくつかの実施形態では、本発明の化合物を使用して、癌および腫瘍性の状態を治療、予防、および／または診断する。本明細書で使用する場合、用語「癌」、「過剰増殖性」および「腫瘍性」は、自律的増殖能を有する細胞、すなわち、早い速度で増殖している細胞成長によって特徴付けられる異常な段階または状態を指す。過剰増殖性および腫瘍性の病態は、病気である、すなわち病態を特徴付けているまたは構成していると分類されることも、あるいは、病気でない、すなわち正常からは逸脱しているが、病態とは関連がないと分類されることもある。この用語は、組織病理的な種類または浸潤度にかかわらず、全ての型の癌性増殖または発癌過程、転移性組織または悪性転換した細胞、組織、または器官、を含むものと意図される。転移性の腫瘍は多くの原発性腫瘍の型から現れる。原発性腫瘍には、これらには限定されないが、乳房、肺、肝臓、結腸および卵巣起源のものが含まれる。「病気の過剰増殖性」細胞は、悪性の腫瘍増殖によって特徴付けられる病態で生じる。病気ではない過剰増殖性細胞の例としては、創傷治癒に関連する細胞の増殖が挙げられる。細胞増殖および／または分化性障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、または転移性障害が挙げられる、いくつかの実施形態において化合物は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、そのような癌の転移などを制御するための新規治療薬である。

【0069】

癌または腫瘍性の状態の例としては、これらには限定されないが、繊維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、またはカポジ肉腫が挙げられる。

【0070】

増殖性疾患の例には、造血器の腫瘍性疾患がある。本明細書で使用する場合、用語「造血器の腫瘍性疾患」には、造血器由来の、例えば骨髄、リンパまたは赤血球分化系列、またはその前駆細胞から生じた、過剰増殖性／腫瘍性細胞を含む疾患が含まれる。好ましくは疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病や急性巨核芽球性白血病から生じるものである。骨髄疾患のさらなる例としては、これらには限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７にまとめられている）が挙げられ、リンパ性悪性疾患には、これらには限定されないが、Ｂ細胞系列性ＡＬＬとＴ細胞系列性ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれる。さらに別の形態の悪性リンパ腫としては、これらには限定されないが、非ホジキンリンパ腫およびその変異体、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・スタンバーグ疾患が挙げられる。

【0071】

乳房の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、増殖性乳房疾患（例えば、上皮過形成、硬化性腺症、および小管乳頭腫など）、腫瘍（例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、および肉腫などの間質性腫瘍、および大管乳頭腫などの上皮腫瘍）、乳房癌（非浸潤性乳管癌（パジェット病など）および非浸潤性小葉癌を含むインシトゥ（非浸潤性）癌、および浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌、膠様（粘液）癌、管状癌、および浸潤性乳頭癌を含むがこれらには限定されない侵襲性（浸潤性）癌、および種々の悪性新生物）が挙げられる。男性の乳房の障害には、これらには限定されないが、女性化乳房および癌腫がある。

【0072】

肺の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、気管支原性癌（例えば、腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、気管支カルチノイド、ならびに種々の腫瘍および転移性腫瘍などの神経内分泌腫瘍）、胸膜の病気（例えば、炎症性胸水貯留、非炎症性胸水貯留、気胸、ならびに孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）および悪性中皮腫などの胸膜腫瘍）が挙げられる。

【0073】

結腸の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍が挙げられる。

【0074】

肝臓の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍（肝臓の原発癌および転移性腫瘍など）が挙げられる。

【0075】

卵巣の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、卵巣腫瘍（例えば体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍）、胚細胞腫瘍（例えば成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌）、性索間質性腫瘍（例えば顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル（ｈｉｌｌ）細胞腫瘍、および性腺芽細胞腫）、並びに転移性腫瘍（クルーケンベルグ腫瘍）が挙げられる。

【0076】

いくつかの実施形態では、本発明のペプチドを使用して、変異したＲａｓタンパク質が介在する癌を治療する。そのような突然変異をしばしば含む癌としては、これらには限定されないが、非小細胞肺癌（腺癌）、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌（例えば、濾胞性、未分化乳頭または乳頭）、精上皮腫、黒色腫、膀胱癌、肝臓癌、腎臓癌、骨髄異形成症候群、および急性骨髄性白血病がある。

【0077】

乳癌
一態様において本発明は、本発明の化合物の投与による、乳癌の治療方法を提供する。乳癌には、侵襲性の乳癌、例えば浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、管状癌、侵襲性篩状癌、髄様癌、粘液癌およびムチンを多く含む他の腫瘍、嚢胞腺癌、円柱細胞粘液癌、印環細胞癌、神経内分泌腫瘍（固形神経内分泌癌、異型カルチノイド腫瘍、小細胞／燕麦細胞癌、または大細胞神経内分泌癌を含む）、浸潤性乳頭癌、侵襲性微小乳頭癌、アポクリン腺癌、化生性癌、純上皮型化生性癌、上皮／間葉混合性化生性癌、脂質に富む癌、分泌性乳癌、膨大細胞癌腫、腺様嚢胞癌、細様細胞癌、グリコーゲンに富む明細胞癌、脂腺癌、炎症性癌または両側乳癌、間葉腫瘍、例えば血管腫、血管腫症、血管外皮腫、乳腺間質の過形成（ｐｓｅｕｄｏａｎｇｉｏｍａｔｏｕｓ ｓｔｒｏｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、筋組織新生物、線維腫症（浸潤性）、炎症性筋線維芽腫瘍、脂肪腫、血管脂肪腫、顆粒細胞腫瘍、神経線維腫、シュワン腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、または平滑筋肉腫、筋上皮の病変、例えば筋上皮増殖（ｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉｏｓｉｓ）、腺筋上皮腺症（ａｄｅｎｏｍｙｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｄｅｎｏｓｉｓ）、腺筋上皮腫、または悪性筋上皮腫、線維上皮腫瘍、例えば線維腺腫、葉状腫瘍、低級管周囲間質肉腫、または乳房過誤腫、および乳頭の腫瘍、例えば乳頭腺腫、乳頭・乳輪部の腺腫、または乳頭のパジェット病が含まれる。

【0078】

乳癌の治療は、その他のいかなる治療と、例えば標準治療の一環である治療と併せて行うこともできる。本発明の化合物を使った治療の前、本発明の化合物を使った治療を行っている間、または本発明の化合物を使った治療の後に、乳腺腫瘍摘出術または乳房切除術などの外科的手法を実施してもよい。あるいは、本発明の化合物と併せて、乳癌を治療するための放射線療法を使用することもできる。他の例では、本発明の化合物を、第二の治療薬と併用投与する。そのような薬剤は、個別の薬物または薬物や治療の併用などの化学療法薬であってもよい。例えば、化学療法薬は、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、および５−フルオロウラシル）、ＦＡＣまたはＣＡＦ（５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、シクロホスファミド）、ＡＣまたはＣＡ（ドキソルビシンおよびシクロホスファミド）、ＡＣ−タキソール（ＡＣと次いでパクリタキセル）、ＴＡＣ（ドセタキセル、ドキソルビシン、およびシクロホスファミド）、ＦＥＣ（５−フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド）、ＦＥＣＤ（ＦＥＣと次いでドセタキセル）、ＴＣ（ドセタキセルおよびシクロホスファミド）などの補助化学療法の場合がある。化学療法に加えて、腫瘍の特徴（つまりＨＥＲ２／ｎｅｕの状態）および再発の危険性に応じて、トラスツズマブも投与計画に加えてもよい。化学療法の前、化学療法を行っている間、または化学療法後のホルモン治療が適している場合もある。例えば、タモキシフェン、またはアミノグルテチミド、アナストロゾール、エキセメスタン、ホルメスタン、レトロゾール、またはボロゾールを含むがこれらには限定されない、アロマターゼ阻害薬に分類される化合物を投与してもよい。他の実施形態では、乳癌を治療するための併用治療において、抗血管新生薬を使用してもよい。抗血管新生薬は抗ＶＥＧＦ薬であってよく、抗ＶＥＧＦ薬にはベバシズマブが含まれるがこれには限定されない。

【0079】

卵巣癌
別の態様では、本発明の化合物を使用して卵巣癌を治療することもできる。卵巣癌としては、卵巣腫瘍、例えば体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍、胚細胞腫瘍、例えば成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未成熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌、性索間質性腫瘍、例えば顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル細胞腫瘍、および性腺芽細胞腫、および転移性腫瘍、例えばクルーケンベルグ腫瘍が挙げられる。

【0080】

本発明の化合物を、第二の治療、例えば標準治療の一環である治療と併せて投与してもよい。卵巣癌に適用可能な治療のいくつかには、手術、免疫療法、化学療法、ホルモン療法、放射線治療、またはその組み合わせがある。適用可能な外科的手法のいくつかとしては、減量手術、および片側または両側の卵巣摘出術および／または片側または両側の卵管摘出術がある。

【0081】

使用可能な抗癌剤としては、シクロホスファミド、エトポシド、アルトレタミン、およびイホスファミドがある。薬物であるタモキシフェンを使ったホルモン療法により、卵巣腫瘍を縮小させてもよい。放射線治療は、外照射療法および／または密封小線源治療であり得る。

【0082】

前立腺癌
別の態様では、本発明の化合物を使用して前立腺癌を治療することもできる。前立腺癌には、腺癌および転移した腺癌が含まれる。本発明の化合物を、第二の治療、例えば標準治療の一環である治療と併せて投与することもできる。前立腺癌の治療には、手術、放射線治療、高密度焦点式超音波療法（ＨＩＦＵ）、化学療法、凍結手術、ホルモン療法、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。手術には、前立腺切除術、根治的会陰式前立腺摘除術、腹腔鏡下根治的前立腺摘除術、前立腺の経尿道的切除または睾丸摘出術が含まれ得る。放射線治療は、外照射療法および／または密封小線源治療を含む場合がある。ホルモン療法には、睾丸摘出術、抗男性ホルモン薬、例えばフルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、または酢酸シプロテロン、ＤＨＥＡなどの副腎アンドロゲンの生産を阻害する薬物、例えばケトコナゾールやアミノグルテチミドの投与、およびアバレリクス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ（登録商標））、セトロレリクス（Ｃｅｔｒｏｔｉｄｅ（登録商標））、ガニレリクス（Ａｎｔａｇｏｎ（登録商標））、ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、またはブセレリンなどのＧｎＲＨアンタゴニストまたはアゴニストの投与が含まれる場合がある。別の適用可能な治療としては、体内でのアンドロゲン活性を遮断する、抗男性ホルモン薬を使った治療がある。そのような薬剤としては、フルタミド、ビカルタミド、およびニルタミドが挙げられる。この治療は、通常、ＬＨＲＨ類似体の投与または睾丸摘出術と併せて行われ、後者は、完全アンドロゲン遮断（ＣＡＢ）と呼ばれている。化学療法には、ドセタキセルを、コルチコステロイド、例えばプレドニゾンなどと併せて投与するものがあるが、これには限定されない。前立腺癌の成長を遅らせるため、症状を軽減するため、および生活の質を改善するために、ドキソルビシン、エストラムスチン、エトポシド、ミトキサントロン、ビンブラスチン、パクリタキセル、カルボプラチンなどの抗癌剤を投与することもできる。ビスホスホネート製剤などの別の化合物をさらに投与してもよい。

【0083】

腎臓癌
別の態様では、本発明の化合物を使って腎臓癌を治療してもよい。腎臓癌には、腎細胞癌、腎外原発新生物からの転移、腎臓リンパ腫、扁平上皮細胞癌、傍糸球体腫瘍（腎腫）、移行上皮癌、血管筋脂肪腫、膨大細胞腫およびウィルムス腫瘍が含まれるがこれらには限定されない。本発明の化合物を、第二の治療、例えば標準治療の一環である治療と併せて投与することもできる。腎臓癌の治療には、手術、経皮的治療、放射線治療、化学療法、ワクチン、または他の薬剤投与が含まれ得る。本発明の化合物との併用において腎臓癌の治療に有用な外科的手法としては腎摘出術があり、これには、副腎、後腹膜リンパ節、および腫瘍の侵襲によって罹患した、他の任意の周辺組織の切除が含まれ得る。経皮的治療には、例えば、画像誘導治療があり、これには、腫瘍を画像化し、次いでこれをラジオ波焼灼療法または凍結療法で標的破壊することが含まれ得る。いくつかの例では、腎臓癌の治療に有用な他の化学療法または他の薬剤投与は、α−インターフェロン、インターロイキン−２、ベバシズマブ、ソレフェニブ、スニチブ（ｓｕｎｉｔｉｂ）、テムシロリムスまたは他のキナーゼ阻害剤である場合がある。

【0084】

膵癌
他の態様において本発明は、本発明の化合物を投与することにより、膵癌の治療方法を提供する。この膵癌は、膵管組織の類上皮癌および膵管の腺癌から選択されるような膵癌である。最も一般的な型の膵癌は腺癌であり、これは膵管の管壁から生じる。膵癌に適用可能な治療としては、手術、免疫治療、放射線治療、および化学療法が挙げられる。手術の選択肢として可能性があるものには、膵体尾部切除術または膵全摘術および膵頭十二指腸切除術（ホイップル法）が含まれる。放射線治療、具体的には、体外にある装置を使って腫瘍に放射線を当てる外照射療法が、膵癌患者に対する選択肢となる場合もある。別の選択肢としては、術中に照射される、術中電子線照射がある。化学療法を膵癌患者に使用することもできる。好適な抗癌剤には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、マイトマイシン、イホスファミド、ドキソルビシン、ストレプトゾシン、クロロゾトシン、およびそれらの併用があるがこれらには限定されない。本発明で提供する方法は、本発明のポリペプチドを投与することによって、または化合物の投与と手術、放射線治療、または化学療法を併用することで、膵癌患者に有益な効果をもたらすことが可能である。

【0085】

結腸癌
一態様では、本発明の化合物を使用して結腸癌を治療してもよい。結腸癌には、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍が含まれるがこれらには限定されない。本発明の化合物と併せて結腸癌に適用可能な治療としては、手術、化学療法、放射線治療または標的薬治療がある。

【0086】

放射線治療は、外照射療法および／または密封小線源治療を含む場合がある。化学療法を使用して、転移が広がる可能性を低下させる、腫瘍サイズを縮小させる、または腫瘍の成長を遅らせることもできる。化学療法は、手術の後に適用される（補助）、手術前に適用される（術前補助）、または手術が指示されない場合には一次療法（姑息的）として適用されることが多い。例えば、補助化学療法の投与計画の一例としては、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、およびオキサリプラチンを併用して静注するＦＯＬＦＯＸがある。化学療法の第一選択の処方計画には、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、およびオキサリプラチン（ＦＯＬＦＯＸ）の静注と、標的薬、例えばベバシズマブ、セツキシマブもしくはパニツムマブの併用、または５−フルオロウラシル、ロイコボリン、およびイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）の静注と、標的薬、例えばベバシズマブ、セツキシマブまたはパニツムマブの併用が含まれる場合がある。本発明の化合物と合わせて結腸癌の治療または予防に有用な可能性のある他の化学療法薬は、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、オブリメルセン（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）、Ｇ３１３９）、ゲフィチニブおよびエルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））およびトポテカン（Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標））である。

【0087】

肺癌
いくつかの実施形態では、本発明の化合物を使った、肺癌の治療方法を提供する。肺細胞の増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、気管支原性癌（腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、神経内分泌腫瘍、例えば気管支カルチノイド、雑多な腫瘍、および転移性腫瘍を含む）；胸膜の病気（炎症性胸水、非炎症性胸水、気胸を含む）ならびに胸膜腫瘍（孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）および悪性中皮腫を含む）が挙げられる。

【0088】

最もありふれた型の肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。これは、肺がんのおよそ８０〜８５％を占め、扁平上皮細胞癌、腺癌、および大細胞未分化癌に分類される。小細胞肺癌、例えば小細胞肺細胞腫は肺癌の１５〜２０％を占める。肺癌の治療の選択肢には、手術、免疫治療、放射線治療、化学療法、光線力学的治療、またはそれらの併用がある。肺癌の治療に適用可能ないくつかの外科的な選択肢は、区域切除術または楔状切除術、肺葉切除術、または肺摘除術である。放射線治療は、外照射療法または密封小線源治療であり得る。本発明の化合物と併せて、肺癌を治療するための化学療法に使用することができる抗癌剤のいくつかとしては、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ゲフィチニブ、イホスファミド、メトトレキサート、またはそれらの併用が挙げられる。光線力学的治療（ＰＤＴ）を使用して、肺癌患者を治療してもよい。本明細書に記載の方法は、化合物を投与することによって、または化合物の投与と、手術、放射線治療、化学療法、光線力学的治療、またはそれらの併用を組み合わせることによって、肺癌患者に有益な効果をもたらすことが可能である。

【0089】

肝臓の細胞増殖性疾患および／または分化性障害の例としては、これらには限定されないが、結節性過形成、腺腫、および悪性腫瘍（肝臓の原発癌および転移性腫瘍を含む）が挙げられる。

【0090】

免疫増殖性疾患
免疫増殖性疾患（「免疫増殖性障害」または「免疫増殖性新生物」としても知られている）は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む、免疫系の主要な細胞の異常な増殖、または免疫グロブリン（抗体としても知られている）の過剰生産によって特徴付けられる、免疫系の疾患である。このような疾患には、一般的な分類である、リンパ増殖性疾患、高ガンマグロブリン血症、およびパラプロテイン血症が含まれる。そのような疾患の例としては、これらには限定されないが、Ｘ連鎖リンパ増殖性疾患、常染色体のリンパ増殖性疾患、高ＩｇＭ症候群、重鎖病、およびクリオグロブリン血症が挙げられる。他の免疫増殖性疾患は、移植片対宿主拒絶病（ＧＶＨＤ）、乾癬、移植拒絶反応に関連した免疫疾患、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、精巣血管中心性Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球性血管炎、および自己免疫疾患、例えばエリテマトーデス、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、インスリン依存型糖尿病、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感性眼炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、関節リウマチ、多発性筋炎、強皮症、および混合性結合組織病であり得る。

【0091】

併用療法
一実施形態では、本発明の化合物を、アルキル化剤およびアルキル化様薬剤と合わせて、癌の治療に使用することもできる。そのような薬剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン、ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン、白金製剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ＢＢＲ３４６４、およびサトラプラチン、またはブスルファン、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、トレオスルファン、若しくはウラムスチンを含むがこれらには限定されない、他の薬剤が挙げられる。

【0092】

別の実施形態では、本発明の化合物を、代謝拮抗薬である抗腫瘍薬と併せて使用してもよい。例えば、そのような抗腫瘍薬は、葉酸、例えばアミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、またはラルチトレキセドである場合がある。あるいは、抗腫瘍薬は、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、ペントスタチン、チオグアニンを含むがこれらには限定されない、プリンであってもよい。さらなる実施形態では、抗腫瘍薬は、カペシタビン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、およびゲムシタビンなどのピリミジンであってもよい。

【0093】

さらに他の実施形態では、本発明の化合物を、紡錘体毒／有糸分裂阻害剤である抗腫瘍薬と併せて使用することもできる。この分類に含まれる薬剤としては、タキサン類、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、およびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。さらに他の実施形態では、本発明の化合物を、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質である抗腫瘍薬と併せて使用してもよく、この場合、細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質は、アントラサイクリンファミリー由来のもの、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピクサントロン、若しくはバルルビシン、ストレプトミセスファミリーに由来する抗生物質、例えばアクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、若しくはプリカマイシン、またはヒドロキシ尿素である。あるいは、併用療法に使用される薬剤は、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、またはテニポシドを含むがこれらには限定されない、トポイソメラーゼ阻害剤であってもよい。

【0094】

あるいは、抗腫瘍薬は抗体または抗体に由来する薬剤であってもよい。例えば、受容体チロシンキナーゼ標的抗体、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、またはトラスツズマブを使用してもよく、あるいは、抗体は抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブまたはトシツモマブ、またはアレムツズマブ、ベバシズマブ、およびゲムツズマブを含むがこれらには限定されない、いかなる他の適切な抗体であってもよい。他の実施形態では、抗腫瘍薬は、腫瘍親和性感光色素、例えばアミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィマーナトリウム、またはベルテポルフィンである。さらに他の実施形態において抗腫瘍薬は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、デジラニブ（ｄｅｄｉｒａｎｉｂ）、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、またはバンデタニブである。本発明の使用に好適な他の腫瘍薬としては、例えば、アリトレチノイン、トレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、亜ヒ酸、アスパラギナーゼ（ペグアルパルガーゼ）、ベキサロテン、ボルテゾミブ、デニロイキンジフチトクス、エストラムスチン、イクサベピロン、マソプロコール、またはミトタンが挙げられる。

【0095】

他の実施形態またはさらなる実施形態では、本明細書に記載の化合物を使用して、過剰な細胞死または生理的障害に起因する細胞死などによって特徴付けられる状態を治療、予防または診断する。早い時期に起こるまたは望まれていない細胞死、あるいは望まれていないまたは過剰な細胞増殖によって特徴付けられる状態のいくつかの例には、これらには限定されないが、低細胞性／低形成性、無細胞性／無形成性、または細胞過形成性／過剰増殖性の状態が含まれる。いくつかの例としては、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、および骨髄形成異常症を含むがこれらには限定されない、血液障害が挙げられる。

【0096】

他の実施形態またはさらなる実施形態では、アポトーシスを低減させるように作用する本発明の化合物を、望ましくないレベルの細胞死に関連した障害の治療に使用する。従って、いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性の本発明の化合物を使用して、ウイルス感染、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染に関連がある感染を伴う細胞死を誘導するような障害を治療する。多くの神経学的疾患は、特定の組のニューロンが徐々に失われていくことを特徴とし、かつ、いくつかの実施形態では、これらの障害の治療において、抗アポトーシス性の本発明の化合物が使用される。そのような障害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、網膜色素変性、脊髄筋萎縮症、および多様な形態の小脳変性症が含まれる。これらの疾患における細胞の消失は炎症性反応を誘発せず、また、アポトーシスは細胞死の機序であるように見受けられる。加えて、多数の血液疾患は、血液細胞の生産の減少と関連している。これらの障害には、慢性疾患に関連する貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少症、および骨髄異形成症候群が含まれる。血液細胞生産の障害、例えば骨髄異形成症候群およびいくつかの形態の再生不良性貧血は、骨髄でのアポトーシス細胞死の増加と関連している。これらの障害は、アポトーシスを促進する遺伝子の活性化、間質細胞または造血生存因子の後天性欠乏症、または毒物および免疫応答調節因子の直接的な作用によって生じる可能性がある。細胞死に関係がある、一般的な２つの障害には、心筋梗塞と脳卒中がある。どちらの障害においても、血流の急激な減少事象によって生じる虚血中心部位の細胞が、壊死の結果、急速に死んでいくと考えられている。しかしながら、虚血中心部位の外側では、細胞は、より長い期間にわたって死に、形態学的にはアポトーシスによって死んでいるように見える。

【0097】

他の使用方法
他の実施形態またはさらなる実施形態では、抗アポトーシス性の本発明の化合物は、望ましくない細胞死に関係する、そのような全ての障害の治療に使用される。

【0098】

本明細書に記載の化合物で治療される免疫疾患のいくつかの例としては、これらには限定されないが、器官移植拒絶反応、関節炎、狼瘡、ＩＢＤ、クローン病、喘息、多発性硬化症、糖尿病などが挙げられる。

【0099】

本明細書に記載の化合物で治療される神経障害のいくつかの例としては、これらには限定されないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、遺伝性アミロイド性脳出血（オランダ型）、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイドニューロパチー、マックル・ウェルズ症候群、特発性骨髄腫、マクログロブリン血症関連骨髄腫、家族性アミロイドポリニューロパチー、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイドーシス、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症型糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイド、甲状腺の髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、家族性アミロイドポリニューロパチー、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、牛海綿状脳症、プリオン介在性疾患、およびハンチントン病が挙げられる。

【0100】

本明細書に記載の化合物で治療される内分泌疾患のいくつかの例としては、これらには限定されないが、糖尿病、甲状腺機能低下症、下垂体機能低下症、副甲状腺機能低下症、性腺機能低下症などが挙げられる。

【0101】

本発明の化合物で治療または予防される心血管障害（例えば、炎症性障害）の例としては、これらには限定されないが、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患、非冠血管疾患、例えば細動脈硬化症、小血管疾患、ネフロパチー、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧、肺気腫および慢性肺疾患、または介入的治療（「手技上の血管の外傷」）、例えば、血管形成術後の再狭窄、シャント、ステント、人工の移植片もしくは天然の切除した移植片の配置、カテーテル、弁または他の植え込み型装置の留置に不随する心血管状態が挙げられる。好ましい心血管障害には、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、および脳卒中が含まれる。

【実施例1】

【0102】

ペプチド１〜１７の合成
図１２〜１５に示すように、ペプチド１〜１７を合成した。ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置を使用し、ＲｉｎｋアミドまたはＫｎｏｒｒ樹脂（負荷量＝０．４ｍｍｏｌｅ／ｇ）上で、標準的なＦｍｏｃ固相化学により、樹脂に結合した遊離アミンペプチドを合成した。標準的なＦｍｏｃアミノ酸（および４−ペンテン酸）（５等量）を、ＨＢＴＵ（４．９等量）により、６％のＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ溶液中で１５分間、活性化し、樹脂に結合した遊離アミンに添加した。得られた混合物を６０分間撹拌した。カップリング効率は、ニンヒドリン試験で監視した。ＮＭＰに溶解した２０％のピペリジンで処理することにより（２×２０分）、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。樹脂を含有しているビス−オレフィンペプチドを、ＤＭＦおよびＤＣＭのそれぞれでしっかりと洗浄し、真空下で一晩乾燥した。

【0103】

樹脂に結合したビス−オレフィン上でのマイクロ波を使った閉環複分解反応は、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ａｒｏｒａ，"Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ： Ｓｕｒｐｒｉｓｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｈｅａｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｕｂｂｓ Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，"Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．８：５８２５−８（２００６）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ジクロロエタンに溶解したホベイダ−グラブス触媒（０．１５等量）を使って行った。反応混合物に、最大出力２５０Ｗ、１２０℃、ランプ時間５分、および１０分維持、の設定で照射した。樹脂に結合したペプチドを、切断用混合液（ＣＦ_３ＣＯ_２Ｈ：Ｈ_２Ｏ：トリイソプロピルシラン、９５：２．５：２．５）で１．５時間処理することで樹脂から切断し、その後逆相ＨＰＬＣで精製した。

【0104】

本発明のペプチドのいくつかを、液体クロマトグラフィー−質量分析法（「ＬＣＭＳ」）で試験した。ＬＣＭＳのデータはＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズの装置を使って得た。ＬＣＭＳの結果を表２に示す。

【0105】

（表２）ペプチド１〜１２の質量分析の結果（ＬＣ／ＭＳＤ（ＸＣＴ）エレクトロスプレートラップ）

【0106】

表２において、^＃はリシンおよびグルタミン酸残基間のラクタム架橋を表し、^＊は、［Ｍ］^２＋を、^＊＊は［Ｍ］^３＋を表す。

【0107】

以下に示す、蛍光標識した型の本発明の例示的なＨＢＳペプチドも調製した。

【実施例2】

【0108】

円二色性分光法
図９に示すＣＤスペクトルは、温度調節器を備えたＡＶＩＶ ２０２ＳＦ ＣＤ分光計で、１ｍｍ長のセルを使用し、５ｎｍ／分のスキャン速度で記録した。１０回スキャンしたスペクトルを、試料に使用したのものと同様の条件から減算した基準値で平均した。試料を１０％のトリフルオロエタノールを含有する０．１×リン酸緩衝食塩水（１３．７ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのリン酸塩、０．２７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）、この時のペプチドの最終濃度は５０〜１００μＭ、の中で調製した。折り畳まれていないペプチドの濃度は、６．０Ｍグアニジン塩酸塩水溶液中、２７６ｎｍでのチロシン残基のＵＶ吸収により決定した。各ペプチドのヘリックス含有量は、アミノ酸の数について補正された２２２ｎｍにおける平均残基ＣＤ、［θ］_２２２（ｄｅｇ ｃｍ^２ ｄｍｏｌ^−１）から決定した。らせん性パーセントは、比［θ］_２２２／［θ］_ｍａｘから計算した。式中、［θ］_ｍａｘは（−４４０００＋２５０Ｔ）（１−ｋ／ｎ）、ｋは４．０、およびｎは残基の数である。ＨＢＳヘリックスのθ_ｍａｘの計算に関する詳細については、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，"Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｒｅｌｅｖａｎｔ Ｓｈｏｒｔ α−Ｈｅｌｉｃｅｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ａ Ｍａｉｎ−ｃｈａｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ，"Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：９２４８−５６（２００６）を参照されたい。

【実施例3】

【0109】

蛍光偏光法で決定した、Ｒａｓタンパク質に対するペプチドの親和性
Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグ化Ｒａｓ_{１−１６６}に対するペプチドの相対的な親和性を、フルオレセインで標識したＳＯＳペプチドである、７^{ｕｎｃｏｎ}−Ｆｌｕ、ＨＢＳ７−ＦｌｕおよびＨＢＳ７^ｍｕｔ−Ｆｌｕを使って、蛍光偏光法に基づく結合アッセイによって決定した。偏光実験は、ＤＴＸ８８０マルチモード検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用し、２５℃で、励起および放出波長をそれぞれ４８５および５２５ｎｍとして行った。試料は全て、９６ウェルプレート内で、０．１％プルロニックＦ−６８（Ｓｉｇｍａ）中で調製した。濃度を徐々に高くした（０ｎｍ〜７５０μＭ）Ｒａｓ_{１−１６６}タンパク質を、Ｒａｓ_{１−１６６}透析緩衝液に溶解したフルオレセイン標識ＳＯＳペプチド（１５ｎＭ）溶液に加えることにより、飽和結合曲線を得た。この結合曲線から得られたＩＣ_５０値を式（１）に当てはめ、Ｓｏｓ／Ｒａｓ_{１−１６６}複合体の解離定数（Ｋ_Ｄ）を計算した。各ペプチドに関して報告した結合親和性（Ｋ_Ｄ）の値は、３回の独立した実験の平均値であり、実験データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０のＳ字型用量−反応非線形回帰モデルに当てはめることによって決定したものである。結果を図１０に示す。
Ｋ_Ｄ１＝（Ｒ_Ｔ×（１−Ｆ_ＳＢ）＋Ｌ_ＳＴ×Ｆ_ＳＢ^２）／Ｆ_ＳＢ−Ｌ_ＳＴ （１）
式中、
Ｒ_ＴはＲａｓ_{１−１６６}タンパク質の総濃度であり、
Ｌ_ＳＴはＳｏｓ蛍光ペプチドの総濃度であり、
Ｆ_ＳＢは、結合したＳｏｓ蛍光ペプチドの画分である。

【実施例4】

【0110】

本発明のペプチドによる、Ｓｏｓ介在性グアニンヌクレオチド交換活性の阻害に関するアッセイ
ｍａｎｔＧＤＰを使ったヌクレオチド交換アッセイを、Ａｈｍａｄｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２、およびＭａｒｇａｒｉｔ ｅｔ ａｌ．，２００３に記載されているように行った。簡単に説明すると、精製したＲａｓ（ヒトＨａ−Ｒａｓの１番目から１６６番目の残基）を、モル等量のｍａｎｔＧＤＰと共に、４ｍＭのＥＤＴＡ存在下で、交換緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．４］、５０ｍＭのＮａＣｌ）中でインキュベートした。反応を１４ｍＭのＭｇＣｌ_２で停止させた。１μＭのＲａｓ・ｍａｎｔＧＤＰを、２５μＭのペプチド、５μＭのＳｏｓ−Ｃａｔおよび１００μＭの未標識ＧＤＰを添加した反応緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．４］、１４ｍＭのＭｇＣｌ_２、および５０ｍＭのＮａＣｌ）中でインキュベートすることによって、ヌクレオチドの解離速度を測定した。データを、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）プログラムを使って、単一の指数関数的減衰関数に当てはめた。結果を図４に示す。

【実施例5】

【0111】

本発明のペプチドによるＲａｓ／Ｓｏｓの阻害に関するＧＳＴアッセイ
ＧＳＴ−Ｒａｓ融合タンパク質（１μＭ）、Ｈｉｓタグ化Ｓｏｓタンパク質（１μＭ）および表示した量のＨＢＳ７を１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１％のトリトンＸ−１００）に加え、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、結合緩衝液にグルタチオン−セファロース４Ｂビーズを再懸濁した１：１スラリーを６０μｌずつ、各試料に加えた。試料をさらに２０分間、４℃でインキュベートした。次いで、ビーズをペレット状にし、結合緩衝液で５回洗浄し、その後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の試料緩衝液に再懸濁した。タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ニトロセルロースに移した。ウェスタンブロットを抗Ｈｉｓ抗体および抗ＧＳＴ抗体で探索し、ＳｏｓおよびＲａｓをそれぞれ検出した。結果を図６に示す。

【実施例6】

【0112】

Ｒａｓ活性化アッセイ
ＲＢＤプルダウンアッセイを、Ｂｏｙｋｅｖｉｓｃｈ Ｓ， Ｚｈａｏ Ｃ， Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｈ， Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｏｕ Ｐ， Ｈａｌｅｇｏｕａ Ｓ， Ｋｕｒｉｙａｎ Ｊ， Ｂａｒ−Ｓａｇｉ Ｄ．"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｂｙ Ｓｏｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ"Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｎｏｖ ７；１６（２１）：２１７３−９に記載されているように、および本明細書に記載したように行った。ＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ融合タンパク質を、０．５ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で５時間誘導することによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させた。細胞溶解物をグルタチオンアガロースビーズと共に１時間、４℃でインキュベートすることで、発現した融合タンパク質を単離した。ＨｅＬａ細胞をコンフルエントに達するまで、血清飢餓状態で４時間成長させ、次いで７５μＭのペプチドと共にさらに１２時間インキュベートした。ＳｏｓＣａｔ−ＣＡＡＸ（ＨＲａｓのＣＡＡＸボックスを含むＳｏｓＣａｔ）を使った実験用には、飢餓の２４時間前に、ＨｅＬａ細胞をＨＡタグ化ＳｏｓＣＡＡＸで形質転換した。細胞を表示したペプチドで１２時間処理し、その後刺激した。１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを使い、表示した間隔、３７℃で刺激した後、細胞を、ＲＢＤ溶解緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１０ｍｇ／ｍｌのペプスタチン、５０ｍＭのＮａＦ、１％のアプロチニン、１０ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０ｍＭのベンズアミジン、１０ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤、１％のＮＰ４０、および０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム含有）中で溶解した。次いで溶解物を、アガロースビーズに固定した組換えＧＳＴ−Ｒａｆ−ＲＢＤ（２０μｇ）と、１．５時間、４℃でインキュベートした。複合体を遠心分離によって回収し、ＲＢＤ溶解緩衝液で６回洗浄した。結合したタンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−１２．５％ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に移した。タンパク質をＳｏｓＣａｔＣＡＡＸに対する抗ＨＡ（１２ＣＡ５；１：１０，０００）一次抗体または抗Ｒａｓ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：１０，０００）一次抗体と、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ヤギ抗マウス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、１：１０，０００）二次抗体と共にブロッティングし、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬｉＣｏｒ）で可視化することによって検出した。結果を図８に示す。

【実施例7】

【0113】

ＥＧＦＲおよびＥｒｋ活性化アッセイ
マイトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路は、広く分布している、真核細胞の制御機構である（図６）。ＭＡＰＫは、細胞代謝、運動生、生存、アポトーシス、および分化などの活性の制御に関わっている。ＳｏｓによるＲａｓの活性化はこのシグナル伝達経路の開始と強く結びついており、最終的に、ＩＥＧ（最初期遺伝子、ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ）プロモーター中の血清応答配列によって制御される遺伝子など、様々な遺伝子の発現を誘導する。Ｅｒｋおよび／またはＥＧＦＲの活性化阻害能を決定するアッセイで、ペプチドを試験した。細胞を、上述したように、並びに、Ｂｏｙｋｅｖｉｓｃｈ Ｓ， Ｚｈａｏ Ｃ， Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｈ， Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｏｕ Ｐ， Ｈａｌｅｇｏｕａ Ｓ， Ｋｕｒｉｙａｎ Ｊ， Ｂａｒ−Ｓａｇｉ Ｄ．"Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｂｙ Ｓｏｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ"Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｎｏｖ ７；１６（２１）：２１７３−９およびＸｕ Ｌ， Ｌｕｂｋｏｖ Ｖ， Ｔａｙｌｏｒ ＬＪ， Ｂａｒ−Ｓａｇｉ Ｄ．"Ｆｅｅｄｂａｃｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ Ｒａｂｅｘ−５−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ"Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ． ２０１０ Ａｕｇ １０；２０（１５）：１３７２−７（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、処理、および溶解した。ＥＲＫ２およびリン酸化したＥＲＫの総レベルを、それぞれ、抗ＥＲＫ２（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１：１，０００）抗体およびホスホ−ＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：１，０００）抗体を使って検出した。ＥＲＫのリン酸化レベルをＯｄｙｓｓｅｙソフトウェアで定量し、ＥＲＫの総発現に対して正規化した。ＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲのレベルは、抗ＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）抗体およびｐＥＧＦＲ ｐＹ１０６８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体とブロッティングすることによって検出した。結果を図８に示す。

【実施例8】

【0114】

細胞取り込みアッセイ
ＨｅＬａ細胞をコンフルエントに近い（サブコンフルエントの）状態で、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れた、ガラス底の９６ウェルプレートに播種した。翌日、培地を、表示したように１μＭフルオレセイン（５−ＦＡＭ）のみを添加した、またはフルオレセインタグ化ペプチドを添加した培地と交換した。１２時間後、細胞を温ＰＢＳで２回洗浄し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡で直接観察した。

【実施例9】

【0115】

ＮＭＲ実験
Ｈｉｓ６−Ｒａｓ（１〜１６６）およびＳｏｓ−Ｃａｔ（５６４〜１０４９）の発現。Ｈｉｓ６タグ化ＨＲａｓ（残基１〜１６６）およびＨｉｓ６タグ化ＳｏｓＣａｔ（残基５５０〜１０５０）は、両方ともｐＰｒｏＥｘ ＨＴｂ発現ベクターに入っており、これらを、ＯＤ６００＝１．０に相当する細胞密度で、５００μＭのＩＰＴＧで誘導することにより、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、ＢＬ２１）内で発現させた。ペレットを、緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．６、２００ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２μＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１％のアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０ｍＭのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのダイズトリプシン阻害剤、および１０μｇ／ｍｌのぺプスタチン含有）に再懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ２００を使って超音波処理した。ポリヒスチジンタグ化タンパク質を含む清澄化した溶解物を、帯電したニッケル樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に４℃で１時間インキュベートした。樹脂を、５０ｍＭのイミダゾールを含む再懸濁緩衝液で５回洗浄した。タグ化タンパク質を、２００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質を、Ｈｉｓタグ化ＳｏｓＣａｔの場合には、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）および２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液に対して、およびＨｉｓタグ化Ｒａｓの場合には２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液に対して透析した。溶出されたタンパク質を、５，０００ｋＤ分子量で分画するＡｍｉｃｏｎ超遠心カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使って濃縮した。精製したタンパク質を液体Ｎ２中で素早く凍結し、さらに使用するまで−８０℃で保存した。

【0116】

^１Ｈ−^１５Ｎ ＨＳＱＣ ＮＭＲ実験用には、Ｈｉｓ−Ｒａｓ構築物を有するＢＬ２１細胞を、３７℃で、窒素^１５の唯一の供給源として^１５ＮＨ_４Ｃｌを添加したＭ９培地中で生育させた。Ｏ．Ｄ．が１．０の時点で、５００μＭのＩＰＴＧを使用し、１６℃で１６時間、タンパク質の生産を誘導した。タンパク質の精製および濃縮は、実施例５と同様に行った。Ｈｉｓ６タグ化Ｒａｓを組換えＨｉｓ６タグ化タバコＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、製造業者によるプロトコールに従って、一晩、４℃でインキュベートすることによって、Ｈｉｓ_６タグを除去した。チャージ済みのＮｉＮＴＡアガロースカラムに試料を負荷すると、タグが除去されたタンパク質はフロースルー画分に回収された。均一に^１５Ｎで標識されたＲａｓを、アミコン超遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使い、ＮＭＲ緩衝液（２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）に対して緩衝液交換し、１０％のＤ_２Ｏを添加した。凍結探針を備えた９００ＭＨｚの、Ｂｒｕｋｅｒ ４チャンネルＮＭＲシステムを使用して３０℃でデータを収集し、ＢｉｏＳｐｉｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）で分析した。スイッチ領域および非スイッチ領域の残基に対応する様々な共鳴の^１Ｈおよび^１５Ｎ核に関して観察された、平均化学シフトの差（ΔδＮＨ）を算出した。ＮＭＲ実験の結果を図５に示す。

【実施例10】

【0117】

ペプチドの設計
野生型のＳｏｓ_{９２９−９４４}α−Ｈ配列を起点として、Ｒａｓ／Ｓｏｓの阻害剤を設計した。ＨＢＳペプチドの溶解度を改善するために、さらに修飾を導入した。Ｒａｓ結合に含まれない位置に、帯電している残基を導入した。Ｒａｓ／Ｓｏｓ複合体の２つの個別の結晶構造（ＰＤＢコード：１ＮＶＷおよび１ＢＫＤ）について、コンピューターを使ってアラニンスキャニングを行い、α−Ｈヘリックスに含まれていて、ペプチド模倣物に組み込むことができる、他の重要な結合残基を決定した。加えて、野生型のα−Ｈ配列に含まれる非必須β−分岐残基（トレオニンなど）を好適な残基と置き換え、ヘリックス含量のより高いペプチドを得た（表１）。これは、そのような修飾がα−らせん性を向上させるだろうと仮定されたためである。

【0118】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し記載してきたが、そのような実施形態がほんの一例として提供されていることは当業者には明白であろう。当業者は本発明を逸脱することなく、多くの変形実施形態、変更実施形態、および置換実施形態を思いつくであろう。本発明を実施するにあたって、本明細書に記載されている本発明の実施形態の様々な代替策を用いることができることが理解されるべきである。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これら特許請求項の範囲に含まれる方法および構造ならびに均等物は、特許請求の範囲によって保護されるものと解釈される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]