特許 6241912 核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6241912

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キット

(51)【国際特許分類】

   G01T 1/161 20060101AFI20171127BHJP

   A61K 51/00 20060101ALI20171127BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20171127BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20171127BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20171127BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171127BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20171127BHJP

【ＦＩ】

   G01T1/161 CZNA

   A61K51/00

   C12M1/34 F

   C12M1/34 Z

   C07K16/28

   C12N15/00 C

   C12N15/00 A

   !C12P21/08

【請求項の数】4

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2013-91871(P2013-91871)

(22)【出願日】2013年4月25日

(65)【公開番号】特開2013-242308(P2013-242308A)

(43)【公開日】2013年12月5日

【審査請求日】2016年4月22日

(31)【優先権主張番号】特願2012-102732(P2012-102732)

(32)【優先日】2012年4月27日

(33)【優先権主張国】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 アメリカン・ケミカル・ソサイエティー，アナリティカル・ケミストリー，第８３巻，第２３号，第９１２３〜９１３０頁，平成２３年１１月１０日 （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２３）に発表

(73)【特許権者】

【識別番号】301032942

【氏名又は名称】国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人 千葉大学

(73)【特許権者】

【識別番号】512112389

【氏名又は名称】小林 典裕

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(74)【代理人】

【識別番号】100135781

【弁理士】

【氏名又は名称】西原 広徳

(72)【発明者】

【氏名】小高 謙一

(72)【発明者】

【氏名】入江 俊章

(72)【発明者】

【氏名】福村 利光

(72)【発明者】

【氏名】田所 裕之

(72)【発明者】

【氏名】小室 一成

(72)【発明者】

【氏名】荒野 泰

(72)【発明者】

【氏名】上原 知也

(72)【発明者】

【氏名】秋澤 宏行

(72)【発明者】

【氏名】小林 典裕

(72)【発明者】

【氏名】吉田 利通

(72)【発明者】

【氏名】吉田 恭子

(72)【発明者】

【氏名】廣江 道昭

【審査官】 亀澤 智博

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５１８６０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００９／００１２１９（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｔ １／１６１− １／１６６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

被検体に投与された標識から放射される放射線を被検体の体外から検出する放射線検出部と、前記放射線検出部で検出した検出データを記憶する記憶部と、前記記憶部に記憶されたデータを用いて各種制御処理を実行する制御部と、前記制御部から出力される出力データを表示する表示部とを備えた核医学診断装置の制御方法であって、
抗原の第１エピトープを認識する第１モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第１剤が標識された第１標識剤から放射される放射線と、前記抗原の前記第１エピトープとは異なる第２エピトープを認識する第２モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第２剤が標識された第２標識剤から放射される放射線とを、前記放射線検出部により検出する放射線検出工程と、
前記放射線検出部で検出した検出データを前記記憶部に記憶する記憶工程と、
前記記憶部の検出データから前記第１標識剤の集積量である第１集積量と前記第２標識剤の集積量である第２集積量とを比較し、この比較結果に基づいて被検体の状態を前記制御部で判定する判定工程と、
前記制御部から出力される判定結果を前記表示部に表示する表示工程とを有し、
前記第１剤の標識に用いられる第１標識と、前記第２剤の標識に用いられる第２標識とが、異なるエネルギーピークを有する放射性核種で構成され、
前記放射線検出工程は、前記第１標識と第２標識から放射される各放射線を同時またはエネルギーピーク別に取得する
核医学診断装置の制御方法。

【請求項2】

抗原の第１エピトープを認識する第１モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第１剤が標識された第１標識剤から放射される放射線と、
前記抗原の前記第１エピトープとは異なる第２エピトープを認識する第２モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第２剤が標識された第２標識剤から放射される放射線とを、投与された被検体の体外から検出する放射線検出部と、
前記放射線検出部で検出した検出データを記憶する記憶部と、
前記記憶部の検出データから前記第１標識剤の集積量である第１集積量と前記第２標識剤の集積量である第２集積量とを比較し、この比較結果に基づいて被検体の状態を判定する制御部と、
前記制御部から出力される判定結果を表示する表示部とを備え、
前記第１剤の標識に用いられる第１標識と、前記第２剤の標識に用いられる第２標識とが、異なるエネルギーピークを有する放射性核種で構成され、
前記放射線検出部は、前記第１標識と第２標識から放射される各放射線を同時またはエネルギーピーク別に取得する構成である
核医学診断装置。

【請求項3】

抗原の第１エピトープを認識する第１モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第１剤と、
前記抗原の前記第１エピトープとは異なる第２エピトープを認識する第２モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第２剤とを有し、
前記第１剤の標識に用いられる第１標識と、前記第２剤の標識に用いられる第２標識とが、異なるエネルギーピークを有する放射性核種で構成され、
標識した前記第１剤と、標識した前記第２剤とを被検体に投与し、
前記第１標識と第２標識から放射される各放射線を同時またはエネルギーピーク別に取得し、
前記第１剤が前記抗原に集積した第１集積量と、前記第２剤が前記抗原に集積した第２集積量とを比較することで、前記被検体の診断を可能とする
診断剤キット。

【請求項4】

前記抗原はテネイシンＣであり、
前記第１モノクローナル抗体は、前記第１エピトープとして前記テネイシンＣのＥＧＦ様配列部分を認識する抗テネイシンＣモノクローナル抗体４Ｆ１０であり、
前記第２モノクローナル抗体は、前記第２エピトープとして前記テネイシンＣのフィブロネクチンＩＩＩ様配列部分を認識する抗テネイシンＣモノクローナル抗体４Ｃ８である
請求項３記載の診断剤キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この発明は、例えば標識された抗体を検出するような核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、診断剤キット、および標識抗テネイシンＣ抗体一本鎖Ｆｖフラグメント（以下、一本鎖ＦｖフラグメントをｓｃＦｖともいう）に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外マトリクス糖たんぱくの１つであるテネイシンＣ（以下、ＴＮＣともいう）は、正常組織では発現しないが、創傷治療や腫瘍細胞浸潤、炎症に伴う組織再構築において高い発現が認められる。このＴＮＣに対して、本発明者らは、いくつかのモノクローナル抗体を提案している（特許文献１、２参照）。また、他にも、ＴＮＣに対するモノクローナル抗体が提案されている（特許文献３参照）。

【0003】

一方、放射性薬剤を血液中に注射して診断できるシングルフォトンＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＳＰＥＣＴ）が用いられている。このＳＰＥＣＴ装置を用いれば、非侵襲的に体外診断することができる。

【0004】

しかし、ＳＰＥＣＴ装置は、定量性のある評価ができないという問題点を有していた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第３６４６１５９号

【特許文献2】特開２００４−２１７５４６号

【特許文献3】特開２００８−５１８６０９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

この発明は、上述の問題に鑑みて、定量的に評価できる核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、診断剤キット、および標識抗テネイシンＣ抗体ｓｃＦｖフラグメントを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

この発明は、被検体に投与された標識から放射される放射線を被検体の体外から検出する放射線検出部と、前記放射線検出部で検出した検出データを記憶する記憶部と、前記記憶部に記憶されたデータを用いて各種制御処理を実行する制御部と、前記制御部から出力される出力データを表示する表示部とを備えた核医学診断装置の制御方法であって、抗原の第１エピトープを認識する第１モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第１剤が標識された第１標識剤から放射される放射線と、前記抗原の前記第１エピトープとは異なる第２エピトープを認識する第２モノクローナル抗体またはその機能的フラグメントである第２剤が標識された第２標識剤から放射される放射線を、前記放射線検出部により検出する放射線検出工程と、前記放射線検出部で検出した検出データを前記記憶部に記憶する記憶工程と、前記記憶部の検出データから前記第１標識剤の集積量である第１集積量と前記第２標識剤の集積量である第２集積量とを比較し、この比較結果に基づいて被検体の状態を制御部で判定する判定工程と、前記制御部から出力される判定結果を表示部に表示する表示工程とを有し、前記第１剤の標識に用いられる第１標識と、前記第２剤の標識に用いられる第２標識とが、異なるエネルギーピークを有する放射性核種で構成され、前記放射線検出工程は、前記第１標識と第２標識から放射される各放射線を同時またはエネルギーピーク別に取得する核医学診断装置の制御方法であることを特徴とする。またこの発明は、前記核医学診断装置、および前記核医学診断装置の制御方法に用いる診断剤キットとすることができる。

【発明の効果】

【0008】

この発明により、定量的に評価できる核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キットを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ＳＰＥＣＴ装置の構成と動作の説明図。

【図2】ＳＰＥＣＴ装置の表示画像を説明する説明図。

【図3】４Ｃ８および４Ｆ１０のｓｃＦｖ作製工程の概略説明図。

【図4】２核種同時標識したテネイシンＣと評価結果の説明図。

【図5】実施例２，３での２核種同時標識したテネイシンＣと評価結果の説明図。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明者らは、鋭意研究の結果、１つの抗原に対して異なるエピトープを認識する複数種類の抗体を用い、定量評価する方法を発明した。この定量評価は、複数種類の抗体の各集積量を比較するものである。比較の方法は、除算により比を求める、減算により差を求めるなど、適宜の方法が可能であるが、比を求める方法が好ましい。比を求めることで、投与量による数量差の影響を受けずに定量評価することができる。
また、本発明者らは、対象となる抗原の１つであるテネイシンＣ（ヒトテネイシンＣ）について、異なるエピトープを認識する複数種類の抗テネイシンＣ抗体（抗ヒトテネイシンＣ抗体）におけるｓｃＦｖフラグメントを発明し、このｓｃＦｖの標識化にも成功した。
すなわち、抗ＴＮＣ抗体４Ｆ１０ＴＴに由来するｓｃＦｖのＣ末端配列を改変してＶＨ−ｌｉｎｋｅｒ−ＶＬ−Ｆｌａｇ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓはメルカプト基を有する）とし、遺伝子工学的手法によりラジオアイソトープによる標識が可能な分子を２種類（４Ｆ１０ＴＴと４Ｃ８ＭＳ）作製した。
ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＨ鎖およびＬ鎖のドメイン（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ）の遺伝子をクローニングし、これらをｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲに付すことによりリンカー配列を介して連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を構築した。これを発現ベクターにサブクローニングしたのち大腸菌に導入して、可溶型ｓｃＦｖタンパク質を調製した。ＳｃＦｖ抗体の大量合成を行った。
また、キレート（ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＥＤＴＡ）を作製し、ｓｃＦｖに付加し、インジウム−１１１を用い標識した。

【0011】

以下、この発明の一実施形態を図面と共に説明する。
図１は、核医学診断装置の一種であるＳＰＥＣＴ装置１の構成と動作を説明する説明図であり、図１（Ａ）がブロック図、図１（Ｂ）がフローチャートである。
図１（Ａ）に示すように、ＳＰＥＣＴ装置１は、放射線検出部となるガンマカメラ２、記憶部となるデータ記憶部３、制御部６、および表示部となる入出力部７により構成されている。

【0012】

ＳＰＥＣＴ装置１のガンマカメラ２は、被検体（図示せず）に静脈内投与された第１診断剤８および第２診断剤９から発生したγ線を検出する。ここで、第１診断剤８および第２診断剤９は、１つの抗原に対して異なるエピトープを認識する標識化モノクローナル抗体または標識化モノクローナル抗体フラグメントである。また、第１診断剤８と第２診断剤９は、セットにした診断剤キットとして提供することができ、第１診断剤８と第２診断剤９を産生する材料等をセットにして診断剤キットとすることもできる。エネルギーピークの異なる核種により前記第１診断剤８と前記第２診断剤９が標識されている場合、ガンマカメラ２は、両核種から放出されるγ線を同時に検出するか、または、エネルギーピーク別に第１診断剤８によるγ線と第２診断剤９によるγ線を別々に検出する。同時検出の場合は、後にエネルギーピークで検出データを分離すればよく、別々の検出の場合は第１診断剤８によるγ線だけを検出してから第２診断剤９によるγ線だけを検出するなど時間差で検出して検出データを分離すればよい。

【0013】

データ記憶部３は、ガンマカメラ２が検出したγ線検出データをデータ５として蓄積する。このデータ５には、他にも、病期を判定するための病期判定基準データ、効果的な治療を判定するための効果的治療判定データなど、適宜のデータを記憶している。また、データ記憶部３は、各種のデータ５に加えて、各種のプログラム４も記憶している。制御部６は、データ記憶部３に蓄積されているγ線検出データを読み出し、画像再構成の実行と解析、及びこれらの演算結果の入出力部７への表示などを実行する。これにより、ＳＰＥＣＴ装置１は、γ線を放射する核種の３次元分布像を得ることができ、任意の断面での断層画像を入出力部７に表示することができる。

【0014】

図１（Ｂ）は、データ記憶部３のプログラム４に従って、制御部６が異なるエピトープに対する標識のデータを分離収集してそれぞれの断層画像を表示する処理のフローチャートである。この処理は、ＳＰＥＣＴ装置１の制御部６が実行するが、これに限らず、別途のコンピュータにデータ記憶部３に蓄積したγ線検出データを伝送し、コンピュータの制御部６が実行することもできる。

【0015】

まず、制御部６は、データ群設定処理を実行し、データ群に分離する条件設定と変数ｉの最大値ｉ_ｍａｘを決定する（ステップＳ１）。データ群の分離は、検出するγ線のエネルギー量によって実行することができる。

【0016】

例えば、図２（Ａ）のエネルギーピークのグラフに示すように、^１１１Ｉｎ標識ｓｃＦｖ_４Ｆ１０によるエネルギーピークは、２４５ＫｅＶ付近に現れ、^９９ｍＴｃ標識ｓｃＦｖ_４Ｃ８によるエネルギーピークは、１４０ＫｅＶ付近に現れる。このため、２４５ＫｅＶ近辺のエネルギーピークを有するγ線検出データを第１標識化抗体（^１１１Ｉｎ標識ｓｃＦｖ_４Ｆ１０）のデータとし、１４０ＫｅＶ近辺のエネルギーピークを有するγ線検出データを第２標識化抗体（^９９ｍＴｃ標識ｓｃＦｖ_４Ｃ８）のデータとして分離できる。この２種類で行う場合、ｉ_ｍａｘは「２」とする。

【0017】

なお、例えば図２（Ｂ）の断層画像１０に示す関心領域１１を設定するために別途のγ線検出データを用いる場合は、ｉｍａｘを「３」とするとよい。この場合、例えば^１１１Ｉｎ標識ｓｃＦｖ_４Ｆ１０と^９９ｍＴｃ標識ｓｃＦｖ_４Ｃ８の同時投与の被検体をＳＰＥＣＴ装置１でスキャンしてデータ記憶部３にデータ蓄積した後（放射性核種が十分半減した後）に、追加で^９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩを被検体に注射し、再度ＳＰＥＣＴ装置１でスキャンして先のデータと分けてデータ蓄積しておくとよい。

【0018】

制御部６は、変数ｉを初期化して「１」とし（ステップＳ２）、データ記憶部３から第ｉデータを収集する処理を実行する（ステップＳ３）。例えば、第１データであれば１回目のγ線検出データのうち２４５ＫｅＶ付近のエネルギーピークを有するγ線検出データを収集する、第２データであれば１回目のγ線検出データのうち１４０ＫｅＶ付近のエネルギーピークのγ線検出データを収集する、第３データであれば２回目のγ線検出データを収集するといったように、ステップＳ１のデータ群設定処理で設定された内容に従った収集を行う。
制御部６は、第ｉデータの断層画像を作成し（ステップＳ４）、変数ｉが最大値ｉ_ｍａｘになるまで（ステップＳ５：Ｎｏ）、ステップＳ３〜Ｓ４を繰り返す。

【0019】

変数ｉが最大値ｉ_ｍａｘになると（ステップＳ５：Ｙｅｓ）、制御部６は、関心領域１１の設定を受け付ける関心領域設定処理を実行する（ステップＳ７）。この設定は、入出力部７による操作者の操作入力によって定められる。また、関心領域１１の設定は、関心領域設定用に取得されたγ線検出データ（例えば^９９ｍＴｃ−ＭＩＢＩのデータ）により実行する、あるいは比較用のデータ（^１１１Ｉｎ標識ｓｃＦｖ_４Ｆ１０や^９９ｍＴｃ標識ｓｃＦｖ_４Ｃ８のデータ）により実行するなど、適宜のデータにより実行するとよい。

【0020】

制御部６は、図２（Ｃ）の並列表示断層画像１５に示すように、比較すべき断層画像１６，１７を入出力部７に並列表示する（ステップＳ８）。図示の例では、第１標識化抗体（^１１１Ｉｎ標識ｓｃＦｖ_４Ｆ１０）による断層画像１６を左側に、同じ断面での第２標識化抗体（^９９ｍＴｃ標識ｓｃＦｖ_４Ｃ８）による断層画像１７を右側に表示している。両断層画像１６，１７には、関心領域１１も表示されている。断層画像１６，１７の下にあるデータは、関心領域１１のピクセル数（ＡＲＥＡ．ｐｘ１）、関心領域１１の平均カウント数（ＡＶＥ．ｃｎｔ）、関心領域１１のカウント数（ＴＯＴＡＬ．ｃｎｔ）、関心領域１１の最大のカウント数（ＭＡＸ．ｃｎｔ）、最大のカウント数の位置（ＭＡＸ（Ｘ，Ｙ））を示しており、上段が断層画像１６のデータ、下段が断層画像１７のデータを示している。この中でも、カウント数１８，１９が次に説明するように重要になる。

【0021】

制御部６は、カウント数１８とカウント数１９の比を演算することで抗体比を演算し、演算結果を入出力部７に表示する（ステップＳ９）。この演算結果の表示は、比率を数字で表示する、比率から判定した被検体の状態を表示するなど、適宜の表示とすることができる。被検体の状態を表示する場合には、例えば病期判定基準データに基づいて判定した被検体の病期、効果的治療判定データに基づいて判定した被検体にとって効果的と考えられる治療など、適宜の状態とすることができる。

【0022】

図２（Ｄ）は、判定基準の例を示す基準データ構成図であり、図２（Ｅ）は、判定結果の表示例を示す画面構成図である。
図２（Ｄ）の例では、心筋梗塞に関する病期と推奨治療法を判定する基準データ５ａ（病期判定基準データ）を示している。４Ｃ８と４Ｆ１０を予め定めた割合（この実施例では同量）ずつ投与した場合の４Ｃ８／４Ｆ１０比が１．４０以上であれば、病期はＡで、推奨治療法として顆粒球コロニー刺激因子治療を開始すべきと判定する。４Ｃ８／４Ｆ１０比が１．２から１．３９であれば、病期はＢで、推奨治療法として顆粒球コロニー刺激因子治療が可能であり、β遮断薬治療を優先すべきと判定する。４Ｃ８／４Ｆ１０比が１．１９以下であれば、病期はＣで、推奨治療法として顆粒球コロニー刺激因子治療は不適で、β遮断薬治療をすべきと判定する。

【0023】

図２（Ｅ）は、抗体比表示画面２０に、抗体比表示部２１、病期表示部２２、推奨治療法表示部２３を備えている。抗体比表示部２１は、抗体比を表示する部分であり、図示の例では４Ｃ８／４Ｆ１０比を表示している。病期表示部２２は、抗体比と前記基準データ５ａをもとに判定した病期を表示し、推奨治療法表示部２３は、抗体比と前記基準データ５ａをもとに判定した推奨治療法を表示する。

【0024】

以上のようにして、体外から定量的に評価でき、病期や推奨治療法を判定できるＳＰＥＣＴ装置１とそのプログラム４を提供することができる。

【実施例1】

【0025】

次に、具体的な実施例として、実験に使用した抗体および抗体フラグメントの作製方法と標識、および結果を説明する。実施例では、抗原としてテネイシンＣを用いている。また、このテネイシンＣに対するモノクローナル抗体やそのフラグメントは、第１診断剤８や第２診断剤９となるものである。なお、本発明は、この実施例に限定されず、様々な形態をとることができる。

【0026】

≪モノクローナル抗体、ハイブリドーマ≫
本実施例では、抗原としてテネイシンＣを用いる場合のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）について説明する。このモノクローナル抗体は、１つの抗原の異なるエピトープを認識するものであれば良く、本実施例では、テネイシンＣの選択的スプライシング部位のＮ末端側を認識する抗テネイシンＣモノクローナル抗体４Ｆ１０ＴＴ（以下、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０という）と、テネイシンＣ分子内のフィブロネクチンＩＩＩ型反復配列のＢＣＤ配列部分を認識する抗テネイシンＣモノクローナル抗体４Ｃ８ＭＳ（以下、抗ＴＮＣ−４Ｃ８という）を用いる。

【0027】

抗ＴＮＣ−４Ｆ１０は、特許第３８３７３７４号に開示されている方法により、平成１４年１０月１０日付で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−１９０６３として寄託されたハイブリドーマ細胞を用いて産生できる。

【0028】

抗ＴＮＣ−４Ｃ８は、特許第３６４６１５９号に開示されている方法を用いて、２０００年１０月４日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７０として寄託されたハイブリドーマα−ｈＴＮＣ／Ｂ−Ｄにより産生した。

【0029】

≪モノクローナル抗体フラグメント≫
モノクローナル抗体は、低分子化することが好ましいため、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、またはｓｄＦｖといった適宜の抗体フラグメントとすることができる。以下、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖフラグメントの製作方法について説明する。

【0030】

≪Ｆａｂの製作≫
Ｆａｂフラグメントは、モノクローナル抗体をパパインで分解することで、Ｎ末端側の産物として得られる。
抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のＦａｂフラグメント（以下、Ｆａｂ_４Ｆ１０という）は、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０をパパインで分解して産生する。
抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＦａｂフラグメント（以下、Ｆａｂ_４Ｃ８という）は、抗ＴＮＣ−４Ｃ８をパパインで分解して産生する。
なお、Ｆａｂ_４Ｆ１０、Ｆａｂ_４Ｃ８といった抗ＴＮＣモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントを、まとめて抗ＴＮＣ−Ｆａｂという。

【0031】

≪ｓｃＦｖの製作≫
さらに低分子化した抗体を得るため、抗体一本鎖Ｆｖフラグメント（以下、ｓｃＦｖという）を作製する。ｓｃＦｖは、抗体を構成するＨ鎖とＬ鎖の可変部ドメイン（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ）を可動性に富むリンカーペプチドで連結した人工の抗体フラグメントであり、分子量は２５，０００〜２８，０００程度、すなわちＩｇＧの約１／６、Ｆａｂの約１／２である。

【0032】

本発明者らは、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のｓｃＦｖフラグメント（以下、ｓｃＦｖ_４Ｆ１０という）と、抗ＴＮＣ−４Ｃ８のｓｃＦｖフラグメント（以下、ｓｃＦｖ_４Ｃ８という）の作製に成功した。ｓｃＦｖ_４Ｆ１０とｓｃＦｖ_４Ｃ８の作製方法は、いずれも共通しており、以下に具体的に説明するとおりである。なお、ｓｃＦｖ_４Ｆ１０とｓｃＦｖ_４Ｃ８といった抗ＴＮＣモノクローナル抗体のｓｃＦｖフラグメントを、まとめて抗ＴＮＣ−ｓｃＦｖという。

【0033】

ＳｃＦｖ遺伝子は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからＨ鎖およびＬ鎖の可変部ドメイン（Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）の遺伝子をクローニングして、これらを連結することにより得られる。そこで、４Ｃ８および４Ｆ１０抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ遺伝子をクローニングし、その塩基配列並びにアミノ酸配列を決定した。
抗体可変部の遺伝子（Ｖ遺伝子）をクローニングするためには、抗体産生ハイブリドーマから得られるｍＲＮＡを鋳型として、その両端の塩基配列に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行うのが効果的である。Ｖ遺伝子の３’末端は、定常部の遺伝子（Ｃ遺伝子）と隣接するが、Ｃ遺伝子はそのサブクラスに応じたほぼ一定の塩基配列を示す。したがって、ｆｏｒｗａｒｄプライマーとしては、Ｃ遺伝子上に相補性を示すオリゴＤＮＡを用いることができる。しかし、５’末端側の枠組み領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）あるいは、さらに上流のリーダー配列は大きな多様性を示すため、ｂａｃｋプライマーの設計には特別な配慮が必要で、このため抗体Ｖ遺伝子のＰＣＲクローニングは必ずしも容易でない。
このように、目的遺伝子の５’側に未知の塩基配列を有する遺伝子のクローニングには、５’ＲＡＣＥ（５’ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）（Ｆｒｏｈｍａｎ ＭＡ， Ｄｕｓｈ ＭＫ， Ｍａｒｔｉｎ ＧＲ． Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡｓ ｆｒｏｍ ｒａｒｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ： ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８８； ８５： ８９９８−９００２．）が有用である。そこで、まず本法により４Ｃ８および４Ｆ１０抗体のＶ_Ｈ遺伝子のクローニングを行った。以下、図３（Ａ）の５’ＲＡＣＥによる抗体Ｖ_Ｈ遺伝子クローニングの概略工程説明図に沿って説明する。
＜Ｖ_Ｈのクローニング＞
まず、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０および抗ＴＮＣ−４Ｃ８の両抗体を産生する各ハイブリドーマ株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９０６３として寄託されたハイブリドーマ細胞、ＦＥＲＭ Ｐ−１８０７０として寄託されたハイブリドーマα−ｈＴＮＣ／Ｂ−Ｄ）より全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を作用させ、ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。このとき、抗体Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを選択的に得るために、定常部サブクラスに特異的なプライマー（ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ：ＧＳＰ−１）を用いた。

【0034】

ついで、調製したｃＤＮＡの３’末端にｄＣＴＰ存在下、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてポリＣ配列を付加し、このポリＣ配列に特異的なプライマー（ＡＡＰ）と、Ｃ遺伝子上、ＧＳＰ−１より５’側に相補性を示すＧＳＰ−２を用いるＰＣＲを行った。

【0035】

得られた遺伝子断片を、ＡＵＡＰ（５’末端に制限酵素認識部位を導入するためのプライマー）およびＧＳＰ−３（ＧＳＰ−２よりさらに５’側に相補性を示す）を用いるｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに付した。

【0036】

得られたＤＮＡ断片を、各々ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩベクターにサブクローニングした後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株にエレクトロポーレーション法により導入した。
形質転換体からプラスミドを単離し、ジデオキシ法によりｓｃＦｖ遺伝子の塩基配列を解析した。

【0037】

以上の方法で、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０および抗ＴＮＣ−４Ｃ８のいずれについてもＶ_Ｈ遺伝子をクローニングすることができた。塩基配列からアミノ酸配列を推定し、Ｋａｂａｔの抗体シークエンスデータベース（Ｋａｂａｔ ＥＡ， Ｗｕ ＴＴ， Ｐｅｒｒｙ ＨＭ， Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ ＫＳ， Ｆｏｅｌｌｅｒ Ｃ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ： Ｕ． Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ； １９９１．）と比較して、各抗体のＣＤＲを決定した。

【0038】

＜Ｖ_Ｌのクローニング＞
Ｖ_Ｌ遺伝子のクローニングに際して、Ｖ_Ｈのクローニングに使用した５’ＲＡＣＥ法では、困難を伴った。これは、ＭＯＰＣ−２１由来ミエローマ細胞（例えば、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１やＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３など）を細胞融合のパートナーとしたハイブリドーマから得られるＲＮＡには、ミエローマに由来するκ鎖のｍＲＮＡが混在することに起因している。そこで、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０および抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＶ_Ｌ遺伝子については、“ユニバーサルプライマー”を用いるクローニングを試み、クローニングに成功した。

【0039】

Ｖ遺伝子をＰＣＲクローニングする際、ｂａｃｋプライマーのハイブリダイゼーション部位として、ＦＲのうちＮ末端に位置するＦＲ１、あるいはリーダー配列が考えられるが、これらの塩基配列は多様性が大きい。そこで、こうした多様な塩基配列に対応できるように設計されたＶ遺伝子増幅用の縮重プライマーのセット、すなわち、ユニバーサルプライマーのセットがこれまでに種々報告されている。本実施例では、そのうちＮｉｃｈｏｌｌｓらによって開発されたκ型Ｌ鎖可変部遺伝子クローニング用のプライマーセット（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ＰＪ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＶＧ， Ｂｌａｎｆｏｒｄ ＭＤ， Ａｎｄｒｅｗ ＳＭ． Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９３；１６５：８１−９１．）を用いた。これは、６種類の縮重ｂａｃｋプライマーを含むもので、 いずれもＦＲ１の５’末端に相補性を示すものである。このうち１種をｂａｃｋプライマーに、κ型Ｌ鎖定常部［Ｃ（κ）］の遺伝子に相補的なプライマー（ＭＫＣ）をｆｏｒｗａｒｄプライマーに用いて上述のｃＤＮＡの増幅を試みたところ、いずれの抗体についても目的のＶＬ（κ）遺伝子を含む約４００ｂｐのＤＮＡ断片を得ることができた。これらの塩基配列を解析してアミノ酸配列を推定し、各抗体のＣＤＲを特定した。

【0040】

配列番号１は、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のＶ_Ｈ鎖の塩基配列である。
配列番号２は、配列番号１のＣＤＲ１領域の塩基配列である。
配列番号３は、配列番号１のＣＤＲ２領域の塩基配列である。
配列番号４は、配列番号１のＣＤＲ３領域の塩基配列である。
配列番号５は、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のＶ_Ｈ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号６は、配列番号５のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
配列番号７は、配列番号５のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
配列番号８は、配列番号５のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号９は、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のＶ_Ｌ鎖の塩基配列である。
配列番号１０は、配列番号９のＣＤＲ１領域の塩基配列である。
配列番号１１は、配列番号９のＣＤＲ２領域の塩基配列である。
配列番号１２は、配列番号９のＣＤＲ３領域の塩基配列である。
配列番号１３は、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０のＶ_Ｌ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、配列番号１３のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、配列番号１３のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、配列番号１３のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＶ_Ｈ鎖の塩基配列である。
配列番号１８は、配列番号１７のＣＤＲ１領域の塩基配列である。
配列番号１９は、配列番号１７のＣＤＲ２領域の塩基配列である。
配列番号２０は、配列番号１７のＣＤＲ３領域の塩基配列である。
配列番号２１は、抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＶ_Ｈ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、配列番号２１のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、配列番号２１のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、配列番号２１のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号２５は、抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＶ_Ｌ鎖の塩基配列である。
配列番号２６は、配列番号２５のＣＤＲ１領域の塩基配列である。
配列番号２７は、配列番号２５のＣＤＲ２領域の塩基配列である。
配列番号２８は、配列番号２５のＣＤＲ３領域の塩基配列である。
配列番号２９は、抗ＴＮＣ−４Ｃ８のＶ_Ｌ鎖のアミノ酸配列である。
配列番号３０は、配列番号２９のＣＤＲ１領域のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、配列番号２９のＣＤＲ２領域のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、配列番号２９のＣＤＲ３領域のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、リンカーの塩基配列である。
配列番号３４は、リンカーのアミノ酸配列である。

【0041】

＜ｓｃＦｖ_４Ｆ１０およびｓｃＦｖ_４Ｃ８の調製＞
上述したＶ遺伝子塩基配列の情報を基盤として、ｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ_４Ｆ１０およびｓｃＦｖ_４Ｃ８）の調製を試みた。すなわち、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０および抗ＴＮＣ−４Ｃ８の各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ遺伝子を、サブクローニングのための制限酵素部位（Ｎｃｏ ＩとＳａｌ Ｉ）および両遺伝子の連結に必要なリンカー配列を含むプライマーで各々増幅した。

【0042】

ついで、図３（Ｂ）のｓｃＦｖ遺伝子構築の概略工程説明図に示すように、得られたＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ両遺伝子断片を、リンカー部分のハイブリダイゼーションを利用するｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ スプライシング法により連結させて、ｓｃＦｖ遺伝子を構築した。リンカーペプチドは、可動性に富み、ｓｃＦｖの構築に一般的に多用される（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３を採用した。また、本ｓｃＦｖの発現の確認に有用と思われるＦＬＡＧ 配列の遺伝子を３’末端に付加した。得られたｓｃＦｖ遺伝子は、いずれも期待どおり約８００ｂｐのサイズを有することがアガロースゲル電気泳動により確認された。これらｓｃＦｖ遺伝子断片を、それぞれ抗体発現用ベクターであるｐＥＸｍｉｄｅ ５（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｎ， Ｓｈｉｂａｈａｒａ Ｋ， Ｉｋｅｇａｓｈｉｒａ Ｋ， Ｓｈｉｂｕｓａｗａ Ｋ， Ｇｏｔｏ Ｊ． Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａｎ ａｎｔｉ−１１−ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ａｆｆｉｎｉｔｙ， ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ｉｄｉｏｔｙｐｅ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｓｔｅｒｏｉｄｓ ２００２； ６７： ７３３−４２．）にサブクローニングし、大腸菌ＸＬＯＬＲ株を形質転換した。この組換え菌では、 ｓｃＦｖ遺伝子の産物は、５’上流のｐｅｌ Ｂ リーダーペプチドの働きにより大腸菌のペリプラズムへ送達されるものと期待される。そこで、得られた形質転換体クローンをｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）存在下で培養し、浸透圧ショック法によりそのペリプラズム抽出液を調製した。これら抽出液について下記のＥＬＩＳＡにより抗原結合活性を調べたところ、対応するマウス抗体に匹敵する十分な抗原結合活性が認められている。

【0043】

≪ｓｃＦｖ_４Ｆ１０およびｓｃＦｖ_４Ｃ８の諸性質と有用性≫
上述したｓｃＦｖのうち、ｓｃＦｖ_４Ｆ１０の結合特性について述べる。まず、ペリプラズム抽出液を、ＦＬＡＧ固定化アガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーに付してｓｃＦｖを精製し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。その結果、クーマシーブルー染色において本ｓｃＦｖの分子量（約２９ＫＤａ）と符合する位置にバンドが認められた。さらに、 抗ＦＬＡＧ抗体を検出プローブとするイムノブロッティングにおいても同じ位置に単一のバンドが認められ、目的の可溶型ｓｃＦｖが発現されていることが示された。

【0044】

次に、図３（Ｃ）のＥＬＩＳＡ原理説明図に示す方法により、ペリプラズム抽出液を、テネイシンＣを固定化したマイクロプレートを用いるＥＬＩＳＡに付したところ、強い陽性シグナルが得られた。さらに、遊離のテネイシンＣを添加して競合反応を行い、用量作用曲線を作成したところ、ｍｉｄｐｏｉｎｔ（５０％阻害率を示す抗原量）はおよそ８ｎｇ（約０．３ｐｍｏｌ）であり、本ｓｃＦｖを用いて高感度なテネイシンＣのＥＬＩＳＡが可能なことが示された。表面プラズモン共鳴センサー（Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００）を用いて本ｓｃＦｖのテネイシンＣに対する解離定数Ｋｄを求めた。図３（Ｄ）は、ｓｃＦｖの表面プラズモン共鳴センサーグラムのグラフ図を示す。この図に示すように、ｓｃＦｖは由来するマウス抗体（４Ｆ１０）Ｆａｂ（解離定数Ｋ_ｄ＝７×１０^−８Ｍ）に全く遜色のない親和力（解離定数Ｋ_ｄ＝４×１０^−８Ｍ）を保持していることを確認した。
本ｓｃＦｖをラット血清と混合し、その一部を経時的に上記のＥＬＩＳＡに付して、ｓｃＦｖの分解の有無を調べた。その結果、混合して２時間後からゆるやかなシグナルの低下が認められるものの、２４時間後でも約８０％が分解することなく血清中に存在していることが示された。従って、本ＳｃＦｖは、標的組織へ到達するに充分な時間、血液中で分解を受けず、安定に循環でき、体内診断薬として応用できる。

【0045】

本ｓｃＦｖを放射性同位体で標識するため、上記のｓｃＦｖ遺伝子の３’末端にシステイン（ｃｙｓ）のコドンをＰＣＲにより付加し、ＸＬＯＬＲ菌内で発現させて、Ｃ末端にｃｙｓ残基を導入したｓｃＦｖ−ｃｙｓを調製した。 このｓｃＦｖ−ｃｙｓは、ｃｙｓ導入前のｓｃＦｖと変わらないテネイシンＣ結合活性をもつことを確認した。

【0046】

≪キレートの開発≫
放射性核種標識ｓｃＦｖの体内動態を検討するためには、ｓｃＦｖが移行した組織において、放射活性が長時間滞留することが望ましい。そこで、インジウム−１１１と安定な錯体を形成することが知られ、標的組織において、滞留すること期待できるＤＴＰＡ（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を金属キレート部位として選択した。また、ｓｃＦｖは分子量が２９０００程度と小さく、アミノ基修飾によるキレートの導入では、アミノ末端など抗原認識に関わる部位へ修飾が懸念される。そこで、カルボキシ末端にシステインを導入したｓｃＦｖのスルフヒドリル基を介して、位置選択的にキレートを導入することにした。本実施例では、スルフヒドリル基との選択的に結合するマレイミド基を選択し、キレート部位としてＤＴＰＡ骨格を有するＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＤＴＰＡを二官能性キレート試薬として設計合成した。

【0047】

≪ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＤＴＰＡの合成≫
＜実験材料＞
^１Ｈ−ＮＭＲおよびＦＡＢ−ＭＳはそれぞれＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬＰＨＡ ４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ， ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＡＸ５００ （ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。試薬は特級を使用した。

【0048】

＜Ｍｅｔｈｙｌ−ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ（１）の合成＞
無水ｍｅｔｈａｎｏｌ（４０ｍＬ）を−１０℃以下に冷却し、ｔｈｉｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（２ｍＬ，２７．４ｍｍｏｌ）を温度を維持したままゆっくりと滴下した。１０分間温度を維持したまま撹拌した後、４−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（５ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）を加えた。室温に戻した後、一晩灌流した。溶媒を減圧留去し、次の［化１］に示す化合物１を白色固体（４．５８ｇ，収率８５．８％）として得た。

【化1】

ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ２２４（Ｍ＋Ｈ）^＋，ｆｏｕｎｄ２２４．

【0049】

＜ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ−Ｎ−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｄｅ（２）の合成＞
化合物１（２．７８ｇ，１２．４ｍｍｏｌ）を乾燥ｍｅｔｈａｎｏｌ（５ｍＬ）に溶解した。窒素気流下、ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（４５ｍＬ，６９２ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、一晩撹拌した。溶媒を留去し、赤色の油状物質２を得た。得られた［化２］に示す化合物２はそのまま次の反応に用いた。

【化2】

ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ２５３（Ｍ＋Ｈ）^＋，ｆｏｕｎｄ２５３．

【0050】

＜１−（ｐ−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ（３）の合成＞
化合物２（２．７ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）をｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ（ＴＨＦ，４３ｍＬ）に溶解した。窒素気流下−１０℃に冷却した後、１．０Ｍ ｂｏｒａｎｅ−ＴＨＦ ｃｏｍｐｌｅｘ（５５．７ｍＬ）を滴下した。そのまま１時間撹拌後、一晩灌流した。溶媒を−１０℃に冷却後、ｍｅｔｈａｎｏｌ（１０ｍＬ）をゆっくりと加えた。溶媒を留去し、同様の操作をもう一度繰り返した後、ｅｔｈａｎｏｌ（２５ｍＬ）を加え、氷令した。次いで、ＨＣｌガスを飽和になるまで吹き込んだ後、２時間灌流した。冷蔵庫で一晩放置した後、結晶をろ取した。結晶を１２ｍＬの水に溶解した後、５０％ＮａＯＨを氷零下滴下し、ｐＨを約１４とした。Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（２５ｘ３）で抽出した後、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｍｅｔｈａｎｏｌ−ａｍｍｏｎｉａ（１２：４：１）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、［化３］に示す化合物３である油状物質３（１．９ｇ，７０％）を得た。

【化3】

ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ２３９（Ｍ＋Ｈ）^＋，ｆｏｕｎｄ２３９．

【0051】

＜１−（ｐ−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｅｎｔａ−ｔ−ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ（４）の合成＞
化合物３（０．６２ｇ，２．５８ｍｍｏｌ）をａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ（７ｍＬ）に溶解し、次いで、Ｋ_２ＣＯ_３（３．５７ｇ，２５．８ｍｍｏｌ）を加えた。ｔ−Ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ（２．６７ｇ，１３．７ｍｍｏｌ）を氷零下滴下し、遮光下一晩撹拌した。溶媒を減圧留去した後、水（２０ｍＬ）を加え、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（２０ｍＬｘ３）で抽出した。Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ−ｈｅｘａｎｅ（１：４）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、［化４］に示す化合物４である黄色の油状物質４（１．６３ｇ，収率７８．１％）を得た。

【化4】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．３７（ｓ，４５Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ），２．４３−３．０１（ｏｖｅｒｌａｐ，９Ｈ，ＣＨ_２，ＣＨ），３．２５−３．４４（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ_２−ＣＯＯ），７．２４−８．１１（ｄ，４Ｈ，ｂｅｎｚｙｌ）．
ＦＡＢ−ＭＳ：８３１（Ｍ＋Ｎａ）^＋，ｆｏｕｎｄ８３１．

【0052】

＜１−（ｐ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｌ）ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｅｎｔａ−ｔ−ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ（５）の合成＞
化合物４（０．７１ｇ，０．８８ｍｏｌ）をｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ（２０ｍＬ）に溶解し、次いで１０％ Ｐｄ／Ｃ（０．３９ｇ）を加え、水素気流下９時間撹拌した。Ｐｄ／Ｃをろ去し、［化５］に示す化合物５を無色透明の油状物質（０．６５ｇ，９５．１％）として得た。

【化5】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．３８−１．４２（ｓ，４５Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ），２．４５−２．８０（ｏｖｅｒｌａｐ，８Ｈ，ＣＨ_２），３．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．３３−３．７１（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ_２−ＣＯＯ），６．５５−６．９８（ｄ，４Ｈ，ｂｅｎｚｙｌ）．
ＦＡＢ−ＭＳ：８０２（Ｍ＋Ｎａ）^＋，ｆｏｕｎｄ８０２．

【0053】

＜Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（６）の合成＞
Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（３．０ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）をｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ（４０ｍＬ）に溶解し、氷令下Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ（３．９２ｇ，３８．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。３時間後沈殿をろ去し、残渣をｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ−ｈｅｘａｎ（１：２）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、［化６］に示す化合物６を白色結晶（３．８ｇ，７９．３％）として得た。

【化6】

【0054】

＜Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（７）の合成＞
６−Ａｍｉｎｏ−ｎ−ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（１９３ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を飽和ＮａＨＣＯ_３（４ｍＬ）に溶解し、氷零下化合物６を加えた。氷零下４０分、室温で５０分間反応させた後、Ｈ_２ＳＯ_４を加え、ｐＨを３とした。Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ（１０ｍＬｘ３）で抽出し、［化７］に示す化合物７を白色固体（１２９ｍｇ，４１．６％）として得た。

【化7】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．２３−１．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．５５−１．６７（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２），２．３０−２．３４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），３．４８−３．６６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２−ＣＯＯ），６．６７（ｓ，２Ｈ，ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）．
ＦＡＢ−ＭＳ：２１１（Ｍ＋Ｈ）^＋，ｆｏｕｎｄ２１１．

【0055】

＜１−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｈｅｘａｎｏｙｌ）−３−ａｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｐｅｎｔａ−ｔ−ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ（８）の合成＞
化合物７（８１．４ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．９３ｍＬ）に溶解し、−１５℃に冷却した。Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ（３８．１μＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を加え、次いでｉｓｏｂｕｔｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ（５５．４μＬ，０．４３ｍｍｏｌ）を加えた。２分後、ＴＨＦ（０．３８ｍＬ）に溶解した化合物５（１５０ｍｇ，０．１９３ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。さらに、室温に戻した後、９０分間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、残渣をｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ １０ｍＬに溶解し、５％ＮａＨＣＯ_３溶液（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）、１Ｍ ＨＣｌ溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。有機層を乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ−ｈｅｘａｎｅ（１：１）を溶出溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフィにより精製し、［化８］に示す化合物８を油状物質（２６０ｍｇ，６７％）として得た。

【化8】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）：δ１．２３−１．７２（ｏｖｅｒｌａｐ，５１，ｔ−ｂｕｔｙｌ，ＣＨ_２），２．２３−２．７０（ｏｖｅｒｌａｐ，８Ｈ，ＣＨ_２），３．０５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．３６−３．５３（ｍ，１０Ｈ，ＣＨ_２−ＣＯＯ），６．６６（ｓ，２Ｈ，ｍａｌｅｉｍｉｄｅ），７．１４−７．３８（ｄ，４Ｈ，ｂｅｎｚｙｌ）．
ＦＡＢ−ＭＳ：９９４（Ｍ＋Ｎａ）^＋，ｆｏｕｎｄ９９４．

【0056】

＜１−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅｈｅｘａｎｏｙｌ）−３−ａｍｉｄｏｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ （ＥＭＣＳ−ＢＺ−ＤＴＰＡ）の合成＞
化合物８（３５５ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ−ａｎｉｓｏｌｅ（９：１，２００μＬ）に溶解し、３時間撹拌した。Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ（５ｍＬ）を加え、［化９］に示すＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（７７ｍｇ，３０％）を白色固体として得た。

【化9】

^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１．２４−１．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），１．４９−１．５９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２），２．２４−２．２７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ_２），２．７５−２．９８（ｏｖｅｒｌａｐ，１０Ｈ，ＣＨ_２），３．１６−３．５９（ｏｖｅｒｌａｐ，１３Ｈ，ＣＨ，ＣＨ_２），７．００（ｓ，２Ｈ，ｍａｌｅｉｍｉｄｅ），７．１１−７．４９（ｄ，４Ｈ，ｂｅｎｚｙｌ）．
ＦＡＢ−ＭＳ：６９２（Ｍ＋Ｈ）^＋，ｆｏｕｎｄ６９２．

【0057】

≪抗体の標識≫
本発明には様々な標識が利用できるが、この実施例では、抗ＴＮＣ−Ｆａｂのヨウ素−１２５／１３１標識、抗ＴＮＣ−Ｆａｂのインジウム−１１１標識、ＳｃＦｖ−ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＤＴＰＡのインジウム−１１１標識について説明する。

【0058】

Ｎａ［^１２５Ｉ］ＩはＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＳＡ）から、Ｎａ［^１３１Ｉ］ＩはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ（Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。インジウム−１１１（^１１１Ｉｎ）は日本メジフィジックス株式会社（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）より購入した。その他の試薬は特級を購入し、そのまま使用した。

【0059】

＜抗ＴＮＣ−Ｆａｂのヨウ素−１２５／１３１（^{１２５／１３１}Ｉ）標識＞
Ｆａｂ_４Ｆ１０あるいはＦａｂ_４Ｃ８（１ｍｇ／ｍＬ，０．１Ｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８）１００μＬにＮａ［^１２５Ｉ］ＩあるいはＮａ［^１３１Ｉ］Ｉを加えた。その溶液にｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ（０．１ｍｇ／ｍＬ，０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８）を６μＬ加え、室温で５分間反応させた。その後、亜硫酸水素ナトリウム（０．１ｍｇ／ｍＬ，０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．８）を２０μＬ加え、反応を終了させた。その後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＫＫ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）を担体とするスピンカラム（０．１Ｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．０）により精製した。放射化学的純度は８０％ｍｅｔｈａｎｏｌによるＴＬＣにより求めた。放射化学的純度は９６％、収率は５９．２％（^１２５Ｉ−Ｆａｂ_４Ｆ１０）または５０．２％（^１３１Ｉ−Ｆａｂ_４Ｃ８）である。

【0060】

＜抗ＴＮＣ−Ｆａｂのインジウム−１１１標識＞
ホウ酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ８．５）に溶解したＦａｂ（５ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ）にホウ酸緩衝液（０．０５Ｍ，ｐＨ８．５９）に溶解したＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（１５ｅｑ，１０μＬ）を加えた。１５時間３７℃で反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を担体とするスピンカラム（０．１Ｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．０）により精製し、Ｆａｂ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡを得た。

【0061】

１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬに^１１１Ｉｎを２００μＬ加え、室温で５分間放置した。次いで、Ｆａｂ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（１ｍｇ／ｍＬ，１００μＬ）を加え、６０分間反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０を担体とするスピンカラム（０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４）により精製した。放射化学的純度は電気泳動（ｖｅｒｏｎａｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．６， Ｉ＝０．０６，６０分）により求めた。放射化学的純度は９５％である。

【0062】

＜抗ＴＮＣ−Ｆａｂのテクネシウム−９９ｍ標識＞
抗ＴＮＣ−Ｆａｂのテクネシウム−９９ｍ標識は、論文「９９ｍＴｃ−ＨＹＮＩＣ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｔｅｒｎａｒｙ ｌｉｇａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ９９ｍＴｃ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ」， Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８（２００１），２１５−２２４ に記載の方法により行った。

【0063】

＜ＳｃＦｖ−ＥＭＣＳ−Ｂｚ−ＤＴＰＡのインジウム−１１１標識＞
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１００μＬに１１１Ｉｎを１００μＬ加え、室温で５分間放置した。次いで、Ｆａｂ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（０．４５ｍｇ／ｍＬ，２２０μＬ，０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６．０）を加え、６０分間反応させた。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を担体とするスピンカラム（０．１Ｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４）により精製した。放射化学的純度は電気泳動（ｖｅｒｏｎａｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ８．６，Ｉ＝０．０６，６０分）により求めた。放射化学的純度は９５．１％である。

【0064】

≪テネイシンＣと標識化抗体≫
テネイシンＣの異なるエピトープを認識する標識化抗体は、上述した、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０（マウスＩｇＧ）と抗ＴＮＣ−４Ｃ８（マウスＩｇＧ）、またはそのＦａｂフラグメント、若しくはそのｓｃＦｖフラグメントとすることができる。分子量が最も低く好ましいｓｃＦｖフラグメントの場合について説明する。
図４（Ａ）は、テネイシンＣ３３と、Ｉｎ−１１１標識４Ｆ１０ＴＴ抗テネイシンＣ ｓｃＦｖ抗体（以下、^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｆ１０という）３１と、Ｔｃ−９９ｍ標識４Ｃ８ＭＳ抗テネイシンＣ ｓｃＦｖ抗体（以下、^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｃ８という）３２を示す説明図である。テネイシンＣ３３は、複数のエピトープを有している。^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｆ１０は、テネイシンＣ３３の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインに集積する。^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｃ８は、テネイシンＣ３３のフィブロネクチンＩＩＩ様配列部分に集積する。

【0065】

このように、選択的スプライシング部位のＮ末端側の「上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン」と、「フィブロネクチンＩＩＩ様配列部分」という異なるエピトープにそれぞれ集積するため、１つの抗テネイシンＣに２つの標識抗体が集積した状態を実現することができる。
また、標識に、インジウム（Ｉｎ−１１１）とテクネシウム（Ｔｃ−９９ｍ）というエネルギーピークの異なる放射性核種を用いているため、ＳＰＥＣＴ装置１による体外評価において、それぞれ分離してデータ収集することができる。
また、分子量が低いｓｃＦｖフラグメントを用いているため、ＩｇＧやＦａｂに比べて組織／血液分布比がより大きく、より鮮明なシンチグラムを与えることができる。

【0066】

≪ラットへの投与結果≫
図４（Ｂ）は、隣接切片のオートラジオグラフィーと組織染色像を示す説明図である。上から順に、（１）^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂを投与した心筋梗塞部、（２）^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂを投与した非心筋梗塞部、（３）抗パラインフルエンザウイルス２型蛋白モノクローナル抗体のＦａｂ抗体を投与した心筋梗塞部、（４）^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖを投与した心筋梗塞部を示している。

【0067】

図示するように、非特異抗体としてアイソタイプの抗パラインフルエンザウイルス２型蛋白モノクローナル抗体のＦａｂ抗体を投与した場合には心筋梗塞部に集積しないことが確認でき、ＦａｂとｓｃＦｖが心筋梗塞による心筋壊死部に集積することを確認できた。

【0068】

図４（Ｃ）は、心筋梗塞モデルラットに同量で同時投与した４Ｃ８と４Ｆ１０の比を測定した結果である。この実施例では、２５μｇ（１１１ｋＢｑ）の^１２５Ｉ−Ｆａｂ_４Ｆ１０と２５μｇ（１１１ｋＢｑ）の^１３１Ｉ−Ｆａｂ_４Ｃ８を混和し、ラット（３００μＬ，ｓａｌｉｎｅ）に尾静脈より投与している。そして、臓器分布により測定している。

【0069】

図示するように、４Ｃ８／４Ｆ１０比は、３０分虚血再灌流後３日に１．４８、３０分虚血再灌流後４日に１．３７となっている。急性心筋梗塞後３日に１．３０であった４Ｃ８／４Ｆ１０比は、急性心筋梗塞後４日に１．３８となっている。また、陳旧性心筋梗塞の場合、４Ｃ８／４Ｆ１０比は０．８８である。ラットの場合、心筋梗塞４日後からは、再灌流していても同様の比であり、治療効果への反応は乏しいが、３日後では大きく変わる。このように、病期によって４Ｃ８／４Ｆ１０比が変化することがわかる。

【0070】

図４（Ｄ）は、心筋梗塞モデルラットに^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂを投与して測定した結果である。急性心筋梗塞後３日の４Ｃ８／４Ｆ１０比は、１．４５であった。このように、体外画像評価でもヨウ素標識、臓器分布と同様の結果が得られる。なお、この図４（Ｄ）は、^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８を投与し、別の個体に^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｆ１０を投与して測定して比を取っているが、^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｃ８と^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−ｓｃＦｖ_４Ｆ１０を同時投与して比をとっても良い。この場合も、２つの抗体フラグメント（ｓｃＦｖ_４Ｃ８とｓｃＦｖ_４Ｆ１０）が集積する２つのエピトープは図示した例と同じであるから、同じ結果が得られる。

【0071】

図４（Ｃ）、図４（Ｄ）に示した結果に基づき、急性心筋梗塞後３日のラットに翌日からＧＣＳＦ注射治療を始めたところ、有意に生存期間の延長を認めた（治療群１０７．５（週）、対照群７６．８（週））。治療群と対照群の「急性心筋梗塞後３日のＩｎ−１１１−４Ｃ８放射活性」を比較すると、同程度（治療群６．２３ ｃｏｕｎｔｓ／ｈｅａｒｔ、対照群７．３７ ｃｏｕｎｔｓ／ｈｅａｒｔ）であり、明らかな差が得られなかった。このように、４Ｆ１０の放射活性を勘案した４Ｃ８／４Ｆ１０比を体外評価から算出することにより、治療を必要とする群を選別することが可能である。

【0072】

これらの結果から、４Ｃ８／４Ｆ１０比を測定することで、病期や推奨治療法を判定することが可能となる。例えば、４Ｃ８／４Ｆ１０比を図２（Ｄ）に説明した基準データ５ａと比較することで、病期や推奨治療法を容易に判定できる。
また、図４（Ａ）に示したＩｎ−１１１標識４Ｆ１０ＴＴ抗テネイシンＣ ｓｃＦｖ抗体３１と、Ｔｃ−９９ｍ標識４Ｃ８ＭＳ抗テネイシンＣ ｓｃＦｖ抗体３２を用いることで、低分子量の診断剤による２核種同時測定を実現することができる。
また、４Ｃ８／４Ｆ１０比を心不全の悪化の指標と用いることもできる。また、病変部を体外定量評価することができる。
また、効果的な薬剤のスクリーニングを定量的な体外評価により実施することも可能となる。
また、炎症部位が複数あっても、４Ｃ８／４Ｆ１０比をとることで画像的に定量評価することができる。

【0073】

以上のように、１つの抗原の異なるエピトープに集積する複数種類の抗体を対で使用し、その比を求めることで、炎症部位を画像的に体外定量評価することができる。従って、このような抗体対を提供することで、病期を判定し治療開始時期を示すという画期的な評価を行える。
抗ＴＮＣ−４Ｃ８及びそのフラグメントは、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０及びそのフラグメントよりも、炎症の重症度との関連が高く、敏感度が高いと考えられる。また、抗ＴＮＣ−４Ｆ１０及びそのフラグメントは、抗ＴＮＣ−４Ｃ８及びそのフラグメントよりも、軽症でも発現が多く重症との差を出しにくくしていると考えられる。従って、免疫染色でのテネイシンＣの発現領域は、抗ＴＮＣ抗体及びそのフラグメントにおいて常に４Ｆ１０＞４Ｃ８と考えられる。このように、敏感性や重症度との関連性が異なる複数種類の抗ＴＮＣ抗体またはそのフラグメントを対として用い、比較することで、病期および適切な治療方法を定量的かつ的確に判定することができる。

【0074】

また、Ｉｎ−１１１標識４Ｆ１０ＴＴ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体と、Ｔｃ−９９ｍ標識４Ｃ８ＭＳ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体により、十分な基礎研究を行うことができる。詳述すると、現在米国でＰｈａｓｅＩＩ臨床治験となっている抗テネイシンＣモノクローナル抗体（８１Ｃ６）は、本発明とは塩基配列が異なっており、ラットおよびマウスのテネイシンＣには結合しない。このため、抗テネイシンＣモノクローナル抗体（８１Ｃ６）には、十分な基礎研究ができないという問題点がある。これに対して、本実施例に説明したＩｎ−１１１標識４Ｆ１０ＴＴ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体と、Ｔｃ−９９ｍ標識４Ｃ８ＭＳ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体は、いずれもラットおよびマウスのテネイシンＣに結合する。このため、ヒトに投与する前に十分な基礎研究を行うことができる。

【0075】

なお、この実施例ではＳＰＥＣＴ装置１を用いたが、これに限らずＰＥＴ装置等の適宜の装置に応用することもなし得る。
また、ｓｃＦｖは、Ｖ_Ｈ，Ｖ_Ｌのそれぞれに３箇所ずつ存在する相補性決定部（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ； ＣＤＲ）のアミノ酸にランダム変異を導入して変異ｓｃＦｖのライブラリーを構築してもよい。これにより、野生型ｓｃＦｖよりも特異性や親和力の向上した変異体を探索することができる。
また、実施例では４Ｃ８／４Ｆ１０の比としたが、４Ｆ１０／４Ｃ８の比とすることもできる。

【0076】

また、４Ｃ８と４Ｆ１０の投与量を同量としたが、これに限らず、あらかじめ定めた適宜の割合とすることができる。この場合でも事前に投与割合がわかっていることから、比をとって判定することができる。
また、４Ｃ８と４Ｆ１０の投与は、静脈内投与に限らず、サプリメントとして経口投与する、経口吸引する、または皮膚吸収するなど、適宜の投与方法で投与することができる。サプリメントによる場合は、４Ｃ８と４Ｆ１０とを有する抗体対を含むサプリメントを作製し提供すればよい。

【実施例2】

【0077】

次に、^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８と^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０を２核種同時投与した実施例２について説明する。この実施例２では、上述の実施例１で説明したＳＰＥＣＴ装置１、および、Ｆａｂ_４Ｃ８とＦａｂ_４Ｆ１０をそれぞれ^９９ｍＴｃまたは^１１１Ｉｎでそれぞれ標識化した^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８と^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０を用いるため、その詳細な説明を省略する。

【0078】

基準データ５ａは、実施例１と異なり、４Ｆ１０／４Ｃ８の比が２．８より低ければ血管再生治療薬である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）の投与による治療効果があり、４Ｆ１０／４Ｃ８の比が２．８以上であれば治療効果がないとする判定基準に設定されている。

【0079】

図５（Ａ）は、この実施例２にて２核種同時標識したテネイシンＣと評価結果を説明するグラフであり、縦軸が拡張末期内腔径変化（ｍｍ）であり、横軸が４Ｆ１０／４Ｃ８の比である。

【0080】

このグラフに表記されている値は、急性心筋梗塞ラット（術後３日）に、Ｉｎ−１１１標識抗テネイシンＣ−４Ｆ１０ＴＴ抗体とＴｃ−９９ｍ標識抗テネイシンＣ−４Ｃ８ＭＳ抗体を同時投与し、３時間後にＳＰＥＣＴ装置にて体外評価した結果である。その比を４Ｆ１０／４Ｃ８とし、翌日から顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）を１４日連続皮下投与すると、４Ｆ１０／４Ｃ８が２．８未満の群では、心筋梗塞７２日後の拡張末期の心臓内腔径が１０日後よりも縮小し、ＧＣＳＦ治療により心機能が改善した。

【0081】

このように、４Ｆ１０／４Ｃ８比を確認することで、検査対象を治療効果が出る群と出ない群に分けることができる。また、この治療効果は、４Ｆ１０ＴＴ／４Ｃ８ＭＳ比と良好な相関を示しており、４Ｆ１０／４Ｃ８比が薬剤治療の効果を予測できることを示している。このように４Ｆ１０／４Ｃ８比を用いて判定する方法により、病態評価が可能となり、病期を評価して炎症治療の開始時期を知ることができる。

【実施例3】

【0082】

次に、脳腫瘍ラットについての放射線治療用化合物生産方法を示す実施例３について説明する。実施例３では、上述した実施例２と同一のＳＰＥＣＴ装置１、^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８と^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０を用いるため、その詳細な説明を省略する。

【0083】

この実施例３では、ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８（４Ｃ８ＭＳ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体）と、ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０（４Ｆ１０ＴＴ抗テネイシンＣ Ｆａｂ抗体）に、それぞれ半減期の異なる核種を結合させて、放射線治療剤を生産する。具体的には、前者が後者よりも半減期が短い核種でかつ高い放射線量の核種としている。半減期の異なる核種を結合させる方法は、実施例１に説明した標識化と同様であるため、その詳細な説明を省略する。このように生産した放射線治療用化合物を、内用放射線治療薬としている。このように生産した治療薬により、各抗体の発現の広さおよび大きさと集積部位の違いを利用した好適な治療を行うことができる。

【0084】

次に、この実施例３の治療薬による治療の有効性について説明する。図５（Ｂ１）〜図５（Ｄ２）は、脳腫瘍細胞移植後１４日の脳腫瘍ラットに^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０と^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８を尾静脈注射により同時投与し、６時間後にＳＰＥＣＴ装置１によってラット頭部線条体付近の短軸像を撮像して体外評価した結果の説明図である。

【0085】

図５（Ｂ１）は、^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０の発現を示し、図５（Ｃ１）は^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８の発現を示し、図５（Ｄ１）は両核種の発現を示している。図はモノクロになっているが、本来は、図５（Ｂ１）が赤色等の第１色で濃淡表示され、図５（Ｃ１）が緑色等の第２色で濃淡表示され、図５（Ｄ１）が第１色と第２色に加えて黄色等の第３色（第１色と第２色の合成色）によって^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０と^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８の両方が発現している部位が濃淡表示されている。このようにモノクロの図では色の違いがわからないことを補足するため、図５（Ｂ２）〜図５（Ｄ２）は、図５（Ｂ１）〜図５（Ｄ１）の注目領域４０付近を、第１色と第２色を異なる方向のハッチングとし、第３色を第１色のハッチングと第２色のハッチングの混合ハッチングとして見やすく図示している。

【0086】

図示からわかるように、^１１１Ｉｎ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｆ１０の領域である４Ｆ１０ＴＴ領域４１と、^９９ｍＴｃ−ａｎｔｉ−ＴＮＣ−Ｆａｂ_４Ｃ８の領域である４Ｃ８ＭＳ４２は、発現する場所が一部を除いて異なっているとともに、両方の発現する重複部位４３が存在している集積の高い領域も一部異なっている。

【0087】

このように、発現の広さと大きさと部位に応じて結合する核種および放射線量を変化させることで、治療剤の治療効果を高めることができる。すなわち、４Ｆ１０ＴＴ領域４１は半減期の比較的長い核種で低めの放射線を照射するものとすることで、癌細胞の遠隔転移を予防することができる。また、例えば、４Ｃ８ＭＳ領域４２は、半減期の比較的短い核種を高めの放射線量で結合させておくことで、原発巣の活動性の高い癌細胞を壊死させることができる。このように、２核種によるカクテル療法として使用できる治療剤を提供することで、放射線内用療法の効果向上や生存率改善を行うことができる。

【0088】

特に、本発明により、半減期の異なる２核種による内用放射線治療というこれまでにない画期的な治療法を提案することができ、研究開発の用途が広がる。
また、本発明のような抗体は、安全性や効果を担保することができ、医薬品としての実用化が十分に期待できる。

【0089】

この発明は、上述の実施形態の構成のみに限定されるものではなく、多くの実施の形態を得ることができる。

【産業上の利用可能性】

【0090】

この発明は、ＳＰＥＣＴ装置等の核医学診断装置に利用することができる。また、テネイシンＣ等の複数のエピトープを有する抗体に利用することができる。

【符号の説明】

【0091】

１…ＳＰＥＣＴ装置
２…ガンマカメラ
３…データ記憶部
６…制御部
７…入出力部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]