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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6242882
(24)【登録日】2017年11月17日
(45)【発行日】2017年12月6日
(54)【発明の名称】植物細胞における長鎖多価不飽和脂肪酸の産生
(51)【国際特許分類】
C11B 1/10 20060101AFI20171127BHJP
C11C 3/00 20060101ALI20171127BHJP
C11C 1/00 20060101ALI20171127BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20171127BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20171127BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20171127BHJP
C12P 7/62 20060101ALI20171127BHJP
A01H 5/00 20060101ALI20171127BHJP
C07C 51/48 20060101ALI20171127BHJP
C07C 53/50 20060101ALI20171127BHJP
C07C 57/03 20060101ALI20171127BHJP
C07C 57/12 20060101ALI20171127BHJP
A23K 10/30 20160101ALI20171127BHJP
A61K 8/37 20060101ALI20171127BHJP
A61K 8/63 20060101ALI20171127BHJP
A61K 8/92 20060101ALI20171127BHJP
A61K 8/9789 20170101ALI20171127BHJP
A61K 31/22 20060101ALI20171127BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20171127BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20171127BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20171127BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20171127BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20171127BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20171127BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20171127BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20171127BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20171127BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20171127BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20171127BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20171127BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20171127BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20171127BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20171127BHJP
A61P 17/08 20060101ALI20171127BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20171127BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20171127BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20171127BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20171127BHJP
A61K 31/56 20060101ALI20171127BHJP
A61K 36/48 20060101ALI20171127BHJP
A61K 36/31 20060101ALI20171127BHJP
【ＦＩ】
C11B1/10ZNA
C11C3/00
C11C1/00
C12N15/00 A
C12N5/04
C12N9/00
C12P7/62
A01H5/00 A
C07C51/48CSP
C07C53/50
C07C57/03
C07C57/12
A23K10/30
A61K8/37
A61K8/63
A61K8/92
A61K8/9789
A61K31/22
A61P9/06
A61P9/00
A61P29/00
A61P11/06
A61P17/06
A61P19/10
A61P13/12
A61P31/18
A61P25/00
A61P29/00 101
A61P1/04
A61P25/18
A61P35/00
A61P13/02
A61P25/24
A61P9/12
A61P3/10
A61P3/04
A61P25/28
A61P11/00
A61P9/10
A61P17/08
A61P7/02
A61P15/00
A61P3/02
A61P27/02
A61K31/56
A61K36/48
A61K36/31
【請求項の数】22
【全頁数】143
(21)【出願番号】特願2015-516383(P2015-516383)
(86)(22)【出願日】2013年6月14日
(65)【公表番号】特表2015-528027(P2015-528027A)
(43)【公表日】2015年9月24日
(86)【国際出願番号】AU2013000639
(87)【国際公開番号】WO2013185184
(87)【国際公開日】20131219
【審査請求日】2016年6月13日
(31)【優先権主張番号】61/660,392
(32)【優先日】2012年6月15日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/663,344
(32)【優先日】2012年6月22日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/697,676
(32)【優先日】2012年9月6日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】61/782,680
(32)【優先日】2013年3月14日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】590003283
【氏名又は名称】コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション
(73)【特許権者】
【識別番号】511119798
【氏名又は名称】グレインズ リサーチ アンド デヴェロップメント コーポレイション
(73)【特許権者】
【識別番号】514318725
【氏名又は名称】ヌシード ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】ピートリー，ジェームズ ロバートソン
(72)【発明者】
【氏名】シング，スリンダー パル
(72)【発明者】
【氏名】デ フェイター，ロバート チャールズ
【審査官】
吉岡 沙織
(56)【参考文献】
【文献】
特表２０１２−５０９０５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１１−５１９５５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００５／１０３２５３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２０１４−５２３７５０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１１Ｂ
Ｃ１１Ｃ
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｐ
Ａ０１Ｈ
Ａ２３Ｋ
Ａ６１Ｋ ８／
Ａ６１Ｋ ３６／
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含む抽出植物脂質であって、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満である、前記抽出植物脂質。
【請求項2】
ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％(w/w)が前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、請求項１の脂質。
【請求項3】
以下の特徴：
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、２％(w/w)から１５％(w/w)の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、３％(w/w)から３０％(w/w)の間である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％(w/w)から３５％(w/w)の間である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、７％(w/w)から４０％(w/w)の間である、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、１１％(w/w)から２０％(w/w)の間である、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、４％(w/w)から２５％(w/w)の間である、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、４％(w/w)から３５％(w/w)の間である、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、２０％(w/w)から７５％(w/w)の間である、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、２０％(w/w)未満である、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、１０％(w/w)未満である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、４０％(w/w)から６０％(w/w)の間である、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％(w/w)から３３％(w/w)の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間である、
ｘｘｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１０％(w/w)の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１５％の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１７％の、ＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％(w/w)未満有する、
ｘｘｖ）前記脂質の前記ＴＡＧ含有量は、少なくとも７０％(w/w)である、
ｘｘｖｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質は、１０％(w/w)未満の遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
ｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する請求項１または２の脂質。
ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、２％(w/w)から１５％(w/w)の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、３％(w/w)から３０％(w/w)の間である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％(w/w)から３５％(w/w)の間である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、７％(w/w)から４０％(w/w)の間である、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルは、４％(w/w)未満である、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、１１％(w/w)から２０％(w/w)の間である、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、４％(w/w)から２５％(w/w)の間である、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、４％(w/w)から３５％(w/w)の間である、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、２０％(w/w)から７５％(w/w)の間である、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、２０％(w/w)未満である、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、１０％(w/w)未満である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、４０％(w/w)から６０％(w/w)の間である、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％(w/w)から３３％(w/w)の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間である、
ｘｘｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１０％(w/w)の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１５％の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも１７％の、ＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％(w/w)未満有する、
ｘｘｖ）前記脂質の前記ＴＡＧ含有量は、少なくとも７０％(w/w)である、
ｘｘｖｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質は、１０％(w/w)未満の遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
ｘｘｖｉｉｉ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する請求項１または２の脂質。
【請求項4】
１またはそれ以上のステロールをさらに含む、および/またはオイルの形態であって、１．５ｍｇから１０ｍｇの間のステロール／ｇのオイルを含む、請求項１〜３のいずれか１つの脂質。
【請求項5】
前記脂質は、アブラナ属種オイルまたはカメリナ サティバオイルである、請求項１から４のいずれか１つの脂質。
【請求項6】
抽出植物脂質を産生するためのプロセスであって、以下の工程：
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満であり、前記植物部分は、Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼをコードし、各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される、外因性ポリヌクレオチドを含む、工程、ならびに
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満である、工程、
を含む、前記プロセス。
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満であり、前記植物部分は、Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼをコードし、各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される、外因性ポリヌクレオチドを含む、工程、ならびに
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満である、工程、
を含む、前記プロセス。
【請求項7】
前記抽出脂質は、請求項２から５のいずれか１つに定義される１またはそれ以上の特徴を有する、請求項５のプロセス。
【請求項8】
前記植物部分が、以下の特徴：
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも６５％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも３０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、５％未満の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも８０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも８０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも１０％である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が、少なくとも１５％である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効率が、少なくとも１７％である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも１５％(w/w)多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する、
ｘｘ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１０％の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１５％の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１７％の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して、少なくとも２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、 ｘｘｖｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｉｘ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する請求項６または７のプロセス。
ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも６５％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも３０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、５％未満の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも６０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも８０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも８０％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも１０％である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が、少なくとも１５％である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効率が、少なくとも１７％である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも１５％(w/w)多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する、
ｘｘ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１０％の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１５％の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも１７％の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して、少なくとも２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、 ｘｘｖｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｉｘ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する請求項６または７のプロセス。
【請求項9】
以下の１またはそれ以上の特徴：
ｉ）前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合される；
ｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも４０％(w/w)である；
ｉｉｉ）前記脂質は、オイルであり、前記脂質の少なくとも９０％(w/w)がトリアシルグリセロールである；
ｉｖ）前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記ＤＨＡのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む；
が該当する、請求項６から８のいずれか１つのプロセス。
ｉ）前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合される；
ｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも４０％(w/w)である；
ｉｉｉ）前記脂質は、オイルであり、前記脂質の少なくとも９０％(w/w)がトリアシルグリセロールである；
ｉｖ）前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記ＤＨＡのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む；
が該当する、請求項６から８のいずれか１つのプロセス。
【請求項10】
以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合され、ここで前記細胞は、請求項１から５のいずれか１つに定義される脂質を含む、前記細胞。
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合され、ここで前記細胞は、請求項１から５のいずれか１つに定義される脂質を含む、前記細胞。
【請求項11】
請求項１０の細胞を含む、トランスジェニック非ヒト生物。
【請求項12】
トランスジェニック植物である、請求項１１のトランスジェニック非ヒト生物。
【請求項13】
ａ）その種子における脂質であって、該脂質がエステル化形態における脂肪酸を含む脂質、ならびに
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／または真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、の１つをコードする外因性ポリヌクレオチド
を含む油料種子植物であって、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満である、前記油料種子植物。
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／または真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、の１つをコードする外因性ポリヌクレオチド
を含む油料種子植物であって、
各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、
前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、
前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満である、前記油料種子植物。
【請求項14】
以下の特徴：
ｉ）キャノーラ、ダイズ、カメリナ サティバ、またはシロイヌナズナ植物である；
ｉｉ）１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使用することができる；
ｉｉｉ）前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも２８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する；
の１またはそれ以上が該当する、請求項１３の植物。
ｉ）キャノーラ、ダイズ、カメリナ サティバ、またはシロイヌナズナ植物である；
ｉｉ）１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使用することができる；
ｉｉｉ）前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも２８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する；
の１またはそれ以上が該当する、請求項１３の植物。
【請求項15】
以下の特徴：
ｉ）請求項１から５のいずれか１つに定義される脂質を含む；または
ｉｉ）請求項１２から１４のいずれか１つの植物由来である；
の１またはそれ以上を有する植物部分。
ｉ）請求項１から５のいずれか１つに定義される脂質を含む；または
ｉｉ）請求項１２から１４のいずれか１つの植物由来である；
の１またはそれ以上を有する植物部分。
【請求項16】
種子である、請求項１５の植物部分。
【請求項17】
種子を産生する方法であって、
ａ）請求項１５もしくは１６に定義される部分を産生する植物を成長させること、または請求項１２から１５のいずれか１つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出することと、
を含む、方法。
ａ）請求項１５もしくは１６に定義される部分を産生する植物を成長させること、または請求項１２から１５のいずれか１つに定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出することと、
を含む、方法。
【請求項18】
請求項１６の種子から得られる種子ミール。
【請求項19】
家畜飼料を産生する方法であって、
１またはそれ以上の、請求項１から５のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、請求項１０の前記細胞、請求項１１もしくは１２の前記トランスジェニック生物、請求項１３もしくは１４の前記油料種子植物、請求項１５もしくは１６の前記植物部分、または請求項１８の前記種子ミールを、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む、方法。
１またはそれ以上の、請求項１から５のいずれか１つの前記脂質もしくはオイル、請求項１０の前記細胞、請求項１１もしくは１２の前記トランスジェニック生物、請求項１３もしくは１４の前記油料種子植物、請求項１５もしくは１６の前記植物部分、または請求項１８の前記種子ミールを、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む、方法。
【請求項20】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状の治療または防止に使用するための、請求項１から５のいずれか１つの前記脂質。
【請求項21】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状の治療または防止に使用するための、請求項１８に記載の前記種子ミール。
【請求項22】
多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスであって、
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満であり、これにより前記エチルエステルを産生する、プロセス。
抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが７％(w/w)から２０％(w/w)であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは２％(w/w)から１６％(w/w)の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは１％(w/w)未満であり、これにより前記エチルエステルを産生する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組換え植物細胞において、長鎖多価不飽和脂肪酸、特にドコサヘキサエン酸を合成する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
オメガ３長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣ‐ＰＵＦＡ）は、ヒトおよび動物の健康のために重要な化合物として現在広く認識されている。これらの脂肪酸は、食事供給源から、またはその両方がヒトの食事において必須脂肪酸であるとされる、リノール酸（ＬＡ，１８：２ω６）もしくはα‐リノレン酸（ＡＬＡ，１８：３ω３）の脂肪酸の転換により得られるかもしれない。ヒトおよび多くの他の脊椎動物が植物源から得られたＬＡまたはＡＬＡをＣ２２に転換することができ、一方、それらは非常に低い割合でこの転換を行う。さらに、最も現代的な社会では、理想であるとされるω６：ω３脂肪酸について４：１の比またはそれ以下の代わりに、少なくとも９０％の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）がω６脂肪酸である、アンバランスな食事をしている（非特許文献１）。ヒトについてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，２０：５ω３）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６ω３）のようなＬＣ‐ＰＵＦＡの即時の食事供給源は、大部分は魚および魚油である。健康の専門家は、よって、ヒトの食事に、有意なレベルのＬＣ‐ＰＵＦＡを含む魚を規則的に含めることを薦めている。ますます、魚由来のＬＣ‐ＰＵＦＡオイルは、食品生産物、例えば、調整粉乳に組み込まれている。しかしながら、グローバルなおよび国際的な水産業の低下に起因し、これらの有益な健康増進オイルの代替的なソースが必要とされる。
【0003】
動物と対照的に、顕花植物は、１８の炭素よりも長い鎖の長さを有する多価不飽和脂肪酸を合成する性能を欠く。特に、他の被子植物とともに作物および園芸作物は、ＡＬＡ由来であるＥＰＡ、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ，２２：５ω３）、およびＤＨＡのようなより長い鎖のω３脂肪酸を合成するために必要とされる酵素を有していない。植物のバイオテクノロジーにおける重要なゴールは、よって、実質的な量のＬＣ‐ＰＵＦＡを産生し、これによりこれらの化合物の代替的なソースを提供する作物植物のエンジニアリングである。
【0004】
ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成経路微細藻類、蘚類、および真菌類のような、生物におけるＬＣ‐ＰＵＦＡの生合成は、通常、一連の酸素依存的な不飽和化および鎖延長反応として生じる（図１）。これらの生物において、ＥＰＡを産生する最も一般的な経路は、Δ６‐不飽和化、Δ６‐伸長およびΔ５‐不飽和化（Δ６‐不飽和化経路と呼ばれる）を含み、一方、より一般的ではない経路は、Δ９‐伸長、Δ８‐不飽和化、およびΔ５‐不飽和化（Δ９‐不飽和化経路とよばれる）を使用する。これらの連続的な不飽和化および鎖延長反応は、図１の左上に模式的に示されるω６脂肪酸基質ＬＡ（ω６）または図１の右下に示されるＥＰＡにたどり着くω３基質ＡＬＡ（ω３）のいずれかにより開始し得る。最初のΔ６‐不飽和化がω６基質ＬＡで行われる場合、一連の３つの酵素のＬＣ‐ＰＵＦＡ産生物は、ω６脂肪酸ＡＲＡであろう。ＬＣ‐ＰＵＦＡ合成生物は、アラキドン酸（ＡＲＡ，２０：４ω６）のＥＰＡへの転換について、図１にΔ１７‐デサチュラーゼ工程として示されるように、ω３‐デサチュラーゼを用いて、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換することとしてもよい。ω３‐デサチュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、ＬＡからＡＲＡの範囲の種々の基質で作用し得る。植物のω３‐デサチュラーゼはＬＡのＡＬＡへのΔ１５‐不飽和化を特異的に触媒することが多く、一方、真菌および酵母のω３‐デサチュラーゼは、ＡＲＡのＥＰＡへのΔ１７‐不飽和化に特異的であることとしてもよい（非特許文献２、非特許文献３）。いくつかの報告は、多種多様なω６基質をそれらの対応するω３産生品に転換し得る非特異的なω３‐デサチュラーゼが存在することを示唆する（非特許文献４）。
【0005】
これらの生物におけるＥＰＡのＤＨＡへの変換は、ＤＰＡを産生するためにＥＰＡのΔ５‐伸長により生じ、その後、ＤＨＡを産生するためのΔ４‐不飽和化に続く（図１）。対照的に、哺乳類は、Δ４‐デサチュラーゼとは独立した、３つの別個の反応により、ＤＰＡをＤＨＡに転換する、いわゆる「シュプレッヒャー（Sprecher）」経路を使用する（非特許文献５）。
【0006】
植物、蘚類、微細藻類、およびカエノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis elegans）のような下等動物に概してみられるフロントエンドのデサチュラーゼは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）基質のｓｎ‐２位置にエステル化された脂肪酸基質を主に受容する。これらのデサチュラーゼは、よって、アシル‐ＰＣ、脂質‐結合フロントエンドデサチュラーゼとして知られる（非特許文献６）。対照的に、高等動物のフロントエンドデサチュラーゼは、概して、脂肪酸基質がＰＣよりもむしろＣｏＡに結合するアシル‐ＣｏＡ基質を受容する（非特許文献７）。いくつかの微細藻類デサチュラーゼおよび１つの植物デサチュラーゼは、ＣｏＡへとエステル化される脂肪酸基質を使用することが知られる（表２）。
【0007】
各ＰＵＦＡ鎖延長反応は、多成分性のタンパク質複合体により触媒される４つの工程からなり、まず、縮合反応が、マロニル‐ＣｏＡから脂肪酸に２Ｃユニットの追加をもたらし、β‐ケトアシル中間物の形成をもたらす。次に、これがＮＡＤＰＨにより還元され、その後エノイル中間物を産生するための脱水へと続いた。この中間物は、最後に、伸長された脂肪酸を産生するために２回目の還元がなされた。概して、これらの４つの反応の濃縮工程は基質特異的であり、一方、他の工程はそうではないことが考えられる。実施においては、このことは、天然の植物の伸長機構は、ＰＵＦＡに特異的な濃縮酵素（概して「エロンガーゼ（elongase）」と呼ばれる）が導入されることを提供するＰＵＦＡを伸長することができるが、非天然ＰＵＦＡ基質を伸長することにおける、天然の植物伸長機構の効率は、低いかもしれないことを意味する。２００７年に、酵母の伸長サイクルデヒドラターゼの同定および特徴づけが公開された（非特許文献８）。
【0008】
植物、蘚類、および微細藻類におけるＰＵＦＡ不飽和化は、アシル‐ＰＣプールにおける脂肪酸基質に対して主に天然に生じ、一方、伸長は、アシル‐ＣｏＡプールにおける基質に対して生じる。アシル‐ＰＣ分子からＣｏＡ担体への脂肪酸の転移は、ホスホリパーゼ（ＰＬＡ）により行われ、一方、アシル‐ＣｏＡ脂肪酸からＰＣ担体への転移は、リゾホスファチジル‐コリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）により行われる（図２１）（非特許文献９）。
【0009】
ＬＣ‐ＰＵＦＡの工学的産生ほとんどのＬＣ‐ＰＵＦＡ代謝工学は、有酸素性のΔ６‐不飽和化／伸長経路を用いて行われてきた。タバコにおけるγ‐リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３ω６）の生合成が、シアノバクテリウムシネコシスティス由来のΔ６‐デサチュラーゼを用いて、１９９６年に最初に報告された（非特許文献１０）。より近年では、ＧＬＡがベニバナ（種子オイルにおける７３％ＧＬＡ；非特許文献１１）およびダイズ（２８％ＧＬＡ；非特許文献１２）のような作物植物において産生された。ＥＰＡおよびＤＨＡのようなＬＣ‐ＰＵＦＡの産生は、増加した数の不飽和化および関連する伸長工程に起因する、より複雑な工学を伴う。陸上植物におけるＥＰＡの産生は、イソクリシスガルバナ（Isochrysis galbana）由来のΔ９‐エロンガーゼ、ユーグレナグラシリス由来のΔ８‐デサチュラーゼ、およびモルティエレラアルピナ由来のΔ５‐デサチュラーゼをコードする遺伝子をアラビドプシスに導入し、３％までのＥＰＡを産生した非特許文献１３により最初に報告された。この研究は、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）由来のΔ６‐デサチュラーゼおよびΔ６‐エロンガーゼ、並びにフェオダクチラム（Phaeodactylum tricornutum）由来のΔ５‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いる亜麻の種子において、０．８％までのＥＰＡの産生を報告した非特許文献１４により続けられた。
【0010】
ＤＨＡ産生の最初の報告、および報告された最も高いレベルのＶＬＣ‐ＰＵＦＡ産生を示すのが、種子ではなく、魚類の内臓真菌症菌（Saprolegnia diclina）のΔ６‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ６‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ５‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症菌のΔ４‐デサチュラーゼ、魚類の内臓真菌症菌のΔ１７‐デサチュラーゼ、モルティエレラアルピナのΔ６‐エロンガーゼおよびパブロバルセリ（Pavlova lutheri）のΔ５‐エロンガーゼをコードする遺伝子を導入することにより、ダイズ胚における３％ＤＨＡの産生が記載される、特許文献１であった。また、ＤＨＡをも産生する胚における最大のＥＰＡのレベルは、ＥＰＡのＤＨＡへの転換の効率が乏しいことを示す、１９．６％であった（特許文献２）。この発見は、非特許文献１５により公開されたものと同様であり、ＥＰＡからＤＨＡへの流動は低く、ゼブラフィッシュΔ５／６‐デサチュラーゼ、カエノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis elegans）Δ６‐エロンガーゼ、並びにパブロバサリナ（Pavlova salina）Δ５‐エロンガーゼおよびΔ４‐デサチュラーゼを用いるアラビドプシスにおいて３％ＥＰＡおよび０．５％ＤＨＡの産生であった。また、２００５年には、Wu et al.が、ピティウムイレギュラレ（Pythium irregulare）のΔ６‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッド（Thraustochytrid）のΔ５‐デサチュラーゼ、ヒメツリガネゴケのΔ６‐エロンガーゼ、キンセンカ（Calendula officianalis）のΔ１２‐デサチュラーゼ、スラウストキトリッドのΔ５‐エロンガーゼ、フィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）のΔ１７‐デサチュラーゼ、ニジマス（Oncorhyncus mykiss）のＬＣ‐ＰＵＦＡエロンガーゼ、スラウストキトリッドのΔ４‐デサチュラーゼ、およびスラウストキトリッドＬＰＣＡＴを用いて、セイヨウカラシナにおける２５％ＡＲＡ、１５％ＥＰＡ、および１．５％ＤＨＡの産生を公開した（非特許文献１６）。ω３ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成する油料種子作物を産生するための試みの概要は、非特許文献１７および非特許文献１８で提供される。非特許文献１８により示されるように、トランスジェニック植物においてＤＨＡの産生について示すための得られた結果は、魚油においてみられるレベルに近いものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】国際公開第０４／０１７４６７号
【特許文献2】国際公開第２００４／０７１４６７号
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Trautwein, 2001
【非特許文献2】Pereira et al., 2004a
【非特許文献3】Zank et al., 2005
【非特許文献4】Zhang et al., 2008
【非特許文献5】Sprecher et al., 1995
【非特許文献6】Domergue et al. , 2003
【非特許文献7】Domergue et al., 2005
【非特許文献8】Denic and Weissman, 2007
【非特許文献9】Singh et al. , 2005
【非特許文献10】Reddy and Thomas, 1996
【非特許文献11】Knauf et al., 2006
【非特許文献12】Sato et al., 2004
【非特許文献13】Qi et al. (2004)
【非特許文献14】Abbadi et al. (2004)
【非特許文献15】Robert et al. (2005)
【非特許文献16】Wu et al., 2005
【非特許文献17】Venegas-Caleron et al. (2010)
【非特許文献18】Ruiz-Lopez et al. (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
従って、遺伝子組換え細胞におけるＬＣ‐ＰＵＦＡの、特に、油料種子植物の種子におけるＤＨＡのより効率的な産生の必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者は、高いレベルのＤＨＡを有する脂質を産生するために特定された方法および植物を有する。
【0015】
第１の態様において、本発明は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である、抽出植物脂質を提供する。
【0016】
一実施形態においては、前記抽出脂質は、以下の特徴：ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルは、約２％から１８％の間、または約２％から１６％の間、または約２％から１５％の間であり、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、約６％未満、または約３％未満、または約２％未満、または約１％未満である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、約１％から約３０％の間、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２０％の間、約３０％から約６０％の間、約４５％から約６０％、または約３０％である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、約４％から約３５％の間、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％の間である、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、約４％から約４０％の間、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、約４％から１６％の間、または約２％から１６％の間である、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルは、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から約７％の間、０．０５％から約４％の間、０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルは、約７％未満、約６％未満、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルは、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約６％の間、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、約４％未満、約２％未満、約１％未満、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間、または約０．０５％から約１％の間である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルは、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約０．０５％から約１０％の間、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルは、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約０．０５％から約８％の間、約０．０５％から約５％の間、または約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｉｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まない、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約２５％の間、約４％から約２０％の間、約６％から約２０％の間、約４％から約６０％の間、約３０％から約６０％の間、または約４５％から約６０％の間である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間である、
ｘｖｉｉｉ）記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約２０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から約２０％の間、約２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％から約６５％の間、約４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％から約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、約９％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｘｘｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間の、Δ１２‐デサチュラーゼによる、オレイン酸のＬＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の、Δ６‐デサチュラーゼによる、ＡＬＡのＳＤＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間の、Δ６‐エロンガーゼによる、ＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間の、Δ５‐デサチュラーゼによる、ＥＴＡのＥＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の、Δ５‐エロンガーゼによる、ＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の、Δ４‐デサチュラーゼによる、ＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘｉｖ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｘｘｖ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間であり、
ｘｘｘｖｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｘｖｉｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．００１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含み、または、これらを実質的に含まない、
ｘｘｘｖｉｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％または少なくとも８０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｘｘｘｉｘ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、
ｘｌ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【0017】
別の実施形態では、前記抽出脂質は、オイルの形態であって、該オイルの重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約９８％の間が前記脂質である。
【0018】
好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特徴を有する：前記脂質またはオイルにおける前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは６％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約１％から約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、ＡＬＡが存在し、ＧＬＡが存在し、前記ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり、前記ＥＴＡのレベルは約４％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約０．０５％から約１０％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約４％から約３５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％のΔ１２‐デサチュラーゼによるオレイン酸のＬＡへの転換の効率、少なくとも約６０％のΔ６‐エロンガーゼによるＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率、約５０％から約９５％の間のΔ５‐エロンガーゼによるＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率、約５０％から約９５％の間Δ４‐デサチュラーゼによるＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１０％のオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づき、および前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０％であり、並びに、任意に、前記脂質は、コレステロールを実質的に含まないおよび／または前記脂質がトリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。
【0019】
より好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは、種子オイルは、以下の特徴を有する：前記脂質における前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは２％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約１％から約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、前記ＡＬＡのレベルは約７％から約４０％の間であり、前記ＧＬＡのレベルは約４％未満であり、前記ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり、前記ＥＴＡのレベルは約４％未満であり、前記ＥＴｒＡのレベルは約０．０５％から約４％の間であり、前記ＥＰＡのレベルは約０．０５％から約１０％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約４％から約３５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは０．５％から約１０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは３６％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルは約９％から約３３％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における、ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３．０の間であり、前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約６０％のΔ１２‐デサチュラーゼによるオレイン酸のＬＡへの転換の効率、少なくとも約６０％のΔ６‐エロンガーゼによるＳＤＡのＥＴＡ酸への転換の効率、少なくとも約６０％のΔ５‐デサチュラーゼによるＥＴＡのＥＰＡへの転換の効率、約５０％から約９５％の間のΔ５‐エロンガーゼによるＥＰＡのＤＰＡへの転換の効率、約５０％から約９５％の間Δ４‐デサチュラーゼによるＤＰＡのＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１０％のオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１５％のＬＡのＤＨＡへの転換の効率、少なくとも約１７％のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づき、並びに、前記抽出脂質における前記脂肪酸含有量が１％未満のＣ２０：１であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０％であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、および前記脂質はトリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。好ましくは、前記脂質もしくはオイルはキャノーラオイルであり、および／または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。好ましい実施形態において、前記脂質またはキャノーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルへと前記オイルにおける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとしてもよい。さらなる処理が、ＤＨＡについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適用されることとしてもよい。
【0020】
一実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは種子オイルは、以下の特徴を有する：前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは２％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約３０％から約６０％の間、好ましくは約４５％から約６０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約２０％の間であり、前記ＡＬＡのレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ＧＬＡのレベルは約３％未満であり、前記ＳＤＡのレベルは約３％未満であり、前記ＥＴＡのレベルは約４％未満であり、前記ＥＴｒＡのレベルは約２％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約４％未満であり、前記ＤＰＡのレベルは約４％未満であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約３０％から約６０％の間、または約４０％から約６０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約２０％から約７５％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは約０．５％から約１０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは約１０％から約２０％の間であり、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルは約９％から約２０％の間であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３．０の間であり、前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０％であり、前記脂質はコレステロールを実質的に含まず、および前記脂質はトリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。好ましくは、前記脂質またはオイルは、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まず、および／またはキャノーラオイルであり、および／または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。特定の実施形態では、前記脂質またはキャノーラオイルは、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルへと前記オイルにおける前記脂肪酸を転換するためにその後に処理されることとしてもよい。さらなる処理が、ＤＨＡについての前記脂質またはオイルを濃縮するために適用されることとしてもよい。
【0021】
さらに好ましい実施形態では、前記脂質またはオイル、好ましくは種子オイルは、以下の特徴を有する：前記脂質またはオイルの前記総脂肪酸含有量において、前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％の間であり、前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、前記ミリスチン酸のレベルは６％未満であり、前記オレイン酸のレベルは約１％から約３０％の間であり、前記ＬＡのレベルは約４％から約３５％の間であり、ＡＬＡが存在し、ＧＬＡが存在し、前記ＳＤＡのレベルは約０．０５％から約７％の間であり、前記ＥＴＡのレベルは約６％未満であり、前記ＥＰＡのレベルは約０．０５％から約１０％の間であり、前記ＤＰＡのレベルは約０．０５％から約８％の間である。
【0022】
さらなる実施形態では、前記抽出脂質は、１またはそれ以上のステロール、好ましくは植物ステロールをさらに含む。
【0023】
別の実施形態では、前記抽出脂質はオイルの形態であって、約１０ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約７ｍｇのステロール／ｇのオイル未満、約１．５ｍｇから約１０ｍｇの間のステロール／ｇのオイル、または約１．５ｍｇから約７ｍｇの間のステロール／ｇのオイルを含む。
【0024】
前記抽出脂質内にあり得るステロールの例は、カンペステロール／２４‐メチルコレステロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリコール（eburicol）、β‐シトステロール／２４‐エチルコレステロール、Δ５‐アベナステロール（avenasterol）／イソフコステロール、Δ７‐スチグマステロール／スティグマスト（stigmast）‐７‐エン‐３β‐オール、およびΔ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上、または全てを含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【0025】
一実施形態では、前記植物種は、キャノーラのような、表２６に挙げられたものであり、前記ステロールのレベルは、その特定の植物種について表２６で挙げられたものとほぼ同じである。
【0026】
一実施形態では、前記抽出脂質は、約０．５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０．２５ｍｇのコレステロール／ｇのオイル未満、約０ｍｇから約０．５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイル、もしくは約０ｍｇから約０．２５ｍｇの間のコレステロール／ｇのオイルを含む、またはコレステロールを実質的に含まない。
【0027】
さらなる実施形態では、前記脂質はオイルであり、好ましくは、油料種子由来のオイルである。このようなオイルの例は、キャノーラオイルのようなアブラナ属種オイル、ワタオイル、アマオイル、ヒマワリ属種オイル、ベニバナオイル、ダイズオイル、トウモロコシオイル、シロイヌナズナオイル、モロコシオイル、ソルガムブルガレ（Sorghum vulgare）オイル、エンバクオイル、トリフォリウム属種オイル、エラエイスグイネエヌシス（Elaesis guineenis）オイル、ベンサミアナタバコオイル、オオムギオイル、ルピナスアングスティフォリウス（Lupinus angustifolius）オイル、イネオイル、アフリカイネオイル、カメリナサティバ（Camelina sativa）オイル、クランベアビシニカ（Crambe abyssinica）オイル、ミスカンサスｘギガンティウスオイル（Miscanthus x giganteus）、またはススキオイルを含むが、これらに限定されない。
【0028】
エステル化形態で脂肪酸を含む、抽出植物脂質、好ましくは抽出されたキャノーラ種子オイルもまた提供され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、脂質は以下の特徴を有する：ｉ）前記ＤＨＡのレベルが、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％であり、
ｉｉ）前記パルミチン酸のレベルが、約２％から約１６％の間であり、
ｉｉｉ）前記ミリスチン酸のレベルが、約２％未満であり、
ｉｖ）前記オレイン酸のレベルが、約３０％から約６０％の間、好ましくは約４５％から約６０％の間であり、
ｖ）前記ＬＡのレベルが、約４％から約２０％の間であり、
ｖｉ）前記ＡＬＡのレベルが、約２％から約１６％の間であり、
ｖｉｉ）前記ＧＬＡのレベルが、約４％未満であり、
ｖｉｉｉ）前記ＳＤＡのレベルが、約６％未満、または約４％未満であり、
ｉｘ）前記ＥＴＡのレベルが、約６％未満、または約４％未満であり、
ｘ）前記ＥＴｒＡのレベルが、約１％未満であり、
ｘｉ）前記ＥＰＡのレベルが、約１０％未満であり、および／または前記ＥＰＡのレベルが、前記ＤＨＡのレベルの０．５から２．０倍であり、
ｘｉｉ）前記ＤＰＡのレベルが、約４％未満であり、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルが、約４％から約２５％の間であり、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルが、約３０％から約７０％の間であり、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルが、約１５％から約７５％の間、好ましくは約１５％から約３０％の間であり、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルが、約０．５％から約１０％の間であり、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総ω３脂肪酸のレベルが、約１０％から約２０％の間であり、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルが、約３％から約２０％の間であり、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約０．０３から約３．０の間であり、
ｘｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約７０％であり、および
ｘｘｉｉ）前記脂質は、コレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。より好ましくは、前記脂質は、ＳＤＡおよびＥＴＡを実質的に含まず、および／または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
【0029】
別の態様では、エステル化形態で脂肪酸を含む、抽出植物脂質が提供され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、（ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが７％から２０％の間であり、（ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルが６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、１％から３０％の間、好ましくは３０％から６０％の間であり、（ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルが４％から３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量におけるαリノレン酸（ＡＬＡ）のレベルが４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルが４％未満であり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルが４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比が、１．０から３．０の間、または０．１から１の間であり、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも７０％であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態においてエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３位置にある。一実施形態では、１もしくはそれ以上のまたは全ての以下の特徴を有する：ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが約２％から約１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルが１％未満である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２０％の間、約４５％から約６０％の間、または約３０％である、
ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルが、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％の間である、
ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルが、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、または約４％から約１６％の間である、
ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルが、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルが、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルが、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間である、
ｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％，約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｉｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｉｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まない、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約２０％の間、または約６％から約２０％の間である、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間である、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約２０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％の間である、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間である、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｘｘｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％から約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｘｘｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｘｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｘｘｉｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｘｘｖ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｘｘｉｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間である、
ｘｘｘ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｘｘｘｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．００１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含み、または、これらを実質的に含まない、
ｘｘｘｉｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも８０％が、ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｘｘｘｉｉｉ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、および
ｘｘｘｉｖ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。
【0030】
特に上記態様に関し、一実施形態では、ｉ）前記脂質がオイルの形態であり、該オイルが、カンペステロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ５‐アベナステロール、Δ７‐スチグマステロールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上のまたは全てのような、１もしくはそれ以上のステロールを含み、および、任意に、前記オイルは１０ｍｇ未満のステロール／ｇのオイルを含む、および／もしくは前記オイルはコレステロールを実質的に含まず、並びに／または、
ｉｉ）前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子であるような、油料種子由来のオイルの形態である。
【0031】
別の態様では、本発明は、ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）の１またはそれ以上を含み、前記植物部分における前記抽出可能な脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスを提供する。
【0032】
好ましい実施形態では、前記抽出脂質は、上記に定義される１またはそれ以上の特徴を有する。
【0033】
一実施形態では、前記植物部分は、種子、好ましくは油料種子である。このような種子の例は、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ（アラビドプシスタリアナ）、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカ、好ましくは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ（Ｃ．サティバ）種子を含むが、これらに限定されない。
【0034】
別の実施形態では、前記種子は、種子１グラム当たり、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、約１８ｍｇから約１００ｍｇの間、約２２ｍｇから約７０ｍｇの間、または約２４ｍｇから約５０ｍｇのＤＨＡを含む。
【0035】
さらなる実施形態では、前記植物部分は、以下のセットの酵素：ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物部分の細胞において、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることが可能である、１またはそれ以上のプロモーターに操作可能に結合される。
【0036】
さらに、さらなる実施形態では、前記植物部分は、以下の特徴：ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、約６０％から約９８％の間、約７０％から約９５％の間、または約７５％から約９０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞におけるオレイン酸をリノール酸に転換する、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、約６５％から約９５％の間、約７５％から約９５％の間、または約８０％から約９５％の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ω６脂肪酸をω３脂肪酸に転換する、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約３０％から約７０％の間、約３５％から約６０％の間、または約５０％から約７０％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＡＬＡをＳＤＡに転換する、
ｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満、約０．１％から約５％の間、約０．５％から約２．５％の間、または約０．５％から約１％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換する、
ｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、約６０％から約９５％の間、約７０％から約８８％の間、または約７５％から約８５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＳＤＡをＥＴＡに転換する、
ｖｉ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約６０％から約９９％の間、約７０％から約９９％の間、または約７５％から約９８％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＴＡをＥＰＡに転換する、
ｖｉｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％の間、約５０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＥＰＡをＤＰＡに転換する、
ｖｉｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９３％、約５０％から約９５％の間、約８０％から約９５％の間、または約８５％から約９５％の間の効率で、１またはそれ以上の植物の細胞において、ＤＰＡをＤＨＡに転換する、
ｉｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのオレイン酸の転換の効率が、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間である、
ｘ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＬＡの転換の効率が、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間である、
ｘｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞における、ＤＨＡへのＡＬＡの転換の効率が、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間である、
ｘｉｉ）前記植物部分の１またはそれ以上の細胞が、前記外因性ポリヌクレオチドを欠いている対応する細胞よりも、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１５％から約３０％の間、または約２２．５％から約２７．５％の間で多いω３脂肪酸を含む、
ｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、、リノール酸（ＬＡ）に対してα‐リノレン酸（ＡＬＡ）を優先的に不飽和化する、
ｘｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼは、また、Δ９‐エロンガーゼ活性を有する、
ｘｖ）前記Δ１２‐デサチュラーゼは、また、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、また、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｖｉｉ）前記Δ８‐デサチュラーゼは、また、Δ６‐デサチュラーゼ活性を有し、またはΔ６‐デサチュラーゼ活性を有していない、
ｘｖｉｉｉ）前記Δ１５‐デサチュラーゼは、また、ＧＬＡでω３‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｉｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、また、ＬＡでΔ１５‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘ）前記ω３‐デサチュラーゼは、両方のＬＡおよび／またはＧＬＡを不飽和化する、
ｘｘｉ）前記ω３‐デサチュラーゼは、、ＬＡに対してＧＬＡを優先的に不飽和化する、
ｘｘｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１５％から約３０％の間、または約２０％から約２５％の間の、前記植物部分におけるオレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｉｉ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、約１５％から約６０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２２％から約３０％の間の、前記植物部分におけるＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｉｖ）前記植物部分における前記ＤＨＡのレベルは、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約６５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間の、前記植物部分におけるＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｘｘｘ）１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼが、対応するアシル‐ＰＣ基質よりもアシル‐ＣｏＡ基質で、より高い活性を有する、
ｘｘｘｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としての、ＬＡよりもＡＬＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、脂肪酸基質としてのＰＣのｓｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する、
ｘｘｘｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、基質としてのＡＬＡで、ＬＡと比較して、少なくとも約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性、少なくとも３倍高い活性、少なくとも４倍高い活性、または少なくとも５倍高い活性を有する、
ｘｘｘｉｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、より高い活性を有する、
ｘｘｘｖ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、少なくとも約５倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する、
ｘｘｘｖｉ）前記デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである、
ｘｘｘｖｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで、検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有していない、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【0037】
さらに、さらなる実施形態では、前記植物部分が、１もしくはそれ以上のまたは全ての以下の特徴：ｉ）前記Δ１２‐デサチュラーゼが、配列番号１０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｉ）前記ω３‐デサチュラーゼが、配列番号１２で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｉｉ）前記Δ６‐デサチュラーゼが、配列番号１６で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｉｖ）前記Δ６‐エロンガーゼが、配列番号２５で規定される配列を有するアミノ酸、配列番号２６のようなその生物学的に活性な断片、または配列番号２５および／または配列番号２６と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖ）前記Δ５‐デサチュラーゼが、配列番号３０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖｉ）前記Δ５‐エロンガーゼが、配列番号３７で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
ｖｉｉ）前記Δ４‐デサチュラーゼが、配列番号４１で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４１と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【0038】
一実施形態では、前記植物部分が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＭＧＡＴ）、グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）、１‐アシル−グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）、好ましくはＣ２２多価不飽和脂肪族アシル‐ＣｏＡ基質を使用し得るＬＰＡＡＴ、アシル‐ＣｏＡ：リソホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、ＣＤＰ‐コリンジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＣＰＴ）、ホスファチジルコリン（phoshatidylcholine）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）、ホスファチジルコリン：ジアシルグリセロールコリンホスフォトランスフェラーゼ（ＰＤＣＴ）、アシル‐ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせをコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
【0039】
別の実施形態では、前記植物部分が、ＦＡＥ１、ＤＧＡＴ、ＭＧＡＴ、ＧＰＡＴ、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、ＰＬＡ２、ＰＬＣ、ＰＬＤ、ＣＰＴ、ＰＤＡＴ、ＦＡＴＢのようなチオエステラーゼ、またはΔ１２‐デサチュラーゼ、または２つもしくはそれ以上のこれらの組み合わせから選択される、前記植物部分の細胞における内因性酵素の産生および／または活性を下方制御する、導入された突然変異または外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。
【0040】
さらなる実施形態では、少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが種子特異的プロモーターである。一実施形態では、少なくとも１つまたは全ての前記プロモーターが、オイル生合成もしくはオレオシンのような蓄積遺伝子から、またはコンリニン（conlinin）のような種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られている。
【0041】
別の実施形態では、前記Δ４‐デサチュラーゼおよび前記Δ５‐エロンガーゼをコードする、外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける前記プロモーターが、前記植物部分の種子の発生以前、またはピークの発現に達する以前において、ポリヌクレオチドの発現を開始し、前記プロモーターが前記Δ１２‐デサチュラーゼおよび前記ω３‐デサチュラーゼをコードする前記外因性ポリヌクレオチドの発現を方向づける。
【0042】
さらなる実施形態では、前記外因性ポリヌクレオチドは、前記植物部分の細胞のゲノムに組込まれるＤＮＡ分子、好ましくはＴ‐ＤＮＡ分子において共有結合で結合され、好ましくは前記植物部分の前記細胞の前記ゲノムに組込まれるこのようなＤＮＡ分子の数は、１、２もしくは３以下であり、または２もしくは３である。
【0043】
さらに別の実施形態では、前記植物は、同じまたは異なるアミノ酸配列を有するΔ６‐デサチュラーゼをそれぞれコードする少なくとも２つの異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。
【0044】
さらなる実施形態では、前記外因性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分の総オイル含有量は、前記外因性ポリヌクレオチドを欠く対応する植物部分の総オイル含有量の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または約５０％から約８０％の間である。これらの実施形態において、最大の前記オイル含有量は、対応する野生型の植物部分の前記オイル含有量の約１００％であることとしてもよい。
【0045】
別の実施形態では、前記脂質は、オイル、好ましくは、油料種子由来の種子オイルの形態であり、前記脂質の重量の少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または約９５％から約９８％の間がトリアシルグリセロールである。
【0046】
さらなる実施形態では、前記プロセスは、前記総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての前記ＤＨＡのレベルを増加させるために前記脂質を処理することをさらに含む。例えば、前記処理がエステル交換反応である。例えば、キャノーラオイルのような前記脂質が、前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルに転換するために処理されることとしてもよく、その後、前記ＤＨＡについての前記脂質またはオイルを濃縮するために分画することとしてもよい。
【0047】
ｉ）脂質を含む、植物部分、好ましくは、キャノーラ種子を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記植物部分における抽出可能な脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％である工程、およびｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出する工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスがさらに提供され、
前記抽出脂質は、前記脂質の前記総脂肪酸含有量において、以下の特徴を有する：
ｉ）前記ＤＨＡのレベルは約３％、約４％、約５％、約６％、または約７％であり、
ｉｉ）前記パルミチン酸のレベルは約２％から約１６％の間であり、
ｉｉｉ）前記ミリスチン酸のレベルは２％未満であり、
ｉｖ）前記オレイン酸のレベルは約３０％から約６０％の間、好ましくは約４５％から約６０％の間であり、
ｖ）前記ＬＡのレベルは約４％から約２０％の間であり、
ｖｉ）前記ＡＬＡのレベルは約２％から約１６％の間であり、
ｖｉｉ）前記ＧＬＡのレベルは約４％未満であり、
ｖｉｉｉ）前記ＳＤＡのレベルは、約６％未満、または約４％未満であり、
ｉｘ）前記ＥＴＡのレベルは、約６％未満、または約４％未満であり、
ｘ）前記ＥＴｒＡのレベルは約１％未満であり、
ｘｉ）前記ＥＰＡのレベルは約１０％未満であり、および／または前記ＥＰＡのレベルは前記ＤＨＡのレベルの０．５から２．０倍であり、
ｘｉｉ）前記ＤＰＡのレベルは約４％未満であり、
ｘｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総飽和脂肪酸のレベルは約４％から約２５％の間であり、
ｘｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総一価不飽和脂肪酸のレベルは約３０％から約７０％の間であり、
ｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記総多価不飽和脂肪酸のレベルは約１５％から約７５％の間、好ましくは、約１５％から約３０％の間であり、
ｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω６脂肪酸のレベルは約０．５％から約１０％の間であり、
ｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは約１０％から約２０％の間であり、
ｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記新ω３脂肪酸のレベルは約３％から約２０％の間であり、
ｘｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．０５から約３．０の間、好ましくは約０．５０未満であり、
ｘｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は約０．０３から約３．０の間であり、
ｘｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は少なくとも約７０％であり、および
ｘｘｉｉ）前記脂質はコレステロールを実質的に含まない。一実施形態では、前記脂質はトリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む。より好ましくは、前記脂質は、ＳＤＡおよびＥＴＡを実質的に含まず、および／または前記植物または植物部分から抽出された後に、エステル交換反応プロセスにより処理されない。
【0048】
ｉ）脂質を含む植物部分を得ることであって、前記脂質はエステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに、１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、（ｉ）前記抽出脂質の総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、７％から２０％の間であり、（ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、１％から３０％の間または３０％から６０％の間であり、（ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％から３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満であり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、または０．１から１の間であり、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも７０％であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％が、ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある工程、％、および、
ｉｉ）前記植物部分から脂質を抽出することであって、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約７％から２０％である工程、
を含む、抽出植物脂質を産生するためのプロセスもまた提供される。
【0049】
本発明のプロセスを用いて産生される、脂質または該脂質を含むオイルもまた提供される。
【0050】
別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、エステル化形態で脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに任意に１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが約７％から２０％であり、これにより前記エチルエステルを産生する。
【0051】
好ましい実施形態では、前記抽出脂質は、１またはそれ以上の上記の特徴を有する。
【0052】
別の態様では、本発明は、多価不飽和脂肪酸のエチルエステルを産生するためのプロセスを提供し、該プロセスは、抽出植物脂質におけるトリアシルグリセロールをエステル交換することを含み、前記抽出植物脂質は、トリアシルグリセロールの形態でエステル化された脂肪酸を含み、該脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、並びに１またはそれ以上のステアリドン酸（ＳＤＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）、およびエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、（ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％、約４％、約５％、約６％、または７％から２０％の間であり、（ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが、２％から１６％の間であり、（ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルは、６％未満であり、（ｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルは、１％から３０％の間または３０％から６０％の間であり、（ｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルは、４％から３５％の間であり、（ｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルは、４％から４０％の間であり、（ｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルは、４％未満であり、（ｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、４％から２５％の間であり、（ｉｘ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、１．０から３．０の間、または０．１から１の間であり、（ｘ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも７０％であり、および（ｘｉ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも７０％が、ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にあり、これにより前記エチルエステルを産生する。一実施形態では、前記抽出植物脂質は、以下の特徴：ｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記パルミチン酸のレベルが２％から１５％の間である、
ｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ミリスチン酸（Ｃ１４：０）のレベルが１％未満である、
ｘｘｘｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記オレイン酸のレベルが、約３％から約３０％の間、約６％から約３０％の間、１％から約２０％の間、約４５％から約６０％の間、または約３０％である、
ｘｘｘｖｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記リノール酸（ＬＡ）のレベルが、約４％から約２０％の間、または約４％から１７％である、
ｘｘｘｖｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記α‐リノレン酸（ＡＬＡ）のレベルが、約７％から約４０％の間、約１０％から約３５％の間、約２０％から約３５％の間、または４％から１６％の間である、
ｘｘｘｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記γ‐リノレン酸（ＧＬＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、０．０５％から７％の間、０．０５％から４％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｘｘｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ステアリドン酸（ＳＤＡ）のレベルが、約４％未満、約３％未満、約０．０５％から約７％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｌ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）のレベルが、約４％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．０５％から約５％の間、約０．０５％から約４％の間、約０．０５％から約３％の間、または約０．０５％から約２％の間である、
ｘｌｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ）のレベルが、約２％未満、約１％未満、０．０５％から４％の間、０．０５％から３％の間、または０．０５％から約２％の間、または０．０５％から約１％の間である、
ｘｌｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から１０％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｌｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）のレベルが、４％未満、約３％未満、約２％未満、０．０５％から８％の間、０．０５％から５％の間、または０．０５％から約３％の間、または０．０５％から約２％の間である、
ｘｌｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルが、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約８％から２０％の間、約１０％から２０％の間、約１１％から２０％の間、約１０％から約１６％の間、または約１４％から２０％の間である、
ｘｌｖ）前記脂質は、その脂肪酸含有量にω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を含む、
ｘｌｖｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ω６‐ドコサぺンタエン酸（２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）を実質的に含まない、
ｘｌｖｉｉ）前記脂質は、その脂肪酸含有量に、ＳＤＡ、ＥＰＡ、およびＥＴＡを実質的に含まない、
ｘｌｖｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約２０％の間、または約６％から約２０％の間である、
ｘｌｉｘ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸のレベルは、約４％から約３５％の間、約８％から約２５％の間、または８％から約２２％の間である、
ｌ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸のレベルは、約２０％から約７５％の間、約５０％から約７５％の間、または約６０％から約７５％の間である、
ｌｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω６脂肪酸のレベルは、約３５％から約５０％の間、約２０％から約３５％の間、約６％から２０％の間、２０％未満、約１６％未満、約１０％未満、約１％から約１６％の間、約２％から約１０％の間、または約４％から約１０％の間である、
ｌｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω６脂肪酸のレベルは、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、４％未満、約１％から約２０％の間、約１％から約１０％の間、約０．５％から約８％の間、または約０．５％から４％の間である、
ｌｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における総ω３脂肪酸のレベルは、３６％から約６５％の間、４０％から約６０％の間、約２０％から約３５％の間、約１０％から約２０％の間、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％である、
ｌｉｖ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における新ω３脂肪酸のレベルは、９％から約３３％の間、約１０％から約２０％の間、約２０％から約３０％の間、約１２％から約２５％の間、約１３％、約１５％、約１７％、または約２０％である、
ｌｖ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約１．０、約０．１、または約０．２である、
ｌｖｉ）前記抽出脂質の前記脂肪酸含有量における、新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸の比は、約１．０から約３．０の間、約０．１から約１の間、約０．１から約０．５の間、約０．５０未満、約０．４０未満、約０．３０未満、約０．２０未満、約０．１５未満、約０．１、約０．２、または約１．０である、
ｌｖｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、約１０％から約５０％の間、約１０％から約３０％の間、または約１０％から約２５％の間の、オレイン酸のＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｌｖｉｉｉ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２２％、少なくとも約２５％、約１５％から約５０％の間、約２０％から約４０％の間、または約２０％から約３０％の間の、ＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｌｉｘ）前記脂質の前記脂肪酸組成は、少なくとも約１７％、少なくとも約２２％、少なくとも約２４％、約１７％から約５５％の間、約２２％から約３５％の間、または約２４％から約３５％の間のＡＬＡのＤＨＡへの転換の効率に基づく、
ｌｘ）前記抽出脂質における前記総脂肪酸は、Ｃ２０：１を１％未満有する、
ｌｘｉ）前記脂質の前記トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）含有量は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも９５％、約７０％から約９９％の間、または約９０％から約９９％の間である、
ｌｘｉｉ）前記脂質は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を含む、
ｌｘｉｉｉ）前記脂質は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．００１％から約５％の間の、遊離（非エステル化）脂肪酸および／もしくはリン脂質を含む、または、これらを実質的に含まない、
ｌｘｉｖ）ＴＡＧの形態でエステル化されたＤＨＡの少なくとも８０％が、前記ＴＡＧのｓｎ‐１またはｓｎ‐３の位置にある、
ｌｘｖ）前記脂質において最も豊富なＤＨＡ含有ＴＡＧの種は、ＤＨＡ／１８：３／１８：３（ＴＡＧ５８：１２）である、および
ｌｘｖｉ）前記脂質は、トリ‐ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）を含む、
の１もしくはそれ以上、または全てを有する。
【0053】
特に上記態様に関し、一実施形態では、以下の事項：ｉ）前記脂質はオイルの形態であり、前記オイルは、カンペステロール、Δ５‐スチグマステロール、エブリコール、β‐シトステロール、Δ５‐アベナステロール、Δ７‐スチグマステロールおよび、Δ７‐アベナステロールの１もしくはそれ以上のまたは全てのような、１もしくはそれ以上のステロールを含み、並びに、任意に、前記オイルは約１０ｍｇ未満のステロール／ｇのオイルを含む、および／もしくは前記オイルはコレステロールを実質的に含まない、
ｉｉ）前記脂質は、油料種子がアブラナ属種子の油料種子またはキャノーラ種子のような、油料種子由来のオイルの形態である、
ｉｉｉ）前記抽出脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは、約３％、約４％、約５％、約６％、または７％から２０％である、
の１もしくはそれ以上、または全てが適用される。
【0054】
さらなる態様では、本発明は、単一のＤＮＡ分子上で、全て共有結合で結合される、第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子、第４の遺伝子、第５の遺伝子、および第６の遺伝子の順で含む、キメラ遺伝子構築物（コンストラクト）を提供し、第１、第２、および第３の遺伝子が第１の遺伝子クラスターとしてともに結合され、第４、第５、および第６の遺伝子が第２の遺伝子クラスターとしてともに結合され、各遺伝子は、各プロモーターが前記コード領域および転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が操作可能に結合されるように、プロモーター、コード領域、および転写ターミネーター、および／またはポリアデニル化領域を含み、
各プロモーターが、前記ＤＮＡ分子が３、４、５、または６つの異なるプロモーターを含むように、独立して他のプロモーターと同じまたは異なり、
１もしくはそれ以上のまたは全ての前記プロモーターが、それが操作可能に結合されるコード領域に対して異種性であり、
前記第１の遺伝子の転写の方向が、前記第３の遺伝子から離れており、前記第３の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第４の遺伝子の転写の方向が、前記第６の遺伝子から離れており、前記第６の遺伝子の転写の方向と反対であり、
前記第２の遺伝子の転写の方向が、前記第１の遺伝子または前記第３の遺伝子と同じであり、
前記第５の遺伝子の転写の方向が、前記第４の遺伝子または前記第６の遺伝子と同じであり、
前記第２の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約０．２から約３．０キロベースの間の第１のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第１または第３の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置き、
約１．０から約１０．０キロベースの間の第２のスペーサー領域により前記第１の遺伝子クラスターが第２の遺伝子クラスターから間隔を置き、および
前記第５の遺伝子の前記転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域が、約０．２から約３．０キロベースの間の第３のスペーサー領域により、より近いいずれかの、第４または第６の遺伝子の前記プロモーターから間隔を置く。
【0055】
一実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、約１．０から約１０．０キロベースの間のスペーサー領域により、より近いいずれかの、前記第１の遺伝子クラスターまたは前記第２の遺伝子クラスターから間隔を置く第７の遺伝子を含む。
【0056】
別の実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、２つまたはそれ以上の異なる転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化領域を含む。
【0057】
さらに、さらなる実施形態では、少なくとも１つの前記スペーサー領域がマトリックス結合領域（ＭＡＲ）を含む。
【0058】
さらなる実施形態では、前記ＤＮＡ分子が、前記遺伝子に隣接する左右境界領域を含み、かつＴ‐ＤＮＡ分子である。
【0059】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクトが、アグロバクテリウム細胞におけるものである、または植物細胞のゲノムに組み込まれる。
【0060】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの前記遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼまたは脂肪酸エロンガーゼをコードする。
【0061】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクトは、本明細書に定義される酵素のセットをコードする遺伝子、および／または本明細書に定義される酵素をコードする１またはそれ以上の遺伝子を含む。
【0062】
さらなる態様では、本発明は、ｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、または４５のいずれかから選択されるヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号１から９、１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、または４５に示される１またはそれ以上の配列と、少なくとも９５％同一または９９％同一であるヌクレオチドの配列、
を含む、単離および／または外因性ポリヌクレオチドを提供する。
【0063】
特定の好ましい実施形態では、前記単離および／または外因性ポリヌクレオチドは、ｉ）配列番号２のヌクレオチドの配列、および／または
ｉｉ）配列番号２に示される配列と、少なくとも９５％同一または９９％同一であるヌクレオチドの配列、
を含む。
【0064】
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／または本発明の前記遺伝子コンストラクトを含む、ベクターまたは遺伝子コンストラクトを提供する。
【0065】
一実施形態では、配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５のいずれか１つから選択される前記ヌクレオチドの配列、または配列番号１１、１４、１８、２２、２３、２８、３４、３５、３９、もしくは４５で示される１もしくはそれ以上の前記配列と少なくとも９５％同一もしくは９９％同一である前記ヌクレオチドの配列は、プロモーターに操作可能に結合される。
【0066】
さらなる態様では、本発明は、以下のセットの酵素：ｉ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｉｖ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖ）ω３‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉ）Δ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
ｖｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｖｉｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、ω３‐デサチュラーゼもしくはΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９−エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする、外因性ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドは、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように、１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
【0067】
一実施形態では、前記細胞が、上記に定義される脂質を含み、または１もしくはそれ以上のまたは全ての前記デサチュラーゼもしくはエロンガーゼは、上記に定義される１またはそれ以上の特徴を有する。
【0068】
別の態様では、本発明は、ｉ）配列番号１０に規定される配列を有するアミノ酸を含むΔ１２‐デサチュラーゼをコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号１０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列と、
ｉｉ）配列番号１２に規定される配列を有するアミノ酸を含むω３‐デサチュラーゼをコードする第２の外因性ポリヌクレオチド、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列とを含む、宿主細胞を提供し、
各ポリヌクレオチドが、前記細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができる１またはそれ以上のプロモーターと操作可能に結合される。
【0069】
さらなる態様では、本発明は、１またはそれ以上の、本発明の前記ポリヌクレオチド、本発明の前記遺伝子コンストラクト、または本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクトを含む、宿主細胞を提供する。
【0070】
一実施形態では、前記細胞は、植物における、植物部分におけるものであり、および／または成熟した植物種子の細胞である。
【0071】
一実施形態では、前記植物または植物種子は、それぞれ油料種子植物または油料種子である。
【0072】
本発明の細胞を含むトランスジェニック非ヒト生物もまた提供される。
【0073】
好ましくは、前記トランスジェニック非ヒト生物は、トランスジェニック植物であり、好ましくは、油料種子植物またはシロイヌナズナである。一実施形態では、前記植物は、アブラナ属植物、好ましくは、セイヨウアブラナもしくはセイヨウカラシナ、またはシロイヌナズナ以外の他の植物である。
【0074】
別の態様では、本発明は、ａ）その種子における脂質であって、該脂質はエステル化形態における脂肪酸を含み、および
ｂ）以下のセットの酵素：
ｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ６‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、または
ｉｉ）Δ１２‐デサチュラーゼ、真菌のω３‐デサチュラーゼ、および／もしくは真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ、Δ８‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、Δ９‐エロンガーゼ、およびΔ５‐エロンガーゼ、
の１つをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、油料種子植物を提供し、各ポリヌクレオチドは、前記植物の種子を発生する場合に、前記ポリヌクレオチドの発現を方向づけることができるように１またはそれ以上の種子特異的プロモーターを操作可能に結合され、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸（ＬＡ）およびγ‐リノレン酸（ＧＬＡ）を含むω６脂肪酸、α‐リノレン酸（ＡＬＡ）を含むω３脂肪酸、ステアリドン酸（ＳＤＡ）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ならびに任意にエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ）を含み、前記脂質の前記総脂肪酸含有量における前記ＤＨＡのレベルは約７％から２０％である。
【0075】
油料種子植物の例は、アブラナ属種子、ワタ、アマ、ヒマワリ属種、ベニバナ、ダイズ、トウモロコシ、シロイヌナズナ、モロコシ、ソルガムブルガレ、エンバク、トリフォリウム属種、エラエイスグイネエヌシス、ベンサミアナタバコ、オオムギ、ルピナスアングスティフォリウス、イネ、アフリカイネ、カメリナサティバ、またはクランベアビシニカを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、前記油料種子植物は、キャノーラ、ダイズ、カメリナサティバ、または シロイヌナズナ植物である。代替的な実施形態では、前記油料種子植物は、シロイヌナズナ以外である。
【0076】
一実施形態では、１またはそれ以上の前記デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を使用することができる。好ましい実施形態では、１またはそれ以上の前記Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼは、もし存在する場合には、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができ、好ましくは、ｉ）Δ６‐デサチュラーゼ、Δ５‐デサチュラーゼ、およびΔ４‐デサチュラーゼ、またはｉｉ）Δ５‐デサチュラーゼ、Δ４‐デサチュラーゼ、およびΔ８‐デサチュラーゼのそれぞれは、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができる。一実施形態では、Δ１２‐デサチュラーゼおよび／またはω３‐デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質を用いることができる。アシル‐ＣｏＡ基質は、好ましくは、ＡＬＡ‐ＣｏＡ、ＥＴＡ‐ＣｏＡ、ＤＰＡ‐ＣｏＡ、ＥＴｒＡ‐ＣｏＡ、ＬＡ‐ＣｏＡ、ＧＬＡ‐ＣｏＡ、またはＡＲＡ‐ＣｏＡである。
【0077】
一実施形態では、前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あたり約８０から約１００ｍｇ、または１グラムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍｇであることとしてもよい。
【0078】
さらなる態様では、本発明は、ＤＨＡを含む種子を産生することができるセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ植物を提供し、前記植物の成熟した、収穫された種子は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あたり約８０から約１００ｍｇ、または１グラムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍｇであることとしてもよい。
【0079】
別の態様では、本発明は、前記外因性ポリヌクレオチドを含む、本発明の植物の植物細胞を提供する。
【0080】
植物部分、好ましくは種子もまた提供され、以下の特徴、ｉ）本発明の植物由来である、
ｉｉ）本明細書で定義される脂質を含む、
ｉｉｉ）本発明のプロセスで使用され得る、
ｉｖ）本発明の遺伝子コンストラクトを含む、または
ｖ）本明細書で定義される外因性ポリヌクレオチドのセットを含む、
の１またはそれ以上を有する。
【0081】
さらに別の態様では、本発明は、ＤＨＡおよび重量で約４％から約１５％の間の水分含有量を含む、成熟した、収穫されたセイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、またはカメリナサティバ種子を提供し、前記種子の前記ＤＨＡの含有量は、１グラムの種子あたり少なくとも約２８ｍｇ、好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約３２ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約３６ｍｇ、１グラムの種子あたり少なくとも約４０ｍｇ、より好ましくは１グラムの種子あたり少なくとも約４４ｍｇ、または１グラムの種子あたり少なくとも約４８ｍｇである。最大のＤＨＡ含有量は、１グラムの種子あたり約８０から約１００ｍｇ、または１グラムの種子あたり約８０ｍｇもしくは約１００ｍｇであることとしてもよい。
【0082】
一実施形態では、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、または本発明の前記種子であって、本明細書で定義される１もしくはそれ以上のまたは全ての特徴を含む抽出脂質を産生するために使用され得るものがある。
【0083】
さらにさらなる態様では、本発明は、本発明の細胞を産生する方法を提供し、該方法は、ａ）前記細胞、好ましくは、ＬＣ‐ＰＵＦＡを合成することができない細胞に、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書に定義される１またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを導入することと、
ｂ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを前記細胞内に発現することと、
ｃ）任意に、前記細胞の前記脂肪酸組成を分析することと、
ｄ）任意に、前記遺伝子またはポリヌクレオチドを発現する細胞を選択することと、
を含む。
【0084】
一実施形態では、前記細胞における前記脂質が、１またはそれ以上の本明細書に定義される特徴を有する。
【0085】
別の実施形態では、前記遺伝子コンストラクト、前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記遺伝子コンストラクト、または外因性ポリヌクレオチドの組み合わせは、前記細胞の前記ゲノムに安定して組込まれる。
【0086】
さらなる実施形態では、前記細胞は植物細胞であり、前記方法は工程ａ）の前記細胞から形質転換植物を再生する工程をさらに含む。
【0087】
別の実施形態では、前記遺伝子および／または外因性ポリヌクレオチドは、一過性で前記細胞内に発現される。
【0088】
本発明の方法を用いて産生される細胞もまた提供される。
【0089】
別の態様では、本発明は、種子を産生する方法を提供し、該方法は、ａ）好ましくは少なくとも１０００のこのような植物の個体群の一部としてのフィールドで、またはスタンダードな栽植密度で栽植される少なくとも１ヘクタールのエリアで、本明細書の植物、または本明細書に定義される部分を産生する植物を成長させることと、
ｂ）前記植物の１つまたは複数から種子を収穫することと、
ｃ）任意に、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも６０ｋｇＤＨＡ／ヘクタールの総ＤＨＡ収率を有するオイルを産生することと、
を含む。
【0090】
一実施形態では、本発明の他の前記植物、植物細胞、植物部分、または種子は、以下の特徴：ｉ）前記オイルが本明細書に定義される、
ｉｉ）前記植物部分または種子が、本発明のプロセスで使用されることができる、
ｉｉｉ）前記外因性ポリヌクレオチドが、本発明の遺伝子コンストラクトに含まれる、
ｉｖ）前記外因性ポリヌクレオチドは、本発明の外因性ポリヌクレオチドを含む、
ｖ）前記植物細胞は、本発明の細胞である、
ｖｉ）前記種子は、本発明の方法で産生される、
の１またはそれ以上を有する。
【0091】
別の態様では、本発明は、１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼおよび／もしくは脂肪酸エロンガーゼ、または１もしくはそれ以上の脂肪酸デサチュラーゼ、並びに１もしくはそれ以上の脂肪酸エロンガーゼを産生する方法を提供し、該方法は、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／または外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターまたは遺伝子コンストラクト、本明細書で定義される１またはそれ以上の外因性ポリヌクレオチドの組み合わせを、好ましくは、前記フィールドで油料種子植物に発生する油料種子において、細胞でまたは細胞フリーの発現システムで発現することを含む。
【0092】
さらなる態様では、本発明は、本発明の前記プロセス、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂質またはオイルを提供する。
【0093】
一実施形態では、前記脂質またはオイルは、油料種子由来のオイルの抽出により得られる。油料種子由来のオイルの例は、キャノーラオイル（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ亜種）、マスタードオイル（セイヨウカラシナ）、他のアブラナオイル、ヒマワリ油（ヒマワリ）、亜麻仁油（アマ）、ダイズオイル（ダイズ）、ベニバナオイル（ベニバナ）、コーンオイル（トウモロコシ）、タバコオイル（タバコ）、ピーナッツオイル（ピーナッツ）、パームオイル、綿実油（ワタ）、ココナッツオイル（ココヤシ）、アボカドオイル（アボカド）、オリーブオイル（オリーブ）、カシューオイル（カシューナッツ）、マカダミアオイル（マカダミア）、アーモンドオイル（アーモンド）、またはシロイヌナズナ種子オイル（シロイヌナズナ）を含むが、これらに限定されない。
【0094】
さらなる態様では、本発明は、本発明の前記プロセス、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、または本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子を用いて、産生されまたは得られる脂肪酸を提供する。好ましくは、前記脂肪酸はＤＨＡである。前記脂肪酸は、本明細書に記載される脂肪酸組成を有する脂肪酸の混合物であることとしてもよい。一実施形態では、前記脂肪酸は非エステル化である。
【0095】
本発明の種子から得られる種子ミールもまた提供される。好ましい種子ミールは、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、カメリナサティバ、またはダイズの種子ミールを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、前記種子ミールは、本明細書に定義される外因性ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子コンストラクトを含む。
【0096】
別の態様では、本発明は、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、または本発明の前記種子ミールを含む組成物を提供する。実施形態では、前記組成物は、薬学的、食品、もしくは農業的使用に適する担体、種子処理化合物、肥料、他の食品もしくは配合原料、または添加されたタンパク質もしくはビタミンを含む。
【0097】
１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、または本発明の組成物を含む、家畜飼料、化粧品、または化学物質もまた提供される。
【0098】
別の態様では、本発明は、家畜飼料を産生する方法を提供し、該方法は、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明に係る前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、または本発明の前記組成物を、少なくとも１つの他の食品原料成分と混合することを含む。
【0099】
別の態様では、本発明は、ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止する方法を提供し、該方法は、対象に、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明の前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、を投与することを含む。
【0100】
ＰＵＦＡから利益を得る症状の例は、心不整脈、血管形成、炎症、喘息、乾せん、骨粗鬆症、腎結石、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、統合失調症、癌、胎児性アルコール症候群、注意欠陥多動性障害、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、単極性うつ病、攻撃的な敵意（aggressive hostility）、副腎白質ジストロフィー（adrenoleukodystophy）、冠動脈心疾患、高血圧、糖尿病、肥満、アルツハイマー病、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、血管形成後の再狭窄、湿疹、血圧上昇、血小板凝集、消化管出血、子宮内膜症、月経前症候群、筋痛性脳脊髄炎、ウイルス感染後の慢性疲労、または眼性疾患を含むが、これらに限定されない。
【0101】
ＰＵＦＡから利益を得る、症状を治療または防止するための薬剤の製造のために、１またはそれ以上の、本発明の前記脂質もしくはオイル、本発明の前記脂肪酸、本発明のいずれか１つの前記遺伝子コンストラクト、本発明の前記単離および／もしくは外因性ポリヌクレオチド、本発明の前記ベクターもしくは遺伝子コンストラクト、本発明の前記細胞、本発明の前記トランスジェニック生物、本発明の前記油料種子植物、本発明の前記セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナ、もしくはカメリナサティバ植物、本発明の前記植物部分、本発明の前記種子、本発明の前記植物、植物細胞、植物部分、もしくは種子、本発明の前記種子ミール、本発明の前記組成物、または本発明の前記家畜飼料、の使用もまた提供される。前記薬剤の前記産生は、本明細書に記載される状態の治療のために、薬学的に受容可能な担体と、本発明のオイルを混合することを含むこととしてもよい。前記方法は、まず、前記ＤＨＡのレベルを増加させるために、前記オイルを精製することおよび／またはエステル交換反応および／または前記オイルの分画を含むこととしてもよい。特定の実施形態において、前記方法は、前記オイルにおける前記脂肪酸を、メチルまたはエチルエステルのようなアルキルエステルに転換するために、キャノーラオイルのような前記オイルまたは脂質を処理することを含む。さらに、分画または蒸留のような処理が、前記ＤＨＡについての前記オイルまたは脂質を濃縮するために適用されることとしてもよい。好ましい実施形態では、前記薬剤はＤＨＡのエチルエステルを含む。さらにより好ましい実施形態では、前記薬剤における前記ＤＨＡのエチルエステルのレベルは、３０％から５０％の間である。例えば、前記薬剤における前記総脂肪酸含有量の３０％から５０％の間で、前記薬剤はＥＰＡのエチルエステルをさらに含むこととしてもよい。このような薬剤は、本明細書に記載されるような医学的状態を治療するために、ヒトまたは動物の対象に投与するのに適する。
【0102】
別の態様では、本発明は、本発明の種子を得ることと、金銭的利益のために得られた前記種子を取引することとを含む、種子を取引する方法を提供する。
【0103】
一実施形態では、前記種子を得ることは、本発明の前記植物を栽培すること、および／または前記植物から前記種子を収穫することを含む。
【0104】
別の実施形態では、前記種子を得ることは、コンテナに前記種子を配置すること、および／または前記種子を保存することをさらに含む。
【0105】
さらなる実施形態では、前記種子を得ることは、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む。
【0106】
さらに別の実施形態では、前記方法は、前記種子が取引された後に、前記種子を異なる場所に運ぶことをさらに含む。
【0107】
さらなる実施形態では、前記取引することは、コンピュータのような電子的手段を用いて行われる。
【0108】
さらに別の態様では、本発明は、ａ）本発明の種子を含む植物の地上部分を刈り取り、並べ、および／または収穫することと、
ｂ）前記植物部分の残りから前記種子を分離するために、前記植物の前記一部を脱穀し、および／または選り分けることと、
ｃ）工程ｂ）で分離された前記種子をふるいにかけおよび／またはソートすること、および容器内に前記ふるいにかけられたおよび／またはソートされた種子をロードすることにより、種子の入った容器を産生することと、
を含む、種子の入った容器を産生するプロセスを提供する。
【0109】
前記脂質もしくオイル、好ましくは種子オイルに関連するまたは有用な、一実施形態では、本発明は、表１６の種子１４のような、実施例のセクションにおいて表で提供されるものについての脂肪のレベルを有する。
【0110】
あらゆる本明細書の実施形態は、別途に特に記載されない限り、あらゆる他の実施形態に必要な変更を加えて適用すると解釈されるべきである。
【0111】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態による範囲に限定されず、これらは例示のみの目的を意図とされる。機能的に均等な産生物、組成物、および方法は、あきらかに、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内である。
【0112】
本明細書を通じて、特定の別途の記載または文脈上別途の必要性がない限り、単一の工程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群への参照は、１つおよび複数（つまり、１またはそれ以上の）のこれらの工程、組成物の材料、工程の群、組成物の材料の群を包含すると解釈されるべきである。
【0113】
本発明は、以下の非限定的な実施例によりおよび添付の図面に対する参照により、ここに記載される。
【図面の簡単な説明】
【0114】
【図1】好気性ＤＨＡ生合成経路である。
【図2】ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の左境界と右境界との間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップ。ＲＢは右境界を示す；ＬＢ、左境界；ＴＥＲ、転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；ＰＲＯ、プロモーター；コード領域は矢印の上に記され、プロモーターおよびターミネーターは矢印の下に記される。Ｍｉｃｐｕ−Δ６Ｄ、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ）Δ６デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ−Δ６Ｅ、ピラミモナス・コルダタ（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ ｃｏｒｄａｔａ）Δ６エロンガーゼ；Ｐａｖｓａ−Ａ５Ｄ、パブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼ；Ｐｉｃｐａ−ω３Ｄ、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼ；Ｐａｖｓａ−Δ４Ｄ、Ｐ．サリナΔ４デサチュラーゼ；Ｌａｃｋｌ−Δ１２Ｄ、ラカンセア・クルイベリ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Δ１２デサチュラーゼ；Ｐｙｒｃｏ−Δ５Ｅ、ピラミモナス・コルダタΔ５エロンガーゼ。ＮＯＳはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリンシンターゼ転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；ＦＰ１、セイヨウアブラナ切断ナピンプロモーター；ＦＡＥ１、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモーター；レクチン、グリシン・マックスレクチン転写ターミネーター／ポリアデニル化領域；Ｃｎｌ１およびＣｎｌ２はリヌム・ウシタティスシムムコンリニン（ｃｏｎｌｉｎｉｎ）１またはコンリニン２プロモーターまたはターミネーターを意味する。ＭＡＲはニコチアナ・タバカムのＲｂ７マトリックス付着領域である。
【図5】Ｔ２およびＴ３世代の複数の独立トランスジェニックシロイヌナズナ種子脂質の総脂肪酸のパーセンテージとしてのＤＨＡ量である。角括弧がついたＴ２事象はＴ３に持ち込まれた。コロンビアおよびｆａｄ２変異体Ａ．タリアナバックグラウンドの双方からの事象が示される。
【図6】トランスジェニックシロイヌナズナ種子の脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとしての、油含有量（ｗ／ｗ）対ＤＨＡ含有量である。
【図7】ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を使って形質転換したＢ．ナプス胚のＴ−ＤＮＡの他の導入遺伝子と比較して、低発現のΔ６デサチュラーゼを示す代表的なＲＴ−ＰＣＲゲルである。レーンは左からＲＴ−ＰＣＲ産物を示す：１、ＤＮＡサイズマーカー；レーン２、Δ１２デサチュラーゼ；レーン３、ω３デサチュラーゼ；レーン４、Δ６デサチュラーゼ（低発現）；レーン５、Δ６エロンガーゼ；レーン６、Δ５デサチュラーゼ；レーン７、Δ５エロンガーゼ；レーン８、Δ４デサチュラーゼ。
【図8】オレイン酸のパーセンテージに対してプロットされたＡＬＡのパーセンテージであり、それぞれトランスジェニック３５Ｓ：ＬＥＣ２セイヨウアブラナ体細胞胚から得た脂質中の総脂肪酸のパーセンテージとして示す。
【図9】ＮＭＲによる、Ａ）マグロ油およびＢ）トランスジェニックＤＨＡアラビドプシス種子油に対する位置分布の分析である。ＤＨＡアルファと示されるピークは、ＴＡＧのｓｎ−１およびｓｎ−３位置に存在するＤＨＡの量を示す（位置的な優先がない場合は、これは総ＤＨＡの６６％に等しい）一方で、ＤＨＡベータと示されるピークは、ＴＡＧのｓｎ−２位置に存在するＤＨＡの量を示す（優先がない場合は、これはＤＨＡの３３％に等しい）。
【図10】トランスジェニックＡ．タリアナの発育中の（灰色）および成熟した（黒色）種子における主要なＤＨＡ含有トリアシルグリセロール種のＬＣ−ＭＳ分析である。ＤＨＡに続く数字は、炭素原子の総数および他の２つの脂肪酸の二重結合の総数を意味する。したがって、ＤＨＡ／３４：１は、ＴＡＧ５６：７などとも呼ばれ得る。
【図11】ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片の左境界と右境界との間のＴ−ＤＮＡ挿入領域のマップである。標識は図２の通りである；ＳＳＵ、シロイヌナズナＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーター。
【図12】候補Δ１２デサチュラーゼがその中にクローニングされるＮｏｔＩ制限部位を示すバイナリーベクターｐＪＰ３３６４のマップである。
【図13】ＳｉｇｍａＰｌｏｔを使用して生成したボックスプロットであり、ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子群の種子脂質の脂肪酸２０：４ω６（ＡＲＡ）のパーセンテージを示す。ゼロに一番近い各枠の境界は、２５パーセンタイルを示し、各枠の中の線は中央値を示し、ゼロから一番遠い各枠の境界は、７５パーセンタイルを意味する。各枠の上下に示される誤差バーは、９０および１０パーセンタイルを示す。
【図14】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子の種子脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして、ＡＲＡの平均量を示す。
【図15】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ２種子群の種子脂質の脂肪酸２０：２ω６（ＥＤＡ）のパーセンテージを示すボックスプロットである。ボックスプロットの値は図１３で記載された通りに示される。
【図17】ｐＦＮ０４５−ｐＦＮ０５０で形質転換したアラビドプシスＴ４種子群の種子脂質の総脂肪酸含有量のパーセンテージとして、ＡＲＡの平均量を示す。
【図19】（Ａ）環および側鎖ナンバリングを伴った、基本的な植物ステロール構造である。（Ｂ）いくつかの植物ステロールの化学構造である。
【図20】公知のＬＰＡＡＴの系統樹である。
【図21】ＰＣ、ＣｏＡプールおよびＴＡＧプールの間で脂肪酸を搬送する様々なアシル交換酵素である。出典はＳｉｎｇｈら（２００５）からである。
【発明を実施するための形態】
【0115】
配列表のカギ配列番号１‐ｐＪＰ３４１６‐ＧＡ７ヌクレオチド配列。
配列番号２‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｂヌクレオチド配列。
配列番号３‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｃヌクレオチド配列。
配列番号４‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｄヌクレオチド配列。
配列番号５‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｅヌクレオチド配列。
配列番号６‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｆヌクレオチド配列。
配列番号７‐ｐＧＡ７‐ｍｏｄ＿Ｇヌクレオチド配列。
配列番号８‐ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿Ｃｏｗｐｅａ＿ＥＰＡ＿インサートヌクレオチド配列。
配列番号９‐植物におけるラカンセア・クルイベリ（Lachancea kluyveri）Δ１２デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１０‐ラカンセア・クルイベリΔ１２‐デサチュラーゼ。
配列番号１１‐植物におけるピキア・パストリスω３デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１２‐ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ。
配列番号１３‐ミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１４‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号１５‐植物におけるミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号１６‐ミクロモナス・プシラΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号１７‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号１８‐植物におけるオストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号１９‐オストレオコッカスルシマリヌスΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号２０‐オストレオコッカスタウリΔ６‐デサチュラーゼ。
配列番号２１‐ピラミモナス・コルダタΔ６‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２２‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする）（バージョン１）。
配列番号２３‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする）（バージョン２）。
配列番号２４‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（３’末端で切断され、機能的なエロンガーゼをコードする）（バージョン３）。
配列番号２５‐ピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼ。
配列番号２６‐切断されたピラミモナス・コルダタΔ６‐エロンガーゼ。
配列番号２７‐パブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号２８‐植物におけるパブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号２９‐植物におけるパブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号３０‐パブロバサリナΔ５‐デサチュラーゼ。
配列番号３１‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３２‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐デサチュラーゼ。
配列番号３３‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３４‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号３５‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号３６‐植物におけるピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン３）。
配列番号３７‐ピラミモナス・コルダタΔ５‐エロンガーゼ。
配列番号３８‐パブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号３９‐植物におけるパブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン１）。
配列番号４０‐植物におけるパブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム（バージョン２）。
配列番号４１‐パブロバサリナΔ４‐デサチュラーゼ。
配列番号４２‐イソクリシスガルバナΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４３‐イソクリシスガルバナΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号４４‐エミリアニアハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４５‐植物におけるエミリアニアハクスレイΔ９‐エロンガーゼの発現についてのコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号４６‐エミリアニアハクスレイＣＣＭＰ１５１６Δ９‐エロンガーゼ。
配列番号４７‐パブロバピンギスΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号４８‐パブロバピンギスΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号４９‐パブロバサリナΔ９‐エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５０‐パブロバサリナΔ９‐エロンガーゼ。
配列番号５１‐パブロバサリナΔ８‐デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５２‐パブロバサリナΔ８‐デサチュラーゼ。
配列番号５３‐Ｐ１９ウイルスサプレッサー。
配列番号５４‐Ｖ２ウイルスサプレッサー。
配列番号５５‐Ｐ３８ウイルスサプレッサー。
配列番号５６‐Ｐｅ‐Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号５７‐ＲＰＶ‐Ｐ０ウイルスサプレッサー。
配列番号５８‐Ｐ１９ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号５９‐Ｖ２ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号６０‐Ｐ３８ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号６１‐Ｐｅ‐Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号６２‐ＲＰＶ‐Ｐ０ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号６３‐シロイヌナズナＬＰＡＡＴ２。
配列番号６４‐リムナンテスアルバＬＰＡＡＴ。
配列番号６５‐サッカロマイセスセレビシエＬＰＡＡＴ。
配列番号６６‐ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ。
配列番号６７‐モルティエレラアルピナＬＰＡＡＴ。
配列番号６８‐セイヨウアブラナ（Braccisa napus）ＬＰＡＡＴ。
配列番号６９‐セイヨウアブラナＬＰＡＡＴ。
配列番号７０‐フィトフトラインフェスタンスω３デサチュラーゼ。
配列番号７１‐タラッシオシラシュードナナω３デサチュラーゼ。
配列番号７２‐ピティウムイレギュラレω３デサチュラーゼ。
【0116】
一般的な技術および定義別途具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、タンパク質化学、および生化学における）により一般的に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【0117】
別途示されない限り、本発明で利用される、遺伝子組換えタンパク、細胞培養、および免疫学的技術は、当業者によく知られる標準的な手順である。このような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (エディター), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (エディター), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995および1996), F.M. Ausubel et al. (エディター), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までの全てのアップデートを含む), Ed Harlow and David Lane (エディター), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988),および J.E. Coligan et al. (エディター), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までの全てのアップデートを含む)のようなソースにおける文献を通じて記載され、および説明される。
【0118】
用語「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味することが理解されるべきであり、両方の意味について、または一方の意味について、明示的なサポートを提供すると解釈されるべきである。
【0119】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、逆の記載がない限り、所定の値の＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、より好ましくは＋／−１％を指す。
【0120】
本明細書を通じて、用語「含む（include）」または「含む（includes）」もしくは「含んでいる（including）」のようなバリエーションは、１つの記載された要素、整数、もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を含むが、あらゆる他の要素、整数、もしくは工程、または群の要素、整数、もしくは工程を排除しないことを暗示することが理解されるであろう。
【0121】
選択された定義本明細書で使用される場合、用語「抽出植物脂質」および「単離植物脂質」は、植物または種子のようなその植物部分を、例えば、破砕することにより、抽出形態である脂質組成物を指す。抽出脂質は、例えば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然の組成物、または全てではなくても、ほとんどの１もしくはそれ以上のもしくはそれぞれの、植物性物質由来の水、核酸、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製された組成物、であり得る。精製方法の例が、以下に記載される。一実施形態では、抽出または単離植物の脂質は、組成物の重量により、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）脂質を含む。脂質は、室温で固体または液体であることとしてもよく、液体である場合に、オイルであることが考えられる。一実施形態では、本発明の抽出脂質は、別のソースにより産生されないＤＨＡのような別の脂質（例えば、魚油由来のＤＨＡ）とブレンドされていない。一実施形態では、抽出後に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有意に変化していない（例えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物脂質は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水素化または分画法のような手順にさらされていない。本発明の抽出植物脂質がオイルにおいて含まれる場合、オイルは、ステロールのような、非脂肪酸分子をさらに含むこととしてもよい。
【0122】
本明細書で使用される場合、用語「抽出植物オイル」および「単離植物オイル」は、抽出植物脂質または単離植物脂質を含み、室温で液体である、物質または組成物を指す。オイルは、植物または種子のようなその一部から得られる。抽出または単離オイルは、例えば、植物の種子を破砕することにより得られる比較的天然の組成物、または全てではなくても、ほとんどの１もしくはそれ以上のもしくはそれぞれの、植物性物質由来の水、核酸、タンパク質、および炭水化物が取り除かれた、より精製された組成物、であり得る。組成物は、脂質または非脂質である他の成分を含むこととしてもよい。一実施形態では、オイル組成物は、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％（ｗ／ｗ）抽出植物脂質を含む。一実施形態では、本発明の抽出されたオイルは、別のソース（例えば、魚油由来のＤＨＡ）により産生されていないＤＨＡのような別のオイルによりブレンドされていない。一実施形態では、抽出後に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比は、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、有意に変化していない（例えば、１０％または５％以下の変化）。別の実施形態では、抽出植物オイルは、無傷の種子または細胞における比と比較される場合に、１もしくはそれ以上のまたは全ての、ＤＨＡに対するオレイン酸、ＤＨＡに対するパルミチン酸、ＤＨＡに対するリノール酸、および総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸の比を変化させるかもしれない、水素化または分画法のような手順にさらされていない。本発明の抽出植物オイルは、ステロールのような非脂肪酸分子を含むこととしてもよい。
【0123】
本明細書で使用される場合、「オイル」は、主に脂質を含み、常温で液体である組成物である。例えば、本発明のオイルは、好ましくは、重量により、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の脂質を含む。典型的には、精製されたオイルは、オイルにおける脂質の重量による少なくとも９０％トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を含む。ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、リン脂質、およびステロールのようなオイルの微量な成分は、本明細書に記載されるように存在することとしてもよい。
【0124】
本明細書で使用される場合、用語「脂肪酸」は、飽和または不飽和の長い脂肪族末端を有することが多い、カルボン酸（または、有機酸）を指す。典型的に、脂肪酸は、少なくとも８炭素原子の長さ、より好ましくは少なくとも１２炭素の長さの炭素‐炭素結合鎖を有する。最も天然に発生する脂肪酸は、それらの生合成が２つの炭素原子を有するアセテートを伴うため、同じ数の炭素原子を有する。脂肪酸は、遊離状態（非エステル化）におけるもの、またはトリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル‐ＣｏＡ（チオ‐エステル）結合、もしくは他の結合形態の一部ような、エステル化形態におけるものであることとしてもよい。脂肪酸は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態のような、リン脂質としてのエステル化であることとしてもよい。
【0125】
「飽和脂肪酸」は、あらゆる二重結合、または鎖に沿う他の官能基を含まない。用語「飽和」は、水素を指し、全ての炭素（カルボン酸［‐ＣＯＯＨ］基から離れてている）が、できるだけ多くの水素を含む。つまり、オメガ（ω）端部は３つの水素（ＣＨ３‐）を含み、鎖内の各炭素は２つの水素（‐ＣＨ２‐）を含む。
【0126】
「不飽和脂肪酸」は、各アルケンが、二重に結合された「‐ＣＨ＝ＣＨ‐」部分（つまり、別の炭素に対して二重に結合された炭素）により、鎖の一重に結合された「‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐」部分を置換し、１またはそれ以上のアルケン官能基が鎖に沿って存在することを除いて、飽和脂肪酸に対して類似の形態である。二重結合の両側に結合された鎖における２つの隣の炭素原子は、シスまたはトランス構造で生じ得る。
【0127】
本明細書で使用される場合、用語「一価不飽和脂肪酸」は、その炭素鎖において少なくとも１２の炭素原子および鎖におけるただ１つのアルケン基（炭素‐炭素二重結合）を含む、脂肪酸を指す。本明細書で使用される場合、用語「多価不飽和脂肪酸」または「ＰＵＦＡ」は、その炭素鎖において少なくとも１２の炭素原子および少なくとも２つのアルケン基（炭素‐炭素二重結合）を含む、脂肪酸を指す。
【0128】
本明細書で使用される場合、用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＬＣ‐ＰＵＦＡ」は、その炭素鎖において少なくとも２０の炭素原子および少なくとも２つの炭素‐炭素二重結合を含む、脂肪酸を指し、よって、ＶＬＣ‐ＰＵＦＡを含む。本明細書で使用される場合、用語「非常に長い長鎖多価不飽和脂肪酸」および「ＶＬＣ‐ＰＵＦＡ」は、その炭素鎖において少なくとも２２の炭素原子および少なくとも３つの炭素‐炭素二重結合を含む、脂肪酸を指す。脂肪酸の炭素鎖における炭素原子の数は、通常、分岐していない炭素鎖を指す。炭素鎖が分岐されている場合、炭素原子の数は、側鎖におけるものを除外する。一実施形態において、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω３脂肪酸であり、つまり、脂肪酸のメチル端部から３番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化（炭素‐炭素二重結合）を有する。別の実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、ω６脂肪酸であり、つまり、脂肪酸のメチル端部から６番目の炭素‐炭素結合において、不飽和化（炭素‐炭素二重結合）を有する。さらなる実施形態では、長鎖多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（ＡＲＡ、２０：４Δ５、８、１１、１４；ω６）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８、１１、１４、１７、ω３）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１、１４、１７；ω３）、ドコサぺンタエン酸（ＤＰＡ、２２：５Δ７、１０、１３、１６、１９、ω３）、またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ，２２：６Δ４、７、１０、１３、１６、１９、ω３）からなる群から選択される。また、ＬＣ‐ＰＵＦＡは、ジホモ‐γ‐リノール酸（ＤＧＬＡ）またはエイコサトリエン酸（ＥＴｒＡ、２０：３Δ１１、１４、１７、ω３）であることとしてもよい。本発明により産生されるＬＣ‐ＰＵＦＡは、上記のあらゆるまたは全ての混合物であることとしてもよく、他のＬＣ‐ＰＵＦＡまたはこれらのＬＣ‐ＰＵＦＡのあらゆる誘導体を含むこととしてもよいことは、容易に明らかになるであろう。好ましい実施形態では、ω３脂肪酸は、少なくともＤＨＡ、好ましくは、ＤＰＡおよびＤＨＡ、またはＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡである。
【0129】
さらに、本明細書で使用される場合、用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」および「非常に長い長鎖多価不飽和脂肪酸」は、遊離状態（非エステル化）における、または、トリグリセリド、ジアシルグリセリド、モノアシルグリセリド、アシル‐ＣｏＡ結合、もしくは他の結合形態の一部のようなエステル化形態におけるである脂肪酸を指す。脂肪酸は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、またはジホスファチジルグリセロール形態のような、リン脂質としてエステル化されることとしてもよい。よって、ＬＣ‐ＰＵＦＡは、細胞の脂質、または細胞、組織、または生物から抽出された脂質もしくは精製されたオイルにおける混合物の形態で存在することとしてもよい。好ましい実施形態においては、本発明は、少なくとも７５％または少なくとも８５％のトリアシルグリセロールを含み、ＬＣ‐ＰＵＦＡを含む少なくとも前記のトリアシルグリセロールを有する、言及したもののような他の形態の脂質として残りが存在する、オイルを提供する。後に、オイルは、さらに精製され、または、例えば、遊離脂肪酸を放出するために強塩基での加水分解により、もしくは蒸留等により処理されることとしてもよい。
【0130】
本明細書で使用される場合、「総ω６脂肪酸」または「総ω６脂肪酸含有量」等は、その内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質、オイル、遺伝子組換え（recombinanat）細胞、植物部分、または種子におけるエステル化および非エステル化ω６脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω６脂肪酸は、（もし存在する場合には）ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、およびω６‐ＤＰＡを含み、あらゆるω３脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
【0131】
本明細書で使用される場合、「新ω６脂肪酸」または「新ω６脂肪酸含有量」等は、その内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、ＬＡを除く、エステル化および非エステル化ω６脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω６脂肪酸は、細胞内に導入される遺伝子コンストラクト（外因性ポリヌクレオチド）の発現による本発明の細胞、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、（もし存在する場合には）ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡおよびω６‐ＤＰＡを含むが、ＬＡおよびあらゆるω３脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω６脂肪酸含有量および新ω６脂肪酸含有量は、実施例１に記載されるように、ＦＡＭＥへのサンプルにおける脂肪酸の転換およびＧＣによる分析により測定される。
【0132】
本明細書で使用される場合、「総ω３脂肪酸」または「総ω３脂肪酸含有量」等は、その内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子におけるエステル化および非エステル化ω３脂肪酸の全ての合計を指す。これらのω３脂肪酸は、（もし存在する場合には）ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを含み、あらゆるω６脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。
【0133】
本明細書で使用される場合、「新ω３脂肪酸」または「新ω３脂肪酸含有量」等は、その内容が測定される場合に、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表される、抽出脂質、オイル、遺伝子組換え細胞、植物部分、または種子における、ＡＬＡを除く、エステル化および非エステル化ω３脂肪酸の全ての合計を指す。これらの新ω３脂肪酸は、細胞内に導入される遺伝子コンストラクト（外因性ポリヌクレオチド）の発現による本発明の細胞、植物、植物部分、および種子で産生される脂肪酸であり、（もし存在する場合には）ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを含むが、ＡＬＡおよびあらゆるω６脂肪酸および一価不飽和脂肪酸を除外する。例示的な総ω３脂肪酸含有量および新ω３脂肪酸含有量は、実施例１に記載されるように、ＦＡＭＥへのサンプルにおける脂肪酸の転換およびＧＣによる分析により測定される。
【0134】
本発明で使用される、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、およびアシルトランスフェラーゼタンパク質、並びにそれらをコードする遺伝子は、あらゆる当該技術分野で知られるもの、または相同体、またはこれらの誘導体である。このような遺伝子およびコードされるタンパク質サイズの例は、表１に挙げられる。ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成に関与することが示されたデサチュラーゼ酵素は全て、いわゆる「フロントエンド」のデサチュラーゼの群に属する。
【0135】
本明細書で使用される場合、用語「フロントエンドのデサチュラーゼ」は、３つの高度に保存されたヒスチジンボックスを含む、典型的な脂肪酸デサチュラーゼドメインに沿って、Ｎ末端シトクロムｂ５ドメインの存在により構造的に特徴づけられる、脂質のアシル鎖の既存の不飽和部分とカルボキシル基との間の二重結合を導入するクラスの酵素のメンバーを指す（Napier et al., 1997）。
【0136】
本発明における使用に関するあらゆるエロンガーゼまたはデサチュラーゼの活性は、例えば、酵母細胞、植物細胞のような細胞における、または好ましくは体性の胚もしくはトランスジェニック植物における酵素をコードする遺伝子を発現することにより、および細胞、胚、もしくは植物が、酵素が発現されない比較可能な細胞、胚、もしくは植物と比較してＬＣ‐ＰＵＦＡを産生する性能を増加させたかどうかを測定することにより試験されることとしてもよい。
【0137】
一実施形態において、本発明における使用のための１またはそれ以上のデサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼは、微細藻類から精製され得、つまり、微細藻類から精製され得るポリペプチドと同じアミノ酸配列である。
【0138】
一定の酵素が、本明細書に「二機能性」として具体的に記載されるが、このような用語がないことが、特定の酵素が具体的に定義される以外の活性を有しないことを暗示する必要はない。
【0139】
デサチュラーゼ本明細書で使用される場合、用語「デサチュラーゼ」は、例えば、アシル‐ＣｏＡエステルのような、典型的にはエステル化形態におけるものである、脂肪酸基質のアシル基内に炭素‐炭素二重結合を導入することが可能な酵素を指す。アシル基は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のようなリン脂質に対して、またはアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）に対して、または、好ましい実施形態ではＣｏＡに対して、エステル化されることとしてもよい。よって、デサチュラーゼは、概して、３つのグループにカテゴライズされることとしてもよい。一実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドのデサチュラーゼである。
【0140】
本明細書で使用される場合、「Δ４‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から４番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。「Δ４‐デサチュラーゼ」は、ＤＰＡをＤＨＡに転換することが少なくとも可能である。ＤＰＡからＤＨＡを産生するための不飽和化工程は、哺乳類以外の生物におけるΔ４‐デサチュラーゼにより触媒され、この酵素をコードする遺伝子は、淡水性の原生生物種ユーグレナグラシリスおよび海洋種スラウストキトリウム（Thraustochytrium）種から単離された(Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003)。一実施形態において、Δ４‐デサチュラーゼは、配列番号４１に規定される配列を有するアミノ酸、もしくはスラウストキトリウム種Δ４‐デサチュラーゼ、その生物学的に活性な断片、または配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0141】
ＬＣ‐ＰＵＦＡ生合成に関連するクローン化遺伝子【表1】
【0142】
本明細書で使用される場合、「Δ５‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から５番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ５‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およびPetrie et al. (2010a)および本明細書の表１に挙げられる。一実施形態において、Δ５‐デサチュラーゼは、配列番号３０に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５‐デサチュラーゼは、配列番号３２に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号３２と少なくとも５３％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ５‐デサチュラーゼは、スラウストキトリウム種またはエミリアニアハクスレイ由来である。
【0143】
本明細書で使用される場合、「Δ６‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から６番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ６‐デサチュラーゼの例は、Ruiz-Lopez et al. (2012)およびPetrie et al. (2010a)および本明細書の表１に挙げられる。好ましいΔ６‐デサチュラーゼは、ミクロモナス・プシラ、ピティウムイレギュラレ、またはオストレオコッカスタウリ由来である。
【0144】
一実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、少なくとも２つの、好ましくは全ての３つの、および好ましくは植物細胞において、以下の事項：ｉ）脂肪酸基質としてのリノール酸（ＬＡ、１８：２Δ９、１２、ω６）よりも高いα‐リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ９、１２、１５、ω３）でのΔ６‐デサチュラーゼ活性；ｉｉ）脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも高い脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡでのΔ６‐デサチュラーゼ活性；およびｉｉｉ）ＥＴｒＡでのΔ８‐デサチュラーゼ活性、を有することによりさらに特徴づけられる。このようなΔ６‐デサチュラーゼの例は、表２に提供される。
【0145】
一実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、ω３基質で、対応するω６基質よりも高い活性を有し、植物細胞のような遺伝子組換え細胞における外因性ポリヌクレオチドから発現される場合には、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％、または、酵母細胞で発現される場合には、少なくとも３５％、の効率で、オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸、ＳＤＡ、１８：４Δ６、９、１２、１５、ω３）を産生するために、ＡＬＡで活性を有する。一実施形態において、Δ６‐デサチュラーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのＡＬＡでＬＡよりも少なくとも約２倍高いΔ６‐デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、より高い活性、例えば、脂肪酸基質としてのＡＬＡ‐ＣｏＡで、脂肪酸基質としてのＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡよりも、少なくとも５倍のΔ６‐デサチュラーゼ活性または少なくとも１０倍高い活性を有する。さらなる実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、脂肪酸基質ＡＬＡ‐ＣｏＡおよびＰＣのＳｎ‐２位置に結合するＡＬＡの両方で活性を有する。
【0146】
アシル‐ＣｏＡ基質で活性を有することが実証されたデサチュラーゼ【表2】
【0147】
一実施形態において、Δ６‐デサチュラーゼは、ＥＴＡで検出可能なΔ５‐デサチュラーゼ活性を有しない。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１６、配列番号１９、もしくは配列番号２０と少なくとも７７％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ６‐デサチュラーゼは、配列番号１９もしくは配列番号２０で規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１９もしくは配列番号２０の１つもしくは両方と少なくとも６７％同一であるアミノ酸配列を含む。また、Δ６‐デサチュラーゼは、Δ８‐デサチュラーゼ活性を有することとしてもよい。
【0148】
本明細書で使用される場合、「Δ８‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から８番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ８‐デサチュラーゼは、ＥＴｒＡをＥＴＡに転換することが少なくとも可能である。Δ８‐デサチュラーゼの例は、表１に挙げられる。一実施形態において、Δ８‐デサチュラーゼは、配列番号５２に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0149】
本明細書で使用される場合、「ω３‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のメチル末端から３番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。よって、ω３‐デサチュラーゼは、ＬＡをＡＬＡにおよびＧＬＡをＳＤＡに（全てＣ１８脂肪酸）、またはＤＧＬＡをＥＴＡにおよび／もしくはＡＲＡをＥＰＡに（Ｃ２０脂肪酸）転換することとしてもよい。いくつかのω３‐デサチュラーゼ（グループＩ）は、植物およびラン藻のω３‐デサチュラーゼのような、Ｃ１８基質でのみ活性を有する。このようなω３‐デサチュラーゼは、Δ１５‐デサチュラーゼでもある。他のω３‐デサチュラーゼは、Ｃ２０基質で活性を有し、Ｃ１８基質で活性を有さず（グループＩＩ）またはいくつかの活性を有する（グループＩＩＩ）。このようなω３‐デサチュラーゼは、Δ１７‐デサチュラーゼでもある。好ましいω３‐デサチュラーゼは、ピキア・パストリスω３‐デサチュラーゼ（配列番号１２）のような、ＬＡをＡＬＡに、ＧＬＡをＳＤＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに、およびＡＲＡをＥＰＡに転換するグループＩＩＩタイプである。ω３‐デサチュラーゼの例は、Pereira et al. (2004a)（魚類の内臓真菌症菌（Saprolegnia diclina）ω３‐デサチュラーゼ、グループＩＩ）、Horiguchi et al. (1998)、Berberich et al. (1998)、およびSpychalla et al. (1997)（線虫ω３‐デサチュラーゼ、グループＩＩＩ）により記載されるものを含む。好ましい実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、真菌のω３‐デサチュラーゼである。本明細書で使用される場合、「真菌のω３‐デサチュラーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース由来、またはアミノ酸配列がこれらに対して少なくとも９５％同一であるこれらの変異体である、ω３‐デサチュラーゼを指す。多数のω３‐デサチュラーゼをコードする遺伝子は、例えば、フィトフトラインフェスタンス（受入番号ＣＡＪ３０８７０、国際公開第２００５０８３０５３号；配列番号７０）、魚類の内臓真菌症菌（受入番号ＡＡＲ２０４４４，Pereira et al., 2004a ＆米国特許第７２１１６５６号）、ピティウムイレギュラレ（国際公開第２００８０２２９６３号，グループＩＩ；配列番号７２）、モルティエレラアルピナ（Sakuradani et al., 2005；受入番号ＢＡＤ９１４９５；国際公開第２００６０１９１９２号）、タラッシオシラシュードナナ（Armbrust et al., 2004;受入番号ＸＰ＿００２２９１０５７；国際公開第２００５０１２３１６号、配列番号７１）、ラカンセア・クルイベリ（サッカロマイセスクルイベリ（Saccharomyces kluyveri）としても知られる；Oura et al., 2004；受入番号ＡＢ１１８６６３）由来の真菌ソースから単離された。Xue et al. (2012)は、Ｃ２０基質について好ましい、ω６脂肪酸基質を対応するω３脂肪酸に効率的に転換することができた、つまり、それらはΔ１５‐デサチュラーゼ活性よりも強いΔ１７‐デサチュラーゼ活性を有した、卵菌ピティウムアファニデルマツム（Pythium aphanidermatum）、フィトフトラソジャエ（Phytophthora sojae）、およびフィトフトララモラム（Phytophthora ramorum）由来のω３‐デサチュラーゼを記載する。これらの酵素は、Δ１２‐デサチュラーゼ活性を欠くが、基質としてのアシル‐ＣｏＡおよびリン脂質フラクションの両方における脂肪酸を使用することができた。
【0150】
より好ましい実施形態では、真菌ω３‐デサチュラーゼは、ピキア・パストリス（コマガタエラパストリス（Komagataella pastoris）としても知られる）ω３‐デサチュラーゼ／Δ１５‐デサチュラーゼ（Zhang et al., 2008;受入番号ＥＦ１１６８８４；配列番号１２）、またはこれらと少なくとも９５％同一であるポリペプチドである。
【0151】
一実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、少なくとも、ＡＲＡをＥＰＡに、ＤＧＬＡをＥＴＡに、ＧＬＡをＳＤＡに、のうち１つを、ＡＲＡをＥＰＡにおよびＤＧＬＡをＥＴＡに、の両方を、ＡＲＡをＥＰＡにおよびＧＬＡをＳＤＡに、の両方を、またはこれら３つの全てを転換することができる。
【0152】
一実施形態において、ω３‐デサチュラーゼは、少なくとも３つの炭素‐炭素二重結合、好ましくはＡＲＡを有する、Ｃ２０脂肪酸で、Δ１７‐デサチュラーゼ活性を有する。別の実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、３つの炭素‐炭素二重結合、好ましくはＧＬＡを有するＣ１８脂肪酸で、Δ１５‐デサチュラーゼ活性を有する。好ましくは、両方の活性が存在する。
【0153】
本明細書で使用される場合、「Δ１２‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１２番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ１２‐デサチュラーゼは、典型的には、オレオイル-ホスファチジルコリンまたはオレオイル‐ＣｏＡのいずれかを、リノレオイル−ホスファチジルコリン（１８：１‐ＰＣ）またはリノレオイル‐ＣｏＡ（１８：ｌ‐ＣｏＡ）にそれぞれ転換する。基質に結合されたＰＣを用いるサブクラスは、リン脂質依存性のΔ１２‐デサチュラーゼを、後者のサブクラス（sublclass）はアシル−ＣｏＡ依存性のΔ１２‐デサチュラーゼを指す。植物および真菌Δ１２‐デサチュラーゼは、概して前者のサブクラスであるのに対して、動物のΔ１２‐デサチュラーゼ、例えば、Zhou et al. (2008)による昆虫からクローン化された遺伝子によりコードされるΔ１２‐デサチュラーゼは後者のサブクラスである。多くの他のΔ１２‐デサチュラーゼ配列は、配列のデータベースをサーチすることにより容易に同定され得る。
【0154】
本明細書で使用される場合、「Δ１５‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１５番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ１５‐デサチュラーゼをコードする多数の遺伝子は、植物および真菌の種からクローン化された。例えば、米国特許第５９５２５４４号は、植物Δ１５‐デサチュラーゼ（ＦＡＤ３）をコードする核酸を記載する。これらの酵素は、植物Δ１５‐デサチュラーゼの特性であったアミノ酸モチーフを含む。国際公開第２００１１４５３８号は、ダイズＦＡＤ３をコードする遺伝子を記載する。多くの他のΔ１５‐デサチュラーゼ配列は、配列データベースをサーチすることにより、容易に同定され得る。
【0155】
本明細書で使用される場合、「Δ１７‐デサチュラーゼ」は、脂肪酸基質のカルボキシル末端から１７番目の炭素‐炭素結合で、炭素‐炭素二重結合を導入するデサチュラーゼ反応を行うタンパク質を指す。Δ１７‐デサチュラーゼは、もしそれがω３結合で不飽和化を導入するためにＣ２０基質で作用する場合には、ω３‐デサチュラーゼであるとも考えられる。
【0156】
好ましい実施形態では、Δ１２‐デサチュラーゼおよび／またはΔ１５‐デサチュラーゼは、真菌Δ１２‐デサチュラーゼまたは真菌Δ１５‐デサチュラーゼである。本明細書で使用される場合、「真菌Δ１２‐デサチュラーゼ」または「真菌のΔ１５‐デサチュラーゼ」は、卵菌ソースを含む真菌ソース、または、アミノ酸配列がこれらに対して少なくとも９５％同一である、これらの変異体由来である、Δ１２‐デサチュラーゼまたはΔ１５‐デサチュラーゼを指す。多数のデサチュラーゼをコードする遺伝子は、真菌のソースから単離された。米国特許第７２１１６５６号は、魚類の内臓真菌症菌由来のΔ１２デサチュラーゼを記載する。国際公開第２００９０１６２０２号は、Helobdella robusta、オオキツネタケ（Laccaria bicolor）、ナスビカサガイ（Lottia gigantea）、ミクロコレスクソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、モノシガブレビコリス（Monosiga brevicollis）、マイコスファエレラフィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）、コムギ葉枯病菌（Mycospaerella graminicola）、Naegleria gruben、ネクトリアヘマトコッカ（Nectria haematococca）、ネマトステラベクテンシス（Nematostella vectensis）、フィコマイセスブレイクスリーアヌス（Phycomyces blakesleeanus）、トリコデルマレシイ（Trichoderma resii）、ヒメツリガネゴケ、ポスティアプラセンタ（Postia placenta）、イヌカタヒバ（Selaginella moellendorffii）、およびミクロドキウムニバレ（Microdochium nivale）由来の真菌のデサチュラーゼを記載する。国際公開第２００５／０１２３１６号は、タラッシオシラシュードナナおよび他の真菌類由来のΔ１２‐デサチュラーゼを記載する。国際公開第２００３／０９９２１６号は、アカパンカビ、アスペルギルスニデュランス、灰色かび病菌およびモルティエレラアルピナから単離された真菌のΔ１２‐デサチュラーゼおよびΔ１５‐デサチュラーゼをコードする遺伝子を記載する。国際公開第２００７１３３４２５号は、サッカロマイセスクルイベリ、モルティエレラアルピナ、アスペルギルスニデュランス、アカパンカビ、フザリウムグラミニアラム（Fusarium graminearum）、フザリウムモニリフォルメ（Fusarium moniliforme）、およびマグネポルテグリセア（Magnaporthe grisea）から単離される真菌のΔ１５デサチュラーゼを記載する。好ましいΔ１２デサチュラーゼは、フィトフトラソジャエ由来である（Ruiz-Lopez et al., 2012）。
【0157】
真菌のΔ１２‐デサチュラーゼおよび真菌のΔ１５‐デサチュラーゼの別個のサブクラスが、二機能性の真菌のΔ１２／Δ１５‐デサチュラーゼである。これらをコードする遺伝子は、フザリウムモリノフォルメ（Fusarium monoliforme）(受入番号ＤＱ２７２５１６、Damude et al., 2006)、アカントアメーバカステラーニ（Acanthamoeba castellanii）(受入番号ＥＦ０１７６５６、Sayanova et al., 2006)、パーキンサスマリヌス（Perkinsus marinus）(国際公開第２００７０４２５１０号)、麦角病菌（Claviceps purpurea）(受入番号ＥＦ５３６８９８、Meesapyodsuk et al., 2007)、およびネナガヒトヨタケ（Coprinus cinereus）(受入番号ＡＦ２６９２６６、Zhang et al., 2007)からクローン化された。
【0158】
別の実施形態では、ω３‐デサチュラーゼが、アシル‐ＣｏＡ基質で、対応するアシル‐ＰＣ基質と少なくとも同じ活性、好ましくはより高い活性を有する。本明細書で使用される場合、「対応するアシル‐ＰＣ基質」は、脂肪酸がアシル‐ＣｏＡ基質におけるものと同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ‐２位置でエステル化された脂肪酸を指す。例えば、アシル‐ＣｏＡ基質はＡＲＡ‐ＣｏＡであることとしてもよく、対応するアシル‐ＰＣ基質はｓｎ‐２ＡＲＡ−ＰＣであることとしてもよい。一実施形態では、活性は少なくとも２倍以上高い。好ましくは、ω３‐デサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質とその対応するアシル‐ＰＣ基質の両方で少なくとも同じ活性を有し、Ｃ１８およびＣ２０基質の両方で活性を有する。このようなω３‐デサチュラーゼの例は、上記に挙げられたクローン化された真菌デサチュラーゼ間で知られる。
【0159】
さらなる実施形態では、ω３‐デサチュラーゼは、配列番号１２に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号１２と少なくとも６０％同じである、好ましくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％配列番号１２と同じであるアミノ酸配列を含む。
【0160】
さらに、さらなる実施形態では、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、アシル‐ＣｏＡ基質で、対応するアシル‐ＰＣ基質よりも高い活性を有する。別の実施形態では、本発明における使用のためのデサチュラーゼは、アシル‐ＰＣ基質で、対応するアシル‐ＣｏＡ基質よりも高い活性を有するが、両方の基質でいくつかの活性を有する。上記に概説したように、「対応するアシル‐ＰＣ基質」は、脂肪酸がアシル‐ＣｏＡ基質におけるものと同じ脂肪酸である、ホスファチジルコリン（ＰＣ）のｓｎ‐２位置でエステル化された脂肪酸を指す。一実施形態では、より高い活性は少なくとも２倍以上高い。一実施形態では、デサチュラーゼは、Δ５もしくはΔ６‐デサチュラーゼ、またはω３‐デサチュラーゼであって、その例が提供されるが、表２に挙げられたものに限定されない。どの基質でデサチュラーゼが作用するのかを、すわなち、アシル‐ＣｏＡまたはアシル‐ＰＣ基質で、試験するために、分析が、Domergue et al. (2003)および(2005)に記載されるように、酵母細胞で行われ得る。また、デサチュラーゼについてのアシル‐ＣｏＡ基質性能が、エロンガーゼの場合に推論され得、デサチュラーゼ（desturase）とともに発現される場合、エロンガーゼがデサチュラーゼの産生物の伸長を触媒する、少なくとも約９０％の植物細胞における酵素的な転換効率を有する。これに基づき、ＧＡ７コンストラクト（実施例２および３）およびその変異体（実施例５）から発現されるΔ５‐デサチュラーゼおよびΔ４‐デサチュラーゼが、それらの個々のアシル‐ＣｏＡ基質、ＥＴＡ‐ＣｏＡ、およびＤＰＡ‐ＣｏＡを不飽和化することを可能にする。
【0161】
エロンガーゼ生化学的証拠が、脂肪酸伸長が４つの工程：濃縮、還元、脱水、および第２の還元からなることを示唆する。本発明の内容において、「エロンガーゼ」は、適切な生理的条件下で、伸長複合体の他のメンバーの存在下で凝縮工程を触媒するポリペプチドを指す。伸長タンパク質複合体の凝縮成分（「エロンガーゼ」）のみの細胞における異種性または相同性発現が、個々のアシル鎖の伸長のために必要とされることが示された。よって、導入されたエロンガーゼが、成功的なアシル伸長を行うためのトランスジェニック宿主からの還元および脱水作業を成功的に採用することができる。鎖の長さに対する鎖延長反応の特異性または脂肪酸基質の不飽和化の程度が、凝縮成分に存在することが考えられる。また、この成分は、鎖延長反応において律速であることが考えられる。
【0162】
本明細書で使用される場合、「Δ５‐エロンガーゼ」は、ＥＰＡをＤＰＡに転換することが少なくとも可能である。Δ５‐エロンガーゼの例は、国際公開第２００５／１０３２５３号に開示されるものを含む。一実施形態において、Δ５‐エロンガーゼは、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、または最も好ましくは８０％もしくは９０％の効率でＤＰＡを産生するために、ＥＰＡで活性を有する。さらなる実施形態では、Δ５‐エロンガーゼは、配列番号３７に規定されるアミノ酸配列、その生物学的に活性な断片、または配列番号３７と少なくとも４７％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ６‐エロンガーゼは、オストレオコッカスタウリまたはオストレオコッカスルシマリヌス由来である（米国出願公開第２０１０／０８８７７６号）。
【0163】
本明細書で使用される場合、「Δ６‐エロンガーゼ」は、ＳＤＡをＥＴＡに少なくとも転換することができる。Δ６‐エロンガーゼの例は、表１に挙げられるものを含む。一実施形態において、エロンガーゼは、配列番号２５に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片（例えば、配列番号２６に規定されるフラグメント）、または配列番号２５もしくは配列番号２６の１つもしくは両方と少なくとも５５％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、Δ６‐エロンガーゼは、ヒメツリガネゴケ（Zank et al., 2002;受入番号ＡＦ４２８２４３）またはタラシオシラシュードナナ（Tlialassiosira pseudonana）（Ruiz-Lopez et al., 2012）由来である。
【0164】
本明細書で使用される場合、「Δ９‐エロンガーゼ」は、ＡＬＡをＥＴｒＡに少なくとも転換することができる。Δ９‐エロンガーゼの例は、表１にあげられるものを含む。一実施形態において、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号４３に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号４６に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４６と少なくとも８１％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号４８に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号４８と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、配列番号５０に規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または配列番号５０と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、Δ９‐エロンガーゼは、ω６基質で対応するω３基質よりも高い活性を有し、またはその逆である。
【0165】
本明細書で使用される場合、用語「ω６基質で対応するω３基質よりも高い活性を有する」は、ω３デサチュラーゼの作用により異なる基質での酵素の相対的な活性を指す。好ましくは、ω６基質はＬＡであり、ω３基質はＡＬＡである。
【0166】
Δ６‐エロンガーゼおよびΔ９‐エロンガーゼ活性を有するエロンガーゼは、（ｉ）ＳＤＡをＥＴＡに転換すること、および（ｉｉ）ＡＬＡをＥＴｒＡに変換することが少なくとも可能であり、Δ９‐エロンガーゼ活性よりも高いΔ６‐エロンガーゼ活性を有する。一実施形態において、エロンガーゼは、ＥＴＡを産生するために、ＳＤＡで、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％の転換の効率、および／またはＥＴｒＡを産生するために、ＡＬＡで、少なくとも６％もしくはより好ましくは少なくとも９％の転換の効率を有する。別の実施形態では、エロンガーゼは、Δ９‐エロンガーゼ活性よりも少なくとも約６．５倍高いΔ６‐エロンガーゼ活性を有する。さらなる実施形態では、エロンガーゼは、検出可能なΔ５‐エロンガーゼ活性を有していない。
【0167】
他の酵素本明細書で使用される場合、用語「１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ」（ＬＰＡＡＴ）は、リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼまたはアシルＣｏＡ‐リゾホスファチジン酸‐アシルトランスフェラーゼともよばれ、ホスファチド酸（ＰＡ）を形成するためにｓｎ‐２位置でｓｎ‐ｌ‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェート（ｓｎ‐１ Ｇ‐３‐Ｐ）をアシル化するタンパク質を指す。よって、用語「１‐アシル‐グリセロール‐３‐ホスフェートアシルトランスフェラーゼ活性」は、ＰＡ（ＥＣ ２．３．１．５１）を産生するための、ｓｎ‐２位置での（ｓｎ‐１ Ｇ‐３‐Ｐ）のアシル化を指す。好ましいＬＰＡＡＴは、ＬＰＡのｓｎ‐２位置に多価不飽和Ｃ２２アシル基を転移するために、基質として多価不飽和Ｃ２２アシル‐ＣｏＡを使用し得るものであり、ＰＡを形成する。このようなＬＰＡＡＴは、実施例１３に例示され、そこに記載されるように試験され得る。一実施形態では、本発明のために有用なＬＰＡＡＴは、配列番号６３から６９のいずれか１つに規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または１もしくはそれ以上の配列番号６３から６９のいずれか１つと少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、本発明について有用なＬＰＡＡＴは、配列番号６４、６５、および６７のいずれか１つに規定される配列を有するアミノ酸、その生物学的に活性な断片、または１もしくはそれ以上の配列番号６４、６５、および６７のいずれか１つと少なくとも４０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0168】
本明細書で使用される場合、用語「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」（ＥＣ２．３．１．２０；ＤＧＡＴ）は、トリアシルグリセロールを産生するために、アシル‐ＣｏＡからジアシルグリセロール基質へと脂肪族アシル基を転移するタンパク質を指す。よって、「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性」は、トリアシルグリセロールを産生するための、ジアシルグリセロールへのアシル‐ＣｏＡの転移を指す。ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ３として言及される３つの既知のタイプのＤＧＡＴがある。ＤＧＡＴ１ポリペプチドは、典型的には、１０の膜貫通ドメインを有し、ＤＧＡＴ２は、典型的には、２の膜貫通ドメインを有し、一方、ＤＧＡＴ３は、典型的には可溶性である。ＤＧＡＴ１ポリペプチドの例は、アスペルギルスフミガーツス(受入番号ＸＰ＿７５５１７２）、シロイヌナズナ（ＣＡＢ４４７７４）、トウゴマ（ＡＡＲ１１４７９）、オオアブラギリ（ＡＢＣ９４４７２）、ベルノニアガラメンシス（ＡＢＶ２１９４５、ＡＢＶ２１９４６）、ニシキギ（ＡＡＶ３１０８３）、カエノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis elegans）（ＡＡＦ８２４１０）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（ＮＰ＿４４５８８９）、ホモサピエンス（ＮＰ＿０３６２１１）由来のＤＧＡＴ１遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および／または突然変異体を含む。ＤＧＡＴ２ポリペプチドの例は、シロイヌナズナ （受入番号ＮＰ＿５６６９５２）、トウゴマ（ＡＡＹ１６３２４）、オオアブラギリ（ＡＢＣ９４４７４）、モルティエレララマニアナ（ＡＡＫ８４１７９）、ホモサピエンス（Ｑ９６ＰＤ７、Ｑ５８ＨＴ５）、ウシ（Bos taurus）（Ｑ７０ＶＤ８）、ハツカネズミ（Mus musculus）（ＡＡ８４１７５）、ミクロモナスＣＣＭＰ１５４５由来のＤＧＡＴ２遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および／または突然変異体を含む。ＤＧＡＴ３ポリペプチドの例は、ピーナッツ（peanut）(ピーナッツ（Arachis hypogaea）, Saha, et al., 2006)由来のＤＧＡＴ３遺伝子によりコードされるポリペプチド、並びにその変異体および／または突然変異体を含む。
【0169】
ポリペプチド／ペプチドポリペプチドの内容における用語「遺伝子組換え」は、それが天然に産生される場合のその自然の状態と比較して、変化した量または変化した率で、細胞によりまたは細胞フリーの発現システムにより産生される場合のポリペプチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリペプチドを天然で産生しない細胞である。しかしながら、細胞は、産生されるポリペプチドの変化した量を生じさせる非内因性遺伝子含む細胞であることとしてもよい。本発明の遺伝子組換えポリペプチドは、それが産生される、細胞、組織、器官、もしくは生物、または細胞フリー発現システムにおけるポリペプチド、つまり、それが産生されたトランスジェニック（遺伝子組換え）細胞の他の成分から分離または精製されていないポリペプチド、および、その後、少なくともいくつかの他の成分から精製されるこのような細胞または細胞フリーのシステムにおいて産生されるポリペプチドを含む。
【0170】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、概して、互換的に使用される。
【0171】
ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準のアミノ酸配列に対してそのアミノ酸配列の同一性の程度（％同一性）により、または１つの基準のアミノ酸配列に対して、別に対するよりもより高い％同一性を有することにより、定義されることとしてもよい。基準のアミノ酸配列に対するポリペプチドの％同一性は、典型的には、ギャップクリエーションペナルティ（gap creation penalty）＝５、および、ギャップエクステンションペナルティ（gap extension penalty）＝０．３のパラメーターによってＧＡＰ分析（Needleman and Wunsch, 1970；ＧＣＧプログラム）により測定される。問い合わせ配列は、少なくとも１５アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準を合わせる。より好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも１００アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準を合わせる。さらにより好ましくは、問い合わせ配列は、少なくとも２５０アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたる２つの配列に照準を合わせる。さらにより好ましくは、ＧＡＰ分析は、それらの全体の長さにわたる２つの配列に照準を合わせる。ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準ポリペプチドと同じ酵素活性もしくは異なる活性を有し、またはその活性を欠くこととしてもよい。好ましくは、ポリペプチドが、基準ポリペプチドの活性の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の酵素的な活性を有する。
【0172】
本明細書で使用される場合、「生物活性」フラグメントは、例えば、デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ活性、または他の酵素活性を有するような、全長基準ポリペプチドの定義された活性を維持する、本明細書に定義されるポリペプチドの一部である。本明細書で使用される生物学的に活性な断片は、全長ポリペプチドを除外する。生物学的に活性な断片は、それらが定義された活性を維持する限り、あらゆるサイズ部分であり得る。好ましくは、生物学的に活性な断片は、全長タンパク質の少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９０％の活性を維持する。
【0173】
定義されたポリペプチドまたは酵素に関し、本明細書で提供されるものよりもより高い％同一性の形態が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。よって、適用できる場合、最小の％同一性の形態に照らして、ポリペプチド／酵素は、関連して挙げられる配列番号と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【0174】
本明細書で定義されるポリペプチドのアミノ酸配列変異体／突然変異体は、本明細書に定義される核酸に適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製され得る。このような変異体/突然変異体は、例えば、アミノ酸内に、残基の欠失、挿入、または置換を含む。欠失、挿入、および置換の組み合わせは、最終的なペプチド産生物が所望の酵素活性を有することを提供する、最終的なコンストラクトに達するために作成され得る。
【0175】
突然変異体（変更された）ペプチドは、あらゆる公知技術を用いて調製され得る。例えば、本明細書に定義されるポリヌクレオチドは、Harayama (1998)により広く記載されるように、インビトロで突然変異誘発またはＤＮＡシャッフリング技術に供され得る。突然変異／変更ＤＮＡ由来の産生物は、例えば、それらがデサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する場合に、測定を行うための、本明細書に記載される技術を用いて容易にスクリーニングされ得る。
【0176】
アミノ酸配列の突然変異体をデザインする際、突然変異点の場所および突然変異の性質が、変更される特徴（複数を含む）に依存するであろう。突然変異の場所は、例えば、（１）まず保守的なアミノ酸の選択により、その後の達成された結果による革新的な選択により置換し、（２）標的残基を欠失させ、または（３）位置される場所に隣り合う他の残基を挿入することにより、個々にまたは連続して変更され得る。
【0177】
アミノ酸配列は、概して約１から１５の残基の範囲、より好ましくは約１から１０残基および典型的には約１から５の連続する残基を欠失する。
【0178】
置換突然変異体は、除去されるポリペプチド分子における少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入される異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も高い関心の場所は、天然に生じるデサチュラーゼまたはエロンガーゼの中で保存されない場所を含む。これらの場所は、好ましくは、酵素活性を維持するために、比較的保守的な態様で置換される。このような保守的な置換は、「例示的な置換」の項目のもとに、表３で示される。
【0179】
好ましい実施形態では、突然変異体／変異体ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドと比較される場合に、唯一、または、１もしくは２もしくは３もしくは４以下の保守的なアミノ酸変更を有する。保守的なアミノ酸の変更の詳細は、表３に提供される。当業者が認識しているように、このような微小な変更は、遺伝子組換え細胞で発現される場合に、ポリペプチドの活性を変更しないことが合理的に予測され得る。
【0180】
ポリペプチドは、当該技術分野で知られる方法に従って、天然のポリペプチドまたは遺伝子組換えポリペプチドの産生および回収を含む、種々の方法で産生され得る。一実施形態において、遺伝子組換えポリペプチドは、本明細書で定義される宿主細胞のような、ポリペプチドを産生するために有効な条件下でポリペプチドの発現を可能にする細胞を培養することにより産生される。ポリペプチドを産生するためにより好ましい細胞は、植物における細胞、特に、植物における種子である。
【0181】
ポリヌクレオチドまた、本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、Ｔ‐ＤＮＡ分子のようなキメラ遺伝子構築物、またはキメラＤＮＡであることとしてもよい、ポリヌクレオチドを提供しおよび／または使用する。本明細書に定義される特定の活性を行うための、ゲノムまたは合成の起源、二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり、炭水化物、脂質、タンパク質、または他の材料との組み合わされることとしてもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書で、用語「核酸分子」と互換的に使用される。「単離ポリヌクレオチド」で、天然のソースから得られる場合に、その天然状態で関連しもしくは結合されるポリヌクレオチド配列、または非天然で生じるポリヌクレオチドで、ポリヌクレオチド配列から分離された、ポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離ポリヌクレオチドは、天然に関連する、他の成分から、少なくとも６０％フリー、より好ましくは少なくとも７５％フリー、およびより好ましくは少なくとも９０％フリーである。
【0182】
例示的な置換【表3】
【0183】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、非天然起源である。非天然源のポリヌクレオチドの例は、（本明細書に記載される方法を用いることによるような）突然変異されたもの、およびタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、（本明細書に記載されるコンストラクトにおけるような）天然に関連していないプロモーターに操作可能に結合されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【0184】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」はその広い内容で解釈され、構造遺伝子の、転写領域および翻訳される場合にはタンパク質コード領域を含み、遺伝子の発現を伴う、両端に少なくとも約２ｋｂの距離でコード領域と５’および３’の端部の両方で隣り合って配置される配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を含む。この点については、遺伝子は、遺伝子が「キメラ遺伝子」を指す場合における、異種性の制御シグナル、または所与の遺伝子と天然に関連する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーション、および／またはポリアデニル化シグナルのような制御シグナルを含む。タンパク質コード領域の５’に配置され、およびｍＲＮＡに存在する配列は、５’の非翻訳配列を指す。タンパク質コード領域の下流または３’に配置され、およびｍＲＮＡに存在する配列は、３’の非翻訳配列を指す。用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡおよび遺伝子のゲノムの形態の両方を包含する。ゲノムの形態または遺伝子のクローンは、「イントロン」、または「介在領域」、または「介在配列」とよばれる非コード配列により中断されるコード領域を含む。イントロンは、核のＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）内に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含むこととしてもよい。イントロンは、核または転写一次産物から取り除かれまたは「切り出され」、よって、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、新生のポリペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を特定するための翻訳中に機能する。用語「遺伝子」は、本明細書に記載される本発明のタンパク質の全部または一部および上記のいずれか１つに対する相補的なヌクレオチド配列をコードする、合成または融合分子を含む。
【0185】
本明細書で使用される場合、「キメラＤＮＡ」または「キメラ遺伝子構築物（コンストラクト）」は、その天然の位置において天然のＤＮＡ分子ではないあらゆるＤＮＡ分子を指し、また、本明細書で「ＤＮＡコンストラクト」を指す。典型的には、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、調節および転写され、または天然でともに操作可能に結合されたことがみられない、つまり、互いに対して異種性である、タンパク質コード配列を含む。よって、キメラＤＮＡまたはキメラ遺伝子は、異なるソース由来である調節配列およびコード配列、または同じソース由来である調節配列およびコード配列を含むが、天然でみられるものと異なる態様で配列されることとしてもよい。
【0186】
用語「内因性」は、例えば、研究下の植物と同じ発生上のステージでの非変更植物に通常存在しまたは産生される物質を指すために、本明細書で使用される。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の場所での天然の遺伝子を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子組換え核酸分子」、「遺伝子組換えポリヌクレオチド」、またはこれらのバリエーションは、遺伝子組換えＤＮＡ技術により構成または変更された核酸分子を指す。用語「外来性ポリヌクレオチド」または「外因性ポリヌクレオチド」または「異種性ポリヌクレオチド」等は、実験的操作により、細胞のゲノム内に導入されたあらゆる核酸を指す。外来性または外因性遺伝子は、非天然生物内に挿入される遺伝子、天然の宿主内で新しい場所に導入される天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子であることとしてもよい。「導入遺伝子」は、変換手順により、ゲノム内に導入された遺伝子である。用語「遺伝的に変更された」、「トランスジェニック」、およびそのバリエーションは、変換または形質導入により細胞内に遺伝子を導入すること、細胞における遺伝子を突然変異すること、およびこれらの作用がなされる細胞もしくは生物またはこれらの後代における遺伝子の調節の変更または調節することを含む。本明細書で使用される「ゲノム領域」は、導入遺伝子、または導入遺伝子の群（本明細書ではクラスターとしても言及される）が、細胞またはこれらの子孫内に導入された、ゲノム内の位置を指す。このような領域は、本明細書に記載される方法によるような、人の干渉により組み込まれたヌクレオチドのみを含む。
【0187】
ポリヌクレオチドの内容における用語「外因性」は、その天然の状態と比較して変化した量における、細胞に存在する場合のポリヌクレオチドを指す。一実施形態において、細胞は、ポリヌクレオチドを天然で含まない細胞である。しかしながら、細胞は、コードされたポリペプチドの変化した産生の量をもたらす、非内因性ポリヌクレオチドを含む細胞であることとしてもよい。本発明の外因性ポリヌクレオチドは、トランスジェニック（遺伝子組換え）細胞、または存在する場合には、細胞フリーの発現システムの他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、および少なくともいくつかの他の成分からその後精製されるこのような細胞または細胞フリーの発現システムで産生されるポリヌクレオチドを含む。外因性ポリヌクレオチド（核酸）は、天然に存在するヌクレオチドの連続的な伸展であり得、またはシングルポリヌクレオチドを形成するために結合される異なるソース（天然由来および／または合成）由来の２つまたはそれ以上の連続的なヌクレオチドの伸展を含む。典型的には、このようなキメラポリヌクレオチドは、関心細胞におけるオープンリーディングフレームの転写を駆動するのに適するプロモーターに操作可能に結合する、本発明のポリペプチドをコードする少なくともオープンリーディングフレームを含む。
【0188】
本明細書で使用される場合、用語「異なる外因性ポリヌクレオチド」またはそのバリエーションは、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、少なくとも１つ、好ましくはそれ以上のヌクレオチドにより異なることを意味する。ポリヌクレオチドは、細胞内のタンパク質へと翻訳されるまたはされないこととしてもよい、ＲＮＡをコードする。実施例では、各ポリヌクレオチドは、異なる活性でタンパク質をコードすることが好ましい。別の実施例では、各外因性ポリヌクレオチドは、他の外因性ポリヌクレオチドと９５％未満、９０％未満、または８０％未満同一である。好ましくは、外因性ポリヌクレオチドは、機能的なタンパク質／酵素をコードする。さらに、異なる外因性ポリヌクレオチドは非重複であり、各ポリヌクレオチドは、例えば、別の外因性ポリヌクレオチドと重複しない染色体外の転移核酸の別個の領域であることが好ましい。最小限で、各外因性ポリヌクレオチドは、転写開始および停止部位、並びに、指定されたプロモーターを有する。個々の外因性ポリヌクレオチドは、イントロンを含むこととしてもよく、または含まないこととしてもよい。
【0189】
定義されたポリヌクレオチドに関し、上記に提供されるよりも高い数値の％同一性は、好ましい実施形態に包含されることが理解されるであろう。よって、適用可能である場合には、最小の同一性％の数値に照らして、ポリヌクレオチドは、関連して挙げられる配列番号の少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【0190】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し、厳しい条件下で、選択的にハイブリダイズすることとしてもよい。本明細書で使用される場合、厳しい条件は、（１）ホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭ ＮａＣｌでｐＨ６．５とした５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム入りの５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを４２℃でハイブリダイゼーション中に採用する、または（２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理されたサーモンスパムのＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにおいて４２℃で採用する、および／または（３）洗浄のための低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍ ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳを５０℃で採用するものである。
【0191】
本発明のポリヌクレオチドは、天然に生じる分子と比較される場合に、ヌクレオチド残基の欠失、挿入または置換である、１またはそれ以上の突然変異を有することとしてもよい。基準配列に対して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然起源（すなわち、天然のソースからの単離）または合成（例えば、上記のような核酸で部位特異的突然変異誘発またはＤＮＡシャッフリングを行うことによる）のいずれかであり得る。よって、本発明のポリヌクレオチドは、天然起源または遺伝子組換え由来のいずれかであり得ることは明らかである。好ましいポリヌクレオチドは、公知技術で知られるような、植物細胞における翻訳のためにコドン最適化されるコード領域を有するものである。
【0192】
組み換えベクター本発明の一実施形態には、組み換えベクターが含まれ、これは、宿主細胞にポリヌクレオチド分子を導入するのが可能ないずれかのベクターに挿入された、本明細書で定義される少なくとも１つのポリヌクレオチド分子を含む。組み換えベクターには発現ベクターが含まれる。組み換えベクターは、異種性ポリヌクレオチド配列、つまり、本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子に、自然には隣接して見つからず、好ましくは、該ポリヌクレオチド分子（複数可）が由来した種以外の種由来であるヌクレオチド配列を含む。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一般的にプラスミドである。プラスミドベクターには通常、１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含む、たとえばｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、ｐＢＳ由来ベクターまたは好ましくはバイナリーベクターといった、原核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅および形質転換を提供する追加の核酸配列を含む。追加の核酸配列には、ベクターの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築物にコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する特有のマルチプルクローニング部位、および、原核および真核（特に植物）細胞の形質転換を強化する配列が含まれる。組み換えベクターには、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを２つ以上、たとえば、３、４、５または６つの本明細書で定義されるポリヌクレオチドを組み合わせて含み得、好ましくは、それぞれのポリヌクレオチドが、対象細胞で動作可能な発現制御配列に操作可能に結合している本発明のキメラ遺伝子構築物を含み得る。本明細書で定義される２つ以上のポリヌクレオチド、たとえば、３、４、５または６つのポリヌクレオチドは、好ましくは単一組み換えベクターと共有結合し、好ましくは単一Ｔ−ＤＮＡ分子内で共有結合し、これは、次いで、単一分子として細胞に導入され、本発明に従った組み換え細胞を形成し得、好ましくは、たとえばトランスジェニック植物の組み換え細胞のゲノムに組み込まれ得る。したがって、そのように結合したポリヌクレオチドは組み換え細胞または植物の子孫内に単一遺伝子座として一緒に受け継がれる。組み換えベクターまたは植物は、たとえば、各組み換えベクターが３、４、５または６つのポリヌクレオチドを含む、それぞれが複数のポリヌクレオチドを含むそのような組み換えベクターを２つ以上含み得る。
【0193】
本明細書で使用される「操作可能に結合」は、２つ以上の核酸（たとえば、ＤＮＡ）断片間の機能的な関係性を指す。通常、転写調整要素(プロモーター)の転写された配列に対する機能的な関係性を指す。たとえば、プロモーターが適切な細胞でコード配列の転写を刺激または調節する場合、プロモーターは本明細書で定義されるポリヌクレオチドといったコード配列に操作可能に結合している。一般的に、転写配列に操作可能に結合するプロモーター転写調節要素は、転写配列に物理的に近接しており、すなわち、これらはシス作用性である。しかし、エンハンサーといったいくつかの転写調節要素は、それらが強化する転写対象であるコード領域に物理的に近接または隣接して位置する必要はない。
【0194】
複数のプロモーターが存在する場合、各プロモーターは独立して同一または異なっていてよい。
【0195】
キメラＤＮＡまたは遺伝子構築物といった組み換え分子はまた、（ａ）発現された本明細書で定義するポリペプチドが、ポリペプチドを生産する細胞から分泌されるのを可能にするシグナルペプチド配列をコードする、または、たとえば細胞の小胞体（ＥＲ）内でのポリペプチドの保持もしくはプラスチドへの送達といった、発現ポリペプチドの局在化を提供する、１つ以上の分泌シグナルを含み、ならびに／または（ｂ）融合タンパク質として核酸分子の発現を導く融合配列を含む。適切なシグナル断片の例には、本明細書で定義されるポリペプチドの分泌または局在化を指示することが可能な、任意のシグナル断片が含まれる。組み換え分子はまた、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列を囲む、および／または、本明細書で定義される核酸分子の核酸配列内に、介在および／または非翻訳配列を含み得る。
【0196】
形質転換体の同定を助長するために、核酸構築物は、好ましくは、外来性または外因性ポリヌクレオチドとして、または、外来性または外因性ポリヌクレオチドに加えて、選択またはスクリーンマーカー遺伝子を含む。「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現する細胞に特有の表現型を分け与え、したがってそのような形質転換細胞がマーカーを有さない細胞から区別されることを可能にする遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子は、選択剤（たとえば、除草剤、抗生物質、放射、熱または非形質転換細胞を傷つける他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」できる特色を提供する。スクリーンマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち、「スクリーニング」する（たとえば、非形質転換細胞には存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは他の酵素活性）ことで、同定できる特色を提供する。マーカー遺伝子および対象のヌクレオチド配列は結合していなくてもよい。植物細胞といった、選択した細胞と組み合わせて機能的である（すなわち、選択的である）限り、マーカーの実際の選択は重要ではない。
【0197】
細菌選択マーカーの例には、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性といった抗生物質耐性を与えるマーカーが挙げられる。植物形質転換体の選択のための例示的選択マーカーには、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８への耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子；たとえば欧州特許第２５６２２３号に記載されるような除草剤由来のグルタチオンへの耐性を与えるラット肝臓のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；たとえば国際公開第８７／０５３２７号に記載されるようなホスフィノトリシンといったグルタミンシンテターゼインヒビターへの耐性を過剰発現の際に与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子、たとえば欧州特許第２７５９５７号に記載されるような選択剤ホスフィノトリシンへの耐性を与えるストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、たとえばＨｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）が説明するようなＮ−ホスホノメチルグリシンへの耐性を与える５−エノールシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子、たとえば国際公開第９１／０２０７１号に記載されるビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子；ブロモキシニルへの耐性を与える臭鼻菌由来のｂｘｎといったニトリラーゼ遺伝子（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８８）；メトトレキセーへの耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Ｔｈｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．、１９８８年）；イミダゾリノン、スルホニルウレアもしくは他のＡＬＳ阻害化学物質への耐性を与える突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（欧州特許第１５４，２０４号）；５−メチルトリプトファンへの耐性を与える突然変異したアントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤への耐性を与えるダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【0198】
好ましいスクリーンマーカーには、様々な色素生産性基質が知られるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子（Ｎｉｅｄｚ ｅｔ ａｌ．、１９９５）またはその誘導体；生物発光検知を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ｏｗ ｅｔ ａｌ．、１９８６）、および、当該技術分野で知られる他のものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「レポーター分子」は、タンパク質産物への参照によってプロモーターの決定を助長する分析的に同定可能なシグナルをその化学的性質で提供る分子を意味する。
【0199】
好ましくは、核酸構築物は植物細胞といった細胞のゲノム内に安定に取り込まれる。したがって、核酸は、分子がゲノム、好ましくはＴ−ＤＮＡ分子の右および左境界配列に取り込まれることを可能にする適切な成分を含み得、または、構築物は、細胞の染色体に組み込まれ得る適切なベクター内に配置される。
【0200】
発現本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換する、および、１つ以上の特定のポリヌクレオチド分子（複数可）の発現をもたらすことが可能なＤＮＡベクターである。本発明の好ましい発現ベクターは、酵母菌および／または植物細胞の遺伝子発現を指示できる。本発明に有益な発現ベクターには、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点といった調整配列および組み換え細胞に適合し、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調整配列が含まれる。特に、本発明に有益なポリヌクレオチドまたはベクターには、転写制御配列が含まれる。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーターおよびエンハンサー配列といった、転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本発明の組み換え細胞の少なくとも１つで機能し得る、いずれかの転写制御配列が含まれる。使用される調整配列の選択は、植物といった標的有機生物および／または対象の標的器官または組織による。そのような調整配列は、植物または植物ウイルスといった任意の真核生物から得られ得、または、化学的に合成され得る。そのような様々な転写制御配列が、当業者には公知である。特に好ましい転写制御配列は、植物またはその部分の使用によって、恒常的、または発生段階および／もしくは組織特異的のいずれかで植物の転写を指示することにおいて活性を有するプロモーターである。
【0201】
植物細胞の安定形質移入またはトランスジェニック植物の確立に適切な複数のベクターが、たとえば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８５，ｓｕｐｐ．１９８７；ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９；ならびにＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ、クルーヴァー・アカデミック・パブリッシャーズ社（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９０で説明されている。通常、植物発現ベクターには、たとえば、５’および３’調整配列の転写制御下の、１つ以上のクローニングされた植物遺伝子および優勢な選択マーカーが含まれる。そのような植物発現ベクターには、プロモーター調整領域（たとえば、誘導性もしくは恒常的、環境的もしくは発達的に調整される、または、細胞もしくは組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開始開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルも含まれ得る。
【0202】
植物細胞で活性を有する複数の恒常的プロモーターが説明されている。植物における恒常的発現に適切なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビ桿状型ウイルス（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ツユクサ黄色斑葉ウイルス（ｃｏｍｅｌｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ）、リブロース−１，５−ビス−リン酸カブロキシラーゼの小サブユニット由来の光誘導性プロモーター、イネ細胞質トリオースリン酸イソメラーゼ（ｒｉｃｅ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）プロモーター、アラビドプシスのアデニンホスホリポシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼプロモーターおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合プロモーターならびにクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【0203】
葉、種子、根または茎といった植物の供給源組織での発現のために、本発明で使用されるプロモーターはこれらの特定の組織で比較的高発現を有することが好ましい。この目的のために、組織または細胞特異的または強化性発現を伴う遺伝子のための複数のプロモーターから選択され得る。文献で報告されているそのようなプロモーターの例には、エンドウ由来の葉緑体グルタミンシンテターゼＧＳ２プロモーター、コムギ由来の葉緑体フルクトース−１，６−ビホスファターゼプロモーター、ジャガイモ由来の核光合成ＳＴ−ＬＳ１プロモーター、シロイヌナズナ由来のセリン／トレオニンキナーゼプロモーターおよびグルコアミラーゼ（ＣＨＳ）プロモーターが含まれる。リブロース−１，５−ビスリン酸カブロキシラーゼプロモーターおよびＣａｂプロモーターも、光合成的に活発である組織で活性を有すると報告されている。
【0204】
環境的、ホルモン的、化学的および／または発達的シグナルに反応して調節される様々な植物遺伝子プロモーターはまた、植物細胞での遺伝子発現のためにも使用され得、これには、（１）熱、（２）光（たとえば、エンドウＲｂｃＳ−３Ａプロモーター、トウモロコシＲｂｃＳプロモーター）；（３）アブシジン酸といったホルモン、（４）傷をつけること（たとえば、ＷｕｎＩ）；または（５）メチルジャスモン酸、サリチル酸、ステロイドホルモン、アルコール、Ｓａｆｅｎｅｒｓ（国際公開第９７／０６２６９号）といった化学物質によって調製されるプロモーターを含み、また（６）器官特異的プロモーターを利用するのも有益であり得る。
【0205】
本明細書で使用される「植物種子特異的プロモーター」またはその変化形は、他の植物組織と比較した際、植物の発育中の種子での遺伝子転写を優先的に指示するプロモーターを指す。ある実施形態では、種子特異的プロモーターは、植物の葉および／または茎と比べて、植物の発育中の種子で少なくとも５倍強大に発現され、好ましくは、他の植物組織と比較して発育中の種子の胚でより強大に発現される。好ましくは、プロモーターは発育中の種子の対象遺伝子の発現を指示するのみであり、および／または、葉といった植物の他の部分の対象遺伝子の発現はノーザンブロット分析および／またはＲＴ−ＰＣＲでは検知不可能である。通常プロモーターは、種子の成長および発育の間に、特に種子での貯蔵化合物の合成および蓄積の段階の間に、遺伝子の発現を促進する。そのようなプロモーターは植物貯蔵器官全体または種皮もしくは子葉（複数可）といったその一部分のみで遺伝子発現を促進し得、好ましくは、胚、双子葉類植物の種子または単子葉類植物の種子の胚乳もしくはアリューロン層で遺伝子発現を促進し得る。
【0206】
種子特異的発現のために好まれるプロモーターには、ｉ）デサチュラーゼおよびエロンガーゼといった、種子での脂肪酸生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプロモーター、ｉｉ）種子貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のプロモーター、およびｉｉｉ）種子での炭水化物生合成および蓄積に関わる酵素をコードする遺伝子のプロモーターが含まれる。適切な種子特異的プロモーターは、アブラナナピン遺伝子プロモーター（米国第５，６０８，１５２号）、ビキア・ファバ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）ＵＳＰプロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９１）、アラビドプシスオレオシンプロモーター（国際公開第９８／４５４６１号）、ファセオルス・ヴルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）ファゼオリンプロモーター（米国第５，５０４，２００号）、ブラシカＢｃｅ４プロモーター（国際公開第９１／１３９８０号）またはビキア・ファバ由来のレグミンＬｅＢ４プロモーター（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９２）およびトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、イネなどといった単子葉植物での種子特異的発現を導くプロモーターである。注目すべき、適切なプロモーターは、オオムギｌｐｔ２またはｌｐｔ１遺伝子プロモーター（国際公開第９５／１５３８９号および国際公開第９５／２３２３０号）または国際公開第９９／１６８９０号に記載されるプロモーター（オオムギホルデイン遺伝子、イネグルテリン遺伝子、イネオリジン遺伝子、イネプロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、トウモロコシゼイン遺伝子、カラスムギグルテリン遺伝子、ソルガムカシリン遺伝子、ライムギセカリン遺伝子のプロモーター）である。他のプロモーターには、Ｂｒｏｕｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｐｏｔｅｎｚａ ｅｔ ａｌ．（２００４）、米国第２００７０１９２９０２号および米国２００３０１５９１７３号によって説明されるものが含まれる。ある実施形態では、種子特異的プロモーターが、胚、子葉（複数可）または胚乳といった種子の定義した部分で優先的に発現される。そのような特異的プロモーターの例には、ＦＰ１プロモーター（Ｅｌｌｅｒｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．、１９９６）、エンドウレグミンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０００）、マメフィトヘマグルチニンプロモーター（Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０００）、アマ２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子のためのコンリニン１およびコンリニン２プロモーター（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．、２０１０）、シロイヌナズナ由来のＦＡＥ１遺伝子のプロモーター、セイヨウアブラナのグロブリン様タンパク質遺伝子のＢｎＧＬＰプロモーター、リヌム・ウシタティスシムム由来のペルオキシレドキシン遺伝子のＬＰＸＲプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。
【0207】
５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種性遺伝子配列を発現するよう選択されたプロモーター由来であり得、または、好ましくは生産される酵素のコード領域に関して異種性であり、および、所望される場合はｍＲＮＡの翻訳を増大するように特定的に改変され得る。導入遺伝子の発現を最適化するレビューに関しては、Ｋｏｚｉｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。５’非翻訳領域は、適切な真核生物遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）または合成遺伝子配列由来の植物ウイルスＲＮＡ（とりわけタバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシ萎縮モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）からも取得され得る。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列に付随する５’非翻訳配列由来である構築物には制限されない。リーダー配列は、無関係のプロモーターまたはコード配列由来でもあり得る。本発明の文脈で役立つリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（米国５，３６２，８６５号および米国５，８５９，３４７号）およびＴＭＶオメガ成分を含む。
【0208】
転写の終結は、対象のポリヌクレオチドにキメラベクター内で操作可能に結合した３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組み換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、アデニレートヌクレオチドのＲＮＡの３’末端への添加を引き起こすように植物で機能するポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞で発現される様々な遺伝子から取得され得る。一般的に、この能力において、ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウ小サブユニットＲｕｂｉｓｃｏ遺伝子の３’非翻訳領域、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子またはアマコンリニン遺伝子の３’非翻訳領域が使用される。アグロバクテリウム腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニレートシグナルを含む３’転写、非翻訳領域も適切である。
【0209】
組み換えＤＮＡ技術を用いて、たとえば宿主細胞内でのポリヌクレオチド分子のコピー数、これらポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として得られる転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することで、形質転換ポリヌクレオチド分子の発現を向上し得る。本明細書で定義されるポリヌクレオチド分子の発現を増大するのに役立つ組み換え技術には、ポリヌクレオチド分子の1つ以上の宿主細胞染色体への組み込み、ｍＲＮＡへの安定配列の添加、転写制御シグナル（たとえば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（たとえば、リボゾーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応するようにポリヌクレオチド分子を修飾すること、および転写物を不安定化する配列の欠失が含まれるが、これらに限定されない。
【0210】
組み換え細胞本発明はまた、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、キメラ遺伝子構築物または組み換えベクターといった1つ以上の組み換え分子で形質転換した宿主細胞である、組み換え細胞、好ましくは組み換え植物細胞も提供する。組み換え細胞は、２または３つの組み換えベクター、または組み換えベクターおよび1つ以上の追加ポリヌクレオチドもしくはキメラＤＮＡといった、その任意の組み合わせを含み得る。本発明の適切な細胞には、たとえば本明細書に記載されるポリペプチドまたは酵素をコードする分子といった、本発明のポリヌクレオチド、キメラＤＮＡまたは組み換えベクターで形質転換され得る任意の細胞が含まれる。細胞は好ましくは、それによってＬＣ−ＰＵＦＡを生産するために使用されることができる細胞である。組み換え細胞は培養中の細胞、インビトロの細胞であり得、または、たとえば植物といった有機生物内にあり得、もしくは、たとえば種子もしくは葉といった器官内にあり得る。好ましくは細胞は、植物または植物部分内にあり、さらに好ましくは植物の種子内にある。
【0211】
ポリヌクレオチド（複数可）が導入される宿主細胞は、非形質転換細胞または少なくとも１つの核酸分子ですでに形質転換された細胞のいずれかであり得る。そのような核酸分子は、ＬＣ−ＰＵＦＡ合成に関係し得、または無関係であり得る。本発明の宿主細胞は、本明細書で定義されるタンパク質を内因的に（すなわち、自然に）生産することができるか、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後にのみ、そのようなタンパク質を生産することができるかのいずれかであり得、前者の場合、そこから生じる組み換え細胞は、ポリペプチドを生産する強化した能力を有する。ある実施形態では、発明の組み換え細胞は、長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化した能力を有する。本明細書で使用される語句「長鎖多価不飽和脂肪酸を合成する強化された能力を伴う細胞」は、本発明の組み換え細胞を本発明のポリヌクレオチド（複数可）を欠如する宿主細胞と比較し、組み換え細胞が、天然の細胞よりも多くの長鎖多価不飽和脂肪酸脂肪酸を生産している、または、天然の細胞よりも大きい濃度のＤＨＡといったＬＣ−ＰＵＦＡ（他の脂肪酸と比べて）を生産している状態である、相対的な語句である。たとえば別の脂肪酸、脂質、デンプンといった炭水化物、ＲＮＡ分子、ポリペプチド、医薬品または他の生成物といった、別の生成物を合成する強化した能力を伴う細胞は、対応する意味を有する。
【0212】
本発明の宿主細胞は、本明細書に記載されるタンパク質を少なくとも１つ生産することのできる任意の細胞であり得、細菌、真菌（酵母菌を含む）、寄生虫、節足動物、動物および植物細胞を含み得る。細胞は原核生物または真核生物の細胞であり得る。好まれる宿主細胞は、酵母菌および植物細胞である。好ましい実施形態では、植物細胞は種子細胞であり、特に種子の子葉または胚乳内の細胞である。一実施形態では、細胞は動物細胞または藻細胞である。植物細胞は、たとえば非ヒト動物細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞といった任意の種類の動物の細胞であり得、または、魚類、甲殻類、無脊椎動物、昆虫などといった水生動物の細胞であり得る。細胞は発酵プロセスに適した有機生物の細胞であり得る。本明細書で使用される「発酵プロセス」という語句は、任意の発酵プロセスまたは発酵工程を含む任意のプロセスを指す。微生物の発酵の例としては、酵母菌といった真菌生物が含まれる。本明細書で使用される「酵母菌」には、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌種、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールベルゲンシス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）菌種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）菌種、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）菌種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）菌種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌種、リポミセス（ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）菌種、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｓｔａｒｋｅｙ）およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が含まれる。好ましい酵母菌には、サッカロマイセス菌種の株、およびとりわけ、サッカロマイセス・セレビシエが含まれる。
【0213】
トランスジェニック植物本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを１つ以上含むトランスジェニック植物といった、本発明の細胞を含む植物も提供する。本明細書で名詞として使用される「植物」という語句は、全体の植物を指すが、形容詞として使用される場合は、たとえば植物器官（たとえば、葉、茎、根、花）、単細胞（たとえば、花粉）、種子、植物細胞などといった、植物に存在する、植物から得られる、植物由来の、または植物に関係する任意の物質を指す。「植物部分」という語句は、その植物部分が本発明に従った脂質を合成する限り、たとえば葉または茎といった植物構造、根、花器官または構造、花粉、種子、胚、胚乳、胚盤または種皮といった種子部分、たとえば維管束組織といった組織、細胞および同植物の子孫を含む、植物ＤＮＡを含む全植物部分を指す。
【0214】
「トランスジェニック植物」「遺伝子改変植物」またはその変化形は、同一の種、変種または品種の野生型植物には見つからない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含む植物を指す。本発明の文脈で定義されるトランスジェニック植物には、所望する植物または植物器官に本明細書で定義する脂質または少なくとも１つのポリペプチドの生産を引き起こす組み換え技術を用いて遺伝子的に改変した植物およびそれらの子孫が含まれる。トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物部分は対応した意味を有する。本明細書で言及される「導入遺伝子」は、バイオテクノロジーの分野での通常の意味を有し、組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって生産した、または変化させた遺伝子配列、および、本発明の細胞、好ましくは植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子には、導入遺伝子が導入された植物細胞と同一の種、変種もしくは品種であり得る、もしくは、異なる種、変種もしくは品種であり得る植物由来の遺伝子配列、または、植物細胞以外の細胞由来の遺伝子配列が含まれ得る。一般的に、導入遺伝子は、たとえば形質転換といったヒトの操作によって植物といった細胞内に導入されるが、当業者が理解する通り、いかなる方法を用いてもよい。
【0215】
「種子」および「穀粒」は、本明細書で同じ意味で使用される。「穀粒」は、収穫された穀粒といった成熟穀粒または植物上にまだあるが収穫される準備ができている穀粒を指すが、文脈によっては吸水または発芽後の穀粒も指し得る。成熟した穀粒または種子は一般的に、約１８〜２０％未満の含水量を有する。本明細書で使用される「発育中の種子」は、通常受精または開花後の植物の生殖構造に見つかる成熟前の種子を指すが、植物から単離された、成熟前のそのような種子も指し得る。
【0216】
本明細書で使用される「植物部分を得る」または「種子を得る」という語句は、それぞれ植物部分または種子を得る任意の方法を指し、野外または温室もしくは成長室といった容器の植物から植物部分または種子を回収すること、または、植物部分または種子の供給元からの購入もしくは受け取りを含む。種子は、植え付けに適切であり得、すなわち、発芽して後代植物を生産でき、または、もう発芽できないように処理されており、たとえば、食物もしくは飼料の適用または本発明の脂質の抽出に役立つ、粉砕、研磨または製粉した種子である。
【0217】
本明細書で使用される「植物貯蔵器官」という語句は、たとえばタンパク質、炭水化物、脂肪酸および／または油の形態での貯蔵エネルギーに特化した植物の一部分を指す。植物貯蔵器官の例としては、種子、果実、塊根および塊茎が挙げられる。本発明の好ましい植物貯蔵器官は種子である。
【0218】
本明細書で使用される「表現型的に正常」という語句は、非改変植物または植物器官と比較した際に、著しく低下した成長および生殖能力を有さない、本発明の遺伝子改変植物または植物器官、特に種子、塊茎または果実といった貯蔵器官を指す。ある実施形態では、表現型的に正常な遺伝子改変植物または植物器官は、植物貯蔵器官特異的プロモーターに操作可能に結合したサイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドを含まない同質遺伝子植物または器官と実質的に同じである成長または生殖能力を有する。好ましくは、バイオマス、成長速度、発芽速度、貯蔵器官サイズ、種子サイズおよび／または生産される生存種子の数は、同一条件下で成長した前記外因性ポリヌクレオチドを有さない植物の９０％未満である。この語句は、野生型植物とは違い得るが、たとえば実生葉のバレリーナ表現型といった、商業上の目的のための植物の有用性をもたらさない植物の特色は包含しない。
【0219】
本発明の実践における使用によって提供される、または本発明の実践における使用が企図される植物には、単子葉類および双子葉類の双方が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の植物は、農作物（たとえば、穀類および豆類、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ、タピオカ、イネ、ソルガム、雑穀、キャッサバ、オオムギもしくはエンドウ）または他のマメ科植物である。植物を、食用根、塊茎、葉、茎、花または果実の生産のために成長させ得る。植物は、野菜または観賞植物であり得る。本発明の植物は：トウモロコシ（ゼア・メイズ）、キャノーラ（セイヨウアブラナ、ブラッシカ・ラパ種）、カラシナ（セイヨウカラシナ）、アマ（リヌム・ウシタティスシムム）、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、イネ（オリザ・サティバ）、ライムギ（セカレ・セレアレ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒａｌｅ））、ソルガム（ソルガム・ビカラー、ソルガム・ヴルガレ）、ヒマワリ（ヘリアンタス・アヌス）、コムギ（トリチウム・アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（グリシン・マックス）、タバコ（ニコチアナ・タバカム）、ジャガイモ（ソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポゲア）、ワタ（ゴシピウム・ヒルスツム）、サツマイモ（ロプモエア・バタツス（Ｌｏｐｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コフェア（Ｃｏｆｅａ）種）、ココナッツ（ココヤシ）、パイナップル（アナナ・コモスス（Ａｎａｎａ ｃｏｍｏｓｕｓ））、柑橘類樹木（シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（テオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、茶（カメリア・セネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｅｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（ムサ（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（ペルセア・アメリカナ）、イチジク（フィクス・カシカ（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グアバ（プシディウム・グアジャバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンギフェラ・インディカ（Ｍａｎｇｉｆｅｒ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オレア・エウロパエア）、パパイア（カリカ・パパヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、カシュー（アナカルジウム・オクシデンタレ）、マカダミア（マカダミア・インテルグリフォリア）、アーモンド（プルヌス・アミグダルス）、テンサイ（ベタ・ブルガリス（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、オートムギまたはオオムギであり得る。
【0220】
好ましい実施形態では、植物は被子植物である。
【0221】
ある実施形態では、植物は油料種子植物であり、好ましくは油料種子農作物である。本明細書で使用される「油料種子植物」は、植物の種子の油の商業的生産のために使用される植物種である。油料種子植物は、アブラナ（たとえばキャノーラ）、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ソルガム、アマ（アマニ）またはテンサイであり得る。さらに、油料種子植物は、他のブラシカ属、綿、ピーナッツ、ポピー、カラシナ、トウゴマ、ゴマ、ベニバナまたはナッツ生産植物であり得る。植物は、オリーブ、アブラヤシまたはココナッツといったその果実内で多量の油を生産する。本発明が適用され得る園芸植物は、レタス、エンダイブまたはキャベツ、ブロッコリーまたはカリフラワーを含むブラシカ属の野菜である。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、イチゴ、トマトまたコショウにも適用され得る。
【0222】
さらに好ましい実施形態では、本発明のトランスジェニック植物を生産するために使用される非トランスジェニック植物は、特に種子内に、ｉ）２０％未満、１０％未満または５％未満の１８：２脂肪酸および／またはｉｉ）１０％未満または５％未満の１８：３脂肪酸を有する油を生産する。
【0223】
好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、その子孫が所望する表現型に関して分離しないように、導入されたそれぞれおよび全ての遺伝子（導入遺伝子）に対してホモ接合である。トランスジェニック植物は、導入された導入遺伝子（複数可）に対してヘテロ接合でもあり得、好ましくは、たとえばハイブリッド種子から成長したＦ１種子において、導入遺伝子と均一にヘテロ接合であり得る。そのような植物は当該技術分野では良く知られる雑種強勢といった利点を提供し得る。
【0224】
関連がある場合、トランスジェニック植物は、限定しないが、Δ６デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ６エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、ω３デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、ＬＰＡＡＴ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよび／またはΔ１２デサチュラーゼといったＬＣ−ＰＵＦＡの生産に関わる酵素をコードする追加の導入遺伝子も含み得る。これらの活性を１つ以上伴うそのような酵素の例は、当該技術分野では知られており、本明細書に記載されるものが含まれる。特定の例では、トランスジェニック植物は；ａ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼおよびΔ６エロンガーゼ、
ｂ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼおよびΔ９エロンガーゼ、
ｃ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ６エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ、
ｄ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼおよびΔ１５デサチュラーゼ
ｅ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ６エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ、または、
ｆ）Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼおよびΔ１７デサチュラーゼ、をコードする外因性ポリヌクレオチドを少なくとも含む。
【0225】
ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ピシウム・イレグラレΔ６デサチュラーゼ、スラウストキトリドΔ５デサチュラーゼまたはエミリアナ・ハックスレイ（Ｅｍｉｌｉａｎａ ｈｕｘｌｅｙｉ）Δ５デサチュラーゼ、フィスコミトレラ・パテンスΔ６エロンガーゼ、スラウストキトリドΔ５エロンガーゼまたはオストレオコッカス・タウリ（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｔａｕｒｉ）Δ５エロンガーゼ、フィトフトラ・インフェスタンスω３デサチュラーゼまたはピシウム・イレグラレω３デサチュラーゼおよびスラウストキトリドΔ４デサチュラーゼである一連のポリペプチドをコードする。
【0226】
ある実施形態では、本発明の植物は、好ましくは少なくとも１，０００または１，０００，０００個の実質的に同じ植物群として野外で成長し、または、少なくとも１ヘクタールの面積内で成長する。植え付け密度は、植物種、植物変種、気候、土壌条件、肥料の割合および当該技術分野で知られる他の要因によって異なる。たとえば、キャノーラは通常１ヘクタールあたり１２０〜１５０万の植物の植え付け密度で成長する。植物は当該技術分野で知られる通りに収穫され、これには植物の一刈り、地干し刈りおよび／または刈り取り、次いで、植物材料を脱穀および／または吹き分けて、しばしばもみ殻の形態である植物部分の残りの部分から種子を分離することが含まれ得る。または、種子は野外で単一のプロセス、すなわちコンバイニングによって収穫され得る。
【0227】
植物の形質転換トランスジェニック植物を、Ａ．Ｓｌａｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、オックスフォード大学出版局（２００３）およびＰ．ＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＨ．Ｋｌｅｅ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー＆サンズ社（２００４）で広く説明されるものといった、当該技術では公知の技術を用いて生産できる。
【0228】
本明細書で使用される語句「安定に形質転換する」、「安定に形質転換した」という語句およびそれの変化形は、外因性核酸分子の存在を積極的に選択する必要なく、外因性核酸分子が細胞分裂の間に後代細胞へ移されるように、外因性核酸分子を細胞のゲノムに組み込むことを指す。安定的形質転換体またはその子孫は、染色体ＤＮＡ上のサザンブロットまたはゲノムＤＮＡのインサイツハイブリダイゼーションといった、当該技術分野では公知の任意の方法によって選択され得る。
【0229】
アングロバクテリウム媒介性導入は、植物細胞へ遺伝子を導入するのに広く適用可能なシステムであり、なぜなら、全体の植物組織もしくは植物器官または組織培養の外植片の細胞に、植物細胞ゲノムのＤＮＡの一過性発現または安定的組み込みのいずれかで、ＤＮＡを導入することができるからである。ＤＮＡを植物細胞に導入する、アグロバクテリウム媒介性植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野では良く知られており（たとえば、米国第５１７７０１０号、米国第５１０４３１０号、米国第５００４８６３号または米国第５１５９１３５号を参照）、ＤＮＡを植物細胞に導入できるアグロバクテリウムまたは他の細菌を用いたフローラルディップ方法が含まれる。導入されるＤＮＡの領域は境界配列によって定義され、介在ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）が通常植物ゲノムに挿入される。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組み込みは、ほとんど再配列をもたらさない比較的正確なプロセスである。アグロバクテリウム媒介性形質転換が効率的であるこれらの植物変種において、トランスジェニックの容易な、および、定義された性質のために、最善の方法である。好ましいアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウムでの複製が可能であり、説明される好都合な操作を可能にする（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ、ＨｏｈｎおよびＳｃｈｅｌｌ編集、シュプリンガー・フェアラーク社（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク、ｐｐ．１７９−２０３（１９８５）。
【0230】
使用され得る加速方法には、たとえば、微粒子銃などが含まれる。植物細胞に形質転換する核酸分子を送達するための方法の一例が、微粒子銃である。この方法は、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、オックスフォード大学出版局、英国、オックスフォード（１９９４）によって評論されている。核酸で覆われ、推進力によって細胞内に送達され得る非生物粒子（微粒子）である。例示的な粒子には、タングステン、金、プラチナなどから成るものが含まれる。微粒子銃の特徴的な利点は、それが再現可能的に単子葉類を形質転換する効果的な方法であることに加え、プロトプラストの単離またはアグロバクテリウム感染の感受性のいずれも必要でないことである。
【0231】
別の代替実施形態では、プラスチドは安定に形質転換され得る。より高等の植物におけるプラスチド形質転換に関して開示される方法には、選択マーカーを含むＤＮＡのパーティクル・ガン・デリバリーおよび相同組み換えを通してＤＮＡをプラスミドゲノムに標的すること（米国第５，４５１，５１３号、米国第５，５４５，８１８号、米国第５，８７７，４０２号、米国第５，９３２４７９号および国際公開第９９／０５２６５号）が含まれる。
【0232】
細胞形質転換の他の方法も用い得、これらには、花粉への直接ＤＮＡ導入、植物の生殖器官へのＤＮＡの直接注入、または、未成熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入に続く乾燥した胚の再水和による、ＤＮＡの植物への導入が含まれるがこれらに限定はされない。
【0233】
単一の植物プロトプラスト形質転換体または様々な形質転換外植片からの植物の再生、発育および栽培は当該技術分野では良く知られている（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック・プレス社、カリフォルニア、サンディエゴ（１９８８）。この再生および成長プロセスには通常、これらの個別化した細胞を、根付いた小植物の段階の一般的な胚発育の段階を通して培養し、形質転換細胞を選択する工程が含まれる。トランスジェニック胚および種子は同様に再生される。その後、得られる根付いたトランスジェニック芽を、土壌といった適切な植物成長培地に播く。
【0234】
外来性、外因性遺伝子を含む植物の発育または再生は当該技術分野で良く知られている。好ましくは、再生される植物は自家受粉してホモ接合トランスジェニック植物を提供する。そうでなければ、再生した植物から得られる花粉を、作物栽培学的に重要な系統の、種子から成長した植物に交雑させる。逆に、これらの重要な系統の植物の花粉を用いて、再生植物を受粉させる。当業者には良く知られている方法を用いて、所望する外因性核酸を含む本発明の導入遺伝子植物を栽培する。
【0235】
トランスジェニック細胞および植物の導入遺伝子の存在を確認するために、当業者には公知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を実施し得る。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質によって様々な方法のいずれかで検知され得、ウェスタンブロットおよび酵素アッセイを含む。トランスジェニック植物が一度得られたら、それらは成長して所望する表現型を有する植物組織または部分を生産し得る。植物組織または植物部分を、収穫および／または種子を回収し得る。種子は、所望する特徴を有する組織または部分を有する追加の植物を成長させるための供給源として役立ち得る。
【0236】
アグロバクテリウムまたは他の形質転換方法を用いて形成したトランスジェニック植物は通常、１つの染色体上に単一遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物を、添加した遺伝子（複数可）に対してヘミ接合であると呼び得る。さらに好ましいのは、添加した遺伝子（複数可）に対してホモ接合であるトランスジェニック植物であり；すなわち、染色体ペアの各染色体上の同一座に１つの遺伝子である、２つの添加遺伝子を含むトランスジェニック植物である。ホモ接合トランスジェニック植物は、ヘミ接合トランスジェニック植物を自家受精させ、生産された種子のいくつかを発芽させ、得られた植物を対象遺伝子に関して分析することで、得ることができる。
【0237】
独立して分離する２つの外因性遺伝子または座を含む、２つの異なるトランスジェニック植物も交雑（交配）して双方の遺伝子または座のセットを含む子孫を生産し得るということも理解される。適切なＦ１子孫の自家受粉は、双方の外来性遺伝子または座に対してホモ接合な植物を生産し得る。親植物とのもどし交雑および非トランスジェニック植物との外交配も、栄養繁殖と同様に、企図される。異なる特質および作物に一般的に使用される他の交雑方法の記述がＦｅｈｒ、Ｉｎ：Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｗｉｌｃｏｘ Ｊ．編集、米国農学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ）、ウィスコンシン、マディソン（１９８７）に見られる。
【0238】
外因性ＲＮＡ量および安定発現の強化サイレンシング抑制因子
ある実施形態では、本発明の細胞、植物または植物部分は、サイレンシング抑制因子タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
【0239】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、細胞およびウイルスｍＲＮＡの双方を分解のためにターゲットし得る、ヌクレオチド配列特異的防御メカニズムである。ＰＴＧＳは、外来性（異種性）または内因性ＤＮＡで安定にまたは一過性に形質転換した植物または真菌で起こり、導入した核酸との配列相同性を有するＲＮＡ分子の蓄積の低下につながる。
【0240】
サイレンシング抑制因子と対象の導入遺伝子との同時発現が、導入遺伝子から転写された細胞内に存在するＲＮＡの量を増大することが広く企図されている。このことがインビトロの細胞に関して正しいと証明されている一方で、多くの全植物同時発現実験では顕著な副作用が観察されている。さらに具体的には、Ｍａｌｌｏｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｄｕｎｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００４）、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｌｅｗｓｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００７）およびＭｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）が説明する通り、サイレンシング抑制因子を発現する植物は、一般的に恒常的プロモーター下では、それらが商業上の生産には有効ではない程度まで、しばしば表現型的に異常である。
【0241】
最近、植物またはその部分の種子へのサイレンシング抑制因子の発現を制限することで、ＲＮＡ分子量が増大し得、および／またはＲＮＡ分子量が多くの世代にわたって安定化し得ることが発見されている（国際公開第２０１０／０５７２４６号）。本明細書で使用される「サイレンシング抑制因子タンパク質」、つまりＳＳＰは、特に初めに形質転換した植物から繰り返された世代にわたって、植物細胞の異なる導入遺伝子からの発現産物の量を強化する植物細胞で発現され得る任意のポリペプチドである。ある実施形態では、ＳＳＰはウイルス性サイレンシング抑制因子またはその変異体である。多くの数のウイルス性サイレンシング抑制因子が当該技術分野で知られており、Ｐ１９、Ｖ２、Ｐ３８、Ｐｅ−ＰｏおよびＲＰＶ−Ｐ０を含むがこれらに限定しない。ある実施形態では、ウイルス性サイレンシング抑制因子は、配列番号５３から５７のいずれか１つで提供される配列、その生物学的に活性な断片、または、配列番号５３から５７のうち１つ以上に少なくとも５０％相同であり、サイレンシング抑制因子としての活性を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸を含む。
【0242】
本明細書で使用される「発現を安定する」、「安定に発現された」「安定な発現」およびそれらの変化形は、繰り返される世代、たとえば少なくとも３、少なくとも５または少なくとも１０の世代にわたって、サイレンシング抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを欠如する同質遺伝子植物と比較した際に、ＲＮＡ分子の量が後代植物において実質的に同じまたはより高いことを指す。しかし、この語句（複数可）は、繰り返される世代にわたって、以前の世代と比較してＲＮＡ分子量の多少の損失、たとえば１世代あたり少なくとも１０％の損失がある可能性を排除しない。
【0243】
抑制因子は任意の供給源から選択され得る、たとえば、植物、ウイルス、哺乳動物などである。抑制因子が得られるウイルスおよびそれぞれの特定ウイルスからの抑制因子に関するタンパク質（たとえばＢ２、Ｐ１４など）またはコード領域指定の一覧表に関しては国際公開第２０１０／０５７２４６号を参照されたい。抑制因子の複数のコピーが使用され得る。異なる抑制因子が一緒に使用され得る（たとえば、タンデムで）。
【0244】
ＲＮＡ分子植物種子に発現されることが望ましいＲＮＡ分子は実質的にどれもサイレンシング抑制因子と同時発現され得る。コードされたポリペプチドは、油、デンプン、炭水化物、栄養素などの代謝に関連し得、または、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、ろう、油、デンプン、砂糖、炭水化物、風味、匂い、毒素、カロテノイド、ホルモン、ポリマー、フラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、アルカロイド、リグニン、タンニン酸、セルロース、糖タンパク質、糖脂質などの合成、好ましくはＴＡＧの生合成または構築に関与し得る。
【0245】
特定の実施例では、作製した植物は、たとえば、キャノーラまたはヒマワリであるブラシカ属、ベニバナ、アマ、綿、ダイズ、カメリナまたはトウモロコシといった植物での油生産のための酵素の量を増大した。
【0246】
生産されるＬＣ−ＰＵＦＡの量組み換え細胞または種子といった植物部分で生産されるＬＣ−ＰＵＦＡまたはＬＣ−ＰＵＦＡ（複数）の組み合わせの量は重要である。量は、特定のＬＣ−ＰＵＦＡ、または、たとえば、ω３ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはω６ＬＣ−ＰＵＦＡもしくはＶＬＣ−ＰＵＦＡといった関連ＬＣ−ＰＵＦＡのグループ、または、当該技術分野で知られる方法によって決定され得る他のものである脂肪酸の合計の組成（パーセントで）として表され得る。量は、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量としても表され得、たとえば、組み換え細胞を含む材料の乾燥重量におけるＬＣ−ＰＵＦＡのパーセンテージ、たとえば、ＬＣ−ＰＵＦＡである種子の重量のパーセンテージである。油料種子で生産されるＬＣ−ＰＵＦＡは、ＬＣ−ＰＵＦＡ含有量の面で見れば、油生産のためには育てられない野菜または穀物においてよりも著しく高い可能性があることがわかるが、双方は類似したＬＣ−ＰＵＦＡ組成を有し得、双方はヒトまたは動物の消費のためのＬＣ−ＰＵＦＡの供給源として使用され得る。
【0247】
ＬＣ−ＰＵＦＡ量は当該技術分野で知られる任意の方法で測定され得る。好ましい方法では、総脂質を細胞、組織または有機生物から抽出し、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による分析の前に脂肪酸をメチルエステルに変換する。そのような技術は実施例１にて説明される。クロマトグラムでのピーク位置を使用して、それぞれの特定の脂肪酸を同定し得、各ピーク下の面積を積分して量を測定する。別で指示されない限り、本明細書で使用される、試料中の特定の脂肪酸のパーセンテージは、クロマトグラムでの脂肪酸の合計面積のパーセンテージとして、その脂肪酸のピーク下の面積として決定される。これは、実質的に重量パーセンテージ（ｗ／ｗ）に対応する。脂肪酸の同一性をＧＣ−ＭＳで確認し得る。総脂肪酸を、当該技術分野で知られる技術で分離し、ＴＡＧ分画といった分画を精製し得る。たとえば、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を分析的規模で実施し、特にＴＡＧの脂肪酸組成を決定するために、ＤＡＧ、アシル−ＣｏＡまたはリン脂質といった他の脂質分画からＴＡＧを分離し得る。
【0248】
一実施形態では、抽出した脂質の脂肪酸のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計量は、細胞の総脂肪酸の約７％と約２５％との間である。さらなる実施形態では、細胞の総脂肪酸は、１%未満のＣ２０：１を有する。好ましい実施形態では、細胞の抽出可能ＴＡＧは、本明細書で言及される量で脂肪酸を含む。本明細書に記載される脂質を定義する特色の可能な組み合わせもそれぞれ包含される。
【0249】
組み換え細胞、植物または種子といった植物部分でのＬＣ−ＰＵＦＡの生産量は、本明細書で「転換効率」または「酵素的効率」とも呼ばれる、特定の基質脂肪酸から１つ以上の産物脂肪酸への転換パーセンテージとしても表され得る。このパラメーターは、細胞、植物、植物部分または種子から抽出される脂質における脂肪酸組成に基づいており、すなわち、１つ以上の基質脂肪酸（それから生じる他の脂肪酸全てを含む）として形成されたＬＣ−ＰＵＦＡ（それから生じる他のＬＣ−ＰＵＦＡを含む）の量である。転換パーセンテージの一般式は：１００×（産物ＬＣ−ＰＵＦＡをおよびそれから生じる全ての産物のパーセンテージの合計）／（基質脂肪酸およびそれから生じる全ての産物のパーセンテージの合計）である。たとえばＤＨＡに関しては、これはＤＨＡの量（脂質の総脂肪酸含有量におけるパーセンテージとして）の、基質脂肪酸（たとえば、ＯＡ、ＬＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴＡまたはＥＰＡ）およびその基質から生じたＤＨＡ以外の全ての産物の量に対する比として表され得る。転換パーセンテージまたは転換の効率は、経路での単一の酵素的工程、または、経路の一部分もしくは全体に関して表され得る。
【0250】
特定の転換効率が、次の式に従って本明細書で算出される：１．ＯＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
２．ＬＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（ ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
３．ＡＬＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／ ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
４．ＥＰＡからＤＨＡ＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
５．ＤＰＡからＤＨＡ（Δ４デサチュラーゼ効率）＝１００×（％ＤＨＡ）／（ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
６．Δ１２デサチュラーゼ効率＝１００×（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
７．ω３デサチュラーゼ効率＝１００×（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
８．ＯＡからＡＬＡ＝１００×（ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＯＡ、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＤＡ、ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
９．Δ６デサチュラーゼ効率（ω３基質ＡＬＡ上）＝１００×（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（％ＡＬＡ、ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ）。
１０．Δ６エロンガーゼ効率（ω３基質ＳＤＡ上）＝１００×（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
１１．Δ５デサチュラーゼ効率（ω３基質ＥＴＡ上）＝１００×（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
１２．Δ５エロンガーゼ効率（ω３基質ＥＰＡ上）＝１００×（ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）／（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計％）。
【0251】
本発明の脂質、好ましくは種子油の脂肪酸組成を、総ω６脂肪酸：総ω３脂肪酸または新ω６脂肪酸：新ω３脂肪酸のいずれかに関する、総脂肪酸含有量のω６脂肪酸：ω３脂肪酸の比によっても特徴づける。総ω６脂肪酸、総ω３脂肪酸、新ω６脂肪酸および新ω３脂肪酸という語句は、本明細書で定義される意味を有する。本明細書で例証する方法で、細胞、植物、植物部分または種子から抽出された脂質での脂肪酸組成から比を算出する。脂質においてω６脂肪酸よりもω３脂肪酸の量を多く有することが望まれ、したがって、１．０未満のω６：ω３比が好まれる。０．０の比は、定義されるω６脂肪酸の完全な不在を示し；０．０３の比が実施例６に記載される通り、達成された。そのような低い比は、ω３デサチュラーゼ、特に、本明細書で例示されるピキア・パストリスω３デサチュラーゼといった真菌ω３デサチュラーゼと、ω３基質に好みを示すΔ６デサチュラーゼとの併合使用を通して達成され得る。
【0252】
種子の重量あたりのＬＣ−ＰＵＦＡの収率も、種子中の総油含有量および油中の％ＤＨＡに基づいて算出され得る。たとえば、キャノーラ種子の油含有量が約４０％（ｗ／ｗ）で、油の総脂肪酸含有量の約１２％がＤＨＡである場合、種子のＤＨＡ含有量は、約４．８％または種子１グラムあたり約４８ｍｇである。実施例２で説明する通り、約９％のＤＨＡを有し、キャノーラよりも低い油含有量を有するアラビドプシス種子のＤＨＡ含有量は、１ｇ種子あたり約２５ｍｇであった。約７％のＤＨＡ含有量では、キャノーラ種子またはカメリナ・サティバ種子は種子１グラムあたり約２８ｍｇのＤＨＡ含有量を有する。したがって、本発明は１グラム種子あたり約２８ｍｇのＤＨＡを少なくとも含む、セイヨウアブラナ、セイヨウカラシナおよびカメリナ・サティバ植物ならびにそれらから得られる種子を提供する。種子は、ドライダウンした後の収穫した成熟種子の標準通りの含水量を有する（４〜１５％水分）。本発明はまた、種子を得ることおよびその種子から油を抽出することを含む、油を得るためのプロセス、ならびに、その油の使用、ならびに、本発明に従う植物から種子を収穫することを含む、種子を得る方法も提供する。
【0253】
１ヘクタールあたりに生産されるＤＨＡ量も、１ヘクタールあたりの種子収率が分かっていれば、算出可能であり、または、推定可能である。たとえば、オーストラリアのキャノーラは通常、１ヘクタールあたり約２．５トンの種子をもたらし、これは、４０％の油含有量では約１０００ｋｇの油をもたらす。総油中１２％のＤＨＡでは、これは、１ヘクタールあたり約１２０ｋｇのＤＨＡを提供する。油含有量が５０％減った場合でも、１ヘクタールあたり約６０ｋｇのＤＨＡを提供する。
【0254】
現在までの証拠によって、酵母菌または植物に異種性で発現されるいくつかのデサチュラーゼは、いくつかのエロンガーゼとの組み合わせで比較的低い活性を有することが提唱されている。ＬＣ−ＰＵＦＡ合成における基質として脂肪酸のアシル−ＣｏＡ形態を使用する能力を有するデサチュラーゼを提供することで、これを緩和し得、これは、組み換え細胞、特に植物細胞で、好都合であると考えられる。効率的なＤＨＡ合成に特に好都合な組み合わせは、たとえばピキア・パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１２）といった真菌ω３デサチュラーゼと、たとえば、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１３）または少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有するその変異形といった、ω３アシル基質に対して好みを有するΔ６デサチュラーゼとの組み合わせである。
【0255】
本明細書で使用される「実質的に含まない」という語句は、その組成物が（たとえば脂質または油）が、定義される成分をほとんど（たとえば、約０．５％未満、約０．２５％未満、約０．１％未満もしくは約０．０１％未満）または一切含まないことを意味する。ある実施形態では、「実質的に含まない」は、その成分が、通例の分析的技術を用いて検知不能であること意味し、たとえば、特定の脂肪酸（ω６ドコサペンタエン酸といった）は実施例１で説明されるガスクロマトグラフィーを用いて検知され得ない。
【0256】
油の生産当該技術分野で日常的に実施される技術を用いて、本発明の細胞、植物、種子などによって生産される油を抽出、プロセスおよび分析し得る。通常、植物種子を、調理、プレスおよび抽出して、粗油を生産し、これを次いで、脱ガム、精製、脱色、脱臭する。一般的に、種子を粉砕する技術は当該技術分野では公知である。たとえば、油料種子に水をスプレーして含水量をたとえば８．５％まで上げることで油料種子を和らげ得、隙間設定が０．２３から０．２７ｍｍの滑らかなローラーを用いてフレーク状にし得る。種子の種類によっては、粉砕前に水を加えない可能性がある。熱の適用は酵素を非活性化させ、細胞破裂を助長し、油の液滴を合体させ、タンパク質粒子を凝集し、これらはすべて抽出プロセスを助長する。
【0257】
ある実施形態では、種子油の大部分は、スクリュープレスを経る経路によって放出される。スクリュープレスから排除されたケイクを次いで、たとえばヘキサンと一緒に、熱トレーシングカラムを用いて溶媒抽出する。または、プレス操作によって生産された粗油を、溝付きのワイヤー排水蓋を有する沈殿タンクを通過させ、プレス操作の間に油と一緒に現れた固体を除き得る。精製油をプレートおよびフレームフィルターを通過させて、いずれの残存している固体微粒子を除去し得る。望ましい場合は、抽出プロセスから回収される油を精製油と一緒にまとめて、混合粗油を生産し得る。
【0258】
溶媒を一度粗油から取り除くと、プレスおよび抽出した部分をまとめ、通常の油プロセシング手順に供する。本明細書で使用される「精製」という語句は、本発明の脂質または油との関連で使用される際は、抽出した脂質または油が、脂質／油成分の純度を高める１つ以上のプロセシング工程に供せられることを通常意味する。たとえば精製工程には、抽出した油を：脱ガム、脱臭、脱色、乾燥および／または分画化することから成る群のうち１つ以上または全てが含まれ得る。しかし、本明細書で使用される「精製」という語句には、総脂肪酸含有量のパーセンテージとしてのＤＨＡ含有量を増大するための、エステル交換反応プロセスまたは本発明の脂質または油の脂肪酸組成を変化する他のプロセスは含まれない。つまり、精製脂質または油の脂肪酸組成は、実質的に非精製脂質または油の脂肪酸組成と実質的に同じである。
【0259】
脱ガム脱ガムは、油の精製において初期の工程であり、その第１の目的は抽出した総脂質のうちおよそ１〜２％で存在し得るリン脂質の大部分を油から取り除くことである。通常リン酸を含む約２％の水を７０〜８０℃で粗油に添加すると、微量金属および色素を伴う、大部分のリン脂質の分離につながる。取り除かれた難溶性物質は、主にリン脂質およびトリアシルグリセロールの混合物であり、レシチンとしても知られる。濃縮したリン酸を粗種子油に添加することで脱ガムを実施し、非水和性ホスファチドを水和性形態に変換し得、および、存在する少量の金属をキレート化し得る。遠心分離によって、ガムを種子油から分離する。
【0260】
アルカリ精製アルカリ精製は、粗油を処理するための精製プロセスの１つであり、時折中和とも呼ばれる。アルカリ精製は、通常脱ガムに続き、脱色の前に行われる。脱ガムに続いて、種子油を十分な量のアルカリ溶液の添加によって処理し、全ての脂肪酸およびリン酸を滴定し、こうして形成されたセッケンを取り除く。適切なアルカリ性材料には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび水酸化アンモニアが含まれる。このプロセスは通常室温で実行され、遊離脂肪酸分画を取り除く。セッケンを遠心分離またはセッケンのための溶媒への抽出によって取り除いて、中和した油を水で洗う。必要であれば、油中の任意の余分なアルカリを、塩酸または硫酸といった適切な酸で中和し得る。
【0261】
脱色脱色は、窒素もしくは蒸気と、または、真空で作用させることで、漂白土（０．２〜２．０％）の存在下および酸素の不在下で、油を９０〜１２０℃で１０〜３０分間加熱する精製プロセスである。油プロセシングにおけるこの工程は、所望しない色素（カロテノイド、クロロフィル、ゴシポールなど）を取り除くように設計され、該プロセスはまた、酸化産物、微量金属、硫黄化合物および微量のセッケンも取り除く。
【0262】
脱臭脱臭は、高温度（２００〜２６０℃）および低圧（０．１〜１ｍｍＨｇ）での油および脂肪の処理である。これは通常、蒸気を、種子油１００ｍｌあたり、約０．１ｍｌ／分の速度で種子油に導入することで達成される。３０分のスパージング後、種子油を真空下で放冷する。通常、種子油をガラス容器に移し、冷蔵下で保管する前に、アルゴンで洗い流す。この処理によって、種子油の色が改善され、任意の残存している遊離脂肪酸、モノアシルグリセロールおよび酸化産物を含む、揮発性物質または臭気化合物の大部分が取り除かれる。
【0263】
脱ろう脱ろうは、周囲以下の温度での結晶化によって、油および脂肪を固体（ステアリン）および液体（オレイン）分画に分離するために、油の商業上の生産において時折使用されるプロセスである。これは本来、固体フリー生成物を生産するために綿実油に適用された。通常は油の飽和脂肪酸含有量を低下するために使用される。
【0264】
エステル交換反応エステル交換反応は、初めに脂肪酸をＴＡＧから自由脂肪酸または脂肪酸エステルのいずれか、通常は脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルとして放出することで、脂肪酸をＴＡＧ内または間で交換する、または、その脂肪酸を別のアルコールに移してエステルを形成するプロセスである。分画化プロセスと組み合わせる場合、エステル交換反応を用いて脂質の脂肪酸組成を改変し得る（Ｍａｒａｎｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。セステル交換は、化学的（たとえば、強酸または塩基触媒性）または酵素的方法のいずれかを用い得、後者はＴＡＧ上の脂肪酸に関して位置特異的（ｓｎ−１／３またはｓｎ−２特異的）であり得るリパーゼを用い、または、他よりもいくつかの脂肪酸に対して好みを有する（Ｓｐｅｒａｎｚａ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。油中のＬＣ−ＰＵＦＡの濃度を増大するための脂肪酸分画化は、たとえば、冷凍結晶化、尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出および銀イオン錯体形成といった、当該技術で公知の方法のいずれかによって達成され得る。尿素との複合体結成はその油中の飽和および一価不飽和脂肪酸の量を減らす際の単純性および効率性のために好ましい方法である（Ｇａｍｅｚ ｅｔ ａｌ．、２００３）。始めに、酸または塩基触媒性反応条件下での加水分解によって、油のＴＡＧを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分け、それによって、過剰なアルコールが用いられ、形成されたアルキルエステルおよび、さらに形成されたグリセロールの分離を可能にする、１ｍｏｌのＴＡＧが少なくとも３ｍｏｌのアルコール（たとえば、エチルエステルにはエタノール、メチルエステルにはメタノール）と反応し、または、リパーゼによって、油のＴＡＧを、しばしば脂肪酸エステルの形態であるそれらを構成する脂肪酸に分ける。その処理によって脂肪酸組成が通常は改変した、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを次いで、複合体形成のための尿素のエタノール溶液と混合する。飽和および一価不飽和脂肪酸は容易に尿素と複合体形成し、冷却の際に結晶化し、続いて濾過によって取り除かれ得る。非尿素と複合した分画はこうしてＬＣ−ＰＵＦＡに富んでいる。
【0265】
家畜飼料本発明には、家畜飼料として使用され得る組成物を含む。本発明のために、「家畜飼料」には、体内に取り込まれた際に（ａ）組織に栄養分を与え、もしくは組織を築く、またはエネルギーを供給するために役立つ；および／または（ｂ）十分な栄養状態または代謝機能を維持、再建または支持する、ヒトまたは動物の消費のための任意の食物または調製物が含まれる。本発明の家畜飼料には、たとえば、本発明の調製粉乳および種子ミールといった、乳児および／または小さな子供にとって栄養のある組成物が含まれる。
【0266】
本発明の家畜飼料は、たとえば、本発明の細胞、本発明の植物、本発明の植物部分、本発明の種子、本発明の抽出物、本発明の方法の生成物、本発明の発酵プロセスの産物、または適切な担体（複数可）を伴う組成物を含む。「担体」という語句は、その広義で使用され、栄養価を含み得るまたは含み得ない任意の成分を包含する。当業者には理解される通り、担体は、家畜飼料を消費する有機生物に有害な影響を有さないような、家畜飼料での使用に適している（または十分低い濃度で使用される）必要がある。
【0267】
本発明の家畜飼料は、本明細書で開示される方法、細胞または植物の使用で直接もしくは間接的に生産される油、脂肪酸エステルもしくは脂肪酸を含む。組成物は、固体または液体の形態のいずれかであり得る。さらに、組成物には、食用多量養素、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよび／またはミネラルが、特定の使用に望ましい量で含まれ得る。これら成分の量は、組成物が、正常な個体への使用を意図されているのか、または代謝疾患などを患う個体など、特化したニーズを有する個体への使用を意図されているのかによって、異なるであろう。
【0268】
栄養価を伴う適切な担体の例には、食用脂、炭水化物およびタンパク質といった多量養素が含まれるが、これらに限定されない。そのような食用脂の例には、ココナッツ油、ルリジサ油、真菌油、黒潮（ｂｌａｃｋ ｃｕｒｒｅｎｔ）油、ダイズ油ならびにモノおよびジグリセリドが含まれるが、これらに限定されない。そのような炭水化物の例には：グルコース、食用ラクトースおよび加水分解デンプンが含まれる（がこれらに限定されない）。さらに、本発明の栄養組成物で使用され得るタンパク質の例には、ダイズタンパク質、電気透析乳漿、電気透析脱脂乳、牛乳の乳漿またはこれらタンパク質の加水分解物が含まれる（が、これらに限定されない）。
【0269】
ビタミンおよびミネラルに関しては、次に挙げるものが本発明の家畜飼料組成物に添加され得る：カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素およびビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ群。他のそのようなビタミンおよびミネラルも添加され得る。
【0270】
本発明の家畜飼料組成物で使用される成分は、半精製または精製由来であり得る。半精製または精製とは、天然材料の精製または新規合成によって調製された物質を指す。
【0271】
また、本発明の家畜飼料組成を、食事の補充が必要でない場合でも、食物に添加してもよい。たとえば、組成物をいかなる種類の植物にも添加してよく、それには：マーガリン、改変バター、チーズ、牛乳、ヨーグルト、チョコレート、キャンディ、スナック食品、サラダ油、調理油、調理脂、肉、魚および飲み物が含まれる（がこれらに限定されない）。
【0272】
サッカロマイセス属の種は、ビールの醸造およびワイン作りの双方で使用され、また、特にパンを焼く際に作用剤としても使用される。たとえばヤロウイア種を含む油性酵母菌といった他の酵母菌もＬＣ−ＰＵＦＡ生産に役立つ。酵母菌は、養殖漁業といった動物試料での添加剤としても使用され得る。本明細書で説明されるようにＬＣ−ＰＵＦＡを合成するよう適合された、遺伝子操作した酵母菌株が提供され得ることは明らかになるであろう。これら酵母菌株またはそれらで生産されるＬＣ−ＰＵＦＡを、次いで、食料品ならびにワインおよびビール作りで使用し、強化した脂肪酸含有量を有する製品を提供し得る。
【0273】
さらに、本発明に従って生産された脂肪酸または形質転換して対象遺伝子を含むおよび発現する宿主細胞を、動物の栄養補助食品としても使用し、動物の組織、卵または牛乳の脂肪酸組成を、ヒトまたは動物の消費により望ましいものに変え得る。そのような動物の例には、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリといった家禽類などが含まれる。
【0274】
さらに、本発明の家畜飼料を養殖漁業で用いて、ヒトまたは動物の消費用の、魚、または、たとえばエビといった甲殻類の脂肪酸量を増大し得る。好ましい魚はサケである。
【0275】
本発明の好ましい家畜飼料は、ヒトまたは他の動物用の食物または試料として直接使用され得る、植物、種子ならびに葉および茎といった他の植物部分である。たとえば、動物は野外で成長したそのような植物を直接食べ得、または、制御した餌やりの中で測定された量を与えられ得る。本発明には、そのような植物および植物部分を、ヒトおよび他の動物のＬＣ−ＰＵＦＡ量を増大するための摂食としての使用が含まれる。
【0276】
組成物また、本発明には、本発明の方法を用いて生産される１つ以上の脂肪酸および／または結果として得られる油を含む組成物、具体的には医薬組成物も包含される。
【0277】
医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水、水、エタノール、ポリオール、植物油、湿潤剤または水／油乳濁液といった乳濁液のような、標準的で、良く知られる、非毒性の薬剤的に許容される担体、補助剤または媒体と組み合わせた、１つ以上の脂肪酸および／または油を含み得る。組成物は液体または固体のいずれかの形態であり得る。たとえば、組成物は、錠剤、カプセル、経口摂取可能液体または粉末、注射可能または局所軟膏またはクリームの形態であり得る。たとえば、分散液の場合は必要な粒径の維持、および、界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。たとえば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことも望まれ得る。そのような不活性希釈剤に加え、組成物はまた、湿潤剤、乳濁および懸濁剤、甘味料、風味料および芳香剤といった補助剤も含み得る。
【0278】
懸濁物は、活性化合物に加え、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、ならびにトラガントまたはこれら物質の混合物といった懸濁剤を含み得る。
【0279】
当該技術分野では良く知られている技術を用いて、錠剤およびカプセルといった固体剤形を調製し得る。たとえば、本発明にしたがって生産した脂肪酸を、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンといった結合剤、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸といった崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤と組み合わせて、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチといった従来の錠剤ベースで錠剤化し得る。これら賦形剤を抗酸化剤および関連脂肪酸と一緒にゼラチンカプセルに組み込むことで、カプセルを調製し得る。
【0280】
静脈内投与に関して、本発明従って生産された脂肪酸またはその誘導体を、市販製剤に組み込んでもよい。
【0281】
特定の脂肪酸の一般的な投与量は、０．１ｍｇから２０ｇを、１日あたり１から５回の摂取（１日最大１００ｇまで）であり、好ましくは、１日約１０ｍｇから約１、２、５または１０ｇの範囲である（１または複数の服用）。当該技術分野で知られる通り、最小限である、約３００ｍｇ／日の脂肪酸、特にＬＣ−ＰＵＦＡ、が望ましい。しかし、任意の量の脂肪酸も対象には有益であることが理解されるであろう。
【0282】
本発明の医薬組成物の可能性のある投与経路には、たとえば、経腸（たとえば経口および経直腸）および非経口が含まれる。たとえば、液体調製物は経口または経直腸投与され得る。さらに、均質な混合物を水に完全に分散させ、生理学的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝剤または噴霧剤と滅菌条件下で混合し、スプレーまたは吸入剤を形成し得る。
【0283】
患者に投与される組成物の投与量は、当業者の一人によって決定され得、患者の体重、患者の年齢、患者の全体的な健康状態、患者の過去の経歴、患者の免疫状態などといった様々な要因次第である。
【0284】
さらに、本発明の組成物を美容上の目的で使用し得る。混合物が形成されるように本発明の組成物を既存の美容組成物に添加し得、また、本発明に従って生産された脂肪酸を、美容組成物における唯一の「活性」成分として使用し得る。
【実施例】
【0285】
実施例１.材料および方法一過性発現系での植物細胞の遺伝子発現
外因性遺伝子構築物を、基本的にＶｏｉｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）およびＷｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）が説明する通りに、一過性発現系で植物細胞に発現させた。ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターといった強度の恒常的プロモーターから発現されるコード領域を含むプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。国際公開第２０１０／０５７２４６号に記載される通り、ｐ１９ウイルス性サイレンシング抑制因子発現のためのキメラ遺伝子３５Ｓ：ｐ１９を別でＡＧＬ１内に導入した。組み換えアグロバクテリウム細胞を、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌリファンピシンを添加したＬＢブロス内で、２８℃で静止期まで成長させた。次いで、１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．７、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１００μΜアセトシリンゴンを含む浸潤緩衝液内でＯＤ６００＝１．０まで再懸濁する前に、室温で１５分間、５０００ｇでの遠心分離によって細菌をペレット状にした。次いで、３５Ｓ：ｐ１９および対象の試験キメラ構築物（複数可）を含む同じ体積のアグロバクテリウム培養物を、葉の組織への浸潤に先立って混合する前に、細胞を振動させながら２８℃で３時間インキュベートした。一般的に、浸潤後、葉のディスクを脂肪酸のＧＣ分析のために取り出して凍結乾燥させる前に、植物をさらに５日間成長させた。
【0286】
内部標準として量が既知であるヘキサデカン酸と一緒に、８０℃で２時間、メタノール／ＨＣｌ／ジクロロメタン（１０／１／１ ｖ／ｖ）溶液中試料をインキュベートすることで、凍結乾燥試料における全ての葉脂質の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を作製した。ＦＡＭＥをヘキサン／ＤＣＭで抽出し、ヘキサン中、小体積まで濃縮し、ＧＣに注入した。脂質分画に存在する各および総脂肪酸の量を内部標準の既知の量をもとに定量化した。
【0287】
脂肪酸のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析３０ｍのＳＧＥ−ＢＰＸ７０カラム（７０％シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン、０．２５ｍｍの内部直径、０．２５ｍｍのフィルムの厚さ）、ＦＩＤ、分割／非分割注入器ならびにアジレント・テクノロジー社７６９３シリーズ自動回収装置および注入器を備えたアジレント・テクノロジー社７８９０Ａ ＧＣ（米国、カリフォルニア州、パロアルト）を用いたガスクロマトグラフィーによって、ＦＡＭＥを分析した。ヘリウムをキャリアガスとして用いた。１５０℃のオーブン温度で試料を分割モード（５０：１比）で注入した。注入後、オーブン温度を１５０℃で１分間維持し、次いで、１分あたり３℃ずつ２１０℃まで上げ、再度１分あたり５０℃ずつ２４０℃まで上げ、最終的に、２４０℃で１．４分間維持した。アジレント・テクノロジー社ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ Ｂ．０４．０３（１６）、米国、カリフォルニア州、パロアルト）で、既知の量である外部標準ＧＬＣ−４１１（Ｎｕｃｈｅｃｋ）およびＣ１７：０−ＭＥ内部標準の反応をもとにピークを定量化した。
【0288】
脂質の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）分析内部定量化標準として既知の量のｔｒｉ−Ｃ１７：０−ＴＡＧを添加した後、開花から１２日後（ｄａｆ）の、凍結乾燥した発育中の種子および成熟した種子から全ての脂質を抽出した。５ｍｇの乾燥材料あたりで、抽出した脂質をブタノール：エタノール（１：１ ｖ／ｖ）中１０ｍＭのブチル化ヒドロキシトルエン１ｍＬに溶解し、アジレント社１２００シリーズＬＣおよび６４１０ｂエレクトロスプレーイオン化３連４重極ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。０．２ｍＬ／分のフロー速度でバイナリ勾配を操作するＡｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＲＰ−Ａｍｉｄｅカラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、２．７μｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて、脂質をクロマトグラフィーによって分離した。移動相は：Ａ．Ｈ２Ｏ：メタノール：テトラヒドロフラン（５０：２０：３０ ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｍＭの蟻酸アンモニウム；Ｂ．Ｈ２Ｏ：メタノール：テトラヒドロフラン（５：２０：７５、ｖ／ｖ／ｖ）中１０ｍＭの蟻酸アンモニウムであった。マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）リストは、３０Ｖの衝突エネルギーおよび６０Ｖのフラグメンターを用いて、次の主要な脂肪酸をもとにした：１６：０、１８：０、１８：１、１８：２、１８：３、１８：４、２０：１、２０：２、２０：３、２０：４、２０：５、２２：４、２２：５、２２：６。アンモニア化合プリカーサーイオンおよび２２：６のニュートラルロスによるプロダクトイオンをもとに、各ＭＲＭ ＴＡＧを同定した。１０μΜのトリステアリン外部標準を用いてＴＡＧを定量化した。
【0289】
種子脂肪酸プロフィールおよび油含有量の測定種子油含有量を測定する予定であった場合、種子を２４時間デシケーター内で乾燥させ、およそ４ｍｇの種子を、テフロン加工のねじ口を含む２ｍｌのガラス小瓶に移した。０．１ｍｌトルエン中に溶解した０．０５ｍｇトリヘプタデカノインを内部標準として小瓶に添加した。
【0290】
０．７ｍｌの１ＮメタノールＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を、種子材料を含む小瓶に添加することで、種子ＦＡＭＥを調製し、簡単に撹拌し、８０℃で２時間インキュベートした。室温まで下げた後、０．３ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）および０．１ｍｌヘキサンを小瓶に添加し、１０分間、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｖｉｂｒａｍａｘ１１０でよく混合した。ＦＡＭＥを０．３ｍｌのガラス製インサートに集め、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を伴うＧＣで、前記した通りに分析した。
【0291】
市販の標準ＧＬＣ−４１１（ニューチェック・プレップ社（ＮＵ−ＣＨＥＫ ＰＲＥＰ，ＩＮＣ．，）、米国）に存在する同じＦＡＭＥの既知の量のピーク面積反応をもとに、各ＦＡＭＥのピーク面積をまず校正した。ＧＬＣ−４１１は、Ｃ８：０からＣ２２：６に及ぶ、同量の３１個の脂肪酸（重量％）を含む。標準に存在しなかった脂肪酸の場合、発明者らは最も類似したＦＡＭＥのピーク面積反応を取り出した。たとえば、１６：ｌｄ９のＦＡＭＥのピーク面積反応を１６：ｌｄ７に関して使用し、Ｃ２２：６のＦＡＭＥ反応をＣ２２：５に関して使用した。校正した面積を用いて、内部標準質量との比較によって、試料中の各ＦＡＭＥの質量を算出した。油はＴＡＧの形態で主に保存され、その重量を、ＦＡＭＥ重量をもとに算出した。各ＦＡＭＥＳのモルを算出し、ＦＡＭＥの合計モルを３で割ることで、グリセロールの合計モルを算出した。４１および１５がそれぞれグリセロール部分およびメチル基の分子量である、重量％油＝１００×（（４１×合計モルＦＡＭＥ／３）＋（合計ｇＦＡＭＥ−（１５×合計モルＦＡＭＥ）））／ｇ種子という関係を用いて、グリセロールおよび脂肪アシル部分の合計としてＴＡＧを算出した。
【0292】
油試料のステロール含有量の分析およそ１０ｍｇの油の試料を、内部標準として添加した一定分量のＣ２４：０モノオールと一緒に、８０％ＭｅＯＨ中４ｍＬの５％ＫＯＨを用い、テフロン加工のねじ口のガラス管内で８０℃にて２時間加熱し、けん化した。反応混合物を冷やした後、２ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水を添加し、振動および撹拌することで、ステロールを２ｍＬのヘキサン：ジクロロメタン（４：１ ｖ／ｖ）に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を取り除き、２ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗浄した。振動および遠心分離のあと、ステロール抽出物を次いで除去した。窒素ガスの流れを利用して抽出物を蒸発させ、２００ｍＬのＢＳＴＦＡを用い、および８０℃で２時間加熱して、ステロールをシリル化した。
【0293】
ステロールのＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析のために、ステロール−ＯＴＭＳｉ誘導体を４０℃のヒートブロック上の窒素ガスの流れ下で乾燥し、次いで、ＧＣ／ＧＣ−ＭＳ分析の直前にクロロホルムまたはヘキサンに再溶解した。ステロール−ＯＴＭＳ誘導体を、Ｓｕｐｅｒｌｃｏ Ｅｑｕｉｔｙ（商標）−１溶融石英キャピラリーカラム（１５ｍ×０．１ｍｍ内部直径、０．１μｍのフィルムの厚さ）、ＦＩＤ、分割／非分割注入器ならびにアジレント・テクノロジー社７６８３Ｂシリーズ自動回収装置および注入器が取り付けられたアジレント・テクノロジー社６８９０Ａ ＧＣ（米国、カリフォルニア州、パロアルト）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。ヘリウムをキャリアガスとして使用した。１２０℃のオープン温度で、非分割モードで試料を注入した。注入後、オーブン温度を１分あたり１０℃ずつ２７０℃まで上げ、最終的に１分あたり５℃ずつ３００℃まで上げた。アジレント・テクノロジー社ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（米国、カリフォルニア州、パロアルト）でピークを定量化した。ＧＣ結果は各成分の面積の±５％のエラーに影響される。
【0294】
ＧＣ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の分析をＦｉｎｎｉｇａｎ Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ ＧＣＱ ＧＣ−ＭＳおよびＦｉｎｎｉｇａｎ Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＧＣ−ＭＳ上で実施した；双方のシステムにカラム上注入器およびＴｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（米国、テキサス州、オースティン）を取り付けた。各ＧＣに、上記したものと類似した極性のキャピラリーカラムを取り付けた。質量スペクトルデータを用いて、保持時間データを、信憑性のある実験室標準に関して得られた保持時間データと比較することで、それぞれの成分を同定した。試料バッチと同時に、完全な手続き上のブランク分析を実施した。
【0295】
ＲＴ−ＰＣＲ条件逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅は、一般的に、製造業者の説明にしたがって１０ｐｍｏｌのフォワードプライマーおよび３０ｐｍｏｌのリバースプライマー、２．５ｍＭの最終濃度までのＭｇＳＣ４、緩衝液を伴う４００ｎｇの全ＲＮＡならびにヌクレオチド成分を用いた、体積２５μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して実行された。典型的な温度レジームは：逆転写が起こるために３０分間４５℃で１サイクル；次いで、２分間９４℃で１サイクル、引き続き、３０秒間９４℃、３０秒間５２℃、１分間７０℃の４０サイクル；次いで、反応混合物を５℃に冷やす前に２分間７２℃の１サイクルであった。
【0296】
３５Ｓ−ＬＥＣ２での誘導によるＢ.ナプス体細胞胚の作製
【0297】
Ｂ.ナプス（ｃｖ．Ｏｓｃａｒ）種子を、（Ａｔｔｉｌａ Ｋｅｒｅｓｚｔ ｅｔ ａｌ．、２００７）が説明する通り、塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌した種子を、ｐＨ５．８に調節した０．８％寒天を伴う１／２強度のＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）上で発芽させ、６〜７日間、２４℃にて、１８／６時間（明／暗）の光周期を伴う蛍光灯（５０μΕ／ｍ２ｓ）下で成長させた。２〜４ｍｍの柄の長さである子葉柄（Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎａｒｙ ｐｅｔｉｏｌｅｓ）をこれら実生から無菌的に単離し、外植片として使用した。１つは種子特異的バイナリーベクターを保有し、２つ目は３５Ｓ−ＬＥＣ２構築物を伴う、形質転換したＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１の培養物を新しいプレートの単一コロニーから接種し、適切な抗生物質を伴う１０ｍＬのＬＢ培地内で成長させ、２８℃で、１５０ｒｐｍの撹拌を伴いながら一晩成長させた。細菌細胞を５分間の４０００ｒｐｍの遠心分離で回収し、２％スクロースを含むＭＳ培地で洗浄し、１０ｍＬの同じ培地内に再懸濁し、１００μＭまでアセトシリンゴンを添加した後、４時間、必要に応じて選択のための抗生物質と成長させた。植物組織への添加の２時間前に、スペルミジンを１．５ｍＭの最終濃度まで添加し、細菌の最終密度を新しい培地でＯＤ６００ｎｍ＝０．４まで調節した。１つは種子特異的構築物を保有し、もう一方は３５Ｓ−ＡｔＬＥＣ２を保有する、２つの細菌培養物を、１：１から１：１．５比で混合した。
【0298】
新たに単離したＢ.ナプス子葉柄を、２０ｍＬのＡ．ツメファシエンス培養物で６分間感染させた。子葉柄を滅菌フィルター紙上にブロットして余分なＡ．ツメファシエンスを除去し、次いで、同時培養培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、Ｌ−システイン（５０ｍｇ／Ｌ）を添加した１００μΜアセトシリンゴン、アスコルビン酸（１５ｍｇ／Ｌ）およびＭＥＳ（２５０ｍｇ／１）を有するＭＳ培地）に移した。プレートを微小孔テープで密封し、２４℃で４８時間、暗所でインキュベートした。同時培養した外植片を事前選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移し、４〜５日間、２４℃で、１６時間／８時間の光周期を伴って培養した。種子特異的ベクター上の選択マーカー遺伝子にしたがって、外植片を次いで選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移し、２〜３週間、２４℃で、１６時間／８時間の光周期を伴って培養した。緑色の胚形成カルスを伴う外植片をホルモンフリーＭＳ培地（３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌチメンチンおよび選択剤を伴うＭＳ）に移し、もう２〜３週間培養した。選択培地上で生き残った外植片から単離した魚雷または子葉期の胚を、ＧＣを使って、それらの全ての脂質の脂肪酸組成に関して分析した。
【0299】
実施例２．シロイヌナズナ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現
【0300】
バイナリーベクターの作製バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４０４はそれぞれ、５つのデサチュラーゼおよび２つのエロンガーゼをコードする７つの異種性脂肪酸生合成遺伝子、ならびに、各ベクターに存在するＴ−ＤＮＡの左境界と右境界の反復の間に植物選択マーカーを含んでいた（図２および３）。配列番号１は、右境界から左境界の配列のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を提供する。双方の遺伝子構築物は、ラカンセア・クルイベリΔ１２−デサチュラーゼ（配列番号１のヌクレオチド１４１４３〜１６６４８を含む）、ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１のヌクレオチド７６５４〜１０１５６を含む）、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１のヌクレオチド２２６〜２３０９を含む）、パブロバ・サリナΔ５およびΔ４デサチュラーゼ（それぞれ配列番号１のヌクレオチド４５２４〜６４８５および１０１５７〜１４１４２を含む）およびピラミモナス・コルダタΔ６およびΔ５エロンガーゼ（それぞれ配列番号１のヌクレオチド２３１０〜４５２３および１７８２５〜１９９６７を含む）をコードする、植物コドン最適化遺伝子を含んでいた。配列番号１に対して、バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ（方向：右境界から左境界の配列）領域の特定の領域は次の通りである：
ヌクレオチド１〜１６３：右境界；４８０〜２２６、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼターミネーター（ＴＥＲ＿ＮＯＳ）；１８８３〜４８９、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ；２３０９〜１９５２、セイヨウアブラナ切断ナピンプロモーター（ＰＲＯ＿ＦＰｌ）；２３１０〜３２４３、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモーター（ＰＲＯ＿ＦＡＥ１）；３３１２〜４１８１、ピラミモナス・コルダタΔ６エロンガーゼ；４１９０〜４５２３、グリシンマックスレクチンターミネーター（ＴＥＲ＿レクチン）；４５２４〜４８８１、ＰＲＯ＿ＦＰｌ；４９５０〜６２３０：パブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼ；６２３１〜６４８５：ＴＥＲ＿ＮＯＳ；７６５３〜６４８６、ニコチアナ・タバカムＲｂ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）；８３８７〜７６５４、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン１ターミネーター（ＴＥＲ＿Ｃｎｌ１）；９６３８〜８３８８、ピキア・パストリスω３デサチュラーゼ；１０１５６〜９７０７、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン１プロモーター（ＰＲＯ＿Ｃｎｌ１）；１０１５７〜１２１８９、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン１プロモーター；１２２５８〜１３６０４、パブロバ・サリナΔ４デサチュラーゼ；１３６０５〜１４１４２、リヌム・ウシタティスシムムコンリニン２ターミネーター；１４１４３〜１４５９２、ＰＲＯ＿Ｃｎｌ１；１４６６１〜１５９１４、ラカンセア・クルイベリΔ１２デサチュラーゼ；１５９１５〜１６６４８、ＴＥＲ＿Ｃｎｌ１；１７８１６〜１６６４９、ＭＡＲ；１７８２５〜１８７５８、ＰＲＯ＿ＦＡＥ１；１８８２７〜１９６３３、ピラミモナス・コルダタΔ５エロンガーゼ；１９６３４〜１９９６７、ＴＥＲ＿レクチン；１９９９０〜２０５２７、複製エンハンサー領域を伴うカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；２０５３７〜２１０８８、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネスホスフィノトリシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ；２１０９７〜２１３４９、ＴＥＲ＿ＮＯＳ；２１３６７〜２１５２７、左境界。
【0301】
構築物の７つのコード領域は、それぞれ、種子特異的プロモーターの制御下にあり、３つの異なるプロモーター、すなわち、切断セイヨウアブラナナピンプロモーター（ｐＢｎＦＰ１）、シロイヌナズナＦＡＥ１プロモーター（ｐＡｔＦＡＥ１）およびリヌム・ウシタティスシムムコンリニン１プロモーター（ｐＬｕＣｎｌ１）が使用された。７つの脂肪酸生合成遺伝子は、一緒に、１８：１Δ９（オレイン酸）から２２：６Δ４、７、１０、１３、１６、１９（ＤＨＡ）に変換するよう設計された全体のＤＨＡ合成経路をコードしていた。双方のバイナリーベクターは、複製エンハンサー領域を伴うカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５ＳプロモーターおよびＡ．ツメファシエンスｎｏｓ３’ポリアデニル化領域−転写ターミネーターに操作可能に結合した領域をコードするＢＡＲ植物選択マーカーを含んでいた。植物選択マーカーはＴ−ＤＮＡ領域の左境界に隣接して配置され、したがって、植物細胞へのＴ−ＤＮＡ導入の方向に関して、Ｔ−ＤＮＡ上で遠位に位置した。これは、選択マーカー遺伝子を含まない可能性が高いＴ−ＤＮＡの部分的導入が選択されない可能性を増大した。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４０４はそれぞれアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）由来のＲｉＡ４複製開始点を含んだ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、１９９７）。
【0302】
配列番号１のヌクレオチド２２６〜１９９７５に対応するＤＮＡ領域（ＧＡ７領域）を合成し、この領域をＰｓｐＯＭＩ部位の受容バイナリーベクターｐＪＰ３４１６に挿入することで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を作製した。ＧＡ７上の各脂肪酸生合成遺伝子は、プロモーターと翻訳開始ＡＴＧとの間に、各コード領域と操作可能に結合して遺伝子から生成されるｍＲＮＡの翻訳効率を最大化するタバコモザイクウイルス５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）配列を含んでいた。ＧＡ７構築物はまた、Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）が説明する通り、２つのニコチアナ・タバカムＲｂ７マトリックス付着領域（ＭＡＲ）配列を含んでいた。核付着領域と時折呼ばれるＭＡＲ配列は、インビトロで核マトリックスに特異的に結合すると知られており、インビボでクロマチンの核マトリックスへの結合を媒介し得る。ＭＡＲは、トランスジェニックサイレンシングを緩和するように機能すると考えられている。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７において、トランスジェニック発現カセットを遮断するＤＮＡスペーサーとして作用するために、ＭＡＲも、Ｔ−ＤＮＡ領域内に挿入および配置される。ＧＡ７領域の挿入前のｐＪＰ３４１６ベクターは、境界間に植物選択マーカーカセットしか含んでいなかった。
【0303】
種子内のＳＤＡ生産のための遺伝子を含んだバイナリーベクターｐＪＰ３３６７に遺伝子カセットが添加される、制限酵素をもとにした順次挿入によって、遺伝子構築物ｐＪＰ３４０４を作製した。この構築物は、双方ともＢ.ナプス切断ナピンプロモーター（ＦＰ１）によって発現されるＬ．クルイベリΔ１２デサチュラーゼおよびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ω３デサチュラーゼ、ならびに、Ａ．タリアナＦＡＥ１プロモーターに発現されるＭ．プシラΔ６デサチュラーゼを含んでいた（図４）。はじめに、Ａ．タリアナＦＡＤ２イントロンをＥｃｏＲＩ部位に隣接させ、ｐＪＰ３３６７ＭｆｅＩ部位にクローニングしてｐＪＰ３３９５を作製した。それぞれＦＡＥ１およびＦＰ１プロモーターによって促進されるＰ．コルダタΔ６およびΔ５エロンガーゼカセットを含む断片を、ｐＪＰ３３９５のＫａｓＩ部位にクローニングして、ｐＪＰ３３９８を作製した。次いで、ｐＪＰ３３９８のＲＫ２複製開始点をＲｉＡ４複製開始点で置き換えることで、ｐＪＰ３３９９を作製した。それぞれＦＰ１およびＦＡＥ１プロモーターによって促進されるＰ．サリナΔ５およびΔ４デサチュラーゼカセットを含むＳｂｆＩ隣接断片をｐＪＰ３３９９のＳｂｆＩ部位にクローニングすることで、最終バイナリーベクター、ｐＪＰ３４０４を作製した。
【0304】
Ａ．タリアナ（シロイヌナズナ）形質転換および脂肪酸組成の分析キメラベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用してＡ．タリアナ（シロイヌナズナ）（生態型コロンビアおよびｆａｄ２変異体）植物を処理した（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）。成熟後、処理した植物からのＴ１種子を回収しＢＡＲ選択マーカー遺伝子を含む植物の選択のためにＰＰＴを含むＭＳプレート上に播いた。生き残った、健康なＴ１実生を土壌に移した。植物が成熟まで成長し、自家受精が可能にした後、これら植物からのＴ２種子を回収し、それらの種子脂質の脂肪酸組成を実施例１で記載する通りにＧＣ分析によって分析した。
【0305】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７をコロンビア遺伝的背景へ使用した１３個の形質転換体およびｆａｄ２変異体を使用した６個の形質転換体に関して、種子脂質のＤＨＡ量のデータが図５に示される（Ｔ２と標識されたレーン）。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物は、総脂肪酸含有量のパーセンテージとして表されるＤＨＡ量の、ｐＪＰ３４０４構築物よりも平均的に少しだけ高い生産につながった。表４は、最も高いＤＨＡ量を伴うＴ２系統からの総種子脂質の脂肪酸組成を示す。同一種子のオレイン酸からのＤＨＡの生産における各酵素的工程に関して算出された転換効率が表５に示される。転換効率は、（％産物×１００）／（％残存基質＋％産物）で算出され、したがってパーセンテージで表される。
【0306】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７ Ｔ２形質転換系統で生産されたＤＨＡの最も高く観察された量は６．２％であり、さらに、０．５％ＥＰＡおよび０．２％ＤＰＡ（系統＃１４）を伴った。これらのＴ２種子は、導入遺伝子に対して依然と分離しており、すなわち、均一してホモ接合ではなかった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質のプロフィール（表４）のまとめたデータが表６に示される。これらの種子の導入遺伝子の結果生産されたω３脂肪酸の量（コロンビア背景で内因的に生産されたＡＬＡの量を除外した全ての新ω３脂肪酸）が１０．７％である一方で、ω６脂肪酸の量（１８：２Δ９、１２を除外した全ての新ω６脂肪酸）は１．５％であった。これは、新ω３脂肪酸：新ω６脂肪酸の極端に有利な比、すなわち、７．３：１を意味する。
【0307】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換した選択系統、すなわち、コロンビア背景の７、１０、１４、２２および３４と指定された系統ならびにｆａｄ２変異体背景の１８、２１および２５と指定された系統のＴ２種子を、インビトロのトランスジェニック実生の選択のためにＰＰＴを含むＭＳ培地上に播いた。各系統に対して２０個のＰＰＴ耐性実生が土壌に移され、自家受精後成熟するまで成長させた。これらの植物は、選択マーカー遺伝子、および、したがって、植物ゲノムの少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ挿入物にとって、ホモ接合である傾向が非常に高かった。これら植物のＴ３種子を回収し、それらの種子油の脂肪酸組成を、ＧＣによって分析した。データは表７に表される。この分析によって、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物は、ホモ接合植物のＴ３種子で、分離するＴ２種子よりも高い量のω３ＬＣ−ＰＵＦＡ ＤＨＡを生産することが明らかになった。最大約１３．９％のＤＨＡがコロンビア背景で２２．２と指定されたＴ３のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７形質転換系統で観察され、これは、ヘミ接合Ｔ２種子における約５．５％から増加し、種子脂質含有量における総脂肪酸のパーセンテージとして、約２４．３％の新ω３脂肪酸の合計量を伴った。新ω６脂肪酸は、総脂肪酸の１．１％の量であり、新ω３脂肪酸：新ω６脂肪酸の大変有利な比、すなわち約２２：１を意味する。同様に、ｆａｄ２変異体背景での形質転換は、種子脂質含有量における総脂肪酸のパーセンテージとして、１１．５％のＤＨＡを含む、２０．６％の新ω３脂肪酸の合計をもたらした。
【0308】
【表4】
【0309】
【表5】
【0310】
【表6】
【0311】
【表7】
【0312】
オレイン酸からのＤＨＡの生産のための経路における各酵素工程の酵素的転換効率が、より高いＤＨＡ量を有するＴ３種子に関して表８に示される。系統２２．２の種子におけるΔ１２デサチュラーゼ転換効率は８１．６％で、ω３デサチュラーゼ効率は８９．１％であり、双方とも著しく高く、これらの真菌（酵母菌）酵素は発育中の種子で良く機能できたことを示す。ＤＨＡ経路における他の外因性酵素の活性はω３基質に対して同様に高く、Δ６デサチュラーゼは４２．２％効率、Δ６エロンガーゼは７６．８％、Δ５デサチュラーゼは９５．０％、Δ５エロンガーゼは８８．７％およびΔ４デサチュラーゼは９３．３％効率で作用した。ω６基質ＬＡ上のΔ６デサチュラーゼ活性はもっと低く、Δ６デサチュラーゼはＬＡ上でたった０．７％の転換効率で作用した。ＧＬＡはたった０．４％の量で存在し、最も高いＤＨＡ含有量を伴うＴ３種子で検知された２０：２ω６を除いて、唯一の新ω６産物であった。独立トランスジェニック種子の総種子脂質プロフィール（表７）のまとめたデータが表９で示される。最も高いＤＨＡ量を有する系統に関するこのデータは、総ω６ ＦＡ（ＬＡを含む）の総ω３ ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する０．１０の比を含んだ。この系統の脂質における、新ω６ ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３ ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．０５であった。総多価不飽和脂肪酸量は、これらの系統で５０％超であり、少なくとも４つの系統で６０％超であった。全体的な転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝２１．８％、ＯＡからＤＨＡ＝１８．０％、ＬＡからＥＰＡ＝２６．９％、ＬＡからＤＨＡ＝２２．２％、ＡＬＡからＥＰＡ＝３０．１％、ＡＬＡからＤＨＡ＝２４．９％。
【0313】
【表8】
【0314】
【表9】
【0315】
Ｔ２系統２２の子孫である、コロンビア背景のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７系統２２．２からのＴ３種子を土壌に直接播き、得られたＴ３植物の成熟種子の脂肪酸組成をＧＣで分析した。これらの種子の平均ＤＨＡ量は、種子脂質の総脂肪酸のパーセンテージとして、１３．３％±１．６（ｎ＝１０）であった。表６で示される通り（右側の柱）、最も高い量のＤＨＡを有する系統は、種子脂質の総脂肪酸において１５．１％のＤＨＡを含んでいた。酵素的転換効率が、オレイン酸からのＤＨＡ生産の各工程に関して、表８に示される。
【0316】
最も高いＤＨＡ量を伴う系統の総ω６ ＦＡ（ＬＡを含む）のω３ ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する比は、０．１０２であった。最も高いＤＨＡ量を有する系統での新ω６ ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３ ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．０５３であった。総飽和脂肪酸の量は約１７．８％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約１８．１％であった。総ω６脂肪酸の量は約５．７％であり、ω３脂肪酸の量は約５５．９％であった。全体的な転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝２４．５％、ＯＡからＤＨＡ＝２０．１％、ＬＡからＥＰＡ＝２９．９％、ＬＡからＤＨＡ＝２４．５％、ＡＬＡからＥＰＡ＝３２．９％、ＡＬＡからＤＨＡ＝２７．０％。総オメガ３脂肪酸は総脂肪酸の５５．９％まで蓄積することが発見された一方で、オメガ６脂肪酸は総プロフィールの５．７％であった。
【0317】
サザンブロットハイブリダイゼーション分析を実施した。結果は、高蓄積ＤＨＡ系統はｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物のＴ−ＤＮＡの単一または重複コピーのいずれかであったが、トランスジェニック系統コロンビア＃２２は例外で、これは、アラビドプシス植物のゲノムに３つのＴ−ＤＮＡ挿入を有した。Ｔ５世代種子もまた分析し、総種子脂質において最大１３．６％のＤＨＡを有することが分かった。ＧＡ７構築物は、ＤＨＡ生産能力の観点からは、複数の世代を超えて安定であることが分かった。
【0318】
トランスジェニックＡ．タリアナ（シロイヌナズナ）ＤＨＡ系統の油含有量の測定様々な量のＤＨＡを有するトランスジェニックＡ．タリアナ種子の油含有量を実施例１で説明した通りＧＣで測定した。データは図６に示され、油含有量（種子の重量％油）をＤＨＡ含有量（総脂肪酸のパーセンテージとして）に対してグラフ化している。種子１グラムあたり最大２６．５ｍｇのＤＨＡが観察された（表１０）。トランスジェニックアラビドプシスの油含有量は、ＤＨＡ含有量と負で相関していることが分かった。種子の重量あたりのＤＨＡ量は、約１４％ＤＨＡを有する種子と比較して、約９％のＤＨＡ量を有する形質転換種子でより高かった。これがアラビドプシス以外の種子にもあてはまるかどうかはまだ測定されていない。
【0319】
【表10】
【0320】
実施例３．カメリナサティバ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現上記のバイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を、Ａ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を用いてＣ．サティバ（カメリナサティバ）顕花植物を処理した（ＬｕおよびＫａｎｇ、２００８）。植物の成長および成熟後、処理した植物のＴ１種子を回収し、土壌に播き、得られた植物を除草剤ＢＡＳＴＡで噴霧することで処理し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ上に存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子のトランスジェニックであり、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡ上に存在するｂａｒ選択マーカー遺伝子を発現していた植物を選択した。除草剤に耐性を持ち、生き残ったＴ１植物を、自家受精させた後に成熟するまで成長させ、得られたＴ２種子を回収した。５つのトランスジェニック植物が得られ、そのうち３つのみが全体のＴ−ＤＮＡを含んでいた。
【0321】
全体のＴ−ＤＮＡを含んだ３つの植物のそれぞれからのおおよそ２０の種子のプールから脂質を抽出した。プール化した試料のうち２つは、大変低い、ほとんど検知できない量のＤＨＡを含んでいたが、３つ目のプールは約４．７％のＤＨＡを含んでいた（表１２）。したがって、この植物の１０個の各Ｔ２種子から脂質を抽出し、脂肪酸組成をＧＣで分析した。この形質転換系統の各種子の脂肪酸組成データも表１１に示される。総種子脂質プロフィール（表１１）をまとめたデータは表１２に示される。
【0322】
【表11】
【0323】
【表12】
【0324】
ＤＨＡは、１０個のそれぞれの種子のうち６つに存在した。他の４つの種子はＤＨＡを有さず、親植物のＴ−ＤＮＡ挿入のヘミ接合性をもとに、Ｔ−ＤＮＡを有さなかった無効分離体であると推定された。最も高い量のＤＨＡを有する単一種子から抽出された脂質は９．０％のＤＨＡを有し、一方で、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計パーセンテージは１１．４％であった。形質転換の結果この種子で生産された新ω３脂肪酸（ＳＤＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ）の合計パーセンテージは１９．３％であり、一方で、新ω６脂肪酸（ＧＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡおよびいずれかのω６伸長産物）の対応する合計は、２．２％であり、ＧＬＡおよびＥＤＡのみが新ω６脂肪酸として検知された。総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）のω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する比は、０．４４だと分かった。最も高いＤＨＡ量を有する種子の新ω６ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、０．１２であった。総飽和脂肪酸の量は約１７．８％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約１５．５％であった。総ω６脂肪酸の量は、約２０．４％であり、ω３脂肪酸の量は約４６％であった。全体の転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１５．６％、ＯＡからＤＨＡ＝１２．３％、ＬＡからＥＰＡ＝１７．２％、ＬＡからＤＨＡ＝１３．６％、ＡＬＡからＥＰＡ＝２４．８％、ＡＬＡからＤＨＡ＝１９．６％。
【0325】
この系統のホモ接合種子を、Ｔ４世代で得た。Ｔ４世代全体で観察された平均７．３％のＤＨＡを有するＦＤ５−４６−１８−１１０事象で、最大１０．３％のＤＨＡが生産された。
【0326】
複数の温室でホモ接合種子を植え付け、全体で６００超の個々の植物を作製した。ソックスレー、アセトンおよびヘキサン抽出を含む様々な方法を使用して、種子から油を抽出している。
【0327】
上記の通り得られた、独立して形質転換した系統のＣ．サティバの数が低かったので、Ｃ．サティバをｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換するさらなる実験を実施する。発明者らは、種子油中の総脂肪酸のパーセンテージで１０％超のＤＨＡ量が、さらに形質転換された系統およびで達成され、Ｔ−ＤＮＡに対してホモ接合である植物は２０％のＤＨＡまで達成される推測する。２０個のＣ．サティバＧＡ７＿ｍｏｄＨ事象を作製し、種子のＤＨＡ含有量を分析している。３つのＧＡ７＿ｍｏｄＢ事象作製し、事象ＣＭＤ１７．１からのＴ１種子の分析は、９．８％のプール化種子ＤＨＡ含有量を明らかにした。最も高い単一種子ＤＨＡ値は１３．５％であることがわかった。
【0328】
実施例４．セイヨウアブラナ種子のトランスジェニックＤＨＡ経路の安定な発現単一ベクターを用いたＢ.ナプス（セイヨウアブラナ）形質転換および脂肪酸組成の分析
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７を使用して、形質転換セイヨウアブラナ植物およびその植物からの種子を作製した。標準的なエレクトロポレーション手法を介して、上記のベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。トランスジェニックアグロバクテリウム細胞の培養物を、１５０ｒｐｍでの振動を伴って、２８℃のＬＢ培地で一晩成長させた。細菌細胞を５分間の４０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収し、Ｗｉｎａｎｓ ＡＢ培地（Ｗｉｎａｎｓ、１９８８）で洗浄し、１０ｍＬのＷｉｎａｎｓ ＡＢ培地（ｐＨ５．２）に再懸濁し、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）、リファンピシン（２５ｍｇ／Ｌ）および１００μΜアセトシリンゴンの存在下で一晩成長を続けた。ブラシカ細胞の感染の２時間前に、スペルミジン（１２０ｍｇ／Ｌ）を添加し、細菌の最終密度を新しいＡＢ培地で０．３〜０．４のＯＤ６００ｎｍまで調節した。１／２ＭＳ（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）で成長した８日目のセイヨウアブラナ実生から新たに単離した子葉柄または１ｍｇ／Ｌのチジアズロン（ＴＤＺ）および０．１ｍｇ／Ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を伴うＭＳ培地上で３〜４日で事前に条件を整えた胚軸断片を、１０ｍＬのアグロバクテリウム培養物で５分間感染した。アグロバクテリウムで感染した外植片を次いで滅菌フィルター紙にブロットして余分なアグロバクテリウムを除去し、異なる抗酸化剤（Ｌ−システイン５０ｍｇ／Ｌおよびアスコルビン１５ｍｇ／Ｌ）を添加した、または添加していない、同時培養培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡおよび１００μΜアセトシリンゴンを伴うＭＳ培地）に移した。全プレートをパラフィルムで密封し、２３〜２４℃の暗所で４８時間インキュベートした。
【0329】
処理した外植片を次いで、５００ｍｇ／Ｌセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含む滅菌蒸留水で１０分間洗浄し、滅菌蒸留水で１０分間すすぎ、滅菌フィルター紙上にブロットして乾燥し、事前選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２０ｍｇ／Ｌの硫酸アデニン（ＡＤＳ）、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌチメンチンを含むＭＳ）に移し、１６時間／８時間の光周期で、５日間２４℃で培養した。次いで、形質転換細胞の選択のための作用剤として１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを伴う選択培地（１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび５０ｍｇ／Ｌのチメンチンを含むＭＳ）にそれらを移し、同じ培地上で、隔週で継代培養しながら、１６時間／８時間の光周期で、２４℃にて４週間培養した。緑色のカルスを伴う外植片を発芽開始培地（１ｍｇ／Ｌのキネチン、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／Ｌのチメンチンおよび１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを含むＭＳ）に移し、もう２〜３週間培養した。耐性外植片から生まれた芽を芽伸長培地（０．１ｍｇ／Ｌのジベレリン酸、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムおよび１．５ｍｇ／Ｌのグルフォシネートアンモニウムを含むＭＳ培地）に移し、もう２週間培養した。２〜３ｃｍの長さの健康的な芽を選択し、発根培地（１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、２０ｍｇ／ＬのＡＤＳ、１．５ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む１／２ＭＳ）に移し、２〜３週間培養した。根を伴う良く確立された芽を、実生成長ミックスを含むポットに移し、２週間成長キャビネットで成長させ、引き続き、温室に移した。この方法で、ＧＡ７構築物で形質転換したおよそ４０（Ｔ０）の植物を得た。
【0330】
植物を、自家受精させた後、成熟するまで成長させた。形質転換した植物から得た種子を、実施例１に記載される通り、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。最も高いＤＨＡ量を有する形質転換系統に関するデータが表１３で示される。平均的なＤＨＡ量は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡで形質転換したＢ.ナプス種子の種子油において、同じ構築物で形質転換したＡ．タリアナ種子（実施例２）またはカメリナ種子（実施例３）よりも、著しく低かった。およそ４０の系統の中で最も高い量のＤＨＡは１．５２％であり、トランスジェニック系統の大部分は検知可能なＤＨＡを有した。これらの種子のなかに、総脂肪酸の約３５％である相当な蓄積のＡＬＡがあり、これはＳＤＡまたは経路で続く産物に効率的に変換されていなかったことが留意された。
【0331】
Ｔ１事象、ＣＴ１２５−２からの単一Ｂ.ナプス種子の脂肪酸プロフィール分析を実施して、トランスジェニック種子で生産されたＤＨＡの量をより良く測定した。種子は、０％（無効種子）と８．５％の間のＤＨＡを含むことがわかった（表１３）。
【0332】
ＤＨＡ生産を示す、植物系統ＣＴ１１６ならびに他のトランスジェニック系統由来の種子をいくつか播いて、後代植物を作製した。ＧＡ７構築物が、同一構築物を有するトランスジェニックＡ．タリアナおよびＣ．サティバと比較して、なぜＤＨＡ生産に関して不十分に作用し、および、ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６上の遺伝子の組み合わせと比較してなぜ不十分に作用したのかを決定するために、これら植物の発育中の胚から単離した総ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した（下）。一段階ＲＴ−ＰＣＲキット（インビトロゲン社）および各導入遺伝子を標的する遺伝子特異的プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを総ＲＮＡに対して行った。これによって、ＧＡ７構築物の各遺伝子は、形質転換種子の大部分で不十分に発現したΔ６デサチュラーゼを除いて、Ｂ.ナプス形質転換体で良好に発現することが確認された。この構築物からの他の遺伝子は、Ｂ.ナプスおよびＡ．タリアナ種子の双方で良く機能し、たとえば、Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼはオレイン酸量を減らす一方で種子のＬＡおよびＡＬＡの増加した量を生産するように機能した。代表的なＲＴ−ＰＣＲゲルは、図７に示され、これは、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７の他の導入遺伝子と比較して、Δ６デサチュラーゼの低発現を明らかに示す。
【0333】
導入遺伝子とホモ接合であるトランスジェニック植物および種子を、最も高いＤＨＡを有する系統の後代を植え付けることで、作製する。
【0334】
【表13】
【0335】
２つのベクターを用いたＢ.ナプス形質転換および脂肪酸組成の分析Ｂ.ナプスの別の実験において、および、導入遺伝子を導入するための代替形式として、国際公開第２０１０／０５７２４６号に記載されるバイナリーベクターｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６を使用して、形質転換Ｂ.ナプス植物を別々に作製し、形質転換種子をその植物から得た。ｐＪＰ３１１５上のＴ−ＤＮＡは、クレピス・パレスチナ（Ｃｒｅｐｉｓ ｐａｌｅｓｔｉｎａ）Δ１２デサチュラーゼ、ミクロモナス・プシラΔ６デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ６エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ５デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子を含み、ｐＪＰ３１１６上のＴ−ＤＮＡはペルリア・フルテスケンス（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）Δ１５デサチュラーゼ、ピラミモナス・コルダタΔ５エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ４デサチュラーゼを含んでいた。２つのＴ−ＤＮＡは、一緒に存在し、発育中の種子に発現された場合、内因的に生産されたオレイン酸からＤＨＡを生産するための７遺伝子経路を形成した。これらのベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に、標準的なエレクトロポレーション手法で導入し、形質転換した細胞を独立して使用し、上記の方法を用いてＢ.ナプスを形質転換し、安定的に形質転換したＴ０植物を作製した。２９のｐＪＰ３１１５および１９のｐＪＰ３１１６形質転換体を得て、これらの植物を成熟するまで成長させ、自家受精の後に得られた種子を、それらの種子油の脂肪酸組成に関して分析した。ｐＪＰ３１１５のＴ−ＤＮＡでの形質転換は、内因的に生産されたＡＬＡからのＥＰＡ生産につながると予測された一方で、ｐＪＰ３１１６のＴ−ＤＮＡでの形質転換はＬＡからのＡＬＡ生産増大につながると予測された。これらの表現型を示す植物を複数同定した。事象の大部分は、低量のＥＰＡ生産を伴うΔ１２不飽和化のために、低下したＯＡ／増大したＬＡ表現型を示した。最大２．６％のＥＰＡがｐＪＰ３１１１５トランスジェニック種子プールで観察された。同様に、ｐＪＰ３１１６事象の大部分はΔ１５デサチュラーゼ活性のために増大したＡＬＡ表現型を有することが分かった。最大１８．５％のＡＬＡがｐＪＰ３１１６のＴ−ＤＮＡで形質転換したプール種子で発見された。
【0336】
最も高い量のＥＰＡおよびＡＬＡを有する系統のＴ１植物を交雑させ、２４個の回収した事象の後代種子（Ｆ１）のＤＨＡ含有量を分析した。ＤＨＡは、これらの事象のうち１７個で発見され、最大１．９％のＤＨＡがこれらの事象のプール種子で発見された。単一種子分析を実施して、ＤＨＡ生産の範囲を決定し、そのデータが表１４に示される。広い範囲のＤＨＡ量が交雑子孫で観察され、おそらく、親植物でのＴ−ＤＮＡのヘミ接合性質のためであり、その結果、いくつかの種子は双方のＴ−ＤＮＡを受け取らなかった。最大６．７％のＤＨＡが全種子脂質で観察された。
【0337】
【表14】
【0338】
【表15】
【0339】
全脂質プロフィール（表１４）をまとめたデータが表１５に示される。表１５のデータによると、最も高い量のＤＨＡを有する種子での全ω６ＦＡ（ＬＡを含む）のω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する比は、３．３４であった。新ω６ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は１．３９であった。総飽和脂肪酸の量は、約１３．７％であり、一価不飽和脂肪酸の量は約２１．８％であった。総ω６脂肪酸の量は４６．４％であり、ω３脂肪酸の量は約１４．８％であった。全体の転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１２．８％、ＯＡからＤＨＡ＝８．５％、ＬＡからＥＰＡ＝１５．７％、ＬＡからＤＨＡ＝１０．４％、ＡＬＡからＥＰＡ＝７２．１％、ＡＬＡからＤＨＡ＝４７．９％。ｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６の組み合わせでの本実験で観察されたω６脂肪酸からω３脂肪酸の転換の効率の低下は、ＡＬＡからＤＨＡの転換のための遺伝子と組み合わせた場合、真菌Δ１５／ω３デサチュラーゼと比較して、植物Δ１５デサチュラーゼの効率がより低い（実施例２および３）ためであると考えられた。
【0340】
導入された導入遺伝子の全てにホモ接合であるＤＨＡ含有系統の子孫を分析のために作製する。
【0341】
実施例５．植物種子における、ＤＨＡ経路をコードするＴ−ＤＮＡの改変Ｂ.ナプスでのＤＨＡ生産量を実施例４に記載される量を超えて改善するために、バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを次のように作製した。これらのバイナリーベクターは、実施例２に記載されたｐＪＰ３４１６−ＧＡ７構築物の変異形であり、特にΔ６デサチュラーゼおよびΔ６エロンガーゼ機能を改善することで、植物種子でのＤＨＡの合成をさらに増大するように設計した。Δ５エロンガーゼと比べて比較的低い伸長効率のために、ＧＡ７構築物で形質転換したある種子では、ＳＤＡが蓄積されるのが観察されていたので、他の改変の中で、２つのエロンガーゼ遺伝子配置をＴ−ＤＮＡで交換した。
【0342】
まず始めに新しいＰ．コルダタΔ６エロンガーゼカセットをｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＳｂｆＩ部位間にクローニングし、Ｐ．コルダタΔ５エロンガーゼカセットと取り換えることで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７における２つのエロンガーゼコード配列を、Ｔ−ＤＮＡ上でのそれらの配置を交換し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡを得た。Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼを促進するＦＰ１プロモーターをコンリニンＣｎｌ２プロモーター（ｐＬｕＣｎｌ２）と交換することで、この構築物をさらに改変し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢを得た。Δ６デサチュラーゼ発現を増大、それによって酵素効率を増大させる試みの中でこの改変を行った。Ｃｎｌ２プロモーターは、切断ナピンプロモーターよりもより高い導入遺伝子の発現をＢ.ナプスにもたらし得ると考えられた。少し異なるコドン使用頻度を伴う第２のＭ．プシラΔ６デサチュラーゼカセット（配列番号１５）を添加することにより、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣを作製し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢの右境界のちょうど内側のＰｍｅＩ部位に挿入したＦＰ１プロモーターで促進した。Δ６デサチュラーゼ発現量を増大し、複数のプロモーターの使用によってΔ６デサチュラーゼの発現のための種子発育間の期間を延ばすために、第２のΔ６デサチュラーゼカセットを双方のｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦに添加した。２つの核配列で異なるコドン使用頻度を使用して、同一Ｔ−ＤＮＡ内での類似したコード領域の同時抑制の恐れのない、同一タンパク質配列の翻訳につながった。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥは、配列番号１のヌクレオチド１６６４９〜１７８１６に対応する３番目のＭＡＲ配列がＰｍｅＩ部位にてそれぞれｐＪＰ３４１６−ＧＡ７およびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢに添加された類似変異形であった。天然Δ６デサチュラーゼヌクレオチド配列を含む第２のＭ．プシラΔ６デサチュラーゼカセットを添加することで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを作製し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢの右境界のＰｍｅＩ部位にあるＦＰ１プロモーターで促進した。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを、まず始めにＡｓｃＩ−ＰａｃＩ部位での制限クローニングによってＭ．プシラΔ６デサチュラーゼカセットをＣｎｌ２：Ｐ．コルダタΔ５エロンガーゼカセットで置き換えることで作製した。次いで、ＳｂｆＩ部位での制限クローニングによって本来のＦＡＥ１：Ｐ．コルダタΔ５エロンガーゼカセットをＦＡＥ１：Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼカセットで交換することで、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを作製した。これらの遺伝子構築物のそれぞれのＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は、次のように示される：ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ（配列番号２）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ（配列番号３）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ（配列番号４）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥ（配列番号５）、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦ（配列番号６）およびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ（配列番号７）。
【0343】
バイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧを使用して形質転換したブラシカ体細胞胚ならびにセイヨウアブラナ、カメリナ・サティバおよびシロイヌナズナ植物および後代種子を作製する。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢに関するデータが次の実施例で示される。
【0344】
８個のトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ Ａ．タリアナ事象および１５個のトランスジェニックｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ Ａ．タリアナ事象を作製した。プール化したｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ種子において３．４％と７．２％との間のＤＨＡが観察され、プール化したＴ２ ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＧ種子において０．６と４．１％との間のＤＨＡが観察された。最も高いｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ事象のいくつかを選択培地上に播き、生き残った実生を次の世代まで持って行った。種子のＤＨＡ含有量が分析されている。プール化したＴ１種子は導入遺伝子に対して分離している群を示し、いずれかの無効分離体を含んでいたので、後代植物のホモ接合種子は種々油中最大２０％の総脂肪酸含有量である増大した量のＤＨＡを有するであろうと予測される。他の改変構築物を使ってＡ．タリアナを形質転換した。ほんの少数の形質転換系統しか得られなかったが、どれもｍｏｄＢ構築物よりも高い量のＤＨＡをもたらさなかった。
【0345】
また、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ構築物を使用し、品種ＯｓｃａｒおよびＮＸ００５と呼ばれる育種系統の形質転換Ｂ.ナプス植物を作製した。Ｏｓｃａｒ形質転換に関しては１０個の独立形質転換植物（Ｔ０）を、ＮＸ００５に関しては２０個の独立系統をこれまでに得た。種子（Ｔ１種子）をこれらのトランスジェニック系統から回収した。種子のプールを、種子油中ＤＨＡ量に関して試験し、最も高い量を示した２つの系統を選択し、これらを系統ＣＴ１３２．５（品種Ｏｓｃａｒで）およびＣＴ１３３．１５（ＮＸ００５で）と名付けた。ＣＴ１３２．５から２０個の種子およびＣＴ１３３．１５から１１個の種子を水に浸し、２日後、各種子それぞれの子葉半分から油を抽出した。胚軸を伴うもう片方の子葉を培地上で維持および培養し、特定の後代系統を維持した。油中脂肪酸組成を決定した；ＣＴ１３２．５に関するデータが表１６に示される。分析した２０の種子のうちの１０個におけるＤＨＡ量は、ＧＣ分析で測定された総脂肪酸含有量の７〜２０％の範囲にあった。他の種子は７％未満のＤＨＡを有し、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢ由来のＴ−ＤＮＡの部分（不完全）コピーを含み得た。トランスジェニック系統は遺伝子的に結合していない複数の導入遺伝子挿入を含んでいるように見えた。トランスジェニック系統ＣＴ１３３．１５の種子は、０〜５％の範囲のＤＨＡ量を示した。ＤＨＡを有さない種子は無効分離体になる可能性が高かった。これらのデータによって、ｍｏｄＢ構築物はキャノーラ種のＤＨＡ生産に関して良好に働くことが確認された。
【0346】
また、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−０Ａ７−ｍｏｄＦ構築物を使って形質転換したカメリナ・サティバ植物を作製した。少なくとも２４個の独立形質転換植物（Ｔ０）を得、後代分析によってさらに細かく調査した。種子（Ｔ１種子）をこれらのトランスジェニック系統から回収した。種子のプールを種子油中ＤＨＡ量に関して試験し、最も高いＤＨＡ量（６％と９％との間）を示す６個の系統を選択した。各系統からの２０個のＴ１種子のＤＨＡ量を分析し、多くの種子はＧＣ分析で測定された総脂肪酸含有量の６〜１４％の範囲でＤＨＡを示した。油中脂肪酸組成を決定した；複数のトランスジェニック種子に関するデータが表１７に示される。これらのデータによって、ｍｏｄＢおよびｍｏｄＦ構築物は双方ともカメリナ属でのＤＨＡ生産に関して良好に働くことが確認された。
【0347】
【表16】
【0348】
【表17】
【0349】
発明者らは、概して、ＤＨＡ経路の律速酵素活性の効率は、単一コピーＴ−ＤＮＡ形質転換体に比べて複数コピーＴ−ＤＮＡ形質転換体においてより活発であり得、また、経路で制限している可能性がある酵素をコードする複数の遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入することで増大し得ることを企図した。複数コピー形質転換体の可能性のある重要性の証拠はＧＡ７構築物で形質転換したアラビドプシス種子（実施例２）に見られ、ここでは、最も多収性であるＤＨＡ事象は、宿主ゲノムに挿入された３つのＴ−ＤＮＡを有した。複数の遺伝子は同一であり得、または、好ましくは、同一のポリペプチドをコードする異なる変異形であり、または、重複した発現パターンを有する異なるプロモーターの制御下にある。たとえば、増加した発現は、同一タンパク質が生産される場合でも、複数のΔ６デサチュラーゼコード領域の発現によって達成され得る。ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦおよびｐＪＰ３４１６−０Ａ７−ｍｏｄＣでは、たとえば、Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼの２つのバージョンが存在し、異なるプロモーターによって発現された。コード配列は異なるコドン使用頻度を有し、したがって、異なるヌクレオチド配列を有して、可能性のあるサイレンシングまたは同時抑制効果を軽減したが、同一タンパク質の生産につながった。
【0350】
実施例６．体細胞胚の種子特異的構築物の活性種子特異的プロモーターの制御下である種子中の遺伝子構築物の発現を予測する迅速アッセイシステムを作るために、体細胞胚システムをセイヨウアブラナに準備した。これには、体細胞胚形成の開始に関わるＬＥＣ２転写因子を発現するベクターが使用された。実演として、バイナリーベクター３５Ｓ：ＬＥＣ２およびｐＪＰ１０７（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、２０１０ａおよびｂ）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１に標準的なエレクトロポレーションを介して導入し、そのアグロバクテリウム形質転換体を使用して同時培養によってセイヨウアブラナを同時形質転換した。ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡ領域はイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）Δ９エロンガーゼ、Ｐ．サリナΔ８デサチュラーゼおよびＰ．サリナΔ５デサチュラーゼをコードする遺伝子を含んでおり、各遺伝子は種子特異的プロモーターによって発現された。対照形質転換には３５Ｓ：ＬＥＣ２ベクターが単独で用いられた。３５Ｓ：ＬＥＣ２発現は、実施例１に記載される形質転換Ｂ.ナプスカルス組織に直接由来する組織培養物での体細胞胚の形成につながった。
【0351】
脂肪酸分析によって、構築物ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡ上の種子特異的遺伝子は、同時形質転換ＬＥＣ２遺伝子の存在下でトランスジェニック体細胞胚に発現され、機能してＬＡからＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）およびＡＬＡからＥＰＡ（２０：５Δ５、８、１１、１４、１７）を生産することが示された。３つの同時形質移転間体細胞胚に関するデータが表１８に示され、それぞれの脂肪酸組成を、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡの遺伝子を導入し、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡを発現したセイヨウアブラナ種子の種子油の脂肪酸組成と比較した（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、２０１０ａおよびｂ）。安定的に形質転換した種子プロフィールと比較した場合、ＡＲＡならびに中間脂肪酸ＥＤＡ（２０：２ω６）およびＤＧＬＡ（２０：３ω６）の類似した総パーセンテージおよび転換効率が体細胞胚組織で観察された。安定なＴ２トランスジェニック種子および体細胞胚の脂肪酸組成において類似した結果が観察された：ω６脂肪酸はそれぞれ２６．６％および２５．６％（平均）の量である一方で、ＡＲＡ量はそれぞれ９．７％および１０．６％（平均）であることが分かった。
【0352】
３５Ｓ：ＬＥＣ２を単独で導入し、体細胞胚を時間経過で分析した場合、脂肪酸プロフィールは、逆相関して減少する１８：３Δ９、１２、１５および増加する１８：１Δ９を伴う、さらに胚様であるプロフィールに変化することが発見された（図８）。これらの結果によって、体細胞胚は確実に性質上種子のようになっており、ｐＪＰ１０７のＴ−ＤＮＡの上の遺伝子は発現されたことが示された。これは、体細胞胚システムが、トランスジェニック植物およびそれからの成熟種子を作製する全プロセスを必要とせずに、Ｂ.ナプスのトランスジェニック種子特異的構築物の迅速な性質決定を可能にすることを示した。
【0353】
【表18】
【0354】
体細胞胚を作製するための同一のシステムを用いて、セイヨウアブラナ細胞を別々でｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤで形質転換した。ｍｏｄＢからは１８個、ｍｏｄＤからは２４個である、４２個の胚を得た。全ての脂質を胚から抽出し、脂肪酸組成を分析した。胚は、０％と最大１６．９％との間のＤＨＡを含んでいた（表１９）。０％のＤＨＡの結果は、部分的Ｔ−ＤＮＡのみの組込みまたはゲノムの転写的に不活動な領域への挿入のためであると推定された。総ω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）の総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）に対する比は胚＃２７０に関しては２．３、胚＃２８４に関しては１１．９６であることが分かった。総ω６ＦＡ（ＬＡを含む）の総ω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）に対する比は＃２８４に関して０．０８であった。新ω６ＦＡ（ＬＡを含まない）の新ω３ＦＡ（ＡＬＡを含まない）に対する比は、＃２８４に関しては０．０３であった。全体の転換効率は次のように算出された：（胚＃２７０、＃２８４に関して）ＯＡからＥＰＡ＝１４．０％、２９．８％；ＯＡからＤＨＡ＝９．７％、２４．２％；ＬＡからＥＰＡ＝１５．４％、３０．７％；ＬＡからＤＨＡ＝１０．７％、２５．０％；ＡＬＡからＥＰＡ＝２２．１％、３３．３％；ＡＬＡからＤＨＡ＝１５．３％、２７．０％。これらの効率は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢベクターがＢ.ナプス細胞で良好に機能できることを示したＴ３ ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７アラビドプシス系統に関して観察されたものに類似しており、または、＃２８４の場合は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢベクターがＢ.ナプス細胞で良く機能できることが示されたＴ３ ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７アラビドプシス系統に関して観察されたものよりも大きかった。ＳＤＡ量は３．０％未満であり、Δ６エロンガーゼはＧＡ７構築物よりもさらに良好に作用していたことを示す。＃２８４で達成されたそれぞれの酵素効率は次の通りであった：Δｌ２デサチュラーゼ、９７．４％；ω３−デサチュラーゼ、９２．３％；Δ６デサチュラーゼ、３８．２％；Δ６エロンガーゼ、８８．２％；Δ５デサチュラーゼ、９８．８％；Δ５エロンガーゼ、９４．１％；およびΔ４デサチュラーゼ、８６．３％。総飽和脂肪酸は２１．２％であり、総一価不飽和脂肪酸は１０．２％であり、総多価不飽和脂肪酸は６８．６％であった。
【0355】
発明者らは、下に記載されるさらなるデータを除いて、これまでＢ.ナプス細胞で達成されたなかで、これは一番高い量のＤＨＡであったと考える。これによって、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＢにおける改変は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７と比較して、Δ６デサチュラーゼ遺伝子の発現量を増大するのに効果的であることも実証された。上記のバイナリーベクターｐＪＰ３４１６−ＧＡ７、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＡ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＣ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＤ、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＥおよびｐＪＰ３４１６−ＧＡ７−ｍｏｄＦを３５Ｓ：ＬＥＣ２と同時形質転換し、形質転換Ｂ.ナプス体細胞胚を作製する。ｍｏｄＤ胚では最大７．０％のＤＨＡ、ｍｏｄＥ胚では９．９％のＤＨＡ、ｍｏｄＦ胚では８．３％のＤＨＡ、少数のｍｏｄＧ胚では３．６％のＤＨＡが観察された。
【0356】
【表19】
【0357】
実施例７．ＤＨＡを生産するトランスジェニックＡ．タリアナ種子のＴＡＧの分析形質転換Ａ．タリアナ種子のＴＡＧ上のＤＨＡの位置分布をＮＭＲで決定した。およそ２００ｍｇの種子から、初めにそれらをヘキサン下でつぶし、つぶした種子を、１０ｍＬヘキサンを含むガラス管に移すことで、全ての脂質を抽出した。管をおよそ５５℃の水浴内で温め、次いで撹拌および遠心分離した。ヘキサン溶液を除去し、その手順をさらに４×１０ｍＬで繰り返した。抽出物を１つにまとめ、ロータリーエバポレーションによって濃縮し、ヘキサン中２０ｍＬの７％ジエチルエーテルを用いた短いシリカカラムを通過させることで、抽出脂質内のＴＡＧを極性脂質から精製した。精製ＴＡＧ上のアシル基の位置分布を以前に説明された通り量的に決定した（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、２０１０ａおよびｂ）。
【0358】
分析によって、総種子油中のＤＨＡのほとんどはＴＡＧのｓｎ−１／３位置に位置し、ｓｎ−２位置にはほとんど発見されないことが示された（図９）。これは、５０％のＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）がトランスジェニックキャノーラ油のｓｎ−２位置に位置する一方で、３３％のみが無作為な分布であると予測されることを示したＡＲＡ生産種子のＴＡＧとは対照的である（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。
【0359】
ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７またはｐＪＰ３１１５およびｐＪＰ３１１６の組み合わせで形質転換したＢ.ナプス種子のＴＡＧにおけるＤＨＡの位置分布は基本的に同じ方法で決定される。
【0360】
また、トランスジェニックＡ．タリアナ種子の全ての脂質を３連４重極ＬＣ−ＭＳによって分析し、主要なＤＨＡ含有トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）種を決定した（図１０）。最も多くＤＨＡを含むＴＡＧ種は、ＤＨＡ−１８：３−１８：３（ＴＡＧ５８：１２；位置分布を説明しない命名法）であり、２番目に多いのはＤＨＡ−１８：３−１８：２（ＴＡＧ５８：１１）であることが分かった。低いが検知可能な量ではあるが、Ｔｒｉ−ＤＨＡ ＴＡＧ（ＴＡＧ６６：１８）が総種子油に観察された。他の主要なＤＨＡ含有ＴＡＧ種には、ＤＨＡ−３４：３（ＴＡＧ５６：９）、ＤＨＡ−３６：３（ＴＡＧ５８：９）、ＤＨＡ−３６：４（ＴＡＧ５８：１０）、ＤＨＡ−３６：７（ＴＡＧ５８：１３）およびＤＨＡ−３８：４（ＴＡＧ６０：１０）が含まれていた。２つの主要なＤＨＡ含有ＴＡＧの同一性は、Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳによってさらに確認された。
【0361】
実施例８．Ｂ．ナプス種子でのＤＨＡ生産の予測ＧＡ７遺伝子構築物を用いた、１５％量でのアラビドプシス種子のＤＨＡの効率的な生産を実施例２で実証した。セイヨウアブラナ種子における同じ構築物は、主にこの種のＧＡ７のΔ６でサンチュラーゼ遺伝子の不十分な発現のために、形質転換体の多く（全てではない）で約１．５％のＤＨＡしか生産しなかった（実施例４）。ＧＡ７構築物の改変はΔ６デサチュラーゼ遺伝子発現問題を克服するであろうという認識に基づいて（実施例５を参照、実施例６で実証された）、計算を実施し、ＪＰ３４１６−ＧＡ７の変異形から遺伝子を発現すし、ここで、各導入遺伝子をコードした酵素が、ＧＡ７構築物を有するＡ．タリアナで観察されたのと同じくらい効率的に作用していたＢ.ナプストランスジェニック種子の、あり得る脂肪酸プロフィールを決定した。３つの計算に対して予測される脂肪酸組成（＃１、＃２、＃３）が表２０に示される。これは、５９％オレイン酸、２０％ＬＡおよび８％ＡＬＡを含んでいたＢ.ナプスに関する野生型（非形質転換）脂肪酸組成に基づいた。表の下半分に示される３つの予測された部分的脂肪酸プロフィールは、表の上半分で示される各酵素的工程の転換効率に基づいた。予測＃２では、７５％効率のΔ１２不飽和化、７５％のΔ１５不飽和化、３５％のΔ６不飽和化、８０％のΔ６伸長化、９０％のΔ５不飽和化、９０％のΔ５伸長化および９０％のΔ４不飽和化の組み合わせが、一般的なキャノーラトランスジェニック種子でのおよそ１０％のＤＨＡの生産につながるであろう。これらの効率は全て、アラビドプシスで見られるそれぞれの効率より低いまたはほぼ同じであったため、予測＃２は控えめな推定を意味した。＃３に列挙される転換効率は、ｐＪＰ３４１６−ＧＡ７で形質転換したＡ．タリアナで見られる効率的な転換に基づいた概算である。ＤＨＡは、Ｂ.ナプスで生産される種子油の総脂肪酸含有量の約１５％で生産されると予測され、Ａ．タリアナで観察された最も効率的な生産量を反映した結果であった。ホモ接合状態での複数のＴ−ＤＮＡの挿入は、Ｂ.ナプスでＤＨＡ量を２０％まで増やすと期待される。
【0362】
【表20】
【0363】
実施例９．トランスジェニックＥＰＡ経路の植物葉での安定な発現バイナリーベクター構築
葉組織でのＥＰＡの合成のための植物へのＴ−ＤＮＡ導入のために、バイナリーベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片（配列番号８）を設計した。このバイナリーベクターは、酵素：Ｍ．プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１６）、Ｐ．コルダタΔ６エロンガーゼ（配列番号：２５）およびＰ．サリナΔ５デサチュラーゼ（配列番号３０）をコードするキメラ遺伝子を含んでおり、それぞれは、ＣａＭＶ３５ＳおよびＡ．タリアナＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーターの制御下であった（図９）。配列番号２の領域１９９〜１０８７８を合成し、これをＢｓｉＷＩおよびＫａｓＩ部位で受容バイナリーベクターｐＯＲＥ０４（Ｃｏｕｔｕ ｅｔ ａｌ．、１９９７）内にクローニングすることで、バイナリーベクターを作製した。３つの脂肪酸生合成遺伝子は、ＡＬＡ、１８：３Δ９、１２、１５からＥＰＡ、２０：５Δ５、８、１１、１４、１７に変換するのに必要な酵素をコードした。
【0364】
Ｎ．ベンサミアナ（ベンサミアナタバコ）葉細胞でのＥＰＡ構築物の一過性発現構築物が正しく、葉組織で効率的に遺伝子を発現することを試験するために、キメラベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片をＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。キメラベクター３５Ｓ：ｐ１９もＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に実施例１で説明された通り導入した。これらの培養物からの細胞を、２４℃の成長室でベンサミアナタバコ植物の葉組織内に浸潤させた。同じ葉の両面に位置する比較中の試料に、複数の直接比較物を湿潤させた。実験は３通りで実施された。浸潤に続いて、実施例１に説明されるＧＣによる脂肪酸プロフィール分析のために葉ディスクを取り出す前に、植物をさらに５日間成長させた。ＧＣ分析によって、ＥＰＡベクターはベンサミアナタバコ葉で機能してＥＰＡを生産し（表２１）、最も高い量のＥＰＡは総葉脂質の１０．７％であったことが明らかになった。
【0365】
ニコチアナ・タバカムの安定的形質転換キメラベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ＿ササゲ＿ＥＰＡ＿挿入断片を使って、ニコチアナ・タバカムを安定に形質転換した。ベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に標準的なエレクトロポレーション手法を介して導入した。形質転換した細胞を、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（２５ｍｇ／Ｌ）を添加した固相ＬＢ培地で成長させ、２８℃で２日間インキュベートした。単一のコロニーを用いて新しい培養を開始した。４８時間の活発な培養に続いて、細胞を２，０００ｘ ｇでの遠心分離によって回収し、上澄みを除去した。細胞を５０％ＬＢおよび５０％ＭＳ培地をＯＤ６００＝０．５の密度で含む新しい溶液に再懸濁した。
【0366】
【表21】
【0367】
インビトロで成長させたＮ．タバカム品種Ｗ３８の葉試料を鋭いメスで切除し、サイズ約０．５〜１ｃｍ２の正方形の断片に切り、一方でＡ．ツメファシエンス溶液に浸した。Ａ．ツメファシエンスに浸した、傷をつけたＮ．タバカム葉断片を、滅菌フィルター紙上にブロットして乾燥し、および添加物なしのＭＳプレートに移動する前に、室温で１０分間放置させた。２４℃での２日間の同時培養期間に続いて、外植片を滅菌の液体ＭＳ培地で３回洗浄し、次いで滅菌フィルター紙でブロットして乾燥し、１．０ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．２５ｍｇ／Ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムを添加した選択ＭＳ寒天上に置いた。プレートを２４℃で２週間インキュベートし、形質転換Ｎ．タバカム葉断片を発芽させた。
【0368】
インビトロで根のついたトランスジェニック植物を作るために、健康な若芽を切断し、２５μｇ／ＬのＩＡＡ、５０ｍｇ／Ｌノカナマイシンおよび２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを添加したＭＳ寒天培地を含む２００ｍＬの組織培養ポットに移した。トランスジェニック芽を室温で根付かせ成熟するまで成長させた後、土壌に移した。十分大きな葉ディスクを２１個の成熟トランスジェニック植物から取り、実施例１に記載される通りに脂肪酸プロフィールを分析した。全てのトランスジェニック試料がＥＰＡを含むことが分かり（表２１）、ヘミ接合の１次形質転換体で最も高い量のＥＰＡは総葉脂質の１２．１％であることが分かった。葉試料は、それらの脂質の中に少量（０．５％未満）のＤＰＡも含み、これは、Δ６エロンガーゼの低量のΔ５伸長活性によるＥＰＡの伸長に起因した。総ω３ＦＡ（ＡＬＡを含む）のω６ＦＡ（ＬＡを含む）に対する比は、２．７であることが分かった。全体的な転換効率は次のように算出された：ＯＡからＥＰＡ＝１８．４％、ＬＡからＥＰＡ＝１８．９％、ＡＬＡからＥＰＡ＝２５．９％。１２．１％のＥＰＡの生産は、特にその事象がヘミ接合の１次転換体であったため、注目すべきである。特にＡＬＡからＥＰＡへの効率は、安定種子形質転換体で観察されたものに近い。構築物がΔ１２またはΔ１５デサチュラーゼを含んでおらず、ＯＡおよびＬＡからＡＬＡへの転換を増大したのは注目に値する。増加した効率はこれらの活性の加算で予測される。
【0369】
ヘミ接合形質転換体の種子は回収され、ホモ接合植物を作製するために植え付けされている。
【0370】
上部ＥＰＡ系統にセットされた種子は正常に見え、系統＃１０および＃１７からの種子は良く発芽し、Ｔ２世代を確立した。ＥＰＡの無効（ＥＰＡ無し）系統に対する比は、事象＃２８が単一遺伝子座であることを示し、したがってこの系統のＴ３世代も確立した。Ｔ３群の脂肪酸プロフィール分析は、導入遺伝子が、無効事象は一切見つからず、安定した量のＥＰＡを伴ったホモ接合であったことを示した。全体のＴ３群の総葉脂質におけるＥＰＡの平均量は、９．４％±０．３（表２２）であることが分かった。
【0371】
【表22】
【0372】
ホモ接合Ｔ３Ｎ．タバカム植物の葉試料をさらに生化学分析に供した。全ての脂質を凍結乾燥した葉材料から抽出し、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分画化した。ＥＰＡはＮ．タバカムＴＡＧに最大３０．１％で、ならびに、極性脂質に６．３％で存在したことが分かった（表２３）。トランスジェニック経路によって生産されるＥＰＡが、ＴＡＧ、ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＳＱＤＧ、ＰＧ、ＰＣ、ＰＥ、ＰＩおよびＰＳを含む評価された総脂質分画に存在したことに留意するのは興味深い。総脂質プールは、低量の新規中間体またはω６ＬＣ−ＰＵＦＡ脂肪酸を、新規ω３のω６脂肪酸に対するＴＡＧ比が１０：１の状態で含んでいた。
【0373】
ササゲの安定的形質転換キメラベクターｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢ ＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片をササゲ（ビグナ・ウンギクラタ）に次の通りに形質転換した。成熟した乾燥種子が好ましい出発材料であるが、種子が最大新鮮重量である未熟なさやから回収した種子を使用してもよい。乾燥種子を手で脱穀し、種子の皮が破けるのを避け、したがって、微生物との混入を低減する。
【0374】
乾燥種子または未熟なさやを７０％エタノールに２分間浸し、次いで、２０％の市販の漂白剤（８．４ｇ／Ｌの次亜塩素ナトリウム最終濃度）で３０分間処理する。種子を次いで滅菌水で複数回洗浄する。未熟な種子をさやから無菌的に取り除き、一方で成熟種子を一晩水に浸した。２つの異なる外植片を、複数の芽作製のために使用し得、すなわち、胚軸および子葉そのもの、好ましくは二分した胚軸が付着した子葉である。芽および根端を、子葉節、すなわち、軸の子葉への付着点に傷をつける前に、軸から取り除く。１９個の品種および系統の初期比較から、ササゲのほとんどの系統は形質転換され得ることが現在明確であり、唯一の注意は異なる組織培養条件が各系統のために最適化される必要があるということである。
【0375】
【表23】
【0376】
選択マーカー遺伝子、ｂａｒまたはＮｐｔＩＩが形質転換のために使用され得る。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１はササゲ形質転換に好ましい株である。ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片ベクターを含むアグロバクテリウムを１８０ｒｐｍの振とう器で２８℃にて一晩培養し、懸濁物を８０００ｇで１０分間遠心分離にかけ、培地１（１０分の１に希釈し、３０ｇ／ｌのスクロース、加圧滅菌の前にｐＨ５．６に調節し、フィルターを滅菌したＭＳ−ビタミンを添加した２０ｍＭの２−ＭＥＳ、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、１．７ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．２５ｍｇ／ｌのＧＡ３、０．２ｍＭのアセトシリンゴン、２５０ｍｇ／ｌの1423706895449_1
、１５０ｍｇ／ｌのジチオスレイトールおよび０．４ｇ／ｌのＬ−システインを含むＭＳ塩基性培地）に再懸濁する。メスで分裂領域に傷をつけてから、外植片を振らずに細菌懸濁物に１時間浸す。処理した外植片を次いで滅菌フィルター紙上にブロットし、フィルター紙をかけた固定培地２（０．８％寒天を含む培地１）に移す。同時培養の４日後、発芽および形質転換した芽の選択のために、外植片を培地３（１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、１５０ｍｇ／ｌのチメンチン、３０ｇ／Ｌのスクロース、３ｍＭのＭＥＳ、１．７ｍｇ／ＬのＢＡＰ、５ｍｇ／ＬのＰＰＴまたは２５〜５０ｍｇ／Ｌのジェネテシンまたは１５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、０．８ｇ／Ｌの寒天を添加し、ｐＨ５．６に調節した全強度ＭＳ培地）に移す。２週間後、初めの芽が見られる。子葉を子葉節領域から取り除き、培養物を新しい培地３に移す。死組織および瀕死の組織の除去に続いて、２週間ごとに培養物を新しい培地３に移す。初めの４つの継代培養物はカナマイシン選択上にあり、続いてジェネテシンおよびカナマイシンと交互にする。６継代培養後、生き残った若芽を、芽伸長のために、培地４（ＢＡＰを含まないが０．５ｍｇ／ｌのＧＡ３、５０ｍｇ／ｌのアスパラギン、０．１ｍｇ／ｌの３−インドール酢酸（ＩＡＡ）、１５０ｍｇ／ｌのチメンチンおよびＰＰＴ（１０ｍｇ／１）、ジェネテシン（５０ｍｇ／Ｌ）またはカナマイシン（１５０ｍｇ／Ｌ）のいずれかを添加した培地３）に移す。それぞれの芽が１ｃｍの長さを超えるまで芽を２週間ごとに継代培養する。選択下でのさらなる成長のために、より大きなこれらの芽をペトリ皿から培養瓶（高さ８０ｍｍ）に移す。
【0377】
再生した芽の大部分はインビトロで根を下ろし得、根を下ろした植物を土壌に移し、周囲室温条件に移す前に１４〜２１日間高湿度室で根付かせた。
【0378】
ササゲへの遺伝子移転を高めるために、同時培養培地にチオール化合物を添加した。Ｌ−システイン、ジチオスレイトールおよびチオ硫酸ナトリウムの添加によって傷をつけた組織の褐色化を緩和する。
【0379】
大量のササゲ外植片を単純化したプロトコルで処理してもよい。簡潔に、該プロトコルは次の工程から成る：滅菌化成熟種子を一晩水に浸す、その結果、その種子を縦に二分化することで外植片を導く、割れた胚軸（芽および根尖部は取り除かれている）は子葉にまだ付着している、分裂領域を局所的に傷つけることで補助されるアグロバクテリウム株ＡＧＬ１との感染、チオール化合物を含む培地上で２５℃にて光をうけて４日間にわたる同時培養、選択剤を含む培地上での発芽および芽の伸長、芽はインビトロで根付き、開花および結実のために室温条件へ移す、推定トランスジェニック植物のＰＣＲまたは酵素分析、ならびに、ＰＣＲまたは酵素活性による次世代子孫のスクリーニング。
【0380】
トランスジェニックＴ０植物の子孫は、表現型では正常である。導入遺伝子を子孫に伝え、ホモ接合Ｔ２植物を、それらのＴ３子孫を酵素活性に関してまたはＰＣＲによってスクリーニングすることで同定する。
【0381】
この形質転換システムを用いて１０００の外植片あたり約１０個のトランスジェニック植物を作製し、これは、他のマメ科植物の形質転換頻度に類似している。形質転換される品種または系統によって、このプロトコルは、外植片調製からＴ１種子回収まで、５〜８か月を必要とする。
【0382】
形質転換システムを使ってｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片バイナリーベクターを再生、形質転換ササゲ植物に導入する。
【0383】
ｐＯＲＥ０４＋１１ＡＢＧＢＥＣ−ササゲ−ＥＰＡ−挿入断片バイナリーベクターに対し、Δ５エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼをコードする遺伝子を加える修飾を行い、生産したＥＰＡをＤＨＡにさらに変換する能力を与える遺伝子構築物を提供する。栄養組織でのＤＨＡの生産のために、構築物を植物へ形質転換する。
【0384】
化学的選択を生き延びた少数の事象にＥＰＡが存在することが分かった。最も高い系統は、総葉脂質中７．１％±０．２のＥＰＡ含んでいた。形質転換の速度は、６つの系統のみトランスジェニックが確認されたササゲに関して普段経験されるよりも低かった。何がこの結果をもたらしたのかは今のところはまだ分からないが、普段の大きさよりも大きいトランスジェニック事象が、不完全なＴ−ＤＮＡ領域を含んでいたことに留意するのは興味深い。大きな構築物のサイズが効率の低下に寄与した可能性がある。３つの各トランスジェニック酵素の見かけの転換効率も算出した（表２２）。天然ＡＬＡの初期Δ６不飽和化後のＥＰＡへの良好な転換を伴い、結果は全３つの種においておおむね類似した。特定のΔ５エロンガーゼの不在にもかかわらず、ＥＰＡからＤＰＡへのΔ５伸長が多少あったことが留意された。Ｐ．コルダタΔ６エロンガーゼは以前、低量のΔ９エロンガーゼ活性（すなわち、１８：３Δ９、１２、１５から２０：３Δ１１、１４、１７への転換）を有すると示されてきたが、酵母菌アッセイではΔ５エロンガーゼ活性は一切検知されなかった。
【0385】
実施例１０．Δ１２デサチュラーゼ遺伝子の差異の試験バイナリーベクター作製
一連のキメラΔ１２デサチュラーゼ遺伝子を試験および比較する試みとして、複数のバイナリーベクターを作り、これらを使用してＡ．タリアナおよびＢ.ナプスを形質転換した。バイナリーベクターｐＪＰ３３６５、ｐＪＰ３３６６、ｐＪＰ３３６７、ｐＪＰ３３６８およびｐＪＰ３３６９はそれぞれ、Ｐ．パストリスω３デサチュラーゼ（配列番号１２）およびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼ（配列番号１６）酵素、および一連のΔ１２デサチュラーゼの１つを含んでいた。Δ１２デサチュラーゼはクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）（ｐＪＰ３３６５において受託番号ＸＰ＿５７０２２６）由来であり、遺伝子活性を増大する試みとしてＬ１５１Ｍ突然異変（ｐＪＰ３３６６において）、ラカンセア・クルイベリ（ｐＪＰ３３６７において配列番号１０）、シネコシスティスＰＣＣ６８０３（ｐＪＰ３３６８において受託番号ＢＡＡ１８１６９）およびクレピス・パラエスチナ（Ｃｒｅｐｉｓ ｐａｌａｅｓｔｉｎａ）（ｐＪＰ３３６９において受託番号ＣＡＡ７６１５７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、１９９８）を含んだクリプトコッカス・ネオフォルマンスΔ１２デサチュラーゼのバージョンである。クレピスデサチュラーゼはこの一連の中で唯一の植物デサチュラーゼであり；他は真菌酵素であった。野生型であったクレピス・パレスチナΔ１２デサチュラーゼを除いた、各Δ１２デサチュラーゼのための植物コドン最適化タンパク質コード領域を、ＦＰ１プロモーターに操作可能に結合して各デサチュラーゼの種子特異的発現を提供する配向で、ベクターｐＪＰ３３６４のＮｏｔＩ部位に挿入することで、ベクターを作った（図１２参照）。ベクターｐＪＰ３３６４は、それぞれが種子特異的プロモーターの制御下にあるＰ．パストリスω３デサチュラーゼおよびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼをコードするキメラ遺伝子をすでに含んでいた（図１２）。３つの脂肪酸生合成酵素、すなわちΔ１２デサチュラーゼ、ω３デサチュラーゼおよびΔ６デサチュラーゼの組み合わせを、オレイン酸（１８：１Δ９）からＳＤＡ（１８：４Δ６、９、１２、１５）に変換する経路を構築するよう設計した。したがって、アッセイを実行し、形質転換種子のＳＤＡ生産量を測定した。
【0386】
Ａ．タリアナおよびＢ.ナプス形質転換および分析キメラバイナリーベクターをＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入し、形質転換したアグロバクテリウムの培養物からの細胞を用いて、形質転換のためにフローラルディップ方法を利用してｆａｄ２変異体Ａ．タリアナ植物を形質転換した（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）。成熟後、処理した植物のＴ１種子を回収し、各キメラベクターのＴ−ＤＮＡ上に存在するＮｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子を有する小植物の選択のために、カナマイシンを含むＭＳプレート上にプレート化した。生き残ったＴ１実生を土壌に移した。植物を自家受精させ、成熟するまで成長させた後、これらの植物からのＴ２種子を回収し、種子脂質の脂肪酸組成をＧＣによって分析した。
【0387】
キメラベクターｐＪＰ３３６７も使用して、実施例４に記載される方法でＢ.ナプスを形質転換し、１２個のトランスジェニック事象を作製した。ＳＤＡは、植物のプール化した種子のうち０．６％から２．２％の範囲で見つかり、最も高いＳＤＡトランスジェニック植物を有するトランスジェニック植物から、９個の別個の種子を脂肪酸組成に関して分析した。そのような分析の脂肪酸組成データは表２４に示される。
【0388】
データによって、双方のＡ．タリアナおよびＢ.ナプスにおけるＴ−ＤＮＡのそれぞれから発現されるΔ１２デサチュラーゼ活性は、予想に反して低く、ＧＡ７構築物の同じ発現カセットで見られた７０〜８０％（実施例２および３）ではなく約２０％の酵素転換効率をもたらしたことが示された。これらのベクターからのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子の比較的不十分な発現の理由は不明であるが、全体の構築物での遺伝子の位置に関連し得る。
【0389】
対照的に、ＲＴ−ＰＣＲ発現分析は、Ｔ−ＤＮＡ上のＰ．パストリスω３デサチュラーゼおよびＭ．プシラΔ６デサチュラーゼ遺伝子は形質転換種子で比較的良好に発現されたことを示した。表２４には、形質転換種子のΔ６デサチュラーゼ転換効率が含まれ、これは、あるＢ.ナプス形質転換系統では約１１％〜約２５％の範囲であった。これは、ＧＡ７構築物で形質転換したＢ.ナプス種子で見られた約７％のΔ６デサチュラーゼの転換効率よりも著しく高かった（実施例４）。
【0390】
【表24】
【0391】
したがって、ｐＪＰ３３６７のＴ−ＤＮＡによってもたらされたより高いΔ６デサチュラーゼ転換効率を活用するために、このＴ−ＤＮＡで形質転換されたＢ.ナプス植物をｐＪＰ３４１６−ＧＡ７のＴ−ＤＮＡで形質転換した植物（実施例４）と交雑させ、双方のＴ−ＤＮＡを保有する後代植物および種子を作製した。Ｆ１種子から抽出された油の脂肪酸組成を、ＤＨＡ含有量および他の脂肪酸含有量に関してＧＣで分析する。増加したＤＨＡ量が、Δ６デサチュラーゼの増加した発現の結果として観察される。双方のＴ−ＤＮＡにとってホモ接合である植物を作製し、該植物はより高い量のＤＨＡを生産するはずである。
【0392】
実施例１１．サイレンシング抑制因子タンパク質を用いることによる、脂肪酸の蓄積の増大バイナリーベクターの構築
国際公開第２０１０／０５７２４６号で、植物の種子における導入遺伝子発現を増大させるためのサイレンシング抑制因子タンパク質（ＳＳＰ）の使用が説明される。そのようなタンパク質が、複数の世代にわたって
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のＬＣ−ＰＵＦＡの生産を強化および安定させ得ることを実証するために、複数のＳＳＰ、すなわち、Ｖ２（受託番号ＧＵ１７８８２０．１）、ｐ１９（受託番号ＡＪ２８８９４３．１）、ｐ３８（受託番号ＤＱ２８６８６９．１）およびＰ０ＰＥ（受託番号Ｌ０４５７３．１）を試験のために選択した。ｐ１９は、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）由来の抑制因子タンパク質であり、これは、２１個のヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡが相同ＲＮＡのアルゴノート誘導切断を誘導する前に、２１個のヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡに結合する（Ｖｏｉｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．、２００３）。トマト黄化葉巻ウイルス（ＴＹＬＣＶ）由来の抑制因子タンパク質であるＶ２は、ｓｓＲＮＡ基質から二本鎖ＲＮＡ中間体を生成するのに必要であると考えられるタンパク質である（Ｂｅｃｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００２）、植物タンパク質ＳＧＳ３に結合し（Ｇｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、２００８）、または、５’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ構造に結合する（Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．、２００９）。ｐ３８は、ダイサーまたはアルゴノートタンパク質に結合することによって植物サイレンシングメカニズムに干渉する、ターニップクリンクルウィルス（ＴＣＶ）由来の抑制因子タンパク質である（Ａｚｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。ポレロウイルス由来の、Ｐ０ＰＥおよびＲＰＶ−Ｐ０といったＰ０タンパク質は、強化した分解のためにアルゴノートタンパク質を標的とする（Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、２００７；Ｂｏｒｔｏｌａｍｉｏｌ ｅｔ ａｌ．、２００７、Ｆｕｓａｒｏ ｅｔ ａｌ．、２０１２）。したがって、ＬＡ（１８：１Δ９、１２）からＡＲＡ（２０：４Δ５、８、１１、１４）への生産のための一連の脂肪酸生合成遺伝子と組み合わせて、植物種子でのこれらＳＳＰの発現のために、遺伝子構築物を次のように調製した。
【0393】
イソクリシス・ガルバナΔ９エロンガーゼおよびパブロバ・サリナΔ８およびΔ５デサチュラーゼをコードする脂肪酸生合成遺伝子および細菌選択マーカーを、９５６０ｂｐ断片を生じるＰｍｅｉおよびＡｖｒＩＩでの消化によって、ｐＪＰ３０１０の単一ＤＮＡ断片上で得た。この断片上のΔ９エロンガーゼコード領域をＡ．タリアナＦＡＥ１プロモーター（ｐＡｔＦＡＥ１）およびコンリニン転写終結／ポリアデニル化領域（ＬｕＣｎｌ２−３’）に結合させた。デサチュラーゼコード領域をそれぞれ切断ナピンＦＰ１プロモーター（ｐＢｎＦＰ１）およびｎｏｓ３’転写終結／ポリアデニル化領域に結合させた。この断片上の３つの脂肪酸生合成遺伝子をｐＪＰ１０７と同じ方法で方向付けおよびスペース配置し（Ｐｅｔｒｉｅ ｅｔ ａｌ．、２０１２）、ｐＪＰ１０７と同じタンパク質をコードさせた。ＤＮＡ断片はまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐＣＷ１４１（国際公報第２０１０／０５７２４６号を参照）のｐＦＰ１：ＧＦｉＰ：ｎｏｓ３’遺伝子を含んでいた。このスクリーニング可能なマーカー遺伝子を、視覚的な種子特異的マーカーとして使用し、単純および非破壊的な同定が可能になり、それによって、その遺伝子を含み発現するトランスジェニック種子の選択が可能になった。
【0394】
それぞれが異なるＳＳＰ遺伝子を含む一連の５つのベクター（国際公報第２０１０／０５７２４６号）のそれぞれのＰｍｅＩ−ＡｖｒＩＩ部位にＰｍｅＩ−ＡｖｒＩＩ断片を挿入し、ｐＦＮ０４５、ｐＦＮ０４６、ｐＦＮ０４７、ｐＦＮ０４８およびｐＦＮ０４９と指定した遺伝子構築物をもたらした。これらは、ＳＳＰのＰ０ＰＥ、ｐ３８、ｐ１９、３５Ｓ：Ｖ２およびＶ２をそれぞれコードする遺伝子を含む。各ＳＳＰ遺伝子は、Ｖ２コード領域が恒常的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下である構築物ｐＦＮ０４８を除いて、ＦＰ１プロモーターおよびｏｃｓ３’転写終結／ポリアデニル化領域の制御下にあった。各例のＳＳＰ遺伝子は構築物のＴ−ＤＮＡ領域内にあり、Ｔ−ＤＮＡの右境界（ＲＢ）に隣接した。ｐＦＮ０４５をＡｈｄＩおよびＮｈｅＩで消化し、続いてＤＮＡリガーゼで再環状化してＦＰ１：Ｐ０ＰＥ遺伝子を欠失することによって、いずれのＳＳＰコード配列も欠如した第６の構築物、ｐＦＮ０５０を作った。６つの各構築物は、Ｔ−ＤＮＡ内およびＴ−ＤＮＡの左境界に隣接したＮｐｔＩＩ選択マーカー遺伝子を含んだ。構築物は全てアグロバクテリウムのプラスミドの維持のためのＲＫ２複製開始点を有した。
【0395】
ＳＳＰと組み合わせたＡＲＡ発現ベクターとのＡ．タリアナの形質転換その種子脂質において高いリノール酸量を有するｆａｄ２／ｆａｅ１二重変異体である、アラビドプシスの遺伝子型ＭＣ４９を形質転換するために、フローラルディップ方法によって（ＣｌｏｕｇｈおよびＢｅｎｔ、１９９８）、６つの各構築体ｐＦＮ０４５〜ｐＦＮ０５０で個別に形質転換したＡ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１で、植物を処理した。処理した植物を成熟するまで成長させ、それらから回収したＴ１種子を、カナマイシンを含むＭＳ培地上にプレートし、形質転換したＴ１種子を選択した。種子のＧＦＰ発現のスクリーニングも、形質転換Ｔ１種子のための視覚的なマーカーとして使用した。ＭＳ／Ｋａｎプレート上に生き残った、または、ＧＦＰ陽性種子から得た実生を土壌に移し、Ｔ２種子のために成熟まで成長させた。得られた形質転換植物の数は、ｐＦＮ０４５、ｐＦＮ０４６、ｐＦＮ０４７、ｐＦＮ０４８、ｐＦＮ０４９およびｐＦＮ０５０との形質転換でそれぞれ５、１４、３２、８、２３および２４であった。この段階で、ｐＦＮ０４６にｐ３８をコードする遺伝子は機能的ではないことが分かり、したがって、ベクターｐＦＮ０４６で形質転換した植物を追加対照、すなわち、ｐＦＮ０５０と基本的に同じであると見なした。
【0396】
ＦＡＭＥ調製およびＧＣ分析による種子脂質の脂肪酸組成決定のために、各形質転換植物から約１００個のプール化したＴ２種子を取り出した。各トランスジェニック系統からの６つのＴ２実生も成長させ、Ｔ３種子を作製した。
【0397】
Ｔ２種子から抽出した全ての脂質における脂肪酸組成を、ＧＣを用いて決定した。分析によって、ある範囲のＡＲＡならびにＴ２群の中間体ＥＤＡ（２０：２ω６）およびＤＧＬＡ（２０：３ω６）の量が示された。ＡＲＡに関するデータが図１３および１４に示される。
【0398】
図１３は、Ｔ２種子の群の脂質におけるＡＲＡ量のボックスプロット分析を示す。ＡＲＡ生合成遺伝子に加えてＦＰ１：ｐ１９および３５Ｓ：Ｖ２遺伝子を含む種子群のＡＲＡの中央（５０パーセンタイル）値は、ＳＳＰ遺伝子を含まないｐＦＰ０５０の欠陥ＦＰ１：ｐ３８遺伝子または対照Ｔ−ＤＮＡ含む種子よりも、著しく高かった。ｐ１９およびＶ２をコードする遺伝子で形質転換した種子に関する平均ＡＲＡ量は、ｐ３８遺伝子で形質転換した種子またはＳＳＰを持たない種子に関してよりも多かった（図１４）。１つのＦＰ１：ｐ１９およぶ２つのＦＰ１：Ｖ２系統は、約１９％、２０％および２３％のＡＲＡをそれぞれ示した。これらは異常値であり、したがって、ボックスプロット分析の計算には含まれなかった。遺伝子ＦＰ１：Ｐ０ＰＥおよび３５Ｓ：Ｖ２を含むＴ−ＤＮＡで形質転換した植物は、他の構築物と比べてより少ない数で生き残った；これらの遺伝子はＭＣ４９背景では植物の健康に有害であり得ると考えられる。
【0399】
構築物の中でＡＲＡ量が著しく異なるだけでなく、ＬＡからＡＲＡの経路の第１の中間体、すなわちＥＤＡ（２０：２ω６）の種子脂質における量もＶ２またはｐ１９を発現する系統において、ＳＳＰを欠如するまたはｐ３８構築物を含む種子よりも低く観察された（図１５）。Ｔ３種子では、ｐ１９を発現する構築物を含む１つの群は種子脂質中の総脂肪酸のパーセンテージとしての３８％のＡＲＡを示した。
【0400】
ある範囲のトランスジェニックＴ３系統をＴ４世代まで進ませた。Ｖ２を発現するＴ４種子のＡＲＡの量は、前の世代に比べて同じであるか、または、それらのＴ３親に比べて増加した量を確実に示すかのいずれかであった（図１６）。ｐ１９を発現する系統は、さらにばらつきのあるＡＲＡ量を示した。ＡＲＡ量はいくつかの系統では低下した一方で、他ではＴ３親と比較して同じまたは増加していた。対照的に、欠陥ｐ３８遺伝子を含む、または、ＳＳＰを欠如する系統は、一般的にＡＲＡの量の低下および中間体の量の増加を示した（図１８）。これらの系統のいくつかでは、ＡＲＡは約１％まで低下し、ＥＤＡの量は約２０％まで増加した。Ｔ４種子のＡＲＡの平均量は、ｐ３８を発現する、または、ＳＳＰを欠如する系統と比べて、ｐ１９およびＶ２を発現する系統に関してより高かった（図１７）。
【0401】
この実験によって、ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成経路のための遺伝子をさらに一緒に伴うトランスジェニック植物の種子におけるＳＳＰの発現は、子孫の第１世代にて所望する脂肪酸の生産量を増加しただけでなく、子孫の第３または第４世代といった後代の世代での脂肪酸生産量を安定させた。増加した脂肪酸生産は、生合成経路での中間脂肪酸の量の低下を伴った。種子特異的プロモーターから発現されるＳＳＰのｐ１９およびＶ２が好ましかった。ｐ３８ ＳＳＰを発現するように設計された構築物は欠陥であり、この構築物では有効なデータは一切得られなかった。他のウイルス由来のＶ２ ＳＳＰおよびそのホモログは、特に好ましいと考えられ、なぜなら、これらは生合成経路遺伝子の最大発現および発育中の種子の同一細胞内での他の遺伝子の同時サイレンシングを可能にするからである。
【0402】
実施例１２．油中のステロール含有量および組成のアッセイオーストラリアの商業的供給源から購入した１２個の植物油試料の植物ステロールを、実施例１に記載される通り、ＧＣおよびＧＣ−ＭＳ分析によってＯ−トリメチルシリルエーテル（ＯＴＭＳｉ−エーテル）として特徴づけた。保持データ、質量スペクトルの解釈ならびに文献および実験室標準質量スペクトルとの比較によってステロールを同定した。ステロールを、５β（Ｈ）−コラン−２４−オール内部標準の使用によって定量化した。基本的な植物ステロール構造および同定ステロールのいくつかの化学構造が図１９および表２５に示される。
【0403】
分析した植物油は：ゴマ（セサマム・インディカム（Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ））、オリーブ（オレア・エウロパエア）、ヒマワリ（ヘリアンサス・アヌス）、トウゴマ（リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ））、キャノーラ（セイヨウアブラナ）、ベニバナ（カーサマス・ティンクトリアス（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、ピーナッツ（アラキス・ヒポガエア（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、アマ（リヌム・ウシタティスシムム）およびダイズ（グリシン・マックス）由来である。全油試料のうち、主要な植物ステロールは相対存在量が多い順で：β−シトステロール（総ステロール含有量の２８〜５５％に及ぶ）、Δ５−アベナステロール（イソフコステロール）（３〜２４％）、カンペステロール（２〜３３％）、Δ５−スチグマステロール（０．７〜１８％）、Δ７−スチグマステロール（１〜１８％）およびΔ７−アベナステロール（０．１〜５％）であった。他のマイナーな複数のステロールを同定し、それらは：コレステロール、ブラシカステロール、カリナステロール、カンペスタノールおよびエブリコールであった。４つのＣ２９：２および２つのＣ３０：２ステロールも検知されたが、これらのマイナーな成分の同定を完成するには研究がさらに必要である。加えて、油のいくつかには他の同定されなかったステロールが複数存在したが、それらの大変低い存在量のために、質量スペクトルはそれらの構造の同定が可能になるほど十分強くなかった。
【0404】
油のｍｇ／ｇとして表されるステロール含有量は、多い量の順で：キャノーラ油（６．８ｍｇ／ｇ）、ゴマ油（５．８ｍｇ／ｇ）、アマ油（４．８〜５．２ｍｇ／ｇ）、ヒマワリ油（３．７〜４．１ｍｇ／ｇ）、ピーナッツ油（３．２ｍｇ／ｇ）、ベニバナ油（３．０ｍｇ／ｇ）、ダイズ油（３．０ｍｇ／ｇ）、オリーブ油（２．４ｍｇ／ｇ）、トウゴマ油（１．９ｍｇ／ｇ）であった。％ステロール組成および総ステロール含有量が表２６に示される。
【0405】
【表25】
【0406】
全種子油試料の中で、主要な植物ステロールは一般的にβ−シトステロール（総ステロール含有量の３０〜５７％に及ぶ）であった。他の主要なステロールの割合では、油間で大きな幅があった：カンペステロール（２〜１７％）、Δ５−スチグマステロール（０．７〜１８％）、Δ５−アベナステロール（４〜２３％）、Δ７−スチグマステロール（１〜１８％）。異なる種の油は異なるステロールプロフィールを有し、いくつかは大変特徴的なプロフィールを有していた。キャノーラ油の場合、キャノーラ油は一番大きな割合のカンペステロール（３３．６％）を有し、一方で、他の種の試料は一般的により低い量を有し、たとえば、ピーナッツ油では最大１７％であった。ベニバナ油は比較的大きな割合のΔ７−スチグマステロール（１８％）を有する一方で、このステロールは通常他の種の油では低く、ヒマワリ油では最大９％である。ステロールプロフィールは各種に対して特有であるので、したがって、ステロールプロフィールを使用して特定の野菜または植物油の同定を助け、および、純種性および他の油との不純物混和を確認し得る。
【0407】
表２６．アッセイした植物油のステロール含有量および組成
【0408】
【表26】
【0409】
ヒマワリおよびベニバナそれぞれの２つの試料を比較し、各場合で、１つは種の冷圧によって作製し、精製しておらず、一方で、他方は冷圧せず、精製した。いくつか違いが観察されたものの、２つの油の源は類似したステロール組成および総ステロール含有量を有し、処理および生産はこれら２つのパラメーターには効果をほとんど有さなかったことを示している。試料間のステロール含有量は３倍ばらつき、１．９ｍｇ／ｇから６．８ｍｇ／ｇに及んだ。キャノーラ油は一番高いステロール含有量を有し、トウゴマ油は一番少ないステロール含有量を有した。
【0410】
実施例１３．ｓｎ−２ＴＡＧ位置でのＤＨＡの蓄積の増加本発明者らは、ＴＡＧのｓｎ−２位置でのＤＨＡ蓄積は、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）をＧＡ７構築物またはその変異形によって提供されるようなＤＨＡ生合成経路と一緒に同時発現することで増加し得ることを考察した。好ましいＬＰＡＡＴは、多価不飽和Ｃ２２脂肪アシル−ＣｏＡに基質として作用するものであり、内因性ＬＰＡＡＴに比べ、ＰＡを形成するＬＰＡのｓｎ−２位置での多価不飽和Ｃ２２鎖の挿入の増加につながる。細胞質ＬＰＡＡＴ酵素はしばしば、特にその種がＴＡＧにて異常な脂肪酸を合成および蓄積する場合、様々な基質の好みを示す。リムナンテス・ダグラシー（Ｌｉｍｎａｎｔｈｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）由来のＬＰＡＡＴ２は、ＰＡ合成のためにエルコイル−ＣｏＡ（Ｃ２２：１−ＣｏＡ）を基質として用いることが示され、これは、Ｃ２２基質を使用し得ない同じ種由来のＬＰＡＡＴ１とは対照的であった（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．、２００２）。
【0411】
公知のＬＰＡＡＴを企図し、試験のために複数を選択し、ｓｎ−２位置でＤＨＡの取り込みを増加することが期待されないものがいくつか対照として含まれた。公知のＬＰＡＡＴには：シロイヌナズナＬＰＡＡＴ２：（配列番号６３、受託番号ＡＢＧ４８３９２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２００５）、リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ（配列番号６４、受託番号ＡＡＣ４９１８５、Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９５）、サッカロマイセス・セレビシエＳｌｃｌｐ（配列番号６５、受託番号ＮＰ０１０２３１、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．、１９９７）、モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ１（配列番号６７、受託番号ＡＥＤ３３３０５；米国特許第７８７９５９１号）およびＢ.ナプスＬＰＡＡＴ（配列番号６８および配列番号６９、それぞれ受託番号ＡＤＣ９７４７９およびＡＤＣ９７４７８）が含まれた。これらを選択してＬＰＡＡＴ酵素の３つのグループを包含した：１）異常な長鎖多価不飽和脂肪酸に対して通常低活性を有する対照植物種子ＬＰＡＡＴ（アラビドプシスおよびブラシカＬＰＡＡＴを含む）、２．基質としてＣ２２アシル−ＣｏＡ、この場合エルカ酸Ｃ２２：１を用いることでＣ２２脂肪酸に作用することが以前に実証されたＬＰＡＡＴ（リムナンテスおよびサッカロマイセスＬＰＡＡＴを含む）、３．ＥＰＡおよびＤＨＡといった長鎖多価不飽和脂肪酸を基質として使用できる可能性が高いと発明者らが考えるＬＰＡＡＴ（モルティエレラＬＰＡＡＴを含む）。
【0412】
アラビドプシスＬＰＡＡＴ２（ＬＰＡＴ２とも呼ばれる）はＣ１６およびＣ１８基質に対して活性を有することが示される、小胞体に局在した酵素であるが、Ｃ２０またはＣ２２基質に対する活性は試験されなかった（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．、２００５）。リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ２は、Ｃ２２：１アシル鎖をＰＡのｓｎ−２位置に挿入することが実証されたが、ＤＨＡを基質として使用する能力は試験されなかった（Ｌａｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９５）。選択されたＳ．セレビシエＬＰＡＡＴ Ｓｌｃｌｐは、１８：１−ＣｏＡに加えて２２：１−ＣｏＡを基質として使用して活性を有することが示され、鎖長に関する幅広い基質特異性を示唆する（Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。再び、ＤＨＡ−ＣｏＡおよび他のＬＣ−ＰＵＦＡは基質として試験されなかった。モルティエレラＬＰＡＡＴは、トランスジェニックヤロウイア・リポリティカのＥＰＡおよびＤＨＡ脂肪酸基質に対して活性を有することが以前に示された（米国７８７９５９１）。
【0413】
発明者らは、さらなるＬＰＡＡＴを同定した。ミクロモナス・プシラは、この種のＴＡＧ上のＤＨＡの分布は確認されていないが、その油中にＤＨＡを生産および蓄積する微細藻類である。アラビドプシスＬＰＡＡＴ２をＢＬＡＳＴ問い合わせ配列として使用してミクロモナス・プシラゲノム配列を調査することで、ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ（配列番号６６、受託番号ＸＰ＿００２５０１９９７）を同定した。候補配列が複数生じ、配列ＸＰ＿００２５０１９９７を、Ｃ２２ ＬＣ−ＰＵＦＡに対する活性を伴う可能性の高いＬＰＡＡＴ酵素として試験するために合成した。リシヌス・コムニスＬＰＡＡＴをトウゴマゲノム配列の推定ＬＰＡＡＴとして注釈した（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０）。トウゴマゲノム由来の４つの候補ＬＰＡＡＴを合成し、浸潤したＮ．ベンサミアナ葉組織の粗葉可溶化物で試験した。ここに記載される候補配列はＬＰＡＡＴ活性を示した。
【0414】
複数の候補ＬＰＡＡＴを、系統樹上に公知のＬＰＡＡＴと一緒に配列した（図２０）。推定ミクロモナスＬＰＡＡＴは推定Ｃ２２ ＬＰＡＡＴとクラスター化しなかったが、分岐配列であったことが留意された。
【0415】
様々なＬＰＡＡＴの、基質としてＤＨＡ−ＣｏＡを使用する能力の初期試験として、キメラ遺伝子構築物を、Ｎ．ベンサミアナ葉における外因性ＬＰＡＡＴの恒常的発現のために作製し、それぞれは次の通りに、３５Ｓプロモーターの制御下にある：３５Ｓ：Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ２（アラビドプシスＥＲ ＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｒｉｃｃｏ−ＬＰＡＡＴ２；３５Ｓ：Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ（リムナンテス・アルバＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｓａｃｃｅ−Ｓｌｃｌｐ（Ｓ．セレビシエＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｉｃｐｕ−ＬＰＡＡＴ（ミクロモナス・プシラＬＰＡＡＴ）；３５Ｓ：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴ１（モルティエレラ・アルピナＬＰＡＡＴ）。外因性ＬＰＡＡＴを欠如する３５Ｓ：ｐ１９構築物を対照として実験で用いる。これら構築物をそれぞれ、実施例１で記載される通りにアグロバクテリウム経由でＮ．ベンサミアナ葉に導入し、浸潤から５日後、処理した葉の区域を切断し、すりつぶして葉可溶化物を作る。各可溶化物には、ＬＰＡを合成するための外因性ＬＰＡＡＴならびに内因性酵素が含まれる。１４Ｃで標識したＯＡ、ＬＡまたはＡＬＡ（Ｃ１８基質）、ＡＲＡ（Ｃ２０基質）およびＤＨＡ（Ｃ２２）を可溶化物に別々に添加することで、インビトロの反応を３通りで準備する。反応を２５℃でインキュベートし、１４Ｃで標識した脂肪酸のＰＡへの取り込みの量をＴＬＣで測定する。ＡＲＡおよびＣ１８脂肪酸と比較して、各ＬＰＡＡＴのＤＨＡを用いる能力を算出する。メドウフォーム、モルティエレラおよびサッカロマイセスＬＰＡＡＴは、ＤＨＡ基質に活性を有することが発見され、放射標識したＰＡはこれらに関しては現れたが、他のＬＰＡＡＴに関しては現れなかった。全ＬＰＡＡＴは、類似したオレイン酸供給によって活性であると確認された。
【0416】
種子のＬＰＡＡＴ活性を試験するために、タンパク質コード配列またはＬＰＡＡＴを複数コンリニン（ｐＬｕＣｎｌ１）プロモーターの制御下でバイナリーベクターに挿入する。次いで、キメラ遺伝子、Ｃｎｌ１：Ａｒａｔｈ−ＬＰＡＡＴ（陰性対照）、Ｃｎｌ１：Ｌｉｍａｌ−ＬＰＡＡＴ、Ｃｎｌ：Ｓａｃｃｅ−ＳｌｃｌｐおよびＣｎｌ１：Ｍｏｒａｌ−ＬＰＡＡＴをそれぞれ含む、結果として得られた遺伝子構築物を用いてＢ.ナプスおよびＡ．タリアナ植物を形質転換し、種子特異的な方法でＬＰＡＡＴを発現する安定した形質転換体を作製する。Ｃｎｌ１：ＬＰＡＡＴ構築物を有する形質転換植物を、種子でＤＨＡを生産するＧＡ７構築物またはその変異形を発現する植物（実施例５）と交雑し、ＴＡＧのｓｎ−２位置でのＤＨＡの取り込みの増加につながる。また、構築物を用いて、ＧＡ７構築物およびその変異形をすでに含むＢ．ナプス、Ｃ．サティバおよびＡ．タリアナ植物（実施例２から５）を形質転換して親およびＬＰＡＡＴ遺伝子構築物の双方を保有する子孫を作製する。ＴＡＧのｓｎ−２位置でのＤＨＡの取り込みの増加は、ＬＰＡＡＴコード導入遺伝子を欠如する植物での取り込みに相対的であると予想される。油含有量も種子で改善され、特に、より多い量のＤＨＡを生産する種子に関して改善され、実施例２で説明されるアラビドプシス種子で見られる傾向を相殺する。
【0417】
広義的に説明される本発明品の趣旨または範囲から逸脱することなく、数多くの変化および／または修正が特定の実施形態で示される本発明品になされ得ることが、当業者には理解されるだろう。したがって、本実施形態は全ての点において例示的であり制限的ではないと見なされる。
【0418】
本出願は、２０１２年６月１５日に出願された米国第６１／６６０，３９２号、２０１２年６月２２日に出願された米国第ＵＳ６１／６６３，３４４号、２０１２年９月６日に出願された米国第６１／６９７，６７６号、２０１３年３月１４日に出願された米国第６１／７８２，６８０号からの優先権を主張し、それぞれの全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0419】
本明細書で考察および／または参照された出版物はすべてその全体が本明細書に組み込まれる。
【0420】
本出願は、２０１２年６月１５日に出願された米国第６１／６６０，３９２号、２０１２年６月２２日に出願された米国第６１／６６３，３４４号および２０１２年９月６日に出願された米国第６１／６９７，６７６号を、参照により本明細書に組み込む。
【0421】
本明細書に含まれる文書、法令、材料、デバイス、品物などの考察はいずれも、本発明の文脈を提供する目的のためのみである。これらの事柄のいずれかまたは全てが先行技術の基盤の一部を形成する、または、本出願の各請求項の優先日以前に存在した通り、本発明に関連した当該分野では共通の常識であったということが承認としては見なされない。
【0422】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]