特許 6243270 柿発酵組成物および柿果実の処理方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6243270

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】柿発酵組成物および柿果実の処理方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/44 20060101AFI20171127BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20171127BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20171127BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/44

   A61P3/10

   A61P9/12

   A61P3/04

   A61K131:00

【請求項の数】6

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2014-63817(P2014-63817)

(22)【出願日】2014年3月26日

(65)【公開番号】特開2015-182997(P2015-182997A)

(43)【公開日】2015年10月22日

【審査請求日】2016年11月8日

(73)【特許権者】

【識別番号】507152970

【氏名又は名称】公益財団法人東洋食品研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】折居 千賀

【審査官】 金子 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１３−１２８４５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２２３７２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−１５８１８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−３５８０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 奈良県工業技術センター研究報告，２００３年，29，17-21

【文献】 和歌山県工業技術センター研究報告，２０１３年 ２月，2011，3

【文献】 日本農芸化学会大会講演要旨集，２０１０年 ３月 ５日，42

【文献】 月刊フードケミカル，２００５年 ５月 １日，21(5)，71

【文献】 日本農芸化学会大会講演要旨集，２００９年 ３月 ５日，225

【文献】 日本臨床(増刊)高血圧，２００９年１１月２８日，第４版，421-426

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する血糖上昇抑制作用のための柿発酵組成物。

【請求項2】

柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する血圧上昇抑制作用のための柿発酵組成物。

【請求項3】

柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する抗肥満作用のための柿発酵組成物。

【請求項4】

前記麹菌がアスペルギルス属である請求項１〜３の何れか一項に記載の柿発酵組成物。

【請求項5】

前記麹菌が黒麹菌である請求項４に記載の柿発酵組成物。

【請求項6】

柿の果実を麹菌で固体発酵処理する発酵工程と、発酵処理物にアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、柿の果実の発酵処理によって得られた柿発酵組成物、および、柿果実の処理方法に関する。

【背景技術】

【0002】

柿は、通常、柿果実や柿果実を用いた加工食品を食用とするため、広く栽培されている。柿の果実を食用とする際には、果実以外の蔕（ヘタ）などを分離して果実部分を使用していた。柿の利用については、例えば以下のことが公知である。

【0003】

特許文献１には、柿の乾燥果実を水または任意の果汁に浸漬して膨潤させ、膨潤した乾燥果実の果肉を破砕して泥漿化させたのちペクチン分解酵素を添加して液状化させ、得られた液状化物にアルコール発酵用糖源を補給するとともに酵母を加えてアルコール発酵を生起させる柿ワインの製造法が記載してある。

【0004】

特許文献２には、柿をペースト状にして乳酸発酵させることが記載してある。この乳酸発酵は、植物由来の乳酸菌を用いて行われている。これにより、柿の抗酸化活性機能を増強させることができ、一方では、酸化ストレスによる、赤血球変形能の低下を抑制する能力を、劣化させることがないという効果を奏するとされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平１０−１９１９５５号公報

【特許文献2】特開２０１０−２５２７２６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

特許文献１,２は、何れも柿の果実を破砕したりすり潰したりした後、発酵の前処理としてのペクチン分解酵素、あるいは並行複発酵の手法として酵母や乳酸菌を用いた発酵と同時にセルラーゼ分解酵素を用いた処理も行っていた。即ち、酵素処理の前に果実を破砕したりすり潰したりする前処理を行う必要があり、煩雑であった。

【0007】

また、柿は、果実に糖質、ビタミン、カリウム等を豊富に含み、さらに上述した抗酸化活性の他、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、抗アレルギー作用等を有することが知られている。そのため、柿の果実を処理して新たな機能を有する組成物を作出することが期待されている。

【0008】

従って、本発明の目的は、柿の果実を簡便に処理して新たな機能を有する組成物および柿果実の処理方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは柿の果実の処理について鋭意検討した結果、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分と柿発酵組成物が、血糖値上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用および抗肥満作用を有することを見出した。

【0010】

即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［６］に示す発明を提供する。
［１］柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する血糖上昇抑制作用のための柿発酵組成物。
［２］柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する血圧上昇抑制作用のための柿発酵組成物。
［３］柿の果実を麹菌で固体発酵処理した処理物を有効成分として含有する抗肥満作用のための柿発酵組成物。
［４］前記麹菌がアスペルギルス属である［１］〜［３］の何れか一項に記載の柿発酵組成物。
［５］前記麹菌が黒麹菌である［４］に記載の柿発酵組成物。
［６］柿の果実を麹菌で固体発酵処理する発酵工程と、発酵処理物にアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法。

【0011】

本発明の柿発酵組成物は、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有する。後述の実施例では、麹菌としてアスペルギルス属の黒麹菌を用いた態様を示し、実施例２では、本発明の柿発酵組成物が乳酸菌による処理より優れたα-グルコシダーゼ阻害活性を有することが示され、実施例３では、当該柿発酵組成物が乳酸菌による処理より優れたアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することが示され、実施例４では、当該柿発酵組成物が乳酸菌による処理より優れたβ-リパーゼ阻害活性を有することが示されている。

【0012】

即ち、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有することで、柿発酵組成物は、血糖値上昇抑制作用（α-グルコシダーゼ阻害活性）、血圧上昇抑制作用（アンジオテンシン変換酵素阻害活性）および抗肥満作用（β-リパーゼ阻害活性）を有するため、それぞれの柿発酵組成物を血糖値上昇抑制剤、血圧上昇抑制剤および抗肥満剤として利用することができる。

【0013】

血糖値上昇抑制剤は、例えば腸内でα-グルコシダーゼ阻害活性の働きを阻害し、糖の分解・吸収を阻害するα-グルコシダーゼ阻害活性を有するものであり、有効量の血糖値上昇抑制剤を摂取することで、血糖値の上昇を抑制することが期待される。

【0014】

血圧上昇抑制剤は、例えば血圧の上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するものであり、有効量の血圧上昇抑制剤を摂取することで、血圧の上昇を抑制することが期待される。

【0015】

抗肥満剤は、腸内でβ-リパーゼの働きを阻害し、脂肪の分解・吸収を阻害するβ-リパーゼ阻害活性を有することにより達成される。

【0016】

本発明で使用する柿は、食用の果実として広く栽培されているものであり、入手は容易である。柿の果実部分を発酵処理に供する際には、そのまま使用できるため、簡便に発酵処理（発酵工程）を行うことができる。

【0017】

本発明の抽出工程で使用するアルコールは、柿発酵組成物を医薬品や食品として利用することを鑑みると、入手が容易、かつ人体に対する安全性を備えたエタノール等を用いるのがよい。

【0018】

即ち、本発明により、柿の果実を簡便に処理し、簡易なアルコール抽出を行うことのみで、血糖値上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用および抗肥満作用という新たな機能性を有する有効成分を含有する柿発酵組成物を容易に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（黒麹菌処理、１００％エタノール-水抽出（エタノール画分））。

【図2】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（黒麹菌処理、１００％エタノール-水抽出（水画分））。

【図3】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（黒麹菌処理、５０％エタノール抽出）。

【図4】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（乳酸菌処理、５０％エタノール抽出）。

【図5】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（乳酸菌処理、１００％エタノール-水抽出（エタノール画分））。

【図6】柿発酵組成物のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である（乳酸菌処理、１００％エタノール-水抽出（水画分））。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明は、柿の果実を麹菌で発酵処理した処理物を有効成分として含有する柿発酵組成物である。当該柿発酵組成物は、柿の果実を麹菌で発酵処理する発酵工程と、発酵処理物にアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程と、を有する柿果実の処理方法によって得ることができる。

【0021】

本発明で使用する柿の部位は、蔕部分を取り除いた果実部分である。果実部分が含まれていれば、果皮や種の有無は問わない。用いられる柿の品種に特に制限はなく、分類学上でDiospyros kakiに属するものであれば何れも用いることができるが、入手が容易である等の理由から、例えば富有柿や次郎柿等とするのがよい。柿は、通常の収穫時期よりも早い時期に収穫された幼果（着果後３０〜６０日程度）、或いは、通常の収穫時期に収穫された成熟果実（着果後１５０〜１８０日程度）を利用するのがよい。収穫した柿から蔕部分を取り除いた後、そのまま、好ましくは洗浄、果皮や種の除去、細断、殺菌処理を行って果実原料とし、発酵工程に供する。殺菌処理は、例えば煮沸、紫外線、薬品による殺菌など、公知の処理を行えばよい。

【0022】

麹菌は、例えば焼酎製造用に供されるアスペルギルス属の麹菌を使用するのがよい。焼酎製造用に供される麹菌は、例えば蒸煮した大麦や米などの穀類などの固体原料を醗酵し、糖質からクエン酸を産生する糸状菌を指す。このような麹菌としては、黒麹菌（アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus Awamori））、白麹菌（アスペルギルス・カワチ（Aspergillus Kawachii））を使用することができる。
このような麹菌は、市販のものを使用することが可能であり、また、特許寄託機関に寄託してある菌株を使用することも可能である。寄託された菌株は、例えば独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より入手可能であり、ＮＢＲＣ４０３３の寄託番号で表される黒麹菌を使用することができる。本発明においては、上述した菌株の変異株又は派生株であってもよく、このような菌株を使用して得られた柿発酵組成物が後述する作用を有する限り使用することができる。

【0023】

本発明において使用する麹菌は、当該麹菌の固体培養に通常用いられる蒸煮した原料を使用して、適当な条件下で固体培養することにより調製することができる。原料としては、穀物として米、麦（大麦、小麦、ライ麦及びオート麦）など、豆類として大豆など、イモ類としてサツマイモなど、当該麹菌が効率よく生育する原料であればどのような原料でも用いることができる。これら原料は単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。或いは、本発明において使用する麹菌は、ポテトデキストロース寒天培地などの公知の真菌用培地を用いて調製してもよい。

【0024】

培養後、得られた麹菌培養物をそのまま使用してもよいし、さらに必要に応じて遠心分離などによる粗精製、濾過等による固液分離、滅菌操作などを行ってもよい。また、麹菌は、２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。

【0025】

発酵工程は、柿の果実部分、および、上述のように調製された麹菌を種菌として接触させて十分に攪拌混合し、約２０〜４５℃の範囲で送風、攪拌、静置を繰り返すことによって行う。発酵工程において柿の果実部分と接触させる麹菌の量は、通常、柿の果実部分に対して乾燥麹菌粉末が０．００１〜１０質量％程度となるようにするのがよいが、これに限定されるのではない。発酵工程を行う際のｐＨ、時間などは公知の条件で行えばよく、例えばｐＨ３〜８程度で１〜２０日間かけて行うとよい。発酵工程の後、例えば通風乾燥などによって培養物を４０〜４５℃程度で１日程度乾燥させる。

【0026】

発酵工程の後、発酵処理物にアルコールを接触させて有効成分を抽出する抽出工程を行う。抽出工程では、発酵処理物を、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の抽出溶媒であるアルコール中に浸漬、攪拌又は還流することにより、抽出液を得ることができる。アルコールは、これらアルコールおよび水の混合溶液、上述した複数のアルコールおよび水を混合した溶液、或いは、上述したアルコールの複数を混合した溶液を利用してもよい。アルコールおよび水の混合比率は特に限定されるものではない。本明細書では、アルコールとして１００％或いは５０％エタノールを使用した場合について説明する。

【0027】

抽出条件として、抽出温度に関しては、抽出に用いる溶媒の凝固点以上から沸点以下であれば任意に設定が可能であり、好ましくは柿の果実中に含まれる成分の変性や反応による消失等が生じ難く、かつ抽出効率が比較的良好な常温〜溶媒の沸点の温度範囲とするのがよい。抽出圧力に関しては、具体的には１．０〜２．５ｋｇ／ｃｍ²の範囲内で適宜設定するのがよい。発酵処理物に対する溶媒の重量比率は、例えば発酵処理物：溶媒を２：１〜１：５０の範囲内で任意に設定することができるが、これに限定されるものではない。抽出時間に関しては特に制限はなく、好ましくは数時間から数日とするのがよい。

【0028】

抽出工程では、必要に応じて溶媒を加えた発酵処理物に対して加熱処理を行うとよい。加熱処理は、例えば３０分〜３時間、２５〜３５℃の条件で行うのがよい。

【0029】

上述した抽出溶媒及び抽出条件によって得られた柿発酵組成物はそのまま利用してもよいが、当該柿発酵組成物を更に精製して用いることも可能である。精製方法としては、具体的には濾紙やメンブランフィルター等を用いた濾過法、分液操作法、蒸留法、昇華法、沈殿法、再結晶化法、遠心分離法、減圧濃縮法、ｐＨ調製、塩析等の方法が挙げられ、これらの方法の１種もしくは２種以上が選択されるが、これらの手法に限定されるものではない。

【0030】

また、得られた柿発酵組成物は、適当な溶媒で希釈したり、濃縮して用いてもよく、さらに減圧乾固する等して乾燥粉末としたり、ペースト状に調製してもよい。

【0031】

このようにして調製された柿発酵組成物に、水、アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、酸、アルカリ、増粘剤、賦形剤、防腐剤等を添加した組成物とすることも可能である。当該柿発酵組成物の形状として、液状である他、固形状、粉末状、顆粒状、ペレット状、ゲル状、粘液状等とすることができる。

【0032】

当該柿発酵組成物は、医薬品として経口、経腸、経粘膜、注射等により投与できる。その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は静脈内注射、筋肉注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、上述した組成物に、さらに薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて添加することができる。投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口投与用製剤として用いる場合の該製剤中の柿発酵組成物の含有量は、例えば０．１〜７０質量％程度とすることが好ましい。

【0033】

医薬として使用する場合、成人１人当たりの１日の投与量は、年齢、体重、性別、投与方法などの種々の要因によって異なるが、経口投与の場合は上記植物体又はその抽出物（固形分換算）として、例えば０．１〜５０００ｍｇを１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。

【0034】

当該柿発酵組成物は、食品として用いる場合の形態としては、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。また、前記柿発酵組成物は、種々の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品等に適宜配合してもよい。

【0035】

種々の形態の食料品を調製するには、上述した柿発酵組成物に、さらに他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて添加することができる。当該食料品中の柿発酵組成物の含有量は、一般的に例えば０．００２〜５質量％程度とすることが好ましい。

【0036】

本発明の柿果実の処理方法によって得られた柿発酵組成物は、血糖上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用および抗肥満作用を有する。

【0037】

血糖値上昇抑制作用は、例えば腸内でα-グルコシダーゼ阻害活性の働きを阻害し、糖の分解・吸収を阻害するα-グルコシダーゼ阻害活性を有することにより達成される。α-グルコシダーゼ（ＡＧＨ）はデンプンが分解されて生じるマルトースなどの二糖類を分解してグルコースにする。このグルコースが血液中に入ると血糖値が上昇する。そのためＡＧＨを阻害することは、生じるグルコース量を減らし血糖値の上昇を抑制することができると考えられている。α-グルコシダーゼ阻害活性は、例えばラット小腸由来酵素を用いて評価することができる。

【0038】

血圧上昇抑制作用は、例えば血圧の上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）を阻害するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有することにより達成される。血圧上昇には昇圧機構（レニン・アンジオテンシン系）と降圧機構（キニン・カリクレイン系）が関与しており、アンジオテンシン変換酵素は両方の系に作用する酵素である。アンジオテンシン変換酵素により、アンジオテンシンIは血管収縮作用を有するアンジオテンシンIIに変換される。さらに、同酵素は血圧を下げるブラジキニンを不活性化させる作用も有しており、これら２つの系の作用が血圧上昇に関与する。そのためアンジオテンシン変換酵素を阻害することで、血圧の上昇を抑制することができると考えられている。アンジオテンシン変換酵素阻害活性は、3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG) から切り出されてくる 3-Hydroxybutyric acid (3HB) を酵素法により検出することができる。

【0039】

抗肥満作用による抗肥満効果は、腸内でβ-リパーゼの働きを阻害し、脂肪の分解・吸収を阻害するβ-リパーゼ阻害活性を有することにより達成される。

【0040】

本発明の柿発酵組成物は、当該柿発酵組成物を有効成分として含有する医薬組成物又は機能性食品として供するのが好ましい。特に機能性食品の態様であれば、日常的に経口摂取できるため、手軽に血糖上昇、血圧上昇および肥満を予防することができると考えられる。また、有効成分として含まれる柿発酵組成物は、高温処理や凍結乾燥処理をした後でも上述した諸作用を保持することから、食品などの加工処理に適している。さらに、柿発酵組成物は、添加しても食品自体の食味や風味に影響を殆ど与えないため、種々の食品に添加して継続的に摂取することができる。

【0041】

当該機能性食品とは、例えば、特定保健用食品（体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、特定の効能が認められる食品）、栄養機能食品（栄養成分の補給・補完のために利用する食品）、健康補助食品、栄養補助食品などの態様で供されるものを指す。このような機能性食品であれば、広く市場に流通しており、容易かつ安価に入手ができる。当該機能性食品に含まれる本発明の柿発酵組成物の割合は、当業者が適宜設定すればよい。

【実施例】

【0042】

〔実施例１〕
本発明の実施例について説明する。
柿の果実は、富有柿の幼果を使用した。幼果は皮・蔕・種を取り除き細断したのち、１００℃の熱水中で１０秒間、煮沸による殺菌を行った（果実原料）。殺菌後、試料を滅菌済み３００ｍＬバッフルフラスコに４０．０ｇずつ移した。

【0043】

麹菌は黒麹菌（ＮＢＲＣ４０３３）を使用した。黒麹菌は、ポテトデキストロース斜面培地にて３５℃で２日間培養したものを種菌とした。適当量の種菌を滅菌水１０ｍＬで懸濁後、２．０ｍＬを上記の果実原料に添加し、好気条件下、３５℃で１４日間発酵を行った（発酵工程）。発酵処理物は０、７、１０、１４日目にサンプリングを行い、抽出工程を行って柿発酵組成物を調製した。

【0044】

尚、コントロールとして乳酸菌（Lactococcus lactis、ＮＢＲＣ１２００７）を使用して果実原料に添加して発酵させた。乳酸菌は、ＭＲＳ培地にて３０℃で２日間前培養を行ったものを種菌とした。上記の果実原料に１００ｍＬの水を添加して浸漬状態とし、種菌の懸濁液を５．０ｍＬ添加した後、アネロパック・ケンキを用いた嫌気条件にて、３０℃で１４日間発酵を行った。発酵処理物は０、７、１０、１４日目にサンプリングを行い、抽出工程を行って柿発酵組成物を調製した。

【0045】

抽出工程は、以下のようにして行った。
・１００％エタノール-水抽出
３０ｍＬのエタノールを用いて４日間抽出してエタノール抽出物を回収した後、３０ｍＬの水を用いて４日間抽出を行った。エタノール画分は減圧乾固後、水に可溶、エタノール不溶成分の析出が見られたため、エタノール可溶成分をエタノール画分とし、水に可溶、エタノール不溶成分は水画分と統合した。それぞれの成分を減圧乾固したのち、１０％（ｗ／ｖ）になるようにそれぞれの溶媒に再溶解した。乳酸菌発酵物では、上記の方法に加えて、サンプリングした浸漬水１０ｍＬもまた水画分に統合した。

【0046】

・５０％エタノール抽出
５０％エタノールを用い、４日間の抽出を２度行った。この抽出法では、減圧乾固後の抽出物は５０％エタノールで完全に溶解したため、１０％（ｗ／ｖ）となるように５０％エタノールで再度溶解し、試料溶液とした。乳酸菌発酵物では上記の方法に加えて、サンプリングした浸漬水１０ｍＬを統合し、減圧乾固した後に同様の処理を行った。

【0047】

〔実施例２〕
実施例１で調製した柿発酵組成物のエタノール画分および水画分について、α-グルコシダーゼ阻害活性（血糖値上昇抑制作用）を調べた。

【0048】

酵素液は以下のようにして調製した。即ち、１．０ｇラット腸管アセトンパウダーを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍＬに懸濁し、氷冷下にて３０分間攪拌処理を行った。その後遠心分離を行い（１２０００ｒｐｍ×１０分、４℃）、上清を粗酵素液とした。調製した酵素液は−８０℃にて保存した。

【0049】

蒸留水０．４８ｍＬに２５０ｍＭマルトース水溶液０．４ｍＬを基質として加えた。この反応液に各抽出液（エタノール画分および水画分、終濃度：１〜２０ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬを阻害剤として添加し、攪拌後３７℃で５分間プレインキュベートを行った。その後、０．０２ｍＬのα−グルコシダーゼ粗酵素液を添加し、３７℃で４０分反応を行った。反応終了後、１．０ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加し、反応を停止させた。同反応にて生成したグルコースはグルコースＣＩＩ−テストワコーを用いて測定した。残存活性を求めたのち５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀、μｇ／ｍＬ）を算出した。結果を表１〜３に示した（値が小さいほど高い活性であることを示す）。

【0050】

尚、表１は黒麹菌による柿発酵組成物の１００％エタノール−水抽出物のα−グルコシダーゼ阻害活性を調べた結果、表２は黒麹菌および乳酸菌による柿発酵組成物の５０％エタノール抽出物のα−グルコシダーゼ阻害活性を調べた結果をそれぞれ示した。

【0051】

【表1】

【0052】

【表2】

【0053】

黒麹菌による処理では、表１（１００％エタノール−水抽出物）より、水画分にのみα−グルコシダーゼ阻害活性が確認された。また、７日目以降に活性が増強しており、１０日目で最も高い活性（ＩＣ₅₀＝８０１６．７μｇ／ｍＬ）を示すことが判明した。また、黒麹菌による処理は、表２（５０％エタノール抽出物）より、７日目、１４日目における活性が増強しており、１４日目の乳酸菌１００％エタノール−水抽出物の活性（ＩＣ₅₀＝３８００．０μｇ／ｍＬ）よりも高い活性（ＩＣ₅₀＝１１８７．９μｇ／ｍＬ）を示すことが判明した。

【0054】

これより、黒麹菌および乳酸菌の処理によるいずれの柿発酵組成物も、発酵によりα-グルコシダーゼ阻害活性が増強するものと認められた。α-グルコシダーゼ阻害活性は抽出法によって異なり、黒麹菌による処理において、１００％エタノール-水抽出では７〜１０日の発酵処理で高い活性を示し、５０％エタノール抽出では７〜１４日の発酵処理で高い活性を示した。
即ち、黒麹菌による処理では、乳酸菌による処理より優れたα-グルコシダーゼ阻害活性増強効果を有するものと考えられ、特に、黒麹菌による処理では、１４日発酵後の５０％エタノール抽出により、最高の阻害活性を有するものと認められた。このときの黒麹菌処理の阻害活性および乳酸菌処理の阻害活性の比は約３．２倍（１１８７．９/３８００．０）であった。

【0055】

〔実施例３〕
実施例１で調製した柿発酵組成物について、アンジオテンシン変換酵素阻害活性（血圧上昇抑制作用）を調べた。
本試験は、血圧上昇に関与するアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）に対する阻害活性をエースキット−ダブルエスティー（アンジオテンシン変換酵素阻害活性測定キット）（（株）同仁化学研究所）を用いて測定し、阻害率（ＩＣ₅₀）を求めた。本実施例では、１００％エタノール−水抽出物（水画分）および５０％エタノール抽出物の阻害活性を調べた。

【0056】

試験はキットの使用方法に沿って行った。つまり、超純水で調製したアンジオテンシン変換酵素とアミノアシラーゼ混合液２０μＬ、基質溶液（3-Hydroxybutyryl-Gly-Gly-Gly (3HB-GGG)）２０μＬ、試料溶液２０μＬを混合し、３７℃で１時間反応させた。これに、３−ヒドロキシブチル酸デヒドロゲナーゼと補酵素の混合液２００μＬを添加して１０分間室温で反応させた。反応後４５０ｎｍの吸光度測定を行い、得られたデータをもとに阻害率を算出した。結果を表３（１００％エタノール−水抽出物），表４（５０％エタノール抽出物）に示した（値が小さいほど高い活性であることを示す）。

【0057】

【表3】

【0058】

【表4】

【0059】

表３（１００％エタノール−水抽出物）より、黒麹菌による処理では、７日目以降に活性が増強しており、７日目で最も高い活性（ＩＣ₅₀＝１８２．９μｇ／ｍＬ）を示すことが判明した。

【0060】

表４（５０％エタノール抽出物）より、黒麹菌による処理では、７日目以降に活性が増強しており、７日目で最も高い活性（ＩＣ₅₀＝１３．５μｇ／ｍＬ）を示すことが判明した。また、乳酸菌による処理では、７日目以降に活性が増強しており、７日目で最も高い活性（ＩＣ₅₀＝４５．６μｇ／ｍＬ）を示すことが判明した。

【0061】

これより、黒麹菌および乳酸菌の処理によるいずれの柿発酵組成物も、発酵によりアンジオテンシン変換酵素阻害活性が増強するものと認められた。黒麹菌による処理において、１００％エタノール-水抽出および５０％エタノール抽出の何れにおいても、７〜１４日の発酵処理で高い活性を示した。
即ち、黒麹菌による処理では、乳酸菌による処理より優れたアンジオテンシン変換酵素阻害活性増強効果を有するものと考えられ、特に、黒麹菌による処理では、７日発酵後の５０％エタノール抽出により最高の阻害活性を有するものと認められた。このときの黒麹菌処理の阻害活性および乳酸菌処理の阻害活性の比は約３．３倍（１３．５/４５．６）であった。

【0062】

〔実施例４〕
実施例１で調製した柿発酵組成物のエタノール画分および水画分について、β-リパーゼ阻害活性（抗肥満作用）を調べた。

【0063】

５０μＬの蛍光性のメチルウンベリフェロンオレイン酸エステル溶液に２５μＬの試料溶液（終濃度：２．５〜２５００ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、２５μＬのβ−リパーゼを添加し、３７℃で３０分間酵素反応を行った。反応終了後、５０μＬの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍにて、遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定した。残存活性を求めたのち５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀、μｇ／ｍＬ）を算出した。結果を表５〜７に示した（値が小さいほど高い活性であることを示す）。

【0064】

尚、表５は黒麹菌による柿発酵組成物の１００％エタノール−水抽出物のβ-リパーゼ阻害活性を調べた結果、表６は乳酸菌による柿発酵組成物の１００％エタノール−水抽出物のβ-リパーゼ阻害活性を調べた結果、表７は黒麹菌および乳酸菌による柿発酵組成物の５０％エタノール抽出物のβ-リパーゼ阻害活性を調べた結果をそれぞれ示した。

【0065】

【表5】

【0066】

【表6】

【0067】

【表7】

【0068】

黒麹菌による処理では、表５（１００％エタノール−水抽出物）より、エタノール画分および水画分の両方にβ−リパーゼ阻害活性が確認された。特に、水画分では７日目（ＩＣ₅₀＝１０．２μｇ／ｍＬ）および１４日目に（ＩＣ₅₀＝２．０μｇ／ｍＬ）高い活性を示すことが判明した。これらは、乳酸菌１００％エタノール−水抽出物の活性（７日目：ＩＣ₅₀＝１１０．７μｇ／ｍＬ、１４日目：ＩＣ₅₀＝２１．６μｇ／ｍＬ）よりも高い活性を示すことが判明した。
また、表７（５０％エタノール抽出物）より、７日目以降に活性が増強しており、１４日目で最も高い活性を示すことが判明した（ＩＣ₅₀＝１．４３μｇ／ｍＬ）。このときの活性は、１４日目の乳酸菌５０％エタノール抽出物の活性（ＩＣ₅₀＝１８９１．３μｇ／ｍＬ）よりも高い活性を示すことが判明した。

【0069】

一方、乳酸菌による処理では、表６（１００％エタノール−水抽出物）より、エタノール画分および水画分の両方にβ−リパーゼ阻害活性が確認された。エタノール画分では、７日目（ＩＣ₅₀＝１２．０μｇ／ｍＬ）および１０日目に（ＩＣ₅₀＝１５．３μｇ／ｍＬ）高い活性を示すことが判明した。水画分では、１０日目（ＩＣ₅₀＝６３．７μｇ／ｍＬ）および１４日目に（ＩＣ₅₀＝２１．６μｇ／ｍＬ）高い活性を示すことが判明した。

【0070】

これより、黒麹菌および乳酸菌の処理によるいずれの柿発酵組成物も、発酵によりβ−リパーゼ阻害活性が増強するものと認められた。
黒麹菌による処理において、１００％エタノール-水抽出では７日および１４日の発酵処理で高い活性を示し、５０％エタノール抽出では７〜１４日の発酵処理で高い活性を示した。
即ち、黒麹菌による処理では、乳酸菌による処理より優れたα-グルコシダーゼ阻害活性増強効果を有するものと考えられた。特に、黒麹菌による処理において、１４日発酵後の１００％エタノール-水抽出時の阻害活性は、乳酸菌処理時の阻害活性の１０．８倍（２．０/２１．６）であった。
また、黒麹菌による処理において、１４日発酵後の５０％エタノール抽出時の阻害活性は、乳酸菌処理時の阻害活性の約１３２３倍（１．４３/１８９１．３）であった。

【0071】

〔実施例５〕
実施例１で調製した柿発酵組成物について、ＧＣ−ＭＳ分析を行った。
ＧＣ−ＭＳ分析には、ＨＰＬＣ装置としてAgilent Technologies 1260 infinity（アジレントテクノロジー製）を使用し、カラムとしてScherzo SS-C18（１５０ｍｍ×φ２ｍｍ）（インタクト株式会社製）、ＭＳ検出器としてAgilent Technologies 6430 Triple Quad LC/MS（アジレントテクノロジー製）を使用した。
移動相は、Ａ：水（０．２％酢酸＋０．２％ギ酸添加）、Ｂ：水−メタノール＝１：１（１００ｍＭ酢酸アンモニウム添加）とし、流速０．３ｍＬ／分、カラム温度４０℃、イオンモード：ポジティブの条件とした。

【0072】

結果を図１〜６に示した。図１は黒麹菌処理（１００％エタノール-水抽出（エタノール画分））の結果を示し、図２は黒麹菌処理（１００％エタノール-水抽出（水画分））の結果を示し、図３は黒麹菌処理（５０％エタノール抽出）の結果を示し、図４は乳酸菌処理（５０％エタノール抽出）の結果を示し、図５は乳酸菌処理（１００％エタノール-水抽出（エタノール画分））の結果を示し、図６は乳酸菌処理（１００％エタノール-水抽出（水画分））の結果を示した。

【0073】

この結果、黒麹菌処理の柿発酵組成物および乳酸菌処理の柿発酵組成物において、それぞれの組成物中の発酵生成物は相違するものと認められた。具体的には、黒麹菌処理の柿発酵組成物において、１９〜２５分の間に発酵生成物と考えられる特徴的なピークが認められた（図１〜３）。これに対して、乳酸菌処理の柿発酵組成物においては、このようなピークは確認できなかった。また、図２において、黒麹菌処理の１４日目には、それまでに確認できなかった複数のピーク（矢印）が確認できた。

【0074】

即ち、黒麹菌処理の柿発酵組成物および乳酸菌処理の柿発酵組成物において、このような発酵生成物の相違がみられることから、柿の果実に対する黒麹菌および乳酸菌の発酵のメカニズムがそれぞれ異なるものと推測された。
また、黒麹菌による処理で、１４日の発酵によって高いα-グルコシダーゼ阻害活性、アンジオテンシン変換酵素阻害活性およびβ-リパーゼ阻害活性がみられるのは、図２に示すような特徴的なピークを示す発酵生成物が要因となっていると推測された。

【産業上の利用可能性】

【0075】

本発明は、柿の果実の発酵処理に利用でき、発酵によって得られた柿発酵組成物は、血糖値上昇抑制作用、血圧上昇抑制作用および抗肥満作用を有する医薬品および食品として利用できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】