特許 6243452 アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有する医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6243452

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有する医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20171127BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20171127BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20171127BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20171127BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00ZNA

   C12N9/78

   A61K38/46

   A61P35/00

   A61P35/02

   !C12N15/00 A

【請求項の数】10

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2015-561630(P2015-561630)

(86)(22)【出願日】2014年3月6日

(65)【公表番号】特表2016-514111(P2016-514111A)

(43)【公表日】2016年5月19日

(86)【国際出願番号】US2014020943

(87)【国際公開番号】WO2014138319

(87)【国際公開日】20140912

【審査請求日】2017年1月26日

(31)【優先権主張番号】14/197,236

(32)【優先日】2014年3月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/773,214

(32)【優先日】2013年3月6日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】515069439

【氏名又は名称】ビジョン グローバル ホールディングス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＩＳＩＯＮ ＧＬＯＢＡＬ ＨＯＬＤＩＮＧＳ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100129643

【弁理士】

【氏名又は名称】皆川 祐一

(74)【代理人】

【識別番号】100138760

【弁理士】

【氏名又は名称】森 智香子

(72)【発明者】

【氏名】ビン ロウ ウォン

(72)【発明者】

【氏名】ノーマン ファン マン ワイ

(72)【発明者】

【氏名】スイ イー クォック

(72)【発明者】

【氏名】ユイン チャン リアン

【審査官】 藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２３４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３４４８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５２７１０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Cancer Letters，２００８年，Vol.261，pp.1-11

【文献】 J. Biol. Chem.，２０１１年，Vol.286, No.7，pp.5234-5241

【文献】 Protein Eng. Des. Sel.，２０１０年，Vol.23, No.11，pp.827-834

【文献】 J. Biol. Chem.，２００９年，Vol.284, No.38，pp.25612-25619

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００ − １９／００

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を形成するために、アルギニンデイナミナーゼを含む第２の部分と融合する、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合たんぱく質から選択される１つまたは２つの構成成分を含む第１の部分、及び、１つまたは１つ以上のリンカー分子を含むアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質であって、
前記融合たんぱく質の一の部分の機能が前記融合たんぱく質の他の部分により妨げられずに、前記アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質が前記アルギニンデイミナーゼの活性を保持して血清アルブミンと結合するように、前記リンカー分子によって前記第１の部分が前記第２の部分の活性部位から離れて位置し、
前記アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質が配列番号４０の配列を含むアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項2】

ポリ−Ｎまたはヒスチジンタグの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項3】

前記アルギニンデイミナーゼが、マイコプラズマ属からなる請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項4】

前記アルギニンデイミナーゼが、マイコプラズマ・アルギニニからなる請求項３に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項5】

前記アルギニンデイミナーゼと前記アルブミン結合ドメインが共有結合によって結合するように、前記アルブミン結合ドメインのＣ末端でＮ末端にシステイン残基を有する前記アルギニンデイミナーゼと反応性チオエステルとの反応によって前記融合たんぱく質が形成される、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項6】

前記アルギニンデイミナーゼと前記アルブミン結合ドメインが共有結合によって結合するように、配列番号４２および４３を使用し、前記アルブミン結合ドメインのＣ末端でＮ末端にシステイン残基を有する前記アルギニンデイミナーゼと反応性チオエステルとの反応によって前記融合たんぱく質が形成される、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質。

【請求項7】

薬学的に許容され得るキャリア中に、請求項１に記載のアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有する医薬組成物。

【請求項8】

前記組成物のｐＨが５．５から９．５の範囲内である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記組成物のｐＨが７．４である、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記組成物のｐＨが６．５である、請求項７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、その開示全体が本明細書に参照によって引用される２０１３年３月６日に出願された米国仮特許出願第６１／７７３，２１４号及び２０１４年３月５日に出願された米国非仮特許出願第１４／１９７，２３６号の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、高活性で長い生体内半減期を有するもつ物質を作るために遺伝子組み換えをしたアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質に関する。本発明は、さらに異種のＡＡＤ融合たんぱく質を作るためのＤＮＡデザイン設計とプロテイン・エンジニアリングに関する。ＡＡＤ融合たんぱく質は、粗たんぱく質の可溶性画分およびや不溶性画分（封入体）から単離し、精製することができる。本発明は、さらにヒトおよびやその他の動物のがんのターゲティング治療やアルギニン依存性疾患の治療のためのアルブミン結合アルギニンデイミナーゼを含有する含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

世界人口中で、膵臓がん、大腸がん、肝臓がん、黒色腫、子宮頸がんの発生は増加している。これらの病気の効果的な治療が緊急に必要とされる。白血病、黒色腫、膵臓がん、大腸がん、腎細胞がん、肺がん、前立腺がん、胸がん、脳がん、子宮頸がん、および肝臓がんなど多くの型のがんでは、がん細胞は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）を発現しないためアルギニン栄養要求性であり、アルギニン枯渇療法の優れたターゲットとなっている。

【0004】

アルギニンは、ヒトおよび他のほ乳類にとって準必須アミノ酸である。アルギニンは、尿素回路酵素であるアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）が触媒する２つの段階を経て、シトルリンから合成できる。アルギニンは、酵素アルギナーゼによってオルニチンに代謝することができ、オルニチンはミトコンドリア中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）によってシトルリンに転換することができる。シトルリンはアルギニンを再び合成するために利用できる。ＡＳＳとＡＳＬの触媒活性が活性なため、正常細胞は一般に成長のために外来性のアルギニンの供給を必要としない。対照的に、多くの型のがんでは、ＡＳＳを発現しないので、アルギニン栄養要求性である。がんの成長は、血液循環から得られるアルギニンにのみ依存する。したがって、アルギニン分解酵素を用いて循環するアルギニンをターゲットとすることは、ＡＳＳ陰性腫瘍の成長を妨げるために実行可能な戦略である[Feun et al., Curr. Pharm. Des. 14:1049-1057 (2008); Kuo et al., Oncotarget. 1:246-251 (2010)]。

【0005】

アルギニンは、アルギナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）により分解することができる。これらの中で、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）は、アルギニンに親和性が最も高いようにみえる（低Ｋ_ｍ値）。ＡＤＩは、アルギニンを尿素回路の前記代謝生成物であるシトルリンとアンモニアに転換する。残念なことにＡＤＩは、たとえばマイコプラズマ属などの原核生物にのみ見いだされる。原核生物からのＡＤＩの単離と精製に関しては、いくつかの問題がある。中性ｐＨでは、その酵素活性が低いため、シュードモナス・プチダから単離されたＡＤＩは、生体内で効果を発揮することができない。大腸菌から産生されるＡＤＩは、酵素的に不活性であり、事後的に多様な変性と再生過程を要求し、事後的な生産費用が高くなる。

【0006】

天然の野生型ＡＤＩは、微生物に見いだされるので、抗原性であり、患者の循環系から急速に取り除かれる。天然形態のＡＤＩは、ヒトの循環系への注射により、短い半減期（〜４時間）で免疫原性となり、中和抗体を誘発する［Ensor et al., Cancer Res. 62:5443-5450（2002）；Izzo et al., J. Clin. Oncol. 22:1815-1822（2004）］。これらの欠点はペグ化によって改善できる。さまざまな型のペグ化ＡＤＩのうち、スクシンイミジルスクシナートを介してＰＥＧ（分子量２０，０００）と結合したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）が有効な剤型であることが見いだされている。しかし、ペグ化後のＡＤＩの活性は、約５０％ほど大きく減少する［Ensor et al., Cancer Res. 62：5443-5450（2002）］。ペグ化ＡＤＩを作る以前の試みは、均質ではなく（たんぱく質表面のリシン残基へのＰＥＧのランダム付加による）、また特性を明らかにすることおよび製造プロセスの間で品質管理を実行することが困難な物質であるという結果になった。また、ＰＥＧもまた非常に高価であるので、製造コストが大きく上昇する。ペグ化ＡＤＩを生体内に静脈注射した後には、遊離のＰＥＧの漏れや分離が見られ、（ＰＥＧを有さない）ＡＤＩは、免疫原性の問題を惹起し得る。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Feun et al., Curr. Pharm. Des. 14:1049-1057 (2008); Kuo et al., Oncotarget. 1:246-251 (2010)

【非特許文献2】Ensor et al., Cancer Res. 62：5443-5450（2002）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

したがって、改良されたがん治療組成物、特に活性および生体内の半減期が向上した改良されたがん治療組成物が必要である。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明においては、がん細胞内のアルギニンを効果的に枯渇させるため、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質は、その活性を高め、血漿半減期を増大する。天然のＡＤＩは、微生物に見いだされ、抗原性であり、患者の循環系から急速に取り除かれる。本発明では、より長い生体内半減期（一度の投与後、少なくとも５日間のアルギニンの枯渇）で高い活性を維持するために、１つまたは２つのアルブミン結合タンパク質を有する異種のＡＡＤ融合たんぱく質を構築する。本発明において、ＡＡＤ融合たんぱく質産物中のアルブミン結合たんぱく質は、その特異的な酵素活性に影響せずに、むしろ循環系での半減期を延長するとみられる。野生型ＡＤＩおよび本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、それぞれ８．４Ｕ／ｍｇおよび９．２Ｕ／ｍｇ（生理的ｐＨ７．４）である。

【0010】

広義においては、本発明は、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質がアルギニンデイミナーゼの活性を保持し、血清アルブミンにも結合できるようなアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を形成するために、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ペプチドまたはアルブミン結合たんぱく質から選択される一つまたは二つの構成成分を含む第１の部分を、アルギニンデイミナーゼを含む第２の部分と融合するアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を提供する。

【0011】

本発明は、さらに、ヒトおよび他の動物のがん治療をターゲットとするアルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質を含有する医薬組成物に関する。本発明の１つ目の側面は、がん細胞に対し高い活性を有する組み換えのＡＡＤ融合たんぱく質を構築することである。本発明の２つ目の側面は、粗たんぱく質から、高純度なＡＡＤ融合たんぱく質を精製することである。本発明の３つ目の側面は、循環系においてアルブミンに十分に結合できるように、ＡＡＤ融合たんぱく質の半減期を延ばすことである。本発明の４つ目の側面は、本発明のがん治療用のＡＡＤを含有する医薬組成物を、様々な腫瘍、がん、腫瘍あるいはがんに関連する疾患または他のアルギニン依存性疾患に患う必要とする被験者に投与することによる、がん治療のために本発明のがん治療用のＡＡＤを含有する医薬組成物を使用する方法を提供する。

【0012】

本発明のＡＡＤ融合たんぱく質は、さらにより安定化され、循環系でより長い半減期を有するように、アルブミン結合たんぱく質とＡＤＩが分離することを回避するために、組み換えられる。ＡＤＩは、ＡＡＤ融合製品中のアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質と融合して、血漿半減期を延ばし、融合製品の免疫原性を減らす。アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、血液中のアルブミンと結合するペプチドである。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の親和性が異なるまたは改善された、異種のＡＢＤの変異体が存在する。異種のＡＢＤの変異体は、ＡＤＩから構築することができ、ＡＤＩに融合することができる。天然に存在しているＡＤＩと異なり、ＡＡＤ融合タンパク質のより長い半減期という特性ががん細胞、がん幹細胞および／またはがん前駆細胞中でアルギニンの効果的な枯渇を促進する。

【0013】

ＡＡＤ融合たんぱく質を含有する医薬組成物は、静脈（ｉ.ｖ.)注射（速効性のある薬物の投与のために）および筋肉（ｉ.ｍ.）注射（かなりの速効性および持続性のある薬物の投与のために）に使用できる。本発明のＡＡＤ融合たんぱく質は、膵臓がん、白血病、頭頸部がん、大腸がん、肺がん、乳がん、前立腺がん、子宮頸がん、肝臓がん、上咽頭がん、食道がん、脳がんなど様々ながんの治療に適用できる。本発明は、ＡＡＤ融合たんぱく質、がん治療法、がん組織の治療および／または転移防止法、およびアルギニン欠乏性疾患の治療法に関する。

【0014】

本発明の方法は、がん治療の相乗効果を与えるために、本発明のＡＡＤ融合たんぱく質と異なる化学療法剤および／またはもしくは放射線治療とを併用することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】図１Ａ〜Ｄは、１つまたは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質を有する、３次元構造の異種のＡＡＤ融合タンパク質を構築するためのデザイン設計を示す。１つまたは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＡＤ融合たんぱく質を形成するために、ＡＤＩに融合することができる。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の位置は、ＡＤＩの活性化部位から離れている。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＤＩのＮ末端または／およびＣ末端に融合することができる。本図の構造は、マイコプラズマ・アルギニニのＡＤＩの構造（Protein Data Bank：1LXY）に基づく。図１Ａは、天然のＡＤＩを示す。

【図1B】２つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。

【図1C】Ｎ末端において１つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。

【図1D】Ｃ末端において1つのＡＢＤまたはＡＢＤ１を有するＡＡＤ融合たんぱく質を示す。

【図2】マイコプラズマ・アルギニニ（配列番号２３）、ラクトコッカス・ラクティス（配列番号２４）、バチルス・セレウス（配列番号２５）、バチルス・リケニホルミス（配列番号２６）を含むいくつかの細菌種におけるＡＤＩの配列アラインメントを示す。

【図3A】図３Ａ〜Ｅは、マイコプラズマ・アルギニニ（ＡからＥ）由来のおよびバチルス・セレウス由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｆ)の異種のＡＡＤ融合たんぱく質のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。図３Ａは、マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ａ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図3B】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｂ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図3C】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｃ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図3D】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｄ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図3E】マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｅ）のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図3F】バチルス・セレウス由来のＡＡＤ融合たんぱく質（Ｆ)のデザイン設計とアミノ酸配列を示す。

【図4A】図４Ａ，４Ｂは、以下のスキームのもとで、インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いた２つの態様（Ａ）と（Ｂ)によるＡＡＤ融合たんぱく質を示す。図４Ａは、インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いる１つの態様を示す。

【図4B】インテイン融合たんぱく質と発現したたんぱく質ライゲーション（ＣＢＤ、キチン結合ドメイン）を用いる別の態様を示す。

【図4C】Ｃ末端融合を示す。

【図4D】Ｎ末端融合を示す。

【図4E】インテイン介在たんぱく質ライゲーションを示す。

【図5】ＡＡＤ融合たんぱく質を作るために構築した発現ベクターのプラスミドマップを示す。

【図6A】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの遺伝子マップを示す。（ＡＤＩ：マイコプラズマ・アルギニニのＡＤＩ）

【図6B】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す。

【図6C】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのアミノ酸配列（配列番号４０）を示す。

【図7A】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの遺伝子マップを示す。（ｂｃＡＤＩ：バチルス・セレウスのＡＤＩ）

【図7B】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのヌクレオチド配列（配列番号４５）を示す。

【図7C】Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのアミノ酸配列（配列番号４１）を示す。

【図8A】ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製を示し、２０℃で発現する場合、ＡＡＤは〜９０％溶解性であり（レーン２と３）、３７℃で発現する場合、〜９０％不溶性（封入体）である（レーン４と５）。

【図8B】ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製を示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のゲル中で精製したＡＡＤ融合たんぱく質：レーン１、精製したＡＡＤ融合たんぱく質（５２．８ｋＤａ)；レーン２、分子量マーカー。

【図9】ヒト黒色腫（Ａ３７５）、ヒト結腸がん（ＨＣＴ１１６）、ヒト膵臓がん（ＰａｎｃＩ）を含む試験管内組織培養研究において、ＡＡＤ融合たんぱく質がアルギニンを効果的に枯渇させ、種々のヒトのがん培養細胞株の成長を抑制することを示す。

【図10A】ＡＡＤ融合たんぱく質のアルブミン結合の結果を示し、ＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列は配列番号３６、図３Ａ）の量が増加するよう添加する場合に、ＨＳＡ＋ＡＡＤ複合体の量の増加を示す、未変性のネイティブなポリアクリルアミドゲル（１２％）を示す。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とのモル比：レーン３−６のＡＡＤは、それぞれ１：１、１：２、１：５、１：１５である。レーン１と２は、ＨＳＡとＡＡＤがそれぞれ６，３０ｐｍｏｌｅを示す。

【図10B】ＡＡＤ融合たんぱく質のアルブミン結合の結果を示し、ＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０、図３Ｅ）に基づく別の実験で、アルブミン：ＡＡＤの比が１：８は、存在するすべてのアルブミンと結合するために十分である。

【図11】マウスの血漿アルギニンレベルに対するＡＡＤ融合たんぱく質の用量反応を示すグラフである。ＡＡＤ１００μｇの投与は、少なくとも５日間は血漿アルギニンを枯渇させるのに十分である。

【発明を実施するための形態】

【0016】

「がん幹細胞」という用語は、生体内で腫瘍の成長を引き起こし維持させることができる新生物クローン内で生物学的に区別できる細胞（すなわち発癌性細胞）をいう。

【0017】

アルギニンは、ヒトおよび他のほ乳類にとって準必須アミノ酸である。アルギニンは、尿素回路酵素であるアルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）およびアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）に触媒される２つの段階を経てシトルリンから合成できる。アルギニンは、酵素アルギナーゼによってオルニチンに代謝でき、オルニチンは、ミトコンドリア中のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＯＴＣ）によってシトルリンに転換できる。シトルリンは、アルギニンを再び合成するために利用できる。正常細胞は、ＡＳＳとＡＳＬの触媒作用が活性なため、一般には成長のために外来性のアルギニンの供給を必要としない。対照的に、多くの型のがんは、ＡＳＳを発現しないため、アルギニン栄養要求性である。がんの成長は、循環系からの中のアルギニンにのみ依存する。したがって、アルギニン分解酵素を用いて循環系のアルギニンにターゲットをあてることは、ＡＳＳ陰性腫瘍の成長を妨げるために実行可能な戦略である。

【0018】

アルギニンは、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）によって分解できる。ＡＤＩは、アルギニンを尿素回路の前記代謝産物であるシトルリンとアンモニア転換する。残念ながら、ＡＤＩは、たとえばマイコプラズマ属などの原核生物にのみ見いだされる。原核生物からのアルギニンデイミナーゼの単離と精製に関しては多くの問題が存在する。シュードモナス・プチダから単離されたＡＤＩは、中性ｐＨでの酵素活性が低いため、生体内で効果を発揮しない。大腸菌から産生されるＡＤＩは、酵素的に不活性であり、事後的に多様な変性と再生過程を要求し、事後的な生産費用が高くなる。天然型ＡＤＩの血漿内半減期は、ヒトの血液循環系中に注入されると短い（〜４時間）［Ensor et al., Cancer Res. ６２：５４４３−５４５０ （２００２）；Izzo et al., J. Clin. Oncol. ２２：１８１５−１８２２ （２００４）］。これらの欠点は、ペグ化によって一部改善できる。さまざまな型のペグ化ＡＤＩのうち、スクシンイミジルスクシナートを介してＰＥＧ（分子量２０，０００）と結合したＡＤＩ（ＡＤＩ−ＰＥＧ２０）が有効な剤型であることが見いだされている。しかし、ペグ化後のＡＤＩの活性は、大幅に減少する（〜５０％）［Ensor et al., Cancer Res. ６２：５４４３−５４５０（２００２）；Wang et al., Bioconjug. Chem. １７：１４４７−１４５９（２００６）］。また、スクシンイミジルスクシナートＰＥＧリンカーは、容易に加水分解し、たんぱく質から分離して、体内での短期間の利用の後に免疫原性の原因となる。したがって、改良されたがん治療組成物、特に活性を高めた改良されたがん治療組成物が必要である。

【0019】

シュードモナス・プチダから単離したＡＤＩは、中性ｐＨでは酵素活性がほとんどなく、実験動物の血液循環系から速やかに除去されるため、生体内で効果を発揮することができない。マイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＤＩについては、たとえばTakaku et al, Int. J. Cancer, ５１：２４４−２４９（１９９２）およびU.S. Pat. No. ５，４７４，９２８に記述されている。しかし、このような異種たんぱく質を臨床に使用することに関する問題は、その抗原性にある。シアヌル酸塩化物連結基を介したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とマイコプラズマ・アルギニニ由来からのＡＤＩとの化学修飾については、Takaku et al., Jpn. J. Cancer Res., ８４：１１９５−１２００（１９９３）に記述されている。しかし、修飾たんぱく質は、代謝されると、シアヌル酸塩化物連結基からシアン化合物が遊離するため有毒であった。対照的に、ＡＤＩ−ＰＥＧ２０においてさえ、ＰＥＧリンカーは、容易に加水分解し、たんぱく質から分離して、体内での短期間の利用の後に免疫原性の原因となる。したがって、非必須アミノ酸を分解し、先行技術に関連する問題を有さない組成物が必要である。

【0020】

黒色腫、膵臓がん、大腸がん、白血病、乳がん、前立腺がん、腎細胞がんおよび肝臓がんを含む多くの型のがんでは、がん細胞は、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ）が発現しないので、アルギニン栄養要求性であり、アルギニン枯渇療法の優れたターゲットとなっている。本発明において、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ（ＡＡＤ）融合たんぱく質は、がん細胞中のアルギニンを効果的に枯渇させるために、長い半減期で高い活性を有する。

【0021】

ＡＤＩ単量体の大きさは、約４５ｋＤａであり、二量体（約９０ｋＤａ）で存在する［Das et al., Structure. １２：６５７−６６７（２００４）］。ＡＡＤ融合タンパク質の構造を図１に示す。配列番号４６−４９に示すリンカーを有するまたは有さない１つあるいは２つのアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＡＤ融合タンパク質を形成するために、ＡＤＩと融合する。１つあるいは２つの特定のアルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の選択が、ターゲットとなるがん組織の型、融合たんぱく質の望ましい大きさと半減期、およびドメインあるいはたんぱく質全体を選択するかどうかに応じて行われることは特筆すべきである。さらに、選択されたアルブミン結合物質は同一であっても、異なっていてもよい。すなわち、結果として得られる分子がＡＤＩの活性を保持して、融合タンパク質の一の部分の機能が融合タンパク質の他の部分により妨げられずに血清アルブミンと結合できる限り、１つのたんぱく質と１つのペプチドは、融合でき、２つのたんぱく質、２つのドメイン、１つのドメインと１つのペプチドなどが融合できる。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質の位置は、活性部位から離れている。アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質は、ＡＤＩのＮ末端または/およびＣ末端に融合できる。異なるあるいは改良されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の親和力を示す異種のＡＢＤの変異体がある。異種のＡＢＤの変異体は、構築することができ、ＡＤＩに融合することができる。ＡＤＩを備えるいくつかの微生物（たとえばシュードモナス属細菌）は、その潜在的な病原性と発熱性のために使用することができない。ＡＤＩのソースは、限定されるものではないが、異なる微生物、たとえばマイコプラズマ属（たとえばマイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・アルスリチジス、マイコプラズマ・ホミニス）、ラクトコッカス属（たとえばラクトコッカス・ラクティス）、シュードモナス属（たとえばシュードモナス病原因菌、シュードモナス・プチダ、緑膿菌）、連鎖球菌属（たとえば化膿性連鎖球菌、Streptococcus pneumonia、肺炎レンサ球菌）、大腸菌属、マイコバクテリウム属（たとえばマイコバクテリウム・ツベルクローシス）およびバチルス属（たとえばバチルス・リケニホルミス、バチルス・セレウス）などである。ＡＤＩは、マイコプラズマ・アルギニニ、ラクトコッカス・ラクティス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・セレウス、またはこれらの組み合わせからクローン化されているのが好ましい。配列番号２３−３５のこれらのアミノ酸配列および図２のアミノ酸配列のうちいくつかの配列アライメントは、本発明および文献に記述されている［Das et al., Structure. 12:657-667（2004）；Wang et al., Bioconjug. Chem. 17:1447-1459（2006）；Ni et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 90:193-201 (2011)］。

【0022】

（Ａ）天然のマイコプラズマ・アルギニニＡＤＩたんぱく質（配列番号２３）、（Ｂ）マイコプラズマ・アルギニニＡＤＩ（配列番号３６−４０）由来の異種のＡＡＤ融合たんぱく質、および（Ｃ）バチルス・セレウスＡＤＩ（配列番号４１）由来のＡＡＤ融合たんぱく質のデザインとアミノ酸配列を図３に示す。異種のＡＡＤ融合たんぱく質を上手く構築している。これらの実施形態において、リンカーをアルブミン結合たんぱく質とＡＡＤ融合タンパク質中のＡＤＩとの間に挿入する。

【0023】

一方、新規なＡＡＤ融合たんぱく質は、インテイン融合たんぱく質を利用して作り、たんぱく質ライゲーションを発現する（図４）。新規なＡＡＤ融合たんぱく質は、ＡＤＩとＡＢＤが共有結合によって結合するように、（１）ＡＢＤのＣ末端で、Ｎ末端にシステイン残基を有するADIを反応性チオエステルとの反応によって、または（２）ＡＤＩのＣ末端で、Ｎ末端にシステイン残基を有するＡＢＤを反応性チオエステルとの反応によって形成することができる。図４Ｅにおいて、Ｎ末端にシステイン残基を有するＡＤＩは、ＡＢＤのＣ末端で反応性チオエステルと反応する。ＡＢＤのＣ末端におけるチオエステルタグとＡＤＩのＮ末端におけるα−システインがたんぱく質ライゲーションを促進するために要求される。これらのフラグメントは、ｐＴＷＩＮ１ベクター（New England Biolabs）を利用し、製造マニュアルにしたがって生産する。特に、ＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ融合たんぱく質をコードする遺伝子を合成し、大腸菌で発現させるためにＴ７プロモーターの制御下でベクターにクローン化する（図４Ｃ）。生産したＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ融合たんぱく質は、カラム中でキチンと結合する。ＡＢＤ−インテイン−ＣＢＤ（配列番号４２）のアミノ酸配列を図４Ａに示す。チオール誘導性開裂とカラムからの溶出の後、Ｃ末端に反応性チオエステルを有するＡＢＤを得る（図４Ｃ）。一方で、ＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ融合たんぱく質をコードする遺伝子を合成し、大腸菌で発現させるためにＴ７プロモーターの制御下でベクターにクローン化する（図４Ｄ）。生産されたＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ融合たんぱく質は、カラム中でキチンと結合する。ＣＢＤ−インテイン−ＡＤＩ（配列番号４３）のアミノ酸配列を図４Ｂに示す。ｐＨ７、２５℃で開裂し、カラムから溶出した後、Ｎ末端にα−システインを有するＡＤＩを得る（図４Ｄ）。最終的に、ＡＡＤ融合たんぱく質は、図４Ｅに示すように、たんぱく質ライゲーションにより生産する。

【0024】

重要なことは、ＡＡＤ融合たんぱく質が簡便な方法で生産でき、精製できることである。たとえば、ＡＡＤ融合たんぱく質は、大腸菌で上手く発現され、可溶性画分と不可溶性画分との双方から精製され、この結果を図８に示す。さらに、図８は、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析された精製ＡＡＤ融合たんぱく質を示す。精製ＡＡＤ融合たんぱく質の大きさは、５２．８ｋＤａとして測定される。

【0025】

本発明の医薬組成物は、がん治療においてがん細胞中のアルギニンを枯渇させるために高い活性をもつＡＡＤ融合たんぱく質を含有する。精製したＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、野生型ＡＤＩの特異的な活性と似ていることがわかっている。ＩＣ_５０は、最大半減抑制濃度であり、これはすなわちがん細胞株を５０％抑制するために必要なＡＡＤ融合たんぱく質の濃度を表す。前記ＩＣ_５０は、薬物の有効性の基準である。異なるがん細胞株（ヒト黒色腫A375 & SK-mel-28、ヒト結腸がんHCT116、ヒト膵臓がんPancI、ヒト肝臓がんSk-hep1、ヒト子宮頸がんC-33A）に対するＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列を図３Ｅの配列番号４０に示す）のＩＣ_５０を表１に示す。異なるがん細胞株でのＡＡＤ融合たんぱく質の生体外の有効性を図９に示す。これは、ＡＡＤ融合たんぱく質がヒト黒色腫、ヒト結腸がんおよび膵臓がんの細胞株を含む多くの型のがんを殺傷できることを示している。

【0026】

【表1】

【0027】

アルブミン結合の研究のために、我々は、操作されたＡＡＤ融合たんぱく質がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合できることを成功裡に示している。図１０は、ＡＡＤ融合たんぱく（アミノ酸配列を図３Ｅ、配列番号４０に示す）がＨＳＡと容易に結合することを示している。モル比１：５あるいは１：１５で、ＨＳＡ−ＡＡＤ複合体の形成は、図１の構成に従い、リンカー分子デザインを利用して行う。血液中を循環するＡＡＤ融合たんぱく質の半減期は、非共有ＨＳＡ−ＡＡＤ複合体の形成によって増加することが期待される。したがって、長続きする半減期を有する型のＡＡＤ融合たんぱく質を成功裡に作り出す。

【0028】

本発明において調整されたＡＡＤ融合たんぱく質を含有する医薬組成物と比較して高い有効性を示す市販の製品は無い。がん治療に使用するために、本発明の医薬組成物を含有するＡＡＤ融合たんぱく質は、腫瘍細胞中のアルギニンを枯渇するための抗がん剤として提供される。ＡＡＤ融合たんぱく質は、他の分子をターゲットとした薬剤または細胞毒性薬と併用するためのよい候補である。

【実施例】

【0029】

次の実施例は、如何なる意味でも本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の特定の実施態様を説明するものとして提供される。

【0030】

下記のいくつかの実施例は、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質の生産方法に関する。クローニングおよびインテイン媒介性たんぱく質連結を含む様々な技術を利用できる。ここで使用されるように、「クローニング」の語は、幅広く用いられ、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質コードする融合遺伝子を構築して、融合遺伝子をベクターに挿入し、ベクターを宿主に挿入し、アルブミン結合アルギニンデイミナーゼ融合たんぱく質を含有するたんぱく質を発現することを含む。この技術の数多くの変形を実行できるが、本発明によって検討されたクローニング内に含まれる。

【0031】

実施例１
アルブミン結合ドメイン／ペプチド／たんぱく質（ＡＢＤ）の遺伝子コーディングの構築

【0032】

ＡＢＤの遺伝子コーディングはポリメラーゼ連鎖反応を二巡することにより構成される。一巡目ではポリメラーゼ連鎖反応混合物（総量２５μｌ）は次の物質を含む。
１×ｉＰｒｏｏｆ ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）
５０ µＭ ｄＮＴＰ 混合物
０．５単位のｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）
各１０ｎＭの下記オリゴ
ＡＢＤ−Ｆ１ フォワードプライマー（配列番号０１）：
5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’
ＡＢＤ−Ｒ２ リバースプライマー（配列番号０２）：
5’-TAGTCACTTACTCCATATTTGTCAAGTTCTCTGTTAGCTAAGACTTTAGC-3’
ＡＢＤ−Ｆ３ フォワードプライマー（配列番号０３）：
5’-GAACTTGACAAATATGGAGTAAGTGACTATTACAAGAACCTAATCAACAA-3’
ＡＢＤ−Ｒ４ リバースプライマー（配列番号０４）：
5’-TACACCTTCAACAGTTTTGGCATTGTTGATTAGGTTCTTGTAATAGTCAC-3’
ＡＢＤ−Ｆ５ フォワードプライマー （配列番号０５）：
5’-GCCAAAACTGTTGAAGGTGTAAAAGCACTGATAGATGAAATTTTAGCTGC-3’
ＡＢＤ−Ｒ６ リバースプライマー （配列番号０６）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８°Ｃ ３０秒； ２０サイクルの｛９８℃ １０秒、５０℃ ２０秒、７２℃ ２０秒｝

【0033】

ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応の２ラウンド二巡目において、ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応混合物（総量５０ｎμｌ）は次の材料物質を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ ｄＮＴＰ混合物；
１μｌのＤＮＡテンプレートとしての１ラウンド目のＰＣＲ反応物；
１単位のｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＢＤ−Ｆ７ フォワードプライマー（配列番号０７）：
5’-CATGATGCGAATTCCTTAGCTGAAGCTAAAGTCTTAGCTAACAGAGAACT-3’
ＡＢＤ−Ｒ８ リバースプライマー（配列番号０８）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃ ３０秒；３５サイクルの{９８℃ １０秒、６０℃ ２０秒、７２℃ ２０秒｝； ７２℃ ５分

【0034】

ＡＢＤのＤＮＡ配列（１６９塩基対）を含むＰＣＲ産物を得て、クローニングの目的でＱｉａｇｅｎのＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって精製する。

【0035】

実施例２Ａ
ＡＡＤ融合たんぱく質の融合遺伝子コーディングの構築

【0036】

１回目のＰＣＲにおいて、ＰＣＲ混合物（総量５０μｌ）は、以下の材料を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ ｄＮＴＰ混合物;
２５ｎｇのマイコプラズマ・アルギニニゲノムＤＮＡ;
１単位のｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＤＩＮｄｅ−Ｆ フォワードプライマー（配列番号０９）：
5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’
ＡＤＩｈｉｓ−Ｒ リバースプライマー（配列番号１０）：
5’-AGCTAAGGAATTCGCATCATGATGGTGATGGTGGTGGCTACCCCACTTAAC-3’

以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃ １分；３５サイクルの｛９８℃ １０秒、５０℃ ２０秒、７２℃ ４０秒｝；７２℃ ５分

１２８０塩基対の長さを持つＰＣＲ産物を得て、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって精製する。その後、２回目のＰＣＲを行う。ＰＣＲ混合物（総量５０μｌ）は以下の物質を含む：
１×ｉＰｒｏｏｆ ＰＣＲ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
５０μＭ ｄＮＴＰ混合物；
１０ｎｇの１２８０塩基対のＰＣＲ産物；
１０ｎｇの１６９塩基対のＰＣＲ産物；
１単位のｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）；
各２００ｎＭの下記オリゴ：
ＡＤＩＮｄｅ−Ｆ フォワードプライマー（配列番号１１）：
5’-ATCGATCGATGTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’
ＡＢＤ−Ｒ１０ リバースプライマー（配列番号１２）：
5’-AGCTACGATAAGCTTAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATCTATCAGTG-3’

以下のＰＣＲプログラムが用いられる：
９８℃ １分；３５サイクルの｛９８℃ １０秒、５０℃ ２０秒、７２℃ ４５秒｝；７２℃ ５分

【0037】

塩基対１４２８のＰＣＲ産物を得て、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって精製する。その後、制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで分解し、同酵素であらかじめ分解したプラスミドｐＲＥＳＴ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）とライゲーションする。ライゲーション産物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換する。構築した融合遺伝子の配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認する。

【0038】

実施例２Ｂ
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩのクローンニング

【0039】

Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの構築（図３Ｅ中、配列番号４０）は、オーバーラップＰＣＲの２つの段階を経て行われ、最終段階で得られるＰＣＲフラグメントをベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入する。Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの遺伝子マップ、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図６に示す。
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ＡＤＩの構築に含まれるプライマー：
ｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ フォワードプライマー（配列番号１３）：
5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’

ＡＢＤｎｎ−Ｒ１ リバースプライマー（配列番号１４）：
5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’

ＡＢＤｎ−Ｒ２ リバースプライマー（配列番号１５）：
5’-AGAACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’

ＡＤｌｎ−Ｆ フォワードプライマー（配列番号１６）：
5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTTCTGTATTTGACAGTAAATTTAAAGG-3’

ＡＤＩＢａｍ−Ｒ リバースプライマー（配列番号１７）：
5’-TAGATCAATGGATCCTTACCACTTAACATCTTTACGTGATAAAG-3’

【0040】

ＰＣＲの第１ラウンドにおいて、５０μｌの既知濃度の構成成分物質を含む反応ボリュームを２つのＰＣＲチューブ内に調整する。各チューブにおいて、ｄＮＴＰ、ｉＰｒｏｏｆ 緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）、ｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製））、プライマーおよびＤＮＡテンプレートを混合し、５０μｌまでｄｄＨ_２Ｏを加える。反応で用いるＤＮＡテンプレートは、ＡＤＩ遺伝子のたんぱく質配列を変えずに、内部ＮｄｅＩサイト変異を除去したマイコプラズマ・アルギニニ由来のＡＤＩの遺伝子を含むｐＥＴ３ａベクターである。

【0041】

２つの反応チューブは、（Ａ）１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ（配列番号１３）、０．５ｐｍｏｌのＡＢＤｎｎ−Ｒ１（配列番号１４）および１０ｐｍｏｌのＡＢＤｎ−Ｒ２（配列番号１５）、および（Ｂ）１０ｐｍｏｌのＡＤＩｎ−Ｆ（配列番号１６）および１０ ｐｍｏｌのＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号１７）のプライマー混合物をそれぞれ含む。

【0042】

ＰＣＲプログラムは、マニュアルにて推奨される段階にしたがって、５０℃（２０秒）と７２℃（４０秒）それぞれでアニーリングと伸展の温度（時間）でセットする。２３７ｂｐと１２７８ｂｐの大きさを有する２つの産物をＰＣＲによって生成する。この産物を抽出し、次のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして用いる。

【0043】

２回目のオーバーラップ段階において、使用するテンプレートが１ラウンド目のＰＣＲより得られた１ｐｍｏｌの２３７ｂｐＰＣＲ産物と１ｐｍｏｌの１２７８ｂｐＰＣＲ産物の混合物であるということ以外は、１ラウンド目と同様に反応混合物を調整する。使用するプライマーは、１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ（配列番号１３）および１０ｐｍｏｌのＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号１７）に変更する。

【0044】

アニーリングと伸展の温度（時間）は、それぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（６０秒）である。１４８４ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が反応により生じる。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって分解し、あらかじめ分解されたｐＥＴ３ａプラスミドとライゲーションする。ライゲーション産物は、組換えたんぱく質の製造のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。

【0045】

実施例２Ｃ
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩのクローンニング

【0046】

Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの構築（図３Ｆ中、に示す配列番号４１）は、オーバーラップＰＣＲの２つの段階を経て行い、最終段階で得られるＰＣＲのフラグメントをベクターｐＥＴ３ａのＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入する。Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの遺伝子マップ、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を図７に示す。
Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ポリＮ−ｂｃＡＤＩの構築に含まれるプライマー：
ｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２ フォワードプライマー（配列番号１８）：
5’-GGAGATATACATATGCATCATCACCATCACCATGATGAAGCCGTGGATG-3’

ｂｃＡＢＤｎｎ−Ｒ１ リバースプライマー（配列番号１９）：
5’-TTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGAAGGTAATGCAGCTAAAATTTCATC-3’

ｂｃＡＢＤｎ−Ｒ２ リバースプライマー（配列番号２０）：
5’-TTTACCGCCGCTACCATTGTTATTATTGTTGTTACTACCCGA-3’

ｂｃＡＤｌｎ−Ｆ フォワードプライマー（配列番号２１）：
5’-AATAATAACAATGGTAGCGGCGGTAAACATCCGATACATGTTACTTCAGA-3’

ｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ リバースプライマー（配列番号２２）：
5’-TAGATCAATGGATCCCTAAATATCTTTACGAACAATTGGCATAC-3’

【0047】

ポリメラーゼ連鎖反応の第１ラウンド目において、５０μｌの既知濃度の構成成分を含む反応ボリュームを２つのＰＣＲチューブ内に調整する。各チューブにおいて、ｄＮＴＰ、ｉＰｒｏｏｆ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）、ｉＰｒｏｏｆ ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製)、プライマーおよびＤＮＡテンプレートを混合し、５０μｌまでｄｄＨ_２Ｏを加える。反応で用いるＤＮＡテンプレートは、ＡＤＩ遺伝子のたんぱく質配列を変えずに、内部ＮｄｅＩサイト変異を除去したセレウス菌由来のＡＤＩの遺伝子を含むｐＥＴ３ａベクターである。

【0048】

２つの反応チューブは、（Ａ）１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２（配列番号１８）、０．５ｐｍｏｌのｂｃＡＢＤｎｎ−Ｒ１（配列番号１９）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＢＤｎ−Ｒ２（配列番号２０）；および（Ｂ）１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩｎ−Ｆ（配列番号２１）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号２２）のプライマー混合物をそれぞれ含む。ＰＣＲプログラムは、マニュアルにて推奨される段階にしたがってアニーリングと伸展の温度（時間）をそれぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（４０秒）でセットする。２３７ｂｐと１２５０ｂｐの大きさの２つの産物がＰＣＲによって生成する。それらの産物を抽出し、次のラウンドのＰＣＲのテンプレートとして適用する。

【0049】

２回目のオーバーラップ段階において、使用するテンプレートが一ラウンド目のＰＣＲにより得た１ｐｍｏｌの２３７ｂｐＰＣＲ産物と１ｐｍｏｌの１２５０ｂｐＰＣＲ産物の混合物であるということ以外は、１ラウンド目と同様に反応混合物を調整する。使用するプライマーは、１０ｐｍｏｌのｈｉｓＡＢＤＮｄｅ−Ｆ２（配列番号１８）および１０ｐｍｏｌのｂｃＡＤＩＢａｍ−Ｒ（配列番号２２）に変更する。

【0050】

アニーリングと伸展の温度（時間）は、それぞれ５０℃（２０秒）と７２℃（６０秒）である。１５１２ｂｐの大きさのＰＣＲ産物が反応により生じる。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩによって分解し、あらかじめ分解したｐＥＴ３ａプラスミドにライゲートする。ライゲート産物は、組換えたんぱく質の製造のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。

【0051】

実施例３
ＡＡＤ融合たんぱく質の発現と精製

【0052】

種培養の準備のために、ＡＡＤ融合たんぱく質（図５）をコードするプラスミドのキャリアである大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を５ｍｌの２×ＴＹ培地にて、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養する。一晩の種培養（２．５ｍｌ）に、３７℃、２５０ｒｐｍ、２．５時間（ＯＤ_６００≒０．６〜０．７まで）で２５０ｍｌの２×ＴＹを加える。ＯＤ_６００に到達した時点で、ＩＰＴＧを培地に加える（最終濃度０．２ｍＭ）。２０℃でさらに２２時間成長を続け、その後遠心分離によって細胞を回収する。細胞ペレットをｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２５ｍｌに再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。遠心分離の後、可溶性部分を回収する。その後、融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）をニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。表２は、培養温度が、発現した宿主から得られるＡＡＤ融合たんぱく質（アミノ酸配列を図３Ｅの配列番号４０に示す）の、溶解性に影響を与える重要な要因であることを示す。

【0053】

ＡＡＤ融合たんぱく質の可溶性画分を単離するために、細胞ペレットをｐＨ７．４、２５ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭに再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。可溶性部分を遠心分離の後、回収する。その後、ＡＡＤ融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）を、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーによって精製する。

【0054】

ＡＡＤ融合たんぱく質の不溶性画分を単離するために、トリトン−Ｘ−１００を１％含む、２０ｍＭトリス塩酸２５ｍｌ、ｐＨ７．４に細胞ペレットを再懸濁する。細胞を超音波処理によって溶解する。不溶性部分（封入体）を遠心分離によって回収する。たんぱく質を、６Ｍのグアニジン塩酸塩を含む２０ｍＭトリス塩酸１０ｍｌ、ｐＨ７．４によってアンフォールドし、溶解するまでボルテックスする。アンフォールドしたたんぱく質液を高速攪拌している２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍｌ、ｐＨ７．４、に一滴ずつ加えることによって、たんぱく質を再びフォールドする。不溶性材料を遠心分離によって除去する。たんぱく質の塩析は、固体の硫酸アンモニウム粉末を７０％の飽和状態となるまで上澄みに加えることによって行う。不溶性部分を遠心分離によって回収し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌに再懸濁する。その後、ＡＡＤ融合たんぱく質（Ｈｉｓタグを含む）をニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。

【0055】

【表2】

【0056】

実施例４
ＡＡＤ融合たんぱく質の酵素活性アッセイおよび酵素反応速度論

【0057】

野生型ＡＤＩおよび本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の酵素活性を測定するために、シトルリン検出のためのジアセチルモノオキシム（ＤＡＭ）−チオセミカルバジド（ＴＳＣ）アッセイを用いる。反応を以下に示す。

【数1】

【0058】

このアッセイは、ＤＡＭ−ＴＳＣ液に酸性塩化鉄溶液を混合して作られた呈色試薬を検体に加えることにより行う。簡単にいえば、２０ｍＭアルギニンおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムとともに、ｐＨ７．４、３７℃で５分間、酵素を培養する。反応混合物を１００℃で５分間加熱すると、発色し、５４０ｎｍ（光路＝１ｃｍ）で読み取る。様々な濃度のシトルリンを用いて、標準曲線を作成する。ＡＤＩ天然酵素の一単位は、アッセイの条件下で、３７℃で１分間に１μｍｏｌのアルギニンを１μｍｏｌのシトルリンに転換する酵素活性量である。野生型ＡＤＩと本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性は、それぞれ８．４Ｕ／ｍｇおよび９．２Ｕ／ｍｇ（ｐＨ７．４、生理的ｐＨ）である。異なるｐＨ範囲（ｐＨ５．５〜９．５）においても、野生型ＡＤＩと本発明のＡＡＤ融合たんぱく質の特異的な活性を測定し、最適なｐＨは６．５である。それゆえ、この結果は、アルブミン結合たんぱく質がＡＤＩの酵素活性に影響を与えないので、ＡＡＤ融合たんぱく質がアルギニンを効果的に枯渇させることを示している。

【0059】

ミカエリス定数Ｋ_ｍは、反応速度が最大速度の半分であるときの基質濃度であり、酵素に対する基質の親和性の逆の尺度である。Ｋ_ｍの値が小さいことは、基質への親和性が高いことを示し、これは反応速度が最大反応速度により速く近づくことを意味する。酵素反応速度論またはＫ_ｍの値を測定するために、異なる基質濃度のアルギニン（２０００μＭ、１０００μＭ、５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭ、６２．５μＭ）、ｐＨ７．４のもとで、野生型ＡＤＩおよびＡＡＤ融合たんぱく質の活性を測定する。図３Ｅに示す（配列番号４０、ＡＤＩたんぱく質はマイコプラズマ・アルギニニ由来である）ＡＡＤ融合たんぱく質および図３Ｆに示す（配列番号４１、ＡＤＩたんぱく質はバチルス・セレウス由来である）で測定したＫ_ｍの値は、それぞれ０．００４１ｍＭおよび０．１３２ｍＭである。この結果は、ＡＢＤへの融合が異種のＡＡＤ融合たんぱく質のアルギニンに対する結合親和性に影響を与えないことを示唆する。

【0060】

実施例５
がん細胞株上におけるＡＡＤ融合たんぱく質の細胞増殖アッセイおよび生体外での有効性

【0061】

ＤＭＥＭ培地をヒト黒色腫Ａ３７５およびＳＫ−ｍｅｌ−２８、ヒト膵臓がんＰａｎｃＩならびにヒト子宮頸がんＣ−３３Ａ株の成長に用いる。ＥＭＥＭ培地をヒト肝臓がんＳＫ−ｈｅｐ１およびヒト子宮頸がんＣ−３３Ａ株の培養に使用する。培地１００μｌ中の細胞株（２〜５×１０^３）を９６ウェルプレートのウェルに播種し、２４時間培養する。その培地を異なる濃度のＡＡＤ融合たんぱく質を含有する培地と交換する。プレートをさらに３日間、３７℃、９５％空気、５％ＣＯ_２の雰囲気で培養する。製造指示書にしたがって、培地中の生細胞の数を、ＭＴＴアッセイで測定する。細胞成長を、５０％阻害を達成するのに必要な酵素の量をＩＣ_５０と定義する。

【0062】

表１および図９に示すとおり、結果は、ＡＡＤ融合たんぱく質は、アルギニンを効果的に枯渇させ、生体外の組織培養研究において様々な型のヒトがん細胞株の成長を阻害することを示す。たとえば、ヒト黒色腫、ヒト結腸がん、ヒト膵臓がん、ヒト肝臓がん、ヒト子宮頸がんすべてにおいて、これらのすべての型のがんは、ＡＡＤ融合たんぱく質によってただちに阻害されているので、ＩＣ_５０の値が低い（表１参照）。予想どおり、ＡＡＤ融合たんぱく質はアルギニン依存性であるすべての型のがん（たとえばＡＳＳ陰性がん）を阻害する。

【0063】

実施例６
生体内におけるＡＡＤ融合たんぱく質の半減期の測定

【0064】

ｂaｌｂ／ｃマウス（生後５〜７週）を本研究に用い、マウスを実験の一週前に環境に順応させる。マウス（ｎ＝３）を４つの群に分け、０、１００、５００、１０００μｇのＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０，図３Ｅ）を有する１００μｌのＰＢＳを腹腔内に注射する。各マウスの血液を０時間および１〜７日に得る。遠心分離後に血清を得る。血清を除たんぱくし、アルギニン用のアミノ酸分析によって分析する。

【0065】

図１１に示すように、ＡＡＤ融合たんぱく質（配列番号４０、図３Ｅ）は、最も低い投与量である１００μｇであっても、１日、３日および５日目に血漿アルギニンを効果的に枯渇させており、ＡＡＤが生体内で少なくとも５日間は効果的にアルギニンを枯渇させることができることを示唆する。アルギニンのレベルは、６日および７日目にすべての処理群においてゆっくり正常に戻っている。

【0066】

実施例７
異種移植したがん細胞におけるＡＡＤ融合たんぱく質の生体内効果

【0067】

ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（生後５〜７週）を本研究に使用し、実験の一週前に環境に順応させる。２×１０^６のがん細胞を有する新しい培地１００μｌをマウスに皮下接種する。１０日後、マウスを無作為に対照群と処理群に分ける。対照群にはＰＢＳ１００μｌを毎週腹腔内に投与し、処理群にはＡＡＤ融合たんぱく質１００μｌを毎週腹腔内に投与する。腫瘍の大きさをキャリパにより測定し、腫瘍の容積を式：（長さ×幅^２）／２を用いて計算する。各処理後５日目にアルギニンの血漿測定のために採血する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]