特許 6243577 新規な細胞透過性ペプチド及びこれとボツリヌストキシン結合体、およびこれらの用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6243577

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】新規な細胞透過性ペプチド及びこれとボツリヌストキシン結合体、およびこれらの用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171127BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20171127BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20171127BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20171127BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 17/04 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20171127BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20171127BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20171127BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61Q 19/06 20060101ALI20171127BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C07K14/33

   C07K7/08

   C12N1/21

   C12P21/02 Z

   A61K38/16

   A61P25/08

   A61P21/02

   A61P29/00

   A61P25/04

   A61P17/04

   A61P17/00

   A61K47/64

   A61K8/64

   A61Q19/08

   A61Q19/00

   A61Q19/06

【請求項の数】21

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2017-515651(P2017-515651)

(86)(22)【出願日】2015年5月29日

(65)【公表番号】特表2017-527300(P2017-527300A)

(43)【公表日】2017年9月21日

(86)【国際出願番号】KR2015005434

(87)【国際公開番号】WO2015183044

(87)【国際公開日】20151203

【審査請求日】2016年11月30日

(31)【優先権主張番号】62/004,426

(32)【優先日】2014年5月29日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509212764

【氏名又は名称】プロセル セラピューティックス インコーポレーティッド

(73)【特許権者】

【識別番号】516359207

【氏名又は名称】エーティージーシー カンパニー、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＴＧＣ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イ、ビョン キュ

(72)【発明者】

【氏名】イ、カン チン

(72)【発明者】

【氏名】キム、ミンチュン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ホンキュ

【審査官】 植原 克典

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５０２８９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０７７６８０（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ ７／０８

Ｃ０７Ｋ １４／３３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的な活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドとして、上記のペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる、細胞透過性のペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のペプチドをエンコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

上記のポリヌクレオチドが配列番号２の塩基配列からなることを特徴とする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

ボツリヌストキシンの軽鎖の一側または両側末端に、配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性のペプチドが融合された、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項5】

上記のボツリヌストキシン組換えタンパク質は、配列番号３１ないし配列番号５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項6】

上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、配列番号３ないし配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項7】

上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、一側末端にヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグ（ｔａｇ）をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項8】

上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、ボツリヌストキシン血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項9】

上記の融合は、上記のボツリヌストキシンの軽鎖のカルボキシ末端、アミノ末端またはこれらの両方に上記の細胞透過性ペプチドが融合されることを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項10】

上記の融合は、ペプチド結合または共有結合によりなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質。

【請求項11】

請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質をエンコードするポリヌクレオチド。

【請求項12】

上記のポリヌクレオチドが配列番号５９ないし配列番号８６からなる群より選択される塩基配列からなることを特徴とする、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。

【請求項14】

上記の組換え発現ベクターは、Ｈｉｓ、ＨＡＴ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびＭａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎからなる群より選択される親和性標識（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。

【請求項15】

請求項１３に記載の組換え発現ベクターで形質転換された細菌。

【請求項16】

請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療用の薬剤学的組成物。

【請求項17】

上記の薬剤学的組成物は、経皮投与用であることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、皮膚外用剤組成物。

【請求項19】

請求項４に記載の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、化粧料組成物。

【請求項20】

上記の組成物は、シワ、四角い顎およびつきだしてる顎、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドの症状を改善させるのに適用されることを特徴とする、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

請求項１５に記載の形質転換細菌を培養する段階を含む、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な細胞透過性ペプチドおよび上記の細胞透過性ペプチドとボツリヌストキシン軽鎖の一側末端が融合された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質およびこれらの用途に関するものである。

【背景技術】

【0002】

ボツリヌストキシンは、腐った缶詰や肉で育つグラム陽性嫌気性のバクテリアであるボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）が作り出す神経毒素である。これは、８つの神経毒素に分類され、この中で７種（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）は、神経の麻痺を引き起こすことができる。サイズは約１５０ｋＤａで、ボツリヌストキシンタンパク質の以外に、非毒素タンパク質（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｎ）の複合体で構成され、各複合体のサイズは、神経毒素の種類に応じて、最大９００ｋＤａまで生成される。ボツリヌスキシンの型に応じて作用形態と対象、活性期間などが異なるが、その中でボツリヌストキシンＡ型の場合、致命的な生物学的作用剤の一つとして知られている。

【0003】

ボツリヌストキシンは、筋肉の痙攣または収縮を誘発するシグナルを遮断して麻痺をもたらす作用をするため、これらの機能で１９８９年に米国ＦＤＡの承認後に、治療または美容の目的のために用いられている。治療目的のためには、斜視 （ｓｔｒａｂｉｓｍｕｓ）、斜頸（ｔｏｒｔｉｃｏｌｌｉｓ）または顔面痙攣（ｂｌｅｐｈａｒｏｓｐａｓｍ）のような神経筋疾患で、美容の目的のためには、シワ、しかめシワの除去と四角い顎の治療、多汗症（ｈｙｐｅｒｈｉｄｒｏｓｉｓ）または片頭痛（ｍｉｇｒａｉｎｅ）の治療に注射剤として用いられている。副作用としては、嚥下障害（ｄｙｓｐｈａｇｉａ）、声の変化（ｖｏｉｃｅ ｃｈａｎｇｅ）、口渇（ｄｒｙ ｍｏｕｔｈ）およびぼけ視（ｂｌｕｒｒｅｄ ｖｉｓｉｏｎ）などのような事例が報告されたが、まだボツリヌストキシンによる直接的な死亡事故がないので、適切に用いると、非常に安全な薬品で評価されている。ただし、薬物に対する過敏症があったり、筋骨格系の疾患がある場合、妊婦や授乳婦の場合には、適用に制限がある。

【0004】

現在のボツリヌストキシンの活用において、皮膚組織に注入されたボツリヌストキシンの持続時間は、３〜６ヶ月以内であり、ボツリヌストキシンによって神経と筋肉の間のシグナル伝達が遮断されると、新しい神経の枝が作られ、ボツリヌストキシンによる神経の麻痺効果を軽減させるので、定期的な処置が必要である。また、ボツリヌストキシンを繰り返し投与する場合、生体内ボツリヌストキシンに対する抗体が形成されて効果が減少する限界がある。

【0005】

また、これらのボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果はほとんど注射剤を介してのみ活用されているので、利用対象者の利便性を提供することができる他の効果的な伝達手段を見つけるために多くの研究がなされているが、まだ不十分な実情である。

【0006】

一方、外部の環境と常に接している身体の組織である皮膚は、体液の漏れ及び感染防止、水分消失を防ぐ防護障壁としての主な機能を担当し、構成は表皮、真皮、および皮下組織で構成されている。表皮の角質層は、皮膚の最外郭に存在しながら、皮膚の外への水分と電解質の消失を抑制することにより、皮膚の乾燥を防ぎ、皮膚が正常な生化学的な代謝をすることができる環境を提供する。また、皮膚の角質層は、外部の物理的な損傷と化学物質から人体を保護し、細菌、カビ、ウイルスなどが皮膚に侵入することを防止する重要な役割を果たしている。

【0007】

皮膚を介した吸収経路は、角質層を通じた吸収、毛嚢と皮脂腺を通じた吸収、汗腺を通じた吸収などの３つの経路があり、皮膚を通じた活性物質の伝達は、皮膚の構造的、物理的な特性の上、いくつかの制限がある。特に、皮膚の角質層は、皮膚の主要構成の細胞である角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）が自然死されて、皮膚の最外郭層に緻密な構造をなしており、汗や各種の脂質成分によりｐＨ５付近の酸味を示す。これらの角質層の障壁を透過するためには、通常、分子量が１，０００以下である必要があって、親脂質の特性を保持している状態で可能だという報告がある。

【0008】

美容及び医薬用の原料として頻繁に用いられる低分子の合成化合物または天然化合物は、細胞内に伝達されやすいと知られているが、タンパク質、ペプチド、および核酸などの巨大分子は、分子量のサイズと親水性の性質のために、二重脂質膜の構造になっている細胞膜の中に透過しにくいので、実際に皮膚の障壁を構成する角質層の固有の特性により、低分子量の物質の透過効率が極めて低く、高分子量の物質の透過効率はさらに低いことが知られている。

【0009】

したがって、ボツリヌストキシンを経皮に伝達するためには、これらの皮膚障壁を透過して、ボツリヌストキシンを伝達することができる伝送体が必須的に求められる。これらの低分子および巨大分子が細胞の原形質膜を通過する効率を高めるための方法として、タンパク質伝達体を適用することができる。広く知られているタンパク質伝達体（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）では、まず、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａなどのＰＴＤを例に挙げられるが、正電荷を持つ短い長さのペプチドとして、タンパク質だけでなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂肪、炭水化物、化合物またはウイルスを細胞内に伝達できることが知られており、受容体非依存的であり、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）または食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）のメカニズムで細胞膜を透過すると報告されている。これらのＰＴＤの長い歴史と同じくらい、これを用いた様々な応用が試されたが、現在までに開発に成功した事例はないと把握される。ＨＩＶ−Ｔａｔ由来のＰＴＤの場合は、ペプチドが、ウイルスに由来するので、安全性の側面で問題が提起され、特に、このようなＰＴＤ系列の伝送ドメインは単独で用いる場合、種類に応じて、２〜５μＭ以下の低濃度で細胞内の伝送率が急激に低下する問題点があることと知られている。また、分子量が３０，０００Ｄａ以上のタンパク質とＰＴＤを結合して細胞内に伝送しようとする場合、ＰＴＤ−タンパク質融合体は、ほとんどエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）にエンドソーム（Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の形で細胞内に伝送される傾向を見せ、エンドソームは細胞質内のライソソムと結合してライソソム内に存在する加水分解酵素によってほとんどのＰＴＤ−タンパク質融合体が分解されて、一部の損傷されていないＰＴＤ−タンパク質融合体だけが細胞質内に遊離されると報告されることもあった。したがって、ＰＴＤを活用した機能性タンパク質の皮膚の伝送のために期待する効能発現のために多量のＰＴＤ融合タンパク質が必要とされ、これは経済的な側面で望ましくない結果を招くことになるだろう。

【0010】

これらのＰＴＤが持つ問題点を解決するとともに、薬物的な価値を高めるために、従来のＰＴＤとは異なる特性を持つ疎水性または両親媒性のペプチドである巨大分子伝達ドメインＭＴＤ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）（大韓民国特許登録第１０−１２５８２７９号）が開発された。 ＭＴＤは、ＰＴＤに比べて、細胞内の物質伝達効率が向上されて、構造および静電気的な特性が異なる新しい細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）である。ＭＴＤの細胞内の伝送プロセスは、ＰＴＤとは異なり、内包作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、およびエネルギーは必要とせず、細胞膜の剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）と完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が重要な要素として作用するので、細胞膜との直接的な相互作用（ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が重要であると提案された。このようなペプチドの細胞膜の透過現象は、早い生体内半減期または細胞膜透過が難しくて薬物として使用しにくかった治療用のタンパク質、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡのような核酸物質を細胞内に伝送して、新規な治療薬物としての開発価値を高めることができる。また、ＭＴＤは、従来の細胞透過性ペプチドであるＨＩＶ−Ｔａｔ由来ペプチドに比べて化合物、ペプチド、およびタンパク質などの一名貨物（ｃａｒｇｏ ｍａｔｅｒｉａｌ）の伝達効率が高いため、ボツリヌストキシンの外用剤の開発の際に、その活用性が高いと判断される。

【0011】

また、本発明で求めようとする皮膚透過および神経末端細胞透過ボツリヌストキシンの軽鎖または軽鎖誘導体は、弱毒化（ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）のプロセスを経ても、安全性を確保するために、１〜１０ｐｐｍの濃度で、その使用量が制限されるべきであることに、ＰＴＤを皮膚透過および神経細胞の透過手段としての活用は適していないと判断され、これを克服するための方案として、皮膚の障壁の透過と神経細胞の透過性を同時に有し、低濃度でも濃度依存的に皮膚障壁を透過するＭＴＤを活用したり、または新規にこのような特性を有するＭＴＤの開発が要求された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、上記のように分子量のサイズと皮膚角質層の固有特性により、皮膚を通過しにくいボツリヌストキシンタンパク質を効率的に透過させ、続いて皮膚組織に存在している神経細胞まで伝達するために考案されたものであって、ボツリヌストキシンの重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）のｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎに由来された生物学的な活性分子の細胞内輸送を媒介することができる新規の細胞透過性ペプチドを提供することを目的とする。

【0013】

また、本発明は、上記の細胞透過性ペプチドがボツリヌストキシンの軽鎖の一側または両側の末端に融合された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を提供することを他の目的とする。

【0014】

また、本発明は、上記のボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む組成物を提供し、より詳しくは、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の経皮を介した伝達を可能とし、皮膚学的に様々な治療および美容学的な目的のために局所的に用いることができる組成物を提供することを他の目的とする。

【0015】

しかし、本発明が解決しようとする技術的な課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるだろう。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は生物学的な活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドとして、上記のペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性ペプチドを提供する。

【0017】

本発明は、上記のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0018】

本発明の一実施例で、上記のポリヌクレオチドが配列番号２の塩基配列からなることができる。

【0019】

本発明は、ボツリヌストキシンの軽鎖の一側または両側末端に配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性のペプチドが融合された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を提供する。

【0020】

本発明の一実施例で、上記のボツリヌストキシン組換えタンパク質は、配列番号３１ないし配列番号５８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることができる。

【0021】

本発明の他の実施例で、上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、配列番号３ないし配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることができる。

【0022】

本発明の他の実施例で、上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、一側末端にヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグ（ｔａｇ）をさらに含むことができる。

【0023】

本発明の他の実施例で、ボツリヌストキシンの軽鎖は、ボツリヌストキシン血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群より選択されることができる。

【0024】

本発明の他の実施例で、上記の融合は、上記のボツリヌストキシンの軽鎖のカルボキシ末端、アミノ末端またはこれらの両方に上記の細胞透過性ペプチドが融合されることができる。

【0025】

本発明の他の実施例で、上記の融合はペプチド結合または共有結合によりなることができる。

【0026】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0027】

本発明の他の実施例で、上記のポリヌクレオチドが配列番号５９ないし配列番号８６からなる群より選択される塩基配列からなることができる。

【0028】

本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。

【0029】

本発明の一実施例で、上記の組換え発現ベクターは、Ｈｉｓ、ＨＡＴ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＳＢＰ、Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅおよびＭａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎからなる群より選択される親和性標識（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）を含むことができる。

【0030】

本発明は、上記の組換え発現ベクターで形質転換された細菌を提供する。

【0031】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む、顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療用の薬剤学的組成物を提供する。

【0032】

本発明の一実施例で、上記の薬剤学的組成物は、経皮投与用であることができる。

【0033】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む皮膚外用剤組成物を提供する。

【0034】

本発明は、上記の 細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む化粧料組成物を提供する。

【0035】

本発明の一実施例で、上記の組成物はシワ、四角い顎およびつきだしてる顎、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドを改善させるのに適用されることができる。

【0036】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を個体に経皮投与する段階を含む、顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療方法を提供する。

【0037】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を個体に経皮投与する段階を含む、シワ、 四角い顎およびつきだしてる顎、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドの改善方法を提供する。

【0038】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患を治療する用途を提供する。

【0039】

本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質のシワ、 四角い顎およびつきだしてる顎、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドの症状を改善するのに用いられる用途を提供する。

【0040】

本発明は、上記の形質転換細菌を培養する段階を含む細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の生産方法を提供する。

【発明の効果】

【0041】

ボツリヌストキシンは、筋肉けいれんまたは収縮を誘発するシグナルを遮断して麻痺をもたらす作用をする。このようなボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果は、今は顔面痙攣、筋緊張、片頭痛、顎関節障害、多汗症などの治療とシワ改善、毛穴縮小、にきび、弾力付与、四角い顎の緩和などの審美的、美容学的な分野で活用されている。しかし、現在までは経皮伝達のための効果的な手段がなく、上記の目的の効果を得るためには、注射を通じた施術方法にのみ依存してきたものがほとんどである。したがって、注射を必要としないボツリヌストキシンの局所適用が可能になれば、より安全で望ましい治療的代案になることができるだろう。それで、本発明の細胞透過性ペプチド−ボツリヌストキシン組換えタンパク質によると、皮膚の複合層と神経細胞を通過して、神経細胞のスネアタンパク質（ＳＮＡＲＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）を切断して活性を示すことができ、一般的なボツリヌストキシンに比べて分子量が大幅に小さいので抗体の生成の可能性を著しく減少させることができ、中和抗体の形成に伴う効能低下を減少させることができる。

【0042】

また、本発明の細胞透過性ペプチド−ボツリヌストキシン組換えタンパク質は、経皮を介した伝達が可能にすることにより、ボツリヌストキシンの固有の効能を保持するとともに、利便性が拡大されて、これを用いた様々な疾患の治療、審美的および/または美容目的のために局所作用剤として効果的に活用することができる。

【0043】

また、ボツリヌストキシンＡ型は、わずかのピコグラム（ｐｇ）の量だけで深刻な毒性を発現するが、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシンは、マイクログラム（μｇ）のレベルで毒性が発現されるように弱毒化されたので、ボツリヌストキシンの毒性から安全性を十分に確保することができる。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】図１は、細胞透過性ペプチドＴＤ１の特性を表に示したものである。

【図2】図２は、細胞透過性ペプチドＴＤ１の構造を解析して、図に示したものである。

【図3a-3b】図３ａ及び図３ｂは、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）の細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能をフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認したものである。

【図3c】図３ｃは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）に対する細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能をフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認したものである。

【図3d】図３ｄは、神経細胞（Ｕ−８７ＭＧ ｃｅｌｌ）に対する細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能をフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認したものである。

【図3e】図３ｅは、ＨｅＬａ ｃｅｌｌに対する細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能をフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認したものである。

【図4a】図４ａは、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図4b】図４ｂは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図4c】図４ｃは、神経細胞（Ｕ−８７ＭＧ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図4d】図４ｄは、ＨｅＬａ ｃｅｌｌからの細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図5】図５は、細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの精製プロセスを模式図に示したものである。

【図6】図６は、精製された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの純度と分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確認したものである。

【図7a】図７ａは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能をフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて確認したものである。

【図7b】図７ｂは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図7c】図７ｃは、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ透過能を共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて確認したものである。

【図8】図８は、人工皮膚模写膜での細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの透過能を確認したものである。

【図9】図９は、精製された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅの活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したものである。

【図10a】図１０ａは、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅの活性を確認したものである。

【図10b】図１０ｂは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅの活性を確認したものである。

【図11a】図１１ａは、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの細胞毒性を評価したものである。

【図11b】図１１ｂは、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）で細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの細胞毒性を評価したものである。

【図12】図１２は、保管期間による精製された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認したものである。

【図13】図１３は、化粧用製剤に組成した細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの安全性と皮膚刺激性試験を臨床試験機関を通じて評価した結果である。

【図14a-14c】図１４ａ、図１４ｂ及び図１４ｃは、化粧用製剤に組成した細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの臨床効能を臨床試験機関によって評価した結果である。

【図15】図１５は、化粧用製剤に組成した細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのほうれい線の臨床効能を臨床試験機関によって評価した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本発明は、新規の細胞透過性ペプチドとこれを用いたボツリヌストキシンの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の経皮伝達組成物および方法を提供する。本発明によれば、開発された新規の細胞透過性ペプチドＴＤ１はボツリヌストキシンの軽鎖が、適切な製剤の局所適用により、経皮的に投与されるようにする伝送システムに適したものと確認された。

【0046】

ボツリヌストキシンは、一つのポリペプチドで発現となるが、発現した後の再構成プロセスによって、約１００ｋＤａの重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ、Ｈ鎖）と約５０ｋＤａの軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ、Ｌ鎖）に分かれることになり、Ｈ鎖とＬ鎖はジスルフィド結合で連結されている。Ｈ鎖は、神経細胞の受容体と結合してエンドサイトーシスを介してボツリヌストキシンが内部に入るようにする。ボツリヌストキシンのＬ鎖は、細胞内に入った後、エンドソームを出て、細胞質に入り、細胞質内のスネアタンパク質（ＳＮＡＲＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）を切断してアセチルコリンの分泌を抑制させて、筋肉麻痺効果を示す。したがって、神経細胞のアセチルコリンの分泌抑制は、Ｌ鎖単独でも可能であり、Ｈ鎖とＬ鎖は、それぞれ独立して機能することができる。これに着目して、筋肉麻痺効果を有するＬ鎖のみを適用して経皮伝達が可能な形で開発しようとした。

【0047】

しかし、分離された分子量５０ｋＤａのボツリヌストキシンの軽鎖は、細胞膜を透過することができないため、そのままでは機能することができない。一般的に、ボツリヌストキシンの軽鎖が、神経細胞内の細胞質に伝達され、ボツリヌストキシンの特有の活性を表すためには、約１００ｋＤａのボツリヌストキシンの重鎖の助けが必ず必要である。ボツリヌストキシンの重鎖は、神経細胞膜の受容体に結合する部位（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）と細胞膜に内在されて軽鎖の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を容易にする部位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）の二つの部位で構成されている。

【0048】

本発明では、ボツリヌストキシン、より具体的には、ボツリヌストキシンの軽鎖を皮膚内部および神経細胞に効率的に伝達するための方法を研究努力した結果、ボツリヌストキシンの重鎖の構造的な解析を通じて、細胞内伝送を可能にする新規の細胞透過性ペプチドを開発した。

【0049】

まず、ボツリヌストキシン重鎖の中で伝送部位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）の３次元構造をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで解析して、細胞透過性ペプチドとしての開発の可能性があるタンパク質の結合部位（ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）の配列を抽出し、選別した。続いて、複数のタンパク質の分泌に関与するシグナルタンパク質（ｓｉｇｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはウイルスタンパク質（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）由来のペプチドと細胞膜を貫通して細胞の内部にタンパク質などの巨大分子の流入を媒介する、従来の巨大分子伝達ドメイン（ＭＴＤ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎ）（大韓民国登録特許第１０−１２５８２７９号）との配列比較を介して選別された配列から透過能が付与されるようにアミノ酸を除去し、置換するなど、数回のシミュレーションのプロセスを行った。上記のペプチドは、両親媒性で極性アミノ酸の配置で細胞膜へのアクセシビリティを増加させ、物性と可用性を改善させ、非極性アミノ酸の追加で細胞膜透過に適した疎水性を付与するプロセスを経て、新規の細胞透過性ペプチドを開発し、上記の新規の細胞透過性ペプチドは、ヒトの皮膚の角質形成細胞と神経細胞に対する透過性を同時に保持することを確認し、これに基づいて、本発明を完成した。

【0050】

したがって、本発明は、新規の細胞透過性ペプチドを提供し、より具体的には、生物学的な活性分子の細胞内輸送を媒介することができるペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性ペプチドを提供する。

【0051】

本発明では、上記の新規の細胞透過性ペプチドは、生物学的な活性分子の細胞内への輸送を媒介することができるペプチドとして、「ＴＤ１」と命名した。

【0052】

本発明の細胞透過性ペプチドＴＤ１は
１）１３個のアミノ酸で構成されており;
２）分子量が約１５３７Ｄａであり;
３）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｐＩは９．３１で解析することができ;
４）断片の疎水性アミノ酸の構成が６０％以上である両親媒性ペプチドであり;
５）ＰｒｏｔＰａｒａｍプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｃｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ参照）を用いて解析されたｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘが４９．６５の値で配列の安定性が評価されて、
６）Ａｌｉｐｈａｔｉｃ ｉｎｄｅｘが９７．６９の値で全体の分子のサイズが評価されて；
７）ＧＲＡＶＹ（Ｇｒａｎｄ Ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）が０と評価されてペプチドの凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が改善され；
８）サポートベクターマシン（Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ、ＳＶＭ）分類アルゴリズムに基づいて、細胞透過性ペプチドを予測する解析では、ＳＶＭの値が−０．１５で評価された特性を有する配列である。

【0053】

本発明では、細胞透過性ペプチドそのものは、好ましくは、定義された酵素または治療的、生物学的な活性を持たないが、細胞膜を介して細胞内伝送を可能にする伝送体（ｃａｒｒｉｅｒ）としての役割を果たす。これは、細胞内に伝送しようとするｃａｒｇｏのＮ−末端またはＣ−末端と、両末端に付着することができ、それぞれの末端から順方向または逆方向に取り付けることができる。また、本発明によるペプチドは、好ましくは、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）として適用されるが、これに限らず、二量体（ｄｉｍｅｒ）またはポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒ）の形態の構成でも用いることができる。さらに、本発明によるペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を最小の単位で含まれているペプチドであることができる。本発明によるペプチド配列ＴＤ１に基づいていずれか一側または両側末端に１つ以上のアミノ酸を追加して、細胞膜アクセシビリティ、透過性及び物性に変化を与えることができる。好ましくは２５ないし７５％の範囲の疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を有するように選択され、組換えタンパク質の精製プロセスで凝集される現象が発生される場合、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）の特徴を有する配列を追加して活用することもできる。

【0054】

本発明の他の態様として、本発明は、上記のペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを提供する。つまり、配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性ペプチドをエンコードし、配列番号２の塩基配列からなることができるが、これに限定されるものではない。

【0055】

本発明によるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形であることができるが、上記のＤＮＡはｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であることができる。もし一本鎖であれば、これはコード鎖または非−コード鎖（アンチセンス）鎖であることができる。上記のコード配列は、配列番号２の塩基配列と同一することができるし、または他のコード配列であることができるが、上記のコード配列は、遺伝的なコードの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の結果として、同じポリペプチドをエンコード（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）することができる。

【0056】

本発明の一実施例では、本発明による細胞透過性ペプチドＴＤ１の細胞透過性を確認した結果、皮膚の角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ、Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌ）及びＨｅＬａ ｃｅｌｌですべて顕著に優れた細胞透過性を示すことを確認した（実施例２および３を参照）。

【0057】

本発明の他の態様として、本発明は、ボツリヌストキシンの軽鎖の一側または両側末端に配列番号１のアミノ酸配列からなる細胞透過性ペプチドが融合された、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を提供する。

【0058】

本発明で、「細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質」とは、新規の細胞透過性ペプチドＴＤ１とボツリヌストキシンの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）を含み、これらのペプチド結合または共有結合のような化学的な結合で形成された結合体を意味する。つまり、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質は、細胞内への導入が容易でない巨大分子であるボツリヌストキシンの軽鎖に特定の細胞透過性ペプチドを融合させ、細胞透過性を付与することにより、ボツリヌストキシンの軽鎖を細胞内に高効率で伝達するものである。この際に、上記の融合は、上記のボツリヌストキシンの軽鎖のカルボキシ末端、アミノ末端またはこれらのすべて、上記の細胞透過性ペプチドが融合することができる。

【0059】

本発明で、用語「ボツリヌストキシン」は、細菌によって、または組換え技術によって生成されるか、操作された変異体又は融合タンパク質を含めて、引き継いで発見されることができるかどうかに関係なく、任意の公知された種類のボツリヌストキシンを意味する。

【0060】

本発明で、ボツリヌストキシンの軽鎖は、ボツリヌストキシン血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧからなる群より選択することができ、この際に、上記のボツリヌストキシンの軽鎖は、配列番号３ないし配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸配列からなることができる。また、一側末端にヘキサヒスチジン（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）タグ（ｔａｇ）をさらに含むことができる。

【0061】

本発明では、ボツリヌストキシンの軽鎖は、代案的にボツリヌストキシン誘導体、すなわち、ボツリヌストキシン活性を有するが、任意の部分または配列の上に１つ以上の変形を有する化合物であることができる。たとえば、７種の血清型のボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質に備えて、アミノ酸配列上の缺失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、修正（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）またはキメラ融合（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｆｕｓｉｏｎ）などの方法を適用して軽鎖のｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅの活性が維持されると同時に、特性を強化したり、副作用を減少させる方法で変形された形態であることができる。または遺伝子組換えまたは化学的な合成で製造されたボツリヌストキシンの軽鎖またはボツリヌストキシンの軽鎖の一部を用いることができる。

【0062】

本発明では、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質は、配列番号３１ないし配列番号５８で構成された群より選択されるアミノ酸配列からなることができ、これらをエンコードするポリヌクレオチドは、配列番号５９ないし配列番号８６から構成される群より選択される塩基配列からなることができるが、これに限定されるものではない。

【0063】

本発明の他の実施例では、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の細胞透過性を確認した結果、皮膚の角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）、神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ、Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌ）及び皮膚模写人工膜（Ｓｔａｒｔ−Ｍ）に対して著しく優れた細胞透過性を表すことを確認した（実施例６および７を参照）。

【0064】

本発明の他の態様として、本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。

【0065】

本発明では、「組換え発現ベクター」とは、適切な宿主細胞で目的タンパク質または目的ＲＮＡを発現することができるベクターとして、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調整要素を含む遺伝子コンストラクトを意味する。

【0066】

本発明においての用語、「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、一般的な機能を行うように核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを意味する。例えば、プロモーターとタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列が作動可能に連結されてコードする核酸配列の発現に影響を与えることができる。組換え発現ベクターとの作動的な連結は、当該の技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位−特異的なＤＮＡ切断および連結は、当該の技術分野で一般的に知られている酵素などを用いる。

【0067】

本発明で使用可能な発現ベクターは、プラスミドベクター、コースミッド（ｃｏｓｍｉｄ）ベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない。適切な発現ベクターは、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、オペレータ（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、終結コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ）、ポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）のような発現調節配列に加えて、膜標的化または分泌のためのシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含めて目的に応じて様々に製造することができる。発現ベクターのプロモーターは、構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）であることができる。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができ、複製が可能な発現ベクターである場合、複製起源を含むことができる。また、Ｈｉｓ、ＨＡＴ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ＳＢＰ、キチン結合ドメイン（Ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）、グルタチオン-Ｓトランスフェラーゼ（ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びマルトース結合タンパク質（Ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）で構成された群より選択される親和性標識（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ）も含むことができる。

【0068】

本発明の他の態様として、本発明は、上記の組換え発現ベクターで形質転換された形質転換細菌を提供する。

【0069】

本発明の他の態様として、本発明は、上記の形質転換細菌を培養する段階を含む、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の生産方法を提供する。

【0070】

上記の生産方法は、本発明の形質転換細菌に導入された組換え発現ベクターで、本発明の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが発現されるように形質転換細菌を適切な培地および条件の下で培養することによって行われる。上記の形質転換細菌を培養して組換えタンパク質を発現させる方法は、当該の分野で公知られており、例えば、形質転換細菌が成長することができる適切な培地に接種して種菌培養した後、これを本培養用の培地に接種し、適切な条件、例えば、遺伝子発現誘導剤であるイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，ＩＰＴＧ）の存在下で培養することにより、タンパク質の発現を誘導することができる。培養が完了されたら、上記の培養物から実質的に純粋な組換えタンパク質を回収することができる。本発明においての用語、「実質的に純粋な」とは、本発明の組換えタンパク質およびこれをコードするポリヌクレオチドの配列が宿主細胞に由来される他のタンパク質を実質的に含まないことを意味する。

【0071】

上記の形質転換細菌で発現された組換えタンパク質の回収は、当該分野で公知された様々な分離及び精製方法を通じて行うことができ、一般的に細胞破片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、およびリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行うことができ、透析、電気泳動、および各種カラムクロマトグラフィーなどを行うことができる。上記のクロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル−ろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相−ＨＰＬＣ、吸着クロマトグラフィー、親和性（ａｆｆｉｎｉｔｙ）カラムクロマトグラフィー、および限外ろ過などの技法を単独または併用して用いることができる。

【0072】

一方、組換え発現ベクターで形質転換された細菌で発現される組換えタンパク質は、タンパク質の分離の際にタンパク質の特性に応じて、溶解性分画（ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）と不溶解性分画（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）に区分することができる。発現されたタンパク質のほとんどが溶解性分画に存在する場合には、上記に記述された方法に基づいて容易にタンパク質を分離及び精製することができるが、発現されたタンパク質のほとんどが不溶解性分画、すなわち、封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）の形で存在する場合には、尿素、界面活性剤などのタンパク質変性剤が含まれる溶液で最大限にタンパク質を溶解させた後、遠心分離して透析、電気泳動、および様々な種類の樹脂が充填された各種のカラムクロマトグラフィーなどを行うことにより、精製することができる。この際に、タンパク質変性剤が含まれる溶液によってタンパク質の構造が変形され、その活性を失うことがあるので、不溶解性分画からタンパク質を精製するプロセスの中には、脱塩および原状化（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要である。すなわち、上記の脱塩および原状化の段階は、タンパク質変性剤が含まれていない溶液を用いて透析及び希釈を行ったり、またはフィルターを用いて、遠心分離をすることができる。また、上記の溶解性分画からタンパク質を精製するプロセスの中にも精製の際に用いる溶液内の塩の濃度が高い場合には、これらの脱塩および原状化の段階を行うことができる。

【0073】

一方、本発明の他の実施例では、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の効能を評価した結果、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）でもボツリヌストキシンの活性が維持されており、ボツリヌストキシンと同じ機能をすることを確認した（実施例８および９を参照）。また、ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）および神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）で細胞毒性が表示されないだけでなく（実施例１０を参照）、安定性も非常に優れていることを確認した（実施例１１を参照）。したがって、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）は、様々な疾患の治療、審美的および/または美容の目的のために局所作用剤として効果的に活用することができる。

【0074】

したがって、本発明の他の態様として、本発明は、細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む、顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療用の薬剤学的組成物を提供する。本発明の薬剤学的組成物は、有効成分である細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質の以外に、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、この際、本発明の薬剤学的な組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体としては、食塩水、緩衝食塩水、水、グリセロールおよびエタノールなどがあるが、これに限定されず、当該技術分野で知られている適切な製剤は、すべて使用可能である。

【0075】

本発明の他の態様として、本発明は、ボツリヌストキシン組換えタンパク質を有効成分として含む皮膚外用剤の組成物または化粧料組成物を提供する。上記の組成物は、シワ、四角い顎およびつきだしてる顎の矯正、傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴の縮小、弾力の付与、リフティングまたはケロイドの症状を緩和または改善させるのに適用されることができるが、これに限定されるものではない。本発明による組成物を用いて、皮膚の下の筋肉または線構造体に麻痺を誘導して収縮を緩和したり、弛緩を起こしたり、他の美容学的に望む効果のために有効量を伝達させることができる。

【0076】

本発明の他の実施例では、本発明による細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質のシワ改善効能の評価を行った結果、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を４週間連続的に使用する場合、皮膚のほうれい線と皮膚の弾力の改善に役に立つことを確認した（実施例１３を参照）。

【0077】

本発明の化粧料組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型としても製造することができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、およびワックスファンデーションなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、またはパウダーの剤形で製造することができる。

【0078】

本発明の化粧料組成物に含有される化粧品学的に有効な担体は、剤形に応じて、当業界で通常的に用いられる担体を用いることができる。本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合には、担体の成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などを用いることができる。

【0079】

本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体の成分として溶媒、溶解化剤または油濁化剤が用いられて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

【0080】

本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体の成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラカントなどを用いることができる。

【0081】

本発明の剤形が界面−活性剤含有のクレンジングである場合には、担体の成分として脂肪族アルコール硫酸、脂肪族アルコールエーテル硫酸、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテル硫酸、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

【0082】

本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分と担体成分に加えて、化粧料組成物に通常的に用いられる成分を含むことができ、例えば保湿剤、抗酸化剤、芳香剤、充填剤、漸増剤、染料、着色剤、界面活性剤、天然または合成オイル、保存剤、浸透剤、水和剤、抗真菌剤、乳化剤溶媒、軟化剤、消臭剤、ワックスなどを含むことができ、必要に応じて植物エキス、コンディショニング剤、色素沈着製又は美白剤、日焼け止め剤、湿潤剤、ビタミン、および誘導体などを含む、そのような製品で通常的に用いられる他の成分を含むことができる。

【0083】

本発明の他の態様として、本発明は、上記の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質を個体に局部投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）する段階を含む顔面痙攣、まぶた痙攣、斜頸、眼瞼痙攣、頸部の筋緊張異常症、咽頭中央部の筋緊張異常症、痙攣性発声障害、片頭痛、肛門掻痒症および多汗症で構成される群より選択される疾患の治療方法、またはシワ、四角い顎及びつきだしてる顎傷、皮膚軟化、傷跡、にきび、毛穴、弾力またはケロイドの改善方法を提供する。本発明で、「個体」とは、疾患の治療または皮膚の改善を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非−ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬と牛などの哺乳類を意味する。

【0084】

本発明に適用される「局部投与（ｌｏｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」とは、薬剤の生物学的な効果を必要とする動物の身体の上の、または体内の部位またはその付近に薬物を直接投与することを意味する。局部投与は、静脈内投与または経口投与のような全身的な経路の投与は排除する。局所投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、薬剤学的な製剤をヒトの皮膚に塗布する、局部投与の一形態で含まれる。本発明の組成物は、上記の皮膚学的、美容的な目的の効果を得るために経皮的に投与されることが望ましい。

【0085】

本発明の組成物において、本発明の組換えタンパク質の総有効量は、単一の投与量（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｓｅ）で患者に投与することができ、複数の投与量（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｏｓｅ）が長期間投与される分割治療方法（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）によって投与されることもあり、症状の程度に応じて、有効成分の含有量を異にすることができる。これは、求める筋肉麻痺または生物学的または審美的な効果をもたらすのに十分であるが、内在的に安全な量を意味する。しかし、上記の組換えタンパク質の濃度は、薬の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率など、さまざまな要因を考慮して、患者に対する有効な投与量が決定されることができる。

【0086】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより理解しやすくするために提供されているものであり、下記の実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。

【実施例】

【0087】

実施例１．新規な細胞透過性ペプチドの作製
ボツリヌストキシンの軽鎖の経皮伝達を実現させることができる新規の皮膚透過性及び細胞透過性ペプチドを開発した。まず、ボツリヌストキシンの重鎖と軽鎖の構造と機能を解析し、ボツリヌストキシンＡ型の神経細胞透過に重鎖が重要な役割をするという点に着目して、これを基に配列を選別した。また、従来の巨大分子の細胞内伝送ドメインＭＴＤの配列と比較解析して、両親媒性で極性アミノ酸の配置で細胞膜アクセシビリティを増加させ、物性と可用性を改善させて、非極性アミノ酸の追加で細胞膜透過に適した疎水性を付与するプロセスを経て、配列番号１のアミノ酸配列からなる新規の細胞透過性ペプチドを設計した。上記のように設計された細胞透過性ペプチドをＴＤ１と命名し、これの特性と構造をＰｒｏｔＰａｒａｍプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｃｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ）で解析し、その結果を図１および図２に示した。

【0088】

実施例２．フローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能を確認
上記の実施例１により作製された新規の細胞透過性ペプチドＴＤ１の皮膚細胞及び神経細胞の透過能を確認するためにフローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて実験を実施した。ＴＤ１の細胞透過性を比較するために、従来に開発された細胞透過性ペプチドであるｋＦＧＦ４と、代表的なタンパク質伝送配列ＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）であるＨＩＶ−Ｔａｔを対照ＭＴＤで用いて、各ペプチド試料は、ＦＩＴＣで蛍光標識し、ペプチド合成の専門機関（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌｔｄ．（Ｓａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を介して合成して備えた。

【0089】

２‐１．皮膚の角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）での定量的細胞透過能を確認
皮膚の角質形成細胞であるＨａＣａＴ ｃｅｌｌにおける細胞透過能を確認するために、ＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、ＨａＣａＴ ｃｅｌｌを培養した。フローサイトメトリー測定のために、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで置き換え、１６〜２４時間の追加培養し、各試料は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で１時間（処理濃度５μＭ、１０μＭ）と３時間（処理濃度２．５μＭ、５μＭ、10μＭ）の間に処理した。反応時間が終了した後、ＤＰＢＳで２回洗浄して残余分の試料を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理、光を遮断したまま、１０分間反応させた後、完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ）を用いて、トリプシン-ＥＤＴＡを不活性化させた。 その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液３ｍＬを加えて、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのＦＡＣＳチューブにリン酸緩衝溶液２００μＬを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。実験グループには、Ｃｅｌｌ ｏｎｌｙおよびＦＩＴＣ ｏｎｌｙ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチドを用いて、細胞透過能がないと思われるＳｃｒａｍｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅに備えて、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチド及びＴＤ１の伝送能を決定した。その結果、図３ａ及び図３ｂに示すように、ＴＤ１が対照群に比べて、角質形成細胞で顕著に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。

【0090】

２‐２．神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）での定量的細胞透過能を確認
神経細胞株であるＳｉＭａ ｃｅｌｌに対する細胞透過能を確認した。ＳｉＭａ ｃｅｌｌは培養プレートに対する細胞付着能が弱いので、ｇｅｌａｔｉｎ（ｓｉｇｍａ、Ｇ２５００）をコーティングした培養プレートを用いるが、０．１％ｇｅｌａｔｉｎ溶液を培養プレートにコーティングして、室温で１時間の後、溶液を除去し、乾燥した状態で用いた。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａは、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、８０％以上のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙで継代培養した。細胞は、繰り返して継代培養で安定化させた後、１００ｍｍ培養プレート当たり５Ｘ１０^５／ｗｅｌｌで細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ_２の条件の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した後、実験した。

【0091】

各試料（対照物質：ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ、ＦＩＴＣ ｏｎｌｙ、比較物質：ＨＩＶ−Ｔａｔ＆ｋＦＧＦ４由来のペプチド、実験材料：ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地で１時間と６時間の間、５μＭの濃度で処理した。反応時間が終了した後、ＤＰＢＳで２回洗浄して残余分の試料を除去し、０．０５％トリプシン-ＥＤＴＡを処理、光を遮断したまま、１０分間反応させた後、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａを用いて、トリプシン-ＥＤＴＡを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液３ｍＬを加えて、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのＦＡＣＳチューブにリン酸緩衝溶液２００μＬを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。測定されたＦｌ−１の幾何平均（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅａｎ； ｇｅｏ．ｍｅａｎ）の値でｋＦＧＦ４由来のペプチドに備えて、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチドおよびＴＤ１の伝送能を決定した。その結果、図３ｃに示すように、ＴＤ１が対照群に比べて、神経細胞でも、優れた細胞透過性を示すことが確認できた。

【0092】

２‐３．神経細胞（Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌ）での定量的な細胞透過能の確認
神経細胞（Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌ）で細胞透過能を確認するために、ＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて細胞を培養した。フローサイトメトリー測定のために、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで細胞を接種して、１６〜２４時の間に培養して、各試料（対照物質：ｃｅｌｌ ｏｎｌｙ、ＦＩＴＣ ｏｎｌｙ、ｓｃｒａｍｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、比較物質：ｋＦＧＦ４由来のペプチド、実験材料：ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で各１時間と６時間の間、５μＭ、１０μＭの濃度で処理した。反応が終わった後、ＤＰＢＳで２回洗浄して残余分の試料を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理、光を遮断したまま、１０分間反応させた後、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａを用いて、トリプシン−ＥＤＴＡを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液３ｍＬを加えて、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのＦＡＣＳチューブにリン酸緩衝溶液２００μＬを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。 細胞内に透過されたＦＩＴＣレベルの測定のために、ＦＬ−１の波長を用いて、測定されたＦｌ−１のｇｅｏ．ｍｅａｎ値で試料の蛍光値を補正するためにｓｃｒａｍｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅの値に基づいて伝送能を決定した。その結果、図３ｄに示すように、ＴＤ１が従来に知られている細胞透過性ペプチドであるｋＦＧＦ４由来のペプチドと比べて、神経細胞（Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌ）で優れた細胞透過性を示すことが確認できた。

【0093】

２‐４．ＨｅＬａ ｃｅｌｌでの定量的な細胞透過能の確認
ＨｅＬａ ｃｅｌｌ（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）で細胞透過能を確認するために、ＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて細胞を培養した。フローサイトメトリー測定のために、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで置き換え、１６〜２４時間の追加培養し、各試料は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で各時間と処理濃度に応じて反応させた。反応時間が終了した後、ＤＰＢＳで２回洗浄して残余分の試料を除去し、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを処理した後、光を遮断したまま、１０分間反応させ、完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ）を用いて、トリプシン−ＥＤＴＡを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液３ｍＬを加え２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。 上澄み液を除去した後、それぞれのＦＡＣＳチューブにリン酸緩衝溶液２００μＬを入れた後、細胞を十分に再懸濁させ、フローサイトメトリー測定を行った。実験グループでは、ＴＤ１、ＨＩＶ−Ｔａｔ及びｋＦＧＦ４由来のペプチドを用いて、測定されたＦｌ−１のｇｅｏ．ｍｅａｎの値で、各時間別、濃度別の伝送能を決定した。その結果、図３ｅに示すように、ＴＤ１はＨｅＬａ ｃｅｌｌで１２時間以内に濃度依存的に細胞内に流入されることを知ることができた。ＨＩＶ−ＴａｔおよびｋＦＧＦ４由来のペプチドは、ほとんど５μＭ以上の濃度で、細胞内に流入されるが、透過量はＴＤ１に比べて、かなり微弱であることを知ることができる。このようにＴＤ１が対照群に比べて、ＨｅＬａ ｃｅｌｌで非常に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。

【0094】

実施例３．共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いた細胞透過性ペプチドＴＤ１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能を確認
３‐１．皮膚の角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）での定性的な細胞透過能の確認
皮膚の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞で細胞透過能を確認するためにＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて細胞を培養した。顕微鏡解析のために１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌに１つずつ入れてＨａＣａＴ細胞を接種して、１６〜２４時間培養した。試料（対照物質：Ｖｅｈｉｃｌｅ、比較物質：ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチド、実験材料：ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない無血清培地で１時間と３時間の間、３μＭ、５μＭの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器（ｓｕｃｔｉｏｎ）を介して完全に削除し、リン酸緩衝溶液を入れ、軽く振って２回を繰り返して洗浄し、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間、弱く攪拌し、細胞を固定した。 細胞の固定の後、固定液を除去し、１０分間２回、リン酸緩衝液で洗浄した。その後、ＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩ染色溶液を用いて遮光した状態で１０分間、室温で対照染色を行い、反応の後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で２回洗浄した。その後、ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）は回収して、ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液が点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないように徐々に下ろして、ｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図４ａに示すように、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチドとくらべて、ＴＤ１の優れた細胞透過性を角質形成細胞で確認することができた。

【0095】

３‐２．神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）での定性的な細胞透過能の確認
神経細胞株であるＳｉＭａ ｃｅｌｌに対する細胞透過能を確認するために、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａはＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、８０％以上のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙで細胞を培養した。細胞は、繰り返した継代培養で安定化させた後、顕微鏡解析のために１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌにｃｏｖｅｒ ｇａｌｓｓ（カバーグラス）１つずつ入れてＳｉＭａ ｃｅｌｌを接種して、１６〜２４時間培養した。各試料（ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチド、ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地で６時間、５μＭの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器（ｓｕｃｔｉｏｎ）を介して完全に削除した後、リン酸緩衝溶液を入れ、軽く振って２回繰り返して洗浄し、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間弱く攪拌し、細胞を固定した。 細胞の固定の後、固定液を除去し、１０分間２回、リン酸緩衝液で洗浄した。その後、遮光した状態で１０分間、室温で対照染色を行い、反応の後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で２回洗浄した。その後ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）は回収して、ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液が点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないように徐々に下ろして、ｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図４ｂに示すようにｋＦＧＦ４由来のペプチドと比べて、ＴＤ１の優れた細胞透過性を神経細胞でも確認できた。

【0096】

３‐３．神経細胞（U-87 MG cell）での定性的な細胞透過能の確認
神経細胞株であるＵ−８７ ＭＧ細胞で細胞透過能を確認するためにＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、Ｕ−８７ ＭＧ細胞を培養した。蛍光顕微鏡の観察のために、１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌに１つずつ入れて細胞を接種して、１６〜２４時間培養した。各試料（ｋＦＧＦ４由来のペプチド、ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない無血清培地で６時間、５μＭの濃度で処理した。反応が終わった後、処理した試料を除去し、ＰＢＳで２回繰り返して洗浄した後、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間、細胞を固定した。その後、固定液を除去し、ＰＢＳで１０分間２回洗浄した後、遮光した状態で、ＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩ染色溶液を用いて１０分間室温で細胞を染色した。染色した後、溶液は除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を回収してｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ が点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないように ｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図４ｃに示すように、神経細胞Ｕ−８７ ＭＧ ｃｅｌｌでもＴＤ１がｋＦＧＦ４由来のペプチドと比べて、優れた細胞透過性を示すことを視覚的に確認することができた。

【0097】

３‐４．ＨｅＬａ ｃｅｌｌでの定性的な細胞透過能の確認
ＨｅＬａ ｃｅｌｌ（Ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｘ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ）で細胞透過能を確認するために、ＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ／ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて細胞を培養した。蛍光顕微鏡の観察のために、１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌに１つずつ入れて細胞を接種して、１６〜２４時間培養した。各試料（ＨＩＶ−Ｔａｔ、ｋＦＧＦ４由来のペプチド、ＴＤ１）は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ）で５μＭの濃度で、６時間と２４時間の間に反応させた。反応が終わった後、処理した試料を除去し、ＰＢＳで２回繰り返して洗浄した後、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間、細胞を固定した。その後、固定液を除去し、ＰＢＳで１０分間２回洗浄した後、遮光した状態で、ＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩ染色溶液を用いて１０分間室温で細胞を染色した。染色した後、溶液は除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を回収してｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎが点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないようにｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図４ｄに示すように、ＴＤ１が対照群に比べて、ＨｅＬａ ｃｅｌｌでも非常に優れた細胞透過性を示すことが確認できた。

【0098】

実施例４．ボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（ＢｏＮＴ／ Ａ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ（Ｌｃ））とＭＴＤ（ＴＤ１）とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を結合した組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の発現コンストラクトの作製
ボツリヌストキシンＡ型の軽鎖タンパク質（Ｌｃ）とＭＴＤ（ＴＤ１）とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を結合した組換えタンパク質の発現コンストラクトを作製した。まず、バイオニア社で合成したコドン最適化（ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたボツリヌス神経毒素Ａ型（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｔｙｐｅ Ａ）の軽鎖（Ｌｃ； ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の配列を鋳型として、それぞれに対して特異的に考案されたプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）ペアと重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この際に、それぞれのプライマーの配列情報は、下記の表１に示した。

【0099】

【表1】

【0100】

ＰＣＲ反応は、ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｌｃを鋳型１００ｎｇ、各０．４ｍＭの最終濃度ｄＮＴＰ混合物、１μＭの各プライマー、１０ｘ ＥＸ ｔａｑ緩衝溶液５μｌ、ＥＸ ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ）０．２５μｌを含む溶液を、最終的な体積５０μｌ反応液にして行った。 ＰＣＲ反応条件は、まず９５℃で５分間熱変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）させた後、９５℃で３０秒、５８℃で１分、および７２℃で１分の反応を３０回繰り返して、最終的に７２℃で８分間増幅した。反応が終わった後、１％アガロースゲル（Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行って、増幅された生成物を確認し、増幅された遺伝子組換え断片は、アガロースゲルから回収した後、市販ののｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、 Ｋｏｒｅａ）を用いて抽出し、精製した。精製されたそれぞれのＰＣＲ産物は、ＮｄｅＩとＸｈｏＩ酵素を３７℃で２時間処理して、再びアガロースゲルで電気泳動を行い、ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）で切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）されたそれぞれの組換え断片を精製した。一方、ヒスチジン−標識（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）とＴ７プロモーターを持つ発現ベクターｐＥＴ−２１ｂ（+）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩを用いて、上記と同じ条件で切断して、精製されたそれぞれの組換え断片と切断されたｐＥＴ−２１ｂ（+）ベクターを混合し、Ｔ４ ＤＮＡ連結酵素（ｌｉｇａｓｅ； Ｉｎｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を添加した後、１６℃で１６時間ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。これは、大腸菌ＤＨ５α感応細胞に形質転換させて、最終的に組換えタンパク質発現ベクターを得ており、発現ベクターは、上記と同じＮｄｅＩとＸｈｏＩ制限酵素の処理及び１％アガロースゲル電気泳動を通じて、それぞれの組換え断片がｐＥＴ−２１ｂ（+）ベクターに適切に挿入されたことを確認した。得られた組換えタンパク質発現ベクターは、それぞれｐＥＴ２１ｂ（+）−Ｌｃ、ｐＥＴ２１ｂ（+）−ＴＤ１−Ｌｃと命名した。

【0101】

実施例５．ボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）とＭＴＤ（ＴＤ１）とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を結合した組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の発現菌株培養及び精製
本発明による組換えタンパク質の発現菌株培養および精製プロセスを下記のように行っており、これに対する概略的な模式図を図５に示した。

【0102】

５‐１．菌株培養
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬ−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓに上記で得た組換え発現ベクターｐＥＴ２１ｂ（+）−Ｌｃ、ｐＥＴ２１ｂ（+）−ＴＤ１−Ｌｃのそれぞれを熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ）方法で形質転換させた後、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が含有されたＬＢ培地で培養した。その後、上記の組換えタンパク質遺伝子が導入された大腸菌を２５ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した後、この１次培養液を再び９Ｌ ＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ_６００（Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｔ ６００ｎｍ）が０．４ないし０．８に達するまで培養した。その後、培養液にタンパク質発現の誘導剤である１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、１８℃でｏｖｅｒｎｉｇｈｔに追加培養した後、培養液を４℃で８，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上澄み液を除去し、菌体を回収した。回収した菌体は、リン酸緩衝液に懸濁し、ｌｙｓｏｚｙｍｅ（リゾチーム）を処理した後、ソニーケータ（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて細胞を破砕し、これを１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して溶解性分画を得た。

【0103】

５‐２．タンパク質の精製および純度確認（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記の実施例5-1で得られた溶解性分画を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＦＰＬＣ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）を用いて精製を行った。溶解性分画をＦＰＬＣに流しながら アフィニティークロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）カラムに結合させ、洗浄緩衝液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を流して洗浄した。その後、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度を段階的に増加させて精製試料を得て、リン酸緩衝溶液またはＰＢＳで透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いて、４℃の条件で１６〜２０時間、撹拌しながら透析した。

【0104】

精製された試料は、純度を検定するために１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動を行った。ゲルは、クマシブリリアントブルーＲ（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ Ｒ）で軽く振盪しながら染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）し、目的タンパク質のバンドが明確になるまで脱色液（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて色落ちした。その結果、図６に示すように、精製されたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で９５％以上の純度であることが確認できた。

【0105】

実施例６．細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の細胞透過能の評価
６‐１．蛍光標識タンパク質の製作
細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能を評価するために、ＦＩＴＣが標識されたタンパク質を製造した。遮光した状態で、５０ｍＭ Ｂｏｒｉｃ酸と０．１ｎｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ、そして、それぞれ０．５μｇ/ｍＬのタンパク質を混合して、１０ｍＬのタンパク質懸濁液を作って、４℃で８時間反応させた。反応が終わった後、タンパク質懸濁液を透析チューブに入れ、遮光した状態の４℃で３日間、４時間−４時間−１６時間の間隔でＤＰＢＳで交換しながら透析を行った。透析が終了した後、ＦＩＴＣ標識タンパク質を０．２μｍ ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｅｒを用いてろ過し、得られたタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ解析法で定量し、必要濃度に応じて選択的に濃縮した。測定された濃度の中で一番低い濃度のタンパク質に合わせて希釈して蛍光強度（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＲＦＵ）を測定した。測定されたＲＦＵに基づいて検証に用いたＦＩＴＣ融合タンパク質の蛍光強度を比較した。

【0106】

６‐２．フローサイトメトリー測定（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた神経細胞透過能の確認
神経細胞株であるＳｉＭａ ｃｅｌｌに対する細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の細胞透過能を評価した。ＳｉＭａ ｃｅｌｌは培養プレートに対する細胞付着能が弱いので、ｇｅｌａｔｉｎ（ｓｉｇｍａ、Ｇ２５００）をコーティングした培養プレートを用いるが、０．１％ ｇｅｌａｔｉｎ溶液を培養プレートにコーティングして、室温で１時間の後、溶液を除去し、乾燥した状態で用いた。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａは、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、８０％以上のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙで継代培養した。細胞は、繰り返した継代培養で安定化させた後、１００ｍｍ培養パレート当たり５Ｘ１０^５／ｗｅｌｌで細胞を接種し、３７℃の５％ＣＯ_２の条件の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で１６〜２０時間培養した後、実験に用いた。

【0107】

各試料（ｖｅｈｉｃｌｅ、ＦＩＴＣ ｏｎｌｙ、Ｌｃ−ＦＩＴＣ、ＴＤ１−Ｌｃ−ＦＩＴＣ）は、ＦＢＳが添加されていない非血清培地で６時間１．５μg/ｍｌ及び７．５μg/ｍｌの濃度で処理した。反応時間が終了した後、ＤＰＢＳで２回洗浄して残余分の試料を除去し、０．０５％トリプシン-ＥＤＴＡを処理、光を遮断したまま、１０分間反応させた後、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａを用いて、トリプシン−ＥＤＴＡを不活性化させた。その後、準備したチューブに細胞を回収し、リン酸緩衝溶液３ｍＬを加え、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄み液を除去した後、それぞれのＦＡＣＳチューブにリン酸緩衝溶液２００μＬを入れた後、細胞を十分に再懸濁させてフローサイトメトリー測定を行った。測定されたＦｌ−１のｇｅｏ．ｍｅａｎ値で蛍光値を補正するために、ｖｅｈｉｃｌｅの値を基準にボツリヌストキシンＡ型の軽鎖（ＬＣ）及び細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の伝送能を決定した。その結果、図７ａに示すように、細胞透過性ペプチドが結合されたＴＤ１−Ｌｃ組換えタンパク質が細胞透過性ペプチドが結合されていないＬｃタンパク質と比べて、神経細胞で顕著に優れた細胞透過性を示すことを定量的に確認することができた。これは、タンパク質などの巨大分子の伝送体としてＴＤ１の可能性を細胞レベルで確認した結果である。

【0108】

６‐３．共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いた神経細胞透過能の確認
神経細胞株であるＳｉＭａ ｃｅｌｌに対する細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の細胞透過能を確認するために、ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａはＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて、８０％以上のｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙで細胞を培養した。細胞は、繰り返する継代培養で安定化させた後、顕微鏡解析のために１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌにｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）1つずつ入れてＳｉＭａ ｃｅｌｌを接種して、１６〜２４時間培養した。各試料（ｖｅｈｉｃｌｅ、Ｌｃ、ＴＤ１−Ｌｃ）は、ＦＢＳが添加されていない無血清培地で３時間５μg/ｍＬの濃度で処理した。反応が終わった後、培地は、吸入器を介して完全に削除した後、リン酸緩衝溶液で２回繰り返して洗浄し、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間、細胞を固定した。細胞の固定の後、固定液は除去し、リン酸緩衝液で１０分間２回洗浄した。その後、遮光した状態で１０分間、室温で対照染色を行ったあと、染色溶液を除去し、リン酸緩衝液で２回洗浄した。細胞の観察のためにｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）は回収して、ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液が点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないように徐々に下ろして、ｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図７ｂに示すように、Ｌｃタンパク質と比べて、細胞透過性ペプチドが結合されたＴＤ１−Ｌｃ組換えタンパク質が神経細胞で顕著に優れた細胞透過性を示すことを視覚的にも確認することができた。

【0109】

６‐４．共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いた角質形成細胞透過能の確認
皮膚の角質形成細胞株であるＨａＣａＴ細胞の細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の細胞透過能を確認するためにＤＭＥＭ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉａ（１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を用いて細胞を培養した。顕微鏡解析のために１２ｍｍ ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を火炎滅菌した後、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのそれぞれのｗｅｌｌに1つずつ入れてＨａＣａＴ細胞を接種して、１６〜２４時間培養した。各試料（Ｖｅｈｉｃｌｅ、Ｌｃ、ＴＤ１−Ｌｃ）は、ＦＢＳが添加されていない無血清培地で１時間、３時間および６時間の間、５μＭの濃度で処理した。反応が終わった後、各ｗｅｌｌの培地は除去し、リン酸緩衝溶液で２回繰り返して洗浄した後、各ｗｅｌｌに１０％ホルマリン溶液を２００μＬずつ入れ、遮光して１０分間、細胞を固定した。細胞の固定の後、固定液は除去し、リン酸緩衝液で１０分間２回洗浄した後、遮光した状態で、ＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩ染色溶液を用いて１０分間、室温で対照染色を行った。染色した後、染色溶液は除去し、リン酸緩衝液で２回洗浄した後、細胞観察のためにｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ（カバーグラス）を回収して、ｍｏｕｎｔｉｎｇ溶液が点滴されたｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ（スライドグラス）に気泡が入らないように徐々に下ろして、ｍｏｕｎｔｉｎｇした（覆い被せた）。これは、遮光状態で十分に乾燥させた後、ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００）を用いて細胞を観察した。その結果、図７ｃに示すようにＬｃタンパク質と比べて、細胞透過性ペプチドが結合されたＴＤ１−Ｌｃ組換えタンパク質が角質形成細胞でも顕著に優れた細胞透過性を示すことを視覚的に確認した。

【0110】

実施例７．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの皮膚模写人工膜の透過効能の評価
細胞透過性ペプチド（ＴＤ１）とボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を結合した組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）の皮膚障壁の透過効能を評価するために、皮膚模写人工膜（Ｓｔａｒｔ−Ｍ）に対する自動皮膚透過器（ＭｉｃｒｏｅｔｔｅＰｌｕｓ）を用いて、皮膚透過効能を確認した。皮膚模写人工膜は吸収を阻害する上層のＰＥＳ（ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ）と多孔質構造の生成で吸収に差別性を与えることができる下層のｐｏｌｙｏｌｅｆｉｎで構成されており、保管が容易で前処理プロセスなしにすぐにシステムに適用することができるメリットがある。また、実際の皮膚で測定することが難しい透過量を皮膚と同じような条件で定量することができ、広く用いられている。用意された皮膚模写人工膜での透過効能を評価するために、ｖｅｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌの下部にＰＢＳを入れ、真ん中に緩衝溶液と皮膚模写人工膜が空いているスペースがないように結合させた後、ｖｅｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌの上に試料を入れて準備した。下部の緩衝溶液を時間が経ることに応じて、１０％の量を採取した後、同じ量の緩衝溶液を入れて、これを繰り返した。採取した試料は、実験が終わった後、ＥＬＩＳＡ解析法を用いて、量を測定した。その結果、図８に示すように、新規の細胞透過性ペプチドＭＴＤが結合されたＴＤ１−Ｌｃがボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質Ｌｃに比べて、皮膚模写人工膜で透過能が約２０％以上、優れていることが確認できた。時間に応じた皮膚模写膜の透過度は、６時間までは同様に見えるが、１２時間の後から２４時間までにはＴＤ１−Ｌｃタンパク質の透過能がより優れていることを確認することができる。

【0111】

実施例８．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの効能評価（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ）
ＳＮＡＰ２５タンパク質は、ＳＮＡＲＥ ｐｒｏｔｅｉｎの一種でボツリヌストキシンＡ型の軽鎖が切るタンパク質で、一般的にボツリヌストキシンの活性を見るために、試験管でＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ方法を用いる。本実施例でもボツリヌストキシンの軽鎖（ＢｏＮＴ／Ａ Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ（Ｌｃ））の活性を確認するために、ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを行った。２μｇのＧＳＴ−ＳＮＡＰ２５−ＥＧＦＰ融合タンパク質に２μｌのｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｕＭ ＺｎＣｌ_２）を入れて、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃをそれぞれの濃度１０、３０、９０、２７０、８１０ｎｇの濃度で添加した後、３７℃で４時間反応させた。陽性対照群には、２７０ｎｇのボツリヌストキシン混合体（ＢｏＮＴ／Ａ ｃｏｍｐｌｅｘ）を添加し、３次蒸留水で全体の容量を２０μｌに合わせて同じ条件で反応させた。上記の反応が終了した混合液は、５Ｘ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｕｆｆｅｒを添加して、１００℃で１０分間加熱した後、１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌを用いて、８０Ｖ ２０分、１２０Ｖ １時間の電気泳動を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌはｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．２５％ ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ、４５％ ｍｅｔｈｎａｏｌ、１０％ ａｃｅｔｉc ａｃｉｄ）で染色した後、ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（３０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ、１０％ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））で脱色してタンパク質のパターンを確認した。その結果、図８に示すように、ＴＤ１−Ｌｃの組換えタンパク質でもボツリヌストキシンの活性が維持されていることを確認することができた。上記の結果から、ＴＤ１−Ｌｃの組換えタンパク質がボツリヌストキシンと同じ機能をすることを予想することができた。

【0112】

実施例９．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ効能評価
９‐１．ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）でのＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅの確認
角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）での組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの皮膚透過および効能を評価するために、ＳＮＡＰ２５タンパク質の切断の可否を介して効能を確認することができるＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙをｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法で行った。角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）は、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１Ｘ１０^４／ｗｅｌｌの細胞数で２４時間培養した後、ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＮＡＰ２５ ｐｌａｓｍｉｄをｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎし、陽性対照群としてｐｃＤＮＡ３．１−Ｌｃ ｐｌａｓｍｉｄをｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした。１６時間培養を介してＳＮＡＰ２５を過発現させた後、ＦＢＳのない培地に交換し、ＴＤ１−Ｌｃタンパク質の処理の後には、４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した。その後、各ｗｅｌｌにＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｉｎｔｒｏｎ）２００μｌずつ入れて細胞を溶解させた後、４℃ ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、上澄み液を得た。得た各試料は、５Ｘ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合した後、１００℃で１０分間加熱して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌに８０Ｖで２０分、１２０Ｖで１時間の電気泳動を行った。電気泳動が終わったｇｅｌはＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）で９０Ｖで１時間１０分間の転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させて、転写されたｍｅｍｂｒａｎｅは５％ ＢＳＡを入れて２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。その後、Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＳＭＩ−８１）を１：１０００に５％ ＢＳＡで希釈して入れ、４℃で１６時間反応させた。反応が終わったｍｅｍｂｒａｎｅはＰＢＳＴを用いて、１０分間隔で３回以上洗浄するプロセスを経て、ｓｅｃｏｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１９２Ｐ）を１：２５００に５％ ＢＳＡで希釈して入れ、再び１時間室温で反応させた。２次反応が終了したｍｅｍｂｒａｎｅはＰＢＳＴで１０分間隔で3回以上洗浄し、ＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎを処理して、追加の反応をさせてカセットに移した後、暗室でＸ−ｒａｙ ｆｉｌｍに感光させて確認した。その結果、図１０ａに示すように、ｐｌａｓｍｉｄ状態でＬｃを内部で発現した場合とタンパク質を外部で処理した場合、すべてのＳＮＡＰ２５の切断を確認することができた。これは、外部からの処理したＴＤ１−Ｌｃのタンパク質が皮膚細胞を透過して内部で発現されたＳＮＡＰ２５を切断したことを意味する。したがって、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃが優れた皮膚細胞透過性と活性を有していることを確認することができた。

【0113】

９‐２．ヒト神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）でのＳＡＮＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅの確認
ヒト神経細胞（Ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ）であるＳｉＭａ ｃｅｌｌでの組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの皮膚透過および効能を評価するために、ＳＮＡＰ２５タンパク質の切断の可否を介して効能を確認することができるＳＮＡＰ２５ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙをｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法で行った。

【0114】

まず、ＳｉＭａ ｃｅｌｌを２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１０％ ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓを含むＲＰＭＩ培地に入れて５Ｘ１０^５／ｗｅｌｌでｓｅｅｄｉｎｇする。 ３７℃の５％ＣＯ_２の条件の培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）でｏｖｅｒｎｉｇｈｔ培養した後、分化培地（１０％ ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１Ｘ ＮＥＡＡ、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、５μＭ ＲＡ、２．５μＭ ＰＵＲ）１ｍｌに交換して、２４時間培養した後、分化培地（１０％ ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１Ｘ ＮＥＡＡ、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、５μＭ ＲＡ、２．５μＭ ＰＵＲ）に２５μｇ／ｍＬの濃度でＧＴ１ｂを添加して、１ｍｌに交換した。 ２４時間培養後、分化培地（１０％ ＦＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１Ｘ ＮＥＡＡ、１Ｘ Ｂ２７、１Ｘ Ｎ２、５μＭ ＲＡ、２．５μＭ ＰＵＲ）１ｍｌに交換して分化を誘導させて用意した。神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）は、２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５Ｘ１０^５／ｗｅｌｌの細胞数で培養した後、神経細胞の分化方法に応じて分化させて、最後の分化培地に交換して、４時間後に組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを処理した。タンパク質の処理の４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、各ｗｅｌｌ当たりＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（ｉｎｔｒｏｎ）２００μｌずつ入れて細胞を溶解させ、４℃ ８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。得た各試料は、５Ｘ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合して、１００℃で１０分間加熱して、これを１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌに８０Ｖ ２０分、１２０Ｖ １時間電気泳動を行った。電気泳動が終わったｇｅｌはＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＩＰＶＨ０００１０）に９０Ｖで１時間１０分の間転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させて、転写されたｍｅｍｂｒａｎｅは５％ ＢＳＡを入れて２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。その後、Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＳＭＩ−８１）を１：１０００に５％ ＢＳＡで希釈して入れ、４℃で１６時間反応させた。反応が終わったｍｅｍｂｒａｎｅはＰＢＳＴを用いて、１０分間隔で３回以上洗浄するプロセスを経て、ｓｅｃｏｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＰ１９２Ｐ）を１：２５００に５％ ＢＳＡで希釈して入れ、再び１時間室温で反応させた。２次反応が終わったｍｅｍｂｒａｎｅはＰＢＳＴで１０分間隔で３回以上洗浄し、ＥＣＬ ｓｏｌｕｔｉｏｎを処理して、追加の反応をさせてカセットに移した後、暗室でＸ−ｒａｙ ｆｉｌｍに感光させて確認した。その結果、図１０ｂに示すように、ＴＤ１−Ｌｃタンパク質だけでも神経細胞を効果的に透過することを確認することができた。これでＴＤ１−Ｌｃタンパク質が皮膚細胞だけでなく、神経細胞も効果的に透過できることを確認することができた。

【0115】

実施例１０．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの皮膚細胞毒性の評価
１０‐１．ヒト角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）での細胞毒性の評価
組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのヒトの皮膚細胞の細胞毒性を評価するために、細胞の生存率を測定するＭＴＴ ａｓｓａｙを行った。まず、角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１Ｘ１０^４／ｗｅｌｌの細胞数で培養して、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを処理する４時間の前にＦＢＳのない培地に交換した。タンパク質は、０．６２５μｇ／ｍＬで４０μｇ／ｍＬの濃度まで処理し、４８時間反応させた後、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（ｓｉｇｍａ）を各１０μｌずつ添加して、さらに４時間反応させた。反応が終わった培養液は捨てて、各試料に１００μｌのＤＭＳＯを添加して、室温で１０分間反応させた後、ＯＤ_５７０で吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。上記の実験の対照群では、細胞透過性ペプチドＴＤ１が結合されていないボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を一緒に実験した。その結果、図１１ａに示すように、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃが角質形成細胞（ＨａＣａＴ ｃｅｌｌ）に対して４０μｇ／ｍＬの高い濃度でも細胞の生存率が維持されることにより、細胞毒性が表さないことを確認することができた。

【0116】

１０‐２．ヒト神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）での細胞毒性の評価
組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのヒト神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）に対する細胞毒性を評価するために、細胞生存率を測定するＭＴＴ ａｓｓａｙを行った。ヒト神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５Ｘ１０^５／ｗｅｌｌの細胞数で培養して、神経細胞分化の方法によって分化を誘導した。最後の分化培地に交換し、４時間の後、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを処理した。タンパク質は、０．６２５μｇ／ｍＬで４０μｇ／ｍＬの濃度まで処理し、４８時間反応させた後、５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（ｓｉｇｍａ）を各１０μｌずつ添加して、さらに４時間反応させた。反応が終わった培養液は捨てて、各試料に１００μｌのＤＭＳＯを添加して、室温で１０分間反応させた後、ＯＤ_５７０で吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定した。上記の実験の対照群では、細胞透過性ペプチドＴＤ１が結合されていないボツリヌストキシンの軽鎖タンパク質（Ｌｃ）を一緒に実験した。その結果、図１１ｂに示すように、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを処理したヒト神経細胞（ＳｉＭａ ｃｅｌｌ）の細胞生存率が維持されることにより、高濃度でも組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃによる細胞毒性が表さないことを確認することができた。

【0117】

実施例１１．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの安定性の評価
ボツリヌストキシンの軽鎖は、精製の後、二つの軽鎖タンパク質がｄｉｍｅｒを形成し、形成された軽鎖ｄｉｍｅｒはｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを有し、保管条件に応じて、ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ ａｃｔｉｖｉｔｙの活性に差を見せる。そして、組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの保管期間に応じた安定性を確認するために、各期間別のタンパク質のパターンの変化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で確認した。組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃは定量して１０μｇずつ、それぞれのチューブに分注して−８０℃の超低温冷凍庫に保管した。保管してから１月、３月、６月が経過した後、その後、各期間の経過に応じて、それぞれの組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを溶かして１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｇｅｌに電気泳動を行い、タンパク質の純度およびパターンの変化があるかを確認した。その結果、図１２に示すように、６月が経過しても、タンパク質のパターンの変化がなく、組換えタンパク質が安定に維持されていることを確認することができた。

【0118】

実施例１２．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの化粧用組成物の製造および皮膚刺激の安全性評価
組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの臨床試験のために、Ｈ＆Ａ ｐｈａｒｍａｃｈｅｍ社にリポソーム化を委託して加工した後、化粧品原料と２次加工して、化粧品組成物として作製した。

【0119】

また、ヒトを対象とした、皮膚刺激の安全性評価のために専門の臨床試験代行機関（ＣＲＯ）であるアイイシコリア（株）（韓国）に試験を依頼して評価した。試験は、健康な男女３１人を対象に、試料をＩＱ ｃｈａｍｂｅｒに入れて、背中の皮膚に 貼布して、４８時間の後、人体の皮膚に対する安全性を皮膚科の専門医が判断して刺激の程度を評価、解析した。 貼布方法は、単回・密閉貼布試験で行って、皮膚刺激の評価に通用される評価基準（ＣＴＦＡ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）を応用してＦｌｏｓｃｈ＆Ｋｌｉｇｍａｎの考案された測定評価法で刺激の程度を評価、解析した。被試験志願者は、皮膚科の医者である試験責任者と研究者の病歴調査、問診及び視診と、必要に応じ促進などを介して被験者の選定および除外基準に適合した健康な成人男女３２人を選抜したが、１人が中途脱落し、年齢分布は満２０歳から３６歳の間に、平均年齢は２５．７±５．４歳、性比は男性と女性は、各１３人：１８人だった。試験を完全に終了した被験者３１人を対象に単回貼布試験の後、評価基準に基づいた皮膚刺激度を読み取りし、その結果を図１３に示した。皮膚刺激反応の結果を通じて刺激度を評価する際に、人体の皮膚反応で適用される世界的な共通基準は定められていないが、通常、５０人以下の志願者を対象にする試験では、単回貼布試験の読み取りの際に、全志願者の２０％を超過する頻度で反応が出現する試料（本試験の場合、３１人の２０％である７人以上）、もしくは毎回読み取る際に＋２以上の刺激反応が全志願者の１０％を超えて観察された試料は、有意に刺激を誘発する可能性がある物質とみなすことができる。上記の試験で４８時間、３１人の被験者の背中の皮膚に貼布した後、皮膚反応を観察した結果、依頼した試料は、無刺激で皮膚に安全に使用することができると判断することができた。

【0120】

実施例１３．細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのシワ改善効能の評価
組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃのシワ改善効能の評価のために専門の臨床試験代行機関（ＣＲＯ）であるアイイシコリア（株）（韓国）に依頼して、臨床試験を実施した。試験は、３０歳から５９歳までのほうれい線を持つ韓国人の大人の女性被験者２２人を対象に、試料１種を１日２回、４週間の間、被験者自ら自宅で使用するようにした後、皮膚ほうれい線の粗さと皮膚の弾力を測定し、臨床写真撮影と皮膚科専門医のほうれい線の肉眼評価を並行して組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃの皮膚のシワの改善の効能を評価した。ほうれい線の粗さは、ＰＲＩＭＯＳ Ｓｙｓｔｅｍを用いて測定し、皮膚の弾力は、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０を用いて測定した。

【0121】

本人体適用試験は、ヘルシンキ宣言の精神とＧＣＰガイドラインの内容に応じて、被験者の権利、安全、福祉を優先的に保護することができるように行った。研究者は、被験者の安全を確保することができるように、次の事項を充実に履行した。
- 試験中の試験責任者と試験担当者は、被験者の安全に最善を尽くさなければならなく、すべての皮膚の異常症状の発生の際に迅速かつ適切な措置を取り、その反応を最小限に抑えなければならない。
- 試験中、被験者は、試料によって皮膚刺激または異常症状の事例を報告する場合には、すぐに使用された試料を拭き取り、症状が好転しない場合の試験責任者による皮膚科的な評価と適切な治療を受ける。
- 通常の試験プロセスにもかかわらず、皮膚に異常の症状が発生した場合、適切な皮膚科的な評価と治療を受けるようにする。
- その他の異常な皮膚反応が発生した場合、試験責任者と試験担当者は、皮膚科的な評価と一緒に適切な措置を取り、症例および状況について詳細に記録をする。
- 結果の測定は、被験者が実験室を訪問して恒温恒湿室（２２±２℃、５０±５％）で１５分以上待機して、皮膚の安定を取るようにした後、測定および評価を実施した。

【0122】

上記の試験では、試料の使用の前と使用の４週間後にほうれい線の部位をscanningした後、ＰＲＩＭＯＳ ｓｙｓｔｅｍを利用して、皮膚の粗さ（Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ）ｐａｒａｍｅｔｅｒを解析した。皮膚の粗さを表現するｐａｒａｍｅｔｅｒは次の通りである。
- Ｒａ：ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅ（平均の粗さ）
- Ｒｍａｘ：Ｍａｘｉｍｕｍ ｐｅａｋ ｔｏ ｖａｌｌｙ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（最大の粗さ）
- Ｒ３ｚ：Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎ ｔｈｉｒｄ ｈｅｉｇｈｔ
- Ｒｔ：ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｐｏｉｎｔ
- Ｒｚ：Ａｖｅｒａｇｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｈｅｉｇｈｔ（１０ ｐｏｉｎｔ ｈｅｉｇｈｔ）

【0123】

皮膚の弾力は、頬の毛穴部位の弾力（弾性復元力）をＣｕｓｔｏｍｅｔｅｒを用いて測定した。４００ｍｂの圧力で２秒間吸引し、２秒間還元するプロセスを３回繰り返して、測定結果の再現性を高めるためにｐｒｅｔｅｎｓｉｏｎ ｔｉｍｅを０．１秒に設定した。皮膚を吸引、弛緩した時の測定値で得られる各ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ値の意味は以下の通りである。
- Ｒ５：Ｎｅｔ ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｖｉｓｃｏｕｓ ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ
- Ｒ７：Ｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｕｒｖｅ

【0124】

ほうれい線の肉眼評価は、試料を使用する前（Ｄ＋０）と４週間の使用の後（Ｄ＋２８）に皮膚科専門医が各被験者の左または右側のほうれい線状態をｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｃａｌｅにより肉眼評価した。

【0125】

試料の使用前・後においてほうれい線の粗さ、皮膚の弾力と皮膚科専門医の肉眼評価の統計的な有意性を検証し、結果の解釈方法は、試料の使用前と後、ほうれい線の粗さ、皮膚の弾力ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ、皮膚科専門医のほうれい線の肉眼評価で有意な変化がある場合、ほうれい線や弾力が改善されたものと解釈した。

【0126】

統計解析プログラムは、ＳＰＳＳ １４．０を用いて、機器の測定結果データの正規性をそれぞれＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ ｔｅｓｔで検証した。被験者２２人はすべて、適切な被験者に選ばれ、最終の訪問日まで、すべての被験者が正常に試験を終了し、最終的な２２人（平均４６．１歳）の有効なデータを獲得した。

【0127】

その結果、図１４ａに示すように、試料の使用の4週間後に、ほうれい線の部位の皮膚の粗さを示すＲａ、Ｒｍａｘ、Ｒ３ｚ、Ｒｚ、Ｒｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒが有意に減少し、ほうれい線が改善されたことと示された。また、図１４ｂに示すように、試料の使用の４週間後に、皮膚の弾力を示すＲ５、Ｒ７ ｐａｒａｍｅｔｅｒが有意に増加し、皮膚の弾力が改善されたことと示された。ほうれい線の肉眼評価の結果も、また、図１４ｃに示すように、試料の使用の４週間後にほうれい線が有意に減少し、図１５に示すように、シワの改善効果を視覚的にも確認できた。

【0128】

これにより、細胞透過性ペプチドＴＤ１を結合したボツリヌストキシン組換えタンパク質ＴＤ１−Ｌｃを用いた皮膚改善効能を臨床試験で評価した結果、試料を４週間、連続的に使用する場合、皮膚のほうれい線と皮膚の弾力の改善に役立つことと確認された。これは、局所的に適用された細胞透過性ボツリヌストキシン組換えタンパク質（ＴＤ１−Ｌｃ）が経皮に効果的に伝達されることにより、皮膚の微細なシワシワや太いシワを減少させる上で意味のある効果を提供していることを示している。

【0129】

前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的な思想や必須的な特徴を変更しなくて、他の具体的な形態に変形しやすいことができることを理解できるだろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解するべきである。

【産業上の利用可能性】

【0130】

本発明の細胞透過性ペプチド−ボツリヌストキシン組換えタンパク質は、経皮を介した伝達ができることにより、ボツリヌストキシンの固有の効能を保有するとともに、利便性が拡大されて、より安全で望ましい治療的な代案にすることができるので、これを用いた様々な疾患の治療、審美的および/または美容的な目的のために局所作用剤として効果的に活用することができる。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5】

【図6】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13】

【図14a】

【図14b】

【図14c】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]