特許 6244140 Ｉ型アレルギー疾患の予防・治療剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6244140

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】Ｉ型アレルギー疾患の予防・治療剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/75 20060101AFI20171127BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20171127BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/75

   A61P37/08

【請求項の数】2

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2013-178249(P2013-178249)

(22)【出願日】2013年8月29日

(65)【公開番号】特開2015-44784(P2015-44784A)

(43)【公開日】2015年3月12日

【審査請求日】2016年5月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】000166959

【氏名又は名称】御木本製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100100251

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 操

(74)【代理人】

【識別番号】100174090

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 光

(72)【発明者】

【氏名】須藤 秀

(72)【発明者】

【氏名】梶浦 孝友

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０００−３１９１９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−０３８１４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０２５９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−１８６３６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６１−１００５１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０１０７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１１９４３２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 小山田 孝嘉，(未来医学事典)花粉症の現状と将来展望，未来医学，２００８年 ２月 ９日，第２３号，ｐ．４８−５１，URI: http://hdl.handle.net/10470/10368

【文献】 エゾウコギで心も体も健康ガイド，[online]，２０１３年 ７月２２日，http://web.archive.org/にて２０１３年７月２２日収録時のファイルを取得（取得日２０１７年２月２４日），インターネット，ＵＲＬ，http://web.archive.org/web/20130722182307/http://www.ezo-ukogi.net/

【文献】 中込 一之, 永田 真，スギ花粉症と喘息に連関性はあるか?，喘息，２０１０年 ４月，第２３巻，第１号，ｐ．３８−４３

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの欠乏に起因する疾患を予防・治療する予防・治療剤であって、
前記フィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進するフィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤を有効成分として含み、前記フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤が大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物であり、
前記疾患が花粉症であることを特徴とする予防・治療剤。

【請求項2】

前記フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤が前記大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物であり、該大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物は、さらにインボルクリンの欠乏に起因する疾患を予防・治療するインボルクリン産生促進剤であることを特徴とする請求項１記載の予防・治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進し、これらの欠乏に起因するＩ型アレルギー疾患を予防・治療する予防・治療剤に関する。

【背景技術】

【0002】

フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシンの産生を促進することによって、皮膚機能を正常化し、シワ形成抑制、肌荒れ防止、肌理正常化、アトピー性皮膚炎等に有効な皮膚外用剤が得られることは知られている。

【0003】

トチュウ（杜仲）（学名Eucommia ulmoides）は、中国原産のトチュウ目トチュウ科の落葉高木で、生薬としては樹皮が利用されている。
トチュウの樹皮（これを杜仲という場合もある）は『神農本草経』の上品に収載され、腰痛、足腰の倦怠感解消、頻尿、肝機能・腎機能の強化、高血圧に効果があるとされている。
また、トチュウの葉は杜仲茶として、血圧の降下や肝機能の機能向上に効果があるとされ、広く飲料として利用されている。
皮膚外用剤としては樹皮に美白作用があることが知られ（特許文献１）、部位は判然としないが、抗酸化作用がある（特許文献２）。
しかしながら、トチュウの葉の抽出物がフィラグリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。

【0004】

エゾウコギ(Acanthopanax senticosus)は、北海道、中国東北部、ロシアシベリア地方に自生する落葉低木で、根を薬用として用いられている。
医薬品等の用途では、ストレス性胃潰瘍の治療または予防、活性酸素消去酵素の活性促進、パーキンソン病の予防、グルタチオンレダクターゼの活性増強、セラミド合成促進、メラニン生成抑制等の作用があることが知られている（特許文献３〜９）。
しかしながら、エゾウコギがフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。

【0005】

大葉月橘はムクロジ目、ミカン科、ゲッキツ属の植物で学名Murraya koenigiiで、中国南部、インド、東アジアに広く分布し、乾燥した低地に自生する常緑の低木または高木で、成長すると高さ４〜６ｍほどになる。
南洋山椒、カレーノキ(カレーの木）とも呼ばれ、香辛料として用いられている。
皮膚外用剤として、抗酸化、美白、ヒアルロニダーゼ阻害、抗菌等の用途が知られている（特許文献１０〜１３）。
しかしながら、大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物がフィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、コルネオデスモシン等の産生を促進することは知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０００−１５９６２３号公報

【特許文献2】特開平１０−１７４３６号公報

【特許文献3】特開平０５−１８６３６０号公報

【特許文献4】特開２００２−００３３９１号公報

【特許文献5】特開２００２−０２９９９２号公報

【特許文献6】特開２００２−２８４６９５号公報

【特許文献7】特開２００６−１１１５４５号公報

【特許文献8】特開２００６−１１１５６０号公報

【特許文献9】特開２００６−１１７６１３号公報

【特許文献10】特開平０７−０６１９１８号公報

【特許文献11】特開平０７−０８２１３３号公報

【特許文献12】特開平０７−１３８１８０号公報

【特許文献13】特開平０８−２２５４２０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することによって、これらの欠乏に起因するＩ型アレルギー疾患を予防・治療する予防・治療剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、フィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの欠乏に起因する疾患を予防・治療する予防・治療剤であって、これらフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進するフィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤を有効成分として含み、上記フィラグリン産生促進剤、ロリクリン産生促進剤、またはコルネオデスモシン産生促進剤がトチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物であり、上記疾患がＩ型アレルギー疾患であることを特徴とする。特に上記Ｉ型アレルギー疾患が花粉症であることを特徴とする。

【0009】

上記エゾウコギの根の抽出物は、さらにインボルクリンの欠乏に起因する疾患を予防・治療するインボルクリン産生促進剤であることを特徴とする。
また、上記大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物は、さらにインボルクリンの欠乏に起因する疾患を予防・治療するインボルクリン産生促進剤であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0010】

トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物を有効成分として含有する予防・治療剤は、少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することができるので、Ｉ型アレルギー疾患、特に花粉症に有効な予防・治療剤が得られる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１のフィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。

【図2】実施例１のロリクリン、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。

【図3】実施例１、実施例２−１、実施例２−２のフィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。

【図4】実施例３のフィラグリンに対する特異抗体を用いたウエスタンブロット図である。

【図5】実施例１のＭＴＴ試験結果である。

【図6】実施例４のフィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。

【図7】実施例４のロリクリン、コルネオデスモシン、インボルクリンの遺伝子発現量を示す図である。

【図8】実施例５のコルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。

【図9】実施例５のフィラグリン、ロリクリン、インボルクリンの遺伝子発現量を示す図である。

【図10】実施例６−１および実施例６−２のフィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明者らが鋭意検討した結果、トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物が少なくともフィラグリン、ロリクリン、またはコルネオデスモシンの産生を促進することがわかった。また、これら抽出物が花粉症の予防・治療に効果があることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。

【0013】

トチュウの葉、およびエゾウコギの根は、乾燥した後、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。

【0014】

大葉月橘の葉等は、カレーリーフとして、生葉あるいは乾燥物として容易に入手可能である。
大葉月橘の葉および／または葉軸より抽出する場合は、未乾燥のものを利用する場合は乾燥した方が抽出効率がよいので、必要により乾燥する。乾燥は天日乾燥や乾燥機を用いて通常通り乾燥し、必要に応じて細断して抽出に用いる。

【0015】

抽出に用いる溶媒としては、水もしくは親水性有機溶媒またはこれらの混合液を用いる。抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

【0016】

また、抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン類、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール類などが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。

【0017】

なお、水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、水１０質量部に対して、低級アルコール類の場合は１〜２０質量部、低級脂肪族ケトン類の場合は１〜１５質量部、多価アルコール類の場合は１〜２０質量部添加することが好ましい。

【0018】

抽出に用いる溶媒の量は、原料となるトチュウの葉、エゾウコギの根、または大葉月橘の葉および／または葉軸の単位質量に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度がよい。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
なお、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。

【0019】

必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えてもよく、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。

【0020】

本発明は、経口、注射、外用のいずれでも薬効を発現するが、食品、医薬品に使用できる。例えば、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤などを含む）、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、錠菓、飲料等が挙げられる。

【0021】

また、本発明の予防・治療剤には、上記抽出成分を必須成分として、食品、医薬品の製剤において使用されている他の成分を配合できる。

【実施例】

【0022】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。

【0023】

実施例２
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、限外濾過（アドバンテック ウルトラフィルター Ｑ０１００ 分画分子量１０，０００）した。
膜透過液（実施例２−１）と膜不透過液（実施例２−２）を別々に凍結乾燥した。

【0024】

実施例３
反応容器内に、トチュウの葉（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに３０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、限外濾過（ミリポア ウルトラセル−ＰＬ公称分画分子量１，０００）し、膜不透過液を凍結乾燥した。

【0025】

得られた抽出物について、以下の確認試験を行った。
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、各実施例を添加し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベータ中で２日間培養した。

【0026】

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

【0027】

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。

【0028】

＜使用プライマー＞
フィラグリン：フォワードプライマーがＧＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＣＣ（配列番号１）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣＣ（配列番号２）の塩基配列とのセット
ロリクリン：フォワードプライマーがＧＧＡＧＴＴＧＧＡＧＧＴＧＴＴＴＴＣＣＡ（配列番号３）の塩基配列と、リバースプライマーがＡＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＡＧＧＴＡＧＴＴ（配列番号４）の塩基配列とのセット
コルネオデスモシン：フォワードプライマーがＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＡＴＡ（配列番号５）の塩基配列と、リバースプライマーがＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＣＧ（配列番号６）の塩基配列とのセット
ＧＡＰＤＨ：フォワードプライマーがＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴ（配列番号７）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ（配列番号８）の塩基配列とのセット

【0029】

図１および図２にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図１は、実施例１の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、フィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。図２は、実施例１の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、ロリクリン、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。図１および図２において、縦軸は実施例１を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。また＊印はｔ検定において有意水準５％で有意であることを示している。
図１および図２に示すように、実施例１は０．１質量％濃度で、フィラグリンの遺伝子発現量を約４倍に、ロリクリンの遺伝子発現量を約３．５倍に、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約２．５倍に、それぞれ増加させることがわかった。

【0030】

図３は、フィラグリンの遺伝子発現増加量を指標に限外濾過による分画の効果を確認するため、実施例１、実施例２−１、実施例２−２の終濃度０．２質量％での確認試験結果である。縦軸は各実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。
図３に示すように、実施例２−２の遺伝子発現量が他の実施例より増加量が多く、有効性成分の多くが、限外濾過で分画した場合に分子量１０,０００以上の分画に存在することがわかった。

【0031】

図４は、タンパク質レベルでの増加も確認するため、実施例３でのフィラグリン０．１質量％に対する特異抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す図である。
図４に示すように、タンパク質レベルでも明らかな増加が認められた。

【0032】

図５は、実施例１を０．１質量％濃度で細胞に作用させたときのＭＴＴ試験結果である。
図５に示すように、実施例１を配合しないコントロールを１として比較したところ、両者に差がなく、実施例１に細胞毒性がないことを確認した。
なお、ＭＴＴ活性の確認方法は以下のように行った。
２４ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで、確認試験と同一条件で培養した後、培地を交換し、１／１０量の５ｍｇ／ｍｌ ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを添加してさらに４時間培養後、等量の０．０４Ｎ塩酸を含むイソプロパノールを添加して完全に溶解する。この溶液をリファレンス波長６３０ｎｍ、測定波長５６０ｎｍで測定して、コントロールに対する相対値として算出した。

【0033】

実施例４
反応容器内に、エゾウコギの根（乾燥物、細断品）を５０ｇ投入し、これに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。

【0034】

得られた抽出物について、実施例１と同様な方法で確認試験を行った。なお、ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲにおける使用プライマーとして、以下のプライマーを追加して使用した。
インボルクリン：フォワードプライマーがＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＡＣＡＣ（配列番号９）の塩基配列と、リバースプライマーがＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧ（配列番号１０）の塩基配列とのセット

【0035】

図６および図７にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図６は、実施例４の終濃度０．０１質量％および０．０２質量％での確認試験結果であり、フィラグリンの遺伝子発現量を示す図である。図７は、実施例４の終濃度０．０１質量％での確認試験結果であり、ロリクリン、コルネオデスモシン、インボクリンの遺伝子発現量を示す図である。図６および図７において、縦軸は実施例４を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。また＊印はｔ検定において有意水準５％で有意であり、＊＊印は有意水準１％で有意であることをそれぞれ示している。
図６に示すように、実施例４はフィラグリンの遺伝子発現量を、０．０１質量％で約１０倍に、０．０２質量％で約２０倍に増加させることがわかった。
また、図７に示すように、ロリクリンの遺伝子発現量を約８．５倍に、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約３．５倍に、インボルクリンの遺伝子発現量を約１．５倍に、それぞれ増加させることがわかった。

【0036】

実施例５
反応容器内に、大葉月橘の葉および／または葉軸（乾燥物、細断品）を３０ｇ投入し、これに５０％（Ｖ/Ｖ）エタノール水溶液１リッターを加え、ときどき撹拌しながら、２５℃で２４時間抽出後、ＪＩＳ Ｐ３８０１に規定されるＮｏ５Ｃの濾紙を用いて濾過し、これを凍結乾燥した。

【0037】

実施例６
実施例５と同様に抽出した液（実施例５の凍結乾燥前）を限外濾過（ミリポア社製ウルトラセルＰＬ・分画分子量１，０００）した。
膜透過液（実施例６−１）と膜不透過液（実施例６−２）を別々に凍結乾燥した。

【0038】

図８〜図１０にリアルタイムＰＣＲの結果を示す。図８は、実施例５の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を示す図である。図９は、実施例５の終濃度０．１質量％での確認試験結果であり、フィラグリン、ロリクリン、インボルクリンの遺伝子発現量を示す図である。図１０は、フィラグリンの遺伝子発現増加量を指標に限外濾過による分画の効果を確認するため、実施例６−１の終濃度０．１質量％、実施例６−２の終濃度０．０２質量％での確認試験結果である。図８〜図１０において、縦軸は各実施例を添加していない場合の遺伝子発現量を１としたときの遺伝子発現量を相対値で表している。
図８および図９に示すように、実施例５は０．１質量％で作用させたとき、コルネオデスモシンの遺伝子発現量を約２３倍に、フィラグリン、ロリクリンの遺伝子発現量を約３倍に、インボルクリン遺伝子発現量を約６倍に増加させることがわかった。
また、図１０に示すように、分子量１，０００で限外濾過を用いて分画したところ、分子量１，０００以上の分画が、分画前、あるいは分子量１，０００以下の分画より１／５の濃度（０．０２質量％）でも遺伝子発現量はさらに３倍以上の発現量を示した。

【0039】

実施例７〜実施例９、比較例１
実施例１で得られた抽出物を有効成分とする花粉症の予防・治療するための飲料を実施例７として、同実施例４で得られた抽出物を有効成分とする飲料を実施例８として、同実施例５で得られた抽出物を有効成分とする飲料を実施例９として、以下の成分表の割合で配合して均一に撹拌して作製した。なお、比較例１の飲料は実施例１、実施例４または実施例５で得られた抽出物を精製水に置き換えたものである。
飲料の成分表
実施例１、実施例４または実施例５で得られた抽出物 １ｇ
キシリトール １０ｇ
ビタミンＢ₁塩酸塩 ０．５ｍｇ
ビタミンＢ₂ ０．２ｍｇ
ビタミンＣ ５００ｍｇ
ナイアシン １．０ｍｇ
パントテン酸カルシウム １．０ｍｇ
精製水 １００ｇ

【0040】

花粉症を発症している男性被験者９名を３名ずつ第一、第二、第三の３グループに分けて、第一のグループには実施例７の飲料を、第二のグループには実施例８の飲料を、第三のグループには実施例９の飲料を、朝昼夕の３回、飲料５０ｍｌをそれぞれ飲用してもらった。試験は７日間行い、起床から就寝までを１日とし、クシャミの回数（１回を１点とする）、鼻をかんだ回数（１回を１点とする）、喉の違和感の程度（０〜３点、違和感がひどいと点数が高い）により花粉症の症状を判定した。７日間の合計点数を算出し、３名の平均値として評価した。試料の飲用を止め何も処置をせずに過ごすと、３日後には試験以前の状態に戻ったので、試験終了後７日間を空けて、比較例１による試験を行った。結果を表１に示す。

【0041】

【表1】

表１に示すように、実施例７〜９の飲料の飲用期間において、明らかな花粉症の諸症状の改善が認められた。

【産業上の利用可能性】

【0042】

本発明は、トチュウの葉の抽出物、エゾウコギの根の抽出物、または大葉月橘の葉および／または葉軸の抽出物を有効成分として含有するので、Ｉ型アレルギー疾患、特に花粉症に有効な予防・治療剤が得られる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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