特許 6244350 ヒト化およびキメラ抗因子Ｂｂ抗体、ならびにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6244350

(24)【登録日】2017年11月17日

(45)【発行日】2017年12月6日

(54)【発明の名称】ヒト化およびキメラ抗因子Ｂｂ抗体、ならびにその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20171127BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20171127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 11/02 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20171127BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20171127BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   A61P7/04

   A61P37/02

   A61P19/02

   A61P29/00 101

   A61P27/02

   A61P11/06

   A61P11/00

   A61P31/06

   A61P11/02

   A61P31/12

   A61P33/00

【請求項の数】18

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2015-504681(P2015-504681)

(86)(22)【出願日】2013年4月2日

(65)【公表番号】特表2015-514111(P2015-514111A)

(43)【公表日】2015年5月18日

(86)【国際出願番号】US2013034982

(87)【国際公開番号】WO2013152020

(87)【国際公開日】20131010

【審査請求日】2016年3月28日

(31)【優先権主張番号】61/619,858

(32)【優先日】2012年4月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514165152

【氏名又は名称】ノーベルメッド セラピューティクス インコーポレイテッド．

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】バンサル，レカ

【審査官】 厚田 一拓

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０２９６６９（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号２１、配列番号２３、および配列番号２５のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインとを含む、単離された抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

ヒト化フレームワーク領域を含み、前記ヒト化フレームワーク領域が配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２のヒト化フレームワーク領域から選択される、請求項１に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

ヒト化または非天然フレームワーク領域を含み、前記ヒト化または非天然フレームワーク領域が、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２６から選択される、請求項１に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

ヒト化または非天然フレームワーク領域を含み、前記ヒト化または非天然フレームワーク領域が、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３０、および配列番号２６から選択される、請求項１に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

ヒト化または非天然フレームワーク領域を含み、前記ヒト化または非天然フレームワーク領域が、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号２６から選択される、請求項１に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

ヒト化または非天然フレームワーク領域を含み、前記ヒト化または非天然フレームワーク領域が、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号１９、配列番号４６、配列番号４０、配列番号４１、および配列番号４２から選択される、請求項１に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

前記抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分が、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、および配列番号５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する因子Ｂｂ上に位置するペプチド領域に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

前記抗体またはその抗原結合部分抗体が、ＰＣ３ｂＢｂ複合体の形成の阻害によりＣ３ｂの形成を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

前記抗体またはその抗原結合部分抗体が、新たに産生されるＣ３ａ、Ｃ５ａ、ＳＣ５ｂ−９の形成を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

前記抗体またはその抗原結合部分が、好中球、単球、および血小板の活性化を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項11】

前記抗体またはその抗原結合部分が赤血球の溶解を阻害する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項12】

処置有効量の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物。

【請求項13】

炎症性障害の処置のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分であって、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、またはＣ５ｂ−９を含む炎症媒介物質の異常なレベルが前記障害で見出される、抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項14】

前記炎症性障害が、自己免疫疾患、関節リウマチ、若年性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、および身体の免疫系が調整を受ける他の自己免疫疾患を含む群から選択される自己免疫疾患である、請求項１３に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項15】

補体活性化が疾病病状に関与する、眼障害の処置における請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項16】

前記眼疾患が、湿潤型および乾燥型加齢黄斑変性症、脈絡膜血管新生、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、糖尿病性網膜症、眼のヒストプラスマ症、糖尿病性網膜症、脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、地図状萎縮、結晶腔疾患（ｄｒｕｓｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、および網膜血管新生を含む群から選択される、請求項１５に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項17】

補体関連障害の処置のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分であって、前記障害が、喘息性または気道炎症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｓｔａｓｉｓ）、嚢胞性線維症（ｃｙｃｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増多症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発喘息、公害誘発喘息、咳喘息、寄生虫性肺疾患、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染、ライノウイルス（ＲＶ）感染、およびアデノウイルス感染を含む群から選択される気道炎症を含む群から選択される、抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【請求項18】

副経路が疾病病状に関与しているか、あるいは副経路が状態もしくは疾患の原因となる少なくとも１つの症状を悪化させているような状態もしくは疾患に罹患しているか、または前記状態もしくは疾患を発症するリスクのある哺乳類での副経路活性化の阻害において使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗Ｂｂ抗体またはその抗原結合部分。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０１２年４月３日出願の米国特許仮出願第６１／６１９，８５８号の優先権を主張し、その主題が全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、エフェクター機能および免疫原性が低下したヒト化およびキメラ抗体ならびにその抗原結合フラグメントに関する。本発明はさらに、Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼにおける因子Ｂのタンパク質分解活性をさらに阻害する、Ｃ３ｂＢｂまたはＰＣ３ｂＢｂ複合体の活性を阻害するための因子Ｂの抗体の使用に関する。本発明のヒト化およびキメラモノクローナル抗体は、古典的活性経路を阻害することなく、ＰＣ３ｂＢ複合体に対する因子Ｂｂの結合を選択的にブロックする。これらの抗体は因子Ｂに対するＣ３ｂの相互作用を阻害せず、したがって特有の機能を有する。そのような抗体は、補体副経路が病理学的役割を果たす疾患徴候の有用な処置である。

【背景技術】

【0003】

補体系は、古典的経路、レクチン経路および補体副経路（ＡＰ）の３つの異なる経路によって活性化される。古典的経路は、抗原−抗体複合体によって活性化される。レクチン経路は古典的経路の変形であり、副経路は異物、人工表面、壊死組織、細菌、死んだ酵母細胞によって活性化される。

【0004】

古典的経路の活性化によって、宿主防御に反応して様々な細胞を活性化するＣ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９分子を生成させる。病的状態では、副経路の活性化の結果として、アナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ５ａが形成され、これらは細胞および、組織に損傷を与える膜侵襲複合体（ＭＡＣ）としても知られるＣ５ｂ−９分子を活性化する。まとめると、これらの分子は、細胞活性化および炎症仲介物質の放出によって炎症を媒介する。溶解性孔形成複合体としてのＣ５ｂ−９の役割に加えて、亜溶解性（ｓｕｂｌｙｔｉｃ）ＭＡＣの沈着が炎症において重要な役割を果たす可能性があることの強力な証拠がある。

【0005】

古典的補体経路は、病原体に対する宿主防御に重要である。補体副経路は病的炎症で活性化される。高レベルのＣ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ−９は、複数の急性および慢性疾患状態と関連することが見出された。したがって、疾患で誘発されるＡＰ活性化の阻害は、補体活性化が疾患病状に関与する疾患での臨床的有益性に重要である。

【0006】

免疫防御におけるその基本的役割に加えて、補体系は多くの臨床症状で組織損傷の一因となる。補体生化学的カスケードに含まれる活動は、宿主組織にとって潜在的脅威となる。一例には、宿主細胞溶解を引き起こし得る破壊酵素の無差別放出が含まれる。したがって、処置効果のある補体阻害物質を開発し、これらの有害作用を防止することが差し迫って必要とされる。

【0007】

ＡＰ活性化が疾患病状の一因となる疾患状態では、高レベルのＣ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９分子が血清、血漿、血液または疾患の代表的な他の体液中で見出される。異なるメカニズムによるこれらの分子の産生および阻害は、疾患にとって重要である。ＰＣ３ｂＢｂ複合体の形成を阻害するための１つの可能なメカニズムは、抗Ｂｂ抗体の使用による。このように、Ｂｂの枯渇、Ｂｂの中和、またはＢｂの不活性化によるＡＰ活性化のブロック／阻害は、依然として重要な処置方針である。

【0008】

本発明は、新規であり、因子Ｂｂに対する標的化結合を提供する、開発されたヒト化およびキメラ抗体配列に関する。そのようなヒト化／キメラ抗体の因子Ｂｂに対する結合は、コンベルターゼの活動を妨げる。そのような抗体はまた、ＰＣ３ｂＢ複合体の因子Ｂ上の因子Ｄ切断部位を結合することによりＰＣ３ｂＢのＰＣ３ｂＢｂへの変換を妨げる。これらの抗体はＣ３ｂに対するプロバージン結合を阻害しない。Ｂｂと結合し、ＰＣ３ｂＢｂ活性を妨げ、新規Ｃ３コンベルターゼの形成を妨げる抗因子Ｂｂとしては、限定するものではないが、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、ヒト化、完全ヒト、およびナノ抗体、完全長およびそのフラグメント、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＩｇＧが挙げられる。本発明の抗体は、炎症を引き起こし、またＡＰ活性化プロセスを増幅するＣ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ−９の形成を阻害する。

【0009】

アプタマー、小分子、およびＳｉＲＮＡも、ＰＣ３ｂＢ複合体に対するＢｂ結合を妨げることができる。その結果、細胞活性化、炎症および炎症仲介物質の放出も防止される。ＡＰ活性化は様々な急性および慢性ヒト疾患と関連づけられるので、抗因子Ｂｂでのブロックも炎症プロセスを妨げ、抗Ｂｂモノクローナル抗体で処置される哺乳類に臨床的な有益性を提供する。

【0010】

補体は病因に関与するいくつかの因子のうちの１つであり、臨床的制御のための有効な特質を提供する重要な病理学的メカニズムであり得る。有効な補体阻害薬の必要性は、様々な疾患状態における補体介在性組織傷害の重要性に関する認識の高まりによって示される。それにもかかわらず、現在、補体活性化を特異的に標的とし、阻害するヒト用の承認薬は一切存在しない。

【0011】

因子Ｂは、Ｃ３コンベルターゼ（ＰＣ３ｂＢｂ）の触媒サブユニット（Ｂｂ）を提供するので、副経路の増幅ループにおいて重要な役割を果たす。Ｂａに対するＣ３ｂ結合を阻害する抗体が開発されているが、そのうちのいずれもＢｂの活性を阻害しない。因子Ｂはそれ自体、既知触媒活性のないチモーゲンである。ＰＣ３ｂ複合体に結合した後、因子Ｂは因子Ｄによって切断されて、Ｂａを放出する。因子ＢはＢａおよびＢｂサブユニットの各々で見出される領域によりＣ３ｂと結合することが示された。因子Ｂ結合剤の阻害物質は、因子Ｂ機能の選択的阻害の結果であり、それによって多くの有害効果の原因となるＣ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の形成を防止する。

【0012】

本特許出願で記載される結果に基づいて、本発明者らは、因子Ｂの触媒ドメインと結合し、ＰＣ３ｂＢｂの活性を妨げ、Ｂｂ上の因子Ｄ切断部位と結合し、さらなるＰＣ３ｂＢｂ分子の形成を防止する、ヒト化およびキメラ抗体を開発した。これらの抗体は因子Ｂに対するＣ３ｂ結合を阻害しない。そのような結合事象は因子ＢのＢａドメインによって媒介されることが示されているからである。本願は、（ａ）ＰＣ３ｂＢｂ活性をブロックすることによって因子Ｂ機能を妨げる、および／または（ｂ）Ｂｂ生成を妨げる因子Ｂ切断を抑制するヒト化およびキメラ抗Ｂｂ特異的阻害物質または阻害方法を開発した。これらの阻害物質は、Ｃ３ｂとの因子Ｂ相互作用を妨害することのないＣ３コンベルターゼ酵素活性の不活性化剤であるように思われる。本発明者らは、抗因子Ｂｂ抗体の阻害活性を、ＡＰ活性化のブロックにおけるそれらの潜在的役割について評価した。これらの抗体は、インビトロと全血中の両方で因子Ｂ機能を妨げる。他の抗因子Ｂａモノクローナル抗体も開発され、疾患の動物モデルで試験されたが、本発明の一部ではない。これらの抗Ｂａ抗体はＣ３ｂに対する因子Ｂ結合を妨げ、したがって補体カスケードの活性化をブロックする。

【0013】

本発明は、抗Ｂｂ抗体の使用によって、病的状態におけるＢｂの機能活性、およびその進行作用を阻害するように設計される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、ＰＣ３ｂＢｂおよびＣ３ｂＢｂ上のＢｂ部位をブロックし、因子Ｄ介在性因子Ｂ切断を制限することによって、Ｂｂ依存的補体活性化を阻害する方法に関する。Ｂｂと結合し、古典的経路を阻害することなく副経路活性化だけを阻害する抗体は、本発明に包含される。因子Ｂ依存的補体活性化は、アプタマーおよびＳｉＲＮＡなどの抗体以外の因子Ｂ阻害物質分子によって阻害され得る。因子Ｂ阻害物質分子抗体は、全またはフラグメント化抗因子Ｂ抗体を含み得る。フラグメント化抗因子Ｂ抗体は、Ｆ_ａｂ、Ｆ_{（ａｂ）２}、Ｆ_ｖ、または単鎖Ｆ_ｖであり得る。抗因子Ｂ抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）であってよく、因子Ｂおよびそのフラグメントと結合する能力を有してもよい。本発明は、補体活性化によって調整されるいくつかの炎症性障害の処置のためのＢｂ抗体を開示し、抗Ｂａ抗体の使用は開示しない。

【0015】

一態様において、本発明は、対象におけるＢｂ依存的補体活性化の有害作用を阻害する方法に関する。この方法は、Ｂｂ依存的補体活性化を阻害するために有効な量のＢｂ阻害剤を対象に投与することを含む。これに関連して「Ｂｂ依存的補体活性化」という語句は、３つの補体経路全ての活性化を指す。本発明のある態様では、Ｂｂ阻害剤は抗因子Ｂｂ抗体またはそのフラグメントであり、他の態様では、抗因子Ｂｂ抗体 は低下したエフェクター機能を有する。さらに別の態様では、Ｂｂ阻害剤はＢｂ阻害ペプチドである。本発明の方法、組成物、および薬剤は、不適切な活性化が疾患病状に関与する、急性または慢性病的状態にあるヒトなどの哺乳類対象においてインビボでＢｂ依存的補体活性化の有害作用を阻害するために有用である。

【0016】

別の態様において、本発明は、相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）の様々な組み合わせを含む抗因子Ｂｂ抗体を作製する。ＣＤＲは、軽鎖および重鎖の組み合わせを含む。ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびフレームワーク領域は、補体が関与する上記疾患状態の処置のために用いられる。可変領域のアミノ酸配列内で任意の順序でＣＤＲを含む抗体は本発明に含まれる。このように、本発明は、検討される配列を、９０％配列同一性が維持される限りＣＤＲまたはフレームワーク領域における任意の配列変化と同様に包含する。そのような抗体は１：１の化学量論比でＢｂ分子だけと結合し、このことは、抗体を使用することにより、血漿の試料における活性化率（パーセント）を見積もることができることを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】古典補体経路および副補体経路の２つの補体経路を示す。この図は、２つの経路を分けており、Ｃ３ｂで２つの経路を一本化していない。

【図2】Ｂタンパク質に対するヒト化抗Ｂｂ抗体の結合親和性を示す。

【図3】Ｂｂタンパク質に対するヒト化抗Ｂｂ抗体の結合親和性を示す。

【図4】ヒト化抗Ｂｂ抗体がＣ３ｂに対する因子Ｂ結合を阻害しないことを示す。

【図5】ヒト化抗Ｂｂが、新規Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼを形成する新規Ｃ３ｂ分子の形成を阻害することを示す。

【図6】ヒト化抗Ｂｂが新規ＰＣ３ｂ複合体の形成を阻害することを示す。

【図7】ヒト化抗ＢｂがＣ３／Ｃ５コンベルターゼと関連する新規因子Ｂ／Ｂｂ分子の形成を阻害することを示す。

【図8】ヒト化抗Ｂｂが、赤血球溶解および組織傷害に必要とされるＣ５ｂ−９の形成を阻害することを示す。

【図9】ヒト化抗Ｂｂ抗体が赤血球の副経路依存的溶解を阻害することを示す。

【図10】ヒト化抗Ｂｂ抗体が古典的活性経路を阻害しないことを示す。

【図11】ヒト化抗体がＰＮＨ血清におけるウサギ赤血球の溶解を阻害することを示す。

【図12】マウス抗Ｂｂ抗体の配列（配列番号１および配列番号２）を示す。ヒト化抗体の配列（配列番号３〜配列番号１２）を示す。

【図13】図１３−ＣＤＲおよびフレームワーク領域の配列番号を示す。

【図14】図１３−ＣＤＲおよびフレームワーク領域の配列番号を示す。

【図15】図１３−ＣＤＲおよびフレームワーク領域の配列番号を示す。

【図16】図１３−ＣＤＲおよびフレームワーク領域の配列番号を示す。

【図17】図１３−ＣＤＲおよびフレームワーク領域の配列番号を示す。

【図18】マウスおよびヒト化抗Ｂｂ結合の原因となるＢｂタンパク質中のペプチドモチーフを示す。

【0018】

当業者によって使用されるものを含む標準的用語は一般的かつ標準的であり、本願全体にわたって無条件で使用している。

【0019】

以下の定義は、本発明を記載するために、用語が本明細書および特許請求の範囲で使用される際に、その用語に関して明確にするために示されている。

【0020】

本明細書中で用いられる場合、「副経路」という用語は補体活性化を指し、これは例えば、真菌および酵母細胞壁、グラム陰性外膜からのリポ多糖（ＬＰＳ）、およびウサギ赤血球、ならびに多くの純粋な多糖、ウサギ赤血球、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生生物および損傷細胞からのザイモサンによる補体因子Ｃ３からのＣ３ｂのタンパク質分解的生成から生じると伝統的に考えられてきた。

【0021】

本明細書中で用いられる場合、「抗体」という用語は、Ｂｂまたはそのポリペプチドもしくは一部と特異的に結合する抗体および抗体フラグメントを包含し、ここで、抗体は任意の抗体を産生する哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒトを含む霊長類）由来である。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナルおよび組換え抗体；多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体；マウス抗体、キメラ（すなわち、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒト）、モノクローナル抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびに脱免疫化抗体が挙げられ、任意のインタクト分子またはそのフラグメントであり得る。

【0022】

本明細書中で用いられる場合、「抗体フラグメント」という用語は、概してその抗原結合または可変領域を含む完全長抗因子Ｂｂ抗体に由来するかまたは関連する部分を指す。抗体フラグメントの実例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。

【0023】

本明細書中で用いられる場合、「Ｂｂ阻害剤」という用語は、Ｂｂと結合または相互作用し、Ｂｂ依存的補体活性化を効果的に阻害する任意の薬剤、例えば抗Ｂｂ抗体およびそのＢｂ結合フラグメント、天然および合成ペプチドを指す。本発明の方法で有用なＢｂ阻害剤はＢｂ依存的補体活性化、したがって全ての活性化を２０％超減少させることができる。１つの実施形態において、Ｂｂ阻害剤は補体活性化を９０％超減少させる。

【0024】

本明細書中で用いられる場合、「キメラ抗体」は、非ヒト種（例えば、げっ歯類）抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域（「ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ」）を含む組換えタンパク質であり、一方、抗体分子の残りはヒト抗体由来である。

【0025】

本明細書中で用いられる場合、「古典的経路」という用語は、（１）異物粒子と結合する抗体によって誘発され、認識分子Ｃｌｑの結合を必要とするＣＩ−複合体の補体活性化と、さらに（２）抗原−抗体複合体形成によって起こる補体活性化との両方を指す。

【0026】

本明細書中で用いられる場合、「ヒト化抗体」は、ヒト抗体フレームワーク中に移植された非ヒト免疫グロブリン由来の特異的相補性決定領域と一致する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、典型的には、抗体相補性決定領域だけが非ヒト起源のものである組換えタンパク質である。

【0027】

本明細書中で用いられる場合、「膜侵襲複合体」（「ＭＡＣ」）は、膜中に侵入し、膜を破壊する５つの終末補体成分（Ｃ５〜Ｃ９）の複合体を指す。ＭＡＣは、Ｃ５ｂ−９、およびＳＣ５ｂ−９とも呼ばれる可能性がある。

【0028】

本明細書中で用いられる場合、「対象」としては、限定するものではないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯類を含む全ての哺乳類が挙げられる。副経路は、補体活性化の独立経路として広く受け入れられているその役割に加えて、最初に古典的およびレクチン経路によって誘発される補体活性化の増幅ループを提供し得る。

【0029】

本明細書中で用いられる場合、「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、ポリペプチド単鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによって、ｓｃＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成することが可能になる。

【0030】

本発明の抗体は、ヒト疾患の処置のためのキメラおよびヒト化抗Ｂｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、および抗原結合フラグメントである。本発明の抗体は、この要求を満たすために有用な高親和性抗体を提供する。本発明の抗Ｂｂモノクローナル抗体はＰＣ３ｂＢｂ複合体中のＢｂの触媒活性を中和し、ＰＣ３ｂＢ複合体中の因子Ｂ上の因子Ｄ切断部位を保護する。

【0031】

ＰＣ３ｂＢ複合体と結合し、ＰＣ３ｂＢ複合体に対するＢｂ結合を阻害する特徴的なＣＤＲを有する動物および植物由来の抗Ｂｂモノクローナル抗体はいずれも本発明に含まれる。本発明の抗体のＣＤＲ間で６０％を上回る相同性を有するＣＤＲは本発明に含まれる。キメラおよびヒト化抗Ｂｂ抗体を生成させるために用いられるマウスモノクローナル抗体は本発明に含まれる。

【0032】

本発明の抗体は、この抗体がａ）Ｃ３ｂに対する因子Ｂの結合を阻害せず、ｂ）因子Ｂ上の因子Ｄ切断部位と結合し、ｃ）古典的補体経路に影響を及ぼさず、ｄ）１：１モル等量でＢｂと結合する点で、先行技術とは異なる。

【0033】

ヒト化およびマウス抗Ｂｂ抗体は、正常および疾患由来の血清中のうさぎ赤血球の溶解を阻害する。

【0034】

ヒト化およびマウス抗Ｂｂ抗体は、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ−９およびＴＮＦアルファの産生を阻害する。これらの抗体はＢｂに対して生成され、したがって、インタクトＢａ分子のフラグメントであるＢａと交差反応しない。

【0035】

本発明の抗体は、新しいＣ３ｂ、ＰＣ３ｂ、ＰＣ３ｂＢ、およびＰＣ３ｂＢｂの形成を阻害する。これらの抗体は、古典的経路の増幅ループに影響を及ぼすことなく副経路だけを阻害する。

【0036】

抗因子Ｂｂ抗体は、副経路の活性化によって生成するＢｂを中和するそれらの能力に基づいて選択することができる。１：１のモル等量は、Ｂｂの全てが抗Ｂｂ抗体によって中和されることを指す。

【0037】

本発明の抗体は古典的活性経路に影響を及ぼさない。したがって、本発明のモノクローナル抗体は古典的経路を阻害しない。副経路（増幅ループ）の阻害は、古典的経路に影響を及ぼすはずであるが、これらの抗体は、両経路が概して活性化される状況でも古典的活性経路に対して影響を示さない。

【0038】

本発明の別の態様は、ｍＡｂの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはそれらの組み合わせを含む抗体に関する。可変重鎖ＣＤＲ１、２および３領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、１６、および１８で示される。可変軽鎖ＣＤＲ１、２および３領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２１、２３、および２５で示され、ここで、抗体はヒトＢｂおよびＢと特異的に結合する。

【0039】

抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。可変領域内のＣＤＲは９０％類似から約９９％類似まで及ぶ可能性がある。

【0040】

本発明の抗体、本発明のＣＤＲ、および本発明のフレームワークを図１２〜１７に記載する。

【0041】

本発明の抗体を使用して、急性または慢性の病的傷害（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｊｕｒｙ）に苦しむヒトなどの対象においてインビボで副経路による補体活性化を阻害することができる。本発明を、限定するものではないが、以下の疾患、障害、傷害、および処置に関連して使用することができる。

【0042】

体外循環疾患および障害：心肺バイパス術後炎症（Ｐｏｓｔ−心肺バイパス ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、術後肺機能不全、心肺バイパス、血液透析、白血球フェレーシス，血漿交換、血小板フェレーシス、ヘパリン起因性体外ＬＤＬ沈殿（ＨＥＬＰ）、体外循環後症候群、膜型人工肺体外循環（ＥＣＭＯ）、両心バイパス（ＣＰＢ）、体外循環後症候群、全身性炎症反応および多臓器不全。

【0043】

心血管疾患および障害：急性冠動脈症候群、川崎病（動脈炎）、高安動脈炎、紫斑病腎炎（Ｈｅｎｏｃｈ−Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ ｐｕｒｐｕｒａ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、脈管漏出症候群、経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）、心筋梗塞、急性心筋梗塞後の虚血−再灌流傷害、アテローム動脈硬化症、血管炎、免疫複合体血管炎、関節リウマチに関連する血管炎（悪性関節リウマチとも呼ばれる）、全身性エリテマトーデス関連性血管炎、敗血症、動脈炎、動脈瘤、心筋症、拡張型心筋症、心臓手術、末梢脈管疾患（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、腎血管性疾患（ｒｅｎｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、脳血管性疾患（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、腸間膜／腸脈管疾患（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ／ｅｎｔｅｒｉｃ ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、糖尿病血管症、静脈基体塞栓（ＶＧＥ）、ヴェゲナー肉芽腫症、ヘパリン誘発性膜型人工肺体外循環、およびベーチェット症候群。

【0044】

骨／筋骨格系疾患および障害：関節炎、炎症性関節炎、非炎症性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性若年性関節リウマチ、骨関節炎、骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット症候群およびシェーグレン症候群。

【0045】

移植病および障害：移植拒絶、異種移植片拒絶反応、移植片対宿主病、器官または移植片の異種移植、器官または移植片の同種移植、および超急性拒絶反応。

【0046】

目／眼疾患および障害：湿潤型および乾燥型加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜神経血管化（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ：ＣＮＶ）、網膜損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜微小血管障害、目のヒストプラスマ症、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑の浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜微小血管障害、病的近視、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜新血管形成、網膜新血管形成、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、目のヒストプラスマ症、およびプルチャー網膜症。

【0047】

溶血性／血液疾患および障害：敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、出血ショック、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、劇症性抗リン脂質抗体症候群（ＣＡＰＳ）、寒冷凝集疾患（ＣＡＤ）、自己免疫血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、内毒血症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、敗血症、敗血症性ショック、鎌状赤血球性貧血、溶血性貧血、好酸球増多症候群および抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＬＳ）。

【0048】

呼吸器／肺疾患および障害：喘息、ヴェゲナー肉芽腫症、輸血関連性急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）、抗糸球体基底膜疾患（グッドパスチャー病）、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、アレルギー気管支炎気管支拡張症（ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｓｔａｓｉｓ）、反応気道疾患症候群、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染症、アデノウイルス感染、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、結核、寄生虫性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、気腫、気管支炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、輸血関連の急性肺傷害、虚血／再灌流急性肺損傷、ビシノーシス、ヘパリン誘発性膜型人工肺体外循環、アナフィラキシーショックおよびアスベスト誘発性炎症。

【0049】

中枢および末梢神経系／神経疾患ならびに障害：多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、重症筋無力症、多発硬化、ギラン・バレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、卒中、卒中後の再灌流、アルツハイマー病、多病巣性運動神経障害（ＭＭＮ）、脱髄、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、変形性椎間板疾患（ＤＤＤ）、髄膜炎、髄膜炎による頭部神経損傷、変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）、特発性多発性ニューロパシー、脳／脳外傷（限定するものではないが、出血、炎症および浮腫を含む）、および神経障害性疼痛。

【0050】

外傷誘発性傷害および障害：出血ショック、循環血液量減少性ショック、脊髄損傷、ニューロン損傷、脳外傷、脳虚血再灌流、圧挫、創傷癒合、重篤な熱傷、および凍傷。

【0051】

腎疾患および障害：腎臓再灌流傷害、溶連菌感染後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、グッドパスチャー病、膜質腎炎、ベルガー病／ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（間質性毛細管性糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎、クリオグロブリン血症糸球体腎炎、狼瘡性腎炎、紫斑病腎炎および腎皮質壊死（ＲＣＮ）。

【0052】

限定するものではないが、心臓、脳、腎臓、および肝臓を含む器官の再灌流傷害および障害。

【0053】

生殖および泌尿性器疾患および障害：痛みを伴う膀胱疾患および障害、感覚性膀胱疾患および障害、自然流産、不妊性由来の男性および女性の疾患、妊娠由来の疾患、胎児母性耐性、子癇前症、泌尿性器炎症性疾患、胎盤機能不全由来の疾患および障害、流産由来の疾患および障害、慢性無菌性膀胱炎ならびに間質性膀胱炎。

【0054】

皮膚／皮膚科疾患および障害：熱傷、乾癬、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、好酸球性海綿状態、じんま疹、熱傷、類天疱瘡、後天性表皮水疱症、自己免疫水疱症、水疱性類天疱瘡、強皮症、血管性浮腫、遺伝性血管神経性浮腫（ＨＡＥ）、多形紅斑、妊娠性疱疹、シェーグレン症候群、皮膚筋炎および疱疹状皮膚炎。

【0055】

胃腸疾患および障害：クローン病、セリアック病／グルテン過敏性腸症、ウィップル病、腸管虚血、炎症性大腸疾患、および潰瘍性大腸炎。

【0056】

内分泌疾患および障害：橋本病、若年性リンパ球性甲状腺炎、ストレス不安、およびプロラクチン、成長またはインスリン様成長因子、副腎皮質刺激ホルモン放出、膵臓炎、アジソン病、１型および２型糖尿病、１型糖尿病、サルコイドーシス、糖尿病性網膜微小血管障害、非肥満性糖尿病（ＩＤＤＭ）、脈管症、ＩＤＤＭまたは２型糖尿病の神経障害または網膜症合併症、ならびにインスリン抵抗性に影響を及ぼす他の疾患。

【0057】

悪性疾患の処置：化学療法および放射線療法から生じる疾患および障害。

【0058】

本発明の抗体は処置できであり得る。マウス、キメラ、ヒト化、および霊長類化抗体が現在検討されている処置である。しかしながら、科学における近年の進歩で、抗体はさらに、抗体様分子の相互作用が低ｐＭｏｌｅから高ｐＭｏｌｅから低ｎＭｏｌｅの範囲内であり得る他の種類の抗体によって置換することもできる。

【0059】

キメラ抗体およびヒト化抗体はいずれもヒトフレームワーク定常領域を有する。前記ＣＤＲ領域の親和性および有効性を増大させるために、ヒト化およびヒトのフレームワーク領域は、天然ヒトフレームワーク領域または改変ヒトフレームワーク領域のいずれかである。定常領域は、前記抗体中に存在していてもよいし、存在していなくてもよい。植物、細菌および哺乳類細胞系において定常領域の有無を問わず抗体を産生するために様々な方法が利用可能である。

【0060】

抗Ｂｂ抗体の機能活性は、抗Ｂｂ抗体が古典的経路の増幅ループに影響を及ぼすことなくＡＰ活性化だけを阻害する能力として定義される。これらの抗体は、（１）ＰＣ３ｂＢ複合体の触媒活性を阻害し、（２）ＰＣ３ｂＢｂ形成および／またはＣ３ｂＢｂ形成を減少させ、（３）遊離Ｃ３ｂの濃度を減少させ、（４）Ｃ３ｂの形成を減少させ、（５）Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の形成を減少させ、（６）単球ＣＤ１１ｂ発現を減少させ、（７）好中球ＣＤ１１ｂ発現を減少させ、（８）血小板ＣＤ６２Ｐ発現を減少させ、（９）白血球−血小板複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形成を減少させ、（１０）腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）を減少させ、（１１）好中球エラスターゼ形成を減少させる。

【0061】

（ｉ）２つの抗体であって、Ｂｂに対する特異性を有する１つの抗体と、一緒に結合する第２分子に対して特異性を有するもう１つの抗体、（ｉｉ）Ｂｂに対して特異的な１つの鎖と、第２分子に対して特異的な第２の鎖とを有する単一抗体、または（ｉｉｉ）Ｂｂおよび他の分子に対して特異性を有する単鎖抗体を含み得る二重特異性抗体を生成させることができる。そのような二重特異性抗体は、当該技術分野で周知の技術を用いて生成させることができる。

【0062】

抗Ｂｂ抗体またはそのフラグメントを、補体副経路の成分、および／または補体副経路の活性化後に生成する因子によって、直接的または間接的に媒介される疾患の予防的および処置的処置のための処置方法で使用することができる。

【0063】

本発明はさらに、副経路由来のＢｂ依存的補体活性化の阻害の有害作用を阻害する方法も提供する。Ｂｂ阻害剤は一次療法として単独で、または他の処置の利益を増強するための補足として他の方法と組み合わせて用いることができる。

【0064】

阻害剤は、小分子、アプタマー、ＤＮＡフラグメント、ＣＤＲドメインを示す小ペプチド、ＳｉＲＮＡであり得る。これらの阻害剤は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ９、およびＣ５ｂ−９に対するＰＣ３ｂＢｂ結合を阻害する。

【0065】

Ｂｂ阻害剤は、動脈内、頭蓋内、静脈内、皮下、筋肉内、または他の非経口投与により様々な方法で投与することができる。非ペプチド作動性阻害物質について潜在的には経口で、もっとも好適には動脈内または静脈内投与による。投与は、最適の処置効果を得るために医師によって決定されるように定期的に繰り返してもよい。

【実施例】

【0066】

特段の断りのない限り、全ての試薬は入手可能なハイグレードのものであった。全ての補体タンパク質、副経路および古典的経路緩衝液、検出抗体、および赤血球は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（テキサス州タイラー所在）またはＱｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州サンディエゴ所在）によって供給されたものであった。フローサイトメトリー抗体はカリフォルニア州サンノゼのＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ＴＭＢ基質は、メリーランド州ゲイザースバーグのＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌｉｍｉｔｅｄから得た。全ての二次抗体は、カリフォルニア州サンクレメンテ所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘから得、ＢＳＡおよび試薬は全てミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。

【0067】

ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０および２５０）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから得、フローサイトメーターはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒであった。Ｖａｒｉｔｙ ３Ｄプログラムをデータ分析のために使用し、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎプログラムを用いて曲線適合を実施した。溶血動態アッセイはＳｅｃｔｒａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施した。ＥＬＩＳＡプレートはマサチューセッツ州ローウェル所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒから得た。

【0068】

ヒト化およびキメラ抗体は、本願で存在する親マウスモノクローナル抗体の配列、配列（配列番号１および配列番号２）のＣＤＲを含む。マウスにヒトＢｂ（テキサス州タイラー所在のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を注射し、マウス血清をＢｂ結合およびＡＰ阻害活性についてスクリーニングした。標準操作法を使用してプロペルジン陽性マウス由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させた。限界希釈技術を使用して、融合細胞を単細胞集団にクローン化させた。９６ウェルプレート中の細胞を増殖させ、プロペルジン結合および副経路阻害を用いて上清を試験した。ＡＰ活性化をブロックする細胞を特定し、Ｃ５ｂ−９形成を阻害するものを用いてさらにスクリーニングした。これらのクローンを、赤血球溶解を阻害する１Ｄ３で分類した。抗体分泌細胞系を配列させて、配列番号１および配列番号２で示されるアミノ酸配列を生成させた。重および軽鎖両方からのＣＤＲをヒトフレームワーク中にグラフトして、配列番号３〜配列番号１２の様々なヒト化抗体配列を生成させた。配列番号９〜１２の抗体を哺乳類ＣＨＯ細胞中で産生し、発現し、分泌し、精製して、完全ＩｇＧｌｋを産生した。抗体は以下で示されるように特性化された。

【0069】

実施例１：ヒト化抗Ｂｂ抗体は高い親和性で因子ＢおよびＢｂタンパク質と結合する
抗ＢｂＩｇＧｌおよびその抗原結合フラグメントのヒト因子Ｂおよび因子Ｂｂに対する親和性は低ｐＭ抗体の範囲内である。Ｂｂに対する抗体結合は、ＰＣ３ｂＢｂ（Ｃ３／Ｃ５コンベルターゼ）の触媒活性を中和する。抗Ｂｂのヒト因子Ｂに対する結合は、因子Ｂ上の因子Ｄ切断部位をブロックする。これらの実験を実施するために、ポリスチレンマイクロタイタープレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中ヒト因子Ｂおよび因子Ｂｂ（ウェルあたり２．０μｇ／５０μｌ）で一晩４℃にてコーティングした。プロペルジン溶液を吸引した後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで１時間室温にてウェルをブロックした。ペプチドまたはプロペルジンコーティングのないウェルは、バックグラウンド対照としての役割を果たした。ヒト化抗因子ＢｂのアリコートをＢおよびＢｂでコーティングされたウェルに添加し、１時間インキュベートして、結合を起こさせた。室温にて１時間のインキュベーション期間の後、プレートをＰＢＳで５回リンスし、１：２０００希釈検出ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ヒトモノクローナル抗体とともにインキュベートした。このインキュベーション後、プレートをリンスし、ＴＭＢ試薬を用いて結合したペルオキシダーゼを特定した。

【0070】

図２および３で示されるように、ヒト化抗Ｂｂは因子Ｂ（図２）およびＢｂ（図３）とピコモル親和性で結合する。

【0071】

実施例２：ヒト化抗Ｂｂモノクローナル抗体はＣ３ｂに対する因子Ｂ結合を阻害しない
先の発明の抗因子Ｂ抗体は典型的にはＣ３ｂとのＢ相互作用を阻害した。この新規抗体は因子ＢのＣ３ｂに対する結合を阻害しない。典型的な実験では、ポリスチレンマイクロタイタープレートウェル（９６ウェル培地結合プレート、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中Ｃ３ｂ（２μｇ／５０μｌ／ウェル、テキサス州タイラー所在のｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で一晩４℃にてコーティングした。Ｃ３ｂ溶液を吸引した後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有するＰＢＳで１時間室温にてウェルをブロックする。Ｃ３ｂコーティングのないウェルはバックグラウンド対照としての役割を果たす。ヒト化抗Ｂｂのありコートを、一定濃度の因子Ｂを含有する溶液に添加した。１時間室温にてインキュベーションした後、ウェルをＰＢＳで充分にすすぐ。総結合「Ｂ」はポリクローナル抗Ｂ抗体で検出された。図４で示されるように、ヒト化抗Ｂｂ濃度のいずれも因子ＢのＣ３ｂに対する結合を阻害しなかった。

【0072】

施例３：ヒト化抗因子Ｂｂは補体副経路のＣ３／Ｃ５コンベルターゼ（ＰＣ３ｂＢｂ）の形成を阻害する
補体副経路を腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｏｓａ）由来のリポ多糖により正常ヒト血清中で活性化する。本発明者らは本発明の抗プロペルジン抗体がＰＣ３ｂＢｂの形成を阻害するかどうかを示すためにこのパラダイムを利用した。本発明者らは、ヒト化抗Ｂｂ抗体の存在下および非存在下でＰ、Ｃ３ｂ、Ｂｂ、およびＣ５ｂ−９の沈着を測定した。沈着したＰ、Ｃ３ｂ、Ｂｂ、およびＣ５ｂ−９は、適切な抗体で検出された。ヒト化抗Ｂｂ抗体の存在下で、Ｐ、Ｃ３ｂ、Ｂｂ、およびＣ５ｂ−９分子のそれぞれの沈着の阻害によって示されるように、Ｃ３およびＣ５コンベルターゼ形成の用量依存的阻害はわかる。

【0073】

典型的なアッセイでは、ポリスチレンマイクロタイタープレートウェルをＬＰＳ（腸チフス菌由来のリポ多糖）でＰＢＳ中２μｇ／５０μｌにて一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳ中１％のＢＳＡとともにインキュベートして、ウェル中の非占有部位をブロックした。室温で２時間ブロックし、ＰＢＳでリンスした後、ＡＰ緩衝液中正常ヒト血清（１０％）を様々な濃度の抗体およびフラグメントと混合した。混合物をＬＰＳでコーティングされたウェル上でインキュベートした。プレートを２時間３７℃にてインキュベートして、補体ＡＰ活性化を起こさせた。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで充分に洗浄し、Ｃ３コンベルターゼの成分を適切な抗体で検出した。本発明者らは、ブロッキング溶液中１：２０００のウサギ抗ヒトＣ３ｃ、ブロッキング溶液中１：２０００のヤギ抗ヒトＰおよびブロッキング溶液中１：５００のヤギ抗ヒト因子Ｂｂおよびブロッキング溶液中１：２０００のＨＲＰＯ複合抗ヒトＣ５ｂ−９でＣ３ｂを検出した。プレートをそれらのそれぞれの抗体とともに１時間室温にてインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳでリンスし、結合した抗体を、Ｃ３ｂについては１：２０００のペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギで、Ｐ検出についてはブロッキング溶液中１：２０００のペルオキシダーゼで標識されたウサギ抗ヤギで検出した。全てのプレートをＰＢＳで充分に洗浄した後にＴＭＢで発現させた。青色を１Ｍのオルトリン酸でクエンチした。Ｃ３ｂ、ＰおよびＢｂならびにＭＡＣの存在はあわせてＣ３／Ｃ５コンベルターゼ形成を示すものである。

【0074】

５は、Ｃ３ｂ沈着の用量依存的阻害を示し、図６はＰ沈着の用量依存的沈着を示し、図７はＢｂ形成の用量依存的沈着を示し、図８はヒト化抗Ｂｂ抗体によるＣ５ｂ−９の用量依存的沈着を示す。これらのデータは、抗Ｂｂモノクローナル抗体がコンベルターゼ形成を防止し、ＡＰ活性化を阻害することの直接的証拠を提供する。

【0075】

施例４：ヒト化抗Ｂｂ抗体はウサギ赤血球（ｒＲＢＣ）の副経路（ＡＰ）依存的溶解を阻害する
この赤血球溶解アッセイは、ｒＲＢＣの表面上の終末補体複合体の形成に基づく。その結果、ｒＲＢＣを溶解させる。７００ｎｍでの光散乱の段階的減少は、赤血球溶解の直接的尺度である。典型的には、ｒＲＢＣを、５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有するゼラチンベローナル緩衝液中正常ヒト血清中でインキュベートする。これらの条件下で、ｒＲＢＣの表面はｎ正常ヒト血清における副経路の活性化を誘発する。副経路活性化は、ｒＲＢＣの表面上のＣ５ｂ−９複合体形成に至る。Ｃ５ｂ−９複合体の形成を阻害する薬剤は、細胞溶解を阻害すると予想される。抗プロペルジン抗体およびそのフラグメントの効果を評価するために、様々な濃度のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦａｂを、７００ｎｍで読み取ることができる恒温ＥＬＩＳＡプレートリーダー中一定濃度のウサギ赤血球で、３７℃にてＡＰ緩衝液中正常ヒト血清（１０％のＮＨＳ）とともにインキュベートした。光散乱の段階的減少（インタクト細胞の溶解による）を時間の関数として７００ｎｍで測定した。データを記録し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０プレートリーダーおよびＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを用いて分析した。計算のために、全阻害を各濃度のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂで計算し、結果を未溶解対照の％として表した。ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてシグモイドプロットで各濃度でのデータをプロットした。

【0076】

図９で示されるように、ヒト化抗ＢｂＩｇＧは、赤血球溶解を阻害する正常ヒト血清中７９ｎＭのＩＣ_５０で正常ヒト血清中のｒＲＢＣのＡＰ依存的溶血を阻害する。抗体は、約７９ｎＭのＩＣ_５０で溶解を阻害することができる。

【0077】

同様の実験を発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）患者由来の血清で実施した。１０％の最終血清濃度の代わりに、本発明者らは４０％の最終血清濃度を使用した。図１１で示されるように、ヒト化抗ＢｂはＰＮＨ血清中の赤血球の溶解を防止した。

【0078】

実施例５：ヒト化抗Ｂｂは古典的活性経路を阻害しない
本発明のモノクローナル抗体は宿主防御に必要な古典的経路を阻害しない。抗体感作ヒツジ赤血球を、カルシウム（５ｍＭのＣａＣｌ_２／ＭｇＣｌ_２）緩衝液を含有するゼラチンベローナル緩衝液中１０％正常ヒト血清とともにインキュベートした。抗体感作ヒツジ細胞は古典的経路を活性化する。その結果、Ｃ５ｂ−９が赤血球の表面上に形成され、それによって溶解が起こる。本発明者らは１０％の正常ヒト血清を試験した。両条件下で、抗Ｂｂはヒツジ赤血球溶解を阻害しなかった。典型的なアッセイでは、１００μｌの抗体感作ヒツジ赤血球（テキサス州タイラー所在のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＣＰ緩衝液中１０％正常ヒト血清中でインキュベートして、補体活性化を起こさせた。ＣＰ活性化の結果、赤血球は溶解する。細胞溶解のための光散乱の段階的減少を時間の関数として７００ｎｍで測定した。

【0079】

図１０で示されるように、ヒト化抗ＢｂＩｇＧは抗体感作ヒツジ細胞正常ヒト血清の溶解を阻害しない。これらの結果は、抗Ｂｂ抗体が古典的活性経路に影響を及ぼすことなく補体副経路を選択的に阻害することができることを示唆する。

【0080】

実施例６：ヒト化抗Ｂｂ抗体の産生
ＣＤＲを有するマウスモノクローナル抗体を配列させ、ＣＤＲを様々なｈｕｍａフレームワーク領域内にグラフトした。抗体をクローン化し、当該技術分野で開発された方法を用いてＣＨＯ細胞で発現させた。図１２〜１７は抗体ＣＤＲおよびフレームワーク領域を示す。

【0081】

実施例７：Ｂｂタンパク質のエピトープマッピング
ｃｌｉｐｓ技術を用いてＢｂタンパク質のエピトープマッピングを実施した。複数のオーバーラッピングペプチドを合成し、抗体をペプチドと１μｇ／ｍｌの濃度で結合させた。最強のシグナルを生じたペプチドを抗体の潜在的なエピトープであると特定した。配列４７および４８が１つの抗体クローンについて特定された一方で、配列４９、５０、および５１がヒト化抗Ｂｂ抗体について特定された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]