特許 6244595 角質層内で発現されるポリペプチドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6244595

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】角質層内で発現されるポリペプチドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171204BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20171204BHJP

   A61K 38/08 20060101ALI20171204BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20171204BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20171204BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20171204BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20171204BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20171204BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   A61K8/64

   A61K38/08

   A61K38/10

   A61P17/00

   A61Q19/00

   !C07K7/06

   !C07K7/08

【請求項の数】9

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2013-506716(P2013-506716)

(86)(22)【出願日】2011年4月27日

(65)【公表番号】特表2013-531472(P2013-531472A)

(43)【公表日】2013年8月8日

(86)【国際出願番号】FR2011050953

(87)【国際公開番号】WO2011135253

(87)【国際公開日】20111103

【審査請求日】2014年2月3日

【審判番号】不服2016-6717(P2016-6717/J1)

【審判請求日】2016年5月6日

(31)【優先権主張番号】1053225

(32)【優先日】2010年4月27日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】311016455

【氏名又は名称】サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェ シアンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】512278685

【氏名又は名称】ユニバーシテ ポール サバティエ トゥールーズ ３

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100128761

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ジョンカ，ナサリー

(72)【発明者】

【氏名】トゥールザ，エヴェ

(72)【発明者】

【氏名】サインティグニー，ガエラ

(72)【発明者】

【氏名】セレ，ガイ

(72)【発明者】

【氏名】ウィーバー ヴィヴァト

【合議体】

【審判長】 中島 庸子

【審判官】 大宅 郁治

【審判官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第０２／０５９２６０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００８／０１６３５６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 ＴＯＵＬＺＡ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄａｔａｂａｓｅ ＧｅｎＢａｎｋ［ｏｎｌｉｎｅ］，Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ９９１２５１，＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ／１１６０９０７０９？ｓａｔ＝４＆ｓａｔｋｅｙ＝１５４４３１６６＞，１８−ＯＣＴ−２００６ ｕｐｌｏａｄｅｄ，１３−ＭＡＲ−２０１５ ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ，Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ： Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｌａｔｅ ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ６Ａ（ＬＣＥ６Ａ）ｍＲＮＡ，ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ．

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C12N15/00-90

ＰｕｂＭｅｄ

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属する、天然または合成の単離された少なくとも１種のポリペプチドの有効量を含む化粧組成物であって、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも５個の長さの連続したアミノ酸を有し、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有し、トランスグルタミナーゼの基質として機能する断片から選択されるポリペプチドであり、
内在性トランスグルタミナーゼの作用下で前記ポリペプチドと表皮の角質層中の角化膜とを共有結合させることにより前記角化膜を増強して、乾燥肌の徴候を予防および／または治療するための、前記組成物。

【請求項2】

角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属する、天然または合成の単離された少なくとも１種のポリペプチドの有効量を含む化粧組成物であって、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも５個の長さの連続したアミノ酸を有し、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有し、トランスグルタミナーゼの基質として機能する断片から選択されるポリペプチドであり、
内在性トランスグルタミナーゼの作用下で前記ポリペプチドと表皮の角質層中の角化膜とを共有結合させることにより前記角化膜を増強して、皮膚の老化の徴候を予防および／または治療するための、前記組成物。

【請求項3】

角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属する、天然または合成の単離された少なくとも１種のポリペプチドの有効量を含む医薬組成物であって、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも５個の長さの連続したアミノ酸を有し、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有し、トランスグルタミナーゼの基質として機能する断片から選択されるポリペプチドであり、
内在性トランスグルタミナーゼの作用下で前記ポリペプチドと表皮の角質層中の角化膜とを共有結合させることにより前記角化膜を増強して、栄養性皮膚障害または治癒障害後の栄養性皮膚障害を予防および／または治療するための、前記組成物。

【請求項4】

角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属する、天然または合成の単離された少なくとも１種のポリペプチドの有効量を含む医薬組成物であって、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも５個の長さの連続したアミノ酸を有し、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有し、トランスグルタミナーゼの基質として機能する断片から選択されるポリペプチドであり、
内在性トランスグルタミナーゼの作用下で前記ポリペプチドと表皮の角質層中の角化膜とを共有結合させることにより前記角化膜を増強して、表皮の菲薄化を予防および／もしくは治療するためならびに／または皮膚の過度の脆弱性を治療するためならびに／または角質層の肥厚化を誘導するための、前記組成物。

【請求項5】

角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属する、天然または合成の単離された少なくとも１種のポリペプチドの有効量を含む医薬組成物であって、
前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列の断片であって、少なくとも５個の長さの連続したアミノ酸を有し、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有し、トランスグルタミナーゼの基質として機能する断片から選択されるポリペプチドであり、
内在性トランスグルタミナーゼの作用下で前記ポリペプチドと表皮の角質層中の角化膜とを共有結合させることにより前記角化膜を増強して、過角化症、乾燥症、魚鱗癬、乾癬、良性または悪性の過角化性腫瘍性病変または反応性角化症を治療するための、前記組成物。

【請求項6】

ポリペプチドが、少なくとも７個の長さの連続したアミノ酸を有する断片であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

ポリペプチドが、少なくとも９個の長さの連続したアミノ酸を有する断片であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項8】

ポリペプチドが、少なくとも１５個の長さの連続したアミノ酸を有する断片であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４および配列番号５から選択される配列を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、以下ＬＣＥ６Ａと称する、角質層の新規ポリペプチド、ならびに化粧品および治療薬の双方としてのその適用に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚は、主に３つの層、すなわち最も外側から出発して：表皮、真皮および皮下組織からなる。

【0003】

表皮は、特に、（主として）ケラチノサイト、メラノサイト（皮膚の色素沈着に関連する）およびランゲルハンス細胞からなる。その機能は、身体を外部環境から保護して、その保全を確実にし、特に微生物または化学物質の侵入を阻止し、皮膚内に含まれる水分の蒸発を防ぐことである。

【0004】

このために、ケラチノサイトは、連続的な定方向の成熟過程を経る。この過程で、表皮の基底層内に位置するケラチノサイトは、それらの分化の最終段階において、角化（アポトーシスの特定の形態）によって生じる細胞である角質細胞を形成する。これらの角質細胞はきわめて相互接着性であり、角化膜（cornified envelope）の形態で完全に角質化されており、きわめて脂質に富んだ細胞外媒体に囲まれている。これらの細胞の構成成分要素、ならびにこれらの剥離を調節して落屑を可能にする酵素は、主に、基底細胞層、顆粒層（stratum granulosum）または顆粒層（granular layer）のケラチノサイトによって合成される。顆粒ケラチノサイトは、角化前の、ケラチノサイトの分化の最後の有核段階に該当し、これには、転写および翻訳のすべての活性の停止と共に核溶解が伴われる。角化膜の前駆物質ならびに表皮のバリア機能に不可欠な他の特定の細胞構成成分、例えば、セラミド、コレステロールおよび遊離脂肪酸などの生成の最高点があるのはこの段階である。角化中に形成された角化膜は、顆粒ケラチノサイトの脂質二重層と入れ替わる。それは、角質層の乾燥重量の７％である。それは、トランスグルタミナーゼによって共有結合で互いにまたはラメラ脂質外膜に結合されたタンパク質からなり、角質層の物理的強度およびバリア機能のために必須である、特に安定な不溶性かつ不透過性の巨大分子複合体を形成している。

【0005】

表皮の分化は、遺伝子の発現の微細な調節を必要とし、ケラチノサイトおよびその後角質細胞の多様な構成成分の生産を可能にする複雑な現象である。多数の転写因子が、この過程に関与する。角化膜の多数のタンパク質の遺伝子は、部位１ｑ２１．３にある「表皮分化複合体」（ＥＤＣ）と呼ばれる２．５Ｍｂの１つの同一クラスター内に集中している。ＥＤＣは、主に表皮内で発現される５０種を超える異なる遺伝子を含む。ロリクリン、フィラグリンおよびインボルクリンなどの、最終分化に必要な構造タンパク質をコードする遺伝子の大部分がそこに見出される。ＥＤＣは、遺伝子のいくつかのファミリーも含んでおり、そのうちの少なくとも１８種は、後期角化膜（ＬＣＥ）の後期タンパク質をコードする（Marshallら 2001、Differentially expressed late constituents of the epidermal cornified envelope. Proc Natl Acad Sci USA. 98:13031-6）。角化の過程において、ＬＣＥファミリーのこれらのタンパク質は、カルシウム依存的方法で、ドナーのグルタミン残基とアクセプターのアミン基との間のε−（γ−グルタミル）リシル結合を確立する、トランスグルタミナーゼの作用によって角化膜に組み込まれる。

【0006】

表皮のバリア機能は、特定の気象条件において（例えば、寒さおよび／または風の影響下で）；ストレスまたは疲労の影響下で；特定の化学因子（公害、紫外線、アルコール、刺激性石鹸、家庭内清掃用品、界面活性剤など）の影響下で、障害されることがある。

【0007】

厚くなった角質層の生成および異常な落屑、すなわち角質増殖を特徴とする多数の皮膚障害もバリア機能の変化を示す。角質増殖は、あらゆる解剖学的皮膚領域できわめて多様な臨床状況において生じうる。その根底にある生理病理学およびその原因は多様である。例として、乾燥症（または乾燥肌）、魚鱗癬、乾癬、特定の良性または悪性の腫瘍性病変、反応性過角化症を挙げることができる。逆に、特定の病理学的症状発現は、表皮および特に角質層の菲薄化と関係しており、これは、皮膚の過度の脆弱性に反映される。後者は、多様な解剖学的領域において生じる可能性があり、その原因は多様であり、それは体質的または後天的でありうる。例として、血管障害、静脈瘤、動脈症（糖尿病、動脈硬化など）を有する患者における下肢の栄養性皮膚障害、疼痛性ジストロフィー症候群に関連した栄養性皮膚障害、異常な治癒後の栄養性障害を挙げることができる。

【0008】

表皮のバリア機能は、老化の過程においても障害されることがある。したがって、より高齢の対象、および特に５０歳を超える対象は、皮脂の分泌の減少、ホルモンの変化または表皮を通した水分の流れが遅くなることと関連した、粘膜の乾燥症または乾燥状態を有するのを認められることが多い。表皮のバリアのこれらの障害は、組織化された水分の量の減少、合成の脱同調化または顆粒層の二重層の構造および／もしくは組成物における変化を引き起こす。したがって、これらの変化は、角質層の落屑、アレルゲン、刺激物質、または微生物の侵入を促進する（したがって、これがつっぱりまたは発赤などの不快な感覚を生じさせうる乾燥肌を引き起こす）だけでなく、肌の色の輝きおよび肌の柔軟性に影響を及ぼす。

【0009】

この現象を予防または修正するために、皮膚上に化粧組成物または医薬組成物を適用することが知られており、前記組成物は、糖もしくはポリオールなどの吸湿性薬剤、または皮膚に存在する水分を取り込み、したがって、その蒸発を防ぐことが意図される尿素および乳酸（天然保湿因子（Natural Moisturizer Factor）であるＮＭＦの成分）を含有する。伝統的に、脂肪は、水分の蒸発を防ぐのを補助する、石油ゼリーなどの閉塞性薄膜を皮膚上に形成するために使用されてきた。さらに、これらの組成物には、皮膚の再生の過程、特に、ケラチノサイトの分化、表皮脂質の合成および角質細胞の接着、または皮膚の天然保湿因子（ＮＭＦ）の構成成分の内因性の合成、特に、プロテオグリカンの合成のいずれかに関与する１種または複数の多様な生物学的標的に作用する有効成分が組み込まれていることが多い。

【0010】

しかし、乾燥肌、バリア機能の障害および／または表皮の脆弱性の発生をより有効に防ぐための新しい化粧有効成分または医薬有効成分に対する必要性が依然としてある。

【発明の概要】

【0011】

現在、出願人は、出願人が実施したヒト顆粒ケラチノサイトのトランスクリプトームの解析（Toulzaら、Large-scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function、Genome Biology 2007、8：R107）後に、ヒト染色体１ｑ２１上のＥＤＣ内に位置し、８０アミノ酸のポリペプチドをコードする新しい遺伝子を同定しており、これは、ＬＣＥ６Ａと称することが決定され、その相補的ＤＮＡが単離およびクローニング（Human Gene Nomenclature、GenBank DQ991251）されている。

【0012】

１１３０ｋｂの長さを有する、この新規なＬＣＥ６Ａタンパク質に対応する遺伝子の配列に基づき、それは、角化膜のタンパク質をコードする遺伝子のファミリーである、「後期角化膜」（ＬＣＥ）ファミリーに属することが断定されうる。この遺伝子の発現は、ケラチノサイトの分化の後期段階に該当する、顆粒ケラチノサイトが豊富な画分においてきわめて強く誘導される。ＬＣＥファミリーに属するにもかかわらず、ＬＣＥ６Ａに対応するポリペプチド配列は、この同一ファミリーの他のタンパク質の配列とほとんど相同性がないことを示し、ＬＣＥファミリーにおいて現在知られている５グループの中で新しいグループを構成している。

【0013】

ＬＣＥ６Ａタンパク質のポリペプチド配列は、８０アミノ酸からなる。それは、８個のグルタミン残基および６個のリシン残基を含有する。ヒトの１７種の一区画の健常な組織または器官（心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、筋肉、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、白血球、表皮）の相補的ＤＮＡの中で、ＬＣＥ６Ａ遺伝子の発現は、表皮においてのみ認められた。

【0014】

したがって、一態様によれば、本発明は、天然または合成の単離されたポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、角化膜の後期タンパク質（ＬＣＥ）のファミリーに属し、前記ポリペプチドは、
−配列番号２の配列、
−配列番号２の配列の断片であって、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する前記断片、および
−配列番号２の配列またはその断片のうちの１種の類似体であって、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する前記類似体
から選択される。

【0015】

他の一態様によれば、本発明は、表皮のバリア機能を増強するならびに／または乾燥肌の徴候を予防および／もしくは治療するならびに／または皮膚の老化の徴候を予防および／もしくは治療するのに有用な薬剤としての、有効量の
−配列番号２の配列、配列番号２の配列の断片、および配列番号２の配列もしくはその断片のうちの１種の類似体から選択され、前記断片および類似体が少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する、少なくとも１種のポリペプチドならびに／または
−配列番号１の配列、配列番号１の配列の断片および配列番号１の配列またはその断片のうちの１種の類似体から選択される核酸配列によってコード化された配列を有する少なくとも１種のポリペプチド、ならびに／または
−前記ポリペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列
の化粧品または非治療薬としての使用に関する。

【0016】

他の一態様によれば、本発明は、
−表皮のバリア機能を増強することならびに乾燥肌の徴候を予防および／もしくは治療することまたは皮膚の老化の徴候を予防および／もしくは治療すること；ならびに／または
−栄養性皮膚障害もしくは治癒障害後の栄養性皮膚障害を予防および／もしくは治療すること；ならびに／または
−表皮および特に角質層の菲薄化を予防および／もしくは治療することならびに／または皮膚の過度の脆弱性を治療するためならびに／または角質層の肥厚化を誘導するため；ならびに／または
−過角化症、乾燥症、魚鱗癬、乾癬、良性または悪性の過角化性腫瘍性病変または反応性角化症を治療すること
が意図された治療組成物を製造するための、
−配列番号２の配列、配列番号２の配列の断片、および配列番号２の配列もしくはその断片のうちの１種の類似体から選択され、前記断片および類似体が少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する、少なくとも１種のポリペプチドならびに／または
−配列番号１の配列、配列番号１の配列の断片、および配列番号１の配列もしくはその断片のうちの１種の類似体から選択される核酸配列によってコード化された配列を有する少なくとも１種のポリペプチド、ならびに／または
−前記ポリペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列
の使用にも関する。

【0017】

本発明は、上述の障害を予防および／または治療するために使用される上記のポリペプチドのうちの１種にも関する。

【0018】

本発明は、その態様のうちの他の１つによれば、少なくとも１種の天然または合成の単離されたポリペプチドを、生理学的に許容される媒体中に含む化粧組成物または医薬組成物にも関し、前記ポリペプチドは、配列番号２によって表されるアミノ酸配列、もしくはその断片、または配列番号２の配列もしくはその断片のうちの１種の類似体を少なくとも含み、前記断片および類似体は、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する。

【0019】

他の一態様によれば、本発明は、配列番号１の配列を少なくとも含む単離されたポリヌクレオチドにも関し、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２によって表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１の配列の断片、または配列番号１の配列もしくはその断片のうちの１種の類似体をコードする。

【発明を実施するための形態】

【0020】

「皮膚のバリア機能を増強すること」とは、皮膚のバリア機能が、その通常レベルの有効性、すなわち、それが身体を保護するその機能を果たすレベルに相当する、最小レベルの有効性に維持されることを確実にすることを意味する。

【0021】

「乾燥肌の徴候」とは、特に表皮の脱水による、皮膚の外見上のあらゆる変化、例えば、くすんだ、粗い、絹のようでない、赤みがかったおよび／または鱗状の外見、ならびに柔軟性の損失および皮膚の厚さにおける減少を意味する。重症の場合、乾燥肌の徴候としては、かゆみ、ヒリヒリ感および／またはつっぱりなどの、乾燥の現象に伴われる感覚などが挙げられ、これは、過敏症、皮膚萎縮、アトピー性皮膚炎または冬の乾燥症などの、実際の障害の発症をもたらしうる。

【0022】

「乾燥肌の徴候を予防および／または治療すること」とは、表皮のバリア、特にその保護機能もしくは調節機能を増強、保護および／もしくは修復すること、表皮の細胞接着を改良および／もしくは増強すること、侵襲性の薬剤に対する表皮の耐性を増大させること、表皮の構造を改良および／もしくは増強すること、その厚さを増大させること、ならびに／または皮膚の完全性を保証することを結果的に意味する。

【0023】

「皮膚の老化の徴候を予防および／または治療すること」とは、光で誘発された老化または光老化を意味することが好ましい。「皮膚の老化の徴候」とは、老化による皮膚の外見上のあらゆる変化、例えば、しわおよび線、しわしわの皮膚、軟らかい皮膚、薄い皮膚、皮膚の弾性および／または引き締まりの欠如、輝きのないくすんだ皮膚を意味する。

【0024】

「有効量」とは、本発明の意味では、予想される効果、すなわち、化粧効果または治療効果を認めるために必要な最低限の量を意味し、化粧効果または治療効果を得るために必要とされる有効量は、状況に依存して、同一であってもまたは異なっていてもよいことが理解される。

【0025】

「栄養性皮膚障害」とは、特に血管由来の皮膚（表皮、真皮および皮下組織）の異常である障害または動脈由来もしくは静脈由来の微小循環性機能不全によって引き起こされる病変を意味する。これらは、血流が悪い、皮膚の栄養不良から結果として生じるので栄養障害と呼ばれる。

【0026】

本発明のポリペプチド
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸の直鎖を含む分子を意味する。

【0027】

本明細書において、ポリペプチドという用語は、タンパク質またはペプチドを表すためにも使用されることになる。

【0028】

本発明のポリペプチドは、８０アミノ酸以下の長さを有する。好ましくは、該ポリペプチドは、４から２０個、より好ましくは７から１５個のアミノ酸からなる。

【0029】

このポリペプチドの必須の特性のうちの１つは、それが、トランスグルタミナーゼの基質として役割を果たすことができるように、少なくとも１つのグルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）−リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）ドメインを有していなければならないことである。

【0030】

本発明によれば、該ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２の配列の断片および配列番号２の配列またはその断片の類似体から選択され、前記断片および類似体は、少なくとも１つのグルタミン（Ｇｌｎ）−リシン（Ｌｙｓ）ドメインを有する。

【0031】

本発明の意味では、ＬＣＥ６Ａは、一般に、他に明記がない限り、タンパク質の配列番号２の配列を意味することが意図され、これは、翻訳後修飾を受けていてもまたは受けていなくてもよい。

【0032】

本発明のポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。「単離された」ポリペプチドとは、ヒトの身体からまたは生物から単離された、好ましくは精製された形態の、ポリペプチドを意味する。

【0033】

「ポリペプチドの類似体」とは、（ａ）アミノ酸配列の相同性、特に、前記ポリペプチドまたはその断片に特徴的な配列のうちの１つについて、ならびに（ｂ）同一の性質の生物活性、を有するあらゆるポリペプチドを意味することが意図される。該相同性は、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、および例えば少なくとも９５％でありうる。この配列相同性は、本発明のポリペプチドの配列における１つまたは複数の変異（置換、挿入または欠失）による変化から生じうる。好ましくは、前記ポリペプチドは、置換型の変異のみを含む。これらの置換は、保存的であってもなくてもよい。百分率の相同性は、２つの配列間での同一残基の数を意味し、前記配列は、最大の一致が得られるようにアライメントされる。２つの配列間の相同性を評価するために、従来技術から知られている多様なアルゴリズムを使用することができる。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.0、Genetics Computer Group(GCG)、Madison、Wisからのプログラムである、ＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。代替的に、これらの配列は、ＢＬＡＳＴプログラム（Altschulら、J. Mol. Biol. 215：403-410（1990）；GishおよびStates、Nature Genet. 3：266-272（1993）；Maddenら、Meth. Enzymol. 266：131-141（1996）；Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389-3402（1997）；ZhangおよびMadden、Genome Res. 7：649-656（1997））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Altschulら、Nucleic Acids Res. 25：3389-3402（1997））を使用して比較することもできる。

【0034】

「同一の性質の生物活性」とは、特に、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の類似体または断片が、特に、（ｉ）本発明のポリペプチドの特異的抗体によって認識されることが可能であること；（ｉｉ）以下に定義されるような少なくとも１つのドメインまたは領域を有すること；（ｉｉｉ）角化膜の形成に関与するヒトのＴＧＭ１、３および５などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧＭ）を結合することができることにおいて、本発明のポリペプチドの少なくとも１つの機能的な特徴または性質を有することを意味する。

【0035】

好ましい一実施形態によれば、本発明のポリペプチドの類似体は、保存的置換の存在のみによってＬＣＥ６Ａタンパク質の配列（配列番号２）と異なっている。本発明において考慮されうる保存的変異の例として、すべて網羅しているわけではないが、同一クラスのアミノ酸での１種または複数のアミノ酸残基の置換、例えば、（アスパラギン、グルタミン、セリン、システインおよびチロシンなどの）非荷電性側鎖上でのアミノ酸の置換、（リシン、アルギニン、およびヒスチジンなどの）塩基性側鎖上でのアミノ酸の置換、（アスパラギン酸およびグルタミン酸などの）酸性側鎖上でのアミノ酸の置換、（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンなどの）非極性側鎖上でのアミノ酸の置換などを挙げることができる。

【0036】

本発明は、１つまたは複数の翻訳後修飾を受けているポリペプチドでありうる、ポリペプチドまたは類似体にも関する。

【0037】

「（１つまたは複数の）翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチドがその合成後に細胞内で受けうる、例えば、１つまたは複数のリン酸化、１つまたは複数のチオール化、１つまたは複数のアセチル化、１つまたは複数のグリコシル化、１つまたは複数の脂質化、例えばパルミトイル化など、ペプチド配列中のジスルフィド架橋の形成の型の構造的再編成などのあらゆる修飾を含むことが意図される。

【0038】

本発明の意味では、「ポリペプチド断片」とは、少なくとも５個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも９個、特に少なくとも１５個の連続した、前記ポリペプチドのアミノ酸を含む、本発明のポリペプチドのあらゆる部分を意味することが意図され、前記部分は、さらに、同一の性質の生物活性を有する。

【0039】

好ましい一実施形態によれば、本発明に好適なポリペプチド断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、およびこれらの混合の配列から選択される。

【0040】

他の一実施形態によれば、本発明の実施に好適なポリペプチドは、他のポリペプチドと融合された、上に定義したようなポリペプチド、親水性または疎水性のターゲティング剤、生物変換前駆物質、発光性、放射性または比色の標識剤でもある。完全に網羅しているわけではないが、本発明のポリペプチドに結合されうる化合物の例として、蛍光タンパク質、蛍光化学物質、例えば、ローダミン、フルオレセインなど、リン光性化合物、放射性元素または比色標識剤、例えば、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アセチルトランスフェラーゼなどの特定の酵素の作用に感受性がある発色性基質などを挙げることができる。

【0041】

本発明のポリペプチドに結合されうる化合物の性質に依存して、該結合は、化学的方法によって、特に、反応性の化学官能基によって、または当業者に知られている分子生物学の方法によって行われうる。

【0042】

本発明のポリペプチドは、分解に対するその耐性またはその生物学的利用能を改良する１つまたは複数の化学修飾をさらに含みうる。この修飾は、生物学的に適合していなければならず、化粧品または薬学の分野における使用と適合していなければならない。これらの化学的または酵素的な修飾は、当業者によく知られている。完全に網羅しているわけではないが、例えば、該ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端の修飾（アセチル化）；２個のアミノ酸間の結合の修飾（アシル化またはアルキル化）；キラリティーの変化を挙げることができる。好ましくは、アミノ末端のアシル化もしくはアセチル化に、またはカルボキシ末端のアミド化もしくはエステル化に、またはその双方のいずれかに基づいた保護が使用される。

【0043】

したがって、本発明は、上に定義したようなポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、保護されたまたは保護されていない形態である。

【0044】

アミノ酸の分野において、分子の幾何学的配置は、それらが理論的に異なる光学異性体の形態でありうるようなものである。実際に、偏光面を右に回転させるようなアミノ酸（ＡＡ）の分子立体配座（右旋性立体配置またはＤ−ａａ）と、偏光面を左に回転させるようなアミノ酸（ａａ）の分子立体配置（左旋性立体配置またはＬ−ａａ）とがある。天然アミノ酸の場合、自然界では、左旋性の立体配置のみがとられる。したがって、天然由来のポリペプチドは、Ｌ−ａａ型のアミノ酸のみで構成されることになる。しかし、研究所における化学合成では、可能性がある双方の立体配置を有するアミノ酸を調製することが可能となる。したがって、この基礎材料から出発して、ポリペプチド合成中に、右旋性または左旋性の光学異性体の型のアミノ酸を組み込むことも可能である。

【0045】

したがって、本発明のポリペプチドを構成しているアミノ酸は、Ｌ−立体配置およびＤ−立体配置でありうる；好ましくは、該アミノ酸はＬ型である。したがって、本発明のポリペプチドは、Ｌ−型、Ｄ−型またはＤＬ−型でありうる。

【0046】

本発明のポリペプチドは、天然または合成の由来でありうる。これらは、当業者によく知られているいかなる方法によって合成されてもよい。こうした方法としては、（固相中または均質な液相中での）古典的な化学的合成、構成的アミノ酸またはその誘導体からの酵素的合成（Kullmanら、J. Biol. Chem. 1980、225、8234）などが挙げられる。

【0047】

本発明のポリペプチドは、改変されたまたは未改変の細菌の株の発酵などの生物学的産生の方法によって、組換え技術を使用して本発明のポリペプチドまたは断片を作製するための遺伝子工学によって（実施例参照）、または動物由来もしくは植物由来のタンパク質の抽出に続いての本発明の中程度の大きさのペプチド断片および小さいペプチド断片を放出する制御された加水分解によっても得られうる。より簡単なまたはより複雑な他の方法は、タンパク質およびペプチドの合成、抽出および精製に精通している当業者によって想定されうる。

【0048】

好ましくは、本発明のポリペプチドは、化学合成によって得られ、この技術は、純度、抗原特異性、望ましくない反応副産物がないことおよびその生成の容易性の理由で特に有利である。

【0049】

本発明の有利な実施形態によれば、本発明の上述のポリペプチドは、１種または複数の美容的または薬学的に許容される溶媒中に最初に溶解される。こうした溶媒は、例えば、水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化もしくはプロポキシル化されたジグリコール、環状ポリオール、石油ゼリー、植物油またはこれらの溶媒の任意の混合物のように、当業者によって従来通りに使用される。

【0050】

本発明の他の有利な一実施形態によれば、上述のポリペプチドは、リポソームなどの１種の美容的または薬学的な担体中に最初に溶解されるか、または粉末化された有機ポリマー上、タルクおよびベントナイトなどの鉱物性支持体上に吸着され、より一般的には、美容的または薬学的に許容されるあらゆる担体中に溶解またはその上に固定される。

【0051】

本発明の核酸配列
一実施形態によれば、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列および本発明の多様な使用におけるその適用にも関する。

【0052】

「核酸」という用語は、ハイブリダイゼーションを可能にする少なくとも１個の修飾されたヌクレオチドを場合によっては含む（例えば修飾された結合、修飾されたプリン塩基もしくはピリミジン塩基、または修飾された糖を含む）、少なくとも２個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの鎖（a chain（strands））を意味する。

【0053】

核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはこの２種の混合物でありうる。それは、単鎖（一本鎖）もしくは二重鎖（二本鎖）、またはこの２種の混合物でありうる。

【0054】

したがって、本発明は、本発明の組成物を調製するための、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列、特に、配列番号１によって表される核酸配列に少なくとも対応する配列、その類似体またはその断片の使用にも関する。

【0055】

本発明の意味では、「核酸配列の断片」とは、本発明のポリペプチドの一部をコードする核酸配列、または後者の類似体、および特に、配列番号１によって表される配列または後者の類似体を意味する。

【0056】

「核酸配列の類似体」とは、前記核酸配列によってコード化されたポリペプチドのものと同一または類似の配列を有するポリペプチドをコードする、およびコードする核酸の変性から場合によって生じるあらゆる核酸配列を意味する。

【0057】

該核酸は、天然または合成の、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸の断片、メッセンジャーＲＮＡ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの酵素による増幅技術によって得られる核酸でありうる。

【0058】

該核酸配列は、可能性があるあらゆる起源から、すなわち、動物、特に哺乳類およびより詳細にはヒトも、または植物のいずれでも、または微生物（ウイルス、ファージ、中でも細菌）からもしくは菌類から、それらが前記起源生物において天然に存在しているかまたはいないかどうかを予め判断することなく、得られるものでありうる。

【0059】

好ましい一実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、特にＰＣＲ技術を用いる、方法においてプライマーおよび／またはプローブとして使用されうる。

【0060】

この技術では、増幅されることになっている断片の両端に位置するオリゴヌクレオチドプライマーの対を選択する必要がある。増幅された断片は、例えば、アガロースもしくはポリアクリルアミドのゲル電気泳動の後、またはゲル濾過もしくはイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術の後に、確認されうる。増幅の特異性は、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列、これらの配列を含むプラスミドまたはこれらの増幅産物を、プローブとして使用する分子ハイブリダイゼーションによって調節されうる。

【0061】

増幅されたヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション反応において、増幅された前記ヌクレオチド断片のものと相補的な配列を有する標的核酸の、生体試料における存在を検出するための試薬として使用されうる。

【0062】

本発明は、本発明のプライマーを使用する増幅によって得ることができるヌクレオチド断片にも関する。

【0063】

標的核酸を増幅するための他の技術は、本発明のヌクレオチド配列を有するプライマー対を使用する（ＰＣＲ様の）ＰＣＲの代替として有利に使用されうる。ＰＣＲ様とは、核酸配列の直接的または間接的な複製を使用する、または他に標識システムが増幅されているすべての方法を意味することになり、これらの技術は当然知られており、一般に、ポリメラーゼによってＤＮＡを増幅することについての問題である；元の試料がＲＮＡである場合、逆転写が最初に行われなければならない。

【0064】

検出される標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ、例えばｍＲＮＡである場合には、生体試料中に含まれるＲＮＡから相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得るために、本発明のプライマーを用いた増幅の反応の適用または本発明のプローブを用いた検出の方法の適用の前に、逆転写酵素型の酵素を使用するのが有利であろう。得られたｃＤＮＡは、次いで、本発明の増幅または検出の方法において用いられるプライマーまたはプローブの標的として役割を果たすことになる。

【0065】

この場合には、本発明は、本発明であるとみなされるポリペプチドをコードする単離および精製された核酸断片の使用にも関する。

【0066】

本発明の核酸配列は、本発明のポリペプチドをコードする配列に対応するセンス配列、アンチセンス配列または干渉配列を含みうる。

【0067】

したがって、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、特にデオキシリボ核酸、またはリボ核酸の配列の使用にも関する。本発明の核酸配列は、特に、対応するセンスまたはアンチセンスのリボ核酸の配列を調製するために使用されうる。

【0068】

本発明は、センス配列またはアンチセンス配列を含むリボ核酸配列またはデオキシリボ核酸配列を有するポリヌクレオチド、特に、配列番号１の核酸配列またはその類似体に少なくとも対応している「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）の使用にも関する。

【0069】

「有効量」とも呼ばれる、本発明の組成物中に含まれる本発明のポリペプチドまたは核酸配列の量は、当然、その化合物の性質および必要とされる効果の関数であり、したがって広範に変化しうる。量の桁を示すには、組成物は、本発明のポリペプチドまたは核酸配列を、該組成物の総重量の０．００００１％から２０％までに相当する量で、特に、該組成物の総重量の０．０００１％から５％までに相当する量で、より詳細には、該組成物の総重量の０．００３％から３％までに相当する量で含みうる。

【0070】

本発明の組成物
好ましくは、本発明の組成物は、病理学的または非病理学的な乾燥肌上に適用される。それは、顔、首および場合によって開裂の皮膚上に、または身体のあらゆる部分におけるバリアントとして、有利に適用されうる。

【0071】

該化粧組成物および／または医薬組成物は、朝および／または夕に、顔中、首および場合によって開裂またはさらに身体上に適用されうる。

【0072】

本発明に従って用いられる化粧組成物および／または医薬組成物は、一般に、生理学的に許容され、好ましくは美容的に許容される媒体を含む、すなわち、それは、毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応のリスクなしでヒトの皮膚と接触する使用に好適であり、特に、使用者に許容されない不快の感覚（発赤、つっぱり、ヒリヒリ感など）を引き起こさない。

【0073】

好ましくは、生理学的に許容される媒体は水からなる。

【0074】

本発明に従って使用される化粧組成物および／または医薬組成物は、皮膚上の局所適用に好適なあらゆる形態、特に、場合によってはマイクロエマルションもしくはナノエマルションであってもよく、水中油型エマルション、油中水型エマルションもしくは多重（Ｗ／Ｏ／ＷまたはＯ／Ｗ／Ｏ）エマルションの形態、または水性分散液、溶液、水性ゲルもしくは粉末の形態でありうる。好ましくは、前記組成物は、水中油型エマルションの形態である。

【0075】

この組成物は、顔および／または身体の皮膚用のケア製品または洗浄製品として使用されるときには、特に、例えばポンプで機能するスプレーボトル、エアロゾルもしくはチューブ中にパッケージングされた、液体、ゲルもしくはムース、または例えばポット中にパッケージングされたクリームの形態でありうる。変形として、これは、化粧製品、および特に、ファンデーションまたはルースパウダーもしくはプレストパウダーの形態であってもよい。

【0076】

上述したポリペプチドの他に、本発明の化粧組成物および／または医薬組成物は、化粧品または薬学の分野において通常用いられている少なくとも１種の添加物、例えば、ゲル化剤および／または増粘剤、界面活性剤または共界面活性剤、液体脂肪または油、ワックス、シリコーンエラストマー、サンフィルター、染料、マット化剤またはフィラー、顔料、リフティング剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、香料およびこれらの混合物から選択される化合物も含みうる。

【0077】

特に、好ましい一実施形態によれば、本発明の化粧組成物は、すべて網羅しているわけではないが、１種または複数の以下の添加物を含みうる：
−水相の１種または複数のゲル化剤および／または増粘剤、例えば、以下から選択されるもの：架橋されたまたは架橋されていない、親水性または両親媒性の、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）のおよび／またはアクリルアミドのおよび／またはアクリル酸のおよび／またはアクリル酸の塩またはエステルの、ホモポリマーおよびコポリマー、例えば、アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ＶＰコポリマーおよびアクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ベヘネス−２５メタクリレートコポリマー、特に、Ｃｌａｒｉａｎｔから名称Ａｒｉｓｔｏｆｌｅｘ（登録商標）ＡＶＣおよびＨＭＢの下で販売されているもの、またはＮｏｖｅｏｎ社によって商品名ＰＥＭＵＬＥＮ（登録商標）ＴＲ−１もしくはＴＲ−２、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）１３８２、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）Ｕｌｔｒｅｚの下で販売されているアクリレーツ／Ｃ１０−３０アクリル酸アルキルクロスポリマー、セルロース誘導体、植物由来のガム（アカシアガムまたはアラビアガム、寒天、グアー、キャロブ、アルギネート、カラギーナン、ペクチン）または微生物由来のガム（キサンタン、プルラン）、クレー（ラポナイト）。前記ゲル化剤および／または増粘剤は、該組成物の総重量に相対して、０．０１から５重量％の桁の含有量で該組成物中に存在しうる；
−非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性にかかわらず、１種または複数の界面活性剤、好ましくは、乳化剤、特に脂肪酸およびポリオールのエステル、例えば、脂肪酸およびグリセロールのアルコキシル化（より詳細には、ポリエトキシル化）エステル、脂肪酸およびソルビタンのアルコキシル化エステル、脂肪酸のアルコキシル化（エトキシル化および／またはプロポキシル化）エステル、例えば、混合物ステアリン酸ＰＥＧ−１００／ステアリン酸グリセリル、例えば、Ｃｒｏｄａ社によって名称Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）１６５の下で販売されているもの、ならびに脂肪酸およびスクロースのエステル、例えば、ステアリン酸スクロース；脂肪アルコールのエーテルおよび糖のエーテル、特に、アルキルポリグルコシド（ＡＰＧ）、例えば、デシルグルコシドおよびラウリルグルコシド、ケトステアリルアルコールと場合によっては混合されるケトステアリルグルコシド、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ社によって名称Ｍｏｎｔａｎｏｖ（登録商標）６８の下で販売されているもの、ならびにアラキジルグルコシド、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ社によって名称Ｍｏｎｔａｎｏｖ（登録商標）２０２の下で販売されているアラキジン酸アルコールとベヘン酸アルコールとアラキジルグルコシドとの混合物の形態のもの；脂肪アルコールのエーテルおよびポリエチレングリコールのエーテル；ポリシロキサン修飾ポリエーテル；ベタインおよびその誘導体；ポリクオタニウム；脂肪アルコールのエトキシ化硫酸塩；スルホサクシネート；サルコシネート；アルキルリン酸およびジアルキルリン酸ならびにこれらの塩；ならびに脂肪酸のセッケン。前記界面活性剤は、該組成物の総重量に相対して、０．１から８％、好ましくは０．５から３重量％の桁の含有量で該組成物中に存在しうる；
−１種または複数の共界面活性剤、例えば、長い炭素鎖（Ｃ１４〜Ｃ２０）を有する直鎖脂肪アルコールならびに特にセチルアルコールおよびステアリルアルコール、前記界面活性剤は、該組成物の総重量に相対して、０．１から５重量％、好ましくは０．５から２重量％の割合で該組成物中に存在する；
−一般的に油と呼ばれる、室温で液体である１種または複数の脂肪、揮発性または不揮発性の、炭化水素、シリコーン、直鎖状、環状または分枝状の、例えば、シリコーン油、例えば、ポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）；合成油、例えば、フッ化油、安息香酸アルキルおよび分岐炭化水素、例えば、ポリイソブチレン、イソドデカン；鉱油（パラフィン）；植物油（スイートアーモンド油、マカダミア油、クロフサスグリ種子油、ホホバ油またはアマナズナ（Camelina sativa）の油、例えば、Ｕｎｉｐｅｘ社によって商品名Ｌｉｐｅｘ（登録商標）Ｏｍｅｇａ３／６の下で販売されている油）；脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸またはエステル、例えば、Ｉｎｎｏｓｐｅｃ社によって商品名Ｆｉｎｓｏｌｖ（登録商標）ＴＮの下で販売されているＣ１２〜Ｃ１５アルコールの安息香酸塩、カプリン酸／カプリル酸のものを含むトリグリセリド、Ｃｏｇｎｉｓ社によって名称Ｃｅｔｉｏｌ（登録商標）ＣＣの下で販売されている炭酸ジカプリリル；該組成物の総重量に相対して、好ましくは０．１から約１０重量％まで、好ましくは０．５から５重量％までの割合で；
−１種または複数のワックス（室温で固体または実質的に固体である化合物）、その融点は一般に３５℃を超える、例えば、オゾケライト、ポリエチレンワックス、蜜蝋またはカルナウバ蝋、該組成物の総重量に相対して、好ましくは０．０１から約５重量％まで、好ましくは０．５から５重量％の割合で；
−少なくとも１個の反応基（特に、水素またはビニル）を有するポリシロキサンの、触媒の存在下での、オルガノシリコーンとの反応によって特に得られ、少なくとも１個のアルキル（特にメチル）またはフェニルの末端基または側基を有する、１種または複数のシリコーンエラストマー、例えば、オルガノハイドロジェン−ポリシロキサン、該組成物の総重量に相対して、好ましくは０．１から約２０重量％まで、好ましくは０．２５から１５重量％の割合で；
−１種または複数のサンフィルター、特に有機フィルター、例えばジベンゾイルメタンの誘導体（特にＤＳＭによって商品名Ｐａｒｓｏｌ（登録商標）１７８９の下で販売されているブチルメトキシジベンゾイルメタンを含む）、桂皮酸の誘導体（特にＤＳＭによって商品名Ｐａｒｓｏｌ（登録商標）ＭＣＸの下で販売されているエチルヘキシルメトキシシンナメートを含む）、サリチル酸塩、パラ−アミノ安息香酸、β−β’−ジフェニルアクリレート、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファーの誘導体、フェニルベンゾイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾールおよびアントラニル誘導体；または無機フィルター、コーティングされているまたはコーティングされていない、顔料もしくはナノ顔料の形態である鉱物酸化物に基づいているもの、および特に二酸化チタンまたは酸化亜鉛に基づいているもの；該組成物の総重量に相対して、好ましくは０．１から約３０重量％まで、さらに良好には０．５から２０重量％の割合で；
−１種または複数の水溶性染料、例えば、ポンソーの二ナトリウム塩、アリザリングリーンの二ナトリウム塩、キノリンイエロー、アマランスの三ナトリウム塩、タルトラジンの二ナトリウム塩、ローダミンの一ナトリウム塩、フクシンまたはキサントフィルの二ナトリウム塩、該組成物の総重量に相対して、好ましくは０．１から約２重量％までの割合で；
−１種または複数のフィラー、特にマット化剤またはぼかし効果のあるフィラー、特にソフトフォーカス効果のある粉末。

【0078】

フィラーは、身体に、または組成物に堅さ、および／または柔らかさ、マット仕上げおよび適用に対する即時の均一性を与えるための、無色または白色、無機または合成、層状または非層状の粒子として理解される。これらのフィラーは、カモフラージュ効果、またはぼかし効果によって、しわを特に修正またはさらにマスクすることができる。

【0079】

マット化剤は、（溶液中の、分散液中の、または粒子の形態の）マット化ポリマーおよび皮膚のテカリを減少させて肌の色を統一する無機粒子から選択されうる。マット化剤は、特に以下から選択されうる：デンプン、タルク、セルロースマイクロビーズ、植物繊維、合成繊維、特にポリアミドのもの（Ｎｙｌｏｎ（登録商標）粉末、例えば、Ｎｙｌｏｎ−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社によって販売されているＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））、アクリルコポリマーのマイクロスフェア、特にポリメチル（メタ）アクリレートのもの（ＰＭＭＡ粒子またはＳｅｐｐｉｃ社によって販売されているＭｉｃｒｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｍ３１０粒子）、シリカ粉末、シリコーン樹脂粉末、アクリルポリマーの粉末、ポリエチレン粉末、エラストマー性架橋オルガノポリシロキサン（特に、信越化学工業株式会社によって名称ＫＳＧ（登録商標）の下で、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社によって名称Ｔｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）もしくはＥＰＳＸ（登録商標）の下で、または、Ｇｒａｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によって名称Ｇｒａｎｓｉｌ（登録商標）の下で販売されているもの）、タルク／二酸化チタン／アルミナ／シリカ複合粉、シリケートの粉末、およびこれらの混合物。

【0080】

「ソフトフォーカス」効果を有するフィラーは、肌の色に透明感を与え、ぼかし効果を示しうる。好ましくは、「ソフトフォーカス」フィラーは、３０ミクロン以下、より好ましくは１５ミクロン以下の平均粒径を有する。これらの「ソフトフォーカス」フィラーは、いかなる形状であってもよく、特に球状または非球状でありうる。これらは、粉末化されたシリカおよびシリケート、特に、アルミナ、ポリメタクリル酸メチル型の粉末（ＰＭＭＡまたはＭｉｃｒｏｐｅａｒｌ（登録商標）Ｍ３１０）、タルク、シリカ／ＴｉＯ_２またはシリカ／酸化亜鉛複合材、ポリエチレン粉末、デンプン粉末、ポリアミド粉末、スチレン／アクリルコポリマーの粉末、シリコーンエラストマー、ならびにこれらの混合物から選択されうる。

【0081】

好ましくは、ソフトフォーカス効果を有するこれらのマット化剤またはフィラーは、該組成物の総重量に相対して、０．１から約１０重量％までの割合、好ましくは０．１から約７重量％までの割合で使用される。

【0082】

１種または複数の顔料−白色または有色、真珠光沢または非真珠光沢、無機および／または有機、コーティングされているまたはコーティングされていない、媒体中に不溶性、該組成物を着色および／または不透明化することが意図されているもの。これらは、通常の大きさまたはナノメートルの大きさを有しうる。無機顔料の中で、二酸化チタン、場合によっては表面処理された、鉄またはクロムの酸化物、マンガンバイオレット、ウルトラマリンブルー、水酸化クロムおよびフェリックブルーを挙げることができる。有機顔料の中で、カーボンブラック、Ｄ＆Ｃ型の顔料、およびカーミン、バリウム、ストロンチウム、カルシウム、アルミニウムに基づいたレーキ顔料を挙げることができる。真珠光沢顔料または真珠層は、光を反射する虹色の粒子である。これらの真珠光沢顔料は白色真珠光沢顔料、例えば、チタンで、またはオキシ塩化ビスマスでコーティングされた雲母、有色真珠光沢顔料、例えば、酸化鉄を有するチタン雲母から選択されうる。顔料は、表面処理を受けてもよい。好ましくは、これらの顔料は、該組成物の総重量に相対して、０．１から約１０重量％の割合で、好ましくは０．１から約５重量％の割合で使用される。
−１種または複数のリフティング剤。「リフティング剤」とは、皮膚を引っ張ることができ、この引っ張り効果の結果として、皮膚を平らにし、しわおよび線を減少させるかまたはさらにこれらを即時に消すことができる化合物を意味する。リフティング剤として、天然由来のポリマー；混合シリケート；無機フィラーのコロイド状粒子；合成ポリマー；およびこれらの混合物を挙げることができる。特に、植物または微生物の由来のポリマー、皮膚付属器由来のポリマー、卵タンパク質および天然由来のラテックスを挙げることができる。これらのポリマーは、好ましくは親水性である。植物由来のポリマーとしては、特に、タンパク質およびタンパク質の加水分解物、より詳細には、穀類の、マメ科植物のおよび油性植物の抽出物、例えば、トウモロコシ、ライムギ、コムギ、ソバ、ゴマ、スペルト、エンドウマメ、タピオカ、マメ、ヒラマメ、ダイズおよびハウチワマメの抽出物などを挙げることができる。本発明に従って使用されうる他のリフティング剤は、天然由来の多糖類、特に、デンプン、特に、米、トウモロコシ、タピオカ、ジャガイモ、キャッサバ、エンドウマメから得られるもの；カラギーナン、アカシアガム（アラビアガム）、アルギネート、寒天、ジェランガム、キサンタンガム、セルロースポリマーおよびペクチン、有利には、ゲルマイクロ粒子の水性分散液において、セルロース誘導体、およびこれらの混合物である。該合成ポリマーは、一般に、ラテックスまたは擬似ラテックスの形態であり、重縮合物型であってもよく、またはラジカル重合によって得ることもできる。特に、ポリエステル／ポリウレタンの分散液およびポリエーテル／ポリウレタンの分散液を挙げることができる。好ましくは、該リフティング剤は、ＰＶＰ／ジメチコニルアクリレートと親水性ポリウレタンとのコポリマー（Ｈｙｄｒｏｍｅｒ社からのＡｑｕａｍｅｒｅ（登録商標）Ｓ−２０１１（登録商標））である。
−１種または複数の保存剤；
−金属イオン封鎖剤、例えば、ＥＤＴＡの塩など；
−香料；
−およびこれらの混合物。

【0083】

こうした添加物の例は、特に、CTFA Dictionary（The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Associationによって出版されたInternational Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook、第11版、2006）に挙げられており、これには、完全に網羅しているわけではないが、スキンケア業界において通常用いられる豊富な種類の化粧品および医薬成分が記載されており、それらは、本発明の組成物におけるさらなる成分としての使用に好適である。

【0084】

当業者は、これらの可能なすべての添加物から、該組成物と、該組成物に添加されるそれらの量との双方を、後者がその性質のすべてを維持するような方法で選択することができる。

【0085】

さらに、本発明の組成物は、多様な活性剤を場合によって含んでいてもよく、これは、ビタミン、抗酸化剤、保湿剤、抗汚染剤、角質溶解剤、収斂剤、抗炎症剤、ホワイトニング剤および微小循環を促進する作用剤からなる群から選択されうる。

【0086】

ビタミンの例としては、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、ＣおよびＥおよびこれらの誘導体、パントテン酸およびその誘導体ならびにビオチンなどが挙げられる。

【0087】

抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸およびその誘導体、例えば、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウムおよびソルビン酸アスコルビルなど；トコフェロールおよびその誘導体、例えば、酢酸トコフェロール、ソルビン酸トコフェロールおよびトコフェロールの他のエステルなど；ＢＨＴおよびＢＨＡ；没食子酸エステル、リン酸、クエン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、セファリン、ヘキサメタリン酸塩、フィチン酸、ならびに植物抽出物、例えば、ショウガ（Zingiber officinale）（ジンジャー）の根からの抽出物、例えば、ＢＩＯＬＡＮＤＥＳ社によって販売されているＢｌｕｅ Ｍａｌａｇａｓｙ Ｇｉｎｇｅｒなど、ヤハズツノマタ（Chondrus crispus）、イワベンケイ属（Rhodiola）、高度好熱菌（Thermus thermophilus）、マテ葉、オーク材、カユラペ（Ｒａｐｅｔ Ｋａｙｕ）の樹皮、サクラ葉およびイランイラン葉からの抽出物などが挙げられる。

【0088】

保湿剤の例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール、キシリトール、ソルビトール、マルチトール、ムコ多糖、例えばコンドロイチン硫酸、高分子量もしくは低分子量のヒアルロン酸またはシラノール誘導体で増強されたヒアルロン酸、例えばＥｘｙｍｏｌ社によって販売されている有効成分Ｅｐｉｄｅｒｍｏｓｉｌ（登録商標）、およびムコイチン硫酸；カロン酸；胆汁酸塩、ＮＭＦ（天然保湿因子）の主な構成要素、例えばピロリドンカルボン酸の塩および乳酸の塩、アミノ酸の類似体、例えば、尿素、システインおよびセリン；短鎖可溶性コラーゲン、ＰＰＧジグリセリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのホモポリマーまたはコポリマー、例えばＮＯＦからのＬｉｐｉｄｕｒｅ ＨＭおよびＬｉｐｉｄｕｒｅ ＰＢＭ；アラントイン；グリセリン誘導体、例えばＮＯＦから商品名Ｗｉｌｂｒｉｄｅ（登録商標）Ｓ７５３の下で販売されているＰＥＧ／ＰＰＧ／ポリブチレングリコール−８／５／３グリセリンまたはＳｅｄｅｒｍａから商品名Ｌｕｂｒａｇｅｌ（登録商標）ＭＳの下で販売されているポリメタクリル酸グリセリル；旭化成ケミカルズ株式会社によって商品名Ａｍｉｎｏｃｏａｔ（登録商標）の下で販売されているトリメチルグリシン；ならびに多様な植物抽出物、例えば、ヨーロッパグリ（Castanea sativa）の抽出物、加水分解されたヘーゼルナッツタンパク質、チューベローズ（Polianthes tuberosa）からの多糖類、アルガニアスピノサ（Argania spinosa）核油および特に丸善製薬株式会社（日本）によって商品名真珠エキス（Ｐｅａｒｌ Ｅｘｔｒａｃｔ）（登録商標）の下で販売されている、コンキオリンを含む真珠貝の抽出物などが挙げられる。

【0089】

保湿剤の他の例としては、マトリプターゼＭＴ／ＳＰ１の発現を刺激する化合物、例えば、キャロブ果肉の抽出物、ならびにＦＮ３Ｋの発現を刺激する作用剤；ケラチノサイトの増殖または分化を増加させる作用剤、例えば、高度好熱菌（Thermus thermophilus）の抽出物、またはツバキアルバプレナ（Camellia Japonica Alba Plena）花の抽出物またはカカオ（Theobroma cacao）マメの外皮の抽出物、水溶性トウモロコシ抽出物、バンバラマメ（Voandzeia subterranea）のペプチド抽出物およびナイアシンアミド；表皮脂質および表皮脂質の合成を、直接か、またはグルコシルセラミドからセラミドへのような脂質前駆物質の脱グリコシルをモジュレートする特定のβ−グルコシダーゼを刺激することによってかのいずれかで、増加させる作用剤、例えば、リン脂質、セラミド、ハウチワマメタンパク質加水分解物などが挙げられる。

【0090】

抗汚染剤の例としては、ワサビノキ（Moringa pterygosperma）種子の抽出物（例えば、ＬＳＮからのＰｕｒｉｓｏｆｔ（登録商標））；シアバター抽出物（例えば、ＳｉｌａｂからのＤｅｔｏｘｙｌ（登録商標））、ツタ抽出物の混合物、フィチン酸、ヒマワリ種子抽出物（例えば、ＳｅｄｅｒｍａからのＯｓｍｏｐｕｒ（登録商標））などが挙げられる。

【0091】

角質溶解剤の例としては、α−ヒドロキシ酸（例えば、グリコール酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、マンデル酸、または酒石酸）およびβ−ヒドロキシ酸（例えば、サリチル酸）、ならびにこれらのエステル、例えば、乳酸アルキル（Ｃ１２，１３）、ならびにこれらのヒドロキシ酸を含む植物抽出物、例えば、ローゼル（Hibiscus sabdriffa）の抽出物などが挙げられる。

【0092】

抗炎症剤の例としては、ビサボロール、アラントイン、トラネキサム酸、酸化亜鉛、硫黄酸化物およびその誘導体、コンドロイチン硫酸、グリチルリチン酸およびその誘導体、例えば、グリチルリチン酸塩などが挙げられる。

【0093】

収斂剤の例としては、ハマメリスの抽出物などが挙げられる。

【0094】

ホワイトニング剤の例としては、アルブチンおよびその誘導体、フェルラ酸（例えば、ＢＡＳＦによって販売されている、Ｃｙｔｏｖｅｃｔｏｒ（登録商標）：水、グリコール、レシチン、フェルラ酸、ヒドロキシエチルセルロース）およびその誘導体、コウジ酸、レゾルシノール、リポ酸およびその誘導体、例えば、特許出願ＷＯ２００６１３４２８２に記載のレスベラトロールジアセテートモノリポエート（resveratrol diacetate monolipoate）、エラグ酸、ロイコドーパクロムおよびその誘導体、ビタミンＢ３、リノール酸およびその誘導体、セラミドおよびそれらのホモログ、特許出願ＷＯ２００９０１０３５６に記載のペプチド、特許出願ＷＯ２００６１３４２８２に記載のバイオプレカーサーまたはトラネキサム酸塩、例えば、トラネキサム酸セチルの塩酸塩、甘草抽出物（スペインカンゾウ（Glycyrrhiza glabra）の抽出物）（これは、特に、丸善製薬株式会社によって商品名カンゾウエキス（Ｌｉｃｏｒｉｃｅ ｅｘｔｒａｃｔ）（登録商標）の下で販売されている）、抗酸化剤効果も有するホワイトニング剤、例えば、ビタミンＣの化合物、例えば、アスコルビン酸塩、脂肪酸またはソルビン酸のアスコルビルエステル、およびアスコルビン酸の他の誘導体、例えば、リン酸アスコルビル塩（例えば、リン酸アスコルビルマグネシウム、リン酸アスコルビルナトリウムなど）、またはアスコルビン酸の糖のエステル（これには、例えば、アスコルビル−２−グルコシド、２−Ｏ−アルファ−Ｄ−グルコピラノシルのＬ−アスコルビン酸塩、または６−Ｏ−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシルのＬ−アスコルビン酸塩が含まれる）などが挙げられる。この種の活性剤は、特に、ＤＫＳＨ社によって商品名アスコルビルグルコシド（登録商標）の下で販売されている。

【0095】

微小循環を促進する作用剤の例としては、ハウチワマメの抽出物（例えば、ＳｉｌａｂからのＥｃｌａｌｉｎｅ（登録商標））、ルスカスの、トチノキの、ツタの、ニンジンのまたはメリロートの抽出物、カフェイン、ニコチン酸塩およびその誘導体、サンゴモ（Corallina officinalis）の藻の抽出物、例えば、ＣＯＤＩＦによって販売されているもの；およびこれらの混合物などが挙げられる。皮膚の微小循環に対して働くこれらの作用剤は、肌の色のくすみを予防するためにならびに／または肌の色の均一性および輝きを改良するために使用されうる。

【0096】

本発明により使用される組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、以下から選択される少なくとも１種の有効成分をさらに含みうる：ｔｅｎｓｉｎ１の発現を刺激する作用剤、例えば、エレミ抽出物；ＦＮ３Ｋおよび／またはＦＮ３Ｋ ＲＰの発現を刺激する作用剤、例えば、ハナモツヤクノキ（Butea frondosa）の抽出物；ＣＥＲＴまたはＡＲＮＴ２の発現を刺激する作用剤；成長因子の産生を刺激する作用剤；抗グリケーション剤または脱グリケート剤；コラーゲンの合成を増加させるか、またはその分解を防ぐための作用剤（抗コラゲナーゼ剤、特に、マトリックスメタロプロテイナーゼの阻害剤）、特に、コラーゲンＩＶおよび／またはヒアルロナンおよび／またはフィブロネクチンの合成を増加させるための作用剤、例えば、少なくとも１種のアシル化されたオリゴペプチド、特に、ＳＥＤＥＲＭＡ社によって商品名Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００の下で販売されているもの；エラスチンの合成を増加させるか、またはその分解を防ぐための作用剤（抗エラスターゼ剤）；グリコサミノグリカンもしくはプロテオグリカンの合成を増加させるか、またはこれらの分解を防ぐための作用剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）、例えば、Ｅｘｓｙｍｏｌ社によって販売されている有効成分Ｅｐｉｄｅｒｍｏｓｉｌ（登録商標）（メチルシラントリオールに結合されたヒアルロン酸）；線維芽細胞によるインテグリンの合成を刺激するための作用剤；線維芽細胞の増殖を増加させるための作用剤；経皮吸収を促進する作用剤、例えば、アルコール、脂肪アルコールおよび脂肪酸ならびにこれらのエステルまたはエーテル誘導体、ピロリドン、４−アルキル−オキサゾリジン−２−オンズ、例えば、４−デシルオキサゾリジン−２−オン；テルペン、精油およびα−ヒドロキシ酸；ならびにこれらの混合物、このリストは、すべてを網羅しているとみなされるものではない。

【0097】

本発明を以下の非限定的な実施例によってこれから説明する。
実施例

【実施例1】

【0098】

遺伝子工学による、ＬＣＥ６Ａをコードする相補的ＤＮＡのクローニングおよびポリペプチドＬＣＥ６Ａの合成
出願人は、ヒトＬＣＥ６Ａをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をクローニングし、細菌の組換え型の、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させたＬＣＥ６Ａタンパク質を作製した。

【0099】

プロトコル：
１− ヒトＬＣＥ６Ａをコードする相補的ＤＮＡのクローニング
出願人は、以前に公表された研究（Toulzaら、Large scale identification of human genes implicated in epidermal barrier function、Genome Biology 2007、8：R107）に記載されているように、ヒトの顆粒ケラチノサイトの濃縮された画分から生成されたｃＤＮＡを得た。これらのｃＤＮＡを使用して、プライマー5’atgtcacagcagaagcagca3’および5’gtcgccttcacactcttcctc3’を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ＬＣＥ６ＡをコードするｃＤＮＡのクローニングを行った。このＰＣＲ産物は、２４０塩基対の大きさを有し、これを、製造業者の説明書に従って、クローニングキットＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）に挿入した。陽性クローンを選択して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＬＣＥ６Ａとした。プラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＬＣＥ６Ａを、制限酵素ＥｃｏＲＩによって消化させ、２５８塩基対を有するｃＤＮＡ ＬＣＥ６Ａに該当する断片を精製し、ＥｃｏＲＩによって消化される原核生物の発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にサブクローニングした。得られたクローンの方向性をスクリーニングすることにより、クローンを選択して、ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＬＣＥ６Ａとすることができた。

【0100】

２− 遺伝子工学による、ポリペプチドＬＣＥ６Ａの合成
大腸菌（E. coli）ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）−ＤＥ３−ＲＩＬ細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をプラスミドｐＧＥＸ６Ｐ１−ＬＣＥ６Ａによって形質転換させ、ＬＣＥ６Ａ組換えタンパク質の作製を以下のように行った：形質転換させた細菌を、１０ｍｌのＬＢ−アンピシリン−クロラムフェニコール培地（１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、１０ｇ／ｌ トリプトン、８ｇ／ｌ 酵母エキス、１００ｍｇ／ｌ アンピシリン、５０ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコール、ｐＨ７）中、２回転／分（ｒｐｍ）で撹拌しながら３７℃で一晩培養した。この培養物を、翌日に使用して、５００ｍｌのＬＢ−アンピシリン−クロラムフェニコール培地に播種し、培養物が６００ｎｍで０．６と０．８との間の光学濃度を有するまで、培養を約２時間継続する。次いで、０．１ｍＭのイソプロピル チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で培養を４時間継続することにより、そのＮ末端でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合された組換えＬＣＥ６Ａタンパク質（以下、ＧＳＴ−ＬＣＥ６Ａと呼ぶ）の産生を誘導する。次いで、この細菌培養物を氷上に１０分間放置し、次いで、＋４℃において６０００ｒｐｍで１０分間遠心処理する。この上清を除去した後に、ペレットを−２０℃で少なくとも１２時間保管する。

【0101】

細菌溶解液を以下のように得る：該細菌ペレットを、５０ｍｌの可溶化緩衝液（１００μｌの細菌性プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｐ８４６５、Ｓｉｇｍａ）を添加した、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に懸濁し、次いで、＋４℃において１３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理する。この上清を除去して、ペレットを５０ｍｌの可溶化緩衝液中に懸濁する。１００ｍｇ／ｍｌのリゾチームを５ｍｌ添加し、これを、氷上で１５分間インキュベートする。次いで、５００μｌの１Ｍジチオスレイトールおよび７．７５ｍｌの１０％Ｓａｒｋｏｓｙｌを添加し、これを、逆さにすることによって混合して、その懸濁液を、各回の超音波処理の間に５分間氷上に戻しながら、３回、２０秒間超音波処理（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ＸＬ２０００、Ｍｉｓｏｎｉｘ）する。次いで、この溶解液を、＋４℃において１００００ｒｐｍで３０分間遠心処理する。この上清を回収して、これに、２０ｍｌの１０％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００および１６．７５ｍｌの可溶化緩衝液を添加する。この溶液を、室温で穏やかに撹拌しながら３０分間インキュベートすることで溶解が完了し、次いで、この溶解液を（０．４５μｍの直径を有する細孔で）濾過する。

【0102】

この細菌溶解液から、ＧＳＴ−ＬＣＥ６Ａを、「ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ」カラム（２．５ｍｌの基質）（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ）上の親和性により、製造業者の説明書に従って精製する。この濾液をカラムに入れて、保持されない画分を捨てる。このカラムを、４０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（１．４７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、４．３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、０．９ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．４）ですすぎ、緩衝液Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ８中の１０ｍＭのグルタチオンを８ｍｌ、次いで、４ｍｌのＰＢＳを適用することによって溶出を行う。カラムの出口で１ｍｌの溶出画分を１２収集する。これらの各画分のうち１２．５μｌの分量を、変性条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ１５％中の電気泳動（「ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動」）によって分離し、電気転写によってニトロセルロース膜上に転写する。次いで、この膜を、ウエスタンブロッティング（免疫転写）による、溶出画分における組換えタンパク質の存在についての試験に使用する。一次抗体は、１／１００００倍で使用する、ＧＳＴを認識するモノクローナル抗体（マウスｍＡｂ ２６Ｈ１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であり、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｚｙｍｅｄ）は、１／１００００倍で使用し、検出は、試薬ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行う。該細菌組換えタンパク質を含む溶出画分を合わせて、透析袋（ＭＷＣＯ ３５００）を使用して、１０００倍量のＰＢＳに対して、撹拌しながら＋４℃で一晩透析する。次いで、この透析液を、「ＢｉｏＲａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ」キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄの方法によって試験する。

【0103】

収率は、５００ｍｌの細菌培養物あたり、平均して３ｍｇの組換えタンパク質である。

【実施例2】

【0104】

正常なヒト表皮におけるＬＣＥ６Ａタンパク質の発現および局在の調査
プロトコル：
１．ＬＣＥ６Ａタンパク質を特異的に認識するウサギ抗血清の作製および精製：
ＬＣＥ６Ａタンパク質の一次配列を解析した後に、出願人は、ＬＣＥファミリーの他のタンパク質と相同でない、ＬＣＥ６Ａの残基４２〜５６に相当する、以下配列番号６と称する、１５アミノ酸ＣＨＳＳＳＱＲＰＥＶＱＫＰＲＲを有するポリペプチドを選択した。このポリペプチドを作製して、２匹のウサギを免疫化するために使用した（第１、４、７および９週目における４回の連続した注射）。この抗血清を、第１１週目に採取する。これらのステップは、Ｇｅｎｏｓｐｈｅｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が行った。次いで、出願人が、この抗ペプチド血清を親和性によって精製した。このために、配列番号６のアミノ酸配列に相当するポリペプチドを、Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ（登録商標）キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してアガロースビーズ上に固定した。このビーズを、添加緩衝液「Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ」（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１／２に希釈した１０ｍｌの抗血清と共に、穏やかに撹拌しながら室温で１時間インキュベートする。このビーズをカラム内に沈降させて、保持されない液体を捨てる。このカラムを、０．５ＭのＮａＣｌを添加した２５ｍｌの添加緩衝液ですすぎ、次いで、５ｍｌの添加緩衝液ですすぐ。９ｍｌの「Ｇｅｎｔｌｅ Ａｇ／Ａｂ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ」（Ｐｉｅｒｃｅ）をカラムに入れることによって、抗ペプチド血清ＬＣＥ６Ａを溶出させ、９つの溶出画分のそれぞれの反応性を、ＧＳＴ−ＬＣＥ６Ａ組換えタンパク質におけるウエスタンブロッティングによって試験する。１／５０倍に希釈したそれぞれの溶出画分の一定分量とインキュベートを行い、次いで、１／１００００倍に希釈した、ペルオキシダーゼに結合された二次ウサギ抗免疫グロブリン抗体（Ｚｙｍｅｄ）とインキュベートを行う。ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出を行う。該組換えタンパク質に対して最も高い反応性を示している画分を合わせて、透析袋（ＭＷＣＯ ３５００）を使用して、１０００倍量のＴＢＳ緩衝液（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に対して、撹拌しながら＋４℃で一晩透析する。この透析液を、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ １５Ｒ、３００００ ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）によって約２０倍に濃縮する。精製された抗血清に相当する、濃縮した透析液を、ウエスタンブロットによって該組換えタンパク質について力価測定する。それは、１／２０００倍の希釈まで１００ｎｇのＧＳＴ−ＬＣＥ６Ａを認識する。

【0105】

２．免疫組織学によるＬＣＥ６Ａタンパク質の検出：
正常なヒト表皮におけるＬＣＥ６Ａタンパク質の発現および局在を、ＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清を使用した免疫組織化学法および免疫蛍光法によって解析した。正常なヒトの腹部皮膚の試料を、ホルモールで２４時間固定して、パラフィンに包埋した。９５℃の５０ｍＭ グリシン−ＨＣｌ ｐＨ３．５中で４０分間インキュベートすることによって抗原をアンマスキングした後に、該切片上で免疫検出を行う。

【0106】

免疫組織化学試験において、免疫検出は、１／２５０倍に希釈したＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清を使用して、「Ｉｍｐｒｅｓｓ ｒａｂｂｉｔ」キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造業者の説明書に従って用いて行う。

【0107】

免疫蛍光試験において、二重標識は、１／１００倍に希釈したＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清と、１／１０００倍に希釈した、（プロ）フィラグリンに指向されるマウスモノクローナル抗体（ＡＨＦ３、Simonら、J Invest Dermatol 1995、105：432）とを使用して行った。二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に結合された抗マウス免疫グロブリン免疫グロブリンおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５に結合された抗ウサギ免疫グロブリン免疫グロブリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、１／１０００倍で使用する。

【0108】

結果：
ＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清を用いた免疫組織化学法または免疫蛍光法によって得られる標識は、表皮の分化の間に、顆粒層／角質層の移行において、および角質層の下方部分において遅れて出現する。免疫蛍光法においてＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清と抗（プロ）フィラグリンモノクローナル抗体とで得られた標識の比較により、２種のタンパク質、ＬＣＥ６Ａおよびフィラグリンは、ヒト表皮の顆粒層内および角質層の底部で発現されていることが示された。

【実施例3】

【0109】

乾癬のヒト表皮におけるＬＣＥ６Ａタンパク質の発現および局在の調査
プロトコル：
１．ＬＣＥ６Ａタンパク質を特異的に認識するウサギ抗血清：
使用する、ヒトＬＣＥ６Ａタンパク質を特異的に認識するウサギ抗血清は、その作製および精製について実施例２に記載したものと同一である。

【0110】

２．免疫組織学によるＬＣＥ６Ａタンパク質の検出：
正常なヒト表皮におけるＬＣＥ６Ａタンパク質の発現および局在を、ＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清を使用した間接免疫蛍光法によって解析した。この試料は、正常なヒトの腹部皮膚からのもの、または乾癬を有する１５名の対象者から採取された乾癬の病変からのものである。これらの皮膚試料を凍結固定して−８０℃で保管した。凍結切片が得られ、これを、開放した空気中で約２時間乾燥させて、アセトンで１０分間固定し、次いで、−８０℃で保管した。９５℃の「ｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ９」（Ｄａｋｏ）中で２０分間インキュベートすることによって抗原をアンマスキングした後に、該切片上で免疫蛍光法により免疫検出を行う。ＬＣＥ６Ａ抗ペプチド血清は、１／２５０倍の希釈で使用する。二次抗体は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５に結合された抗ウサギ免疫グロブリン免疫グロブリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、１／１０００倍で使用する。

【0111】

結果：
乾癬を有する１５名の対象者から得られた病変を有する皮膚の切片の観察結果より、正常な皮膚と比較して、表皮の顆粒層および角質層の底部でのＬＣＥ６Ａの発現における大きな低下が示される。したがって、ケラチノサイトの増殖および分化の深刻な障害、ならびに表皮のバリア機能の相当な障害を示すこの疾患は、顆粒ケラチノサイトによって発現され、次いで、角化膜に組み込まれる、大きく減少された量のＬＣＥ６Ａタンパク質を示すようである。

【実施例4】

【0112】

ＬＣＥ６Ａの生化学的および機能的な特性評価−トランスグルタミナーゼ結合アッセイ
出願人は、Ｃ末端ヒスチジンタグを有する組換えＬＣＥ６Ａ（ＬＣＥ−Ｈｉｓ）を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスグルタミナーゼ結合アッセイを行った。

【0113】

１．ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓタンパク質のクローニングおよび精製：
プロトコル：
ＬＣＥ６Ａ−ＨｉｓをコードするｃＤＮＡのクローニングでは、ｐＧＥＸ６Ｐ１−ＬＣＥ６Ａベクターを起点としたＰＣＲにより、プライマー5’catatgtcacagcagaagcagcaa3’および5’ctcgaggtcgccttcacactc3’を使用して、ＬＣＥ６ＡのｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲ産物は、２４８塩基対の大きさを有し、これを、製造業者の説明書に従って、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）クローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してベクターｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）に挿入した。陽性クローンを選択して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ＬＣＥ６Ａ−ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩとした。このプラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって消化させ、２４８塩基対を有するＬＣＥ６ＡのｃＤＮＡに該当する断片を精製し、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって消化した原核生物の発現ベクターｐＥＴ４１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。得られたクローンをスクリーニングすることにより、ｐＥＴ４１ｂ−ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓというクローンを選択することができた。

【0114】

大腸菌（E. coli）ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（登録商標）−ＤＥ３−ＲＩＬ細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をｐＥＴ４１ｂ−ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓプラスミドによって形質転換させ、組換えタンパク質の作製を以下のように行った：形質転換させた細菌を、１０ｍｌのＬＢ−カナマイシン−クロラムフェニコール培地（１０ｇ／ｌ ＮａＣｌ、ｇ／ｌ トリプトン、８ｇ／ｌ 酵母エキス、５０ｍｇ／ｌ カナマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ クロラムフェニコール、ｐＨ７）中、２５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で一晩培養した。この培養物を、翌日に使用して、５００ｍｌのＬＢ−カナマイシン−クロラムフェニコール培地に播種し、培養物が６００ｎｍで０．６と０．８との間の光学濃度を有するまで、培養を約２時間継続する。次いで、０．１ｍＭのイソプロピル チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在下で培養を４時間継続することにより、組換えＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓタンパク質の産生を誘導する。次いで、この細菌培養物を氷上に１０分間放置し、次いで、＋４℃において６０００ｒｐｍで１０分間遠心処理する。この上清を除去した後に、ペレットを−２０℃で少なくとも１２時間保管する。

【0115】

細菌溶解液を以下のように得る：該細菌ペレットを、１００ｍｌの溶解緩衝液（１００μｌの細菌性プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｐ８４６５、Ｓｉｇｍａ）を添加した、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８、０．１ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）中に懸濁し、穏やかに撹拌しながら＋４℃で１．５時間インキュベートする。この溶解液を、各回の超音波処理の間に５分間氷上に戻しながら、６回、５秒間超音波処理（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｃｅｌｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ ＸＬ２０００、Ｍｉｓｏｎｉｘ）し、次いで、＋４℃において１４０００ｒｐｍで３０分間遠心処理する。この上清を回収して（０．４５μｍの直径を有する細孔で）濾過した後に、ニッケルカラム（１ｍｌの基質）「Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上の親和性による精製を行う。このカラムを、１０倍量の溶解緩衝液で平衡化し、次いで、該溶解液を入れる。保持されない液体を捨て、カラムを１５倍量の洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ８）ですすぐ。１０倍量の溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５Ｍ イミダゾール、ｐＨ８）で溶出を行う。これらの溶出画分中の該組換えタンパク質の存在をウエスタンブロットによって検出する。一次抗体は、１／２０００倍で使用する、抗テトラＨｉｓモノクローナル抗体（マウスモノクローナルＩｇＧ１「Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体」、Ｑｉａｇｅｎ）であり、ペルオキシダーゼに結合された二次抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｚｙｍｅｄ）は、１／１００００倍で使用し、検出は、試薬ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行う。該細菌組換えタンパク質を含む溶出画分を合わせて、透析袋（ＭＷＣＯ ３５００）を使用して、１０００倍量のＰＢＳに対して、撹拌しながら＋４℃で一晩透析する。次いで、この透析液を、「ＢｉｏＲａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ」キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用してＢｒａｄｆｏｒｄの方法によって試験する。収率は、５００ｍｌの細菌培養物あたり、平均して３ｍｇの組換えタンパク質である。

【0116】

２．ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスグルタミナーゼ２（ＴＧＭ２）結合アッセイ：
プロトコル：
トランスグルタミナーゼ２（モルモット肝臓から精製されたトランスグルタミナーゼ、Ｓｉｇｍａ Ｔ５３９８）によるＬＣＥ６Ａの結合アッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏで行った。

【0117】

第１の試験において、出願人は、ＬＣＥ−Ｈｉｓと、アミン結合を有する分子であるモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）との間で架橋を形成するＴＧＭ２の能力を試験した。このために、１０ｍＭのＣａＣｌ_２および５００μＭのＭＤＣ（Ｆｌｕｋａ）を添加した、緩衝液である５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４中の溶液中、０．３５μｇのＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの存在下でＴＧＭ２（１０ｎｇ／μＬ）をインキュベートした。３７℃で２時間または１８時間のインキュベート後、最終２５ｍＭまでＥＤＴＡを添加することによってこの反応を停止させる。陰性対照は、ＣａＣｌ_２の非存在下かつ１８時間のインキュベート後に１００ｍＭのＥＴＤＡの存在下で行われる同一の試験に相当する。この反応生成物を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いでＵＶでの照射によって可視化する。

【0118】

第２の試験において、出願人は、ＴＧＭ２の、それ自体とＬＣＥ６Ａの架橋を形成する能力も試験した。このために、１０ｍＭのＣａＣｌ_２を添加した、緩衝液である５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４中、０．３５μｇのＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの存在下でＴＧＭ２（１０ｎｇ／μＬ）をインキュベートした。３７℃で２時間または１８時間のインキュベート後、最終２５ｍＭまでＥＤＴＡを添加することによってこの反応を停止させる。陰性対照は、ＣａＣｌ_２の非存在下かつ１８時間のインキュベート後に１００ｍＭのＥＴＤＡの存在下で行われる同一の試験に相当する。この反応生成物を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上に転写する。分子間結合は、上述したようなウエスタンブロットによって抗Ｈｉｓ抗体（マウスモノクローナルＩｇＧ１「Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体」、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可視化される。

【0119】

結果：
第１の試験において、２時間のインキュベートから始まり、いくつかの蛍光バンドが検出され、遊離ＭＤＣ（前方移動）またはＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓ（約１７ｋＤａ）の高さまで移動した。より大きい分子量を有する、弱い、他のバンドは、ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの二量体または多量体の大きさまで移動する。同一の試験を１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下かつカルシウムの非存在下で行うときには、遊離ＭＤＣに相当するもの以外には、蛍光バンドは検出されない。

【0120】

第２の試験において、ウエスタンブロットの結果より、単量体のＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓに相当する約１７ｋＤａのバンドが１本示され、より大きい分子量のいくつかのバンドは、ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの二量体または多量体と同等の大きさまで移動する。同一の条件で、しかしカルシウムの非存在下かつ１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下でこの試験を行うときには、単量体のＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓに相当するバンドのみが検出される。

【0121】

したがって、これらの試験により、ＬＣＥ６Ａタンパク質が実際にトランスグルタミナーゼ２の基質であることを確認できる。ＬＣＥ６Ａは、ε−（γ−グルタミル）リジルをトランスグルタミナーゼに結合させるのに必要なアミノ酸残基のドナーおよびアクセプターの双方として機能する。

【0122】

３．ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスグルタミナーゼ３（ＴＧＭ３）結合アッセイ：
トランスグルタミナーゼ３（ヒトの組換えトランスグルタミナーゼ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＬＣＥ６Ａの結合アッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏで行った。これらのアッセイは、実施例４の第２段落にトランスグルタミナーゼ２について記載しているものと同一の試験プロトコルに従って行う。

【0123】

第１の試験において、出願人は、ＬＣＥ−Ｈｉｓとモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）との間で架橋を形成するＴＧＭ３の能力を試験した。このために、１０ｍＭのＣａＣｌ_２および５００μＭのＭＤＣ（Ｆｌｕｋａ）を添加した、緩衝液である５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４中の溶液中、０．３５μｇのＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの存在下でＴＧＭ３（１０ｎｇ／μＬ）をインキュベートした。３７℃で２時間または１８時間のインキュベート後、最終２５ｍＭまでＥＤＴＡを添加することによってこの反応を停止させる。陰性対照は、ＣａＣｌ_２の非存在下かつ１８時間のインキュベート後に１００ｍＭのＥＴＤＡの存在下で行われる同一の試験に相当する。この反応生成物を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで、ＵＶでの照射によって可視化する。

【0124】

第２の試験において、出願人は、ＴＧＭ３の、それ自体とＬＣＥ６Ａの架橋を形成する能力を試験した。このために、１０ｍＭのＣａＣｌ_２を添加した、緩衝液である５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．４中、０．３５μｇのＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの存在下でＴＧＭ３（１０ｎｇ／μＬ）をインキュベートした。３７℃で２時間または１８時間のインキュベート後、最終２５ｍＭまでＥＤＴＡを添加することによってこの反応を停止させる。陰性対照は、ＣａＣｌ_２の非存在下かつ１８時間のインキュベート後に１００ｍＭのＥＴＤＡの存在下で行われる同一の試験に相当する。この反応生成物を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜上に転写する。分子間結合は、上述したようなウエスタンブロットによって抗Ｈｉｓ抗体（マウスモノクローナルＩｇＧ１「Ｔｅｔｒａ−Ｈｉｓ抗体」、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて可視化される。

【0125】

結果：
第１の試験において、２時間のインキュベートから始まり、いくつかの蛍光バンドが検出され、遊離ＭＤＣ（前方移動）またはＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓ（約１７ｋＤａ）の高さまで移動した。より大きい分子量を有する弱い他のバンドは、ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの二量体または多量体の大きさまで移動する。同一の試験を１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下かつカルシウムの非存在下で行うときには、遊離ＭＤＣに相当するもの以外には、蛍光バンドは検出されない。

【0126】

第２の試験において、ウエスタンブロットの結果より、単量体のＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓに相当する約１７ｋＤａのバンドが１本示され、より大きい分子量のいくつかのバンドは、ＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓの二量体または多量体と同等の大きさまで移動する。同一の条件で、しかしカルシウムの非存在下かつ１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下でこの試験を行うときには、単量体のＬＣＥ６Ａ−Ｈｉｓに相当するバンドのみが検出される。

【0127】

したがって、これらの試験により、ＬＣＥ６Ａタンパク質が実際にトランスグルタミナーゼ３の基質であることを確認できる。ＬＣＥ６Ａは、ε−（γ−グルタミル）リジルをトランスグルタミナーゼに結合させるのに必要なアミノ酸残基のドナーおよびアクセプターの双方として機能する。ＴＧＭ２と同一の反応を触媒する、トランスグルタミナーゼ１、３および５は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、角質層の形成、ならびに角化膜の強度および不溶性に必要なイソペプチド結合の形成に関与する。したがって、ＬＣＥ６Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、角化膜の形成に、ｉｎ ｖｉｖｏで、関与する少なくとも１種のトランスグルタミナーゼの基質である。

【実施例5】

【0128】

トランスグルタミナーゼに対する結合に関与するＬＣＥ６Ａのペプチド配列の特性評価
プロトコル：
ＬＣＥ６Ａタンパク質のどの領域がトランスグルタミナーゼによる結合に必要であるかを決定するために、出願人は、ＭｉｌｌｅＧｅｎ社に手配して、ＬＣＥ６Ａのアミノ酸配列の種々の領域に相当する、９から１３アミノ酸の長さを有する、それらのＮ末端でビオチン化された、多様なポリペプチドを合成した。

【0129】

これらのポリペプチドを、ｉｎ ｓｉｔｕでの結合アッセイに使用した。ＰＢＳ中に１％のウシアルブミンの存在下で室温で３０分間のインキュベートによって含浸させた、ヒトの腹部皮膚の凍結切片を、１００μＭのビオチン化ポリペプチドおよび５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）と接触させた。室温で２時間のインキュベート後、２５ｍＭのＥＤＴＡを５分間添加することによってこの反応を停止させる。次いで、これらの切片を、１％のＳＤＳを含むＰＢＳ中でインキュベートして、非共有結合を破壊させる。

【0130】

組織内に存在し活性があるトランスグルタミナーゼによって角化膜に結合されたビオチン化ポリペプチドの存在は、該切片を５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートして共焦点顕微鏡で可視化することによって検出される。

【0131】

陽性対照は、同様の試験で、しかし、切片を、ポリペプチドの代わりに、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５に結合されたカダベリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μＭとインキュベートすることによって行う。陰性対照については、凍結切片を、各ビオチン化ポリペプチドと共にまたはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５に結合されたカダベリンと共にインキュベートするが、インキュベートは、１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下かつカルシウムの非存在下で行われる。

【0132】

結果：
陽性対照は、活性なトランスグルタミナーゼがある切片の領域に相当する、顆粒ケラチノサイトの輪郭の標識を示す。配列番号３、４および５のアミノ酸配列に相当するポリペプチドは、カダベリン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５とのインキュベート後に得られるものと同様の標識を示すのに対して、これらの同ポリペプチドまたはカダベリン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５を、ＥＤＴＡの存在下かつカルシウムの非存在下でインキュベートするときには標識が得られない。該切片を、ＬＣＥ６Ａのいかなる断片にも相当しない配列を有する、ポリペプチドRPAPPPISGGGYRARと共にカルシウムの存在下でインキュベートすると、顆粒層のケラチノサイトの細胞周囲のいかなる標識も示されない。最後に、変異した配列番号３に相当するポリペプチドMSQAKQQSW（配列番号７）、および変異した配列番号５に相当するポリペプチドEVAKPRRARQALR（配列番号８）では、顆粒層のケラチノサイトの細胞周囲のいかなる標識も示されない。

【0133】

したがって、配列番号３、４および５のアミノ酸配列は、ヒトの表皮の顆粒層内に存在するトランスグルタミナーゼが角化膜との共有結合を形成するのに必要な残基を含んでいる。変異した配列番号１および番号３に相当するポリペプチドが、角化膜を結合する能力を損失していることより、前記結合を可能にするために、ＬＣＥ６Ａタンパク質の配列中のグルタミン残基（Ｑ）とリシン残基（Ｋ）との連結が必要であることが示唆される。

【実施例6】

【0134】

化粧組成物（Ｏ／Ｗ血清）
以下の組成物は、当業者によって従来通りに調製されうる。以下に述べる量は、重量パーセントで表している。大文字で示している成分は、ＩＮＣＩ名によるものと同一である。

【0135】

【表1】

【0136】

この組成物は、快適性を向上させ、肌の色を均一にするために、特に水分を奪われかつ／または侵襲性の環境因子に曝露された皮膚上に、毎日朝および／または夕に適用されうる。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]