特許 6244597 超耐熱性エンドグルカナーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6244597

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】超耐熱性エンドグルカナーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/42 20060101AFI20171204BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171204BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20171204BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20171204BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20171204BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171204BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/42ZNA

   C12N15/00 A

   C12P19/02

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

【請求項の数】8

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-163721(P2015-163721)

(22)【出願日】2015年8月21日

(65)【公開番号】特開2017-38573(P2017-38573A)

(43)【公開日】2017年2月23日

【審査請求日】2016年3月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】000005326

【氏名又は名称】本田技研工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100064908

【弁理士】

【氏名又は名称】志賀 正武

(74)【代理人】

【識別番号】100146835

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 義文

(74)【代理人】

【識別番号】100175802

【弁理士】

【氏名又は名称】寺本 光生

(74)【代理人】

【識別番号】100094400

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 三義

(74)【代理人】

【識別番号】100126664

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 慎吾

(72)【発明者】

【氏名】須田 みぎわ

(72)【発明者】

【氏名】大熊 二郎

(72)【発明者】

【氏名】山口 明日香

(72)【発明者】

【氏名】広瀬 佳嗣

(72)【発明者】

【氏名】近藤 康弘

(72)【発明者】

【氏名】柴田 大輔

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 大

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１５−１３６３２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０１１９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３６３９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集，２０１４年 ８月 ５日，66th，p.123，2P-065

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集，２０１４年 ８月 ５日，66th，p.122，2P-062

【文献】 Appl. Environ. Microbiol.，１９９６年，62 (8)，p.3047-3049

【文献】 J. Mol. Biol.，２００２年，320，p.883-897

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol.，２０１２年，95，p.135-146

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。

【請求項2】

（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。

【請求項3】

請求項２に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。

【請求項4】

請求項３に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。

【請求項5】

真核微生物である、請求項４に記載の形質転換体。

【請求項6】

請求項４又は５に記載の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。

【請求項7】

請求項１に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項６に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。

【請求項8】

セルロースを含む材料を、請求項１に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項２に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項４若しくは５に記載の形質転換体、請求項６に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項７に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題から、化石燃料に代わる太陽光発電、風力発電、地熱発電などの新エネルギーの開発が進められている。特に、二酸化炭素排出抑制の一つの手段として、再生可能エネルギーである植物バイオマスの利用が注目されている。植物バイオマスの主な組成はセルロース、ヘミセルロース及びリグニンである。植物バイオマスの加水分解方法には、生物的手法、物理的手法、化学的手法があり、現在は酵素（セルラーゼ）による生物的糖化法が主流である。セルロース、ヘミセルロースは、グルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。

【0003】

複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。このため、多糖類のうちセルロースの加水分解には、一般的に、グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１、ＥＣ ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。一方、ヘミセルロースの加水分解には、キシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）が必要とされる。

【0004】

従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％ ｓｏｌｉｄ ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。

【0005】

高温でのリグノセルロース糖化処理に用いることが可能な耐熱性酵素、特にセルロースの加水分解に必要なエンドグルカナーゼについては、リグノセルロースの分解やセルロース繊維の処理剤、紙パルプの処理を目的として、これまでに好熱性細菌、糸状菌、アーキア等から多数単離されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。さらに、ホスト生物の突然変異体や、これら酵素のアミノ酸配列の一部を変更するなどして、比活性や耐熱性を向上させる試みもなされている。しかしながら、これらの酵素のほとんどは至適温度が６０〜８０℃であり、さらなる高耐熱性化が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００３／００５４５３９号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００３／００６８８０５号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を基質とした加水分解活性を示す新規な超耐熱性エンドグルカナーゼ、当該超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド、当該超耐熱性エンドグルカナーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該超耐熱性エンドグルカナーゼを用いたリグノセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。

【0009】

すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵素混合物及びリグノセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］ （Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
［２］ （ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［３］ 前記［２］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［４］ 前記［３］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［５］ 真核微生物である、前記［４］の形質転換体。
［６］ 前記［４］又は［５］の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
［７］ 前記［１］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［２］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記［６］の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［８］ セルロースを含む材料を、前記［１］の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［２］のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記［４］若しくは［５］に記載の形質転換体、前記［６］の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記［７］のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造に好適に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１がコードするポリペプチド（ＡＲ１５Ｇ−１１）のアミノ酸配列（配列番号１）と、メタゲノム手法により得られたｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＥＣ４５５６６．１）（配列番号８）のアミノ酸配列アライメント図である。

【図2】実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−１１−７タンパク質の各基質に対する加水分解活性の相対値（％）を示した図である。

【図3】実施例１において、各温度における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−１１−７タンパク質のＣＭＣ加水分解活性（ｐＨ５．５）（Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を示した図である。

【図4】実施例１において、各ｐＨにおける、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−１１−７タンパク質のＣＭＣ加水分解活性（５０℃）（ｐＨ５．５における加水分解活性を１００％とした相対値（％））を示した図である。

【図5A】実施例１において、８０℃の各プリインキュベーション時間における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−１１−７タンパク質のＣＭＣ加水分解活性の相対値（％）を示した図である。

【図5B】実施例１において、９０℃の各プリインキュベーション時間における、大腸菌発現させたＡＲ１５Ｇ−１１−７タンパク質のＣＭＣ加水分解活性の相対値（％）を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

［超耐熱性エンドグルカナーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離及び培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。

【0013】

近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。

【0014】

本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知のエンドグルカナーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。これらのＯＲＦのうち、エンドグルカナーゼ触媒領域が確認できたＯＲＦ１０６個について、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＣＭＣ加水分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からエンドグルカナーゼ活性を持つ超耐熱性エンドグルカナーゼ（以下、「ＡＲ１５Ｇ−１１−７」）を得た。ＡＲ１５Ｇ−１１−７のアミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号４に、それぞれ表す。

【0015】

後記実施例１＜９＞に示すように、ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、ＣＭＣ、β−グルカン、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）、非結晶性セルロースのリン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｗｏｌｌｅｎ Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、及びＰＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド）に対し加水分解活性を示す一方で、結晶性セルロースであるアビセル、β−１，３結合とβ−１，６結合グルカンからなるラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉｎ）、キシラン（ｘｙｌａｎ）、ＰＮＰＸ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド）、及びＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）に対しては、ほとんど分解活性を示さない。

【0016】

ＡＲ１５Ｇ−１１−７のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、カムチャッカの噴火口からメタゲノム手法により得られた既知のＧＨファミリー５に属するセルラーゼｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＥＣ４５５６６．１）（配列番号８）であり、ＧＨ５（Glycoside hydrolase family 5）触媒領域について７６％の配列同一性（相同性）を示した。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、ＧＨ５ファミリーに属する新規なエンドグルカナーゼであることが明らかとなった。

【0017】

ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。実際に、後記実施例１＜１０＞、＜１１＞に示すように、ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、４０〜１００℃の広い温度範囲内、かつｐＨ５〜８のｐＨ範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示し、７０〜１００℃の温度範囲内、かつｐＨ５〜８において強いエンドグルカナーゼ活性を示し、８０〜１００℃の温度範囲内、かつｐＨ５〜８において非常に強いエンドグルカナーゼ活性を示す。

【0018】

一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１５Ｇ−１１−７に対しても、グリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。

【0019】

すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有する、超耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１がコードするポリペプチド又はＡＲ１５Ｇ−１１−７）、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。

【0020】

本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。

【0021】

前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。

【0022】

前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。

【0023】

なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

【0024】

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１５Ｇ−１１及びＡＲ１５Ｇ−１１−７等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。

【0025】

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。

【0026】

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをエンドグルカナーゼ触媒領域として有することにより超耐熱性エンドグルカナーゼが得られる。

【0027】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン、及びβ−１，４結合からなるグルカンを基質とするものである。β−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカンとしては、リケナン、β−グルカン等が挙げられる。β−１，４結合からなるグルカンとしては、ＣＭＣ、ＰＳＡ、セロビオース、アビセル、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース等が挙げられる。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、ＣＭＣ、β−グルカン、リケナン、ＰＳＡ、及びＰＮＰＣを基質とするものが特に好ましい。

【0028】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他のグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが基質とし得るものとしては、例えば、キシラン、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＧ、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｌ−アラビノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。

【0029】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくともｐＨ５．５の条件下で、ＣＭＣ加水分解活性を、８０〜１００℃の温度範囲内で示すことが好ましく、７０〜１００℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、４０〜１００℃の広い温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼのＣＭＣ加水分解活性の至適温度は、ｐＨ５．５の条件下で、８０〜１００℃の範囲内にあることが好ましい。

【0030】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが有するエンドグルカナーゼ活性の至適ｐＨは、反応温度や基質に依存して変化するものの、ｐＨ５．０〜７．０の範囲内にある。例えば、基質がＣＭＣの場合の５０℃における至適ｐＨは５．４である。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜７．０の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ５．０〜８．０の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものがより好ましい。

【0031】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、キシラナーゼ活性を有するものであってもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが有するキシラナーゼ活性は、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下で示すことが好ましい。

【0032】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、エンドグルカナーゼ活性及びキシラナーゼ活性以外のグリコシド加水分解活性を有していてもよい。その他のグリコシド加水分解活性としては、β−キシロシダーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。

【0033】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるエンドグルカナーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のグリコシド加水分解酵素が有する、酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼには、公知のグリコシド加水分解酵素に対し、酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。

【0034】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことも好ましい。セルロース結合モジュールは、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとエンドグルカナーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼとしては、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、エンドグルカナーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。

【0035】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。

【0036】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた超耐熱性エンドグルカナーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。

【0037】

また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該超耐熱性エンドグルカナーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。

【0038】

［超耐熱性エンドグルカナーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼをコードする。当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。

【0039】

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。

【0040】

（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

【0041】

なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。

【0042】

本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

【0043】

前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号３又は４で表される塩基配列であってもよく、配列番号３又は４で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。

【0044】

配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１５Ｇ−１１−７をコードする遺伝子（「ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子」ということがある。）の全長若しくはエンドグルカナーゼ触媒領域を含む部分領域（ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子の場合、配列番号２中の３２位のチロシン（Ｙ）から３２６位のセリン（Ｓ）までの２９５アミノ酸残基からなる部分領域をコードする領域）を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３又は４で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。

【0045】

前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号３又は４で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。

【0046】

なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

【0047】

例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。

【0048】

本発明に係るポリヌクレオチドは、エンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。

【0049】

［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

【0050】

本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。

【0051】

当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。

【0052】

本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。

【0053】

［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた超耐熱性エンドグルカナーゼを生産し得る。

【0054】

発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ヒートショック法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。

【0055】

宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。

【0056】

［超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法］
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる。

【0057】

形質転換体によって生産された超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。

【0058】

形質転換体から本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出又は精製する方法は、当該超耐熱性エンドグルカナーゼのグリコシド加水分解活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の超耐熱性エンドグルカナーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。

【0059】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に超耐熱性エンドグルカナーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の超耐熱性エンドグルカナーゼを簡便に精製することができる。

【0060】

すなわち、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記超耐熱性エンドグルカナーゼを抽出し精製することを含む。

【0061】

［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。

【0062】

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、リグノセルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記超耐熱性エンドグルカナーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼを全て含むものがより好ましい。

【0063】

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるリグノセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。

【0064】

［リグノセルロース分解物の製造方法］
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによりセルロースやへミセルロースを加水分解して、オリゴ糖を産生することによってリグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。

【0065】

ヘミセルロース、若しくはセルロースを含む材料としては、ヘミセルロース、若しくはセルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。

【0066】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによるヘミセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該超耐熱性エンドグルカナーゼがエンドグルカナーゼ活性を示す条件であればよく、エンドグルカナーゼ活性とキシラナーゼ活性を示す条件であることが好ましい。例えば、４０〜１００℃、ｐＨ５．０〜８．０で反応を行うことが好ましく、７０〜１００℃、ｐＨ５．０〜７．０で反応を行うことがより好ましく、８０〜１００℃、ｐＨ５．０〜７．０で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。

【0067】

リグノセルロースの加水分解反応には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃でグリコシド加水分解酵素活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該リグノセルロース分解物の製造方法には、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。

【実施例】

【0068】

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0069】

［実施例１］温泉土壌からの新規超耐熱性エンドグルカナーゼのクローニング
＜１＞ 温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
超耐熱性エンドグルカナーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。

【0070】

採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ Ｌａｒｇｅ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち５μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、エンドグルカナーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。
温泉土壌サンプルＡＲ１５について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３７０ｂｐ、総リード数５，４１９,４０６個、総ゲノム解読量２，００７，７２５，０４０ｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。

【0071】

＜２＞ 温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
４５４シーケンサーで読みとられた塩基配列は、Ｒｏｃｈｅ ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｍａｔｃｈ （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ ｕｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
１００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計１１８，６００，８４６ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数５，４１９，４０６リードのうち４，８０５，６４０リードが、平均で１，１４６ｂｐ以上のコンティグにアセンブルされ（計１０３，５０８コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１５１，５８５ｂｐであった。

【0072】

＜３＞ エンドグルカナーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０））。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ^−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットしたＯＲＦ配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。

【0073】

＜４＞ 遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ^−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性から、前記＜３＞で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。なお、ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。

【0074】

メタゲノムＡＲ１５シーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索から、エンドグルカナーゼ配列として１０６個のＯＲＦがエンドグルカナーゼ遺伝子と予測された。このＯＲＦ１０６個のＧＨファミリー分類を表１に示す。表１に示すように、メタゲノムＡＲ１５から、ＧＨ５ファミリーに属するエンドグルカナーゼ完全長ＯＲＦ１３個と、ＧＨ９ファミリーに属する完全長ＯＲＦ４個と、ＧＨ１２ファミリーに属する完全長ＯＲＦ４個とが得られた。エンドグルカナーゼ遺伝子と推定された全ての完全長ＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨ１２ファミリーに属しエンドグルカナーゼ配列を持つＯＲＦであるＡＲ１５Ｇ−１１からエンドグルカナーゼ遺伝子が単離された。

【0075】

【表1】

【0076】

＜５＞ オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１
オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１（配列番号１）は、３５３アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、当該ポリペプチドは１位のアミノ酸残基が開始コドンメチオニン（Ｍ）であり、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号３）である。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１は、３２位のチロシン（Ｙ）から３２６位のセリン（Ｓ）までの２９５アミノ酸残基がＧＨ５触媒ドメインをコードしていると推測された。また、シグナル配列予測ソフトウェア ＳｉｇｎａｌＰ ４．１による分泌シグナルは検出されなかった。当該ＯＲＦと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、カムチャッカの噴火口からメタゲノム手法により得られたＧＨファミリー５に属するセルラーゼｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＥＣ４５５６６．１）であった。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、ＧＨ５触媒領域について７６％であったため、当該ＯＲＦは新規な配列であると確認された。

【0077】

図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１がコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）と、ＧＨファミリー５に属するセルラーゼｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＥＣ４５５６６．１）のアミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。

【0078】

＜６＞ オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１からの遺伝子クローニング
配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴ−３’：配列番号５で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）を付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号５で表される塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列の１〜２０位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号６で表される塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列の１，０４４〜１，０６２位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。

【0079】

ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１から２個の遺伝子クローンＡＲ１５Ｇ−１１−３及びＡＲ１５Ｇ−１１−７を得た。エンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−１１−７の塩基配列（配列番号４）は、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１（配列番号３）と同様、 １，０６２ｂｐを含むが、２塩基異なっていた。すなわち、８９６番目の塩基がオープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１ではＡ、クローニングされたＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子においてはＧであり、 ９３２番目の塩基がオープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１ではＡ、ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子においてはＧであった。この２ヶ所の塩基の違いにより、両者がコードするポリペプチドのアミノ酸配列も異なっており、オープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１のアミノ酸配列（配列番号１）とエンドグルカナーゼ候補遺伝子ＡＲ１５Ｇ−１１−７のアミノ酸配列（配列番号２）は２アミノ酸残基異なっていた。すなわち、２９９位のアミノ酸残基がオープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１ではグルタミン（Ｑ）、ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子においてはアルギニン（Ｒ）であり、 ３１１位のアミノ酸残基がオープンリーディングフレームＡＲ１５Ｇ−１１ではグルタミン酸（Ｅ）、ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子においてはグリシン（Ｇ）であった。

【0080】

＜７＞ ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子の遺伝子発現及び酵素タンパクの精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ_６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ−２００Ｔ（コスモバイオ社製）を用いて、３０秒間破砕−３０秒間休止工程を１０回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物を７０℃で２時間熱処理した後、遠心分離処理を行って得られた上清を、粗酵素液とした。

【0081】

酵素タンパク質の精製を行う場合には、前記と同様に培養及び遠心分離して得られた菌体の懸濁液に対して、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。

【0082】

当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清に、終濃度５００ｍＭとなるようにＮａＣｌを加えた後、５００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉｓＴｒａｐ ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、５００ｍＭのＮａＣｌ及び５００ｍＭのイミダゾールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のＣＭＣ加水分解活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ Ｐｈｎｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０によって５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。ＣＭＣ加水分解活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。

【0083】

＜８＞ ＡＲ１５Ｇ−１１−７のＣＭＣ加水分解活性測定
まず、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製）を基質とし、ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−１１−７）のＣＭＣ加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた粗酵素液、又は前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素液を用いた。
具体的には、５０μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液、２５μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、２５μＬの粗酵素液又は精製酵素液からなる混合液を、１０分間又は１５分間反応させることにより行った。全ての計測において、粗酵素液又は精製酵素液の代わりに５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。
反応終了後は、等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の氷冷後に遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。精製酵素を用いた場合には、１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。この結果、粗酵素液と精製酵素液のいずれも、ＣＭＣ加水分解活性を有することが確認された。

【0084】

＜９＞ ＡＲ１５Ｇ−１１−７の基質特異性
ＡＲ１５Ｇ−１１−７遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−１１−７）に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた粗酵素液を用いた。また、基質として、アビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）、ＰＳＡ、ＣＭＣ、大麦由来β−グルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）、キシラン（カバ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、及びＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。

【0085】

具体的には、まず、反応液として、２５μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と７μＬの粗酵素液と１８μＬの精製水からなる混合液を９０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに同様に保温した５０μＬの各基質溶液（アビセル粉末、ＰＳＡ、ＣＭＣ、β−グルカン、キシラン、リケナン、及びラミナリンは１質量％水溶液、ＰＮＰＣ、ＰＮＰＧ、及びＰＮＰＸは３．４ｍＭ水溶液）を添加し、得られた混合液を９０℃で１５分間インキュベートすることにより酵素反応を行った。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。

【0086】

反応終了後、アビセル粉末、ＰＳＡ、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とした反応においては、前記＜８＞のＡＲ１５Ｇ−１１−７のＣＭＣ加水分解活性を調べた場合と同様にして、加水分解によって生成した還元糖量を求めた。ただし、キシランの場合は、キシロースで作成した検量線を用いた。
ＰＮＰＧ、ＰＮＰＸ、又はＰＮＰＣを基質とした反応においては、反応終了後は、等量の２００ｍＭ 炭酸ナトリウム水溶液を加えて５分間遠心分離処理し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて４２０ｎｍによって吸光度を計測し、ｐ−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。

【0087】

各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。各基質に対する加水分解活性は、ＣＭＣ加水分解活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）、すなわち、ＣＭＣを基質とした反応で生成された還元糖量を１００％とした場合の、反応により生成された還元糖量又はｐ−ニトロフェノール量の相対値（％）として示した。各基質に対する加水分解活性の相対値（％）を図２に示す。この結果、ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、ＣＭＣ、β−グルカン、ＰＳＡ、リケナン、及びＰＮＰＣに対し加水分解活性を示したが、その他の基質に対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。

【0088】

＜１０＞ ＣＭＣ加水分解活性の温度依存性
酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−１１−７）のＣＭＣ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素液を用いた。

【0089】

具体的には、２５μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と２５μＬの精製酵素液と５０μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液とからなる混合液を、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００℃で１０分間反応させることにより行った。反応終了後、前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）として算出した。

【0090】

測定結果を図３に示す。ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、温度範囲４０〜１００℃においてＣＭＣ加水分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔ_ｏｐｔ）は、ｐＨ５．５において９０℃であった。

【0091】

＜１１＞ ＣＭＣ加水分解活性のｐＨ依存性
酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−１１−７）のＣＭＣ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した精製酵素液を用いた。また、バッファーとして、２００ｍＭ マッキルベインバッファー（ＭＢ）（ｐＨ４．０〜８．０）、２００ｍＭ 酢酸バッファー（ＳＡＢ）（ｐＨ４．０、５．５、６．０）、又は２００ｍＭ リン酸バッファー（ＰＢ）（ｐＨ６．０、７．０、８．０）を用いた。

【0092】

具体的には、２５μＬの各バッファーと２５μＬの精製酵素液と５０μＬの１質量％ＣＭＣ水溶液からなる混合液を、５０℃で１０分間反応させることにより行った。反応終了後、前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求めた。

【0093】

各ｐＨにおけるＣＭＣ加水分解活性は、ｐＨ５．５におけるＣＭＣ加水分解活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）、すなわち、ｐＨ５．５における反応で生成された還元糖量を１００％とした場合の、各反応により生成された還元糖量の相対値（％）として示した。ｐＨ５．５におけるＣＭＣ加水分解活性を１００％とした、各ｐＨにおけるＣＭＣ加水分解活性の相対値（％）を図４に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
ＡＲ１５Ｇ−１１−７は、ｐＨ５〜８の範囲において、ＣＭＣ加水分解活性を示した。至適ｐＨは、５０℃でｐＨ５．４（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。

【0094】

＜１２＞ ＣＭＣを基質としたＡＲ１５Ｇ−１１−７の熱安定性
酵素タンパク質（ＡＲ１５Ｇ−１１−７）の熱安定性（耐熱性）を調べるため、８０℃で０〜１６８時間、又は９０℃で０〜１２０分間の予備加温（プリインキュベーション）を行い、酵素活性が無処理区（プリインキュベーション時間：０時間）の５０％に低下するプリインキュベーション時間（半減期Ｔ_ｈａｌｆ）を求めた。計測には、前記＜７＞で得られた粗酵素液を用いた。

【0095】

具体的には、まず、２５μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と７μＬの粗酵素液と１８μＬの精製水とからなる混合液を、８０℃で０、３、６、２４、４８、７２、９６、１２１、１６８時間保温、又は９０℃で０、１５、３０、６０、１２０分間保温してプリインキュベーションを行った。ＣＭＣ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＣＭＣ水溶液をそれぞれ別々に９０℃で５分間加温した後、当該混合液に等量の１質量％ＣＭＣ水溶液を添加し、９０℃で１５分間反応させることにより行った。反応終了後、前記＜８＞と同様にして酵素による加水分解によって生成した還元糖量を求めた。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。

【0096】

ＣＭＣ加水分解活性は、無処理区の活性を１００％とした相対値（％）として示した。各プリインキュベーション時間におけるＣＭＣ加水分解活性の相対値（％）を図５に示す。図５Ａに８０℃でプリインキュベーションした結果を、図５Ｂに９０℃でプリインキュベーションした結果を、それぞれ示す。プリインキュベーション温度８０℃及び９０℃におけるＡＲ１５Ｇ−１１−７の半減期Ｔ_ｈａｌｆは、それぞれ約９０時間及び約５０分間であった。

【産業上の利用可能性】

【0097】

本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼは、少なくとも９０℃、ｐＨ５．５の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該超耐熱性エンドグルカナーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【配列表】

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