特許 6245866 嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6245866

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20171204BHJP

   B09B 3/00 20060101ALI20171204BHJP

   B09C 1/10 20060101ALI20171204BHJP

   C02F 3/28 20060101ALI20171204BHJP

   C02F 3/34 20060101ALI20171204BHJP

   C12R 1/385 20060101ALN20171204BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   C12N1/20 DZNA

   C12N1/20 F

   B09B3/00 CZAB

   B09B3/00 E

   C02F3/28 Z

   C02F3/34 Z

   C12N1/20 A

   C12R1:385

【請求項の数】2

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2013-141062(P2013-141062)

(22)【出願日】2013年7月4日

(65)【公開番号】特開2015-12822(P2015-12822A)

(43)【公開日】2015年1月22日

【審査請求日】2016年6月21日

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01596

【微生物の受託番号】NPMD  NITE P-01598

(73)【特許権者】

【識別番号】390037154

【氏名又は名称】大和ハウス工業株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】593006630

【氏名又は名称】学校法人立命館

(74)【代理人】

【識別番号】100157107

【弁理士】

【氏名又は名称】岡 健司

(72)【発明者】

【氏名】河目 裕介

(72)【発明者】

【氏名】吉田 和生

(72)【発明者】

【氏名】久保田 謙三

(72)【発明者】

【氏名】川越 大樹

(72)【発明者】

【氏名】久保 幹

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００６／０９０８５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開平０５−２７６９３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−３４２２５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Soils and Sediments，２０１１年，11(6)，923-929

【文献】 Geosystem Engineering，２０１３年 ６月２５日，16(2)，165-174

【文献】 日本生物工学会大会講演要旨集，１９９７年，1997，247

【文献】 Current Microbiology，２００４年，49(6)，415-422

【文献】 World journal of microbiology & biotechnology，２０１２年，28(3)，841-848

【文献】 Journal of Hazardous Materials，２０１０年，182(1-3)，896-902

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１／３８

Ｂ０９Ｂ ３／００

Ｃ０２Ｆ ３／００−３／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８で寄託された微生物。

【請求項2】

請求項１に記載の微生物を炭化水素化合物または油分で汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物に関するものである。

【背景技術】

【0002】

近年、工場やガソリンスタンドなどの跡地を再利用する際に、跡地の土壌が鉱物油やその他の化学物質に汚染されている場合があり、これら汚染土壌への対策が必要になっている。
そして、このような汚染土壌の浄化方法の１つに、微生物が有する汚染物質の分解能を利用したバイオレメディエーション法がある。またこのようなバイオレメディエーション法に用いる新規な微生物が各種単離されている（特許文献１〜３参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特許第４２２７８６１号公報

【特許文献2】特許第４３９５８７０号公報

【特許文献3】特許第４８３６５５２号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、特許文献１〜３に記載されている新規微生物は、全て好気条件下において分解能力が発現するものであり、嫌気条件下において分解能力が発現するものであるかは不明である。

【0005】

ここで一般的に、汚染土壌の浄化では、地表面近傍においては空気が供給されることから好気状態での浄化が行われることになるが、地表面から深くなるにしたがって空気が供給されにくくなることから徐々に嫌気状態となってくる。加えて、バイオレメディエーション法において用いられている微生物は一般的に好気条件下において分解能力を発現するものである。
従って、従前の汚染土壌の浄化においては、地表面から深い土壌においても微生物の分解能力を発現させるために、地中内に空気を供給する配管を設置したり、定期的に土壌を撹拌したりすることなどを行って、人為的に地中深くの土壌についても好気条件を作り出すことが行われている。

【0006】

しかしながら、空気供給用の配管を設置したり、定期的に土壌を撹拌したりすることは、設備が大規模化し、浄化コストの上昇に繋がってしまうという問題がある。

【0007】

そこで、空気を供給しなくても汚染土壌を分解することができれば、空気供給用の配管などの設備が不要となり、省力化を実現することができる。また、浄化コストも下げることができることにもなる。

【0008】

今回、本願発明者らは、鋭意検討を行った結果、嫌気条件下においても炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物を単離することに成功したのである。
すなわち、本発明は従前のバイオレメディエーション法による汚染土壌の浄化における上記の問題点に鑑みてなされたものであって、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する新規微生物の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を達成するために、本発明の請求項１は、嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８で寄託された微生物である。

【0010】

本発明の請求項２は、請求項１に記載の微生物を炭化水素化合物または油分で汚染された土壌または水に供給することを特徴とする汚染土壌または汚染水の浄化方法である。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６または受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８で特定される新規微生物を用いることで、嫌気条件下においても油分で汚染された土壌や水の浄化を行うことができる。その結果、設備の省力化を図ることができ、浄化コストも下げることができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６）のコロニー像である。

【図2】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６）のグラム染色像である。

【図3】１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６）の分子系統解析結果である。

【図4】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８）のコロニー像である。

【図5】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８）のグラム染色像である。

【図6】５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８）の分子系統解析結果である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明に係る微生物は、Pseudomonas属に属するものであり、さらにシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）に帰属するものであり、株名は１５−Ｂ株と５５−Ｄ株である。また、本発明に係る微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構
特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に平成２５年６月１７日に受託されており、その受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−１５９６（１５−Ｂ株）とＮＩＴＥ Ｐ−１５９８（５５−Ｄ株）である微生物である。
なお、本発明に係る微生物については、炭化水素化合物または油分を分解する能力を有しつつ、紫外線照射や放射線照射などの公知の手法にて変異をさせた変異株や、自然界において変異した変異株も含まれるものである。

【0014】

本発明に係る微生物の単離方法は以下の通りである。
（１）１次スクリーニング
まず、土壌サンプル０．１ｇを１．５ｍｌ容マイクロチューブに入れ、蒸留水１ｍｌを加えてボルテックスミキサーで撹拌し、土壌懸濁液を作製した。次に、１０ｍｌ容バイアル瓶にＡ重油を０．２％（ｗ／ｖ）含む改変ＳＷ培地１０ｍｌと、作製した土壌懸濁液１％（ｖ／ｖ）を加え、窒素を充填した嫌気ボックス内で密閉した。これを３０℃の環境恒温下で培養し、濁度が上昇した培養液１００ μＬをＧＡＭ寒天培地（ＧＡＭ培地に寒天末を２０ｇ／Ｌとなるように加えたもの）に塗布した。そして、このプレートを３０℃、７２時間静置培養し、単離できたコロニーを１次スクリーニング通過サンプルとした。なお、改変ＳＷ培地の組成を表１に、ＧＡＭ培地の組成を表２に示す。

【0015】

【表1】

【0016】

【表2】

（２）２次スクリーニング
次に、１０ｍｌ容バイアル瓶に改変ＳＷ培地１０ｍｌを入れて１次スクリーニング通過菌株を植菌した後、これにＡ重油を０．２％（ｖ／ｖ）加えて嫌気ボックス内で密栓し、３０℃、７２時間振盪培養した。そして、増殖が見られたサンプルを２次スクリーニング通過菌株とした。
（３）３次スクリーニング
最後に、３次スクリーニングを行うことによって、本発明に係る微生物１５−Ｂ株、５５−Ｄ株を単離した。具体的には、まずＧＡＭ培地で２次スクリーニング通過菌株を一晩培養し、前培養液を作製した。次に、５００ｍｌ容培養瓶に改変ＳＷ培地５００ｍｌを入れ、作製した前培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌した。さらにＡ重油を０．２％（ｗ／ｖ）加えて嫌気ボックス内で密栓し、３０℃、７２時間振盪培養した。そして、増殖が見られたサンプルに、クロロホルム・メタノール（３：１）混合溶液を３０％入れてよく撹拌し、残存油分を抽出した。Ａ重油の初期添加量と残存量を比較し、減少が認められたものをスクリーニング取得菌株すなわち本発明に係る微生物１５−Ｂ株、５５−Ｄ株とした。

【0017】

（１５−Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６））
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の分類学的性質及び形態的性質を説明する。

【0018】

（分類学的性質）
まず、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の塩基配列は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ塩基配列である。
次に、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表３に示す結果となり、Pseudomonas属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas aeruginosa ＤＳＭ５００７１株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
さらに、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行った結果においても表４に示す通り、Pseudomonas属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas aeruginosa ＡＴＣＣ１０１４５株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。

【0019】

【表3】

【0020】

【表4】

【0021】

次に、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析を行ったところ図３に示す結果となり、Pseudomonas属の種で形成されるクラスターに含まれ、ブーツストラップ確率が１００％でPseudomonas aeruginosaと同一の分類系統学的位置を示した。

【0022】

（形態的性質）
次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の形態観察を、LB寒天培地（Polypeptone ：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、Agar：２０ｇ／Ｌ）上で、３０℃下、培養２４時間において行ったところ以下に示す通り、桿菌で、黄色のコロニー色を示した。コロニー像を図１に、グラム染色像を図２に示す。
細胞形態 ： 桿菌（０．７−０．８×１．０−１．２μｍ）
グラム染色 ： −
芽胞形成 ： −
コロニー色調 ： 黄色

【0023】

（培養条件、保管条件）
最後に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の培養条件、保管条件を以下に示す。なお、以下に記載の培養条件、保管条件は一例に過ぎず、本発明に係る微生物１５−Ｂ株が増殖できるものであれば特に限定されるものではない。
［培養条件］
培地名：LB培地（Polypeptone：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）
培養温度：３０℃
培養期間：１〜２日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性：不要
［保管条件］
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：５℃付近、保護剤の組成：１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ無調整、加圧滅菌（１１５℃、１５分））
凍結法による保管（−８０℃付近）：可能（保護剤：２０％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：１ヶ月、保管温度：５℃）

【0024】

以上の分類学的性質（塩基配列解析）および形態的性質（形状的特徴）の結果から、本発明に係る微生物１５−Ｂ株はPseudomonas aeruginosaに属せしめるのが適当であることが認められた。
ここで、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する微生物であるが、Pseudomonas aeruginosaに属する微生物においてこのような能力を有する微生物はこれまで単離されていない。
従って、これらの結果から本発明に係る微生物１５−Ｂ株は新規微生物であることが確認できた。なお、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は好気条件下においても生育可能な通性嫌気性微生物であるため、使用状況が嫌気条件下のみに限定されるものではない。

【0025】

また、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有するものであることから、水中においても特段空気の供給を行うことなく使用することができる。従って、本発明に係る微生物１５−Ｂ株は、汚染土壌の浄化だけでなく、汚染水の浄化にも使用することができる。

【0026】

さらに、本発明に係る微生物１５−Ｂ株を使用する際には、必要に応じて適宜、窒素やリンなどの栄養素や各種の栄養塩を添加することもできる。

【0027】

（５５−Ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８））
次に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の分類学的性質及び形態的性質を説明する。

【0028】

（分類学的性質）
まず、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の塩基配列は、配列番号１に示す１６ＳｒＤＮＡ塩基配列である。
次に、国際塩基配列データベース（GenBank／DDBJ／EMBL）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行ったところ表５に示す結果となり、Pseudomonas属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas aeruginosa ＤＳＭ５００７１株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。
さらに、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）に基づいて当該塩基配列の相同性検索を行った結果においても表６に示す通り、Pseudomonas属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に高い相同性を示した。また、基準株ではPseudomonas aeruginosa ＡＴＣＣ１０１４５株に対して相同率１００％の高い相同性を示した。

【0029】

【表5】

【0030】

【表6】

【0031】

次に、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく分子系統解析を行ったところ図６に示す結果となり、Pseudomonas属の種で形成されるクラスターに含まれ、ブーツストラップ確率が１００％でPseudomonas aeruginosaと同一の分類系統学的位置を示した。

【0032】

（形態的性質）
次に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の形態観察を、LB寒天培地（Polypeptone ：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ、Agar：２０ｇ／Ｌ）上で、３０℃下、培養２４時間において行ったところ以下に示す通り、桿菌で、黄色のコロニー色を示した。コロニー像を図４に、グラム染色像を図５に示す。
細胞形態 ： 桿菌（０．７−０．８×１．０−１．２μｍ）
グラム染色 ： −
芽胞形成 ： −
コロニー色調 ： 黄色

【0033】

（培養条件、保管条件）
最後に、本発明に係る微生物５５−Ｄ株の培養条件、保管条件を以下に示す。なお、以下に記載の培養条件、保管条件は一例に過ぎず、本発明に係る微生物５５−Ｄ株が増殖できるものであれば特に限定されるものではない。
［培養条件］
培地名：LB培地（Polypeptone：１０ｇ／Ｌ、Extract Yeast Dried：５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ：５ｇ／Ｌ）
培地の殺菌条件：オートクレーブ（１２１℃、１５ｍｉｎ）
培養温度：３０℃
培養期間：１〜２日
酸素要求性：好気
培養方法：好気培養
光要求性：不要
［保管条件］
凍結乾燥法による保管：可能（保管温度：５℃付近、保護剤の組成：１０％スキムミルク、１％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ無調整、加圧滅菌（１１５℃、１５分））
凍結法による保管（−８０℃付近）：可能（保護剤：２０％グリセロール）
継代培養による保管：固体培養、液体培養どちらでも可（植え継ぎ間隔：１ヶ月、保管温度：５℃）

【0034】

以上の分類学的性質（塩基配列解析）および形態的性質（形状的特徴）の結果から、本発明に係る微生物５５−Ｄ株はPseudomonas aeruginosaに属せしめるのが適当であることが認められた。
ここで、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有する微生物であるが、Pseudomonas aeruginosaに属する微生物においてこのような能力を有する微生物はこれまで単離されていない。
従って、これらの結果から本発明に係る微生物５５−Ｄ株は新規微生物であることが確認できた。なお、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は好気条件下においても生育可能な通性嫌気性微生物であるため、使用状況が嫌気条件下のみに限定されるものではない。

【0035】

また、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、後記するように嫌気条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を有するものであることから、水中においても特段空気の供給を行うことなく使用することができる。従って、本発明に係る微生物５５−Ｄ株は、汚染土壌の浄化だけでなく、汚染水の浄化にも使用することができる。

【0036】

さらに、本発明に係る微生物５５−Ｄ株を使用する際には、必要に応じて適宜、窒素やリンなどの栄養素や各種の栄養塩を添加することもできる。

【実施例】

【0037】

次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株および５５−Ｄ株について、嫌気条件下における炭化水素化合物または油分の分解能を実施例に基づいて説明する。

【0038】

（実施例１）
まず、嫌気性ボックス（Thermo Scientific社製）内で改変ＳＷ培地にＡ重油を２０００ｐｐｍ添加することによって試験用培地を作製した。

【0039】

次に、本発明に係る微生物１５−Ｂ株を上記の試験用培地に添加し、３０℃で７２時間静置培養した。

【0040】

最後に、培養後の試験用培地の油分を有機溶媒にて抽出し、残存油分濃度をガスクロマトグラフィーにて分析することで、本発明に係る微生物１５−Ｂ株の嫌気条件下における炭化水素化合物または油分の分解能を評価した。

【0041】

（実施例２）
１５−Ｂ株を５５−Ｄ株に変更した以外は実施例１と同様にして、実施例２を行った。

【0042】

その結果、微生物１５−Ｂ株を添加した実施例１は７２時間後のＡ重油が７．３％低下し、微生物５５−Ｄ株を添加した実施例２は７２時間後のＡ重油が７．２％低下した。
従って、本発明に係る微生物１５−Ｂ株および５５−Ｄ株は、従前の微生物では生育が困難である嫌気条件下においても生育するだけでなく、かかる条件下において炭化水素化合物または油分を分解する能力を発現するものであることがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0043】

本発明に係る微生物は、バイオレメディエーション法による汚染土壌または汚染水の浄化に用いることができる。

【受託番号】

【0044】

ＮＩＴＥ Ｐ−１５９６

【0045】

ＮＩＴＥ Ｐ−１５９８

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]