特許 6246039 ベロ毒素不活性化剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6246039

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】ベロ毒素不活性化剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/353 20060101AFI20171204BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20171204BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20171204BHJP

   A23L 29/00 20160101ALI20171204BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/353

   A61P39/02

   A61P1/00

   A23L29/00

【請求項の数】4

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2014-58456(P2014-58456)

(22)【出願日】2014年3月20日

(65)【公開番号】特開2015-182961(P2015-182961A)

(43)【公開日】2015年10月22日

【審査請求日】2017年1月6日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504145342

【氏名又は名称】国立大学法人九州大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】島谷 佳奈果

(72)【発明者】

【氏名】中山 素一

(72)【発明者】

【氏名】小澤 忠弘

(72)【発明者】

【氏名】宮本 敬久

【審査官】 馬場 亮人

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０２−２７６５６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１３６５５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 T. Taguri et al.，Antimicrobial activity of 10 different plant polyphenols against bacteria causing food-borne disease，Biol. Pharm. Bull.，日本，２００４年，27(12)，1965-1969

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／３５３

Ａ６１Ｐ １／００

Ａ６１Ｐ ３９／０２

Ａ２３Ｌ ２９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

テアフラビンジガレートを有効成分とするベロ毒素不活性化剤。

【請求項2】

テアフラビンジガレートを有効成分とする腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は
改善剤。

【請求項3】

テアフラビンジガレートを有効成分とするベロ毒素不活性化用食品。

【請求項4】

テアフラビンジガレートを有効成分とする腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善用食品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ベロ毒素の不活性化剤に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｏ−２６、Ｏ−５５、Ｏ−９１、Ｏ−１０３、Ｏ−１０４、Ｏ−１１１、Ｏ−１２１、Ｏ−１４５、Ｏ−１５７、Ｏ−１６５等の腸管出血性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ＥＨＥＣ）は、食中毒、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群等の疾患の原因菌である。腸管出血性大腸菌は、強い病原性を有し、しばしば集団感染を引き起こし、また感染者の死亡例も少なくない。

【0003】

ベロ毒素（Ｖｅｒｏ ｔｏｘｉｎ；ＶＴ）は、腸管出血性大腸菌に産生され、上記疾患を引き起こす原因と考えられている毒素である。ベロ毒素は、志賀毒素と同一のＳｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ ｆａｍｉｌｙに分類される毒素であり、志賀毒素とアミノ酸配列が同一のＶＴ１（Ｓｔｘ１）と、アミノ酸配列が５５％同一のＶＴ２（Ｓｔｘ２）とが知られている。ＶＴ１とＶＴ２は、生物学的性質は類似するものの、その物理化学的及び免疫学的性質は異なることが知られている。

【0004】

腸管出血性大腸菌による感染症を防止する手段としては、菌の生育抑制、菌によるベロ毒素の産生又は分泌抑制、及び産生されたベロ毒素の無毒化、が挙げられる。
ワクチンや抗菌剤は、菌の感染及び生育を防止するために最も一般的使用されている手段である。臨床的には、ホスホマイシン等の抗生物質が経験的に使用されている。しかし、これらは腸管出血性大腸菌全般に対しては常に有効とはいえない。なぜなら、ワクチンは、Ｏ−１５７には効いても他のタイプの腸管出血性大腸菌には効かないなど、効果が菌のタイプにより制限されるという問題があり、また抗菌剤を使用する場合、菌が死滅する際に菌体内に蓄えられたベロ毒素が腸管内に一度に放出されることにより、症状が重篤化するおそれがあるからである。

【0005】

腸管出血性大腸菌によるベロ毒素の産生又は分泌を抑制する物質が知られている。例えば、ザクロ果皮抽出物により腸管出血性大腸菌によるベロ毒素の産生が抑制されたこと（非特許文献１）、エピカテキンガレート（ＥＧＣｇ）により菌体外へのベロ毒素の分泌が抑制されたこと（非特許文献２）、また、ホップ苞葉タンニンから得られた特定の構造を有するポリカテキンに、Ｓｔｘ１の細胞質ゾルへの移行を阻害して、その病原性を抑える作用があること（特許文献１）が報告されている。また、ベロ毒素を不活性化する物質も知られており、例えばリンゴジュース及びカテキン製剤に、Ｓｔｘ２に対する抗毒素作用を有することが報告され（非特許文献３、非特許文献４）、さらに、ＥＧＣｇがＳｔｘ１を不活化する作用があること（特許文献２）が報告されている。

【0006】

一方、カテキン類から生成するポリフェノールであるテアフラビン類には、シュクラーゼ活性阻害剤作用（特許文献３）、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用（特許文献４）、リパーゼ阻害作用（特許文献５、６）等の薬理作用があることが報告されている。

【0007】

しかしながら、テアフラビンジガレートにベロ毒素を不活性化する作用があることは全く知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表２００６−５０８９２４号公報

【特許文献2】特開２０１３−１３６５５３号公報

【特許文献3】特開平５−１７３５２号公報

【特許文献4】特開平６−９３９１号公報

【特許文献5】特開２０１０−９５４７７号公報

【特許文献6】国際公開第２００６／００４１１４号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Supayang et al J. Health Science, 51(5):590-596, 2005

【非特許文献2】Konishi et al, Biochim Biophys Acta, 1472:42-50, 1999

【非特許文献3】大久保ら、感染症学雑誌、第72巻第3号:211-217、平成10年3月20日

【非特許文献4】Reuven et al, J. Food Science, 75(5):296-301, 2010

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、腸管出血性大腸菌の産生するベロ毒素を不活性化し、当該菌の感染による症状を予防、治療又は改善するために有用なベロ毒素不活性化剤を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、ベロ毒素を無毒化する物質を探索した結果、テアフラビンジガレートが、ＶＴ１及びＶＴ２に対してその細胞毒性活性を低減する作用があることを見出した。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２）に係るものである。
（１）テアフラビンジガレートを有効成分とするベロ毒素不活性化剤。
（２）テアフラビンジガレートを有効成分とする腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善剤。

【発明の効果】

【0013】

本発明のベロ毒素不活性化剤等によれば、腸管出血性大腸菌が腸管内に分泌したベロ毒素の活性を低減でき、食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、中枢神経障害、急性脳症等のベロ毒素による中毒症状の予防、治療又は改善を図ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＶＴ１不活性化作用を示すグラフ。エラーバー＝標準偏差。ＴＦＤＧ：テアフラビンジガレート、ＥＧＣＧ：エピガロカテキンガレート。

【図2】ＶＴ２不活性化作用を示すグラフ。エラーバー＝標準偏差。ＴＦＤＧ：テアフラビンジガレート、ＥＧＣＧ：エピガロカテキンガレート。

【発明を実施するための形態】

【0015】

ベロ毒素（Ｖｅｒｏ ｔｏｘｉｎ：ＶＴ）には、Ｖ１とＶＴ２が存在する。ＶＴ１及びＶＴ２は、それぞれ、Ｓｔｘ１及びＳｔｘ２、又はＳＬＴ（Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ）−１及びＳＬＴ−２とも称され、これらはいずれも、志賀毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ；Ｓｔｘ）と同じくＳｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ（Ｓｔｘ）ｆａｍｉｌｙに分類される毒素であり、他のＳｔｘ ｆａｍｉｌｙに属する毒素と同様にＡサブユニットとＢサブユニットからなる構造を有している。ＶＴ１のアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ Ｍ １６６２５として登録されており、Ｓｔｘのアミノ酸配列と同一又はほぼ同一である。一方、ＶＴ２には多くの変異型が知られており、そのＳｔｘアミノ酸配列に対する同一性は５５％程度である。ＶＴ１とＶＴ２は、いずれも細胞のＧｂ３レセプターと結合することから始まる一連の経路で細胞に致死的影響を与えるが、一方、ＶＴ１とＶＴ２との間のアミノ酸配列の同一性はＡサブユニットで５８．２％、Ｂサブユニットで６０．７％に過ぎない。従って、ＶＴ１とＶＴ２は、その生物学的性質（生体に対する毒性）は共通するものの、物理学的及び免疫学的性質においては異なる。例えば、ＶＴ１は、Ｓｔｘと抗原性が共通しており抗志賀毒素抗体で中和されるが、ＶＴ２はＶＴ１又はＳｔｘとの間に共通する抗原性を有さない（細菌毒素ハンドブック 編集員；櫻井純、本田武司、小熊恵二 発行元；株式会社サイエンスフォーラム 発行年；２００２年）。
本発明において、「ベロ毒素」とは、斯かるＶＴ１及びＶＴ２のいずれをも包含するものである。

【0016】

本発明において、「ベロ毒素不活性化」とは、ベロ毒素（ＶＴ１及びＶＴ２）が有する細胞毒性活性を低減又は消失させることである。ベロ毒素不活性化によって、細胞がベロ毒素から受ける毒性又は悪影響を低減又は消失させることができる。
ここで、ベロ毒素がその毒性を及ぼし得る「細胞」としては、アフリカミドリザル由来ベロ細胞、ならびに生体においてベロ毒素により直接又は間接的に影響を受け得る腸管細胞、例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類、又はウサギに由来する腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等が挙げられる。

【0017】

本発明において、「テアフラビンジガレート」（ＴＦＤＧ）とは、茶（Camellia sinensis）の葉の発酵過程でカテキン類から生成する赤色色素成分の一種である、下記の「テアフラビン ３，３'−ジ−ｏ−ガレート（Theafravin 3,3'-di-O-gallate）」を意味する。

【0018】

【化1】

【0019】

本発明のテアフラビンジガレートは、それを含む植物、例えば茶葉から公知の方法により抽出・分画すること、或いは酵素反応を用いた合成（例えば、特開２０１０−３５５４８号公報）等により得ることが可能である。また、市販品（長良サイエンス株式会社等）を使用することも可能である。

【0020】

後記実施例に示すように、ベロ細胞をベロ毒素ＶＴ１又はＶＴ２の存在下で培養した場合、ＶＴ１又はＶＴ２の毒性の影響を受けて細胞はほとんど生存できないが、テアフラビンジガレートを共存させてＶＴ１又はＶＴ２を添加した場合、生存率が向上する。すなわち、テアフラビンジガレートは、細胞に対するベロ毒性活性を低減する作用を有する。特にＶＴ１に対する不活性化作用は強力であり、ＥＧＣｇの約５倍である。
従って、対象にテアフラビンジガレートを投与若しくは摂取するか接触させることにより、腸管出血性大腸菌により産生・分泌されたベロ毒素を不活性化すること、或いは腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善することができる。

【0021】

すなわち、テアフラビンジガレートは、ベロ毒素不活性化剤、腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善剤（以下、「ベロ毒素不活性化剤等」と云う）となり得、ベロ毒素不活性化のため、或いは腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善のために使用することができる。ここで、使用は、ヒト若しくは非ヒト動物（非ヒト霊長類、マウス、ラット等のげっ歯類や、ウサギ等の動物）、又はそれらに由来する検体（腸管上皮細胞、大腸粘膜上皮細胞、腎細胞、中枢神経細胞等の細胞、それらの細胞を含む組織、器官等）における使用であり得、ヒトに対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
また、テアフラビンジガレートは、ベロ毒素不活性化剤等を製造するために使用することができる。
本発明のベロ毒素不活性化剤等は、既に分泌されてしまったベロ毒素を不活性化できるため、抗生物質による菌体破壊によって起こるベロ毒素の大量放出に起因する症状の重篤化にも適用でき、従来の治療剤と比較して有利である。

【0022】

本発明において、「腸管出血性大腸菌による中毒症状」としては、例えば食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎障害、中枢神経障害、急性脳症等の症状が挙げられるが、これらに限定されない。
尚、本発明において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、「改善」とは、疾患又は症状の好転、疾患又は症状の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。

【0023】

本発明のベロ毒素不活性化剤等は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合にベロ毒素不活性化、腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品であり得、或いは当該医薬品、医薬部外品、食品又は飼料に配合して使用される素材又は原料であり得る。
また、テアフラビンジガレートを素材又は原料として配合した食品には、ベロ毒素不活性化、腸管出血性大腸菌による中毒症状の改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品が包含される。これらの食品は機能の表示を許可された食品であって、一般の食品と区別されるものである。

【0024】

上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、各種外用剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の何れでもよい。投与形態は、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射、経鼻、経腸）の何れであってもよいが、経口投与が好ましい。
また、このような種々の剤型の製剤は、本発明のテアフラビンジガレートを単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、他の薬効成分（例えば、抗生物質や抗菌剤等）等を適宜組み合わせて調製することができる。例えば、経口用液体製剤は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により調製することができる。

【0025】

上記食品の形態としては、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料、パン類、麺類、パスタ、ゼリー状食品、各種スナック類、ケーキ類、菓子類、アイスクリーム類、スープ類、乳製品、冷凍食品、インスタント食品、その他加工食品、調味料、サプリメント等の飲食品や栄養食品等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。また、病者用食品、例えば適当量の栄養補給が困難な高齢者やベッドレスト状態の病者に対する食品は、経腸栄養剤等の栄養組成物の形態とすることが可能である。

【0026】

飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。

【0027】

種々の形態の食品又は飼料は、テアフラビンジガレートを単独で、又は他の食品若しくは飼料材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、テアフラビンジガレート以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。

【0028】

上記医薬品、食品又は飼料中のテアフラビンジガレートの含有量は、ベロ毒素不活性化の点から、一般的に好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、そして好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下、さらに好ましくは０．１質量％以下、特に好ましくは０．０１質量％以下である。また、０．０００１〜５質量％、より好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．００１〜０．１質量％、より好ましくは０．００１〜０．０１質量％である。

【0029】

本発明のベロ毒素不活性化剤等をヒトに投与又は摂取する場合の対象は、それを必要としている又は希望しているヒトであれば特に限定されないが、例えば、腸管出血性大腸菌の感染により、食中毒、下痢、出血性腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎障害、中枢神経障害、急性脳症等の症状を起こした患者やその疑いのあるヒトなどが挙げられる。
本発明のベロ毒素不活性化剤等をヒトに投与又は摂取する場合の投与又は摂取量は、剤形や用途によって異なるが、成人に対して１日あたり、テアフラビンジガレートとして、０．１μｇ以上／５０ｋｇ体重、好ましくは１μｇ以上／５０ｋｇ体重、より好ましくは１０μｇ以上／５０ｋｇ体重であり、より好ましくは１００μｇ以上／５０ｋｇ体重、より好ましくは１ｍｇ以上／５０ｋｇ体重、より好ましくは１０ｍｇ以上／５０ｋｇ体重、より好ましくは１００ｍｇ以上／５０ｋｇ体重、さらに好ましくは１，０００ｍｇ以上／５０ｋｇ体重であり、且つ好ましくは３０，０００ｍｇ以下／５０ｋｇ体重、より好ましくは２０，０００ｍｇ以下／５０ｋｇ体重、より好ましくは１０，０００ｍｇ以下／５０ｋｇ体重、より好ましくは５，０００ｍｇ／５０ｋｇ、さらに好ましくは１，０００ｍｇ／５０ｋｇである。また、０．１μｇ〜３０，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、好ましくは１μｇ〜２０，００ｍｇ／５０ｋｇ体重、好ましくは１０μｇ〜１０，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、より好ましくは１００μｇ〜５，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、より好ましくは１ｍｇ〜５，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、より好ましくは１０ｍｇ〜５，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、より好ましくは１００ｍｇ〜５，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重、さらに好ましくは１，０００ｍｇ〜５，０００ｍｇ／５０ｋｇ体重が挙げられる。

【0030】

上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞テアフラビンジガレートを有効成分とするベロ毒素不活性化剤。
＜２＞テアフラビンジガレートを有効成分とする腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善剤。
＜３＞ベロ毒素不活性化剤を製造するための、テアフラビンジガレートの使用。
＜４＞腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善剤を製造するための、テアフラビンジガレートの使用。
＜５＞ベロ毒素の不活性化に使用するためのテアフラビンジガレート。
＜６＞腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善に使用するためのテアフラビンジガレート。
＜７＞テアフラビンジガレートを、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するベロ毒素不活性化方法。
＜８＞テアフラビンジガレートを、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する腸管出血性大腸菌による中毒症状の予防又は改善方法。
＜９＞前記＜５＞〜＜６＞及び＜７＞〜＜８＞において、使用及び方法は非治療的である。
＜１０＞上記＜２＞、＜４＞、＜６＞及び＜８＞における中毒症状は、好ましくは食中毒である。

【実施例】

【0031】

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１ ベロ毒素不活化作用
（１）試験物質
ＴＦＤＧ：テアフラビン ３，３'−ジ−ｏ−ガレート（長良サイエンス株式会社）
ＥＧＣＧ：エピガロカテキンガレート（三井農林株式会社）

【0032】

（２）毒素溶液の調製と力価の測定
ベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）としては、ＶＴ１産生株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ−１５７：Ｈ−７ Ｎｏ．３３株（ＶＴ１＋）を、ＶＴ２産生株としてＥ．ｃｏｌｉ Ｏ−１５７ Ｎｏ．１４８株（ＶＴ２＋）をそれぞれ使用した。
上記Ｎｏ．３３株及びＮｏ．１４８株をＬＢ培地（Ｂｅｃｔｏｎ＆Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）５ｍｌ中、３７℃で一晩振とう培養した。培養液を１０００倍希釈して１０μｌを新しいＬＢ培地５ｍｌ（４０本）に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養した。各菌株の培養液５ｍｌを１５ｍｌ遠沈管に入れ、ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ Ｂを５０００Ｕ／１ｍｌとなるように培養液に加え、３７℃で１時間インキュベートし、培養液を集めた。集めた培養液を２５ｍｌずつ５０ｍｌ遠沈管に入れて、遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）して、上清をいったんビーカーに集めた後、ろ過（０．２μｍ）滅菌して毒素溶液とした。
毒素溶液中のベロ毒素の力価は、ＶＴＥＣ−ＲＰＬＡ「生研」（デンカ生研）を用い、附属のプロトコールに従ってＶＴ１及びＶＴ２の産生性を調べて算出した。測定の結果、Ｎｏ．３３株から得られた毒素溶液（ＶＴ１）は力価２５６で、Ｎｏ．１４８株から得られた毒素溶液（ＶＴ２）は力価３２７６８であった。以下のベロ毒素不活化試験では、ＶＴ１およびＶＴ２をＰＢＳで段階的に２倍希釈し、最終希釈倍率１〜１２８倍に調製した毒素溶液を用いた。

【0033】

（３）ベロ毒素不活化試験
Ｖｅｒｏ細胞を２．０×１０⁴ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように懸濁した５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ−Ｅ培地１００ μＬを９６穴細胞培養プレート［Ｃｏｒｎｉｎｇ］の各ウェルに播種し、３７℃のＣＯ₂インキュベーター （５％ＣＯ₂）中で２４時間培養した。毒素試料とＴＦＤＧ又はＥＧＣＧを混合し、３７℃のＣＯ₂インキュベーター（５％ＣＯ₂）中で１時間インキュベートしたものを培養後のＶｅｒｏ細胞に１００μＬ、２ウェルずつ添加し、３７℃のＣＯ₂インキュベーター（５％ＣＯ₂）中で２４時間培養した。培養後、培地を取り除き、新しい５％ＦＢＳ添加ＭＥＭ−Ｅ培地を１００μＬずつ加え、ＭＴＴ ｓｏｌｕｔｉｏｎを１０μＬずつ添加して、さらに３７℃のＣＯ₂インキュベーター（５％ＣＯ₂）中で４時間インキュベートした。その後、培地を取り除き、ＤＭＳＯを１００μＬずつ添加して色素を溶解した後、５９５ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の測定にはＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ６８０を用いた。毒性試験のネガティブコントロールとしてＶＴ非含有試料のみを添加したウェルを用意し、ポジティブコントロールとしてＶＴ含有試料のみを添加したウェルを用意した。

【0034】

（４）結果
結果を図１〜図２に示す。ＴＦＤＧと混合されたＶＴ１毒素溶液、及びＴＦＤＧと混合されたＶＴ２毒素溶液を添加された細胞は、ＴＦＤＧ未処理のＶＴ１又はＶＴ２毒素溶液を添加された細胞と比較して生存率が向上した（図１及び２）。また、ＴＦＤＧのＶＴ１に対する阻害活性は、ＥＧＣＧの約５倍強かった。

【図1】

【図2】