特許 6246980 韓国伝統の麹から分離した製パン用の新規な土地産の天然乳酸菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6246980

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】韓国伝統の麹から分離した製パン用の新規な土地産の天然乳酸菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20171204BHJP

   A21D 8/04 20060101ALI20171204BHJP

   A21D 13/00 20170101ALI20171204BHJP

   C12R 1/24 20060101ALN20171204BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   A21D8/04

   A21D13/00

   C12N1/20 A

   C12R1:24

【請求項の数】3

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2017-513031(P2017-513031)

(86)(22)【出願日】2015年12月30日

(65)【公表番号】特表2017-530698(P2017-530698A)

(43)【公表日】2017年10月19日

(86)【国際出願番号】KR2015014528

(87)【国際公開番号】WO2016190513

(87)【国際公開日】20161201

【審査請求日】2017年3月7日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0072203

(32)【優先日】2015年5月22日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12776BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12777BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12778BP

【微生物の受託番号】KCTC  KCTC 12779BP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516193335

【氏名又は名称】エスピーシー カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＣ ＣＯ．， ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 託嗣

(72)【発明者】

【氏名】パク，チョン キル

(72)【発明者】

【氏名】イ，チョン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】シム，サン ミン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン，ムン ヨン

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ソン ボン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ビョン チョル

(72)【発明者】

【氏名】ソ， ジン ホ

(72)【発明者】

【氏名】ハン，ナム ス

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ソン ジョン

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０６００７８５０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００７１７８７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００１９７２４（ＫＲ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５４３５７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PloS One, 2014, 9(3), e90866

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ａ２１Ｄ ８／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

香気成分としてアルデヒド及びケトンの発散に優れたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）。

【請求項2】

香気成分としてアルデヒド及びケトンの発散に優れたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を小麦粉に添加して発酵させることを特徴とする製パン生地の製造方法。

【請求項3】

香気成分としてアルデヒド及びケトンの発散に優れたラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を小麦粉に添加して発酵させた後、ベーク（ｂａｋｉｎｇ）することを特徴とするパンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、韓国伝統の麹（こうじ）から分離した製パン用の新規な土地産（韓国固有）の天然乳酸菌に関し、特に、韓国伝統の麹から分離した新規な土地産の天然乳酸菌であるラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）に関する。

【背景技術】

【0002】

サワードウ（Ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ）は酸性生地とも呼ばれるものであり、独特の風味がある。サワードウを用いる発酵法は、一般に、小麦粉、水及びライ麦粉を混ぜ、その中に内在している微生物を活性化させてサワードウスターター（Ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｓｔａｒｔｅｒ）を作り、このサワードウスターターの一部を生地作りに使用し、残りは次の生地作りに使用するために保管しておくという過程を繰り返す。このようなサワードウを用いた発酵法は、発酵過程で酵母と乳酸菌とが相互関与し、パンのボリュームの増加、風味の向上、賞味期限の延長といった様々な利点をもたらす。

【0003】

一方、サワードウの発酵は、微生物により大きな影響を受け、特に、主な発酵微生物である乳酸菌及び酵母のいずれか一方或いは両方が発酵に作用して、サワードウが作られるものとして知られている。酸味の主な原因は乳酸菌から生成された乳酸であるが、これはサワードウの基本となり、また、酵母によるアルコール発酵代謝産物もパンに風味を与え、嗜好性を向上させる。サワードウ発酵に関連する乳酸菌としては、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）属、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属などが知られている。

【0004】

一方、自然発酵法による伝統的なサワードウパン（ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ｂｒｅａｄ）は、種々の酵母と細菌を混合して作っている。このため、不適切な作業環境ではしばしば他の微生物による汚染によって、風味の低下、酸敗酸臭の発生などの問題点が発生する。その上、空間及び時間の差によって、均等な品質の製品を再現することも困難である。

【0005】

このような問題点に鑑み、自然発酵パンの汚染機会を回避するとともに均等な品質の製品を確保するために、機能性及び安定性を確保した微生物スターター（ｓｔａｒｔｅｒ）をドウに添加する発酵法が開発されている。

【0006】

韓国の一部の製パンメーカーでは製品の差別化及び高級化を追求して、輸入したスターターを使用している。しかしながら、輸入した種菌は、継代培養中に菌株分布が変化しやすいため、製パン現場で取り扱い難いだけでなく、有機酸を多量生成するラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）菌株が優占種として含まれており、酸味の強度を調節し難いなど、現実的ないろいろな問題を抱えている。また、輸入したスターターは、生産国の気候及び製パン特性に応じて選抜されたため、韓国の製パンの現実には適さない品質特性を有することもある。したがって、韓国人の嗜好に合うとともに、製パンの現場で安定して使用できるスターターの開発が望まれる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、韓国伝統の麹から分離した新規な天然乳酸菌を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の目的を達成するために、本発明は、第１態様として、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を提供することを特徴とする。上記ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）は、麹から分離した新規な天然乳酸菌であり、耐酸性及びマルトース利用能に優れているため、ｐＨの低い小麦粉生地でも成長及び代謝に優れている。

【0009】

一方、本発明は、第２態様として、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を小麦粉に添加して発酵させて製造されたことを特徴とする製パン生地を提供する。麹から分離した新規な天然乳酸菌であるラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を添加した小麦粉生地は、乳酸菌の成長及び代謝が活発なため、発酵時間が短くてガス発生力に優れ、製パン用に適する。

【0010】

一方、サワードウ（ｓｏｕｒ ｄｏｕｇｈ）を製造するとき、乳酸菌が過度に増殖すると、乳酸菌が過剰な量の乳酸を生産し、酸味が強くなるだけでなく、乳酸菌が、酵母菌の増殖に必要な栄養源を先に使用してしまい、酵母の生育が抑制される。一方、初期の酵母数が多すぎると、乳酸菌の添加による効果は低くなる。したがって、嗜好度の高いサワードウを製造するためには、発酵中に、適当なレベルの、酵母及び乳酸菌の生菌数を確保することが非常に重要である。そのためには、競争関係にある酵母と乳酸菌よりは、共生的に生長する酵母と乳酸菌の菌株を種菌として使用する必要がある。

【0011】

本発明の、麹から分離した新規な天然乳酸菌であるラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）は、酸に対する耐性が強く、マルトース利用能に優れている。このような特性を有する上記の天然乳酸菌を生地に適用すると、酵母と乳酸菌が共生的に生長するため、比容積が大きく、食感がよく、優れた風味を有するパンを製造することができる。すなわち、韓国伝統の麹から分離した酵母及び菌株を使用することによって、既存の輸入種菌を使用した場合に比べて韓国人の口に合うパンを製造することができる。

【0012】

一方、本発明は、第３の態様として、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を小麦粉に添加して発酵させてベーク（ｂａｋｅ）してなることを特徴とするパンを提供する。このように製造されたパンは、比容積が大きく、硬度が低く、老化速度が遅くて日持ちする。また、軟らかくて、スイートな香り、バター香、果物の香り、マイルドな香りといった嗜好度の高い香気成分を発散して風味がよく、嗜好度が高い。

【0013】

上記の本発明の第３の態様において、ベークするということは、焼き上げることを意味する。

【発明の効果】

【0014】

本発明は、韓国伝統の麹から分離した新規な土地産の天然乳酸菌であるラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２（ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ）を提供する。

【0015】

上記の新規な天然乳酸菌を用いた製パン生地は、適度な酵母及び乳酸菌の生菌数が確保されるため、ガス発生力に優れる。また、上記の新規な天然乳酸菌を添加した小麦粉生地で製造されたパンは、比容積が大きく、硬度が低く、軟らかくて食感がよく、嗜好度の高い香気成分を発散するため、韓国人の口に合う。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】麹、小麦粉、天然サワー種及びライ麦から分離した微生物などの同定結果を示す図である。

【図2】天然サワー種から分離した菌株に対して、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。

【図3】天然サワー種から分離した菌株に対して、ラクトバチルス・ブレビスに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。

【図4】分離した酵母に対して、サッカロミセス・セレビシエに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。

【図5】天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス菌株の最大乳酸生成量を比較したグラフである。

【図6】天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス菌株のうちグループ１の発酵プロファイルである。

【図7】天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスの耐酸性を確認した結果である。

【図8】天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスのマルトース利用能を確認した結果である。

【図9】天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５の、酸の種類による耐酸性を確認した結果である。

【図10】対照群（市販酵母が適用されたパン）及び分離酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５が適用されたパンの写真である。

【図11】天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５が添加された本捏ね生地のガス発生力を確認したグラフである。

【図12】天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【図13】天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５が適用されたパンの香気成分を定量的な数値で比較した結果である。

【図14】対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ１０４）が適用されたパンの写真である。

【図15】天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【図16】天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【図17】天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【図18】対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ１４９）が適用されたパンの写真である。

【図19】天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【図20】天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【図21】天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９が適用されたパンの香気成分を定量的な数値で比較した結果である。

【図22】対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンの写真である。

【図23】天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【図24】天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【図25】天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【図26】市販酵母のみ適用されたパン（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４（Ｅセット）が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９（Ｆセット）が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２（Ｇセット）が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４、ラクトバチルス・ブレビス１４９及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２（Ｈセット）が適用されたパンの写真である。

【図27】市販酵母のみ適用された本捏ね生地（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用された本捏ね生地（Ｅセット適用本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用された本捏ね生地（Ｆセット適用の本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用された本捏ね生地（Ｇセット適用の本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用された本捏ね生地（Ｈセット適用の本捏ね生地）のガス発生力を確認した結果である。

【図28】市販酵母のみ適用されたパン（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン（Ｅセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン（Ｆセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｇセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｈセット適用のパン）の老化速度を確認した結果である。

【図29】市販酵母のみ適用されたパン（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン（Ｅセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン（Ｆセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｇセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｈセット適用のパン）の香気成分を定量的な数値で比較した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本発明の構成を、下記の実施例に基づいて具体的に説明する。ただし、本発明の権利範囲は、下記の実施例に限定されるものではなく、それと均等な技術的思想の変形をも含む。

【0018】

一方、本発明では、下記の実験によって分離されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５を「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−１」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７６ＢＰ」を付与された。また、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−３」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７８ＢＰ」を付与された。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ」を付与された。また、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−４」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７９ＢＰ」を付与された。

【0019】

［製造例１：麹が添加された天然サワー種（麹を添加した韓国型サワードウ）の製造］
麹から微生物を抽出するために、麹５０ｇに給水４５０ｇを加えた後、温度２２℃、湿度８３％の培養器で４時間培養し、１００メッシュ篩にかけて麹のふすま成分を除去してスターター抽出ろ液を得た。

【0020】

天然サワー種を製造するための第１工程として、室温の加熱冷却水６５０ｇにスターター抽出ろ液４００ｇ、小麦粉９５０ｇ、ライ麦粉１００ｇを均一に混ぜ、温度２５℃、湿度８５％で４８時間発酵させてスターターを培養し、スターター培養液を製造した。

【0021】

天然サワー種を製造するための第２工程（天然サワー種の製造及び継代培養）として、加熱冷却水１０５０ｇに、上記製造されたスターター培養液７００ｇ、小麦粉９５０ｇ、ライ麦粉１００ｇを均一に混ぜて捏上温度を２６℃に合わせ、温度１２℃の培養器で１５時間発酵させて天然サワー種を製造した。保管は２〜４℃の冷蔵庫で行った。継代培養のためには、加熱冷却水１０５０ｇに、上記冷蔵保管中の天然サワー種７００ｇ、小麦粉９５０ｇ、ライ麦粉１００ｇを均一に混ぜて捏上温度を２６℃に合わせ、温度１２℃の培養器で１５時間発酵させて天然サワー種を製造し、この工程を繰り返し行って継代培養した。

【0022】

［実施例１：微生物の分離及び同定］
麹、ライ麦、小麦粉、天然サワー種（製造例１）から微生物を分離した。それぞれの原料１０ｇ、０．８５％ ＮａＣｌ ９０ｍｌをろ過袋（ｆｉｌｔｅｒ ｂａｇ）に入れ、ストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）を用いて３分間均質化した。これをさらに、０．８５％ ＮａＣｌで段階的に希釈をして適度な濃度にした後、乳酸菌は、０．０１％シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）が添加されたＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ，Ｄｉｆｃｏ）、ＳＤＢ（２％ Ｍａｌｔｏｓｅ、０．３％ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１．５％ Ｆｒｅｓｈ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．０３％ Ｔｗｅｅｎ８０、０．６％ Ｃａｓｅｉｎ ｐｅｐｔｏｎｅ、ｐＨ５．６）固体培地に塗抹して分離し、酵母は、０．３５％プロピオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｍ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）が添加されたＹＭ（Ｙｅａｓｔ Ｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）固体培地に塗抹して分離した。

【0023】

上記ＭＲＳは３７℃で静置培養し、ＳＤＢ、ＹＭ及びＰＤＡ培地はいずれも３０℃で静置培養した。その後、単一コロニーを得るために各コロニーを３〜４回継代培養し、細胞形態の観察、グラム染色を行って、バクテリア（乳酸菌）は１６ｓ ｒＲＮＡ、酵母はＩＴＳ配列分析によって同定した。

【0024】

実施の結果、麹からは、乳酸菌として、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）が分離され、酵母としては、トルラスポラ・デルブルッキー（Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ピキア・アノマラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ペリクロサ（Ｃ．ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）が分離された。

【0025】

また、天然サワー種からは、乳酸菌として、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、ラクトバチルス・クラストラム（Ｌ．ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）が分離され、酵母としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・ペリクロサ（Ｃ．ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）が分離された。

【0026】

また、小麦粉からはペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）が、ライ麦からはペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）及びラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）が分離された。

【0027】

図１に、麹、小麦粉、天然サワー種及びライ麦から分離した微生物の同定結果を示す。

【0028】

［実施例２：天然サワー種からラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）の分離］
本実施例では、天然サワー種（麹を添加した韓国型サワードウ）からラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）を分離した。そのために、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス特異的ＰＣＲをデザインした。

【0029】

ラクトバチルス・サンフランシスエンシスは２０１１年に全ての遺伝体配列が明らかにされ（Ｒｕｄｉ Ｆ Ｖｏｇｅｌ，Ｍｅｌａｎｉｅ Ｐａｖｌｏｖｉｃ，Ｍａｔｔｈｉａｓ Ａ Ｅｈｒｍａｎｎ１，Ａｒｎｉｍ Ｗｉｅｚｅｒ，Ｈｅｉｋｏ Ｌｉｅｓｅｇａｎｇ，Ｓｔｅｆａｎｉｅ Ｏｆｆｓｃｈａｎｋａ，Ｓｏｎｊａ Ｖｏｇｅｔ，Ａｎｇｅｌ Ａｎｇｅｌｏｖ，Ｇｅｏｒｇ ＢｏＷｏｌｆｇａｎｇ Ｌｉｅｂｌ（２０１１） Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ａｓ ｓｔａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ．１０（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ６）、これを用いてラクトバチルス・サンフランシスエンシスＴＭＷ１．１３０４のゲノム地図及び遺伝子データベースの中で他の菌株と重ならない遺伝子を探索し、それらの中からＬＳＡ＿０２５１０ハイポセティカルタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を選別した。

【0030】

他の菌株の遺伝子では増幅がなされないようにＰＣＲプライマーをデザインし、プライマーｓａｎｈｙｐ１：５’ＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＣＴＣＡＴＧＡＧＴＧＴＴＡＡＧ３’（２４ｍｅｒ）及びｓａｎｈｙｐ２：５’ＣＡＡＡＧＴＣＡ−ＡＧＡＡＧＴＴＡＴＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣ（２７ｍｅｒ）を用いて、「９４℃５分プレ変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、９４℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃１分で３０サイクル、７２℃７分ファイナルエクステンション（ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）」の条件でＰＣＲを行った。

【0031】

天然サワー種から分離した６８個の単一コロニーからゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を分離し、これらをそれぞれ鋳型にして、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス特異的ＰＣＲを行った後、電気泳動した。

【0032】

実施の結果、６８個のうち３９個のサンプルで９５７ｂｐのバンドが形成されたことが知られ、残りのサンプルではバンドが観察されなかった。バンドが形成された３９個のサンプルの全てについて１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析を行い、その結果、ラクトバチルス・サンフランシスエンシスであると同定された。

【0033】

図２は、天然サワー種から分離した菌株をラクトバチルス・サンフランシスエンシスに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。

【0034】

［実施例３：天然サワー種からラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）を分離−Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ］
本実施例では天然サワー種（麹を添加した韓国型サワードウ）からラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）を分離するためにラクトバチルス・カルバタス特異的ＰＣＲをデザインした。

【0035】

ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔサーチを行って他の乳酸菌との相同性が殆どない遺伝子を探索し、「ＣＲＬ ７０５ ｃｏｎｔｉｇ ００１０７」を選別した。他の菌株の遺伝子では増幅されないようにしてＰＣＲプライマーをデザインし、プライマーＦ’−ＣＵＲ５’−ＧＡＣＣＣＡＴＧＣＣＴＴＴ ＡＡＴＡＣＧＣＡＴＡＧ−３’とＲ’−ＣＵＲ５’−ＣＴＧＡＡＡＴＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＧＣＣＡＣＣＣＣ−３’を用いて、「９４℃５分プレ変性，９４℃３０秒、６１．５℃３０秒、７２℃１分で４０サイクル、７２℃７分ファイナルエクステンション」の条件でＰＣＲを行った。

【0036】

一方、天然サワー種から分離した６８個の単一コロニーからゲノムＤＮＡを分離し、それらをそれぞれ鋳型にしてラクトバチルス・カルバタス特異的ＰＣＲを行った後、電気泳動した。

【0037】

実施の結果、３５個のサンプルで１２９ｂｐのバンドが形成されたことが分かり、残りのサンプルではバンドが観察されなかった。バンドが形成された３５個のサンプルの全てに１６ｓ ｒＲＮＡ配列分析を行い、その結果、ラクトバチルス・カルバタスと同定された。

【0038】

［実施例４：天然サワー種からラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を分離−Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ］
本実施例では、天然サワー種（麹を添加した韓国型サワードウ）からラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を分離するためにラクトバチルス・ブレビス特異的ＰＣＲをデザインした。

【0039】

（１）選択培地の製造及び培養条件
天然サワー種（麹を添加した韓国型サワードウ）からラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を分離するためにｍＭＲＳ−ＢＰＢ選択培地を使用した。ｍＭＲＳ−ＢＰＢは、既存のＭＲＳ培地にシステインヒドロクロリド（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ）０．２ｇ／４００ｍｌ、ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ−ｂｌｕｅ）８ｍｇ／４００ｍｌを添加した後、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ（ａｕｔｏｃｌａｖｅ）し、シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）２０ｍｇ／ｍｌ Ｄ．Ｗをろ過して２ｍｌ／４００ｍｌ基準で添加した。ブロモフェノールブルー（Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ−ｂｌｕｅ）は、乳酸菌が生成する酸によってコロニーの色が変わる特性を用いて菌株を選択的に選抜するために添加し、シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）は、真菌類の抑制のために使用した。培養条件は３７℃で２４時間嫌気培養とした。

【0040】

（２）乳酸菌の分離
天然サワー種５ｇと０．８５％ ＮａＣｌ ４５ｍｌを混ぜてストマッカーで均質化した後、０．８５％ ＮａＣｌを用いて１×１０^−６まで希釈し、ｍＭＲＳ−ＢＰＢ培地に１００μｌを塗抹した。これを３７℃で２４時間嫌気培養し、薄い空色の無模様のコロニーをラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）候補菌株と見なして純粋培養した。

【0041】

（３）ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）の分離−Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ特異的ＰＣＲ
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）に特異的なプライマーとしては、ベク・ヒョヌックの論文（Ｈｙｕｎ−ｗｏｏｋ Ｂａｅｋ，２０１４，Ｔｈｅｓｉｓ，ＳＮＵ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｋｏｒｅａｎ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｂｙ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ））を参照してデザインしたＢＲＥ−Ｆ（５’−ＣＡＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＧＣＧＡＧＴＣＡＧＣＡＧ−３’）及びＢＲＥ−Ｒ（５’−ＣＧＴＣＡＧＧＴＴＣＣＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＣ−３’）を使用し、増幅サイズは１６２ｂｐであり、「９５℃１０分プレ変性、９５℃３０秒、６１．５℃３０秒、７２℃２０秒で３０サイクル、７２℃２０秒ファイナルエクステンション」の条件でコロニーＰＣＲを行った後、電気泳動した。

【0042】

実施の結果、７個のサンプルで１６２ｂｐのバンドが形成されたことが確認でき、バンドが形成されたサンプルはいずれもラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）と同定された。

【0043】

図３は、天然サワー種から分離した菌株をラクトバチルス・ブレビスに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。

【0044】

［実施例５：天然サワー種からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を分離及び同定］
本実施例では、天然サワー種からサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を分離するために、サッカロミセス・セレビシエ特異的ＰＣＲをデザインした。

【0045】

（１）酵母の分離及び培養条件
初期天然サワー種、後期天然サワー種（安定化した状態）、パネトーネ種、サンフランシスコサワー種から酵母を分離するために、上記の各原料１０ｇと９０ｍｌの０．８５％ ＮａＣｌをろ過袋（ｆｉｌｔｅｒ ｂａｇ）に入れた後、ストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）を用いて３分間均質化した。これをさらに０．８５％ ＮａＣｌで段階的希釈によって適度な濃度に希釈した後、酵母を特異的に分離するために、０．３５％プロピオン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）が添加されたＹＰＭ（１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、２％ Ｐｅｐｔｏｎｅ、２％ Ｍａｌｔｏｓｅ）固体培地に塗抹した。これを３０℃で静置培養した。その後、単一コロニーを得るためにそれぞれのコロニーを３〜４回継代培養をし、分離された単一コロニーから、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に特異的なプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の候補菌株を選別した。

【0046】

（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の選別−Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ特異的ＰＣＲ
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に特異的なプライマーとしては、ジャン・ホウォンらの論文（Ｈｏ−Ｗｏｎ Ｃｈａｎｇ，Ｙｏｕｎｇ−Ｄｏ Ｎａｍ，Ｙｏｕｌｂｏｏｎｇ Ｓｕｎｇ，Ｋｙｏｕｎｇ−Ｈｏ Ｋｉｍ，Ｓｅｏｎｇ Ｗｏｏｎ Ｒｏｈ，Ｊｕｎｇ−Ｈｏｏｎ Ｙｏｏｎ，Ｋｗａｎｇ−Ｇｕｋ Ａｎ，Ｊｉｎ−Ｗｏｏ Ｂａｅ，２００７，Ｑｕａｎｔｉａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｃｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．７１，Ｉｓｓｕｅ ３）を参照してデザインしたＳＣＤＦ（５’−ＡＧＧ ＡＧＴ ＧＣＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＴＧ−３’）及びＳＣＤＲ（５’−ＴＡＣ ＴＴＡ ＣＣＧ ＡＧＧ ＣＡＡ ＧＣＴ ＡＣＡ−３’）を使用した。このプライマーは、サッカロミセス・セレビシエのＤ１／Ｄ２領域（ｒｅｇｉｏｎ）を３１０ｂｐの大きさで定量し、他の酵母の遺伝子は増幅させない特異的なプライマーとして報告されている。

【0047】

上記（１）で分離したサッカロミセス・セレビシエ候補菌株をＳＣＤＦ、ＳＣＤＲプライマーを用いて「９４℃５分プレ変性、９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分で３０サイクル、７２℃７分ファイナルエクステンション」の条件でコロニーＰＣＲを行った後、電気泳動した。

【0048】

実験の結果、図４に示すように、初期天然サワー種、後期天然サワー種（安定化した状態）、パネトーネ種、サンフランシスコサワー種から分離された微生物４５個のうち３６個のサンプルにおいて３１０ｂｐでバンドが形成されたことが確認できる。図４は、分離した酵母をサッカロミセス・セレビシエに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った後、電気泳動した結果である。このとき、パネトーネ種及びサンフランシスコサワー種サンプルではバンドが増幅されないサンプルもあることが確認できた。

【0049】

［実施例６：天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）の中からスターターとして優れた菌株を選別−酸生成の程度及びマルトース利用性を確認］
本実施例では、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）の中からスターターとして優れた菌株を選別するために、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス菌株の酸生成能及びマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）利用能を比較した。

【0050】

−８０℃で保管した菌株を１０ｍｌ ｍＭＲＳ（１Ｌ基準、ポリペプトン１０ｇ、肉エキス １０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０ １ｍｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ２ｇ、酢酸ナトリウム５ｇ、クエン酸アンモニウム２ｇ，ＭｇＳＯ_４ ０．２ｇ、ＭｎＳＯ_４ ０．０５ｇ、マルトース又はグルコース２０ｇ、ｐＨ ５．４、糖は別にオートクレーブする。）ブロス（ｂｒｏｔｈ）に３０℃の温度で２４時間前培養した。培養された細胞は遠心分離（４℃、１０，０００ｒｐｍ）して回収した後、これを１００ｍｌ ｍＭＲＳブロス（ｂｒｏｔｈ）に初期Ｏ．Ｄ．（ａｔ ６００ｎｍ）０．１で接種して３０℃，９０ｒｐｍで培養し、３〜４時間の間隔で試料を採取した。

【0051】

有機酸の測定は、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ｓｅｒｉｅｓ，ＵＳＡ）を用いて行った。ＨＰＬＣ条件としては、移動相は０．００１Ｎの硫酸溶液を流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで流し、６０℃に加熱された有機酸分析用カラム（Ｒｅｚｅｘ ＲＯＡ−ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）及びＲＩ 検出器（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を利用した。

【0052】

測定の結果、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）の生成が少ない上位６個の菌株は、ｓｓ １３１、ｓｓ １３６、ｓｓ １３５、ｓｓ １４２、ｓｓ １６１（ｇｒｏｕｐ １）であり、その次の上位５個の菌株はｓｓ ２０４、ｓｓ １９４、ｓｓ １２１、ｓｓ ２０５、ｓｓ ２２３（ｇｒｏｕｐ ２）であることが確認できた（図５）。図５は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス菌株の最大乳酸生成量を比較したグラフである。

【0053】

上記グループ１の菌株の特徴を比較し、乳酸を少なく生成しながらもマルトースの代謝能力に最も優れた菌株を選定した。

【0054】

選定の結果、ｓｓ １４２菌株が、マルトースの代謝も完全になされ、乳酸の生成量が少ないことが確認できた（図６）。このような結果から、ｓｓ １４２菌株がスターターとして最も適した特徴を有することが確認できた。図６は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス菌株のうちグループ１菌株の発酵プロファイルである。

【0055】

一方、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）ｓｓ １４２菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−４」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７９ＢＰ」を付与された。

【0056】

［実施例７：天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）の中からスターターとして優秀な菌株を選別−ｐＨ別耐酸性及びマルトース利用性を確認］
本実施例では、天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）の中からスターターとして優秀な菌株を選別するために、ラクトバチルス・カルバタス菌株のｐＨ別耐酸性及びマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）利用能を確認した。

【0057】

（１）天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタスのｐＨ別耐酸性の確認
天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス３５種の菌株（１００，１０４，１０６，１０９，１１２，１１４Ｃ，１１４ＳＳ，１１６，１２０，１２２，１２７，１３０，１３２，１３４，１３８，１４０Ｎ，１４０ＳＳ，１４４，１４６，１５６Ｎ，１５６ＳＳ，１５９，１７１Ｎ，１７２，１８３Ｎ，２０６Ｎ，２０６ＳＳ，２１６Ｎ，２３８，２４１Ｎ，２４１ＳＳ，２４９Ｎ，２５０Ｎ，２５３ＳＳ，２５３Ｎ）の耐酸性を確認するために、それぞれｐＨを６．８、４．６、４．４、４．２に調節したＭＲＳブロスに上記の各菌株を１％ずつ接種し、２４時間後に６００ｎｍで吸光度を測定して生長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）を作成した。

【0058】

その結果、ｐＨ４．２で高い吸光度値を有する菌株は２４９Ｎ、２５０Ｎ、２０６ＳＳ、１０４であり、それぞれ、１．５４０、１．５０１、１．４４６、１．４０３の値を示すことが確認できた。また、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）との吸光度差は、それぞれ、０．２０７、０．１６８、０．１１３、０．０７０だった。

【0059】

（２）天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタスのマルトース利用能の確認
天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス３５種（１００，１０４，１０６，１０９，１１２，１１４Ｃ，１１４ＳＳ，１１６，１２０，１２２，１２７，１３０，１３２，１３４，１３８，１４０Ｎ，１４０ＳＳ，１４４，１４６，１５６Ｎ，１５６ＳＳ，１５９，１７１Ｎ，１７２，１８３Ｎ，２０６Ｎ，２０６ＳＳ，２１６Ｎ，２３８，２４１Ｎ，２４１ＳＳ，２４９Ｎ，２５０Ｎ，２５３ＳＳ，２５３Ｎ）のマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）利用性を確認するために、ＭＲＳブロス培地組成からデキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）を除いて２％マルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）を添加した培地を作った後、これに上記の各菌株を１％ずつ接種し、２４時間培養後に６００ｎｍで吸光度を測定して生長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）を作成した。

【0060】

その結果、天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタスはいずれも、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）に比べてマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）をより良好に利用することが確認できた。特に、１０４、１１４Ｃ、１５６ＳＳ、１８３Ｎが他の菌株に比べて優れたマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）利用能を示したが、吸光度値はそれぞれ、１．４９８、１．５０１、１．５２３、１．５２８であった。これらの値は公知菌株に比べて０．２５３、０．２５６、０．２７８、０．２８３高い値である。

【0061】

上記の実験で耐酸性及びマルトース利用能が共に高く現れたラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−３」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７８ＢＰ」を付与された。

【0062】

［実施例８：天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）の中からスターターとして優秀な菌株を選別−ｐＨ別耐酸性及びマルトース利用性を確認］
本実施例では、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）の中から、スターターとして優れた菌株を選別するために、ラクトバチルス・ブレビスのｐＨ別耐酸性及びマルトース利用能を確認した。

【0063】

（１）天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスのｐＨ別耐酸性の確認
天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス菌株に対して１次的にマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ）培養によってｐＨ４及びｐＨ３．５における細胞成長速度を測定して比較した。これらのうち最も高い生育度を示す菌株として１１１、１４９、Ｔ３０の菌株を選抜した。

【0064】

その後、ｐＨ４及びｐＨ３．５に調節したＭＲＳブロスに上記の各菌株を１％ずつ接種し、２４時間培養後に、６００ｎｍで吸光度を測定して生長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）を作成した。

【0065】

その結果、１１１、１４９、Ｔ３０の菌株は、いずれも、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＣＣＭ１１４３３）と類似の生育速度を示し、特に、１１１、１４９菌株は、公知菌株よりも高い生育速度を示すことを確認できた。特に、生育速度の最も高い１４９菌株がスターターとして最も適することが確認できた（図７）。図７は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスの耐酸性を確認した結果である。

【0066】

（２）天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスのマルトース利用能の確認
下記の表１のような組成を有する２％マルトース含有ＭＲＳブロス培地（ｍｅｄｉｕｍ）を作った後、１１１、１４９、Ｔ３０の菌株をそれぞれ１％ずつ接種し、２４時間培養した後に、６００ｎｍで吸光度を測定して生長曲線（ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ）を作成した。

【0067】

【表1】

【0068】

実施の結果、１４９菌株とＴ３０菌株が公知菌株に比べてマルトース（ｍａｌｔｏｓｅ）培地における生育速度が速く、特に、１４９菌株が最も高い生育速度を示すことが確認できた。この結果から、１４９菌株がスターターとして最も適することが確認できた（図８）。図８は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビスのマルトース利用能を確認した結果である。

【0069】

一方、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９菌株を「Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−２」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７７ＢＰ」を付与された。

【0070】

［実施例９：天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中からスターターとして優れた菌株を選別−ｐＨ別耐酸性を確認］
本実施例では、天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の中からスターターとして優れた菌株を選別した。

【0071】

まず、初期天然サワー種（ｅａｒｌｙ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ、初期サワー種）から分離されたサッカロミセス・セレビシエ０１４３４、後期天然サワー種（ｍａｔｕｒｅ ｓｏｕｒｄｏｕｇｈ、後期サワー種）から分離されたサッカロミセス・セレビシエ０１４３５に対して実験を行った。実験は、９６マイクロウェルプレート（ｍｉｃｒｏ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で行い、ウェル（ｗｅｌｌ）当たり全容積（ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ）を２５０μｌとしてＹＰ培地に２０ｇ／Ｌマルトースを入れ、初期ＯＤ_６００ ０．２で接種した。耐性テストに用いられた酸の種類は、サワードウで最も多く生成される乳酸と酢酸を用いてｐＨ５．５、５．０、４．５、４．０、３．５で行った。

【0072】

実施の結果、サッカロミセス・セレビシエ０１４３４は、酢酸ｐＨ ３．５ではほとんど成長できず、ｐＨ ４．０では遅く生長し、ｐＨ ４．５からｐＨ ５．５では、ほぼ同一の速度で生長した。これとは異なり、乳酸では、酸度に関係なく、殆どについて、よく成長することが確認でき、特に、ｐＨ５．５でよく生長した。このような結果から、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３４は、乳酸よりは酢酸に対する耐性が低く、酢酸ｐＨ４．５以下では生長が阻害されることが確認できた。

【0073】

また、初期天然サワー種から分離した酵母と後期天然サワー種から分離した酵母の酸耐性は略同様のレベルであることが分かり、後期天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ０１４３５の方が僅かではあるが耐性に優れていることが確認できた（図９）。図９は、天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ０１４３５の耐酸性を確認した結果である。

【0074】

一方、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５を「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＰＣ−ＳＮＵ ７０−１」と命名して寄託し、寄託番号「ＫＣＴＣ １２７７６ＢＰ」を付与された。

【0075】

［実施例１０：天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を製パンに適用］
本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株の中から、製パン用スターターとして最も優れた菌株として選抜されたサッカロミセス・セレビシエ０１４３５（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５）と、市販酵母（ＲｅｕｓｙａＰｒｏ（フランス）、水分２８％）を、それぞれ製パンに適用し、その特性を比較した。

【0076】

（１）パンの製造
下記の表２に記載した中種の組成成分をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、２段で２分、３段で１分間捏ねた後、生地の最終温度が２５℃になるようにさらに混合した。その後、室温で３０分間放置した後、６℃の発酵器に入れ、１６時間１次発酵させて中種を製造した。

【0077】

その後、下記の表２に記載する本捏ねの組成成分（強力粉、精製塩、精白糖、全脂粉乳、酵母、精製水）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、１段で１分間捏ねた後、上記の中種を添加して２段で３分、３段で２分間混合した。その後、バターを添加し、２段で３分、３段で３分間捏ねて生地の最終温度を２７℃にして本捏ね生地を製造した。

【0078】

この本捏ね生地を、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて３０分間中間発酵させた後、この生地を一定の大きさに分割して丸めた後、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて１５分間熟成した。熟成ののち成形して食パンケースに入れた。その後、食パンケースに入れた生地を３７℃、相対湿度８５％の雰囲気で５０分間発酵させて食パン生地を製造した。この食パン生地をオーブンに入れ、上火１７０℃、下火２１０℃で３５分間焼き上げた。その後、室温で、内部温度が３２℃になるまで冷却した。

【0079】

上記の手順で製造された、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５と市販酵母が添加された食パンは、図１０の写真のとおりであった。図１０は、対照群（市販酵母が適用されたパン）及び分離酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５が適用されたパンの写真である。

【0080】

【表2】

（単位：ｇ）

【0081】

（２）パンの物性の測定
サッカロミセス・セレビシエ０１４３５と市販酵母がそれぞれ適用されたパンの物性を測定した。

【0082】

ｐＨ測定は、２５０ｍｌビーカーに蒸留水１００ｍｌ、試料１５ｇを入れて均質化した後、ｐＨメーター（ｐＨ ｍｅｔｅｒ）で測定した。

【0083】

総滴定酸度（ｔｏｔａｌ ｔｉｔｒａｂｌｅ ａｃｉｄｉｔｙ；ＴＴＡ）は、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液で滴定してｐＨ ６．６及びｐＨ ８．５に達するまでのＮａＯＨ溶液消費量（ｍｌ）と定義した。

【0084】

色度測定は、パンを約２０ｍｍの厚さに切った試料を色度計（ＣＲ−４００，ＫＯＮＩＫＡ ＭＩＮＯＬＴＡ社製）を用いて測定した。色度測定は、明度はＬ値、色度はａ（赤〜緑）値、ｂ（黄〜青）値で示した。

【0085】

パンのｐＨ、総滴定酸度、色度測定の結果を、下記の表３に示す。

【0086】

【表3】

【0087】

測定の結果、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンは、市販酵母が適用されたパンに比べて、ｐＨが低く、水分含量が高く、比容積が大きいことが確認できた。

【0088】

（３）生地のガス発生力の確認
サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用された本捏ね生地と市販酵母が適用された本捏ね生地のガス発生力を比較確認した。

【0089】

ガス発生力の測定は、生地２５ｇを取り、ガス発生力測定器（Ｆｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）にて３０℃で１０時間行った。

【0090】

測定の結果、両本捏ね生地のガス発生力は全般的に類似していた。ただし、初期には、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用された本捏ね生地のガス発生力が多少高いことが確認できた（図１１）。図１１は、天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエが適用された本捏ね生地のガス発生力を確認したグラフである。

【0091】

（４）パンの老化度の測定
サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンと市販酵母が適用されたパンの硬度及び時間による老化速度を比較した。

【0092】

パンを常温で約３時間置いた後、約２０ｍｍ厚に切って試料を準備した後、物性測定器（Ｔａｘｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｅｒ，Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｃｒｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて硬度を測定し、時間の経過による硬度を比較することで老化速度を測定した。硬度測定結果は下記の表４に示し、老化速度は図１２に示す。

【0093】

【表4】

【0094】

測定の結果、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンは、市販酵母が適用されたパンに比べて全般的に硬度が低くて軟らかさに優れていることが確認できた。

【0095】

しかし、時間による硬度を比較して老化速度を測定した結果、全般的な老化速度は類似していることが確認できた（図１２）。図１２は、天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【0096】

（５）パンの香気成分の分析
サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンと市販酵母が適用されたパンの風味成分を比較するために、ＧＣ／ＭＳシステムを用いて香気成分を分析した。

【0097】

試料１ｇに対して分析を行い、また、ＧＣ／ＭＳ分析条件は下記の表５のようにした。ＧＣ／ＭＳ分析後、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、酸（ａｃｉｄ）類に対する全体的な定量的数値を比較した（図１３）、下記の表６に、２２種の代表的な香気成分に対して各成分の相対的比率を百分率で示す。

【0098】

【表5】

【0099】

【表6】

【0100】

揮発性香気成分（アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、酸（ａｃｉｄ）類）の全体的な定量的数値を比較した結果、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンでケトン類が多量検出されることが確認できた。ケトン類は軟らかくてマイルドな匂いがする香気成分であり、本発明の分離酵母が適用されたパンは、風味が軟らかくてマイルドであることが確認できた。特に、バターの香りの軟らかい風味を示すケトン類のうち、アセトインの含量が高いことが確認できた。また、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンは、対照群に比べて、青臭い匂いを起こすエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の含量が少ないことが確認できた。

【0101】

一方、市販酵母が適用されたパンは、アルコール類、エステル類が多量に検出されることが確認できた。アルコール類及びエステル類は、香りが軽く、強い匂いがする香気成分であり、市販酵母が適用されたパンは、本発明の分離酵母に比べて風味スペクトラムがよくないことが分かった（図１３）。図１３は、天然サワー種から分離されたサッカロミセス・セレビシエ０１４３５が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【0102】

［実施例１１：天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）を製パンに適用］
本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４菌株と公知菌株であるラクトバチルス・カルバタス ＫＣＣＭ ４０７１５菌株をそれぞれ製パンに適用し、その特性を確認した。

【0103】

（１）乳酸菌発酵生地の製造及び分析
強力粉１００ｇ、乳酸菌数２×１０^１０ｃｆｕ／ｇ、加熱冷却水１００ｇを混合した後、３０℃の発酵器で発酵させて乳酸菌発酵生地を製造するが、生地のｐＨがｐＨ４．２±０．２に達すると、冷却してから、乳酸菌発酵生地のｐＨ、ＴＴＡ及び菌数を測定した。

【0104】

一方、本実施例で乳酸菌は、ＭＲＳブロスで３０℃の温度で２２±２時間培養した後、遠心分離して収得した菌体を生理食塩水で洗浄したものを使用し、最初の菌接種量は生地１ｇ当たり１×１０^８ｃｆｕにした。

【0105】

実施の結果を下記の表７に示す。

【0106】

【表7】

【0107】

測定の結果、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ１０４）適用の生地及び公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）適用の生地の発酵時間は３時間程度であり、上記の表７に示すように、分離菌株適用生地は公知菌株適用生地と類似の菌数を有することが確認できた。

【0108】

（２）パンの製造
下記の表８のように中種組成成分をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、２段で２分、３段で１分間捏ねた後、生地の最終温度が２５℃となるようにさらに混合した。その後、室温で３０分間放置した後、６℃の発酵器に入れて１６時間１次発酵させて中種を製造した。

【0109】

その後、下記の表８に記載された本捏ね組成成分（強力粉、精製塩、精白糖、全脂粉乳、酵母、精製水及び乳酸菌発酵生地）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入して１段で１分間捏ねた後、上記の中種を添加して２段で３分、３段で２分間混合した。その後、バターを添加して２段で３分、３段で３分間捏ね、生地の最終温度が２７℃になるようにして本捏ね生地を製造した。

【0110】

この本捏ね生地を、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて３０分間中間発酵をさせた後、この生地を一定の大きさに分割して丸め、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて１５分間熟成した。熟成ののち成形して食パンケースに入れた。その後、この食パンケースに入れた生地を、３７℃、相対湿度８５％の雰囲気で５０分間発酵させて食パン生地を製造した。この食パン生地をオーブンに入れ、上火１７０℃、下火２１０℃で３５分間焼き上げた。その後、室温で内部温度が３２℃になるまで冷却させた。

【0111】

製造された対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンは、図１４の写真のとおりだった。図１４は、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンの写真である。

【0112】

【表8】

（単位：ｇ）

【0113】

（３）パンの物性の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンの物性（ｐＨ、総滴定酸度、色度）を測定した。ｐＨ、総滴定酸度、色度の測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同様にした。その結果を下記の表９に示す。

【0114】

【表9】

【0115】

測定の結果、分離菌株が適用されたパンは、公知菌株が適用されたパンに比べてｐＨが低く、比容積が大きいことが確認できた。

【0116】

（４）生地のガス発生力の確認
対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用された本捏ね生地、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用された本捏ね生地のガス発生力を比較確認した。ガス発生力の測定は、生地２５ｇを取ってガス発生力測定器（Ｆｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて３０℃で１０時間行った。

【0117】

測定の結果、対照群（市販酵母のみ適用された生地）に比べて乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）を適用した生地の方がガス発生力に優れていることが確認できた。ただし、分離菌株と公知菌株とのガス発生力の差は殆どないことが確認できた（図１５）。図１５は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス１０４（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【0118】

（５）パンの老化度の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンの硬度及び時間による老化速度を比較した。

【0119】

硬度及び時間による老化速度の測定方法は、上記の実施例１０に記載の方法と同一にした。硬度についての値は下記の表１０に示し、時間による老化速度の結果は図１６に示す。

【0120】

【表10】

【0121】

測定の結果、乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）を適用したパンは、硬度が低くて軟らかいことが確認できた。特に、本発明の分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンは、最も低い硬度値を示し、最も軟らかいことが確認できた。また、時間による老化速度も、硬度と類似の結果を示すことが確認できた（図１６）。図１６は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス１０４（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンの老化速度を測定した結果である。

【0122】

（６）パンの香気成分の分析
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が添加されたパンの風味成分の発現を比較するために、ＧＣ／ＭＳシステムを用いて香気成分を分析した。

【0123】

試料１ｇに対して分析を行い、また、ＧＣ／ＭＳ分析条件は上記の表５と同様にした。ＧＣ／ＭＳ分析の後、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、酸（ａｃｉｄ）類に対する全体的な定量的数値を比較し（図１７）、下記の表１１に、２２種の代表的な香気成分に対して各成分の相対的比率を百分率で示した。

【0124】

【表11】

【0125】

揮発性香気成分（アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、酸（ａｃｉｄ）類）の全体的な定量的数値を比較した結果、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンからケトン類が多量検出されることが確認できた。ケトン類は、軟らかくてマイルドな香りがする香気成分であり、本発明の分離菌株を含有するパンは、風味が柔らかくてマイルドであることが確認できた。

【0126】

また、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンは、酸（ａｃｉｄ）類が多量検出されることが確認できた。

【0127】

これに対し、市販酵母のみ適用されたパンは、アルコール類、エステル類が多量検出されることが確認できた。アルコール類及びエステル類は、香りが軽く、強い匂いがする香気成分であり、市販酵母のみ適用されたパンは風味スペクトルが良くないことが確認できた。

【0128】

図１７は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【0129】

一方、代表的香気成分の分析結果、上記の表１１から確認されるように、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）に比べて、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンの方が、青臭い匂いを起こすエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の含量が少ないことが確認できた。また、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ファッティー（ｆａｔｔｙ）な香り（ｐｌｅａｓａｎｔ ｆｌａｖｏｒ）を出すノナナール（ｎｏｎａｎａｌ）と、キャラメル、キャンディ、アーモンドの香りを出すフルフラール（ｆｕｒｆｕｒａｌ）は、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンで高く現れた。特に、キャンディの香りのような甘ったるい風味を出すベンズアルデヒド（ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）と、バターの香りの軟らかい風味を出すケトン類のうちアセトインは、分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）で高く現れることが確認できた。また、公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ｋｃｃｍ ４０７１５）が適用されたパンは、甘い香臭がする１−プロパノール（１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）及びオレンジ香を出すアルファ−リモネン（ａｌｐｈａ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ）が検出されないことが確認できた。

【0130】

［実施例１２：天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）を製パンに適用］
本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９菌株と公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）をそれぞれ製パンに適用し、その特性を確認した。

【0131】

（１）乳酸菌発酵生地の製造及び分析
強力粉１００ｇ、乳酸菌数２×１０^１０ｃｆｕ／ｇ、加熱冷却水１００ｇを混合した後、３０℃の発酵器で発酵させて乳酸菌発酵生地を製造するが、生地のｐＨがｐＨ４．２±０．２に到達すると冷却させ、乳酸菌発酵生地のｐＨ、ＴＴＡ及び菌数を測定した。

【0132】

一方、乳酸菌株は、ＭＲＳブロスで３０℃の温度で２２±２時間培養した後、遠心分離して得た菌体を生理食塩水で洗浄したものを使用し、最初の菌接種量は、生地１ｇ当たりに１×１０^８ｃｆｕにした。

【0133】

測定結果を下記の表１２に示す。

【0134】

【表12】

【0135】

測定の結果、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）適用の生地の発酵時間は６時間、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）適用の生地の発酵時間は８時間だった。

【0136】

また、上記の表１２に示すように、分離菌株が適用された生地は、公知菌株が適用された生地に比べて約１．８倍の、高い菌数を示すことが確認できた。

【0137】

（２）パンの製造
下記の表１３のように中種の組成成分をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、２段で２分、３段で１分間捏ねた後、生地の最終温度が２５℃となるようにさらに混合した。その後、室温で３０分間放置した後、６℃発酵器に入れて１６時間１次発酵させて中種を製造した。

【0138】

その後、下記の表１３に記載された本捏ねの組成成分（強力粉、精製塩、精白糖、全脂粉乳、酵母、精製水及び乳酸菌発酵生地）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入して１段で１分間捏ねた後、上記の中種を添加して２段で３分、３段で２分間混合した。その後、バターを添加して２段で３分、３段で３分間捏ね、生地の最終温度が２７℃になるようにして本捏ね生地を製造した。

【0139】

この本捏ね生地を２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて３０分間中間発酵をさせた後、この生地を一定の大きさに分割して丸め、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて１５分間熟成した。熟成ののち成形して食パンケースに入れた。その後、食パンケースに入れた生地を３７℃、相対湿度８５％の雰囲気で５０分間発酵させて食パン生地を製造した。この食パン生地をオーブンに入れ、上火１７０℃、下火２１０℃で３５分間焼き上げた。その後、室温で内部温度が３２℃になるまで冷却した。
製造された対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（L.brevis ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ１４９）が適用されたパンは、図１８の写真のとおりだった。図１８は、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの写真である。

【0140】

【表13】

（単位：ｇ）

【0141】

（３）パンの物性の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの物性（ｐＨ、総滴定酸度、色度）を測定した。ｐＨ、総滴定酸度、色度測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同様にした。その結果を下記の表１４に示す。

【0142】

【表14】

【0143】

測定の結果、分離菌株が適用されたパンは、公知菌株が適用されたパンに比べてｐＨが高く、比容積が大きいことが確認できた。

【0144】

（４）生地のガス発生力の確認
対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用された本捏ね生地、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用された本捏ね生地のガス発生力を比較確認した。ガス発生力の測定は、生地２５ｇを取ってガス発生力測定器（Ｆｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて３０℃で１０時間行った。

【0145】

測定の結果、対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）よりも乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）が適用された本捏ね生地の方がガス発生力に優れていることが確認できた。ただし、分離菌株と公知菌株ではガス発生力の差が殆どないことが確認できた（図１９）。図１９は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【0146】

（５）パンの老化度の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの硬度及び時間による老化速度を比較した。

【0147】

硬度及び時間による老化速度の測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同様にした。硬度に対する値は下記の表１５に示し、時間による老化速度の結果は図２０に示す。

【0148】

【表15】

【0149】

測定の結果、乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）を適用したパンは、硬度が低くて軟らかいことが確認できた。特に、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンは、最も低い硬度値を示すことが確認できた。

【0150】

一方、時間による老化速度を分析した結果、対照群に比べて乳酸菌適用のパンの老化速度が遅く、特に、分離菌株が適用されたパンの老化速度が最も遅いことが確認できた（図２０）。図２０は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【0151】

（６）パンの香気成分の分析
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの風味成分を比較するためにＧＣ／ＭＳシステムを用いて香気成分を分析した。

【0152】

試料１ｇに対して分析を行い、また、ＧＣ／ＭＳ分析条件は上記の表５と同様にした。ＧＣ／ＭＳ分析の後、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、酸（ａｃｉｄ）類に対する全体的な定量的数値を比較し（図２１）、下記の表１６に、２２種の代表的香気成分に対して各成分の相対的比率を百分率で示した。

【0153】

【表16】

【0154】

揮発性香気成分（アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、酸類）の全体的な定量的数値を比較した結果、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンでケトン類、アルデヒド類、エステル類が多量検出されることが確認できた。ケトン類、アルデヒド類、エステル類は軟らかくてマイルドな匂いがする香気成分であって、本発明の分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンは、風味が軟らかくてマイルドであることが確認できた。また、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンは酸（ａｃｉｄ）類が多量検出されることが確認できた。

【0155】

しかしながら、市販酵母のみ添加されたパンは、アルコール類が多量検出されることが確認できた。アルコール類は、香りが軽く、強い匂いがする香気成分であって、市販酵母のみ適用されたパンは風味が良くないことが確認できた。

【0156】

図２１は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【0157】

一方、代表的香気成分の分析結果、上記の表１６から確認されるように、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）よりも乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンの方が、青臭い匂いを起こすエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の含量が少ないことが確認できた。また、バナナ、西洋梨の甘ったるい香臭がするイソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、とうもろこしの甘い香臭がする２−フェニルエチルアルコール（２−ｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）及びバター香の軟らかい風味がするケトン類のうちアセトインは、乳酸菌添加のパンで高く現れることが確認できた。また、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ファッティー（ｆａｔｔｙ）香（ｐｌｅａｓａｎｔ ｆｌａｖｏｒ）を示すノナナール（ｎｏｎａｎａｌ）、キャラメル、キャンディ、アーモンド香を示すフルフラール（ｆｕｒｆｕｒａｌ）、甘ったるい香りがするエステル類の物質は全体的に、分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンで高く現れることが確認できた。

【0158】

［実施例１３：天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ１４２）を製パンに適用］
本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２菌株と公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ１２４３１）をそれぞれ製パンに適用し、その特性を確認した。

【0159】

（１）乳酸菌発酵生地の製造及び分析
強力粉１００ｇ、乳酸菌数２×１０^１０ｃｆｕ／ｇ、加熱冷却水１００ｇを混合した後、３０℃の発酵器で発酵させて乳酸菌発酵生地を製造するが、生地のｐＨがｐＨ４．２±０．２に到達すると冷却させ、乳酸菌発酵生地のｐＨ、ＴＴＡ及び菌数を測定した。この時、ｐＨ、ＴＴＡは、上記の実施例１０に記載の方法と同一の方法で測定した。

【0160】

一方、乳酸菌株は、ＭＲＳブロスで３０℃の温度で２２±２時間培養した後、遠心分離して収得した菌体を生理食塩水で洗浄したものを使用し、最初の菌接種量は、生地１ｇ当たり１×１０^８ｃｆｕにした。

【0161】

測定結果を下記の表１７に示す。

【0162】

【表17】

【0163】

測定の結果、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）適用の生地の発酵時間は６時間であり、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）添加生地の発酵時間は８時間であって、分離菌株が公知菌株よりも２時間早いことが確認できた。

【0164】

また、上記の表１７に示すように、分離菌株が適用された生地の菌数は、公知菌株が適用された生地に比べて多いことが確認できた。

【0165】

（２）パンの製造
下記の表１８のように、中種の組成成分をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、２段で２分、３段で１分間捏ねた後、生地の最終温度が２５℃となるようにさらに混合した。その後、室温で３０分間放置した後、６℃発酵器に入れて１６時間１次発酵させて中種を製造した。

【0166】

その後、下記の表１８に記載された本捏ねの組成成分（強力粉、精製塩、精白糖、全脂粉乳、酵母、精製水及び乳酸菌発酵生地）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入して１段で１分間捏ねた後、上記の中種を添加して２段で３分、３段で２分間混合した。その後、バターを添加して２段で３分、３段で３分間捏ね、生地の最終温度が２７℃になるようにして本捏ね生地を製造した。

【0167】

この本捏ね生地を２７℃、相対湿度８５〜９０％の発酵器に入れて３０分間中間発酵をさせた後、この生地を一定の大きさに分割して丸め、２７℃、相対湿度８５〜９０％の発酵器に入れて１５分間熟成した。熟成ののち成形して食パンケースに入れた。その後、食パンケースに入れた生地を３７℃、相対湿度８５〜９０％の雰囲気で５０〜６０分間発酵させて食パン生地を製造した。この食パン生地をオーブンに入れ、上火１７０℃、下火２１０℃で３５分間焼き上げた。その後、室温で内部温度が３２℃になるまで冷却した。

【0168】

製造された対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンは、図２２のの写真のとおりであった。図２２は、対照群（市販酵母）のみ適用されたパン、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンの写真である。

【0169】

【表18】

（単位：ｇ）

【0170】

（３）パンの物性の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンの物性（ｐＨ、総滴定酸度、色度）を測定した。

【0171】

ｐＨ、総滴定酸度、色度測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同一にした。その結果を下記の表１９に示す。

【0172】

【表19】

【0173】

測定の結果、分離菌株が適用されたパンは、公知菌株が適用されたパンに比べてｐＨが低く、比容積が大きいことが確認できた。

【0174】

（４）生地のガス発生力の確認
対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用された本捏ね生地、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用された本捏ね生地のガス発生力を比較確認した。ガス発生力の測定は、生地２５ｇを取り、ガス発生力測定器（Ｆｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて３０℃で１０時間行った。

【0175】

測定の結果、対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）よりも乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）が適用された本捏ね生地の方がガス発生力に優れていることが確認できた。ただし、分離菌株と公知菌株のガス発生力差は殆どないことが確認できた（図２３）。図２３は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用された本捏ね生地のガス発生力を確認した結果である。

【0176】

（５）パンの老化度の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンの硬度及び時間による老化速度を比較した。

【0177】

硬度及び時間による老化速度の測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同一にした。硬度に対する値は下記の表２０に示し、時間による老化速度の結果は図２４に示す。

【0178】

【表20】

【0179】

測定の結果、乳酸菌株（公知菌株、分離菌株）が適用されたパンは、硬度が低くて軟らかいことが確認できた。特に、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が添加されたパンは、最も低い硬度値を示すことが確認できた。

【0180】

一方、時間による老化速度を分析した結果、対照群に比べて乳酸菌適用のパンの老化速度が遅いことが確認できた（図２４）。図２４は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用されたパンの老化速度を確認した結果である。

【0181】

（６）パンの香気成分の分析
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）が適用されたパン、分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンの風味成分を比較するためにＧＣ／ＭＳシステムを用いて香気成分を分析した。

【0182】

試料１ｇに対して分析を行い、また、ＧＣ／ＭＳ分析条件は上記の表５と同様にした。ＧＣ／ＭＳ分析の後、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、酸（ａｃｉｄ）類に対する全体的な定量的数値を比較し（図２５）、下記の表２１に、２２種の代表的香気成分に対して各成分の相対的比率を百分率で示した。

【0183】

【表21】

【0184】

揮発性香気成分（アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、酸類）の全体的な定量的数値を比較した結果、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンでエステル類が多量検出されることが確認できた。エステル類は軟らかくてマイルドな匂いがする香気成分であって、本発明の分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンは、風味が軟らかくてマイルドであることが確認できた。また、乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンは、酸（ａｃｉｄ）類が多量検出されることが確認できた。

【0185】

しかし、市販酵母のみ適用されたパンは、アルコール類が多量検出されることが確認できた。アルコール類は、香りが軽く、強い匂いがする香気成分であって、市販酵母のみ添加されたパンは、風味スペクトルが良くないことが確認できた。

【0186】

図２５は、天然サワー種から分離したラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用されたパンの香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【0187】

一方、代表的香気成分の分析結果、上記の表２１から確認されるように、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）よりも乳酸菌（分離菌株、公知菌株）が適用されたパンの方が、青臭い匂いを起こすエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の含量が少ないことが確認できた。また、バナナ、西洋梨の甘ったるい香臭がするイソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、とうもろこしの甘い香臭がする２−フェニルエチルアルコール（２−ｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、キャラメル、キャンディ、アーモンド香を示すフルフラール（ｆｕｒｆｕｒａｌ）、バター香の軟らかい風味を示すケトン類のうちアセトイン、甘ったるい香りがするエステル類の物質は、乳酸菌が適用されたパンで高く現れることが確認できた。また、公知菌株が適用されたパンは、対照群及び分離菌株が適用されたパンとは異なる酸（ａｃｉｄ）類組成を示すことが確認できた。

【0188】

［実施例１４：天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）が適用されたパンの官能評価及び特性確認］

【0189】

本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）が添加されたパンの官能評価及び特性を確認した。

【0190】

上記の実施例で製造された各パンを試食させ、食感及び風味に対して官能評価を行った。官能評価の結果は、食感及び風味に対して９点尺度法を利用した（９−極めて良い、１−極めて悪い）。

【0191】

また、各パンに対する比容積、ｐＨ、ＴＴＡ、水分含量の測定方法は、上記の実施例１０に記載の方法と同様にした。

【0192】

官能評価及び特性に対する結果を下記の表２２に示す。

【0193】

【表22】

【0194】

評価の結果、分離酵母（Ｓａｃ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ０１４３５）が適用されたパンは、対照群（市販酵母）が適用されたパンに比べて軟らかいため食感がよく、ガス臭が少ないため風味がマイルドであり、優れた食感及び風味の点数を受けることが確認できた。

【0195】

ラクトバチルス・カルバタス分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）が適用されたパンは、対照群（市販酵母）が適用されたパンに比べて食感及び風味点数に優れていることが確認できた。分離菌株と公知菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ ＫＣＣＭ ４０７１５）では大きな差はなかった。

【0196】

ラクトバチルス・ブレビス分離菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）が適用されたパンは、対照群（市販酵母）及び公知菌株（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ ＫＡＣＣ １１４３３）に比べて食感及び風味点数に優れていることが確認できた。分離菌株が適用されたパンは食感が柔らかかったが、公知菌株が適用されたパンは多少水っぽい食感がし、良い評価を受けなかった。

【0197】

ラクトバチルス・サンフランシスエンシス分離菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンは、対照群（市販酵母）及び公知菌株（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ ＫＡＣＣ １２４３１）に比べて食感に優れていることが確認できた。分離菌株が適用されたパンは食感が軟らかかったが、公知菌株が適用されたパンは多少水っぽい食感がし、良い評価を受けなかった。

【0198】

［実施例１５：天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）及び混合菌株を製パンに適用］

【0199】

本実施例では、天然サワー種（麹が添加された韓国型サワードウ）から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９菌株、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２菌株及び混合菌株（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ０１４３５，Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４，Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９，Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）をそれぞれ製パンに適用し、その特性を確認した。

【0200】

（１）乳酸菌発酵生地の製造及び分析
ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２、混合乳酸菌（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４，Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９，Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用された乳酸菌発酵生地を製造し、特性を分析した。

【0201】

強力粉１００ｇ、乳酸菌数２×１０^１０ｃｆｕ／ｇ、加熱冷却水１００ｇを混合した後、３０℃の発酵器で発酵させて乳酸菌発酵生地を製造するが、生地のｐＨがｐＨ４．２±０．２に到達すると冷却させ、乳酸菌発酵生地のｐＨ、ＴＴＡ及び菌数を測定した。この時、ｐＨ、ＴＴＡは、上記の実施例１０に記載された方法を用いて測定した。

【0202】

このとき、乳酸菌株は、ＭＲＳブロスで３０℃の温度で２２±２時間培養した後、遠心分離して収得した菌体を生理食塩水で洗浄したものを使用し、最初の菌接種量は、生地１ｇ当たり１×１０^８ｃｆｕにした。

【0203】

また、混合分離菌株が適用された乳酸菌発酵生地は、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２がそれぞれ適用された乳酸菌発酵生地を同量で混合して製造した。

【0204】

測定の結果を下記の表２３に示す。

【0205】

【表23】

【0206】

表２３に示すように、各生地のｐＨに大差はなく、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）１０４が適用された生地の菌数は、２．１×１０^９ｃｆｕ／ｇ、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）１４９が適用された生地の菌数は、１．４×１０^９ｃｆｕ／ｇ、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）１４２が適用された生地の菌数は、２．３×１０^９ｃｆｕ／ｇ、混合分離菌株（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４，Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９，Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用された生地の菌数は、１．７×１０^９ｃｆｕ／ｇであることが確認できた。

【0207】

（２）パンの製造
下記の表２４のように分離酵母と分離菌株を組成し、それぞれＥセット〜Ｈセットと名付けた。その後、それぞれをパンに適用して組成による特性を確認した。

【0208】

パンの製造は、下記の表２５のように、中種の組成成分（強力粉、酵母、リマルソフト、精製水）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入し、２段で２分、３段で１分間捏ねた後、生地の最終温度が２５℃となるようにさらに混合した。その後、室温で３０分間放置した後、６℃発酵器に入れて１６時間１次発酵させて中種を製造した。

【0209】

その後、下記の表２５に記載された本捏ねの組成成分（強力粉、精製塩、精白糖、全脂粉乳、酵母、精製水及び乳酸菌発酵生地）をミキサー（製品名：ＳＫ１０１Ｓ ＭＩＸＥＲ、日本）に投入して１段で１分間捏ねた後、上記の中種を添加して２段で３分、３段で２分間混合した。その後、バターを添加して２段で３分、３段で３分間捏ね、生地の最終温度が２７℃になるようにして本捏ね生地を製造した。

【0210】

この本捏ね生地を２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて３０分間中間発酵をさせた後、この生地を一定の大きさに分割して丸め、２７℃、相対湿度８５％の発酵器に入れて１５分間熟成した。熟成ののち成形して食パンケースに入れた。その後、食パンケースに入れた生地を３７℃、相対湿度８５％の雰囲気で５０分間発酵させて食パン生地を製造した。この食パン生地をオーブンに入れ、上火１７０℃、下火２１０℃で３５分間焼き上げた。その後、室温で内部温度が３２℃になるまで冷却した。

【0211】

製造された対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパンの写真は、図２６のとおりだった。図２６は、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパンの写真である。

【0212】

【表24】

【0213】

【表25】

（単位：ｇ）

【0214】

（３）パンの物性の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、Ｅセットが適用されたパン、Ｆセットが適用されたパン、Ｇセットが適用されたパン、Ｈセットが適用されたパンの物性（ｐＨ、総滴定酸度、色度）を測定した。ｐＨ、総滴定酸度、色度測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同一にした。その結果を下記の表２６に示す。

【0215】

【表26】

【0216】

測定の結果、分離菌株（Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセット）が適用されたパンは、対照群に比べてｐＨが低いことが確認できた。また、Ｈセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５+Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４+Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９+Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）が適用されたパンは、他のパンに比べて比容積が多少大きいことが確認できた。

【0217】

（４）生地のガス発生力の確認
対照群（市販酵母のみ適用された本捏ね生地）、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットがそれぞれ適用された本捏ね生地のガス発生力を比較確認した。ガス発生力の測定は、生地２５ｇを取ってガス発生力測定器（Ｆｅｒｍｏｍｅｔｅｒ）を用いて３０℃で１０時間行った。

【0218】

測定の結果、Ｅセット、Ｆセット、 Ｇセット、Ｈセットが適用された本捏ね生地の場合、対照群と全般的に類似するが、初期にはＥセット、Ｆセット、 Ｇセット、Ｈセットが適用された本捏ね生地でガス発生力が多少高く現れることが確認できた（図２７）。図２７は、市販酵母のみ適用された本捏ね生地（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用された本捏ね生地（Ｅセット適用の本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用された本捏ね生地（ Ｈ セット適用の本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用された本捏ね生地（Ｇセット適用の本捏ね生地）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用された本捏ね生地（Ｈセット適用の本捏ね生地）のガス発生力を確認した結果である。

【0219】

（５）パンの老化度の測定
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットがそれぞれ適用されたパンの硬度及び時間による老化速度を比較した。

【0220】

硬度及び時間による老化速度の測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同一にした。硬度に対する値は下記の表２７に示し、時間による老化速度の結果は図２８に示す。

【0221】

【表27】

【0222】

測定の結果、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットが適用されたパンは、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）に比べて硬度が低いため軟らかいことが確認できた。

【0223】

一方、時間による老化速度を分析した結果、いずれのパンも類似の老化速度を示すことが確認できた（図２８）。図２８は、市販酵母のみ適用されたパン（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン（Ｅセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン（Ｆセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｇセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｈセット適用のパン）の老化速度を確認した結果である。

【0224】

（６）パンの香気成分の分析
対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットがそれぞれ適用されたパンの風味成分の発現を比較するためにＧＣ／ＭＳシステムを用いて香気成分を分析した。

【0225】

試料１ｇに対して分析を行い、また、ＧＣ／ＭＳ分析条件は上記の表５と同様にした。ＧＣ／ＭＳ分析の後、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌ）、アルデヒド（ａｌｄｅｈｙｄｅ）、ケトン（ｋｅｔｏｎｅ）、エステル（ｅｓｔｅｒ）、酸（ａｃｉｄ）類に対する全体的な定量的数値を比較し（図２９）、下記の表２８に、２２種の代表的香気成分に対して各成分の相対的比率を百分率で示した。

【0226】

【表28】

【0227】

揮発性香気成分（アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、酸類）の全体的な定量的数値を比較した結果、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットが適用されたパンから、軟らかくてマイルドな匂いがするケトン類が、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）に比べて多量検出され、特に、Ｈセットが適用されたパンから最も多いケトン類が検出されることが確認できた。また、軟らかくてマイルドな匂いがするアルデヒド類は、Ｅセットが適用されたパンから多量検出された。また、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットが適用されたパンの方が、対照群が適用されたパンに比べて酸（ａｃｉｄ）類が多量検出されることが確認できた。

【0228】

しかし、対照群は、香りが軽く、強い匂いがするエステル類が多量検出され、風味スペクトルが良くないことが確認できた。

【0229】

図２９は、市販酵母のみ適用されたパン（ｃｏｎｔｒｏｌ）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・カルバタス１０４菌株が適用されたパン（Ｅセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・ブレビス１４９菌株が適用されたパン（Ｆセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｇセット適用のパン）、サッカロミセス・セレビシエ０１４３５、ラクトバチルス・カルバタス１０４菌株、ラクトバチルス・ブレビス１４９菌株及びラクトバチルス・サンフランシスエンシス１４２菌株が適用されたパン（Ｈセット適用のパン）の香気成分を定量的数値で比較した結果である。

【0230】

一方、代表的香気成分の分析結果、上記の表２８から確認されるように、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットを適用したパンは、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）に比べて、青臭い匂いを起こすエチルアルコール（ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）の含量が少ないことが確認できた。また、バナナ、西洋梨の甘ったるい香臭がするイソアミルアルコール（ｉｓｏａｍｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、とうもろこしの甘い香臭がする２−フェニルエチルアルコール（２−ｐｈｅｎｙｌ ｅｔｈｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）は、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットを適用したパンから多量検出され、シトラス（ｃｉｔｒｕｓ）、ファッティー（ｆａｔｔｙ）香（ｐｌｅａｓａｎｔ ｆｌａｖｏｒ）を示すノナナール（ｎｏｎａｎａｌ）は、Ｆセット及びＧセットを適用したパンで高く検出された。また、バター香の軟らかい風味を示すケトン類のうちアセトインは、対照群に比べて、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットを適用したパンで全般的に高い含量を示した。また、酸（ａｃｉｄ）類は、対照群に比べて、Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセットを適用したパンで全般的に高い含量を示し、特に、Ｆセット及びＧセットを適用したパンから多量検出されることが確認できた。

【0231】

［実施例１６：天然サワー種から分離したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・カルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス（Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）及び混合菌株が適用されたパンの官能評価及び特性確認］

【0232】

本実施例では、対照群（市販酵母のみ適用されたパン）、及びＥセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５+Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４）、Ｆセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５+Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９）、Ｇセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５+Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）、Ｈセット（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ０１４３５+Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ １０４+Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ １４９+Ｌ．ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ １４２）がそれぞれ適用されたパンの官能評価及び特性確認を行った。

【0233】

上記の実施例で製造された各パンを試食させた後、食感及び風味に対して官能評価を行った。官能評価の結果は、食感及び風味に対して９点尺度法を利用した（９−極めて良い、１−極めて悪い）。

【0234】

また、各パンに対する比容積、ｐＨ、ＴＴＡ、水分含量の測定方法は、上記の実施例１０に記載された方法と同様にした。

【0235】

官能評価及び特性に対する結果を下記の表２９に示す。

【0236】

【表29】

【0237】

評価の結果、分離酵母と分離菌株（Ｅセット、Ｆセット、Ｇセット、Ｈセット）が適用されたパンは、対照群（市販酵母）が適用されたパンよりも軟らかくて食感がよく、ガス臭が少ないため風味がマイルドであり、優れた食感及び風味点数を受けることが確認できた。

【0238】

【0239】

【0240】

【0241】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】