特許 6248095 核酸の抽出及び貯蔵のための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6248095

(24)【登録日】2017年11月24日

(45)【発行日】2017年12月13日

(54)【発明の名称】核酸の抽出及び貯蔵のための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/28 20060101AFI20171204BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20171204BHJP

   C12Q 1/68 20060101ALI20171204BHJP

【ＦＩ】

   G01N1/28 J

   C12N15/00 A

   C12Q1/68 A

【請求項の数】15

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2015-510354(P2015-510354)

(86)(22)【出願日】2013年4月29日

(65)【公表番号】特表2015-518569(P2015-518569A)

(43)【公表日】2015年7月2日

(86)【国際出願番号】US2013038576

(87)【国際公開番号】WO2013165870

(87)【国際公開日】20131107

【審査請求日】2016年4月14日

(31)【優先権主張番号】13/460,076

(32)【優先日】2012年4月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】390041542

【氏名又は名称】ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ

(74)【代理人】

【識別番号】100137545

【弁理士】

【氏名又は名称】荒川 聡志

(74)【代理人】

【識別番号】100105588

【弁理士】

【氏名又は名称】小倉 博

(74)【代理人】

【識別番号】100129779

【弁理士】

【氏名又は名称】黒川 俊久

(74)【代理人】

【識別番号】100113974

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 拓人

(72)【発明者】

【氏名】リ，ビン

(72)【発明者】

【氏名】ムーア，デイヴィッド・ロジャー

(72)【発明者】

【氏名】クヴァム，エリック・リーミング

【審査官】 三木 隆

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００８１３６３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開昭６１−０８８８９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１２３９０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３６３７７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第４１８９３２１（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特許第５２８２０８８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特表２００７−５０２４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特許第５７６６１７８（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 特開２００４−３２９２１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１２４９５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Maximize Your RNA Yield - What Yield to Expect，２０１７年 １月２３日，AMBION TECHNOTES，ＵＲＬ，https://www.thermofisher.com/jp/ja/home/references/ambion-tech-support/rna-isolation/tech-notes/maximize-your-rna-yield.html

【文献】 RNAQUEOUS-4PCR INSTRUCTION MANUAL，Thermo Fisher Scientific Inc，２０１７年 １月２３日，ＵＲＬ，https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_059300.pdf

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ １／２８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｑ １／６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料からの核酸の抽出及び貯蔵のための固体マトリクスであって、１種以上のタンパク質変性剤、１種以上の還元剤、ＵＶ抑制剤及び緩衝剤を含む組成物が固体マトリクス中に含浸されて乾燥状態で存在しており、固体マトリクスが、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維又はこれらの組合せを含む多孔性マトリクスであり、タンパク質変性剤が、グアニジニウム塩酸塩、チオシアン酸グアニジニウム（ＧＩＴＣ）、アルギニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素及びこれらの組合せから選択され、還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びこれらの組合せから選択され、ＵＶ抑制剤が、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）、アスコルビン酸及びこれらの組合せから選択される、固体マトリクス。

【請求項2】

タンパク質変性剤がＧＩＴＣであり、還元剤がＴＣＥＰであり、ＵＶ抑制剤がＭＥＨＱ、ＴＨＱ又はこれらの組合せから選択される、請求項１記載の固体マトリクス。

【請求項3】

固体マトリクス中に存在する組成物がさらにＲＮａｓｅ阻害剤を含む、請求項１又は請求項２記載の固体マトリクス。

【請求項4】

固体マトリクスが周囲条件下において乾燥形態での核酸の長期貯蔵を可能にする、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の固体マトリクス。

【請求項5】

核酸がＲＮＡ、ＤＮＡ又はこれらの組合せである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の固体マトリクス。

【請求項6】

核酸がＲＮＡである、請求項５記載の固体マトリクス。

【請求項7】

多孔性マトリクスがセルロース紙である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の固体マトリクス。

【請求項8】

緩衝剤が、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、クエン酸緩衝剤及びリン酸緩衝剤からなる群から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の固体マトリクス。

【請求項9】

緩衝剤が、３〜８のｐＨを有する、請求項８記載の固体マトリクス。

【請求項10】

ＲＮａｓｅ阻害剤がバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）、ヌクレオチド類似体又は市販のＲＮａｓｅ阻害剤である、請求項３記載の固体マトリクス。

【請求項11】

固体マトリクスが多孔性のセルロース性マトリクスであり、かつ
ａ）タンパク質変性剤がＧＩＴＣ、洗剤又はこれらの組合せであり、
ｂ）還元剤がＤＴＴ、ＴＣＥＰ又はこれらの組合せであり、かつ
ｃ）緩衝剤がＴｒｉｓ、ＭＥＳ又はＭＯＰＳである、請求項１記載の固体マトリクス。

【請求項12】

核酸を試料から抽出し貯蔵する方法であって、
ａ）請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の固体マトリクスを用意する工程と、
ｂ）試料を固体マトリクスに適用して核酸を収集する工程と、
ｃ）固体マトリクスを乾燥する工程と、
ｄ）周囲条件下において核酸を乾燥状態で固体マトリクス上に貯蔵する工程と
を含む方法。

【請求項13】

当該方法がさらに、固体マトリクスから核酸を回収することを含む、請求項１２記載の方法。

【請求項14】

生物学的試料が血液、血清、組織、唾液又は細胞である、請求項１２記載の方法。

【請求項15】

試料が精製した核酸試料又は組織培養細胞調製物である、請求項１２記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、一般に、乾燥形態の生物学的試料由来の核酸の周囲条件下での抽出、安定化、及び保存のための固体組成物に関する。その固体組成物から核酸を抽出し、収集し、保存し、及び回収する方法も記載されている。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡは、化学的な自己加水分解と酵素に媒介される分解との両方の結果として最も不安定な生体分子の１つである。従って、生物学的試料に由来するＲＮＡの抽出及び保存は、限定されることはないがＲＮＡを抽出又は収集するのに使用される緩衝液、ｐＨ、温度、及び特に堅牢な(robust)リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の普遍的存在をはじめとする幾つかの環境因子に対して感受性である。その結果、精製状態及び未精製状態のＲＮＡは、通例、ＲＮＡ試料の加水分解及び酵素的分解を防止しその完全性(integrity)を保存するために−８０℃で貯蔵する必要があった。ＲＮＡを周囲条件下で抽出し、収集し、保存することができるということは、−８０℃での冷蔵に伴う費用及び空間の必要性を回避するために経済的に望ましい。

【0003】

周囲条件下において液体の状態でＲＮＡを保存するための現在の方法論は、例えば、洗剤、カオトロピック化合物、還元剤、遷移金属、有機溶媒、キレート化剤、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）、ＲＮａｓｅペプチド阻害剤、及び抗−ＲＮａｓｅ抗体を用いることによるＲＮａｓｅの失活に集中している。補助的な努力は、エステル交換反応及び自己加水分解を防ぐためにＲＮＡを化学的に修飾することに焦点を合わせている。しかし、殆どの市販のＲＮＡ保存製品は室温でＲＮＡを数日又は数週間しか保存することができない。乾燥形態のＲＮＡの十分な収集及び保存が可能な現在の技術では、通例、ＲＮＡの貯蔵に先立ち、先ず最初にＲＮＡを生物学的材料（例えば、血液、血清、組織、唾液、等のような生物学的試料）から「予備的に精製し」濃縮することを必要とする。

【0004】

乾燥形態でＲＮＡを保存するための現在の技術では追加の乾燥用設備が必要である。従って、これらの方法は、試料の多大な処理なしに試料（例えば、生物学的試料）から直接ＲＮＡを収集することの助けにはならない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】米国特許第８０８８５７６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、試料（例えば、生物学的試料）からのＲＮＡの抽出、安定化、及び貯蔵／保存を単一のプロセス内に統合する組成物及び方法が望ましく、当技術分野において必要とされている。かかる組成物及び方法によると、周囲条件下におけるＲＮＡの長期の貯蔵が可能となり、またさらなる分析のためにインタクトなＲＮＡを回収することができるようになるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書中以下で定義される生物学的試料のような試料からの核酸の抽出及び貯蔵のための固体マトリクスであって、該固体マトリクス中にタンパク質変性剤、還元剤、及び緩衝剤を含む組成物が存在している、固体マトリクスが記載されている。本出願の固体マトリクスにより、乾燥形態のＲＮＡ及びＤＮＡの周囲条件下での長期の貯蔵が可能になる。核酸（例えば、ＲＮＡ）を乾燥形態で含む固体マトリクスは、収集された核酸試料のさらなる分析に適したインタクトな形態で核酸を固体マトリクスから解放するためのプロセスに付すことができる。生物学的試料から核酸を抽出し貯蔵するために本発明の固体マトリクスを使用する方法も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0008】

化学的に修飾された多孔性膜の上記及びその他の特徴、局面、及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読むことでより十分に理解されるであろう。図面を通じて類似の符号は類似の部分を表す。

【図1】図１は、培養したヒト細胞をいろいろな組成の固体マトリクス上にスポットした後電気溶出を用いてセルロースから回収された核酸の代表的な電気泳動図を示す。高分子量のゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ ｒＲＮＡバンドが矢印で表示されている。さらに、Ｉｍａｇｅ Ｊ．を用いたＤＮＡ及びＲＮＡの定量化が示されている。パネルＡの各々のレーンの上から下に垂直の線が引かれており、画素強度（グレー値任意単位）がＰｌｏｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ関数を用いて線間隔（ｃｍ）の関数としてプロットされている。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ ｒＲＮＡに対応するピークがボックス内に示されている。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図2】図２は、示されている組成物の各々について２８ｓ及び１８ｓ ｒＲＮＡに対するグレー値任意単位として表されたゲル画素強度を示す。分析の前にセルロース試料を室温でデシケーターキャビネット内に１０日間貯蔵した。２８ｓの１８ｓ ｒＲＮＡに対する比の値をグラフの各々のバーの上に示す。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図3】図３は、示されている組成物の各々について２８ｓ及び１８ｓ ｒＲＮＡに対するゲル画素強度を示す。分析の前にセルロース試料を室温でデシケーターキャビネット内に１３日間貯蔵した。各々の実験条件について２８ｓの１８ｓ ｒＲＮＡに対する比の値をグラフの各々のバーの上に示す。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図4】図４は、示されている組成物の各々について２８ｓ及び１８ｓ ｒＲＮＡに対するゲル画素強度を示す。分析の前にセルロース試料を室温でデシケーターキャビネット内に１０日間貯蔵した。各々の実験条件について２８ｓの１８ｓ ｒＲＮＡに対する比の値をグラフの各々のバーの上に示す。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図5】図５は、示されている組成物の各々について２８ｓ及び１８ｓ ｒＲＮＡバンドに対するゲル画素強度を示す。分析の前にセルロース試料を室温でデシケーターキャビネット内に３０日間貯蔵した。各々の実験条件について２８ｓの１８ｓ ｒＲＮＡに対する比の値をグラフの各々のバーの上に示す。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図6】図６は、リストに挙げた各々の条件についてＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ＬａｂＣｈｉｐｓを用いてＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで決定された、セルロース紙上の乾燥血液スポットで測定されたＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒｓ（ＲＩＮ）を示す。追加の実験の詳細は後記の実施例の欄に記載する。

【図7】図７は、セルロース紙上の日光による損傷に対するｍＲＮＡ保護の証拠を提供する。グラフの各々のバーは、図に示されている組成物を含むＵＶ処理と未処理の試料の間のｑＲＴ−ＰＣＲサイクル閾値の差を表す。追加の実験の詳細は後記実施例の欄に記載する。

【図8】図８は、いろいろな緩衝剤の存在下、異なる温度でのセルロース系紙上のＴＣＥＰ活性を示す。追加の詳細は後記実施例の欄に述べる。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本明細書には、試料（例えば、生物学的試料）からの核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はこれらの組合せ）の抽出及び貯蔵のための固体マトリクスであって、その中にタンパク質変性剤、還元剤、及び緩衝剤を含む組成物が乾燥状態で存在する固体マトリクスが記載されている。本発明の組成物は周囲の貯蔵条件下における核酸の長期の乾燥保存を可能にする。この観察結果は、不安定であることが広く知られているＲＮＡの周囲条件での保存に関して格別重要である。本明細書で使用する用語「固体マトリクス」は、限定されることはないが、セルロース系製品、セルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、又はこれらの任意の組合せを包含する。本出願の固体マトリクスは多孔性であってもよい。特定の実施形態において、固体マトリクスはＦＴＡ（商標）はＦＴＡ（商標） ＥｌｕｔｅのようなＷｈａｔｍａｎ（商標）の多孔性セルロース紙である。用語「抽出」とは、試料、より特定的には生物学的試料から核酸を分離し単離するためのあらゆる方法をいう。ＲＮＡ及びＤＮＡのような核酸は、例えば、空気中での蒸発性試料細胞溶解中、又は試料と接触すると細胞溶解を起こし核酸を遊離させる化学的に修飾された固体マトリクス（例えば、ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅセルロース紙）内の化合物の存在により、遊離させることができる。当業者には分かるように、試料（例えば、未精製の生物学的試料）から核酸、特にＲＮＡを抽出して、その核酸を核酸の安定化と保存のための固体マトリクス上に捕捉することができるいかなる方法でも、開示されている組成物及び方法に使用し得る。試料から核酸を抽出する方法の上の例は例示の目的のみで挙げたものである。本明細書中で用語「貯蔵」又は「保存」は、抽出された核酸をさらなる分析に適した形態で維持することに関して互換的に使用され得る。

【0010】

核酸、特にＲＮＡの分野で熟練した技術者は、伝統的に、（１）ｍＲＮＡ標的の定量ＲＴ−ＰＣＲ増幅、（２）Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒでのＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）分析、及び（３）大部分の全細胞ＲＮＡに当て嵌まる(compromise)、２８ｓ：１８ｓリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の比の値に基づいて、ＲＮＡの安定性及び質を評価している。高品質細胞ＲＮＡは一般に、１より大きい２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡ比及び１０に近いＲＩＮスコアを示す。また、高品質の細胞ＲＮＡは低含量及び大きい（例えば、１ｋＢより大きい）ｍＲＮＡの両方の効率的な増幅を支える。便宜上、ｒＲＮＡのシグナル強度及び２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡの比の値が、ゲル電気泳動により強固なＲＮＡ貯蔵特性を有する試料を迅速にスクリーニングし同定するために使用されることが多い。

【0011】

本明細書中で定義されているように、「生物学的試料」は、限定されることはないが、ヒトを含めたいずれかの生物から得られる血液、血清、組織、及び唾液を包含する。生物学的試料は、自己診断（例えば、血糖モニタリング）をする個人により、或いは、例えば注射針を用いる血液の吸引、又は患者の皮膚の病変部のような特定の部分を削り取るか若しくは綿棒で採取するといったような様々な技術によって熟練した医学の専門家により、得ることができる。各種の生物学的試料を収集する方法は当技術分野で周知である。用語「試料」には、上で定義された生物学的試料だけでなく、例えば、組織培養した細胞及び精製した核酸も包含される。

【0012】

タンパク質変性剤、還元剤、及び緩衝剤を含む組成物が本開示の乾燥固体マトリクス中に存在する。組成物は上記リストの成分の各々の１以上を含み得る。本組成物は場合によりさらに紫外線（ＵＶ）抑制剤、遊離基捕捉剤、ＲＮａｓｅ阻害剤、キレート剤、又はこれらの任意の組合せを含み得る。熟練した技術者には了解されるように、数多くのタンパク質変性剤が当技術分野で公知であり、本明細書に記載した組成物及び方法に使用するために経験的に選択することができる。特定のタンパク質変性剤に制限されることはないが、代表的なタンパク質変性剤としては、チオシアン酸グアニジニウム、グアニジニウム塩酸塩、アルギニン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、尿素、又はこれらの任意の組合せがある。代表的なタンパク質変性剤の式を示す。

【0013】

【化1】

式中、各Ｒは、独立に、水素、ヘテロ原子含有基又は炭化水素基からなる群から選択されるものである。

【0014】

ヘテロ原子含有基は窒素、酸素、イオウ、リン、ケイ素、及びホウ素から選択される１以上を含む基である。反応性の官能基を用いてグアニジンを含有する化合物に結合させることが目的である。ヘテロ原子を有する典型的な反応性の基には、エポキシ、アクリレート、マレイミド、アシルハライド、アルキルハライド、アジド、シアン酸エステル、イソシアネート、アリールハライド、アルデヒド、アミン、オキシム、チオール、アルコール、酸、アジリジン、アゾ、イソチオシアネート、無水物、混合無水物、ラクトン、スルトン、及びケトンがある。

【0015】

炭化水素基は炭素と水素の両方を含む基であるが、親水性を高めるためにヘテロ原子を含有していてもよい。反応性の官能基を用いてグアニジンを含有する化合物に結合させることが目的である。炭化水素を有する典型的な反応性の基としては、アリル、スチリル、ビニル、及びアルキンがある。ヘテロ原子を含有する炭化水素基としては２−、３−又は４−オキシスチリル、アミノアリル、オキシアリル、オキシビニル、アミノビニルがある。

【0016】

Ｘは陰イオン、すなわち、１以上の形式負電荷を含有する基である。塩素、チオシアン酸、硫酸、リン酸、臭素、亜塩素酸、塩素酸、チオ硫酸、炭酸、重炭酸、酢酸、ギ酸、リン酸水素、リン酸二水素イオンからなる群から選択される。１以上の陰イオンを使用してもよく、様々なレベル（二価、一価、三価）の形式電荷を有する陰イオンの組合せを使用してもよいと考えられる。陰イオンの分子量は１０〜１０００００で変化し得る。

【0017】

用語「還元剤」は、別の化学種に電子を供与する化学種を指す。この場合も、様々な還元剤が当技術分野で公知であり、以下及び特許請求の範囲に挙げる代表的なリストは本開示の組成物及び方法に使用することができる還元剤をいかなる意味でも制限することはない。代表的な還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）がある。また、これら又は他の還元剤のいかなる組合せも本発明を実施する上で使用し得る。特定の実施形態において、還元剤はＴＣＥＰである。

【0018】

本明細書で使用する「緩衝剤」には、例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝剤、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及びリン酸緩衝剤がある。この可能な緩衝剤のリストは例示のためだけのものである。熟練した技術者には認識されるように、本明細書に開示されている組成物及び方法に使用するのに選択される緩衝剤のｐＨが関連する。緩衝剤のｐＨは通例３〜８の範囲である。

【0019】

上に示したように、固体マトリクス中に存在する組成物は場合によりＵＶ保護剤又は遊離基捕捉剤を含み得る。いかなる特定のＵＶ保護剤にも限定する意図はないが、代表的な作用剤には、例えば、ヒドロキノンモノメチルエーテル（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン（ＨＱ）、トルヒドロキノン（ＴＨＱ）、及びアスコルビン酸が包含される。幾つかの局面において、フリーラジカルはＭＥＨＱである。また、固体マトリクス中の組成物は、バナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）又は市販のＲＮａｓｅ阻害剤のいずれか（例えば、ＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ（商標））のようなＲＮａｓｅ阻害剤も含み得る。追加の代表的なＲＮａｓｅ阻害剤はＫｕｍａｒら（２００３）のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３００：８１−８６（援用によりその全体が本明細書の一部をなす）に記載されている。

【0020】

さらに、本明細書に記載した組成物を使用する方法が提供される。１つの実施形態において、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はこれらの組合せ）を抽出し保存する方法は、ａ）１種以上のタンパク質変性剤、１種以上の還元剤、生物学的緩衝剤、及び場合により遊離基捕捉剤を含む組成物が乾燥形態で取り込まれている固体マトリクスを準備し、ｂ）試料（例えば、生物学的試料）を固体マトリクスに適用（塗布）して核酸を抽出し、ｃ）固体マトリクスを乾燥し、ｄ）固体マトリクス上の核酸を乾燥状態で周囲条件下に貯蔵するという工程を含む。本方法の幾つかの局面において、固体マトリクスは市販のＦＴＡ Ｅｌｕｔｅ（商標）のような多孔性のセルロース系紙である。この方法の性能により、核酸、特に貯蔵するには不安定な生体分子であることが広く知られているＲＮＡの乾燥形態（例えば、固体マトリクス上）における周囲温度での貯蔵が可能になる。この方法に利用される試料としては、制限されることはないが、ヒトを含めたあらゆる生物から得られる血液、血清、組織、及び唾液のような生物学的試料がある。

【0021】

上に記述した方法は場合により、さらなる分析のために核酸を固体マトリクスから回収する工程を含み得る。例えば、核酸は、固体マトリクス（例えば、セルロース紙）を水溶液、上で定義された緩衝剤溶液、又は有機溶液中に再水和することによって回収し得る。或いは、核酸は、電気溶出によって固体マトリクスから回収することができよう。当業者には了解されるように、固体マトリクスから核酸を回収することができるあらゆる方法を使用して開示されている方法を実施し得る。

【0022】

用語「核酸」は、あらゆる形態のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）、並びに組換えＲＮＡ及びＤＮＡ分子又はヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡ若しくはＲＮＡの類似体をいう。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であることができる。鎖はコード鎖又は非コード鎖を含むことができる。天然のＲＮＡ又はＤＮＡ分子の核酸の断片が本発明に包含され、開示されている組成物及び方法を使用して回収し得る。「断片」は核酸（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）の一部分を指す。

【実施例】

【0023】

以下の実施例は例証のためのものであり、限定するものではない。

【0024】

実施例１ 一般的なＲＮＡ分析
培養ヒトリンパ球細胞株（すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞）を全細胞ＲＮＡ源として利用した。細胞を、表示した試薬で含浸させた７−ｍｍセルロースディスク上で乾燥し、室温で１０日間デシケーターキャビネット内に貯蔵し、細胞内核酸を標準的なプロトコルに従って電気溶出した。簡潔にいうと、ディスクを１５μＬのヌクレアーゼを含まない水中２ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫで再水和して余分なタンパク質を除去し、〜３０ｍｉｎ乾燥した。パンチを１％Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）アガロースゲルの個々のウェルに入れ、ホルムアミドを含有する１Ｘ Ｇｅｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ II（Ａｍｂｉｏｎ）に懸濁させた。細胞内核酸を１１０ボルトで１〜２時間電気泳動させ、ＲＮＡとＤＮＡをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で後染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出した。全ての機器と表面は、セルロースからの電気溶出中及びその後の細胞ＲＮＡの完全性を保存するためにＲＮＡＺａｐ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した。ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｌａｄｄｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び筋肉から精製したヒト全ＲＮＡ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を含めて内部標準をアガロースゲルに含ませて、ＲＮａｓｅの汚染をモニターすると共に対照のｒＲＮＡバンドを同定した。

【0025】

ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて電気泳動図をデジタル式に定量化した。簡潔にいうと、垂直の線を各々のレーンの頂部から底部に引き、画素強度（グレー値任意単位）を、Ｐｌｏｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ関数を用いて線間隔（ｃｍ）の関数としてプロットした。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ ｒＲＮＡに対応するピークを同定し、２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡの比の値を計算するのに用いた。

【0026】

図１は、電気溶出を用いてセルロースから回収された核酸の代表的な電気泳動図を示す。高分子量のゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ ｒＲＮＡバンドが示されている。

【0027】

図１は、さらに、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いたＤＮＡ及びＲＮＡの定量化を示す。パネルＡの各レーンの上から下まで垂直の線が引かれており、画素強度（グレー値任意単位）がＰｌｏｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ関数を用いて線間隔（ｃｍ）の関数としてプロットされている。ゲノムＤＮＡ及び２８ｓ／１８ｓ ｒＲＮＡに対応するピークを「箱」に囲って示す。

【0028】

実施例２ ＲＮＡの抽出及び貯蔵のための好都合な条件の経験的な決定
この実施例の主たる目的は、セルロース紙上のＲＮＡの保存に対する、各々の単一の因子の効果、及び試験した因子（例えば、キレート化剤、緩衝剤、ｐＨ、タンパク質変性剤、還元剤、及びペプチドＲＮａｓｅ阻害剤）の組合せの効果を評価することであった。この実施例の追加の局面は、還元剤（ＤＴＴ）の存在が、タンパク質変性剤の効果を高めることが可能であるか否かを評価することであった。

【0029】

ここでもＪｕｒｋａｔ細胞を全細胞ＲＮＡ源として利用し、細胞を直接セルロース紙試料上に付け、空気−乾燥して典型的な末端使用者の用途を模倣した。先の実施例１に記載したプロトコルに従って、全細胞ＲＮＡを電気溶出により１％アガロースゲル中に回収し、既知の標準に基づいて２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡ含量を分析した。図２のグラフの各バーの下に挙げた成分を含有する試料を１０日間室温でデシケーターキャビネット内に貯蔵した後分析した。

【0030】

実施例２の結果を図２に示す。各バーの上の数字は、２８ｓと１８ｓ ｒＲＮＡの比の値に対応する。２８ｓ：１８ｓの比の値＞１は一般にインタクトなＲＮＡを示す。ＲＮａｓｅを不活化する還元剤（ＤＴＴ）若しくはＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎを含まない試料、又はアルカリ性のｐＨを有する試料を含めて幾つかの組成物はｒＲＮＡを安定化しなかった。ＧＩＴＣ、ＤＴＴ、及び中性の緩衝剤を含有する試料は試験した全ての他の試薬の組合せより性能が優れていた。

【0031】

実施例３ ＲＮＡの抽出及び貯蔵のための好都合な条件の継続した経験的な決定
ＲＮＡを貯蔵するための鍵となる重要な成分が実施例２で同定された後、ＤＴＴ及びＳＤＳの単独又は組合せのＲＮＡを保存する能力に対する効果、並びにＧＩＴＣ／ＤＴＴの組合せにフリーラジカル捕捉剤及びキレート化剤を追加することの、実施例２で好都合なＲＮＡ安定化特性を性能に対する効果を調べるために実施例３を立案した。

【0032】

Ｊｕｒｋａｔ細胞を直接セルロース紙試料上に付け、空気−乾燥して典型的な末端使用者の用途を模倣した。先の実施例１に記載したプロトコルに従って全細胞ＲＮＡを電気溶出により１％アガロースゲル中に回収し、既知の標準に基づいて２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡ含量を分析した。セルロース試料を１３日間室温でデシケーターキャビネット内に貯蔵した後分析した。各バーの上の数字は２８ｓ対１８ｓ ｒＲＮＡの比の値に対応する。２８ｓ：１８ｓの比の値＞１は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例３の結果は図３に示した。

【0033】

実施例４ ＲＮＡの抽出及び貯蔵のための好都合な条件の継続した経験的な決定
ＲＮＡを貯蔵するための追加の重要な成分が実施例３で同定された後、より良好な安定性を有し臭いがずっと少ない代わりの還元剤（ＴＣＥＰ）をＤＴＴの代わりに用いることができるかどうか調べるために実施例４を立案した。本実施例に導入されたもう１つの因子はバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ）、すなわち小分子ＲＮａｓｅ阻害剤であった。これらの変更を比較し、ｒＲＮＡを安定化する能力を評価した。

【0034】

Ｊｕｒｋａｔ細胞を直接セルロース紙試料に付け、空気−乾燥して典型的な末端使用者の用途を模倣した。先の実施例１に記載したプロトコルに従って、全細胞ＲＮＡを電気溶出により１％アガロースゲル中に回収し、既知の標準に基づいて２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡ含量を分析した。セルロース試料を１０日間室温でデシケーターキャビネット内に貯蔵した後分析した。各バーの上の数字は２８ｓ対１８ｓ ｒＲＮＡの比の値に対応する。２８ｓ：１８ｓの比の値＞１は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例４の結果は図４に示した。

【0035】

実施例５ セルロース上におけるＲＮＡの貯蔵に対する選択組成物の長期の性能
実施例５は、選択組成物の３０日間室温で貯蔵後の長期の性能を評価するために立案された。Ｊｕｒｋａｔ細胞を直接セルロース紙試料上に付け、空気−乾燥して典型的な末端使用者の用途を模倣した。先の実施例１に記載したプロトコルに従って、全細胞ＲＮＡを電気溶出により１％アガロースゲル中に回収し、既知の標準に基づいて２８ｓ：１８ｓ ｒＲＮＡ含量を分析した。セルロース試料を３０日間室温でデシケーターキャビネット内に貯蔵した後分析した。各バーの上の数字は２８ｓ対１８ｓ ｒＲＮＡの比の値に対応する。２８ｓ：１８ｓの比の値＞１は一般にインタクトなＲＮＡを示す。実施例５の結果は図５に示した。

【0036】

実施例６ 血液由来のＲＮＡの安定性分析
実施例６は、様々な緩衝条件で新鮮な全血を有する選択紙組成物の性能を評価するために立案された。およそ５０μＬのラット全血を被験体の尾静脈から採取し、表示した緩衝剤成分で調製されたＲＮＡ安定化用の紙上にスポットして付けた。カードを乾燥し、周囲温度であるが制御された湿度（〜２０％相対湿度）で５〜２２日間貯蔵した。ＲＮＡを７ｍｍセンターパンチから溶解緩衝剤中に抽出し、当技術分野で公知のプロトコルに従ってシリカ−膜スピンカラムに通して精製した。精製及び溶出後、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＲＩＮ）を、ＲＮＡ ６０００ Ｐｉｃｏ ＬａｂＣｈｉｐｓを用いるＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで測定した。慣習により、ＲＩＮ＞５は良好であるが、ＲＩＮ＞６はＲＴ−ＰＣＲ又はマイクロアレイ適用のような定量的下流分析に最良である。実施例６の結果は図６に示す。

【0037】

実施例７ ＲＮＡ安定性に対するＵＶ保護の影響
実施例７は、選択乾燥マトリクス中に存在するＵＶ抑制剤及び遊離基捕捉剤によるｍＲＮＡ保護を立証するために立案された。ＤＮＡを含まない全Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ（１μｇ）を、表示した成分を含有するＲＮＡ紙上に二つ組で(in duplicate)でスポットした。各々のカードを分割し、一方の半分を暗所に３５℃で２０時間保ち、他の半分はＱ−ＳＵＮ Ｘｅ−１ Ｘｅｎｏｎ試験チャンバー内で２０時間（３５℃、０．３Ｗ／ｃｍ²、３４０ｎｍ）処理して、太陽光の全スペクトルを複製した（全エネルギー２１．７ｋＪ／ｍ²）。各々の試料から１．２ｍｍのパンチを採り、直接逆転写酵素反応液中に滴下してｃＤＮＡライブラリーを作成し、次いでこれをｑＰＣＲによりＨＰＲＴ１及びクラスリンｍＲＮＡに特異的なプライマーに対して探索した(probed)。ＵＶに露光した試料に対するサイクル閾値（Ｃ_T）を暗所に貯蔵した未処理のつがいの一方のＣ_Tから差し引いた。実施例７の結果は図７に示す。

【0038】

実施例８ 周囲条件下での紙上の還元剤の安定性
Ｗｈａｔｍａｎ（商標）の３１ＥＴＦセルロース系紙をＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＧＩＴＣの存在下での増大する濃度のＴＣＥＰ又はＤＴＴに浸した。セルロース系紙を湿度調節をしないで室温で貯蔵した。５、１９、及び１０５日に、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（「ＤＴＮＢ」）を各々の紙試料上に載せた。活性な還元剤の存在下で、瞬時の黄変が観察された。周囲条件下で１０５日までの貯蔵において、全ての濃度のＴＣＥＰ溶液を塗布したセルロース紙は活性のままであり、紙の白色から黄色への色の変化で示されるようにＤＴＮＢを還元することができた。ＤＴＴに浸した紙試料はＤＴＮＢを還元することができなかったので、紙の色は白色のままであった。これらの点はその意味が書面で表わされていないので、本明細書には含めないが、審査官から要請があれば提出する用意がある。ＤＴＮＢの還元に関連する化学反応はＣｌｉｎｅら（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：１５１９５−１５２０３に見られる。

【0039】

実施例９ 還元剤のエージングの定性分析
３１ＥＴＦセルロース紙試料はいろいろな濃度の還元剤ＴＣＥＰ又はＤＴＴを含むＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中にＧＩＴＣを含有していた。紙試料を、１）２１℃、１０％相対湿度、２）２１℃、８０％相対湿度、３）４１℃、１０％相対湿度といういろいろな条件で貯蔵した。

【0040】

０、１、６、及び２５日に、各々の条件でのセルロース紙の試料１０ｍｇをＤＴＮＢ溶液に入れ、簡単に振盪し、カラー画像を撮影した。１日目、各々の環境条件でのＴＣＥＰ試料は全てＤＴＮＢ溶液の色を黄色に変えることができ、還元剤として機能可能なままであることを示した。対照的に、ＤＴＴは２１℃、１０％相対湿度でもＤＴＮＢの存在下で試料を黄色に変化させることができなかった。２５日目、２１℃、１０％相対湿度に貯蔵したＴＣＥＰ紙は機能的な還元活性を示し続けた。しかし、湿度又は温度のいずれかの増加は、還元剤としてのＴＣＥＰ活性の顕著な低下の結果となり、温度と湿度の両方が還元剤としてのＴＣＥＰの機能に関連がある因子であることを示した。

【0041】

実施例１０ セルロース系紙上のＴＣＥＰ活性の定性分析
さらにいろいろな緩衝液（Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、ＭＥＳ、ｐＨ６．２、及びＭＰＯＳ、ｐＨ７．０）中にＧＩＴＣ及びＭＥＨＱを含むＴＣＥＰ組成物、並びに緩衝液を含まない対照試料を調製した。次に、セルロース系紙を各々上記溶液の異なる一つを塗布し、通気した５０℃のオーブンですばやく乾燥し、アルミニウムホイルバッグ内に乾燥剤と共に密封して湿気を低く維持し、次に４℃、室温、又は４１℃で貯蔵した。

【0042】

図に示した（０、１、及び４）週に、ＤＴＭＮを各々の３．６ｍｍの紙パンチに加え、３０分間撹拌した後、４１２ｎｍでの液体の吸光度を測定するＤＴＮＢ比色分析法を用いてＴＣＥＰ活性を分析した。

【0043】

全ての試料は４℃で安定であり、１月およそ１００％の活性を維持する。室温では、１か月、ＴＣＥＰ活性は利用した緩衝剤に基づく変化を示した（例えば、ＭＯＰＳ（１００％）＞緩衝剤なし（９０％）＞ＭＥＳ（８６％）＞Ｔｒｉｓ（８１％））。４１℃で１月後、やはりＴＣＥＰ活性の変化が観察された（例えば、ＭＯＰＳ（６７％）＞ＭＥＳ（６３％）＞Ｔｒｉｓ（４８％）＞緩衝剤なし（３９％））。

【0044】

全ての刊行物、特許文献、及び特許は援用により、個々の刊行物又は特許が各々具体的に表示されているのと同じように、本明細書の一部をなすものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】