特許 6249124 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6249124

(24)【登録日】2017年12月1日

(45)【発行日】2017年12月20日

(54)【発明の名称】有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/06 20060101AFI20171211BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20171211BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/06

   C12N1/02

【請求項の数】14

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2017-87511(P2017-87511)

(22)【出願日】2017年4月26日

【審査請求日】2017年5月10日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000006231

【氏名又は名称】株式会社村田製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100132241

【弁理士】

【氏名又は名称】岡部 博史

(74)【代理人】

【識別番号】100183265

【弁理士】

【氏名又は名称】中谷 剣一

(72)【発明者】

【氏名】萬壽 優

(72)【発明者】

【氏名】渡邉 順子

(72)【発明者】

【氏名】近藤 孝志

(72)【発明者】

【氏名】松本 誠一

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０００−５０１３３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−０８６７３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−０５２３００（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２５５４８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５４１９５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−２１５１０９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、
前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である、フィルター。

【請求項2】

前記貫通孔の形状は、多角形である、請求項１に記載のフィルター。

【請求項3】

前記貫通孔の形状は、長方形である、請求項２に記載のフィルター。

【請求項4】

互いに対向する第１主面と第２主面とを貫通する前記複数の貫通孔を有するフィルター部と、
前記フィルター部の外周を囲むように配置された枠部と、
を備え、
前記フィルター部内において、前記枠部から離れた中央側領域における前記フィルター部の膜厚は、前記中央側領域よりも前記枠部に近い周縁側領域における前記フィルター部の膜厚よりも小さい、請求項１〜３のいずれか一項に記載のフィルター。

【請求項5】

前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のフィルター。

【請求項6】

前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のフィルター。

【請求項7】

有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である、フィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む、濾過方法。

【請求項8】

前記貫通孔の形状は、多角形である、請求項７に記載の濾過方法。

【請求項9】

前記貫通孔の形状は、長方形である、請求項８に記載の濾過方法。

【請求項10】

前記フィルターは、
互いに対向する第１主面と第２主面とを貫通する前記複数の貫通孔を有するフィルター部と、
前記フィルター部の外周を囲むように配置された枠部と、
を備え、
前記フィルター部内において、前記枠部から離れた中央側領域における前記フィルター部の膜厚は、前記中央側領域よりも前記枠部に近い周縁側領域における前記フィルター部の膜厚よりも小さい、請求項７〜９のいずれか一項に記載の濾過方法。

【請求項11】

前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の濾過方法。

【請求項12】

前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の濾過方法。

【請求項13】

前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の濾過方法。

【請求項14】

有核細胞の濾過用フィルターを含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特許文献１には、赤血球と有核細胞と血小板とを含んでなる液体から、細胞捕捉フィルター材を用いて単核細胞と血小板とを濃縮する方法が開示されている。特許文献１の細胞捕捉フィルター材は、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２００９−２８４８６０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルター材では、有核細胞の回収率の向上といった点で、未だ改善の余地がある。

【0005】

本発明は、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、
前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である。

【0007】

本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である、フィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】本発明に係る実施の形態１のフィルターの概略構成図である。

【図2】本発明に係る実施の形態１のフィルターの一部の拡大斜視図である。

【図3】図２のフィルターの一部を厚み方向から見た概略図である。

【図4】本発明に係る実施の形態１のフィルターに支持基材を設けた概略図である。

【図5】本発明に係る実施の形態１の変形例のフィルターの概略図である。

【図6】本発明に係る実施の形態１の別の変形例のフィルターの一部の拡大断面図である。

【図7】本発明に係る実施の形態１の別の変形例のフィルターの一部の拡大断面図である。

【図8】本発明に係る実施の形態１の別の変形例のフィルターの一部の拡大断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

（本発明に至った経緯）
特許文献１では、不織布で構成される細胞捕捉フィルター材を用いて、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させることによって、血液から単核細胞を分離している。しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルターでは、単核細胞の回収率が７４％程度であり、捕捉対象である細胞の回収率の向上といった点で未だ改善の余地がある。

【0011】

本発明者らは、鋭意研究したところ、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とするフィルターを用いて、有核細胞を含む液体に対して濾過を行うことによって、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができることを見出し、本発明に至った。

【0012】

本発明の一態様のフィルターは、
有核細胞の濾過用フィルターであって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、
前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である。

【0013】

このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0014】

前記フィルターにおいて、前記貫通孔の形状は、多角形であってもよい。

【0015】

このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0016】

前記フィルターにおいて、前記貫通孔の形状は、長方形であってもよい。

【0017】

このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0018】

前記フィルターにおいて、更に
互いに対向する第１主面と第２主面とを貫通する前記複数の貫通孔を有するフィルター部と、
前記フィルター部の外周を囲むように配置された枠部と、
を備え、
前記フィルター部内において、前記枠部から離れた中央側領域における前記フィルター部の膜厚は、前記中央側領域よりも前記枠部に近い周縁側領域における前記フィルター部の膜厚よりも小さくてもよい。

【0019】

このような構成により、フィルター部における第１主面および第２主面の少なくともいずれかの表面の一部に凹面を形成することができる。凹面が形成された側で細胞を捕捉するような場合には、流体の表面張力により凹面に流体溜まりが形成されやすくなることから、捕捉された細胞の乾燥を抑制することができる。よって、フィルター部にて捕捉された細胞の取り扱い性を向上させることができる。

【0020】

前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。

【0021】

このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。

【0022】

前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。

【0023】

このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。

【0024】

本発明の一態様の濾過方法は、
有核細胞の濾過方法であって、
金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である、フィルターを準備するステップ、
前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。

【0025】

このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0026】

前記濾過方法において、前記貫通孔の形状は、多角形であってもよい。

【0027】

このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0028】

前記濾過方法において、前記貫通孔の形状は、長方形であってもよい。

【0029】

このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。

【0030】

前記濾過方法において、
前記フィルターは、
互いに対向する第１主面と第２主面とを貫通する前記複数の貫通孔を有するフィルター部と、
前記フィルター部の外周を囲むように配置された枠部と、
を備え、
前記フィルター部内において、前記枠部から離れた中央側領域における前記フィルター部の膜厚は、前記中央側領域よりも前記枠部に近い周縁側領域における前記フィルター部の膜厚よりも小さくてもよい。

【0031】

このような構成により、フィルター部における第１主面および第２主面の少なくともいずれかの表面の一部に形成された凹面で細胞を捕捉することができる。流体の表面張力により凹面に流体溜まりが形成されやすくなることから、捕捉された細胞の乾燥を抑制することができる。よって、フィルター部にて捕捉された細胞の取り扱い性を向上させることができる。。

【0032】

前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。

【0033】

このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。

【0034】

前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。

【0035】

このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。

【0036】

前記濾過方法において、前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含んでもよい。

【0037】

このような構成により、生細胞と死細胞とを分離することができる。

【0038】

本発明の一態様のキットは、
有核細胞の濾過用フィルターを含む、前記濾過方法を実施するためのキットであって、
前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である。

【0039】

このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0040】

以下、本発明に係る実施の形態１について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。

【0041】

（実施の形態１）
［フィルターの構成］
図１は、本発明に係る実施の形態１のフィルター１０の概略構成図である。図２は、本発明に係る実施の形態１におけるフィルター１０の一部の拡大斜視図である。図１及び図２中のＸ、Ｙ、Ｚ方向は、それぞれフィルター１０の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図１に示すように、フィルター１０は、フィルター部１１と、フィルター部１１の外周に設けられた枠部１５とを備える。図２に示すように、フィルター１０は、互いに対向する第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを有している。フィルター部１１は、第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを貫通する複数の貫通孔１２が形成されたフィルター基体部１４を備える。

【0042】

フィルター１０は、有核細胞を含む液体（細胞懸濁液）をフィルター部１１に通過させることによって、有核細胞を濾過するものである。

【0043】

本明細書において、「有核細胞」とは、核小体と細胞質とが核膜によって隔てられている細胞である。

【0044】

＜材質＞
フィルター１０の基体部分を形成するフィルター基体部１４を構成する材料は、金属及び／又は金属酸化物を主成分としている。フィルター基体部１４は、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物であってもよい。

【0045】

フィルター１０の最表層は、細胞懸濁液へ溶出しにくい金属及び／又は金属酸化物で構成されていてもよい。例えば、フィルター１０の最表層が、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である金属で覆われている場合、フィルター１０を構成する材料が、細胞懸濁液へ溶出することを抑制することができる。これにより、細胞へのストレスを低減することができる。あるいは、フィルター１０の最表層は、親水性の材料で構成されていてもよい。例えば、水系の細胞懸濁液を処理する場合に、処理時間を短縮することができるため、細胞へのストレスを低減することができる。

【0046】

＜外形＞
フィルター１０の外形は、例えば、円形、長方形、又は楕円形である。実施の形態１では、フィルター１０の外形は、略円形である。フィルター１０の外形を略円形にすることによって、フィルター１０の主面（例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１）に対して流体を均一に流すことができる。なお、本明細書において、「略円形」とは、短径の長さに対する長径の長さの比が１．０以上１．２以下であることをいう。

【0047】

＜フィルター部＞
フィルター部１１は、複数の貫通孔１２が形成された板状構造体である。フィルター部１１の形状は、例えば、円形、長方形、楕円形である。実施の形態１では、フィルター部１１の形状は、略円形である。フィルター部１１の形状を略円形にすることによって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して流体を均一に流すことができる。

【0048】

図３は、フィルター部１１の一部を厚み方向（Ｚ方向）から見た概略図である。図３に示すように、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２上に周期的に配置されている。具体的には、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１においてマトリクス状に等間隔で設けられている。

【0049】

実施の形態１では、貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見て、長方形の形状を有する。図３に示すように、貫通孔１２の形状は、Ｘ方向に長辺ｄ１、Ｙ方向に短辺ｄ２の長方形である。なお、貫通孔１２は、Z方向から見て、正方形以外の形状を有する。貫通孔１２は、Z方向から見て、例えば、菱形、多角形などの形状であってもよい。なお、多角形は、正方形を除く正多角形を含んでいてもよい。

【0050】

実施の形態１では、貫通孔１２の長辺ｄ１は、例えば、短辺ｄ２の１．２倍以上１．８倍以下で形成されている。

【0051】

実施の形態１では、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して垂直な面に投影した貫通孔１２の形状（断面形状）は、長方形である。具体的には、貫通孔１２の断面形状は、フィルター１０の半径方向の一辺の長さがフィルター１０の厚み方向の一辺の長さより長い長方形である。なお、貫通孔１２の断面形状は、長方形に限定されず、例えば、平行四辺形又は台形等のテーパー形状であってもよいし、対称形状であってもよいし、非対称形状であってもよい。

【0052】

実施の形態１では、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側（Ｚ方向）から見て長方形の各辺と平行な２つの配列方向、即ち図３中のＸ方向とＹ方向に等しい間隔で設けられている。このように、複数の貫通孔１２を長方格子配列で設けることによって、開口率を高めることが可能であり、フィルター１０に対する流体の通過抵抗を低減することができる。このような構成により、処理時間を短くし、細胞へのストレスを低減することができる。また、複数の貫通孔１２の配列の対称性が向上するため、フィルターの観察が容易になる。

【0053】

なお、複数の貫通孔１２の配列は、長方格子配列に限定されず、例えば、準周期配列、又は周期配列であってもよい。周期配列の例としては、方形配列であれば、２つの配列方向の間隔が等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列又は正三角格子配列などであってもよい。なお、貫通孔１２は、フィルター部１１に複数設けられていればよく、配列は限定されない。

【0054】

なお、貫通孔１２の開口を画定する各辺が接続される角部は、Ｒ加工されていてもよい。即ち、貫通孔１２の角部は、丸く形成されていてもよい。このような構成により、貫通孔１２の角部において、細胞が傷つくのを抑制し、細胞の活性をより保つことができる。

【0055】

貫通孔１２の間隔は、分離する細胞の種類（大きさ、形態、性質、弾性）又は量に応じて適宜設計されるものである。ここで、貫通孔１２の間隔とは、図３に示すように、貫通孔１２をフィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、任意の貫通孔１２の中心と隣接する貫通孔１２の中心との距離ｂ１及びｂ２を意味する。具体的には、間隔ｂ１は、貫通孔１２の短辺方向（X方向）における貫通孔１２の中心と隣接する貫通孔１２の中心との距離を意味する。間隔ｂ２は、貫通孔１２の長辺方向（Y方向）における貫通孔１２の中心と隣接する貫通孔１２の中心との距離を意味する。なお、実施の形態１において、任意の貫通孔１２の中心とは、長方形の貫通孔１２の対角線の交点を意味する。

【0056】

周期配列の構造体の場合、貫通孔１２の間隔ｂ１は、例えば、貫通孔１２の長辺ｄ１の１倍より大きく１０倍以下であり、好ましくは貫通孔１２の長辺ｄ１の３倍以下である。貫通孔１２の間隔ｂ２は、例えば、貫通孔１２の短辺ｄ２の１倍より大きく１０倍以下であり、好ましくは貫通孔１２の短辺ｄ２の３倍以下である。あるいは、例えば、フィルター部１１の開口率は、１０％以上であり、好ましくは開口率は、２５％以上である。このような構成により、フィルター部１１に対する流体の通過抵抗を低減することができる。そのため、処理時間を短くすることができ、細胞へのストレスを低減することができる。なお、開口率とは、（貫通孔１２が占める面積）／（貫通孔１２が空いていないと仮定したときの第１主面ＰＳ１の投影面積）で計算される。

【0057】

貫通孔１２の内接楕円の長径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。本明細書では、「貫通孔１２の内接楕円」とは、長径と短径とを有する楕円であり、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２内に描ける楕円のうち長径が最も大きい楕円を意味する。即ち、「貫通孔１２の内接楕円」とは、貫通孔１２を構成するフィルター基体部１４の内壁に接する楕円のうち長径が最も大きい楕円を意味する。言い換えると、「貫通孔１２の内接楕円」とは、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２の開口を画定するすべての辺に接する楕円を意味する。また、「貫通孔１２の内接楕円」の長径と短径とは、異なる長さであってもよいし、同じ長さであってもよい。本明細書において、「貫通孔１２の内接楕円」は、真円を含んでもよい。

【0058】

また、本明細書では、「有核細胞の核の大きさ」とは、有核細胞を液中に配置して顕微鏡で観察し、有核細胞の核の外周の任意の２つの点を結んだ線のうち、最長なものを有核細胞の核の長さとした場合、複数個の有核細胞の核の長さの平均値を意味する。

【0059】

複数の貫通孔１２の寸法は、略同一に設計されている。同じ形状の複数の貫通孔１２を周期配列した構成である場合、複数の貫通孔１２の大きさにおける標準偏差は小さい方が好ましい。

【0060】

フィルター部１１は、フィルター部１１の中心から外側に向かって均一な膜厚を有している。言い換えると、フィルター部１１のＺ方向に切断した場合、フィルター部１１は、平板状の断面形状を有する。フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２を画定する辺のうち最も短い辺（例えば、短辺ｄ２）の０．１倍より大きく１００倍以下が好ましい。より好ましくは、フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２の短辺ｄ２の０．５倍より大きく１０倍以下である。このような構成により、流体に対するフィルター１０の抵抗を低減することができ、処理時間を短くすることができる。その結果、細胞へのストレスを低減することができる。

【0061】

フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）の算術平均粗さは、有核細胞の核の大きさよりも小さいことが好ましい。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、細胞の回収率を高くすることができる。なお、算術平均粗さの測定は、株式会社アルバック製の触針式表面形状測定機ＤＥＫＴＡＫ１５０（登録商標）を用い、フィルター部１１の表面のうち５個所の測定値の平均値をフィルター部１１の算術平均粗さとした。

【0062】

フィルター部１１において、有核細胞を含む液体が接触する第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されていてもよい。具体的には、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、凹凸がなく均一な平面で形成されていてもよい。言い換えると、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上の複数の貫通孔１２の開口が同一平面上に形成されている。また、フィルター部１１のうち貫通孔１２が形成されていない部分であるフィルター基体部１４は、繋がっており、一体に形成されている。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。

【0063】

フィルター部１１の貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。即ち、フィルター部１１を第１主面ＰＳ１側から見た場合に、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口と重なるように設けられている。実施の形態１において、貫通孔１２は、その内壁が第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直となるように設けられている。

【0064】

＜枠部＞
枠部１５は、フィルター部１１の外周に設けられており、フィルター部１１に比べて単位面積当たりの貫通孔１２の数が少ない部分である。枠部１５における貫通孔１２の数は、フィルター部１１における貫通孔１２の数の１％以下である。枠部１５の厚みは、フィルター部１１の厚みよりも厚くてもよい。このような構成により、フィルター１０の機械強度を高めることができる。

【0065】

フィルター１０を装置に接続して使用する場合、枠部１５は、フィルター１０と装置とを接続する接続部として機能してもよい。また、枠部１５には、フィルターの情報（貫通孔１２の寸法など）を表示してもよい。

【0066】

枠部１５は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、リング状に形成されている。フィルター１０を第１主面ＰＳ１側から見て、枠部１５の中心は、フィルター部１１の中心と一致する。即ち、枠部１５は、フィルターと同心円上に形成されている。

【0067】

フィルター１０は、取り扱いやすさ及びシステムとの接合のしやすさの観点から、治具に固定されて使用されてもよい。治具は、例えば、ガンマ滅菌可能な材料で構成することができる。治具は、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコンゴム、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリスルフォン、天然ゴム、ラテックス、ウレタンゴム、シリコンゴム、エチレン酢酸ビニル、ポリエステル類、エポキシ類、フェノール類、シリカ、アルミナ、金、白金、ニッケル、ステンレス、チタン、などを含む材料で形成されていてもよい。このような材料で治具を構成することにより、細胞へのストレスを低減することができる。

【0068】

［濾過方法］
フィルター１０を用いた濾過方法について説明する。

【0069】

まず、フィルター１０を準備する。この工程では、有核細胞の核の大きさに応じて貫通孔１２のサイズを選択したフィルター１０を準備する。具体的には、濾過対象となる有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２を有するフィルター１０を準備する。

【0070】

例えば、フィルター１０を準備する工程では、複数個の有核細胞の核の大きさをミクロメーター又は血球計算盤などを用いて確認することによって、有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２のサイズを有するフィルター１０を選択してもよい。あるいは、複数個の有核細胞を写真撮影し、複数個の有核細胞の核の大きさを測長することによって、有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２のサイズを有するフィルター１０を選択してもよい。なお、フィルター１０の選択は、これらに限定されない。

【0071】

フィルター１０は、装置に取り付けられる。具体的には、フィルター１０の枠部１５を挟持することによって、フィルター１０が装置に取り付けられる。

【0072】

次に、細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる。本明細書において、「細胞懸濁液」とは、有核細胞を含む流体である。多くの場合、有核細胞を含む流体は、液体である。液体としては、例えば、アミノ酸、タンパク質、血清、などを含んだ培養溶液、リン酸緩衝生理食塩水、又は水である。細胞懸濁液には、細胞と流体の他に、樹脂製粒子などの非生物由来物質、骨片又は肉片などの組織の一部、死細胞などを含んでいてもよい。

【0073】

このように、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させることによって、液体から有核細胞を分離する。実施の形態１では、フィルター部１１の貫通孔１２の内接楕円の長径は、有核細胞の核の大きさよりも小さく設計されている。このため、有核細胞は、貫通孔１２を通過せずに、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に捕捉される。

【0074】

細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる方法としては、例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して略鉛直上方から重力を利用して細胞懸濁液を通過させる方法がある。この他に、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた上で細胞懸濁液に圧力を加えて通過させる方法（押圧）、又はフィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させて、第２主面ＰＳ２から吸引して細胞懸濁液を通過させる方法（吸引）などがある。なお、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させる工程においては、細胞にストレスをなるべく与えないことが好ましい。例えば、圧力を加える場合、有核細胞が変形しない程度の圧力とすることが好ましい。より好ましくは、圧力を加えずに、液体の自重により、液体をフィルター部１１に通過させることである。あるいは、フィルター部１１の開口率を高めることによって処理時間を短縮し、有核細胞にストレスがかかっている時間を少なくすることが好ましい。

【0075】

また、液体中に有核細胞が浮遊した状態で細胞懸濁液をフィルター１０に通過させてもよい。液体中に浮遊した有核細胞は、ほぼ球形状となるため、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができる。即ち、捕捉したい有核細胞の寸法精度を向上させることができる。

【0076】

また、フィルター１０に複数回通過させることによって、捕捉対象である有核細胞の寸法精度を高めることができる。

【0077】

フィルター１０を用いた濾過方法において、例えば、濾過用容器を用いて、濾過を行ってもよい。濾過用容器は、例えば、外形１４ｍｍ、内径６ｍｍ、高さ５５ｍｍの円筒形状の容器であり、底部にフィルター１０を取り付けることができる。なお、濾過容器は、これに限定されず、様々な形状及び寸法の容器を使用してもよい。

【0078】

［フィルターの製造方法］
フィルター１０の代表的な製造方法について説明する。フィルター１０は、以下の工程により製造される。

【0079】

＜給電膜の形成＞
スパッタ装置を用いて、シリコン基板の上面にＣｕの給電膜を形成する。この給電膜は、後述するフィルター１０のフィルター基体部１４を形成するときの給電源となる。このとき、シリコン基板と給電膜との接着性確保を目的としてＴｉ等の中間層を形成してもよい。

【0080】

Ｃｕの給電膜を形成する条件は、以下の通りである。
スパッタリングガス：アルゴンガス
スパッタリング装置の真空度：５．０×１０^−４Ｐａ
印加電力：ＤＣ５００Ｗ
スパッタ時間：Ｃｕ膜形成時／２７分
Ｔｉ膜形成時／３分５秒

【0081】

＜レジスト像の形成＞
シリコン基板の上面に形成された給電膜上にレジスト像を形成する。
スピンコーター等を用いて、シリコン基板の上面に形成された給電膜上に所定の膜厚のレジスト膜を形成する。次に、所定のパターンが形成されたフォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。

【0082】

レジスト膜塗布の条件は、以下の通りである。
レジスト剤：ノボラック系樹脂＋有機溶剤
スピンコーターの回転数：１１３０ｒｐｍ
レジスト膜厚：２μｍ
スピンコーターにて上記レジスト剤をシリコン基板上面に塗布した後に窒素雰囲気下で１３０℃にて溶剤を揮発させた後に冷却することで、レジスト膜を形成する。

【0083】

波長３６５ｎｍを含んだエネルギー密度２５００Ｊ／ｍ^２の光線を０．２５秒間照射して、レジスト剤を露光する。

【0084】

露光部分をアルカリ性溶液に接触させて現像処理する。

【0085】

＜フィルター基体部の形成＞
レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなるフィルター基体部１４を形成する。

【0086】

フィルター基体部１４の形成の条件は、以下の通りである。
前処理：希硫酸に６０秒浸漬させることで給電膜の表面を活性化する。
めっき液：スルファミン酸ニッケルめっき液 液温５５℃ ｐＨ＝４．０
めっき速度：０．５μｍ／ｍｉｎ
めっき：揺動させながら、電解めっきを行う。

【0087】

＜レジストの溶解及び剥離＞
フィルター基体部１４にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させて、レジストを剥離する。

【0088】

＜支持基材の形成＞
フィルター１０を用いて濾過を行うに際し、必要に応じてフィルター１０に支持基材を設けてもよい。

【0089】

図４は、支持基材１３が取り付けられたフィルター１０の概略構成を示す。図４に示すように、フィルター１０の第２主面ＰＳ２側に支持基材１３が設けられてもよい。支持基材１３には、正方形状の複数の開口部１３ａが設けられている。支持基材１３の厚みは、例えば、１４μｍであり、開口部１３ａの一辺、即ち桟の間隔Ａは、２６０μｍであり、桟の幅Ｂは、１４μｍである。

【0090】

このように支持基材１３を設けることで、濾過中にフィルター１０が破損することを防止できる。支持基材は以下の工程により作製される。

【0091】

フィルター１０の基体が形成されたシリコン基板の上面に再度、感光性レジストを塗布してレジスト膜を形成した後に、フォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。このとき、レジスト像がフィルター１０の基体を複数またぐように露光、現像処理を行う。なお、レジスト像がフィルター１０の基体をまたいでいる部分は、フィルター１０の完成後に、フィルター１０の開口部となる。つまり、レジスト像がまたぐフィルター１０の基体の数は、フィルター１０に求められる開口率に応じて適宜決定される。

【0092】

レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなる支持基材を形成する。なお、支持基材の幅は、フィルター１０に求められる強度に応じて適宜決定される。

【0093】

支持基材にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させることで、レジストを剥離する。

【0094】

＜給電膜の除去＞
給電膜を除去し、シリコン基板から、フィルター基体部１４及び支持基材を分離することで有核細胞の濾過用のフィルター１０が完成する。

【0095】

給電膜の除去は、６０％の過酸化水素水と酢酸と純水を１：１：２０の混合比で作製した水溶液に、２５℃の環境下で４８時間浸漬することによって行う。

【0096】

［効果］
実施の形態１に係るフィルター１０によれば、以下の効果を奏することができる。

【0097】

フィルター１０は、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分としている。また、フィルター１０は、複数の貫通孔１２が形成されたフィルター部１１を備えている。このような構成により、フィルター部１１の貫通孔１２が変形しにくく、捕捉対象である有核細胞を捕捉し、有核細胞の回収率を向上させることができる。

【0098】

貫通孔１２の内接楕円の長径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。

【0099】

貫通孔１２の形状が長方形に形成されている。このような構成により、正方形形状の貫通孔に比べて濾過時間を減少させることができる。具体的に説明すると、有核細胞の細胞質は、核に比べて変形しやすい。正方形形状の貫通孔の場合、フィルター部で有核細胞を捕捉すると、細胞質が変形し、変形した細胞質によって貫通孔が塞がれてしまう可能性がある。一方、長方形形状の貫通孔１２においては、有核細胞を捕捉したときに細胞質が変形して貫通孔１２が一部塞がれたとしても、貫通孔１２の他の部分から液体が通り抜けることができる。したがって、長方形形状の貫通孔１２においては、正方形形状の貫通孔に比べて、液体を通過させやすく、濾過時間を減少させることができる。

【0100】

フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されている。このような構成により、第１主面ＰＳ１で捕捉した有核細胞を容易にフィルター部１１から分離させることができるため、回収が簡単になる。

【0101】

有核細胞の核の形状は、真円以外に楕円形等の様々な形状が存在する。フィルター１０では、貫通孔１２の内接楕円の長径は、有核細胞の核の大きさより小さく形成されており、且つ、貫通孔１２の内接楕円は、貫通孔１２の開口を画定するすべての辺に接する楕円である。このような構成により、真円形状の核以外の様々な形状の核についても確実に捕捉することができ、回収率を向上させることができる。

【0102】

また、フィルター１０を用いた濾過方法では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、捕捉対象である有核細胞を確実に捕捉することができるため、回収率を向上させることができる。

【0103】

有核細胞は、種類、培養条件、継代数等によって、核の大きさが変動する。例えば、同じ細胞であっても、培養した温度、時間又は環境などの培養条件によって、核の大きさが異なってくる。このため、同じ有核細胞であっても核の大きさは様々であり、核の大きさに着目せずに、フィルター１０を準備した場合、有核細胞が貫通孔１２を通過してしまうことがある。フィルター１０を用いた濾過方法では、有核細胞の核の大きさに応じて貫通孔１２のサイズを選択したフィルター１０を準備している。即ち、フィルター１０を用いた濾過方法では、濾過対象の有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２を有するフィルター１０を選択し、濾過に使用するフィルター１０を準備している。このため、フィルター１０を用いた濾過方法では有核細胞をフィルター１０上に確実に捕捉することができ、回収率を向上させることができる。

【0104】

なお、実施の形態１では、貫通孔１２の寸法が略同一である例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔１２の寸法は、それぞれ異なっていてもよい。この場合、貫通孔１２の最大寸法は、有核細胞の核の大きさより小さく設計されていればよい。

【0105】

実施の形態１では、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含む例を説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含んでいなくてもよい。

【0106】

実施の形態１では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、有核細胞を濾過する例について説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０を用いて、生細胞と死細胞とを含む液体から、生細胞と死細胞とを分離してもよい。

【0107】

生細胞と死細胞とを分離する方法としては、例えば、フィルター１０によってフィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に生細胞を捕捉し、死細胞を通過させてもよい。また、フィルター１０によって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に死細胞を捕捉し、生細胞を通過させてもよい。

【0108】

実施の形態１では、フィルター１０と濾過方法について説明したが、これに限定されない。例えば、有核細胞の濾過用のフィルター１０を含む、濾過方法を実施するためのキットとして使用されてもよい。

【0109】

実施の形態１では、フィルター部１１が均一な膜厚を有する例について説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター部１１は、均一な膜厚を有しているのではなく、中央側の膜厚が周縁側に比し小さくなるように形成されていてもよい。

【0110】

図５は、実施の形態１の変形例のフィルター１０Ａを示す。図５に示すように、フィルター１０Ａのフィルター部１１ａ内において、枠部１５から離れた中央側領域Ｒ１１における膜厚Ｔ１が、中央側領域Ｒ１１よりも枠部１５に近い周縁側領域Ｒ１３における膜厚Ｔ３よりも小さく形成されている。さらに、フィルター１０Ａでは、フィルター部１１ａ内において、中央側領域Ｒ１１と周縁側領域Ｒ１３との間に位置する中間領域Ｒ１２における膜厚をＴ２とした場合、それぞれの領域における膜厚は、Ｔ１＜Ｔ２＜Ｔ３の関係を満たしている。すなわち、フィルター１０のフィルター部１１ａ内において、フィルター部１１ａの中心から放射方向（半径方向外向き）に向かって、膜厚が増加するように、膜厚が設定されている。また、膜厚は、連続的または段階的に増加するようにしてもよい。

【0111】

また、図５に示すように、フィルター１０Ａの第２主面ＰＳ２は平坦面として形成されており、第１主面ＰＳ１におけるフィルター部１１ａに相当する面が、中央側領域よりも周縁側領域が高くなるような凹面として形成されている。フィルター１０Ａの枠部１５は膜厚Ｔ０が概ね一定の厚さに形成され、膜厚Ｔ０は周縁側領域Ｒ１３における膜厚Ｔ３以上となっている。

【0112】

フィルター１０Ａは、例えば、直径６ｍｍ（枠部１５の外形）、枠部１５の幅寸法１ｍｍ、隣接する貫通孔１２ａの間隔が１μｍ以上５００μｍ以下に形成される。また、フィルター部１１ａにおいて、枠部１５に近い周縁側領域Ｒ１３おける膜厚Ｔ３が１．１μｍ、中央側領域Ｒ１１における膜厚Ｔ１が０．８μｍに形成される。

【0113】

フィルター１０Ａによれば、フィルター部１１ａにおいて、中央側領域Ｒ１１の膜厚Ｔ１が周縁側領域Ｒ１３の膜厚Ｔ３よりも小さくなるように、第１主面ＰＳ１が凹面として形成されている。これにより、凹面が形成された第１主面ＰＳ１で細胞を捕捉するような場合には、流体の表面張力により凹面に流体溜まりが形成されやすくなる。例えば、培養液を液溜まりとして凹面に溜めた状態にて捕捉された細胞を取り扱うことにより、細胞の乾燥を抑制しながら、分析等の処理を行うことができる。よって、フィルター部１１ａにて捕捉された細胞の取り扱い性を向上させることができる。

【0114】

また、フィルター部１１ａ内において、中央側領域Ｒ１１から周縁側領域Ｒ１３に向かって、フィルター部１１ａの膜厚が連続的にまたは段階的に増加しているようにすることで、フィルター部１１ａに滑らかな凹面を形成することができる。これにより、表面張力の作用により凹面に流体溜まりを形成しやすくでき、フィルター部１１ａにて捕捉された細胞の取り扱い性をさらに向上させることができる。

【0115】

また、フィルター部１１ａの第２主面ＰＳ２が平坦面であり、第１主面ＰＳ１が凹面としている。これにより、例えば、凹面を利用した流体溜まりを利用したい場合には、凹面である第１主面ＰＳ１側にて細胞を捕捉することができる。一方、流体溜まりを形成せずに流体抜けを良くしたい場合には、平坦面である第２主面ＰＳ２側にて細胞を捕捉することができる。このように目的に応じて第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを使い分けることにより、細胞濾過フィルタの取り扱い性を向上できる。

【0116】

なお、フィルター１０Ａの説明では、フィルター部１１ａ内において、中央側領域Ｒ１１から周縁側領域Ｒ１３に向かって、膜厚が連続的にまたは段階的に増加するように凹面を形成する場合を例としている。しかしながら、フィルター１０Ａはこのような場合についてのみに限られない。例えば、フィルター部１１ａ内において、中央側領域Ｒ１１から周縁側領域Ｒ１３に向かって膜厚が増加している箇所が一部に含まれているような場合であっても構わない。そのような場合であっても、中央側領域Ｒ１１における平均膜厚が、周縁側領域Ｒ１３における平均膜厚よりも小さくなっていれば、フィルター１０Ａの効果を奏することができる。

【0117】

実施の形態１では、貫通孔１２の形状が長方形である例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔１２の形状は、正方形を除く多角形であってもよい。

【0118】

図６は、正六角形形状に形成された貫通孔１２ｂを有するフィルター１０Ｂの一部の拡大断面図を示す。図６に示すように、フィルター１０Ｂのフィルター部１１ｂにおいては、正六角形形状に形成された複数の貫通孔１２ｂが正三角格子配列（ハニカム構造）で形成されている。

【0119】

図７は、正八角形形状に形成された貫通孔１２ｃを有するフィルター１０Ｃの一部の拡大断面図を示す。図７に示すように、フィルター１０Ｃのフィルター部１１ｃにおいては、正八角形形状に形成された複数の貫通孔１２ｃが正方格子で形成されている。

【0120】

図６及び図７に示すように、正多角形形状の貫通孔１２ｂ、１２ｃにおいては、貫通孔１２ｂ、１２ｃの開口を画定する隣り合う辺と辺との間の角度を鈍角にすることができる。即ち、貫通孔１２ａ、１２ｂの角部が、正方形形状の貫通孔と比べて、緩やかになる。このため、貫通孔１２ｂ、１２ｃは、正方形形状の貫通孔に比べて、細胞を傷付けにくいというメリットがある。また、正多角形形状の貫通孔１２ｂ、１２ｃは、正方形形状の貫通孔に比べて、加工がし易いため、加工精度を向上させることができる。即ち、正多角形形状の貫通孔１２ｂ、１２ｃにおいては、正方形形状の貫通孔に比べて変動係数を小さくすることができる。

【0121】

なお、貫通孔１２は、正六角形及び正八角形以外の正多角形状で形成されてもよい。

【0122】

また、貫通孔１２の形状は、異なる長さの辺を含む多角形であってもよい。図８は、多角形状形状に形成された貫通孔１２ｄを有するフィルター１０Ｄの一部の拡大断面図を示す。図８に示すように、フィルター１０Ｄにおいては、貫通孔１２ｄは、Ｙ方向に伸びた横長の六角形形状に形成されている。具体的には、貫通孔１２ｄは、開口を画定する平行な二辺をＹ方向に伸ばした横長の六角形形状で形成されている。

【0123】

このような構成により、フィルター１０Ｄは、正多角形形状の貫通孔１２ｂ、１２ｃと同様の効果を奏すると共に、長方形形状の貫通孔１２と同様の効果を奏することができる。

【0124】

なお、フィルター１０Ｄにおいては、六角形形状の貫通孔１２ｄに限定されず、八角形などの多角形形状の貫通孔であってもよい。また、フィルター１０Ｄの貫通孔１２ｄの延びる方向は限定されない。例えば、貫通孔１２ｄは、Ｘ方向に伸びた縦長の多角形形状で形成されていてもよい。

【実施例】

【0125】

実施の形態１に係るフィルター１０の性能評価を、実施例１−５及び比較例１−３を用いて行った。

【0126】

（１）実施例１−５と比較例１−３のフィルターについて
実施例１−５と比較例１−３のフィルターを、表１に示す仕様で作製した。

【0127】

【表1】

【0128】

なお、表１の配列間隔において、長辺は図３中の符号ｂ１の長さに相当し、短辺は図３中のｂ２の長さに相当する。

【0129】

実施例１−５及び比較例１−３のフィルターは、円形であり、外形の直径７．８ｍｍ、フィルター部１１の直径６ｍｍ、枠部の厚み２μｍである。材質は、ニッケル（Ｎｉ）である。

【0130】

実施例１及び２は、長方形形状の貫通孔１２を有するフィルター１０を用いた。実施例３は、正六角形形状の貫通孔１２ｂを有するフィルター１０Ｂを用いた。実施例４は、正八角形形状の貫通孔１２ｃを有するフィルター１０Ｃを用いた。実施例５は、長方形形状の貫通孔１２ａを有するフィルター１０Ａを用いた。また、実施例５においては、枠部１５から離れた中央側領域におけるフィルター部１１ａの膜厚は、中央側領域よりも枠部１５に近い周縁側領域におけるフィルター部１１ａの膜厚よりも小さい。

【0131】

比較例１は、長方形形状の貫通孔１２を有するフィルター１０を用いた。比較例２は、正六角形形状の貫通孔１２ｂを有するフィルター１０Ｂを用いた。比較例３は、正八角形形状の貫通孔１２ｃを有するフィルター１０Ｃを用いた。

【0132】

これらの実施例１−５及び比較例１−３のフィルターをそれぞれ濾過装置に設置し、細胞懸濁液を濾過することによって、性能評価を行った。なお、前処理として、それぞれのフィルターをエタノール溶液に1分間浸漬し、その後、純水中に１分間浸漬して親水性を高めた。

【0133】

（２）細胞懸濁液について
１００ｍｍディッシュを用いて、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ１６２０培地（Ｌ−グルタミン含有）で、白血病細胞株である浮遊細胞ＨＬ−６０を５日間培養した。

【0134】

１００ｍｍディッシュから培養液の一部を、ピペッティングにより１５ｍＬの遠沈管に移した。次に、培養液が入った遠沈管に対して、回転数１０００ｒｐｍで、３分間の遠心分離を行った後、上清を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞懸濁液を生成した。なお、細胞懸濁液の細胞濃度が１０^５個／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水の添加量を調整した。

【0135】

３０μＬの細胞懸濁液と、１５μＬの蛍光試薬ＤＡＰＩと、をマイクロチューブにて混合して細胞を染色し、染色した細胞懸濁液（細胞染色液）を遮光下にて３７℃で２０分間インキュベートした。その後、スライドガラスの上に細胞染色液１０μＬを滴下し、カバーガラスを重ね、波長３４５ｎｍの励起光源を使用し、４５５ｎｍを中心とするバンドパスフィルターを通して、蛍光顕微鏡により蛍光観察を行った。青紫色に発色した核のサイズを測定したところ、ＨＬ−６０の核の大きさは３．６６μｍであった。なお、ＨＬ−６０の核の大きさは、１００個のＨＬ−６０の核の大きさを測定することによって算出された平均値である。

【0136】

１００ｍｍディッシュ中の培養液の一部に対して、ピペッティングにより細胞を分散させた後、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） ＩＩ ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は５×１０^５個／ｍＬ、活性のある細胞（ＨＬ−６０）の大きさの平均値は１３．４μｍ、生存率は９０％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。

【0137】

１００ｍｍディッシュ中の培養液に対して、さらにＲＰＭＩ１６２０培地を任意の比率で混合することにより、以下のＨＬ−６０細胞懸濁液を作製した。
活性のある細胞（ＨＬ−６０）の濃度・・・３．０６×１０^５個／ｍＬ
液量・・・１ｍＬ

【0138】

なお、室温下のクリーンベンチ内に４時間放置した１００ｍｍディッシュ中の培養液について、上述の方法で細胞の生存率を測定した結果、生存率が８１％に低下した。このことは、細胞を室温で、長時間放置することによって活性が低下することを意味している。

【0139】

（３）濾過方法について
濾過装置に取り付けられた実施例１−５及び比較例１−３のフィルターにおいて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上にピペットで細胞懸濁液を滴下し、第２主面ＰＳ２側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、０．５ｋＰａの圧力で吸引を行った。フィルターを通過した液体（通過液）が約０．８ｍｌとなったことを目視で確認次第、吸引を中止させた。評価は、吸引開始から吸引中止までの時間（濾過時間）、通過液の液量、通過液に含まれる細胞の数を測定することによって行った。

【0140】

（４）評価結果について
表２に評価結果について示す。

【0141】

【表2】

【0142】

実施例１−５においては、細胞（ＨＬ−６０）の回収率が１００％であった。これに対し、比較例１−３では、細胞の回収率が、それぞれ２９．３％、３５．７％、４０．９％であった。

【0143】

表１に示すように、比較例１−３では、貫通孔１２の内接楕円の長径が、それぞれ９．０μｍ、６．６μｍ、６．５μｍであり、細胞（ＨＬ−６０）の核の大きさ３．６６μｍよりも大きい。このため、細胞が貫通孔１２を通過してしまったと考えられる。

【0144】

一方、実施例１−５においては、貫通孔１２の内接楕円の長径は、３．０μｍ以上３．５μｍ以下であり、細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例１−５では、細胞を確実に捕捉することができたと考えられる。

【0145】

なお、本明細書において、「回収率」とは、フィルターの第１主面ＰＳ１上に捕捉した細胞に対する投入した活性のある細胞数の割合を意味し、（投入した活性のある細胞数−通過液に含まれる活性細胞の数）／（投入した活性のある細胞数）で計算した。

【0146】

なお、通過液に含まれる活性細胞の数は、ピペッティングにより通過液中の細胞を分散させた後にマイクロピペットを使用して１０μＬの通過液を１０検体取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標） ＩＩ ＦＬ）にて、上記検体中の細胞の数を計測した。

【0147】

このように、貫通孔１２の内接楕円の長径を、細胞核の大きさよりも小さく設計することで、回収率を向上させることができる。この理由としては、細胞核を取り囲む細胞質は変形しやすく、細胞核は変形しにくい点にある。

【0148】

比較例１−３のように、貫通孔１２の内接楕円の長径が細胞核の大きさよりも大きい場合、たとえ貫通孔１２の内接楕円の長径が細胞全体の大きさよりも小さくても、細胞質が変形することで細胞がフィルター１０を通過してしまうことがある。

【0149】

一方、実施例１−５のように、貫通孔１２の内接楕円の長径を細胞核より小さく設計している場合、細胞核は細胞質と比べて変形しにくいため、比較例１−３と比べて、細胞をフィルター１０上で捕捉しやすい。

【0150】

また、フィルター１０が金属製である点も細胞の回収率の向上に寄与している。金属から成るフィルター１０を使用することで、フィルター１０の貫通孔１２自体の変形量は、メンブレンなどの樹脂性のフィルターと比べて少なくなる。このため、フィルター１０では、更に細胞を捕捉しやすくなっている。

【0151】

なお、有核細胞を濾過するに際し、細胞懸濁液への不純物混入、すなわちフィルター１０を構成する金属が細胞懸濁液へ溶出することを抑制することが好ましいことは言うまでもない。

【0152】

実施例５において、濾過後に、フィルター部１１ａの第１主面ＰＳ１上に捕捉された細胞を観察した。その結果、濾過前の細胞と同様に、細胞の形態が円形であり、活性が保たれていることがわかった。これは、フィルター部１１ａの中央側領域Ｒ１１において液溜まりが生じ、細胞が液溜まりの中に浸された状態でフィルター部１１ａの第１主面ＰＳ１上に捕捉されたためである。

【0153】

ニッケルについて、金属のイオン化傾向の指標である浸漬電位の測定を実施した。リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位を３分間測定したところ、ニッケルの浸漬電位は０．０３Ｖより貴の範囲で推移した。つまり、同条件で測定したときに、少なくとも０．０３Ｖより貴の浸漬電位を示す金属及び／又は金属酸化物であれば、細胞の活性を損なわずに濾過が可能であると言える。

【0154】

また、実施例１、２及び５では、実施例３及び４に比べて濾過時間が短い。これは、貫通孔１２を長方形形状に形成していることによって、細胞の細胞質の変形による目詰まりを抑制することができるためである。具体的には、貫通孔１２の形状が長方形である場合、細胞質の変形によって貫通孔１２の一部が塞がれたとしても、貫通孔１２の他の部分から液体が通過しやすい。このため、実施例１、２及び５では、実施例３及び４に比べて濾過時間が短くなったと考えられる。

【0155】

なお、実施例においては、細胞懸濁液中に有核細胞が１０^５個／ｍＬ以上存在する比較的高い濃度の細胞懸濁液を濾過して有核細胞を捕捉する例について説明したが、フィルター１０は、細胞懸濁液中に有核細胞が数個／ｍＬ程度の極めて低濃度の細胞懸濁液を濾過した場合であっても、回収対象である有核細胞を捕捉することができる。

【0156】

本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。

【産業上の利用可能性】

【0157】

本発明のフィルターは、有核細胞の回収率を向上させることができるため、細胞懸濁液から有核細胞を分離する用途に有用である。

【符号の説明】

【0158】

１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ フィルター
１１、１１ａ、１１ｂ、１１ｃ、１１ｄ フィルター部
１２、１２ａ、１２ｂ、１２ｃ、１２ｄ 貫通孔
１３ 支持基材
１３ａ 開口部
１４ フィルター基体部
１５ 枠部
ＰＳ１ 第１主面
ＰＳ２ 第２主面
Ｒ１１ 中央側領域
Ｒ１２ 中間領域
Ｒ１３ 周縁側領域
Ｔ０、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３ 膜厚

【要約】

【課題】有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターを提供する。
【解決手段】本発明のフィルターは、有核細胞の濾過用フィルターであって、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔（正方形を除く）が形成されており、前記貫通孔の内接楕円の長径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接楕円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する楕円である。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】