特許 6249941 プロバイオティック細菌株およびそれを含有する乳児食向けシンバイオティスク組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6249941

(24)【登録日】2017年12月1日

(45)【発行日】2017年12月20日

(54)【発明の名称】プロバイオティック細菌株およびそれを含有する乳児食向けシンバイオティスク組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20171211BHJP

   A61K 35/74 20150101ALI20171211BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20171211BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20171211BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20171211BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20171211BHJP

   A23L 33/10 20160101ALI20171211BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   A61K35/74 A

   A61P31/04

   A61P1/00

   A61P1/12

   A61K47/44

   A61K9/10

   A61K9/107

   A61K47/28

   A61K47/36

   A61K47/26

   A61K47/46

   A61K47/34

   A23L33/10

【請求項の数】21

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2014-509849(P2014-509849)

(86)(22)【出願日】2012年5月9日

(65)【公表番号】特表2014-513978(P2014-513978A)

(43)【公表日】2014年6月19日

(86)【国際出願番号】IB2012000897

(87)【国際公開番号】WO2013050833

(87)【国際公開日】20130411

【審査請求日】2015年4月28日

(31)【優先権主張番号】MI2011A000793

(32)【優先日】2011年5月9日

(33)【優先権主張国】IT

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 24706

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 24707

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 24708

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 24709

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM 16604

(73)【特許権者】

【識別番号】512233329

【氏名又は名称】プロバイオティカル・ソシエタ・ペル・アチオニ

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＢＩＯＴＩＣＡＬ Ｓ．Ｐ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ジョヴァンニ・モーニャ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン・パオロ・ストロッツィ

(72)【発明者】

【氏名】ルカ・モーニャ

【審査官】 田中 耕一郎

(56)【参考文献】

【文献】 A.Cheikhyoussef, et al., Food Control, 2009, 20, pp553-559

【文献】 MODESTO M，RESISTANCE TO FREEZING AND FREEZE-DRYING STORAGE PROCESSES OF POTENTIAL PROBIOTIC BIFIDOBACTERIA，ANNALS OF MICROBIOLOGY，イタリア，２００４年 １月 １日，V54 N1，P43-48

【文献】 Mario Del Piano, et al., J Clin Gastroenterol., 2010, 44(Supp.1), ppS42-S46

【文献】 LIKOTRAFITI ELENI，MICROBIAL ECOLOGY IN HEALTH AND DISEASE，英国，TAYLOR & FRANCIS，２００４年 ７月 １日，V16 N2-3，P105-112

【文献】 神谷茂、医学のあゆみ、２００３年、207(10)、pp894-898

【文献】 岡村雅史、養鶏の友、２００８年、通巻５５８号、１７−２１頁

【文献】 金森豊、静脈経腸栄養、２０１０年、25(4)、pp923-928

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−Ｃ１２Ｎ １５／９０

Ａ６１Ｋ ３９／００−Ａ６１Ｋ ３９／４４

Ａ６１Ｋ ４９／００−Ａ６１Ｋ ４９／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４、および２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０からなる群から選択されるビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種に属し、病原体大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、病原体サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、病原体クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および病原体カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）に対して抗菌活性を有する、細菌株。

【請求項2】

２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５であるビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種に属し、病原体大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、病原体サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、病原体クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および病原体カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）に対して抗菌活性を有する、細菌株。

【請求項3】

請求項１または２に記載の細菌株であって、病原体大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）が大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７バイオタイプからなる、細菌株。

【請求項4】

細菌混合物を含む食品組成物であって、前記細菌混合物が、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０、および、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５からなる群から選択される、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種、またはビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する少なくとも一つの細菌株を含む、食品組成物。

【請求項5】

小児時期の対象のための、請求項４に記載の食品組成物。

【請求項6】

請求項４−５の一項に記載の食品組成物であって、前記細菌混合物が、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、種子油およびパーム油のうちから選択される植物油中に、添加、または懸濁、または分散される、食品組成物。

【請求項7】

請求項４−６の一項に記載の食品組成物であって、前記食品組成物が、ステロールもしくは植物ステロール、スタノールもしくは植物スタノール、グルコマンナン、コンニャクガムを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、少なくとも一つの植物物質、ならびに／または、フラクトオリゴ糖−ＦＯＳ、ガラクトオリゴ糖−ＧＯＳ、キシロオリゴ糖−ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維もしくはアラビノガラクタン、および／もしくは発酵赤米、および／もしくはオーツ麦、オーツ麦ふすま、大麦、大麦ふすま、および／もしくは凍結乾燥形態のキダチアロエゲル由来のベータグルカンを含む群から選択される、少なくとも一つのプレバイオティック繊維を含むシンバイオティック組成物である、食品組成物。

【請求項8】

請求項４−７の一項に記載の食品組成物であって、前記食品組成物がシメチコンを含む、食品組成物。

【請求項9】

請求項７に記載の食品組成物であって、前記少なくとも一つの植物物質がガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンを含む群から選択される、食品組成物。

【請求項10】

細菌混合物を含むサプリメント製品であって、前記細菌混合物が、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０、および、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５からなる群から選択される、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種、またはビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する少なくとも一つの細菌株を含む、サプリメント製品。

【請求項11】

小児時期の対象のための、請求項１０に記載のサプリメント製品。

【請求項12】

請求項１０−１１の一項に記載のサプリメント製品であって、前記細菌混合物が、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、種子油およびパーム油のうちから選択される植物油中に、添加、または懸濁、または分散される、サプリメント製品。

【請求項13】

請求項１０−１２の一項に記載のサプリメント製品であって、前記サプリメント製品が、ステロールもしくは植物ステロール、スタノールもしくは植物スタノール、グルコマンナン、コンニャクガムを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、少なくとも一つの植物物質、ならびに／または、フラクトオリゴ糖−ＦＯＳ、ガラクトオリゴ糖−ＧＯＳ、キシロオリゴ糖−ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維もしくはアラビノガラクタン、および／もしくは発酵赤米、および／もしくはオーツ麦、オーツ麦ふすま、大麦、大麦ふすま、および／もしくは凍結乾燥形態のキダチアロエゲル由来のベータグルカンを含む群から選択される、少なくとも一つのプレバイオティック繊維を含むシンバイオティック組成物である、サプリメント製品。

【請求項14】

請求項１０−１３の一項に記載のサプリメント製品であって、前記サプリメント製品がシメチコンを含む、サプリメント製品。

【請求項15】

請求項１３に記載のサプリメント製品であって、前記少なくとも一つの植物物質がガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンを含む群から選択される、サプリメント製品。

【請求項16】

疝痛、下痢および腸障害の治療における使用のための、細菌混合物を含む医薬組成物であって、前記細菌混合物が、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０、および、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５からなる群から選択される、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種、またはビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する少なくとも一つの細菌株を含む、医薬組成物。

【請求項17】

小児時期の対象における、疝痛、下痢および腸障害の治療における使用のための、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

請求項１６−１７の一項に記載の使用のための細菌混合物を含む医薬組成物であって、前記細菌混合物が、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、種子油およびパーム油のうちから選択される植物油中に、添加、または懸濁、または分散される、医薬組成物。

【請求項19】

請求項１６−１８の一項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物が、ステロールもしくは植物ステロール、スタノールもしくは植物スタノール、グルコマンナン、コンニャクガムを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、少なくとも一つの植物物質、ならびに／または、フラクトオリゴ糖−ＦＯＳ、ガラクトオリゴ糖−ＧＯＳ、キシロオリゴ糖−ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維もしくはアラビノガラクタン、および／もしくは発酵赤米、および／もしくはオーツ麦、オーツ麦ふすま、大麦、大麦ふすま、および／もしくは凍結乾燥形態のキダチアロエゲル由来のベータグルカンを含む群から選択される、少なくとも一つのプレバイオティック繊維を含むシンバイオティック組成物である、医薬組成物。

【請求項20】

請求項１６−１９の一項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物がシメチコンを含む、医薬組成物。

【請求項21】

請求項１９に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも一つの植物物質がガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンを含む群から選択される、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するプロバイオティック株の選択、およびそれを含有し、乳児食を対象とするシンバイオティック組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

人工的な食事を与えられた乳児は、母乳で育った乳児と比較して、腸内微生物叢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の組成にかなりの違いを示す：特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）およびクロストリジウム属菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）などの、他の潜在的に病原性である微生物を代償に、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）の菌体数の低減が観察され得る。ビフィドバクテリウム属に属する微生物のコロニー形成は、生後最初の４日に、母乳で育った乳児で起こり、ビフィズス菌属はすぐに広く行き渡った微生物群になる。他方、フォーミュラ（ｆｏｒｍｕｌａ）を与えると、大腸菌群、バクテロイデス、クロストリジウム属（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）および連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）から構成される、より異種の細菌叢（ｆｌｏｒａ）が発達する。まさにこれらの理由のため、フォーミュラを与えられた乳児は、腸内感染にかかるより高いリスクを有している。

【0003】

さらに、腸内ガスの過剰産生は、人生の最初の数ヶ月に多数の乳児を苦しめる、いわゆる「疝痛（ｃｏｌｉｃ）」の原因であると見られる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

そのため、乳児において、母乳を与えることによって獲得される、生理学的にビフィズス菌特異的な（ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ）効果を獲得する必要性が感じられる。特に、フォーミュラを与えられた乳児に疝痛を回避するような腸内細菌叢を保証できることが望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本出願人は、鋭意研究を重ねた後、ビフィドバクテリウム属に属する細菌株の選択を確認し、上述の必要性への回答を提供している。

【図面の簡単な説明】

【0006】

（原文に記載なし）

【発明を実施するための形態】

【0007】

本発明の主題は、ビフィドバクテリウム属に属し、添付の独立請求項に開示される特徴を有する細菌株に関する。

【0008】

本発明の主題はまた、添付の独立請求項に開示される、前記細菌株を含有する食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物に関する。前記組成物は、好ましくは小児時期の対象における、疝痛、下痢および腸障害の治療における使用のために、効果的に適用される。

【0009】

本発明の好ましい実施形態は、以下の詳細な説明において示される。

【0010】

出願人によって選択された細菌株は、プロバイオティックな特徴を有し、乳児に投与可能である、なぜなら、アンタゴニスト細菌（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａ）への抗菌活性の評価、株の非毒性および非病原性、その正確な分類学的同定、腸上皮への接着、消化管（胃液および胆汁）に対する抵抗、抗生物質耐性の伝染性（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に特に関連して、遺伝的安定性、ならびに工業プロセスの中で使用された場合の望ましい知覚特性および加工性を要求する、特定のガイドライン（ＦＡＯ／ＷＨＯ、２００２）をそれらが準拠しているからである。さらに、ヒト細胞に対するプロバイオティクスの細胞毒性の研究、ならびに、腸粘膜に付着するそれらの能力および腸細胞自体への病原体の接着を阻止する能力の確認が特に重要である。

【0011】

出願人は、上述の仕様を経験的に確認して初めて、本発明の株を選択した。

【0012】

出願人によって選択された細菌株はビフィドバクテリウム属に属し、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）に対して抗菌活性を有する。その上、前記株はさらに、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）に対しても、抗菌活性を有する。

【0013】

選択された株は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）またはビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）に属する。出願人により選択された株は以下である：

【0014】

（ｉ）２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２。

【0015】

（ｉｉ）２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４。

【0016】

（ｉｉｉ）２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０。

【0017】

（ｉｖ）２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５。

【0018】

上述の数の全ては、ブダペスト条約により定められた条件下、公衆に利用可能かつアクセス可能である。

【0019】

好ましくは小児時期の対象における、疝痛、下痢および腸障害の治療における使用のための、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、少なくとも一つの上述の細菌株を順に含む、細菌混合物を含む。

【0020】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）または（ｉｉ）または（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0021】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0022】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉｉ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0023】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0024】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0025】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0026】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0027】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0028】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0029】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉｉ）および（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0030】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0031】

一実施形態では、細菌混合物は、株（ｉ）および（ｉｉ）および（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を含むか、あるいはそれらからなる。

【0032】

その上、本発明の主題は、少なくとも一つのプレバイオティクス繊維（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ ｆｉｂｒｅ）と組み合わせて、少なくとも一つの上述のプロバイオティック株を含む、シンバイオティック組成物に関する。前記組み合わせは、有利には、存在している、得られる有益な細菌の選択的な増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を可能にし、それゆえ、宿主に対して有利な、局所性および全身性効果を誘導する。前記シンバイオティック組成物は乳児向けである。

【0033】

特に、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンを含む群から選択される数種類の「難消化性オリゴ糖」は、本発明との関連で、繊維として効果的に適用される。

【0034】

好ましい実施形態は、少なくとも一つの本発明の細菌株および上述のものから選択される少なくとも一つのプレバイオティクス繊維を含む、乳児に与えるための組成物に関する。有利なことに、前記組成物は、人乳のものに極めてよく似た著しい「ビフィズス菌特異的な（ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ）」効果を、乳児に提供できる。

【0035】

本発明の主題は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種またはビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属し、病原体大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、病原体サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、病原体クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）および病原体カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）に対しても、抗菌活性を有する細菌株に関する。病原体大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７バイオタイプを含む。

【0036】

ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種に属する株は、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０７を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ２２７４；２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０８を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ７８４０、および、寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ １６６０４を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３を含むか、あるいはそれらからなる群から選択される；好ましくは、株は、寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ １６６０４を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３である。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種に属する株は、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０９を有する、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）Ｂ１９７５である。

【0037】

本発明の主題は、寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ １６６０４を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３と組み合わせられた、２０１１年４月７日に寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ ２４７０６を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２株に関する。

【0038】

本発明の主題は、２００１年１０月１６日に寄託機関ＢＣＣＭ−ＬＭＧにノヴァーラ（イタリア）のモフィン エス．アール．エル．社によって寄託され、寄託番号ＬＭＧ Ｐ−２１０２１を有する、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１と組み合わせられた、寄託機関ＤＳＭＺにノヴァーラ（イタリア）のプロバイオティカルＳｐＡ社によって寄託され、寄託番号ＤＳＭ １６６０４を有する、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３株に関する。有利なことに、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１株は、続く実験の部で実証されるように、病原菌株に対して強力な阻害活性を示す（図１−５）。

【0039】

本発明は、好ましくは小児時期の対象における、疝痛、下痢および腸障害の治療における使用のための、細菌混合物を含む食品組成物またはサプリメント製品または医薬デバイスまたは医薬組成物に関し、前記細菌混合物は、上述されるように、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）種、ビフィドバクテリウム・ロンガム亜種ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）種に属する少なくとも一つの細菌株を含むか、あるいはそれらからなる。前記細菌混合物は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）ＢＲ０３と組み合わせられた、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２株、あるいは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１と組み合わせられた、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）Ｂ６３２株を含むか、あるいはそれらからなる。前記食品組成物またはサプリメント製品または医薬デバイスまたは医薬組成物は、上述されるように、細菌混合物を含み、ここで前記細菌混合物は、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、種子油およびパーム油のうちから選択される植物油中に添加、または懸濁、または分散される。好ましくはトウモロコシ油である。

【0040】

食品組成物またはサプリメント製品または医薬デバイスまたは医薬組成物は、油性懸濁液または顆粒、粉末、カプセル、錠剤およびサシェの形態とすることができる。

【0041】

本発明の主題は、シンバイオティック組成物としての、食品組成物またはサプリメント製品または医薬デバイスまたは医薬組成物に関する。前記シンバイオティック組成物は、ステロールもしくは植物ステロール、スタノールもしくは植物スタノール、グルコマンナン、コンニャクガムを含むか、あるいはそれらからなる群から選択される、少なくとも一つの植物物質（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、ならびに／または、フラクトオリゴ糖−ＦＯＳ、ガラクトオリゴ糖−ＧＯＳ、キシロオリゴ糖−ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維（ｌａｒｃｈ ｆｉｂｒｅ）もしくはアラビノガラクタン、および／もしくは発酵赤米（ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｒｅｄ ｒｉｃｅ）、および／もしくはオーツ麦、オーツ麦ふすま、大麦、大麦ふすま、および／もしくは凍結乾燥形態のキダチアロエゲル由来のベータグルカンを含む群から選択される、少なくとも一つのプレバイオティック繊維を含む。一実施形態では、前記シンバイオティック組成物はシメチコンを含む。別の実施形態では、前記シンバイオティック組成物は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンを含む群から選択される、少なくとも一つの植物物質を含む。

【実施例】

【0042】

実験の部
１．ビフィズス菌の選択
４６株のビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）が試験された；それらは、乳児糞便から一般に単離され、５種類の異なる種（Ｂ．ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．ロンガム亜種インファンティス（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ロンガム亜種ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ． ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）およびＢ．シュードカテヌラータム（Ｂ． ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ））に属する。該微生物は、ＤｉＳＴＡに存在するＢＵＳＣｏＢコレクション（ボローニャ大学スカドヴィビフィズス菌コレクション、ボローニャ大学、イタリア）の一部分であると考えられる。

【0043】

２．標的病原微生物の選択
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の様々な株を考慮した：コレクション由来の１株の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ １１１０５）、過去の研究にて良好な標的微生物であると実証された、尿路感染症の間の糞便から単離された１株の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（Ｍ８５株）、疝痛に罹患している乳児から単離された２株の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＧＣ ６ａおよびＧＣ ２３ａ株）。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）は子供における急性下痢の主要な病原因子（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）である。またさらに、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）株、イタリアの子供における細菌性の下痢の原因である主要な微生物（Ｉｎｆａｎｔｅ Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００８）：クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、子供における急性下痢の主要な病原因子（ｅｔｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）（Ｉｎｆａｎｔｅ Ｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．， ２００８）；およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）、同様に子供における急性下痢の原因、についても実験を行った。

【0044】

３．選択された微生物の抗菌活性試験
４６種類の微生物全てを、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１１０５ＴＭ、Ｍ８５、ＧＣ ６ａ、ＧＣ ２３ａおよびＳ．エンテリティディス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）Ｍ９４の成長を阻害する能力に関して分析した。本明細書に簡単に要約されるプロトコールに従って、「スポット寒天試験」を用いて、抗菌活性の予備スクリーニングを実施した。

【0045】

スポット寒天試験：完全対数期（ｆｕｌｌ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に対応する、約０．７−１の６００ｎｍでの吸光度（Ａ６００）を有する、ビフィズス菌各株の一晩（ｏ．ｎ．）培養物を用いる。ＴＰＹ寒天培地を用いる；プレートを４つに分割し、４分の１それぞれに１０ηｌの各株のｏ．ｎ．培養物を播種する。プレートを嫌気条件下３７℃で２４時間インキュベートする。生育が起こった時点で、７−８ｍｌ層の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）用の軟寒天培地（ＮＢ＋０．７％寒天）で表面を覆い、１００ηｌのマーカー株のｏ．ｎ．培養物を播種する。プレートをマーカー株の生育が可能な条件下でインキュベートする。２４−４８時間のインキュベーション後、用いられたマーカー株に依存して、ビフィズス菌の各株の播種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）の周囲に阻止円（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｈａｌｏ）の存在を観察することができる。この円を定規で測定する。本試験を少なくとも二回繰り返す。得られた結果−二回の実験の平均値−を表１に示す。表１は、試験された４６株のうち１６株のみについて、５種類のマーカー株によって生じた阻止円を示す。

【0046】

【表1】

【0047】

表１の試験から注目できるように、この研究から、とりわけ、疝痛を患っている乳児から単離された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の２株およびサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）に対して、良好なアンタゴニスト活性を有する株の存在が明らかとなった。より大きなサイズの阻止円を全体的に示した株のみを選択した。

【0048】

次いで、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｍ２１６およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）ＬＭＧ８８４１に対する、１６種類の選択された株のアンタゴニスト活性を評価した。得られた結果−二回の実験の平均値−を表２に示す。

【0049】

［表２］１６種類の選択されたビフィズス菌株に関する、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｍ２１６およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ）ＬＭＧ８８４１によって生じた阻止円のサイズ（ｃｍ）。

【表2】

【0050】

得られた結果から、Ｃ．ジェジュニＬＭＧ８８４１に対する高い阻害活性、およびＣ．ディフィシレＭ２１６に対するより弱い活性−株の大部分がはっきりと存在するが−が明らかとなった。

【0051】

次いで、疝痛にかかっている乳児から単離された２株に対する、およびＳ．エンテリティディス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）に対する、１６種類の選択された微生物のｏ．ｎ．培養物から得られた上清の抗菌力を評価した。試験を実施する前に、５．５−６．２の間に含まれるｐＨを有する上清をｐＨ６．５へと上昇させた。アッセイは、本明細書に簡単に説明される二つの方法：「ウェル拡散アッセイ（ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）」および「ブランクディスク試験（ｂｌａｎｋ ｄｉｓｋ ｔｅｓｔ）」を用いて実施した。

【0052】

ウェル拡散アッセイ（ｗｅｌｌ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）：完全対数期（ｆｕｌｌ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）に対応する、約０．７−１のＡ_６００を有する、ビフィズス菌各株の一晩（ｏ．ｎ．）培養物を用いる。培養物を１００００ｒｐｍで１０分間、遠心する；上清を１４０００ｒｐｍで１５分間、再遠心し、かつ直ちに再遠心する。次いで、１ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５へ上げる。５００ηｌの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）１０^６ＣＦＵ／ｍｌ（または任意の他の用いられるマーカー株）の懸濁液を播種した軟寒天培地の層を、プレートに注ぐ。寒天が固まった後、ウェルを無菌パスツールピペットで調製し、５０−８０ηｌのビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）の中性化懸濁液をそのウェルに導入する。プレートをマーカー株の生育が可能な条件下、３７℃で一晩インキュベートする（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）については３７℃、好気生活下）。

【0053】

ブランクディスク法（ｂｌａｎｋ ｄｉｓｋ ｍｅｔｈｏｄ）：ビフィズス菌培養物の遠心分離および上清の中性化は上記のように実行した。大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）の場合は普通寒天（ＮＡ）プレートを、異なる株が用いられる場合は他の培地を用いる。マーカー株を、１０^６ＣＦＵ／ｍｌの細胞濃度を有する懸濁液から開始して（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｆｒｏｍ）、表面に播種する。１ｃｍの直径を有するディスク（事前に無菌にしたもの）を、０．１ｍｌの上清（中性化および非中性化の両方）に浸し、プレート上に静置する。プレートをマーカー株の生育に適した条件下でインキュベートする。

【0054】

スポット寒天試験によって明らかにされるようなマーカー微生物への微生物の阻害効果は、周辺環境のｐＨの低下によって、病原体の阻害をもたらす、酸性代謝物の産生が主な原因に見えるが、それだけではない。しかしながら、バクテリオシンの産生は可能に見える。

【0055】

このような次第ではあるが、この試験で用いられた微生物の上清の抗菌活性をより特徴付けるために、ビフィズス菌の各株の既知量の上清の存在下における、いくつかのマーカー株（大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ １１１０５^商標、Ｓ．エンテリティディス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）Ｍ９４、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＧＣ ６ａおよび大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＧＣ ２３ａ）の生育動態の評価を行った。無添加（これは対照を表す）、およびビフィドバクテリウム属菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）のｏ．ｎ．培養物に由来する既知量の上清の存在下でのＮＭ（普通ブイヨン）培地に、マーカー株を播種した。上清を、そのまま、および中性化後の両方で、３種類の異なる濃度：１２．５％（ｖ／ｖ）、２５％（ｖ／ｖ）および５０％（ｖ／ｖ）で用いた。規定の時間間隔で、微生物の生育を示す、マーカー株のＡ_６２０の測定が用いられた。最大濃度の上清は第一の試行後に除外された、なぜなら、マーカー微生物の成育を完全に妨げたからである。

【0056】

得られたデータは上述の結論を裏付ける。

【0057】

４．異なる抗生物質に対する選択されたビフィズス菌の感受性または耐性の決定、および最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
抗生物質感受性または耐性試験は、インビボ試験において微生物を用いる可能性を評価するための、基礎研究の一つである。他の腸内細菌へ抗生物質耐性が伝達されるリスクを避けるために、治療において用いられる主要な抗生物質に対してできるだけ感受性であることが、微生物に関して重要である；一方で、プロバイオティクスは抗生物質治療と共同で投与されることが多く、それ故、抗生物質耐性は、共投与のための基本的な必要条件となる（Ｏｕｂａ ｅｔ ａｌ， ２００８）。本試験では、プロバイオティック株における抗生物質耐性を評価するために伝統的に用いられる１０種類の抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、バンコマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、トリメトプリム、セフロキシムおよびゲンタマイシン）を考慮した；それらは２−１０２４μｇ／ｍｌの間の濃度で試験された。またさらに、同じ濃度で試験された、新生児治療において一般的に用いられる別の３種類の抗生物質（アモキシシリン、セフトリアキソンおよびクラリスロマイシン）のＭＩＣが決定された。ＭＩＣは、増加していく抗生物質濃度の存在下、選択されたビフィズス菌の生育を解析することにより評価した；生育はＡ_６２０を測定することにより評価した。抗生物質に対する耐性または感受性は、欧州委員会（ＥＵ ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，２００２）および欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ，２００５）が発行するガイドラインを用いて評価した。

【0058】

得られた結果から、選択された株は、アンピシリン、カナマイシンおよびアモキシシリンに耐性を示すが、一方、一般に、試験された株の多くが考慮した他の抗生物質に対して感受性であることを示した、ということが示された。

【0059】

それらが、異なる株の大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（疝痛にかかっている乳児において、そうでない乳児よりも高い濃度で存在する、ガス産生細菌）に対して、抗菌活性を示すため、得られた結果から、本発明が関する、４株のビフィドバクテリウム属菌の選択が可能となった。さらに、前記株は、最も高い頻度で乳児における細菌性の下痢の原因である細菌（サルモネラ・エンテリティディス（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉｉ））に対する興味深い抗菌活性、並びに限られた数の抗生物質だけに対する耐性を示す。４種類の選択された株のいずれもが、その遺伝子がビフィズス菌の染色体ＤＮＡにＰＣＲで同定された場合でさえも、ビフィズス菌または乳酸桿菌へ抗生物質耐性遺伝子を伝達できることを実証しなかった。

【0060】

５．プレート上での阻害を試験するための方法
阻害作用を備える細菌
ａ．糞便細菌（ｆａｅｃａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ）に対する阻害作用の確認を目的とされる細菌は、ＭＲＳブイヨン培地（１５ｍｌ含有試験管）において、少なくとも二回の連続植菌（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）を受ける。
ｉ．細菌がビフィドバクテリウム属に属する場合、ＭＲＳブイヨンには１％システイン・クロロハイドレート（５％溶液）が添加される。
ｂ．新鮮肉汁培養（ｆｒｅｓｈ ｂｒｏｔｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）（２２＋／−２時間培養した）を遠心分離し、細胞を滅菌水で１回洗浄する。
ｃ．次いで、細胞を遠心分離し、５ｍｌの新鮮ＭＲＳブイヨン培地中に再懸濁する。

【0061】

２．感受性糞便細菌
ａ．阻害に供される細菌は、マッコンキーブイヨン培地（１０ｍｌ含有試験管）において、少なくとも二回の連続植菌を受ける。
ｂ．新鮮肉汁培養を水で希釈し、６００ｎｍの波長で０．６００−０．７００の光学濃度を得る。
ｃ．この細菌懸濁液の１００ｍｌをマッコンキー寒天プレートに注ぎ、液体が完全に吸収されるまで、適した滅菌スパチュラを用いて表面全体にまんべんなく撒く。

【0062】

３．１００ｍｌの試験される株の細菌懸濁液を吸収するように作成される（段階１−ｃ参照）、１１ｍｍ直径の紙ディスク（耐性記録ディスク）を、プレートの表面上に置く。

【0063】

４．プレートをサーモスタット中、３７℃で２４時間、インキュベートする。

【0064】

結果：細菌が阻害されている場合、ディスクの周りに無生育（ｎｏ ｇｒｏｗｔｈ）を示す円（ｈａｌｏ）が見える。円の大きさ（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）は、寒天の隅々まで塗り広げられた、株の静菌性／殺菌性作用を有する物質を産生する能力に比例する。

【0065】

６．プレート上での阻害試験
阻害可能性のあるプロバイオティックのそれぞれについて、培養液を調製し、ＭＲＳブイヨンにて２４時間インキュベートする。次いで細胞を洗浄し、新鮮ＭＲＳブイヨン培地中に再懸濁する。プレート当たり１００ｌの量の第一の希釈系列（ｄｅｃｉｍａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で、阻害を意図される病原種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ）に特異的な、寒天化させた培地を含有するプレートの表面上に、病原性細菌の新鮮肉汁培養をまんべんなく塗り広げる。ディスク当たり１００ｌの量で、そのようにして処理された細胞を紙ディスク上に吸収させる。３７℃、２４時間のインキュベーション後、ディスクの端と試験された病原体の生育の端の間に広がる領域により表される阻止円の測定を行う。

【0066】

５種類の病原体に対する６種類のプロバイオティクスの阻害活性の試験を、以下に列挙し、示す。結果はミリメートルで表される阻止円として報告される。

【0067】

６．１ リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ １９１１２について、結果を図１に示す。
図１は以下を示す：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４ ０ｍｍ
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８ ０ｍｍ
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８ （陽性基準） ０ｍｍ
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１ ５ｍｍ
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１ ２ｍｍ
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１ ４ｍｍ

【0068】

６．２ 腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（乳児糞便由来）について、結果を図２に示す。
図２は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの背面）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0069】

図２は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの内側）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0070】

結果：ミリメートルで表される阻止円
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４ ３ｍｍ
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８ ３ｍｍ
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準） ３ｍｍ
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１ ５ｍｍ
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１ ４ｍｍ
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１ ２ｍｍ

【0071】

６．３ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ８７３９について、結果を図３に示す。
図３は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの背面）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0072】

図３は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの内側）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0073】

結果：ミリメートルで表される阻止円
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４ ０ｍｍ
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８ １ｍｍ
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準） ２ｍｍ
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１ ４ｍｍ
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１ ２ｍｍ
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１ １ｍｍ

【0074】

６．４ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ ３５２１８について、結果を図４に示す。
図４は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの背面）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0075】

図４は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの内側）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0076】

結果：ミリメートルで表される阻止円
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４ ４ｍｍ
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８ ２ｍｍ
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準） ５ｍｍ
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１ ５ｍｍ
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１ ２ｍｍ
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１ １ｍｍ

【0077】

６．５ クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ）（乳児糞便由来）について、結果を図５に示す。
図５は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの背面）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0078】

図５は以下を示す（時計回りの方向に、矢印からスタートする−プレートの内側）：
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準）
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１

【0079】

結果：ミリメートルで表される阻止円
プロバイオティック株 ｍｍ：
１． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＬＬＲＥ０８、ＤＳＭ ２５６８４ ０ｍｍ
２． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＩＤ １７７４ ＬＲＥ ０２、ＤＳＭ ２３８７８ ２ｍｍ
３． Ｌ．ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８（陽性基準） ２ｍｍ
４． Ｌ．プランタルム（Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＰ０１ ＬＭＧ Ｐ−２１０２１ ３ｍｍ
５． Ｌ．デルブルッキー亜種ブルガリクス（Ｌ． ｄｅｌｂｒ． ｓｕｓｐ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＬＤＤ０１ １ｍｍ
６． Ｌ．ペントーサス（Ｌ． ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＰＣＢ １０１ ０ｍｍ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】