特許 6249945 上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6249945

(24)【登録日】2017年12月1日

(45)【発行日】2017年12月20日

(54)【発明の名称】上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20171211BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20171211BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20171211BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   A61P35/00

   A61K39/395 T

   C12P21/08

【請求項の数】21

【全頁数】79

(21)【出願番号】特願2014-519224(P2014-519224)

(86)(22)【出願日】2012年7月2日

(65)【公表番号】特表2014-522850(P2014-522850A)

(43)【公表日】2014年9月8日

(86)【国際出願番号】US2012045235

(87)【国際公開番号】WO2013006547

(87)【国際公開日】20130110

【審査請求日】2015年6月25日

(31)【優先権主張番号】61/504,633

(32)【優先日】2011年7月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/558,945

(32)【優先日】2011年11月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508044829

【氏名又は名称】メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ブハーリッド ラギダ

(72)【発明者】

【氏名】フェルトハウス マイケル

(72)【発明者】

【氏名】キング アン

(72)【発明者】

【氏名】コーリー ニーラジュ

(72)【発明者】

【氏名】クラウラント エリック

(72)【発明者】

【氏名】キーンズ ジェフリー デビッド

(72)【発明者】

【氏名】ルゴフスコイ アレクセイ エイ．

(72)【発明者】

【氏名】ニールセン ウーリック

【審査官】 田ノ上 拓自

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１０４１８３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＥＧＦＲの細胞外ドメインに１００ｎＭよりも良好なＫ_Ｄで結合し、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体であって、該重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列が、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列
から成る群から選択される、モノクローナル抗体。

【請求項2】

ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体であって、該重鎖及び軽鎖の可変領域の配列が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域配列；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域配列
から成る群から選択される、モノクローナル抗体。

【請求項3】

１０ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合するヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。

【請求項4】

１ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する請求項２または３に記載のモノクローナル抗体。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体と薬学上許容可能なキャリアを含む組成物。

【請求項6】

３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物であって、該組成物が第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、（ｉ）第１の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５、及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８、及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１、及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第３の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列を含み、第１、第２、及び第３の抗体は、１００ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合するヒト抗体またはヒト化抗体であり、かつ互いに対して２：２：１のモル比で存在する、組成物。

【請求項7】

３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物であって、該組成物が第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、（ｉ）第１の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域配列を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第３の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域配列を含み、かつ、第１、第２、及び第３の抗体は互いに対して２：２：１のモル比で存在する、組成物。

【請求項8】

第１の抗体が１×１０^−９Ｍ〜１．１×１０^−１１Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、第２の抗体が１×１０^−９Ｍ〜７．０×１０^−１１Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、かつ第３の抗体が１×１０^−９Ｍ〜３．６×１０^−１０Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、請求項６または７に記載の組成物。

【請求項9】

第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体のそれぞれが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥから成る群から独立して選択されるアイソタイプの抗体である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体のそれぞれが、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体である、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

静脈内注射に好適な無菌組成物である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

対象における癌を治療するための、有効量の請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬学的組成物。

【請求項13】

癌を治療するための医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体または請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項14】

癌が、黒色腫、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化器／結腸癌、肺癌、または前立腺癌である、請求項１２に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

癌が、黒色腫、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化器／結腸癌、肺癌、または前立腺癌である、請求項１３に記載の使用。

【請求項16】

少なくとも1つの追加の抗癌剤と順次または同時に投与される、請求項１３または１５に記載の使用のためのモノクローナル抗体または組成物。

【請求項17】

少なくとも1つの抗癌剤が、別表Aに記載される剤から選択される、請求項１６に記載の使用のためのモノクローナル抗体または組成物。

【請求項18】

少なくとも1つの抗癌剤が、トポイソメラーゼ阻害剤である、請求項１７に記載の使用のためのモノクローナル抗体または組成物。

【請求項19】

少なくとも1つの抗癌剤が、フルオロウラシル（5-FU）である、請求項１７に記載の使用のためのモノクローナル抗体または組成物。

【請求項20】

ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列を含むモノクローナル抗体であって、該重鎖及び軽鎖の可変領域の配列が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０における軽鎖可変領域配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２における軽鎖可変領域配列；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４における軽鎖可変領域配列
から成る群から選択される、モノクローナル抗体。

【請求項21】

３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物であって、該組成物が第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体と第３のモノクローナル抗体を含み、（ｉ）第１のモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０における軽鎖可変領域配列を含み；（ｉｉ）第２のモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２における軽鎖可変領域配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第３のモノクローナル抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３における重鎖可変領域配列及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４における軽鎖可変領域配列を含み、かつ、第１、第２、及び第３の抗体は互いに対して２：２：１のモル比で存在する、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、双方とも参照によって本明細書に組み入れられる米国特許仮出願番号６１／５０４６３３（２０１１年７月５日出願）及び米国特許仮出願番号６１／５５８９４５（２０１１年１１月１１日出願）の優先権の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景
天然の免疫系は病原体の効率的な中和のために抗体を作るように進化してきた。免疫した動物から単離された天然の抗体調製物は、起源がポリクローナルであり、特定の抗原の１つ又はわずかなエピトープに拘束される個々の抗体に比べて免疫優勢を示す。抗腫瘍抗体は、それらが結合する腫瘍細胞の増殖を阻止し、又は殺傷することができ、高度に有効な癌治療剤として開発されている。抗腫瘍抗体の混合物は、混合物における個々の抗体によって達成されるよりも大きい腫瘍抑制効果を達成し得る。

【0003】

そのような成績は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１）に対する２以上の中和抗体を組み合わせることによって達成されている。ＥＧＦＲに結合し、それを阻害する抗体は、有用な抗癌利益を提供することが判っており、大きな医学価値及び商業価値がある。拮抗的ではあるが、非競合的な抗ＥＧＦＲ抗体の対の特定の組み合わせはＥＧＦＲの下方調節を生じ、抗体のいずれか１つを適用するよりも速くて有効である（Friedman et al. (2005) PNAS 102:1915-1920（非特許文献1））。２つの交差競合性（すなわち、抗原への結合について互いに競合性）の抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせは相乗性ではないことが示されている。ＥＧＦＲの異なるエピトープに複数の抗体が結合することは細胞表面にて複合体化した受容体の格子を形成することが可能であり、単一のエピトープを標的とする抗体によって得られるよりも効率的な内部移行及び分解がもたらされる。抗ＥＧＦＲ受容体抗体の特定の対の組み合わせはまた生体内で相加的な及び場合によっては相乗的な抗腫瘍活性を生じることも報告されている（Perera et al. (2005) Clin Cancer Res 11:6390-6399（非特許文献2））。拮抗性の抗体５２８と組み合わせた変異体ｄｅ２−７ＥＧＦＲに対して生成したモノクローナル抗体８０６は、神経膠腫の異種移植モデルにて抗体単独で処理するよりも有意に高い抗腫瘍活性を示した。相乗的な抗腫瘍活性のメカニズムは、ＥＧＦＲの迅速な下方調節に関連することが示されたが、それは個々の抗体による処理では誘導されなかった。同様にＥＧＦＲのリン酸化は、抗ＥＧＦＲ抗体の別の対、セツキシマブ及びＥＭＤ５５９００の存在下で大きく低下した（Kamat et al. (2008) Cancer Biol Ther 7:726-33（非特許文献3））。

【0004】

関連する受容体、ＥｒｂＢ２を標的とする抗体の特定の組み合わせも相乗的に機能することが示されている（Friedman et al. (2005）（非特許文献1）。ペルツズマブと組み合わせたトラスツズマブは、個々の抗体が有効ではない用量でＢＴ４７４乳癌細胞の生き残りを阻害した（Nahta et al. (2004) Cancer Res 64:2343-2346（非特許文献4））。別の試験では、３つの非競合性の抗ＥｒｂＢ２抗体が併用にて、個々に使用するよりもはるかに有効な試験管内でのＢＴ４７４細胞の殺傷を示し、類似の成績はＢＴ４７４の異種移植モデルにて生体内でも得られた（Spiridon et al. (2002) Clin Cancer Res 8:1699-701（非特許文献5））。

【0005】

１を超える抗体を併用することが腫瘍細胞に対する抗体の増殖抑制（たとえば、細胞傷害性）効果を高め得るという他の証拠が報告されている。たとえば、腫瘍抗原１７−１Ａに対するモノクローナル抗体を併用し、腫瘍細胞の溶解を調べたら、モノクローナル抗体並びに競合性抗体の併用は有効ではなかったが、２以上の非競合性抗体の併用は腫瘍細胞の完全な溶解を生じることが分かった。

【0006】

抗体を併用することに加えて、親和性成熟として知られる組換えＤＮＡ技法を介して組換えで発現させた抗腫瘍抗体の抗原親和性を高めることによってさらに高い抗体の潜在力も達成されている。

【0007】

従って、高い腫瘍親和性を持つ抗ＥＧＦＲ抗体及びシグナル伝達阻害を高め、さらに効果的な細胞増殖抑制又は細胞傷害性の抗腫瘍転帰を提供する、そのような高親和性の抗ＥＧＦＲ抗体及びのそのような高親和性の抗ＥＧＦＲ抗体の併用を含む、抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体の併用に対する腫瘍の応答性を高めるような抗腫瘍抗体の作用を作出する追加のアプローチ及び方法が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Friedman et al. (2005) PNAS 102:1915-1920

【非特許文献2】Perera et al. (2005) Clin Cancer Res 11:6390-6399

【非特許文献3】Kamat et al. (2008) Cancer Biol Ther 7:726-33

【非特許文献4】Nahta et al. (2004) Cancer Res 64:2343-2346

【非特許文献5】Spiridon et al. (2002) Clin Cancer Res 8:1699-701

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

ＥＧＦＲに結合し、種々のＥＧＦＲの機能を阻害する新規のモノクローナル抗体が本明細書で提供される。これらの抗体は有用な治療効果を提供し、互いに又は他の抗ＥｒｂＢ受容体抗体（たとえば、他の抗ＥＧＦＲ抗体）と併用すると、各抗体を単独で投与することに比べて相乗的な又は相加的な治療効果を示すことが可能である。これらの抗体は個々に投与された場合又は本明細書で提供されるように併用で投与された場合、ＥＧＦＲが介在する細胞性のシグナル伝達に関連する種々の障害（たとえば、癌）を治療するのに有用である。従って、ＥＧＦＲに結合し、種々のＥＧＦＲの機能を阻害する特性を示す単離された新規のモノクローナル抗体、及びそのような特性を示すそのような抗体の併用も本明細書で提供される。診断目的及び治療目的でのこれら抗体の使用も、本明細書で開示される抗体の使用及び抗体の併用と同様に、提供される。

【課題を解決するための手段】

【0010】

一実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを結合し、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体が提供され、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；
から成る群から選択される。

【0011】

別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供され、重鎖及び軽鎖の可変領域の配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域
から成る群から選択される。

【0012】

前述のモノクローナル抗体は、たとえば、１００ｎＭより良好な又は１０ｎＭより良好な又は１ｎＭより良好な、又は１００ｐＭより良好な又は１０ｐＭより良好な又は１ｐＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合することができる。モノクローナル抗体は本明細書で開示される機能的特性の１以上を示すことができる。モノクローナル抗体は、たとえば、ヒト抗体であることができる。他の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ（登録商標）、アビマー、ナノボディ又はドメイン抗体であることができる。他の実施形態では、モノクローナル抗体は、たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、又はＩｇＥアイソタイプ抗体であることができる。

【0013】

１以上の前述の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体及び薬学上許容可能なキャリアを含む薬学的組成物も提供される。キットも提供される。キットは、たとえば、容器の中に薬学的組成物を含むことができる。１以上の前述の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を含む有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法も提供される。癌の治療のための（又は癌の治療のための薬物の製造のための）前述の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体又はその組み合わせも提供される。

【0014】

別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する２又は３のモノクローナル抗体を含む組成物が提供され、２又は３のモノクローナル抗体は、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体
から成る群から選択され、その際、組成物は、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む。

【0015】

さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する２又は３のモノクローナル抗体を含む組成物が提供され、２又は３のモノクローナル抗体は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
から成る群から選択され、その際、組成物は、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む。

【0016】

２又は３のモノクローナル抗体を含む前述の組成物におけるモノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれは、たとえば、１００ｎＭより良好な又は１０ｎＭより良好な又は１ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合することができる。モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれは、本明細書で開示される１以上の機能的特性を示すことができる。モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれは、たとえば、ヒト抗体であることができる。他の実施形態では、モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の１以上は独立して二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ（登録商標）、アビマー、ナノボディ又はドメイン抗体から成る群から選択される。他の実施形態では、モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のそれぞれは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、又はＩｇＥアイソタイプ抗体から成る群から選択される。モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はＩｇＹ及びラクダ科動物抗体の形態でもあり得る。

【0017】

２又は３の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体及び薬学上許容可能なキャリアを含む前述の組成物のいずれか１つを含む薬学的組成物も提供される。キットも提供される。キットは容器の中にたとえば、薬学的組成物を含むことができる。２又は３の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体含む前述の組成物のいずれか１つを含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む対象における癌を治療する方法も提供される。癌を治療するための２又は３の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を含む前述の組成物（及び薬物の製造のためのその使用）も提供される。

【0018】

別の実施形態では、３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物が提供され、前記組成物は、第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、その際、（ｉ）第１の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第３の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み、第１、第２及び第３の抗体は互いに２：２：１のモル比で存在する。

【0019】

さらに別の実施形態では、３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物が提供され、前記組成物は、第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、その際、（ｉ）第１の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含み；並びに（ｉｉｉ）第３の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含み、第１、第２及び第３の抗体は互いに２：２：１のモル比で存在する。

【0020】

前述の組成物における第１、第２及び第３の抗体のそれぞれは、たとえば、１００ｎＭより良好な又は１０ｎＭより良好な又は１ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合することができる。別の実施形態では、第１の抗体は１×１０^−９Ｍ〜１．１×１０^−１１Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、第２の抗体は１×１０^−９Ｍ〜７．０×１０^−１１Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、第３の抗体は１×１０^−９Ｍ〜３．６×１０^−１0Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する。前述の組成物における第１、第２及び第３の抗体のそれぞれは、本明細書で開示される機能的特性の１以上を示すことができる。前述の組成物における第１、第２及び第３の抗体のそれぞれは、たとえば、ヒト抗体であり得る。他の実施形態では、第１の抗体、第２の抗体及び第３の抗体の１以上は独立して、二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ、アビマー、ナノボディ又はドメイン抗体から成る群から選択される。他の実施形態では、第１の抗体、第２の抗体及び第３の抗体のそれぞれは独立して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、又はＩｇＥアイソタイプ抗体から成る群から選択される。

【0021】

２：２：１の比での第１の抗体、第２の抗体及び第３の抗体と、薬学上許容可能なキャリアを含む前述の抗ＥＧＦＲ組成物のいずれか１つを含む薬学的組成物も提供される。一実施形態では、薬学的組成物は無菌の組成物である。別の実施形態では、薬学的組成物は注射に好適である。さらに別の実施形態では、薬学的組成物は静脈内注射に好適な無菌組成物である。キットも提供される。キットは、たとえば、容器内に薬学的組成物を含むことができる。２：２：１の比で第１、第２及び第３の抗体を含む前述の抗ＥＧＦＲ組成物のいずれか１つを含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む対象における癌を治療する方法も提供される。癌を治療するために薬物を製造するための２：２：１の比で第１、第２及び第３の抗体を含む前述の抗ＥＧＦＲ組成物のいずれかの使用も提供される。

【0022】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法が提供され、方法は単一の組成物にて
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体
を併用することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で併用される。

【0023】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法が提供され、方法は単一の組成物にて
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
を併用することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で併用される。

【0024】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体
を投与することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で対象に投与される。

【0025】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法が提供され、方法は、対象に
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
を併用することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で対象に投与される。

【0026】

[本発明1001]
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体であって、該重鎖及び軽鎖のＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列が、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、及び3の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、5、及び6の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、8、及び9の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、11、及び12の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13、14、及び15の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16、17、及び18の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列
から成る群から選択される、モノクローナル抗体。
[本発明1002]
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体であって、該重鎖及び軽鎖の可変領域の配列が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む軽鎖可変領域；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む軽鎖可変領域
から成る群から選択される、モノクローナル抗体。
[本発明1003]
100ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1001又は1002のモノクローナル抗体。
[本発明1004]
10ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1003のモノクローナル抗体。
[本発明1005]
1ｎＭよりも良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する本発明1003のモノクローナル抗体。
[本発明1006]
ヒト抗体である、本発明1001又は1002のモノクローナル抗体。
[本発明1007]
二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＳｃＦｖ、アビマー、ナノボディ、及びドメイン抗体から成る群から選択される、本発明1001又は1002のモノクローナル抗体。
[本発明1008]
ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ抗体から成る群から選択される、本発明1001又は1002のモノクローナル抗体。
[本発明1009]
本発明1001又は1002のモノクローナル抗体と薬学上許容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
[本発明1010]
容器の中に本発明1009の薬学的組成物を含むキット。
[本発明1011]
対象において癌を治療する方法であって、有効量の本発明1009の薬学的組成物を対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1012]
癌を治療するための本発明1001又は1002のモノクローナル抗体。
[本発明1013]
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する2又は3種のモノクローナル抗体を含む組成物であって、該2又は3種のモノクローナル抗体が、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、及び3の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、5、及び6の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、8、及び9の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、11、及び12の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13、14、及び15の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16、17、及び18の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体
から成る群から選択され、
かつ、組成物が、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）、又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む、組成物。
[本発明1014]
ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する2又は3種のモノクローナル抗体を含む組成物であって、該2又は3種のモノクローナル抗体が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
から成る群から選択され、
かつ、組成物が、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）、又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む、組成物。
[本発明1015]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれが、100ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1016]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれが、10ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれが、1ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1015の組成物。
[本発明1018]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれが、ヒト抗体である、本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1019]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の1以上が、二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＳｃＦｖ、アビマー、ナノボディ、及びドメイン抗体から成る群から独立して選択される、本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1020]
モノクローナル抗体（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）のそれぞれが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ抗体から成る群から独立して選択される、本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1021]
薬学上許容可能なキャリアをさらに含む、本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1022]
容器の中に本発明1021の組成物を含むキット。
[本発明1023]
対象において癌を治療する方法であって、有効量の本発明1021の組成物を対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1024]
癌を治療するための本発明1013又は1014の組成物。
[本発明1025]
3つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物であって、該組成物が第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体を含み、（ｉ）第1の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、及び3の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、5、及び6の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含み；（ｉｉ）第2の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、8、及び9の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、11、及び12の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第3の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13、14、及び15の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16、17、及び18の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含み、かつ、第1、第2、及び第3の抗体は互いに対して2：2：1のモル比で存在する、組成物。
[本発明1026]
3つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物であって、該組成物が第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体を含み、（ｉ）第1の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む軽鎖可変領域を含み；（ｉｉ）第2の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む軽鎖可変領域を含み；並びに（ｉｉｉ）第3の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む軽鎖可変領域を含み、かつ、第1、第2、及び第3の抗体は互いに対して2：2：1のモル比で存在する、組成物。
[本発明1027]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体のそれぞれが、100ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1028]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体のそれぞれが、10ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1027の組成物。
[本発明1029]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体のそれぞれが、1ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1027の組成物。
[本発明1030]
第1の抗体が1×10⁻⁹Ｍ〜1．1×10⁻¹¹Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、第2の抗体が1×10⁻⁹Ｍ〜7．0×10⁻¹¹Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合し、かつ第3の抗体が1×10⁻⁹Ｍ〜3．6×10⁻¹⁰Ｍの範囲でのＫ_ＤでＥＧＦＲに結合する、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1031]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体のそれぞれがヒト抗体である、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1032]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体の1以上が、二重特異性抗体、免疫複合体、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＳｃＦｖ、アビマー、ナノボディ、及びドメイン抗体から成る群から独立して選択される、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1033]
第1の抗体と第2の抗体と第3の抗体のそれぞれが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＭ、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ抗体から成る群から独立して選択される、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1034]
薬学上許容可能なキャリアをさらに含む、本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1035]
無菌組成物である、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
注射に好適である、本発明1034の組成物。
[本発明1037]
静脈内注射に好適な無菌組成物である、本発明1034の組成物。
[本発明1038]
容器内に本発明1034の組成物を含むキット。
[本発明1039]
対象において癌を治療する方法であって、有効量の本発明1034の組成物を対象に投与する段階を含む方法。
[本発明1040]
癌を治療するための本発明1025又は1026の組成物。
[本発明1041]
抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法であって、該方法が、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、及び3の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、5、及び6の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、8、及び9の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、11、及び12の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13、14、及び15の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16、17、及び18の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体
を単一組成物中に組み合わせる段階を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が互いに対して2：2：1のモル比で組み合わせられる、方法。
[本発明1042]
抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法であって、該方法が、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
を単一組成物中に組み合わせる段階を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が互いに対して2：2：1のモル比で組み合わせられる、方法。
[本発明1043]
抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法であって、該方法が、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、2、及び3の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、5、及び6の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、8、及び9の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、11、及び12の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13、14、及び15の重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列、並びにそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16、17、及び18の軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3の配列を含むモノクローナル抗体
を対象に投与する段階を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が互いに対して2：2：1のモル比で対象に投与される、方法。
[本発明1044]
抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法であって、該方法が
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
を対象に投与する段階を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が互いに対して2：2：1のモル比で対象に投与される、方法。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から及びクレームから明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1A】野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ抗原（ＷＴ）、Ｂｉｎ１エピトープ変異体（Ｂｉｎ１ＭＴ）及びＢｉｎ３エピトープ変異体（Ｂｉｎ３ＭＴ）を用いたＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ抗体による直接ＥＬＩＳＡエピトープビニング実験の結果を示す棒グラフである。

【図1B】野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ抗原の注入、その後のそれに続くＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ抗体の注入による、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＩＣＲ１０エピトープ（Ｂｉｎ２）を用いた表面プラスモン共鳴エピトープビニング実験の結果を示す棒グラフである。

【図2A】野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ抗原の注入、その後のそれに続くＰ３Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ１Ｘ抗体の注入による、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＰ１Ｘ抗体を用いた表面プラスモン共鳴エピトープビニング実験の結果を示すグラフである。

【図2B】野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ抗原の注入、その後のそれに続くＰ３Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ１Ｘ抗体の注入による、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＰ２Ｘ抗体を用いた表面プラスモン共鳴エピトープビニング実験の結果を示すグラフである。

【図2C】野生型ＥＧＦＲ−ＥＣＤ抗原の注入、その後のそれに続くＰ３Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ１Ｘ抗体の注入による、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＰ３Ｘ抗体を用いた表面プラスモン共鳴エピトープビニング実験の結果を示すグラフである。

【図3】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳプロット）によって測定したＡ４３１細胞上のＥＧＦＲへのＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ抗体の結合動態の結果を示すグラフである。

【図4】単一の抗体：Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ又はＰ３Ｘ抗体による単一剤処理によるホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）の阻害を示すｐＥＧＦＲのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図5A】元の抗体（ｃａ抗体）及び親和性成熟したＰ１Ｘ抗体によるｐＥＲＫの阻害の比較によるｐＥＲＫ阻害に対する親和性成熟の効果を示すホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図5B】元の抗体（ｃａ及びｃｈ抗体）及び親和性成熟したＰ１Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体によるｐＥＲＫの阻害を比べたホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図5C】元の抗体（ｃａ及びｃｄ抗体）及び親和性成熟したＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ抗体によるｐＥＲＫの阻害を比べたホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図6A】およそ２５ｎＭのＩＣ_５０値を持つＰ１Ｘ抗体によるｐＥＲＫ阻害を示すホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図6B】２５ｎＭの一定濃度のＰ１Ｘと組み合わせた５種の連続希釈比のＰ３Ｘ＋Ｐ２Ｘによって処理したＡ４３１細胞についてのホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図6C】Ｐ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３Ｘの６種の組み合わせ連続希釈比で処理したＡ４３１細胞についてのホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図6D】Ｐ１Ｘ：Ｐ２Ｘの５種の組み合わせ連続希釈比で処理したＡ４３１細胞についてのホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図7A】２：２：１のＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３Ｘの組み合わせによる阻害を示すホスホ−ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）のＥＬＩＳＡ（丸）及びホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡ（三角）の結果を示すグラフである。

【図7B】Ｐ１Ｘ単独抗体のみに対する２：２：１のＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３Ｘの組み合わせ（Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ）による阻害を示すホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図7C】Ｐ２Ｘ単独抗体のみに対するＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘによる阻害を示すホスホ−ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）のＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図8A】ＥＧＦによる刺激の前に種々の時間、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で予備処理したＨ１９７５細胞の総ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）の内部移行動態についてのウエスタンブロット解析の結果を示す棒グラフである。

【図8B】ＥＧＦによる刺激の前にＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で予備処理したＨ１９７５細胞についてのウエスタンブロット解析の結果を示す棒グラフであり、負荷対照（ＰＣＮＡ）及び対照の未処理細胞の溶解物に対して標準化した、細胞におけるｔＥＧＦＲ、ｐＥＲＫ、ホスホ−ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）及びホスホ-ｃ-Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）のレベルを示す。

【図9A】ＥＧＦリガンドの存在下でセツキシマブと比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で処理することによる腫瘍細胞増殖の阻害を示すＨＣＣ８２７細胞の細胞生存性アッセイの結果を示すグラフである。

【図9B】ＥＧＦリガンドの存在下でセツキシマブと比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で処理することによる腫瘍細胞増殖の阻害を示すＨ１９７５細胞の細胞生存性アッセイの結果を示すグラフである。

【図9C】アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）リガンドの存在下でセツキシマブと比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で処理することによる腫瘍細胞増殖の阻害を示すＨＣＣ８２７細胞の細胞生存性アッセイの結果を示すグラフである。

【図9D】ＡＲＥＧリガンドの存在下でセツキシマブと比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体で処理することによる腫瘍細胞増殖の阻害を示すＨ１９７５細胞の細胞生存性アッセイの結果を示すグラフである。

【図10A】ＰＢＳ対照及びセツキシマブ対照と比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体によって処理したマウスにおける生体内腫瘍容積の低下を示す、ＤＵ１４５腫瘍異種移植マウスモデルの実験の結果を示すグラフである。

【図10B】ＰＢＳ対照と比較した、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体によって処理したマウスにおける生体内腫瘍容積の低下を示す、Ｈ１９７５腫瘍異種移植マウスモデルの実験の結果を示すグラフである。

【図11】低用量にてＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ又はＰ３Ｘ単独でのＥＧＦリガンド遮断能力を示すリガンド拮抗細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図12A】高用量にてＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ又はＰ３Ｘ単独での又は３つの組み合わせでのＥＧＦリガンド遮断能力を示すリガンド拮抗細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図12B】高用量にてＰ１ＸＦａｂ、Ｐ２ＸＦａｂ又はＰ３ＸＦａｂ単独での又は３つの組み合わせでのＥＧＦリガンド遮断能力を示すリガンド拮抗細胞結合アッセイの結果を示すグラフである。

【図13A】低用量（５０ｎｇ／ｍｌ：８ｎＭ）にてＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つ組み合わせの阻害能力を示すホスホ−ＥＧＦＲ阻害アッセイの結果を示すグラフである。

【図13B】高用量（５００ｎｇ／ｍｌ：８０ｎＭ）にてＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つ組み合わせの阻害能力を示すホスホ−ＥＧＦＲ阻害アッセイの結果を示すグラフである。

【図13C】低用量（５０ｎｇ／ｍｌ：８ｎＭ）にてＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つ組み合わせの阻害能力を示すホスホ−ＥＲＫ阻害アッセイの結果を示すグラフである。

【図13D】高用量（５００ｎｇ／ｍｌ：８０ｎＭ）にてＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つ組み合わせの阻害能力を示すホスホ−ＥＲＫ阻害アッセイの結果を示すグラフである。

【図14】Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つ組み合わせ、又はセツキシマブによって予備処理した細胞におけるＥＧＦ受容体の下方調節アッセイの免疫ブロットである。ハウスキーピングタンパク質ＰＣＮＡを対照として使用した。

【発明を実施するための形態】

【0028】

詳細な説明
Ｉ．定義
用語「ＥＧＦＲ」、「ＥｒｂＢ１」、及び「ＥＧＦ受容体」は本明細書では相互交換可能に使用され、ヒトのＥＧＦＲタンパク質を指す；UｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ００５３３を参照のこと。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）のアミノ酸配列は実施例１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３にて示される。

【0029】

用語「阻害」は本明細書で使用されるとき、活性の完全な阻止を含む生物活性の統計的に有意な低下を指す。たとえば、「阻害」は生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は約１００％の統計的に有意な低下を指すことができる。

【0030】

リン酸化の阻害は本明細書で使用されるとき、抗体の非存在下でのシグナル伝達（対照）に比べて基質タンパク質のリン酸化を統計的に有意に低下させる抗体の能力を指す。当該技術で知られるように、細胞内シグナル伝達経路には、たとえば、ホスホイノシチド３'−キナーゼ／Ａｋｔ（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＰＴＥＮ又は「ＡＫＴ」）及び／又はマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ又は「ＥＲＫ」）の経路が挙げられる。また当該技術で知られるように、ＥＧＦＲが介在するシグナル伝達は、基質のリン酸化（たとえば、ＡＫＴ及び／又はＥＲＫのリン酸化又は非リン酸化）のレベルをアッセイすることによって測定することができる。従って、一実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ及び組成物は、そのような抗体の非存在下でのＡＫＴ及び／又はＥＲＫのリン酸化のレベル（対照）に比べて少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％ＡＫＴ及びＥＲＫのいずれか又は双方のリン酸化のレベルの統計的に有意な阻害を提供する。そのようなＥＧＦＲが介在するシグナル伝達は、ＥＧＦＲが関与する細胞性カスケードにおけるタンパク質を測定する当該技術で承認された技法、たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン、又はＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）のような多重方法を用いて測定することができる。

【0031】

語句「ＥＧＦＲを発現している細胞の増殖の阻害」は本明細書で使用されるとき、生体内又は試験管内のいずれかにて抗体の非存在下での細胞の増殖（対照）に比べてＥＧＦＲを発現している細胞の増殖を統計的に有意に低下させる抗体の能力を指す。一実施形態では、ＥＧＦＲを発現している細胞（たとえば、癌細胞）の増殖を、細胞が本明細書で開示される組み合わせの抗体組成物と接触している場合、組み合わせの抗体組成物の非存在下で測定される増殖（対照）に比べて少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％低下させ得る。細胞の増殖は、細胞分裂の比率、細胞分裂を受けている細胞集団の範囲内の細胞の分画、及び／又は最終分化若しくは細胞死のために細胞集団から喪失される細胞の比率を測定する（たとえば、細胞タイターグローアッセイ又はチミジンの取り込みを用いて）当該技術で承認された技法を用いて測定することができる。

【0032】

語句「ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンドの結合の阻害」は、本明細書で使用されるとき、抗体の非存在下でのＥＧＦＲリガンドの結合（対照）に比べてその受容体ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンドの結合を統計的に有意に低下させる抗体の能力を指す。このことは、抗体の存在下で対照（抗体なし）に比べてＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲリガンドの量が統計的に有意に減少することを意味する。ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲリガンドの量は、抗体の非存在下での量（対照）に比べて、本明細書で開示される抗体の組成物又は組み合わせの存在下で少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％減少し得る。ＥＧＦＲリガンドの結合の低下は、抗体の存在下又は非存在下（対照）にてＥＧＦＲを発現している細胞への標識したＥＧＦＲリガンド（たとえば、放射線標識したＥＧＦ又は放射線標識したベタセルリン）の結合のレベルを測定する当該技術で承認された技法を用いて測定することができる。

【0033】

語句「ＥＧＦＲの二量化の阻害」は本明細書で使用されるとき、抗体の非存在下でのＥＧＦＲの二量化（対照）に比べてＥＧＦＲの二量化（別のＥｒｂＢ受容体と対合してホモ二量体、たとえば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ１対合又はヘテロ二量体、たとえば、ＥｒｂＢ１／ＥｒｂＢ３対合を形成すること）を統計的に有意に低下させる抗体の能力を指す。一実施形態では、ＥＧＦＲの二量化は、抗体の非存在下で測定されるＥＧＦＲの二量化に比べて、ＥＧＦＲを発現している細胞が本明細書で開示される抗体の組成物又は組み合わせと接触している場合、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％減少し得る。ＥＧＦＲの二量化における低下は、抗体の存在下又は非存在下（対照）にてＥＧＦＲの二量化を測定する当該技術で認められた技法を用いて測定することができる。

【0034】

語句「ＥＧＦＲ発現の下方調節」は、本明細書で使用されるとき、抗体の非存在下でのＥＧＦＲの発現（対照）に比べて、たとえば、ＥＧＦＲの内部移行を増やすことによって及び／又は細胞内小胞からのＥＧＦＲの再利用を減らすことによって細胞表面におけるＥＧＦＲの発現を統計的に有意に減らす抗体の能力を指す。一実施形態では、ＥＧＦＲの発現は、抗体の非存在下で測定される細胞表面上のＥＧＦＲの発現と比べて、ＥＧＦＲを発現している細胞が本明細書で開示される組み合わせの抗体組成物と接触している場合、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は約１００％減少し得る。細胞表面におけるＥＧＦＲ発現の下方調節には、たとえば、受容体の内部移行／再利用の増加、及び／又は受容体の内部移行／分解の増加が含まれる。ＥＧＦＲの内部移行の増加は、抗体の存在下又は非存在下（対照）にてＥＧＦＲの内部移行のレベルを測定する当該技術で承認された技法を用いて測定することができる。

【0035】

ＥＧＦＲ抗体（本明細書で記載される）の組み合わせに関して、用語「相加的」又は「相加性」は本明細書で使用されるとき、２以上の抗体の活性を指し、その際、それらの組み合わせた活性が（特定の機能、たとえば、細胞増殖の阻害に関して）それらの個々の活性の合計に等しい。すなわち、本明細書で提供される２以上の抗体の活性の合計は、ＥＧＦＲを発現している細胞に個々に作用する場合、同じ細胞に対して一緒に作用する同じ抗体の組み合わせた効果とほぼ同等である。一実施形態では、相加効果は上記で議論された特性のいずれか（たとえば、ＡＫＴ又はＥＲＫのリン酸化の阻害、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害等）に関して測定される。

【0036】

用語「相乗的」又は「相乗性」は本明細書で使用されるとき、それらの組み合わせた活性（特定の機能、たとえば、細胞増殖の阻害に関して）がそれら個々の活性の予想される相加効果よりも大きい２以上の抗体の活性を指す。たとえば、予想される相加効果はＢｌｉｓｓの独立基準に従って定義することができる。Ｂｌｉｓｓの基準によれば、２以上の薬剤（たとえば、抗体）の効果は、個々の薬剤の効果の合計から個々の薬剤の効果の掛け算を差し引くこと：
Ｅ１２＝Ｅ１＋Ｅ２−Ｅ１×Ｅ２
に等しく、式中、Ｅ１は薬剤１による％阻害であり、Ｅ２は薬剤２による％阻害であり、Ｅ１２は併用による予想された％阻害である。

【0037】

相乗効果は、本明細書で議論される特性（たとえば、ＥＧＦＲ依存性のＡＫＴ又はＥＲＫのリン酸化の阻害、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖の阻害等）のいずれかに適用することができる。特定の実施形態では、個々の活性の相加効果に比べて併用した抗体の活性にて少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％以上の増加が達成される。

【0038】

用語「抗体」又は「免疫グロブリン」には、本明細書で相互交換可能に使用されるとき、抗体全体及び任意の抗原結合断片（抗原結合タンパク質）又はその単鎖同族体が含まれる。「抗体」は、少なくとも１つの重鎖（Ｈ）及び１つの軽鎖（Ｌ）を含む。天然に存在するＩｇＧでは、たとえば、これらの重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって相互連結され、２つの対合した重鎖と軽鎖があり、これら２つもジスルフィド結合によって相互連結される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略記する）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略記する）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬで構成される。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域はさらに、よく保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）又は連結（Ｊ）領域（それぞれ重鎖及び軽鎖におけるＪＨ又はＪＬ）と呼ばれる領域で中断された相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細かく分割することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、Ｊでアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ、３つのＦＲ及び１つのＪから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は抗原と結合する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（たとえば、エフェクター細胞）又は古典的な補体系の第１補体（Ｃ１ｑ）のような液性因子を含む宿主の組織又は因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。従って、抗原（たとえば、ＥＧＦＲ）に特異的に結合する能力を保持する１以上の断片を本明細書で開示される組み合わせで使用し得る。完全長の抗体の断片は抗体の抗原結合機能を実施することができることが示されている。抗原結合部分又は抗体の断片として示される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから成る一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）_２断片、ヒンジ領域にてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単鎖のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインを含むｄＡｂ；（ｖｉ）Ｖ_Ｈドメインから成るｄＡｂ断片（Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546）；（ｖｉｉ）ＶＨ又はＶＬドメインから成るｄＡｂ；（ｖｉｉｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；又は（ｉｘ）合成リンカーによって任意で連結され得る２以上の単離したＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶ_Ｌ及びＶ_Ｈは別々の遺伝子によってコードされているが、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合し、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作ることが可能である合成リンカーによって組換え法を用いてそれらを連結することができる（免疫グロブリン断片のそのような単鎖同族体は単鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）として知られる）。そのような単鎖抗体も用語「抗体」の範囲内に包含されることが意図される。抗体断片は当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、未処理の抗体と同様の一般的な方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ法によって又は未処理の免疫グロブリンの酵素切断若しくは化学切断によって作出することができる。

【0039】

用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在し得る天然に生じる変異の可能性を除いて同一である。そのような免疫グロブリンの抗原結合断片（ｓｃＦｖを含む）も本明細書で使用されるとき用語「モノクローナル抗体」によって包含される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原性部位に向けられる。さらに、通常様々な抗体を含み、様々な決定基（エピトープ）に向けられる従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に向けられる。モノクローナル抗体は、当該技術で承認された技法及び本明細書で記載されるもの、たとえば、ハイブリドーマ法、トランスジェニック動物、組換えＤＮＡ法（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）を用いて、又は、たとえば、米国特許第７，３８８，０８８号及び米国特許出願番号０９／８５６，９０７（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／３１２４６）に記載された技法を用いたファージ抗体ライブラリを用いて調製することができる。モノクローナル抗体はキメラ抗体、ヒト抗体及びヒト化抗体を含み、天然に存在してもよく又は組換えによって作出されてもよい。

【0040】

用語「組換え抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、創られ、又は単離される抗体、たとえば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（たとえば、ヒトの免疫グロブリン遺伝子）について遺伝子導入した又は染色体導入した動物（たとえば、マウス）又はそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換した宿主、たとえば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）ファージディスプレイを用いて組換え、組み合わせの抗体ライブラリ（たとえば、ヒト抗体配列を含む）から単離される抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子（たとえば、ヒトの免疫グロブリン遺伝子）配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の手段によって調製され、発現され、創られ、又は単離される抗体を指す。そのような組換え抗体はヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有し得る。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は試験管内での突然変異誘発に供することができるので、組換え抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列に由来する一方で、生体内でのヒト抗体の生殖系列レパトアの範囲内で天然に存在しなくてもよい。

【0041】

用語「キメラ免疫グロブリン」又は抗体は、その可変領域が第１の種に由来し、その定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリン又は抗体を指す。キメラ免疫グロブリン又は抗体は、たとえば、遺伝子操作によって異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子断片から構築することができる。

【0042】

用語「ヒト抗体」は本明細書で使用されるとき、たとえば、Ｋａｂａｔら（Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）によって記載されたようにフレームワークとＣＤＲ領域の双方がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むように意図される。さらに、抗体が定常領域を含有するのであれば、定常領域もヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体はヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（たとえば、試験管内における無作為若しくは部位特異的な変異誘発によって、又は生体内の体細胞突然変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、用語「ヒト抗体」は本明細書で使用されるとき、別の哺乳類種、たとえば、マウスの生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に導入されている抗体を含めるようには意図されない。

【0043】

ヒト抗体は、アミノ酸残基、たとえば、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされない、活性を高めるアミノ酸残基によって置き換えられる少なくとも１以上のアミノ酸を有することができる。通常、ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列の一部ではないアミノ酸残基で置き換えられる２０までの位置を有することができる。特定の実施形態では、これらの置き換えは、以下で詳細に記載されるようにＣＤＲ領域の範囲内である。

【0044】

用語「ヒト化抗体」は少なくとも１本のヒト化された抗体鎖（すなわち、少なくとも１本のヒト化軽鎖又は重鎖）を含む抗体を指す。用語「ヒト化抗体鎖」（すなわち、ヒト化免疫グロブリン軽鎖）は、実質的にヒト抗体に由来する可変フレームワーク領域と実質的に非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）（たとえば、少なくとも１つのＣＤＲ、２つのＣＤＲ又は３つのＣＤＲ）を含む可変領域を有する抗体鎖を指し、さらに定常領域（たとえば、軽鎖の場合、１つの定常領域又はその一部、及び好ましくは重鎖の場合、３つの定常領域）を含む。

【0045】

「単離された」は本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体又は２、３又は４の抗体の組み合わせを指すように意図される（たとえば、それぞれＥＧＦＲに特異的に結合する抗体ｃａ、ｃｆ及びｃｈの単離された組成物はＥＧＦＲ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。加えて、単離された抗体は他の細胞性物質及び／又は化学物質を通常実質的に含まない。一実施形態では、異なるＥＧＦＲ結合特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは明確に定義された組成物にて組み合わせられる。

【0046】

本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は重鎖定常領域の遺伝子によってコードされる抗体のクラス（たとえば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。一部の実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体組成物はＩｇＧ１アイソタイプの抗体のみを含む。他の実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体組成物はＩｇＧ２アイソタイプの抗体のみを含む。他の実施形態では、本明細書で提供されるモノクローナル抗体組成物は２又は３の異なるアイソタイプの抗体を含む。

【0047】

「抗原」は、抗体が結合する実体（たとえば、タンパク質様の実体又はペプチド）である。種々の実施形態では、抗原はＥＧＦである。特定の実施形態では、抗原はヒトＥＧＦＲである。

【0048】

従って、本開示によって包含されるのはまた、本明細書で記載される組み合わせの特定の抗体によって認識されるエピトープのすべて又は一部を含むＥＧＦＲ上にエピトープに結合する抗体の組み合わせである。別の実施形態では、本明細書で記載される抗体とＥＧＦＲへの結合について競合する抗体が提供される。競合する抗体及びそれを認識する抗体又は重複するエピトープは、たとえば、免疫アッセイのような日常の技法を用いて、たとえば、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する１つの抗体の能力を示すこと、すなわち、競合結合アッセイによって特定することができる。競合結合は以下の実施例で記載されるようなアッセイを用いて測定され得る。

【0049】

用語「特異的な結合」、「特異的に結合する」、「選択的な結合」及び「選択的に結合する」は、抗体が特定の抗原又はエピトープに対して相当な親和性を示し、一般に他の抗原及びエピトープとの有意な交差反応性を示さないことを意味する。「相当な」又は好まれる結合には、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９又は１０^１０Ｍ^−１より良好なＫ_Ｄを伴った結合が挙げられる。抗体抗原相互作用のＫ_Ｄ（親和性定数）は、５０％の抗体と抗原の分子が一緒に結合する抗体の濃度を示す。従って、好適な固定した抗原濃度では、５０％より高い（すなわち、強い）親和性の抗原は、低親和性の抗体との同一比率の結合を達成するのに必要とされるよりも低濃度で抗原分子を結合するであろう。従って、低いＫ_Ｄは高い（強い）親和性を示す。本明細書で使用されるとき、「より良好な」親和性はさらに強い親和性であり、比較値よりも低い数値であり、１０^７Ｍ^−１のＫ_Ｄは低い数値なので、１０^６Ｍ^−１のＫ_Ｄよりもより良好な親和性を表す。１０^７Ｍ^−１より良好な親和性（すなわち、低いＫ_Ｄ値なのでさらに強い）、好ましくは１０^８Ｍ^−１より良好な親和性が一般に好まれる。本明細書で述べたそれらの中間の値も熟考され、好まれる結合親和性は親和性の範囲として示すことができ、たとえば、本明細書で開示される抗ＥＧＦＲ抗体についての好まれる結合親和性は１０^６〜１０^１２Ｍ^−１、好ましくは１０^７〜１０^１２Ｍ^−１、さらに好ましくは１０^８〜１０^１２Ｍ^−１である。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、標的ではない抗原（たとえば、非ＥＧＦＲタンパク質）に感知できるほど結合しないものである。たとえば、一実施形態では、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体は、ＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）以外のＥｒｂＢ分子又は非ＥｒｂＢタンパク質若しくはペプチドよりもＥＧＦＲについて少なくとも２、好ましくは３又は４桁以上大きいより良好な結合親和性（すなわち、２、３又は４桁以上低いＫ_Ｄ値を示す結合）を示すであろう。特異的な又は選択的な結合は、たとえば、本明細書で記載されるようなＳｃａｔｃｈａｒｄ解析及び／又は競合性（競合）結合アッセイを含む、そのような結合を測定する当該技術で承認された手段に従って測定することができる。

【0050】

用語「Ｋ_Ｄ」は本明細書で使用されるとき、特定の抗体／抗原相互作用の解離平衡定数又は抗原についての抗体の親和性を指すように意図される。一実施形態では、表面プラスモン共鳴アッセイ、細胞結合アッセイ、又は平衡透析アッセイを用いて測定したとき、本明細書で提供される抗体は、１００ｎＭより良好な（すなわち、以下）（たとえば、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ以下）の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原（たとえば、ＥＧＦＲ）に結合する。特定の実施形態では、抗体は、表面プラスモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイによって測定したとき、８ｎＭより良好な（たとえば、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１．２ｎＭ、１．１ｎＭ、１ｎＭ以下）の親和性（解離定数Ｋ_Ｄによって表されるような）でＥＧＦＲに結合する。他の実施形態では、検体として組換えＥＧＦＲ及びリガンドとして抗体を用いてＢＩＡＣＯＲＥ３０００機器にて表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）法によって測定した場合、抗体は、たとえば、約１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ又は１０^−１０Ｍ以下のような、およそ１０^−７Ｍ未満の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原（ＥＧＦＲ）に結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗癌（たとえば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合する親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で所定の抗原に結合する。Ｋ_Ｄを測定する他の方法には、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）法を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を介した又は溶液中でのＥＧＦＲを発現している細胞への平衡結合が挙げられる。

【0051】

用語「Ｋ_ｏｆｆ」は本明細書で使用されるとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離のための解離速度定数を指すように意図される。

【0052】

用語「ＩＣ５０」及び「ＩＣ９０」は本明細書で使用されるとき、生物学的な又は生化学的な機能（たとえば、ＥＧＦＲの機能又は活性）をそれぞれ５０％及び９０％阻害することにおける化合物（たとえば、抗ＥＧＦＲ抗体）の有効性の測定値を指す。たとえば、ＩＣ５０は、どれほどの抗ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲの活性（たとえば、ＥＧＦＲを発現している細胞の増殖）を半分阻害するのに必要とされるのかを示す。すなわち、それは抗ＥＧＦＲ抗体の半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）である（５０％ＩＣ又はＩＣ_５０）。ＦＤＡによれば、ＩＣ５０は試験管内での５０％の阻害に必要とされる薬剤の濃度を表す。ＩＣ５０及びＩＣ９０は当該技術で既知の技法によって、たとえば、用量反応曲線を構築し、ＥＧＦＲ活性を無効にすることにおける拮抗剤（すなわち、抗ＥＧＦＲ抗体）の様々な濃度の効果を調べることによって決定することができる。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、さらに具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合する糖質単位のパターンとして定義される。

【0054】

用語「核酸分子」は本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むように意図される。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

【0055】

用語「単離された核酸分子」は、抗体又は抗体断片（たとえば、Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｌ，ＣＤＲ３）をコードする核酸を参照して本明細書で使用されるとき、ヌクレオチド配列がゲノムの他のヌクレオチド配列、たとえば、ＥＧＦＲ以外の抗原に結合する抗体をコードするものを本質的に含まず、他の配列はヒトのゲノムＤＮＡにて天然に核酸に隣接する、核酸分子を指すように意図される。

【0056】

用語「修飾すること」又は「修飾」は本明細書で使用されるとき、抗体又はその抗原結合部分にて１以上のアミノ酸を変更することを指すように意図される。１以上の位置のアミノを加える、置換する、または欠失させることにより、変化を作出することができる。たとえば、ＰＣＲ変異誘発のような既知の方法を用いて変化を作出することができる。たとえば、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法を用いて特定される抗体又はその抗原結合部分を修飾することができ、それによって抗体又はその抗原結合部分のＥＧＦＲへの結合親和性を改変する。抗体の配列における「保存的なアミノ酸置換」が提供され、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされる又はアミノ酸配列を含有する抗体の抗原、すなわち、ＥＧＦＲへの結合を破棄しないヌクレオチド及びアミノ酸の配列の修飾が提供される。保存的なアミノ酸置換には、同一クラスのアミノ酸によるあるクラスのアミノ酸の置換が挙げられ、クラスは一般的な物理化学的なアミノ酸側鎖の特性によって定義され、たとえば、標準のＤａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリクス又はＢＬＯＳＵＭマトリクスによって決定されるように、相同タンパク質にて高い置換頻度が実際に見つかる。アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが分類されており、それらには、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）が挙げられる。たとえば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕのような別のクラスＩＩＩの残基についてのＡｓｐの置換は保存的な置換である。従って、抗ＥＧＦＲ抗体における予想される非必須アミノ酸残基は好ましくは同一クラスの別のアミノ酸残基によって置き換えられる。抗原結合を排除することのないヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を特定する方法は当該技術で周知である。

【0057】

用語「非保存的なアミノ酸置換」は、別のクラスのアミノ酸によるあるクラスのアミノ酸の置換、たとえば、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎのようなクラスＩＩＩの残基によるクラスＩＩの残基Ａｌａの置換を指す。

【0058】

或いは、別の実施形態では、たとえば、飽和変異誘発によって抗ＥＧＦＲ抗体のコーディング配列のすべて又は一部に沿って無作為に変異（保存的又は非保存的）を導入することができ、得られた修飾された抗ＥＧＦＲ抗体を結合活性についてスクリーニングすることができる。

【0059】

「コンセンサス配列」は、ファミリー又は関連する配列にて最も頻繁に存在するアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成される配列である。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列における各位置はファミリーにおけるその位置で最も頻繁に存在するアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が同等に頻繁であるならば、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。免疫グロブリンの「コンセンサスフレームワーク」はコンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域を指す。同様に、ＣＤＲについてのコンセンサス配列は本明細書で提供されるＥＧＦＲ抗体のＣＤＲアミノ酸配列の最適な配列比較によって導き出される。

【0060】

核酸について、用語「実質的な相同性」は、２つの核酸又はその指定された配列が、最適に並べられ、比較された場合、適当なヌクレオチドの挿入又は欠失を伴って、ヌクレオチドの少なくとも約８０％にて、ヌクレオチドの普通少なくとも約９０％〜９５％、さらに好ましくは少なくとも約９８％〜９９．５％同一であることを示す。或いは、実質的な相同性は、選択的なハイブリッド形成条件下で断片を鎖の相補物とハイブリッド形成させるときに存在する。

【0061】

核酸は、全細胞にて、細胞溶解物にて、又は部分精製の形態で、又は実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動及び当該技術で周知のその他を含む常法によって他の細胞性成分又は他の混入物、たとえば、他の細胞性の核酸又はタンパク質から精製されると、「単離される」又は「実質的に純粋にされる」。

【0062】

核酸組成物は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はその混合物に由来する天然の配列（修飾された制限部位等を除く）を含むことが多い一方で、代わりに常法に従って変異させ、改変遺伝子配列を提供し得る。コーディング配列については、これらの変異は、コードされたアミノ酸配列を所望のように修飾し得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチの配列及び本明細書で記載される他のそのような配列に実質的に相同性のＤＮＡ配列が熟考される。

【0063】

用語「操作可能に連結される」は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれた核酸配列を指す。たとえば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、ポリペプチドのためのＤＮＡに操作可能に連結され；プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼすのであれば、コーディング配列に操作可能に連結され；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置づけられるのであれば、コーディング配列に操作可能に連結される。一般に「操作可能に連結される」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合、隣接し、読み取り工程にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは隣接する必要はない。連結は好都合な制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しなければ、従来の実践に従って合成オリゴヌクレオチドのアダプタ又はリンカーを使用する。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、「操作可能に連結される」。たとえば、プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼすのであれば、コーディング配列に操作可能に連結される。転写調節配列に関しては、操作可能に連結されるは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、２つのタンパク質コーディング領域を接続する必要がある場合、隣接しており、読み取りフレームにあることを意味する。スイッチ配列については、操作可能に連結されるは、配列がスイッチ組換えを達成することが可能であることを示す。

【0064】

用語「ベクター」は、本明細書で使用されるとき、それが連結される別の核酸を輸送することが可能である核酸分子を指すように意図される。ベクターの１種が「プラスミド」であり、それは、追加のＤＮＡ断片が連結され得る円形の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、その際、追加のＤＮＡ断片はウイルスのゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞にて自律的な複製が可能である（たとえば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳類ベクター）。他のベクター（たとえば、非エピソーム性の哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに統合することができ、それによって宿主細胞と共に複製される。さらに、特定のベクターはそれらが操作可能に連結される遺伝子の発現を指揮することが可能である。そのようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ法で有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。用語「プラスミド」及び「ベクター」は相互交換可能に使用され得る。しかしながら、同等の機能を果たす、たとえば、ウイルスベクター（たとえば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも熟考される。

【0065】

用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は本明細書で使用されるとき、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すように意図される。そのような用語は特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すように意図されることが理解されるべきである。突然変異又は環境の影響のために特定の修飾が連続する世代で生じ得るので、そのような子孫は実際、親細胞と同一ではないが、本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含められる。

【0066】

用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は本明細書で使用されるとき、本明細書で記載される治療方策又は予防方策を指す。「治療」の方法は、ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患又は障害を防ぐ、治す、遅らせる、その重症度を軽減する、若しくは疾患又は障害又は再発している疾患又は障害の１以上の症状を改善するために、又はそのような治療の非存在下で期待されるものを超えて対象の生存を延長するために、対象、たとえば、そのような疾患又は症状を有する又はそのような疾患又は症状を有する素因がある対象への本明細書で開示される抗体又は抗体の対又は３つ組の投与を採用する。

【0067】

用語「ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患」又は「ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する障害」は本明細書で使用されるとき、高いレベルのＥＧＦＲ及び／又はＥＧＦＲが関与する細胞性カスケードの活性化が見つかる疾患状態及び／又は疾患状態に関連する症状を含む。用語「ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患」はまた、代替のＥＧＦＲシグナル伝達経路の活性化に関連する疾患状態及び／又は症状も含む。一般に、用語「ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患」は、ＥＧＦＲの関与を必要とする障害、症状の発症、進行、又は持続を指す。例となるＥＧＦＲが介在する障害には、たとえば、癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0068】

用語「癌」及び「癌性」は、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的状態を指し、又は記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、膠芽細胞腫及び神経線維腫のような膠細胞腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、悪性黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、及び様々な種類の頭頸部の癌が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で開示される方法を用いて治療される又は診断される癌は、悪性黒色腫、卵巣癌、腎癌、消化器／結腸癌、肺癌及び前立腺癌から選択される。

【0069】

用語「有効量」は本明細書で使用されるとき、対象に投与すると、本明細書で記載されるようなＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患の治療、予後診断又は診断を達成するのに十分であるＥＧＦＲに結合する抗体又はその抗原結合部分の量を指す。本明細書で提供される抗体の治療上有効な量は、単独で又は併用で使用したとき、抗体及び組み合わせの相対的な活性（たとえば、細胞増殖を阻害することにおいて）によって、及び治療される対象及び疾患の状態、対象の体重及び年齢、疾患の状態の重症度、投与等の方法によって変化するであろうが、それは当業者が容易に決定することができる。投与のための投与量は、たとえば、約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ、又は約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇの抗体の範囲である。投与計画を調整して最適な治療応答を提供し得る。有効量は、抗体の毒性効果又は有害効果（すなわち、副作用）が有益な効果によってできる限り抑えられる及び／又はそれよりも有益な効果が上回るものでもある。

【0070】

用語「治療剤」は、疾患若しくは障害の症状の重症度を減らす若しくは抑える、又は疾患若しくは障害にて症状のない頻度及び／又は持続時間若しくは症状の低下した期間を増やす、又は疾患若しくは障害の苦痛による損傷若しくは障害を抑える若しくは防ぐ、又は疾患若しくは障害の進行を抑える若しくは遅らせる、又は疾患若しくは障害の発症を抑える若しくは遅らせる、又は感染性の疾患若しくは障害にて感染抑える若しくは防ぐ能力を有する化合物のいずれか及びすべてを包含するように意図される。治療剤の非限定例には、有機小分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組換え操作した生物剤、ＲＮＡｉ化合物、チロシンキナーゼ阻害剤、及び市販の抗体が挙げられる。特定の実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤には、たとえば、エルロチニブ、ゲフィチニブ及びラパチニブが挙げられ、それらは現在市場にある医薬である。市販医薬抗ＥＧＦＲ抗体にはセツキシマブ及びパニツムマブが挙げられる。他の医薬抗ＥＧＦＲ抗体にはザルツムマブ、ニモツズマブ及びマツズマブが挙げられるが、それらは現在開発中である。

【0071】

用語「患者」には、予防的処置又は治療的処置をうけるヒト対象及び他の哺乳類対象が含まれる。

【0072】

用語「対象」には、哺乳類、たとえば、霊長類が含まれる。たとえば、本明細書で開示される方法及び組成物は、癌を有する対象を治療するのに使用することができる。特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0073】

用語「試料」は、患者又は対象から採取された組織、体液、又は細胞（又は前述のいずれかの分画）を指す。普通、組織又は細胞が患者から取り出されるが、生体内診断も熟考される。固形腫瘍の場合、組織試料は外科的に切除した腫瘍から取り出すことができ、従来の技法によって試験のために調製される。リンパ腫及び白血病の場合、リンパ球、白血病細胞又はリンパ節を得ることができ（たとえば、血液からの白血病細胞）、適宜調製することができる。尿、涙、血清、血漿、脳脊髄液、糞便、喀痰、細胞抽出物等を含む他の試料も特定の癌については有用であり得る。

【0074】

以下の小節にて開示の種々の態様をさらに詳細に説明する。

【0075】

ＩＩ．抗ＥＧＦＲ抗体及びその併用
実施例にてＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘと呼ばれる３つを含む新規の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体が本明細書で開示される。Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘモノクローナル抗体は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３５２３８にて開示されたそれぞれｃａ、ｃｄ及びｃｈと呼ばれる元の抗体の親和性成熟した抗体である。元の抗体及び親和性成熟した抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を以下に示すが、親和性成熟した抗体における荷電したアミノ酸を太字で表し、下線を引いた。

【0076】

Ｐ１Ｘの完全長Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌのアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９及び２０に示す。Ｐ２Ｘの完全長Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌのアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及び２２に示す。Ｐ３Ｘの完全長Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌのアミノ酸配列をそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及び２４に示す。さらに、本明細書で提示されるようなＶ_Ｈ及びＶ_ＬのＣＤＲ断片は、たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ末端からカルボキシ末端の順に配置する。

【0077】

一実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体が提供され、重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列は、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列；
から成る群から選択される。

【0078】

別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が提供され、重鎖及び軽鎖の可変領域の配列は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域
から成る群から選択される。

【0079】

前述の抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせも提供される。そのような組み合わせは、たとえば、前述の抗ＥＧＦＲ抗体２つの組み合わせを含有することができる。別の組み合わせは前述の抗ＥＧＦＲ抗体の３つすべてを含むことができる。従って、別の態様では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する２又は３のモノクローナル抗体を含む組成物が提供され、２又は３のモノクローナル抗体は、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
から成る群から選択され、その際、組成物は、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む。

【0080】

さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインに結合する２又は３のモノクローナル抗体を含む組成物が提供され、２又は３のモノクローナル抗体は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体
から成る群から選択され、その際、組成物は、（ａ）と（ｂ）、（ａ）と（ｃ）、（ｂ）と（ｃ）又は（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含む。

【0081】

本明細書で開示される抗ＥＧＦＲ抗体は、単一抗体であれ、抗体の組み合わせであれ、たとえば、１００ｎＭより良好な又は１０ｎＭより良好な又は１ｎＭより良好なＫ_ＤでＥＧＦＲに結合することができる。Ｋ_Ｄに関して本明細書で使用されるとき、用語「＿ｎＭよりも良好」は抗体が示された数より低いナノモル濃度として表されるＫ_Ｄを有することを意味する。たとえば、１００ｎＭ「より良好な」Ｋ_Ｄは、１００ｎＭより低い値である（たとえば、５０ｎＭである）ナノモル濃度として表されるＫ_Ｄを示す。

【0082】

他の実施形態では、Ｐ１Ｘに関連する抗体、たとえば、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む抗体、又はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９及び２０のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列を含む抗体は、約１×１０^−９Ｍ〜１．１×１０^−１１Ｍ以上良好なＫ_ＤにてＥＧＦＲに結合することができる。

【0083】

他の実施形態では、Ｐ２Ｘに関連する抗体、たとえば、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む抗体、又はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１及び２２のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列を含む抗体は、約１×１０^−９Ｍ〜７．０×１０^−１１Ｍ以上良好なＫ_ＤにてＥＧＦＲに結合することができる。

【0084】

他の実施形態では、Ｐ３Ｘに関連する抗体、たとえば、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含む抗体、又はそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及び２４のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列を含む抗体は、約１×１０^−９Ｍ〜３．６×１０^−１０Ｍ以上良好なＫ_ＤにてＥＧＦＲに結合することができる。

【0085】

本明細書で開示される抗ＥＧＦＲ抗体は、単一抗体であれ、抗体の組み合わせであれ、
（ａ）細胞に基づいたアッセイにて測定されるようなＡＫＴ又はＥＲＫのリン酸化、たとえば、ＥＧＦＲ依存性のＡＫＴ又はＥＲＫのリン酸化の阻害；
（ｂ）ＥＧＦＲを発現している細胞の増殖の阻害；
（ｃ）ＥＧＦＲへのＥＧＦＲリガンドの結合の阻害（たとえば、ＥＧＦ、ヘパリン結合性のＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、エピゲン、エピレグリン、ベタセルリン、又はアンフィレグリンを含む１以上のリガンドのＥＧＦＲへの結合の阻害）；
（ｄ）ＥＧＦＲ二量化の阻害；
（ｅ）細胞表面上のＥＧＦＲの下方調節（たとえば、受容体の内部移行及び再利用、及び／又は受容体の内部移行及び分解による）；
（ｆ）試験管内の腫瘍細胞の増殖の阻害；及び／又は
（ｇ）生体内の腫瘍増殖の阻害
を含むが、これらに限定されない本明細書で開示されるような１以上の他の機能特性を示すことができる。

【0086】

本明細書で開示される抗体にはあらゆる既知の形態の抗体及び抗体様の特性を持つタンパク質の骨組みが含まれる。たとえば、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、免疫複合体、キメラ抗体、又はフィブロネクチン又はアンキリン反復のような抗体様の特性を持つタンパク質の骨組みであることができる。抗体はまた、Ｆａｂ、Ｆａｂ'２、ＳｃＦｖ、アフィボディ（登録商標）、アビマー、ナノボディ又はドメイン抗体であることができる。抗体はまた、以下のアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプを有することもできる。ＩｇＧ抗体が好まれる。標準の組換えＤＮＡ法及び可変領域の配列に操作可能に連結される所望の定常領域の配列をコードする核酸を用いて、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌの配列から完全長の抗体を調製することができる。好適な定常領域の非限定例には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５にて開示される軽鎖κ定常領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６にて開示されるＩｇＧ１重鎖定常領域が挙げられる。

【0087】

実施例にて開示されるように、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体の３剤併用は、２：２：１のＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３Ｘのモル比にて使用されると特に有効であることが発見されている。従って、そのような３抗体併用については、総濃度の４０％がＰ１Ｘであるように選択され、総濃度の４０％がＰ２Ｘであるように選択され、総濃度の２０％がＰ３Ｘであるように選択される。

【0088】

従って、別の実施形態では、３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物が提供され、前記組成物は、第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、その際、（ｉ）第１の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み；並びに（ｉｉｉ）第３の抗体は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含み、その際、第１と第２と第３の抗体は、互いに２：２：１のモル比で存在する。

【0089】

さらに別の実施形態では、３つのモノクローナル抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物が提供され、前記組成物は、第１の抗体と第２の抗体と第３の抗体を含み、その際、（ｉ）第１の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含み；（ｉｉ）第２の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含み；並びに第３の抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含み、その際、第１と第２と第３の抗体は、互いに２：２：１のモル比で存在する。

【0090】

３つの抗体を含む抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法が提供され、抗体は２：２：１の比で調製される。さらに具体的には、別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法が提供され、該方法は、単一の組成物にて
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体を組み合わせることを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で組み合わせられる。

【0091】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体組成物を調製する方法が提供され、該方法は、単一の組成物にて
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を組み合わせることを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比で組み合わせられる。

【0092】

抗体が２：２：１の比で対象に投与される３つの抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法が提供される。さらに具体的には、抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法が提供され、該方法は対象に、
（ａ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２及び３の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、５及び６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８及び９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、１１及び１２の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列及びそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７及び１８の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を含むモノクローナル抗体を投与することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比にて対象に投与される。

【0093】

別の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体で対象を治療する方法が提供され、該方法は対象に、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体；並びに
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を含む重鎖可変領域及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を投与することを含み、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は互いに２：２：１のモル比にて対象に投与される。

【0094】

抗ＥＧＦＲ抗体を薬学的組成物に製剤化すること及びＥＧＦＲ関連疾患においてそのような組成物を使用する方法に関するさらなる詳細を以下の小節で説明する。

【0095】

ＩＩＩ．抗体を作出する方法
（ｉ）モノクローナル抗体
本明細書で提供されるモノクローナル抗体は最も通常では、本明細書で開示されるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌの領域のアミノ酸配列に基づいて標準の組換えＤＮＡ法によって調製される。

【0096】

さらに又は代わりに、モノクローナル抗体は、種々の既知の方法、たとえば、標準の体細胞ハイブリッド形成法、Ｂリンパ球のウイルス若しくは癌遺伝子による形質転換、又はヒト抗体遺伝子のライブラリを用いた酵母若しくはファージのディスプレイ法を用いて作出することができる。特定の実施形態では、抗体は完全なヒトモノクローナル抗体である。

【0097】

従って、一実施形態では、ＥＧＦＲを結合する抗体を作出するのにハイブリドーマ法が使用される。この方法では、免疫に使用する抗原に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することが可能であるリンパ球を引き出すために、好適な抗原でマウス又は他の適当な宿主動物を免疫することができる。或いは、試験管内でリンパ球を免疫してもよい。次いでポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成することができる。抗原に向けられたモノクローナル抗体の産生についてハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地をアッセイする。所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定した後、限界希釈法によってクローンを継代し、常法によって増殖させる。この目的に好適な培養培地には、たとえば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、動物における腹水腫瘍としてハイブリドーマ細胞を生体内で増殖させてもよい。サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、従来の免疫精製法、たとえば、プロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィによって培養培地、腹水液、又は血清から分離することができる。

【0098】

別の実施形態では、ＥＧＦＲを結合する抗体は、たとえば、Ｌａｄｎｅｒらへの米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；及び同第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらへの米国特許第５，４２７，９０８号；及び同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらへの米国特許第５，９６９，１０８号；及び同第６，１７２，１９７号；並びにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらへの米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号；及び同第６，５９３，０８１号に記載されたもののような周知の技法を用いて生成した抗体ライブラリから単離することができる。さらに、非常に大きなファージライブラリを構築する戦略としての組み合わせ感染及び生体内組換えと同様に、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の作出も使用され得る。たとえば、米国特許出願番号０９／８５６，９０７（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／３１２４６）を参照のこと。

【0099】

特定の実施形態では、ＥＧＦＲを結合するモノクローナル抗体はファージディスプレイを用いて作出される。この技法には、ヒトドナーから単離された免疫グロブリン配列の独特の組み合わせを有し、重鎖ＣＤＲにおける合成多様性を有するヒトＦａｂライブラリの生成が関与する。次いでＥＧＦＲに結合するＦａｂについてライブラリをスクリーニングする。

【0100】

さらに別の実施形態では、ＥＧＦＲに向けられたヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなくヒトの免疫系の一部を運ぶ遺伝子導入した又は染色体導入したマウスを用いて生成することができる（たとえば、すべてＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙへの米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９；号；及び同第５，７７０，４２９号；Ｓｕｒａｎｉらへの米国特許第５，５４５，８０７号；すべてＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙへのＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９７／１３８５２，ＷＯ９８／２４８８４及びＷＯ９９／４５９６２；並びにＫｏｒｍａｎらへのＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／１４４２４を参照のこと）。

【0101】

別の実施形態では、導入遺伝子及び導入染色体にてヒト免疫グロブリン配列を運ぶマウス、たとえば、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を運ぶマウス（たとえば、ＩｓｈｉｄａらへのＰＣＴ公開番号ＷＯ０２／４３４７８を参照）を用いてヒト抗体を生じることができる。

【0102】

その上さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替の遺伝子導入動物系が当該技術で利用可能であり、抗ＥＧＦＲ抗体を生成するのに使用することができる。たとえば、Ｘｅｎｏマウス（Ａｂｇｅｎｉｘ社）と呼ばれる代替の遺伝子導入系を使用することができ、そのようなマウスは、たとえば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらへの米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号；及び同第６，１６２，９６３号に記載されている。

【0103】

さらにヒト免疫グロブリンを発現する代替の染色体導入動物の系が当該技術で利用可能であり、抗ＥＧＦＲ抗体を生成するのに使用することができる。たとえば、ヒトの重鎖導入染色体とヒトの軽鎖導入染色体の双方を持つマウスを使用することができる。さらに、ヒトの重鎖と軽鎖の導入染色体を持つウシが当該技術で記載されており、抗ＥＧＦＲ抗体を生成するのに使用することができる。

【0104】

さらに別の実施形態では、遺伝子導入植物及び／又はそのような抗体を産生する培養植物細胞（たとえば、タバコ、トウモロコシ及びウキクサ）を用いて抗体を調製することができる。たとえば、誘導性プロモータを用いてそのような抗体を作出するのに、抗体を発現する遺伝子導入タバコを使用することができる。また、遺伝子導入トウモロコシを用いてそのような抗体及びその抗原結合部分を発現させることができる。たとえば、タバコの種子及びジャガイモの塊茎を用いて、たとえば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のような抗体の一部を含む遺伝子導入植物の種子から抗体を大量に生産することもできる。

【0105】

ここで開示されるものを含む任意の技法を用いて調製したＥＧＦＲを結合するモノクローナル抗体（又はその一部）の結合特異性は、免疫沈降によって、又はたとえば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような試験管内の結合アッセイによって決定することができる。モノクローナル抗体又はその一部の結合親和性はＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定することができる。

【0106】

特定の実施形態では、上記で議論した方法のいずれかを用いて作出したＥＧＦＲ抗体を、たとえば、本明細書で記載されるもののような当該技術で承認された技法を用いてさらに改変し、又は最適化し、所望の結合特異性及び／又は親和性を達成し得る。

【0107】

一実施形態では、ＥＧＦＲ抗体に由来する部分抗体配列を用いて構造的に及び機能的に関連する抗体を作出し得る。たとえば、抗体は、６つの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して主として標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲの中のアミノ酸配列はＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で多様性が大きい。ＣＤＲの配列はほとんどの抗体／抗原の相互作用に関与しているので、異なる特性を持つ異なる抗体に由来するフレームワーク配列に導入した特定の天然に存在する抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって特定の天然に存在する抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現することが可能である。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列の抗体遺伝子の配列を含む公的なＤＮＡデータベースから入手することができる。

【0108】

従って、たとえば、ＣＤＲのような抗ＥＧＦＲ抗体の１以上の構造的な特徴を用いて少なくとも１つの所望の機能的特性、たとえば、ＥＧＦＲを発現している細胞の増殖を阻害することを保持する構造的に関連した抗ＥＧＦＲ抗体を創ることができる。

【0109】

特定の実施形態では、本明細書で開示される１以上のＣＤＲ領域をヒトの既知のフレームワーク領域及びＣＤＲと組換えによって組み合わせて、追加の組換え操作した抗ＥＧＦＲ抗体を創る。重鎖及び軽鎖の可変フレームワーク領域は同一の又は異なった抗体配列に由来することができる。

【0110】

抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３ドメインは、抗原についての抗体の結合特異性／親和性にて特に重要な役割を担うことが当該技術で周知である。従って、特定の実施形態では、本明細書で記載される特定の抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ３を含む抗体が生成される。抗体はさらに、本明細書で記載される抗体の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２を含むことができる。

【0111】

上述の操作された抗体のＣＤＲ１、２及び／又は３の領域は、本明細書で開示されるもののように正確なアミノ酸配列を含む。しかしながら、当業者は、正確なＣＤＲ配列からの若干の逸脱が可能であってもよく、特にＣＤＲ１及びＣＤＲ２の配列についてはＣＤＲ３の配列よりもエピトープの特異性を変えることなくさらなる変異を認容することができる（そのような逸脱は、たとえば、保存的なアミノ酸置換である）ことを十分に理解するであろう。従って、別の実施形態では、操作された抗体は、本明細書で名付けられた抗体の相当するＣＤＲと、たとえば、９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．５％同一である１以上のＣＤＲ１及びＣＤＲ２から構成され得る。

【0112】

別の実施形態では、ＣＤＲの１以上の残基を改変して結合を変え、さらに有利な結合の結合速度を達成し得る。この戦略を用いて、たとえば、１０^１０Ｍ^−１以上の超高結合を有する抗体を達成することができる。当該技術で周知の親和性成熟及び本明細書で記載されるものを用いてＣＤＲ領域を改変し、その後、結合における所望の変化について得られた結合分子をスクリーニングすることができる。従って、ＣＤＲが改変されると、免疫原性と同様に結合親和性における変化がモニターされ、最適に組み合わせられた結合と低い免疫原性について最適化された抗体が達成されるようにスコア化される。

【0113】

修飾は、これらの修飾に続く抗原結合親和性が１０^６Ｍ^−１よりも良好である限り、抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域の１以上のフレームワーク領域又は連結領域の範囲内で行うことができる。

【0114】

別の実施形態では、抗体は、たとえば、癌を治療することにおける抗体の有効性を高めるようにエフェクター機能に関してさらに修飾される。たとえば、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入し、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。こうして生成されるヘテロ二量体抗体は、改善された内部移行能力及び／又は高い補体介在性細胞殺傷性及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。高い抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体もヘテロ二官能性交差リンカーを用いて調製され得る。或いは、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作することができ、それによって高い補体溶解及びＡＤＣＣの能力を有し得る。

【0115】

以下で議論されるように二重特異性抗体及び免疫複合体も提供される。

【0116】

（ｉｉ）二重特異性抗体
本明細書での二重特異性抗体は、好ましくは重複しない又は競合しないエピトープに結合するＥＧＦＲについて少なくとも２つの結合特異性を含む。そのような二重特異性抗体は、追加の結合特異性、たとえば、第３のＥＧＦＲ結合特異性及び／又は別のＥｒｂＢ受容体（たとえば、ＥｒｂＢ３）若しくは別の抗原についての特異性を含むことができる。二重特異性抗体は、完全長の抗体又は抗体断片（たとえば、Ｆ（ａｂ'）_２二重特異性抗体）として調製することができる。

【0117】

二重特異性抗体を作製する方法は当該技術で周知である（たとえば、ＷＯ０５１１７９７３及びＷＯ０６０９１２０９を参照）。たとえば、完全長の二重特異性抗体の作出は、２つの対になった免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の同時発現に基づくことができ、その際、２つの鎖は異なる特異性を有する。組換え細胞の培養物から直接、二重特異性抗体断片を作製し、単離するための種々の技法も記載されている。たとえば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを用いて作出されている。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。

【0118】

特定の実施形態では、二重特異性抗体は、別の機能的な分子、たとえば、別のペプチド又はタンパク質（たとえば、受容体に対する抗体又はリガンド）に誘導体化される又は連結されるＥＧＦＲに結合する第１の抗体（又はその結合部分）を含んで、少なくとも２つの異なる部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成する。抗体は１を超える他の機能的分子に誘導体化され又は連結されて２を超える異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多重特異性分子を生成し；そのような多重特異性分子も本明細書で使用されるような用語「二重特異性分子」によって包含されるように意図される。二重特異性分子を創るために、本明細書で開示される抗体を、結果として二重特異性分子が生じるように、１以上の他の結合分子、たとえば、別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣体に機能的に連結することができる（たとえば、カップリング、遺伝子融合、非共有関係又はその他によって）。

【0119】

従って、ＥＧＦＲについての少なくとも１つの第１の結合特異性及び第２の標的エピトープについての第２の結合特異性を含む二重特異性分子が熟考される。特定の実施形態では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、たとえば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）又はヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。従って、ＦＣγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（たとえば、単球、マクロファージ又は多形核球（ＰＭＮ））及びＥＧＦＲを発現する標的細胞の双方に結合することが可能である二重特異性分子も提供される。これらの二重特異性分子はエフェクター細胞に対してＥＧＦＲを発現する細胞を標的とし、Ｆｃ受容体介在性のエフェクター細胞活性、たとえば、ＥＧＦＲを発現する細胞の貪食、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、サイトカインの放出、又はスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。

【0120】

一実施形態では、二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１つの抗体、又はたとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）_２又は単鎖Ｆｖを含むその抗体断片を含む。抗体は、軽鎖又は重鎖の二量体であってもよく、又はＬａｄｎｅｒらの米国特許第４，９４６，７７８号に記載されたようなＦｖ若しくは単鎖構築物のようなその最小限の断片であってもよい。

【0121】

二重特異性分子は、当該技術で既知の方法を用いて、構成的な結合特異性、たとえば、抗ＦｃＲ及び抗ＥＧＦＲ結合特異性を複合させることによって調製することができる。たとえば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成し、次いで互いに複合させることができる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、種々のカップリング剤又は架橋剤を共有結合に使用することができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、５,５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる。好まれる複合剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、双方ともＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（イリノイ州、ロックフォード）から入手可能である。

【0122】

結合特異性が抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合させることができる。特に好まれる実施形態では、ヒンジ領域は、複合に先立って、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つを含有するように改変される。

【0123】

或いは、双方の結合特異性は同一のベクターにコードすることができ、同一の宿主細胞で発現させ、会合させることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）_２、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合、特に有用である。二重特異性分子は、単鎖抗体１つと結合決定基を含む単鎖分子、又は２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であることができる。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、たとえば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。

【0124】

特定の標的に対する二重特性分子の結合は、たとえば、酵素連結免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（たとえば、増殖阻害）又はウエスタンブロット法によって確認することができる。これらの方法のそれぞれは、当該複合体に特異的な標識試薬（たとえば、抗体）を用いてタンパク質／抗体の当該複合体の存在を一般に検出する。たとえば、ＦｃＲ抗体複合体は、抗体／ＦｃＲ複合体を認識し、特異的に結合する、酵素に連結した抗体又は抗体断片を用いて検出することができる。或いは、複合体は種々の他の免疫アッセイのいずれかを使用することによって検出することができる。たとえば、抗体を放射活性で標識し、放射性免疫法（ＲＩＡ）に使用することができる。γ−βカウンタ若しくはシンチレーションカウンタの使用のような手段によって、又はオートラジオグラフィによって放射性同位元素を検出することができる。

【0125】

（ｉｉｉ）免疫複合体
本明細書で提供される免疫複合体は、本明細書で記載される抗体を別の治療剤に複合させることによって形成することができる。好適な剤には、たとえば、細胞傷害剤（たとえば、化学療法剤）、毒素（たとえば、細菌、真菌、植物又は動物が起源の酵素的に活性のある毒素又はその断片）、及び／又は放射性同位元素（たとえば、放射性複合体）が挙げられる。

【0126】

そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は上記で記載されている。使用することができる酵素的に活性のある毒素又はその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エンドトキシンＡ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、αサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。放射性複合された抗ＥＧＦＲ抗体を作出するのに種々の放射性核種が利用可能である。例には、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ及び^１８６Ｒｅが挙げられる。

【0127】

免疫複合体は、たとえば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（たとえば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（たとえば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（たとえば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（たとえば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（たとえば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（たとえば、トリエン２,６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（たとえば、１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）のような種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性核種を複合させるための例となるキレート剤である（たとえば、ＷＯ９４／１１０２６を参照）。

【0128】

ＩＶ．抗体をスクリーニングする方法
抗体の作出に続いて、当該技術で周知の種々のアッセイを用いて、本明細書に記載されるような種々の特性について抗体をスクリーニングすることができる。

【0129】

一実施形態では、たとえば、精製したＥＧＦＲ及び／又はＡ４３１細胞のようなＥＧＦＲ発現細胞を用いて、ＥＧＦＲへの結合について（たとえば、フローサイトメトリー又はＥＬＩＳＡによって）抗体をスクリーニングする。抗ＥＧＦＲ抗体が結合するエピトープをさらに特定し、比較して、たとえば、結合について競合する及び／又は同一の若しくは重複するエピトープを結合する抗体と同様に競合しない抗体（たとえば、異なるエピトープに結合する抗体）を特定する。

【0130】

日常の技法を用いて競合抗体及び非競合抗体を特定することができる。そのような技法には、たとえば、標的抗原への別の抗体の結合を阻止する（又は阻止しない）１つの抗体の能力を示す免疫アッセイ、すなわち、競合結合アッセイが挙げられる。競合結合は、試験のもとで免疫グロブリンが共通する抗原、たとえば、ＥＧＦＲへの参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイにて決定される。たとえば、固相直接又は間接放射性免疫法（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素免疫法（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ、固相直接ビオチン／アビジンＥＩＡ、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ、固相直接^１２５Ｉ標識ＲＩＡ、固相直接ビオチン／アビジンＥＩＡ及び直接標識ＲＩＡのような多数の種類の競合結合アッセイが知られている。以下の実施例の材料及び方法、並びに実施例２にて言及される表面プラスモン共鳴法もこの目的で有利に使用することができる。通常、そのようなアッセイには、固相表面又はこれらのいずれかを運ぶ細胞に結合する精製した抗原、非標識の試験免疫グロブリン、及び標識した参照免疫グロブリンが関与する。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下での固相表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。普通、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。普通、競合する抗体が過剰に存在すれば、共通の抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％。６５〜７０％、７０〜７５％以上阻害するであろう。

【0131】

本明細書で開示される抗体が結合するエピトープを決定する他のスクリーニング法には、たとえば、抗原／抗体複合体の結晶のＸ線解析が挙げられ、それはエピトープの原子分解を提供する。他の方法は、抗原断片又は抗原の変異した変化体への抗体の結合をモニターし、抗原配列の中でのアミノ酸残基の修飾による結合の喪失はエピトープ成分の指摘とみなされることが多い。加えて、エピトープのマッピングについてのコンピュータによる組み合わせ法も使用することができる。これらの方法は、組み合わせファージディスプレイペプチドライブラリに由来する特定の短いペプチドを親和性で単離する当該抗体の能力に頼る。ペプチドは次いでペプチドライブラリをスクリーニングするのに使用された抗体に相当するエピトープを規定するための糸口とみなされる。エピトープマッピングについては、構造的に不連続のエピトープをマッピングすることが示される計算アルゴリズムが開発されている。

【0132】

別の実施形態では、リガンド、たとえば、ＥＧＦＲへの結合の際、露出されるエピトープに結合する能力について抗体（たとえば、非競合性抗体抗ＥＧＦＲ抗体）をスクリーニングする（すなわち、ＥＧＦＲへのＥＧＦＲ結合リガンドの結合を阻害しない）。そのような抗体は、たとえば、抗ＥＧＦＲ抗体の非存在下（対照）又は存在下でＥＧＦＲ（たとえば、Ａ４３１細胞）を発現している細胞を標識したＥＧＦＲリガンド（たとえば、放射性標識又はビオチン化ＥＧＦ）に接触させることによって特定することができる。抗体がＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を阻害しなければ、そのときは、抗体の非存在下における量に比べて回収される標識の量で統計的に有意な低下は認められないであろう。或いは、抗体がＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を阻害するのであれば、そのときは、抗体の非存在下における量に比べて回収される標識の量で統計的に有意な低下が認められるであろう。

【0133】

抗体はその結合親和性についてもスクリーニングする（調べる）ことができる。たとえば、以下で記載されるようなプラスモン共鳴アッセイを用いてこれを実施することができる。

【0134】

本明細書で記載されるもののようなシグナル伝達アッセイを用いてＥＧＦＲを介したシグナル伝達を阻害する能力についても抗体をスクリーニングすることができる。たとえば、ＥＧＦＲリガンドが介在するＥＧＦＲのリン酸化を阻害する抗体の能力は、抗体の存在下又は非存在下でＥＧＦＲを発現する細胞をＥＧＦＲリガンド（たとえば、ＥＧＦ）によって処理することによって評価することができる。次いで細胞を溶解し、粗精製の溶解物を遠心して不溶物を取り除き、ウエスタンブロッティング、その後の抗ホスホチロシン抗体による探査によってＥＧＦＲのリン酸化を測定することができる。

【0135】

或いは、ＥＧＦＲを介する下流のシグナル伝達を阻害する抗体の能力は、たとえば、ＡＫＴ及び／又はＥＲＫのようなＥＧＦＲの既知の基質についてのキナーゼアッセイ、その後のＥＧＦリガンドによるＥＧＦＲの刺激によって測定することができる。たとえば、ＥＧＦＲを発現している細胞を候補抗体と共にインキュベートし、ＥＧＦリガンドによって刺激することができる。そのような細胞からその後調製した細胞溶解物を、ＥＧＦＲの基質（又はＥＧＦＲが関与する細胞性経路におけるタンパク質）に対する抗体、たとえば、抗ＡＫＴ抗体によって免疫沈降し、当該技術で承認された技術を用いてキナーゼ活性（たとえば、ＡＫＴキナーゼ活性）についてアッセイすることができる。抗体の非存在下でのレベル又は活性に比べて抗体の存在下でのＥＧＦＲ基質又はＥＧＦＲが関与する経路におけるタンパク質のレベル又は活性（たとえば、キナーゼ活性）の低下又は完全な消失は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する抗体を示す。

【0136】

細胞表面におけるＥＧＦＲのレベルを低下させる抗体は、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲの発現を下方調節する又は阻害するその能力によって特定することができる。特定の実施形態では、抗体は、ＥＧＦＲの内部移行を誘導する（又はエンドサイトーシスを高める）ことによって（たとえば、受容体の内部移行及び再利用及び／又は受容体の内部移行及び分解によって）、又は内部移行したＥＧＦＲの再利用を阻害することによって細胞表面上のＥＧＦＲを減らす。これを調べるには、ＥＧＦＲをビオチン化し、細胞表面上のＥＧＦＲ分子の数を、たとえば、抗体の存在下又は非存在下での培養における単層の細胞にてビオチンの量を測定し、その後ＥＧＦＲを免疫沈降し、ストレプトアビジンで探査することによって容易に決定することができる。抗体の存在下でのビオチン化ＥＧＦＲの経時的な検出における低下は、細胞表面上のＥＧＦＲのレベルを低下させる抗体を示す。

【0137】

以下の実施例にて記載されるＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ及びトリチウム標識チミジン取り込みアッセイを含む当該技術で承認された技法を用いて、たとえば、腫瘍細胞のようなＥＧＦＲを発現している細胞の増殖を阻害するその能力（生体内又は試験管内のいずれか）について抗体及び抗体の組み合わせを調べることもできる。ＥＧＦＲを発現している細胞の立体増殖を阻害する能力についても抗体をスクリーニングすることができる。これは、本明細書で記載されるような発達している腫瘍増殖の状態を近似するアッセイを用いて実施することができる。

【0138】

別の実施形態では、たとえば、ＥＧＦＲが介在するシグナル伝達のような特定のＥＧＦＲの活性又は機能を測定すること（たとえば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタン、又はＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）のような多重法によって測定されるように）に対するＩＣ５０及び／又はＩＣ９０について抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせをスクリーニングすることができる。そのそれぞれが特定の所望のＩＣ５０及び／又はＩＣ９０値（たとえば、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することに関して約８０ｎＭのＩＣ９０）を持つ抗体の組み合わせを次いで選択することができる。一実施形態では、組み合わせは既知の参照抗体（たとえば、セツキシマブ）よりも大きなＩＣ５０又はＩＣ９０を有する。別の実施形態では、組み合わせは相加的なＩＣ５０又はＩＣ９０を有する（すなわち、ＥＧＦＲを発現する細胞に個々に作用する場合、抗体の活性の合計が同じ細胞に一緒に作用する同一抗体の組み合わせた効果にほぼ等しい）。別の実施形態では、組み合わせは相乗的なＩＣ５０又はＩＣ９０を有する（すなわち、ＥＧＦＲを発現する細胞に個々に作用する場合、抗体の活性の合計が同じ細胞に一緒に作用する同一抗体の組み合わせた効果より小さい）。

【0139】

Ｖ．薬学的組成物
別の態様では、本明細書で提供されるのは、薬学上許容可能なキャリアと一緒に製剤化された本明細書で開示される抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体１つ又はその組み合わせを含有する組成物、たとえば、薬学的組成物である。一実施形態では、組成物はＥＧＦＲ上の異なるエピトープに結合する複数（たとえば、２又は３）の単離された抗体の組み合わせを含む。そのような抗体は好ましくは、たとえば、ＥＧＦＲが介在するシグナル伝達のような特定のＥＧＦＲの活性又は機能を阻害することに関して相加的な又は相乗的な効果を有する。好まれる組成物は、無菌組成物、注射に好適な組成物、及び静脈内注射によるような所望の投与経路による注射に好適な無菌組成物である。

【0140】

本明細書で使用されるとき、「薬学上許容可能なキャリア」には、生理学的に認容性である溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、等のいずれか及びすべてが含まれる。好ましくは、キャリアは静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮への投与（たとえば、注射又は点滴による）に好適である。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二重特異性及び多重特異性の分子は、物質にて被覆されて化合物を不活化し得る酸の作用及び他の天然の状態から化合物を保護し得る。

【0141】

組成物を単独で投与することができ、又は併用療法で、すなわち、他の剤と組み合わせて投与することができる。たとえば、併用療法は、本明細書で記載される抗癌剤のような少なくとも１以上の追加の治療剤と共に本明細書で提供される組成物を含むことができる。一実施形態では、併用療法は本明細書で開示される２又は３の抗ＥＧＦＲ抗体の本明細書で提供される組成物を使用することができる。別の実施形態では、併用療法は、１以上の他の抗体、たとえば、当該技術で既知の１以上の他の抗ＥＧＦＲ抗体（たとえば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３５２８）と組み合わせた本明細書で開示される少なくとも１つの抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物を使用することができる。組成物はまた放射線療法及び／又は手術と併せて投与することもできる。抗ＥＧＦＲ抗体の特定の組み合わせはまた、追加の治療剤の有無にて別々に又は順次投与され得る。

【0142】

当該技術で既知の種々の方法によって組成物を投与することができる。技量のある熟練者によって十分に理解されるように、投与の経路及び／又は方法は所望の成績に応じて変化するであろう。迅速な放出に対して抗体を保護するキャリア、たとえば、埋め込み、経皮貼付剤及び微細カプセル化送達系を含む徐放性製剤と共に抗体を調製することができる。たとえば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル及びポリ乳酸のような生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製に関する多数の方法に特許が与えられ、又はそれらは当業者に一般に知られている。

【0143】

特定の投与経路によって組成物を投与するには、その不活化を防ぐ物質で構成成分、たとえば、抗体を被覆する、又はそれと共に組成物を同時投与する必要があり得る。たとえば、組成物は、適当なキャリア、たとえば、リポソーム又は希釈剤にて対象に投与され得る。許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。リポソームには、従来のリポソームと同様に水中油中水のＣＧＦエマルジョンが挙げられる。

【0144】

許容可能なキャリアには、無菌水溶液又は分散液及び無菌の注射用水又は分散液の即席調製用の粉体が挙げられる。薬学上活性のある物質のためのそのような媒体及び剤の使用は当該技術で既知である。従来の媒体又は剤が抗体と相溶性でないという範囲を除いて、本明細書で提供される組成物におけるその使用が熟考される。補完性の活性のある構成成分も組成物に組み入れられ得る。

【0145】

治療組成物は通常、製造及び保存の条件下にて無菌で且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、又は高濃度の薬剤に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適正な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、組成物に等張剤、たとえば、糖類、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。吸収遅らせる剤、たとえば、一ステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることは注射組成物の延長された吸収をもたらすことができる。

【0146】

上記で列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に適当な溶媒にて必要とされる量でモノクローナル抗体を必要に応じて組み入れ、その後無菌化微細濾過によって無菌の注射用溶液を調製することができる。一般に、塩基性分散媒体及び上記で列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクルに抗体を組み入れることによって分散液を調製する。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉体の場合、調製の好まれる方法は、有効成分プラス以前無菌濾過したその溶液からの追加の所望の成分の粉体が得られる真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）である。

【0147】

投与計画を調整して最適な所望の応答（たとえば、治療応答）を提供する。たとえば、単一のボーラスを投与してもよく、幾つかに分割した用量を時間をかけて投与してもよく、又は治療状況の要件によって示されるように用量を比例的に増減してもよい。たとえば、ヒト抗体を皮下注射によって週に１回若しくは２回、又は皮下注射によって月に１回若しくは２回投与してもよい。

【0148】

投与の容易さ及び投与量の均一性のために投与単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。投与単位形態は本明細書で使用されるとき、治療される対象にとって単位投与量として適合させる物理的に個別の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的キャリアに関連した所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の抗体を含有する。本明細書で提供される投与単位形態についての明細は、（ａ）抗体の独特の特徴及び達成される特定の治療効果、並びに（ｂ）個体における感受性の治療についてそのような抗体を配合することの当該技術での固有の限界性によって及びそれらに直接応じて決定付けられる。薬学上許容可能な抗酸化剤の例には、（１）水溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、たとえば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等；及び（３）金属キレート剤、たとえば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。

【0149】

治療組成物については、製剤には、経口、鼻内、局所（頬内及び舌下を含む）、直腸内、及び非経口の投与に好適なものが挙げられる。非経口投与が、抗体を含む治療組成物にとっては最も一般的な投与経路である。製剤は単位投与形態で好都合に提示されてもよく、薬学の技術で既知の方法によって調製されてもよい。キャリア物質と組み合わせて単一の投与形態を生じる抗体の量は治療される対象及び特定の投与形態に応じて変化するであろう。抗体のこの量は一般に治療効果を生じるのに十分な量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約０．００１〜約９０質量パーセントの抗体、好ましくは約０．００５〜約７０パーセント、最も好ましくは約０．０１〜約３０パーセントの範囲であろう。

【0150】

語句「非経口投与」及び「非経口で投与する」は本明細書で使用されるとき、経腸及び局所投与以外の、普通、注射による投与の方法を意味し、限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨下の注射及び点滴が挙げられる。本明細書で提供される薬学的組成物にて採用され得る好適な水性及び非水性のキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、等）及び好適なその混合物、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合は必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。

【0151】

これらの組成物はまた、たとえば、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような補助剤も含有し得る。当該技術で周知の補助剤の特定の例には、たとえば、無機補助剤（たとえば、アルミニウム塩、たとえば、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム）、有機補助剤（たとえば、スクアレン）、油系補助剤、ウイロゾーム（たとえば、膜結合性の血球凝集素及びインフルエンザウイルス由来のノイラミダーゼを含有するウイロゾーム）が挙げられる。

【0152】

微生物の存在の防止は、無菌化処置によって及び種々の抗菌剤や抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の包含によっての双方で確保され得る。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム等を組成物に含めることも望ましくてもよい。加えて、たとえば、一ステアリン酸アルミニウム又はゼラチンのような吸収を遅らせる１以上の剤を含むことによって注射用医薬形態の延長された吸収がもたらされ得る。

【0153】

組成物が医薬としてヒト及び動物に投与される場合、それらは単独で与えることができ、又は薬学上許容可能なキャリアと組み合わせた、たとえば、０．００１〜９０％（さらに好ましくは０．００５〜７０％、たとえば、０．０１〜３０％）の有効成分を含有する薬学的組成物として与えることができる。

【0154】

選択される投与経路にかかわりなく、本明細書で提供される組成物は、好適な水和された形態で使用されてもよく、それらは、当業者に既知の従来の方法によって薬学上許容可能な投与形態に製剤化されてもよい。

【0155】

本明細書で提供される薬学的組成物における抗体の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性であることなく、特定の患者について所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るように、組成物及び投与方法によって変化し得る。選択される投与量レベルは、採用される特定の組成物又はそのエステル、塩又はそのアミドの活性、投与経路、投与の時間、採用される特定の化合物の排泄の速度、治療の持続時間、採用される特定の組成物との併用で使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身状態及び既往歴、及び医学技術で周知の類似の因子を含む種々の薬物動態因子に左右されるであろう。当該技術で普通の技量を有する医師又は獣医師は必要とされる組成物有効な量を容易に決定し、処方することができる。たとえば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで抗体の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に高くすればよい。一般に、本明細書で提供される組成物の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である抗体の量である。そのような有効用量は上述の因子に一般に左右される。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内又は皮下であること、好ましくは標的の部位の近傍に投与されることが好ましい。所望であれば、治療組成物の有効な１日用量を任意で単位投与量形態にて、１日を通して適当な間隔で別々に２、３、４、５、６回以上に分けて投与されてもよい。抗体を単独で投与することが可能である一方で、製剤（組成物）として抗体を投与することが好ましい。

【0156】

治療組成物は、たとえば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、同第４，５９６，５５６号、同第４，４８７，６０３号、同第４，４８６，１９４号、同第４，４４７，２３３号、同第４，４４７，２２４号、同第４，４３９，１９６号、及び同第４，４７５，１９６号にて開示されたもののような当該技術で既知の医療器具によって投与することができる。

【0157】

特定の実施形態では、生体内での適切な分布を確保するようにモノクローナル抗体を製剤化することができる。たとえば、脳血管関門（ＢＢＢ）は親水性の高い多数の化合物を排除する。治療用抗体がＢＢＢを交差するのを確保するには（所望ならば）、たとえば、それらをリポソームにて製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、たとえば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；同第５，３９９，３３１号；同第５，８９１，４６８号；同第６，０５６，９７３号；同第６，２１０，７０７号；同第６，２２４，９０３号；同第６，３１６，０２４号；同第７，１２２，２０２号；同第７，１３５，１７７号；及び同第７，５０７，４０７号並びに米国特許公開２００７０１１６７５３を参照のこと。リポソームは、特定の細胞又は組織に結合する及び／又は選択的にそこに輸送される１以上の部分を含み得る。

【0158】

２：２：１の比で抗ＥＧＦＲ抗体のトリオを含む薬学的組成物が提供され、それは、３つの異なる抗ＥＧＦＲ抗体、特にＰ１Ｘ関連の抗体、Ｐ２Ｘ関連の抗体及びＰ３Ｘ関連の抗体を含む組成物であり、それは、異なるＥＧＦＲエピトープに結合し、特定の２：２：１の比で製剤化される。３つの抗体に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学上許容可能なキャリア及び／又は上記で詳細に記載されたもののような他の賦形剤を含むことができる。薬学的組成物は３つの抗体すべてを含む単一の容器にて供給されてもよいし、又は代わりに薬学的組成物は、３つの異なる抗ＥＧＦＲ抗体の１つ（同様に上述のような薬学上許容可能なキャリア及び／又は他の賦形剤）をそれぞれ含有する３つの異なる容器を含む包装物を含むことができる。

【0159】

ＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患を治療するための薬物の製造における上述の抗ＥＧＦＲ抗体の単独での（単一剤として）、対の組み合わせでの（２つの抗体）又は３つの組み合わせ（３つの抗体）での使用が提供される。上述の抗ＥＧＦＲ抗体はまた、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化器癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部の癌、膠芽細胞腫、前立腺癌、及び他の固形腫瘍及び／又は転移性腫瘍を含むが、これらに限定されない癌のようなＥＧＦＲ発現性の癌のような癌の治療のために（又は癌の治療のための薬物の製造にて使用される）単独で（単一剤として）、対の組み合わせで（２つの抗体）又は３つの組み合わせ（３つの抗体）で提供される。

【0160】

さらに、熟考される組成物はさらに、併用療法における薬物として、追加の治療剤、たとえば、追加の抗癌剤を含み得るし、又は追加の治療剤、たとえば、追加の抗癌剤との併用療法における使用のために調製され得る。「抗癌剤」は、腫瘍、癌、悪性腫瘍等を治療するのに使用される薬剤である。（たとえば、本明細書で開示される抗体組成物による）薬剤療法は、他の治療なしで投与され得るし、又は手術、温熱療法、若しくは放射線療法（イオン化放射線を用いて）との併用で投与され得る。関与する臓器又は組織の性質に応じて癌の治療では幾つかのクラスの抗癌剤が使用され得る。たとえば、乳癌は一般にエストロゲンによって刺激され、性ホルモンを不活化する薬剤で治療され得る。同様に、前立腺癌はアンドロゲンを不活化する薬剤で治療され得る。本明細書で開示される抗体組成物との併用で使用される抗癌剤は、限定として解釈されるべきではない別表Ａに列記されたものがとりわけ挙げられる。本明細書で開示される抗体組成物の投与と同時に又はその前に又はその後に、１以上の抗癌剤が投与され得る。追加の抗癌剤、たとえば、以下の別表Ａにて開示される抗癌剤と順次又は一緒に本明細書で開示される抗体組成物を投与することができる。

【0161】

提供されるのはまた、任意で単一のバイアル又は容器に含有される本明細書で開示される１以上の抗ＥＧＦＲ抗体を含み、ＥＧＦＲの上方調節及び／又はＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患（たとえば、以下の第ＶＩ節で記載されるもののような癌）を治療する又は診断するのに使用するための指示書を含むキットである。キットは、キットの内容物の用途を示すラベルを含み得る。用語、ラベルには、キット上で若しくはキットと共に供給される又はキットに伴う記入する、マーケティング物質又は記録される物質が含まれる。そのようなキットは、たとえば、単回用量バイアル又は単回用量事前負荷シリンジのような単位投与量形態にて抗体組成物を含み得る。本明細書で開示される抗ＥＧＦＲ抗体の組み合わせ（たとえば、Ｐ１Ｘ関連の抗体、Ｐ２Ｘ関連の抗体及びＰ３Ｘ関連の抗体の組み合わせ）は、組み合わせの成分すべてを含有する単一バイアルを含むことができ、又は代わりにキットは併用療法での抗体の投与の指示書と共に別々のバイアルで各成分を含むことができる。好まれる実施形態では、Ｐ１Ｘ関連の抗体、Ｐ２Ｘ関連の抗体及びＰ３Ｘ関連の抗体は２：２：１の比で単一バイアルにて供給され、又は代わりに２：２：１の比で３つの抗体を投与する指示書と共に別々のバイアルでそれぞれ供給される。

【0162】

ＶＩ．抗体の使用方法
本明細書で開示される抗体及び組成物は、幅広い種々の治療及び診断の応用、特に腫瘍学の応用で使用することができる。従って、別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＥＧＦＲが介在する活性を阻害するのに有効な量にて本明細書で記載される１以上の抗体又は組成物を投与することによって対象におけるＥＧＦＲ活性を阻害する方法である。治療することができる特定の治療適応には、たとえば、臓器又は組織、たとえば、皮膚、脳及び中枢神経系、頭頸部、食道、胃、結腸、直腸、肛門、肝臓、膵臓、胆管、胆嚢、肺又は気管、乳腺、卵巣、子宮、子宮頸部、膣、精巣、生殖細胞、前立腺、腎臓、尿管、膀胱、副腎、下垂体、甲状腺、骨、筋肉又はその他の結合組織の癌、白血病、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が挙げられる。

【0163】

本明細書で開示される抗体は、たとえば、本明細書で開示される１以上の抗体、抗体の対又は抗体トリオを対象由来の細胞に接触させ（たとえば、生体外又は生体内にて）、細胞上のＥＧＦＲへの結合のレベルを測定することによってＥＧＦＲと関連する疾患（たとえば、癌）を診断し、又は予後診断するのに使用することができ、その際、ＥＧＦＲへの異常に高いレベルの結合は対象がＥＧＦＲに関連する癌を有することを示す。

【0164】

提供されるのはまた、種々の癌を含むＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達を含む種々の生体内及び生体内の診断応用及び治療応用にて本明細書で開示される抗ＥＧＦＲ抗体を使用する方法である。

【0165】

従って、一実施形態では、疾患を治療するのに有効な量にて、本明細書で提供される抗体、又は好ましくは抗体の組み合わせを対象に投与することによってＥＧＦＲ依存性のシグナル伝達に関連する疾患を治療する方法が提供される。好適な疾患には、たとえば、悪性黒色腫、乳癌、卵巣癌、腎癌、消化器癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、前立腺癌、及び他の固形腫瘍及び／又は転移腫瘍を含むが、これらに限定されない種々の癌が挙げられる。

【0166】

抗体は単独で投与することができ、又はＥＧＦＲが介在するシグナル伝達に関連する疾患を治療する抗体と併せて作用する若しくは相乗的に作用する別の治療剤と共に投与することができる。そのような治療剤には、本明細書で記載されるもの、たとえば、有機小分子、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、組換え操作した生物剤、ＲＮＡｉ化合物、チロシンキナーゼ阻害剤、及び組み合わせ抗体、並びに抗癌剤（たとえば、細胞毒素、化学療法剤、小分子及び放射線）が挙げられる。本明細書で開示される１以上の抗ＥＧＦＲ抗体と共に併用療法で使用することができる抗癌剤の非限定例は別表Ａに列記されるものである。

【0167】

他の実施形態は以下の非限定の実施例にて記載される。

【実施例】

【0168】

実施例のための材料及び方法
一般に、以下の実施例では特に指示されない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、免疫学（特に、たとえば、抗体技術）の従来の技法、及び組換え免疫グロブリン調製の標準的な技法を使用した。

【0169】

細胞株
以下に記載される実験で使用される細胞株はすべて国立癌研究所又はＡＴＣＣから入手される。
細胞株
Ａ４３１：上皮癌
ＤＵ１４５：前立腺癌
Ｈ１９７５：肺腺癌；非小細胞肺癌
ＨＣＣ８２７：肺腺癌；非小細胞肺癌

【0170】

ＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）変異体のタンパク質精製
ｍＡｂエピトープ結合のためにＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）の変異体を生成する。変異は、セツキシマブ（Li S. et al., Cancer Cell. 7: 301-311, 2005）及びＨ１１（Spangler J. et al. PNAS. 107: 13252-13257, 2010）のエピトープ及びＥＧＦＲ−ＥＣＤ構造の構造解析（タンパク質データバンクID: 1NQL; Ferguson K.M. et al. Mol Cell. 11: 507-517, 2003）に基づいて設計した。本出願に含まれるタンパク質配列で言及されたようにアラニンに対して残基を変異させる。発現構築物のＤＮＡ合成は、ＤＮＡ２．０（ｗｗｗ.ｄｎａ２０.ｃｏｍ）から商業的に入手され得る。その後のＤＮＡのサブクローニング、２９３Ｆ細胞におけるタンパク質発現及びタンパク質の精製は従来の方法を用いて完了する。

【0171】

腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ又はＥＲＫのＥＧＦが介在するシグナル伝達の阻害
リガンドが介在する腫瘍細胞のシグナル伝達の阻害は以下のように検討する：９６穴組織培養プレートにてウェル当たり３５，０００個又はウェル半分当たり１７，５００個の密度にてＡ４３１又はＤｕ１４５細胞を播き、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補完したＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地にて３７℃、５％二酸化炭素で２４時間増殖させる。抗生物質及び２ｍＭのＬ−グルタミンで補完した１％ＦＢＳ培地にて３７℃、５％二酸化炭素で約２０時間、細胞を血清欠乏にする。次いで３７℃、５％二酸化炭素にて、細胞を種々の濃度の抗ＥＧＦＲ抗体と共に２時間、事前インキュベートし、次いでヒトＥＧＦリガンド（５０ｎｇ／ｍＬ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号ＡＦ−１００−１５）によって１０分間刺激する。細胞を氷冷ＰＢＳによって洗浄し、氷上で３０分間インキュベートすることによって１５０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１４）で補完した５０μＬの氷冷溶解緩衝液（哺乳類タンパク質抽出溶解緩衝液（ＭＰＥＲ−Ｐｉｅｒｃｅ、＃７８５０５）にて溶解する。溶解物は直ちにＥＬＩＳＡによってＥＲＫ（ＥＧＦＲの下流のエフェクター）及びＥＧＦＲのリン酸化について解析する、又は使用まで−８０℃で凍結する。

【0172】

ＥＬＩＳＡアッセイ
ホスホ−ＥＧＦＲサンドイッチＥＬＩＳＡについては、９６半穴ＧＲＥＩＮＥＲ高結合プレート（カタログ番号６７５０７７；ノースカロライナ州、モンローのＧＲＥＩＮＥＲ ＢＩＯ-ＯＮＥ）を５０μＬのＥＧＦＲ抗体（ＥＧＦＲ Ａｂ−１１、クローン：１９９．１２、ＢＳＡ及びアジドを含まず、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＭＳ３９６Ｐ１ＡＢＸ）によって被覆し、室温にて一晩インキュベートする。翌朝、ＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機にて１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）によってプレートを３回洗浄する。その後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡによって室温にて約１時間プレートをブロックする。ＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機にて１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）によってプレートを３回洗浄する。細胞溶解物（５０μＬ）又は標準（ｐＥＧＦＲｐＹ１０６８ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹＣ３５７０）を５０％溶解緩衝液と１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（製造元の推奨に従って）にて希釈し、２つ組にてプレートに加え、室温で２時間、又は４℃で一晩、振盪しながらインキュベートする。次いでＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機にて１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）によってプレートを３回洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ｐＥＧＦＲ ｐＹ１０６８ＥＬＩＳＡキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＹＣ３５７０）に結合し、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈した検出抗体を約５０μＬ加え、室温で約２時間インキュベートする。ＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機にて１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）によってプレートを３回洗浄する。約５０μＬのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＰＩＣＯＥＬＩＳＡ基質を加え、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーを用いてプレートを読み取る。データ解析については、２つ組試料を平均し、誤差バーを使用して２つの試料間の標準偏差を表す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用い、４パラメータロジスティック方程式に対するデータの回帰を介して阻害曲線及び相当するＩＣ５０値を算出する。

【0173】

以下の変更を伴ってホスホ−ＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡと類似してホスホ−ＥＲＫ ＥＬＩＳＡを実施する：ヒトｐＥＲＫ ＥＬＩＳＡ ＤｕｏｓｅｔキットをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＤＹＣ１０１８−５）から購入し、製造元によって推奨されるように使用する。

【0174】

捕捉試薬としてＥＧＦＲ−ＥＣＤ野生型（ＷＴ）、Ｂｉｎ１エピトープ変異体又はＢｉｎ３エピトープ変異体（４μｇ／ｍＬ）を用いて直接ＥＬＩＳＡを実施する。９６半穴ＧＲＥＩＮＥＲ高結合プレート（カタログ番号６７５０７７；ＮＣ、ＭｏｎｒｏｅのＧＲＥＩＮＥＲ ＢＩＯ-ＯＮＥ）を５０μＬの捕捉試薬で被覆し、室温で一晩インキュベートする。翌朝、ＢＩＯＴＥＫプレート洗浄機にて１００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）によってプレートを３回洗浄し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中１％ＢＳＡによって室温にて約１時間ブロックする。ＰＢＳ、ｐＨ７．２中１％ＢＳＡによって希釈した種々の濃度（１、０．２５、０．０６、及び０．０２μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を捕捉試薬と共に室温で２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中１％ＢＳＡによって１：５０，０００に希釈したペルオキシダーゼを結合したＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−００８）で２時間検出する。約５０μＬのＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ＰＩＣＯ ＥＬＩＳＡ基質を加え、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーを用いてプレートを読み取る。データ解析については、２つ組試料を平均し、誤差バーを使用して２つの試料間の標準偏差を表す。

【0175】

結合親和性：動的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）
ＫｉｎＥｘＡ機器（アイダホ州ボイジのＳａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて組換えＥＧＦ受容体を伴った溶液にて抗体の親和性及び交差反応性を測定する。このアッセイで使用される材料は、ＫｉｎＥｘＡ３０００機器及びソフトウエア（アイダホ州ボイジのＳａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ヒト抗ＥＧＦＲ ＩｇＧ、組換えヒトＥＧＦＲ、Ｃｙ５結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ペンシルベニア州ウエストグローブのＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）及びＰＢＳ中ウシ血清アルブミン（１００ｍｇ／ｍＬ）である。

【0176】

組換えＥＧＦ受容体をＰＭＭＡビーズに結合するには、２００ｍｇのＰＭＭＡビーズの事前に測定したアリコートに１００μｇの組換えＥＧＦＲを加え、ＰＢＳを加えて総容積を１ｍＬにする。回転ホイール上で室温にて１時間ビーズをインキュベートする。次いでビーズを手短に遠心し、上清を取り除く。ＰＢＳ中１００ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ１００μＬをビーズに加え、さらにＰＢＳを加えて総容積を１ｍＬにする。回転ホイール上で室温にて１時間ビーズを再びインキュベートする。次いで２７ｍＬのＰＢＳを含有するガラス瓶にビーズを移す。

【0177】

一価の抗体結合親和性を測定するには、一定濃度の抗ＥＧＦＲ抗体を有する５ｍＬのＰＢＳにて組換えＥＧＦＲの１２段階の連続希釈（７５ｎＭ、２５ｎＭ、８．３ｎＭ、２．８ｎＭ、０．９ｎＭ、０．３ｎＭ、１００ｐＭ、３３ｐＭ、１１ｐＭ、４ｐＭ、１．３ｐＭ、０ｐＭ）を調製する。正確な親和性測定については、抗体結合部位の総濃度（「ＡＢＣ」；価数による抗体のモル濃度の２倍）はＥＧＦＲについての抗体の一価の親和性未満にすべきである。平衡を達成するために抗体／受容体の混合物を室温で２時間インキュベートする。抗体／受容体複合体の予想される親和性に応じて、この平衡時間はそれに従って調整され得る。別の試験管にて、ストック（２ｍｇ／ｍＬ）抗体の１：１０００ＰＢＳ希釈を用いて、２μｇ／ｍＬのＣｙ５結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体１５ｍＬを調製する。次いで、ＫｉｎＥｘＡ機器ラインを１２本の抗体／受容体溶液の試験管のそれぞれに連結する。ＥＧＦＲ／ビーズを詰めたカラムに各溶液を注入する。（ＫｉｎＥｘＡ機器は各注入について新しいビーズカラムを自動で詰める。）洗浄工程の後、標識した二次抗体をカラムに通す。最終的に、測定した量の複合体化しなかった受容体を様々な受容体濃度で用いて、平衡滴定データをＫｉｎＥｘＡソフトウエアにおける１：１結合モデルに適合させ、親和性の値Ｋ_Ｄを得る。Ｋ_Ｄの値が小さければ小さいほど、結合親和性は良好である（さらに強い、時にはさらに高いと言う）。従って、ｘｎＭのＫ_Ｄで抗体が結合するという言及は、たとえば、１×１０^−８Ｍ（１０ｎＭ）のＫ_Ｄ値で、又は１×１０^−１０Ｍ（０．１ｎＭ）のＫ_Ｄ値で結合することを意味し、小さなＫ_Ｄ値は良好な（高い）親和性を示す。

【0178】

ＫｉｎＥｘＡ「直接法」を用いて結合する結合速度を測定するために、上記のアプローチ及び抗体結合部位総濃度（ＡＢＣ）を用いて平衡一価結合親和性（Ｋ_Ｄ）を測定する。次いで、「理論的結合曲線実証」ソフトウエア（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、動態実験について出発抗原濃度（Ｌ０）を測定する。これを行うには、一価結合親和性実験にて測定した親和性及びＡＢＣ値を入力し、平衡にて抗体のおよそ２０％が抗原に結合しない濃度として出発抗原濃度を選択する。これによって実験における良好なシグナル対ノイズの比を確保する。ストック（２ｍｇ／ｍＬ）抗体の１：１０００ＰＢＳ希釈を用いて、２μｇ／ｍＬのＣｙ５結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体１５ｍＬを調製する。別の試験管にて、８ｍＬの抗ＥＧＦＲ抗体の溶液を2×ＡＢＣの濃度で調製する。実験の前にそれを８ｍＬの抗原溶液と混合するので、この濃度は試行濃度の２倍である。別の試験管にて、８ｍＬの組換えＥＧＦＲ溶液を２×Ｌ０の濃度で調製する。実験の前にそれを８ｍＬの抗体溶液と混合するので、この濃度も試行濃度の２倍である。次いで、ＥＧＦＲを被覆したビーズ及び二次抗体溶液をそれぞれ、適当な容器及びラインに入れる。抗体及び抗原の溶液を十分に混合し、直ちに適当なラインに接続し、ＫｉｎＥｘＡソフトウエアを用いて、得られた溶液における時間の関数として遊離の抗体の量を測定する。会合定数Ｋ_ｏｎ（Ｋｏｎ）を測定するには、ＫｉｎＥｘＡソフトウエアを用いて、時間の関数としての遊離の抗体の量の枯渇を可逆的な生体分子の速度方程式に適合させる。解離定数Ｋ_ｏｆｆ（Ｋｏｆｆ）は、Ｋ_ｏｎ^＊Ｋ_Ｄ（Ｋｄ）に等しい。

【0179】

結合親和性：表面プラスモン共鳴アッセイ
表面プラスモン共鳴アッセイは以下のように実施する：アミンのカップリングを用いて抗体又は抗原（３００ＲＵ）のいずれかをＣＭ５チップに不動化する。様々な濃度の抗体又は抗原を次いで注入し、不動化したタンパク質との会合及び解離を検討する。様々な注入の間で、好適な再生緩衝液（たとえば、グリシン、ｐＨ２．５）を用いてチップを再生する。方程式１を用いて解離相を適合させ、Ｋ_ｏｆｆ（解離速度）を決定する。

Ｋ_ｏｆｆのこの値と方程式２を用いて会合相を適合させ、Ｋ_ｏｎ（会合速度）及びＫ_Ｄ（平衡定数）を決定する。

式中、Ｃは溶液における抗原又は抗体のいずれかを表し、Ｒ_ｍａｘは飽和シグナルを表し、ｔは時間を表す。

【0180】

エピトープのビニング：表面プラスモン共鳴アッセイ
上述のように表面プラスモン共鳴アッセイを用いてエピトープのビニングを実施する。抗体の１つをチップの表面に不動化する。次いで、組換えで発現させたヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ）を注入する。ＥＧＦＲ−ＥＣＤが、チップの表面に複合された抗体と会合するにつれて共鳴シグナルが増大する。３つのＢｉｎ１、２及び３に属する抗体を順次注入する。抗体が注入した抗体と重複するエピトープに結合するのであれば、前の注入に比べてシグナルは変化しないであろう。抗体が重複しないエピトープに結合するのであれば、チップ上のシグナルは以前の注入よりも高いであろう。チップに複合された抗体は最終的に遊離のリガンドとして注入され、重複するエピトープとの結合の欠如を確認する。

【0181】

細胞結合アッセイ
Ｋ_Ｄ値を決定するための細胞結合アッセイは以下のように実施する：３ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡによって３７℃にて５分間、Ａ４３１細胞を剥離する。トリプシン処理した細胞に直ちに完全ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）を加え、穏やかに再浮遊させ、Ｂｅｃｋｍａｎの卓上遠心機にて１１００ｒｐｍで５分間遠心する。ｍｌ当たり２×１０^６個の細胞の濃度で染色緩衝液（ＰＢＳ＋０．２％ＢＳＡ＋０．１％アジ化ナトリウム）に細胞を再浮遊し、５０μＬ（１×１０^５個）のアリコートを９６穴タイタープレートに入れる。

【0182】

２０００ｎＭの抗ＥＧＦＲ抗体の３００μＬストック溶液を染色緩衝液で調製し、その１００μＬを２００μＬの染色緩衝液で連続希釈する。希釈した抗体の濃度は２０００ｎＭ〜０．１ｎＭの範囲である。次いで１５０μＬの様々なタンパク質希釈を５０μＬの細胞浮遊液に直接加え、１５００ｎＭ、５００ｎＭ、１６６．７ｎＭ、５５．６ｎＭ、１８．５ｎＭ、６．１７ｎＭ、２．０５ｎＭ、０．６８ｎＭ、０．２３ｎＭ及び０．０７６ｎＭの抗体の最終濃度を得る。

【0183】

９６穴プレートに分注した細胞を振盪しながら室温にて２時間、抗体希釈物とインキュベートし、３００μＬの染色緩衝液で３回洗浄する。次いで細胞をＢＤ染色緩衝液における１：７５０希釈したＡｌｅｘａ６４７標識したヤギ抗ヒトＩｇＧの１００μＬと共に振盪しながら４℃にて４５分間インキュベートする。最終的に細胞を２回洗浄し、ペレットにして２５０μＬの染色緩衝液＋０．５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムに再浮遊する。ＦＬ４チャンネルを用いてＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメータにて１０，０００個の細胞の解析を実施する。ＭＦＩ値及び抗ＥＧＦＲ抗体の相当する濃度をそれぞれｙ軸及びｘ軸にプロットする。非線形回帰曲線についての片側結合モデルを用いたＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭソフトウエアを用いて分子のＫ_Ｄを決定する。

【0184】

式Ｙ＝Ｂｍａｘ^＊Ｘ／Ｋ_Ｄ＋Ｘ（Ｂｍａｘ＝飽和での蛍光、Ｘ＝抗体の濃度、Ｙ＝結合の程度）に基づいてＫ_Ｄ値を算出する。

【0185】

免疫ブロッティングを介したＥＧＦＲレベルの測定
細胞溶解物を調製するために、Ｈ１９７５細胞をトリプシン処理し、回収し、数え、ウェル当たり１×１０^６個にて６穴ディッシュに入れ、一晩インキュベートして培養プレートに付着させる。ｒｈＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１００−１５）による１０分間の刺激の前に１μＭ濃度のＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ（Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ＆Ｐ３Ｘは２：２：１のモル比でのＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの組み合わせを指す）で１、２、５及び２４時間、事前処理する。哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号７８５０５）１００μＬによって細胞を溶解する。ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４９０６８３７００１）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０４６９３１２４００１）でタンパク質抽出試薬を補完する。試料緩衝液にて５分間煮沸することによってＨ１９７５の抽出物を変性させ、還元条件下に供し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ４〜１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて２００Ｖにて５０分間電気泳動する。ニトロセルロース膜へのタンパク質の転移に続いて、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（ＬＩ−ＣＯＲ、カタログ番号９２７−４００−００）と共に室温にて１時間インキュベートすることによって非特異的部位をブロックする。マウスモノクローナル抗ＥＧＦＲ（１Ｆ４標識ｔＥＧＦＲ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号２２３９）；ウサギモノクローナル抗ホスホ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、Ｄ１３．１４.４Ｅ標識ｐＥＲＫ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４３７０；ウサギモノクローナル抗ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３、１９３Ｈ１２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号４０５８）；ウサギモノクローナル抗ホスホ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓｅｒ７３、Ｄ４７Ｇ９標識ｐ−ｃ−Ｊｕｎ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３２７０）及びウサギ抗ＰＣＮＡ（ＦＬ−２６１）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ｓｃ−７９０７）と共に必要に応じて膜をインキュベートする。一次抗体との一晩のインキュベートに続いて、適当なＩＲＤｙｅ標識した二次抗体（ＩＲ８００ＣＷヤギ抗マウス（Ｏｄｙｓｓｅｙ、カタログ番号９２６−３２１０）又はＩＲ８００ＣＷヤギ抗ウサギ（Ｏｄｙｓｓｅｙ、カタログ番号９２６−３２１１）と共に１０分間、免疫ブロットをインキュベートし、ＳＮＡＰｉ．ｄ．，タンパク質検出システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて膜を真空下に置く。ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像解析システムを用いてバンドを検出し、Ｏｄｙｓｓｅｙのソフトウエアを用いて解析する。

【0186】

試験管内における腫瘍細胞の増殖の阻害
ＥＧＦＲを発現している細胞の細胞増殖の阻害を試験管内にて以下のように調べる：ウェル当たり５，０００個にて９６穴組織培養プレートにＨＣＣ８２７及びＨ１９７５癌細胞を播き、抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で補完したＲＰＭＩ−１６４０にて３７℃及び５％二酸化炭素で２４時間増殖させる。次いで培地を、種々の濃度のＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ又はセツキシマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の存在下で５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ又は２００ｎｇ／ｍＬのＡＲＥＧ（アンフィレグリン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で補完したＲＰＭＩ−１６４０（抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ＦＢＳを伴う）に交換する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｇ７５７２）を製造元の指示書に従って使用して細胞の生存率を測定する。ＣＴＧアッセイは、代謝的に生きている細胞の指標である存在するＡＴＰの量に基づいて培養物における生存細胞の数を測定する。対照の処理には、５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ又は２００ｎｇ／ｍＬのＡＲＥＧの存在下（「＋ＥＧＦ」又は「＋ＡＲＥＧ」と呼ぶ）又は非存在下（「−ＥＧＦ」又は「−ＡＲＥＧ」と呼ぶ）にて抗生物質、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ−１６４０で処理した細胞が含まれる。

【0187】

ＤＵ１４５及びＨ１９７５のマウス異種移植試験
Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓ）の組み合わせが細胞によって皮下に注入される。３００ｍｍ^３の平均サイズに達するまで得られた腫瘍を増殖させる。次いで、Ｐ１ＸとＰ２Ｘ及びＰ３Ｘとの組み合わせ、セツキシマブの指示された濃度、又はビヒクル対照としての同じ容積のＰＢＳで投与を開始する。４日間隔で測定を行い、式 容積＝π／６×（Ｗ×Ｌ^２）を用いて腫瘍の容積を算出する。セツキシマブ及びＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの用量を標準化して均一な血清暴露を提供する。

【0188】

生体内でのＰ１ＸとＰ２Ｘ及びＰ３Ｘとの組み合わせの有効性はＤＵ１４５前立腺癌細胞の異種移植マウスモデルにて評価する。８×１０^６個のＤＵ１４５細胞をｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に皮下注射する。腫瘍がいったん３００ｍｍ^３の平均サイズに達すると、処理を開始する。ビヒクル対照（ＰＢＳ）；２．０７５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ；以下のようなＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘそれぞれについて２：２：１Ｃ_ｍａｘを提供するように設計した「マウスの比」である成分濃度でのＰ１ＸとＰ２Ｘ及びＰ３Ｘ：Ｐ１Ｘ＝２．５３ｍｇ／ｋｇ、Ｐ２Ｘ＝７．２６ｍｇ／ｋｇ及びＰ３Ｘ＝０．６６ｍｇ／ｋｇのいずれかによって１０匹のマウスの群を処理する。セツキシマブ群のマウスには４日ごとに投与する。Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ群のマウスには２日ごとに投与する。これらの用量及び投与間隔は、セツキシマブ及びマウス比の抗体トリオの同等の血清暴露を得るように選択する。

【0189】

リガンド拮抗細胞結合アッセイ
単一の又は複数の抗体の存在下でＥＧＦリガンドの結合を測定する細胞結合アッセイは以下のように実施する：５ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡによって３７℃にて５分間、Ａ４３１細胞を剥離する。トリプシン処理細胞に直ちに完全ＤＭＥＭ（１０ｍＬ）を加え、穏やかに浮遊させ、Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心機にて１２００ｒｐｍで７分間遠心する。ｍＬ当たり３×１０^５個の細胞の濃度で染色緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）に細胞を再浮遊し、１００μＬ（３×１０^４個）のアリコートを９６穴タイタープレートに入れる。

【0190】

各実施例で指示された濃度にて染色緩衝液で抗ＥＧＦＲ抗体の５ｍＬの２×ストック溶液を調製する。ビオチンタグに複合した組換えヒトＥＧＦリガンド（ビオチン／ＥＧＦ）の１０ｍＬの３×ストック溶液を染色緩衝液で調製し、その１００μＬを２００μＬの染色緩衝液で連続希釈する。希釈したビオチン／ＥＧＦの濃度は６００ｎＭ〜９ｐＭの範囲である。次いで抗ＥＧＦＲ抗体の１００μＬアリコートを１００μＬの細胞浮遊液に直接加え、各実施例で指示された最終濃度を得る。９６穴プレートに分注した細胞を抗体希釈物とともに室温で１時間インキュベートする。次いでビオチン／ＥＧＦの１００μＬアリコートを１００μＬの細胞浮遊液に直接加え、２００ｎＭ、６６．６７ｎＭ、２２．２２ｎＭ、７．４１ｎＭ、２．４７ｎＭ、０．８２ｎＭ、０．２７ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０１ｎＭ、及び０．００３ｎＭのビオチン／ＥＧＦの最終濃度を得る。９６穴プレートに分注した細胞を抗体及びビオチン／ＥＧＦ希釈物とともに室温で１０分間インキュベートし、１００μＬの染色緩衝液で１回洗浄し、次いでＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心機にて１２００ｒｐｍで７分間遠心する。染色緩衝液中ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１：５００希釈の１００μＬに暗所にて室温で３０分間、細胞を浮遊させる。最終的に、細胞を１００μＬの染色緩衝液で２回洗浄し、ペレットにして８０μＬの固定緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２％パラホルムアルデヒド）に再浮遊させ、９６穴Ｕ底アッセイプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、ホイルで封止し、４℃で保存する。

【0191】

ＦＬ４チャンネルを用いてＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲフローサイトメータにて１０，０００個の細胞の解析を実施する。ＷｉｎＬｉｓｔ６．０ソフトウエアを用いてデータを解析する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値及びビオチン／ＥＧＦリガンドの相当する濃度をそれぞれｙ軸及びｘ軸にプロットする。

【0192】

実施例１：エピトープのマッピング／ビニング
元の抗体の親和性成熟を介して抗体Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘを生成した。元の各抗体、ｃａ、ｃｄ及びｃｈは同時係属特許出願、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３５２８にて開示されている。エピトープのマッピング及びビニングの実験を行って元の各分子のようにＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘが同一の重複しないエピトープを共有することを明らかにした。

【0193】

Ｂｉｎは、選択した抗体がＥＧＦＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）上で３つの異なる重複しないエピトープにまたがるように設計された。これらは３つのＢｉｎにグループ分けされ；Ｂｉｎ１はＥＧＦＲのドメインＩＩＩにマップされ、ｃ２２５エピトープ（セツキシマブの結合部位）を表し；Ｂｉｎ２はドメインＩにマップされ、ＩＣＲ１０エピトープ（ＡｂｃａｍＡｂ２３１）（Cochran et al. (2004) Journal of Immunological Methods, 287:147-158）を表し；Ｂｉｎ３はドメインＩＩＩにマップされ、クローンＨ１１エピトープ（Spangler J. et al. PNAS. 107: 13252-13257, 2010）を表す。ＥＧＦＲ細胞外ドメインにて以下で太字で示すアミノ酸の位置でのエピトープのマッピングのためにＢｉｎ１（Ｂ１−７ＭＴ−Ａｌａ）及びＢｉｎ３（Ｂ３−４ＭＴ）の変異体を生成した。
ＥＧＦＲのＥＣＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）

標準の組換えＤＮＡ技術を用いて太字アミノ酸の位置にて以下の置換変異体を作製し、以下の変異残基を持つＢｉｎ１（Ｂ１）及びＢｉｎ３（Ｂ３）エピトープ変異体を創った。
変異体
Ｂｉｎ１（Ｂ１）変異体残基
Ｂ１−７ＭＴ−Ａｌａ：Ｑ４０８Ａ、Ｑ４３２Ｍ、Ｈ４３３Ｅ、Ｋ４６７Ａ、Ｋ４８９Ａ、Ｉ４９１Ａ、Ｎ４９７Ａ
Ｂｉｎ３（Ｂ３）変異体残基
Ｂ３−４ＭＴ：Ｓ３８０Ａ、Ｆ３８１Ｇ、Ｔ３８２Ａ、Ｈ３８３Ｇ

【0194】

捕捉試薬としてＥＧＦＲ−ＥＣＤ野生型（ＷＴ）、Ｂｉｎ１エピトープ変異体（ｃ２２５エピトープ）又はＢｉｎ３エピトープ変異体（Ｈ１１エピトープ）を用いて直接ＥＬＩＳＡを行った。種々の濃度の（１、０．２５、０．０６及び０．０２μｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、Ｐ１Ｘ（Ｂｉｎ１）、Ｐ２Ｘ（Ｂｉｎ２）及びＰ３Ｘ（Ｂｉｎ３）を室温で２時間、捕捉試薬と共にインキュベートし、その後、ＨＲＰ複合した抗ヒトＦｃポリクローナル抗体で１時間検出した。図１Ａに示すように、３つの抗体はすべてＥＧＦＲのＷＴ細胞外ドメインに結合したが、Ｂｉｎ１抗体Ｐ１ＸはＢｉｎ１変異エピトープに結合せず、Ｐ３Ｘ抗体はＢｉｎ３変異エピトープに結合しなかった。

【0195】

表面プラスモン共鳴実験を行ってＰ２ＸがＥＧＦＲの細胞外ドメインのドメイン１におけるＩＣＲ１０エピトープに会合することを明らかにした（図１Ｂ）。ＩＣＲ１０をＢＩＡＣＯＲＥチップの表面に複合させた。０．５μＭのＥＧＦＲ−ＥＣＤを注入し、その後０．５μＭの抗体Ｐ１Ｘ（Ｂｉｎ１）、Ｐ２Ｘ（Ｂｉｎ２）及びＰ３Ｘ（Ｂｉｎ３）を順次注入した。Ｐ１Ｘ及びＰ３ＸはＩＣＲ１０を結合するＥＧＦＲ−ＥＣＤと会合することが同時に認められるが、Ｐ２Ｘは会合しないことが示される。

【0196】

Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘのエピトープが異なっており、重複しないことを明らかにするために、一連の３つの表面プラスモン共鳴ビニング実験を行った。Ｐ１Ｘ（図２Ａ）、Ｐ２Ｘ（図２Ｂ）及びＰ３Ｘ（図２Ｃ）をＢＩＡＣＯＲＥチップの表面に複合させた。０．５μＭのＥＧＦＲ−ＥＣＤを注入し、その後０．５μＭの抗体Ｐ３Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ１Ｘを順次注入した。ＢＩＡＣＯＲＥチップに複合させたのと同じ抗体の注入は陰性対照として役立つ。実験すべてにおいて、残りのＢｉｎに由来する２つの抗体はＥＧＦＲ−ＥＣＤに会合することが認められる。従って、３つの実験の結果はＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘが重複しない異なるエピトープを有し、同時にＥＧＦＲ−ＥＣＤに会合することができることを明らかにしている。

【0197】

実施例２：結合親和性
Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３ＸのＥＧＦＲに対する一価の親和性をＫｉｎＥｘＡによって測定した。データを表１で以下に示す。Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの親和性はすべて０．４ｎＭより良好であり、すべて元の分子に比べて改善されている。Ｐ１Ｘ（１１ｐＭ）の親和性は元のＢｉｎ１分子ｃａ（１４５ｐＭ）よりも１３．１８倍良好である。Ｐ２Ｘ（７０ｐＭ）の親和性は元のＢｉｎ２分子ｃｄ（５４０ｐＭ）よりも７．７１倍良好である。Ｐ３Ｘ（３６０ｐＭ）の親和性は元のＢｉｎ１分子ｃｈ（７５７ｐＭ）よりも２．１０倍良好である。

【0198】

【表1】

【0199】

実施例３：単一抗体による細胞結合アッセイ
細胞結合アッセイを行ってモノクローナル抗体、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３ＸがＡ４３１細胞上のＥＧＦＲに会合することができることを明らかにした（図３）。連続希釈した単一抗体と共にＡ４３１細胞を２時間インキュベートし、上記の方法論の節で記載したように定量フローサイトメトリーによって、結合した抗体の量を測定した。抗体の連続希釈で使用した濃度は表２にて以下に示す。表２における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0200】

【表2】

【0201】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）を用いた４パラメータロジスティック方程式に対する回帰を介して、これらの実験条件下での細胞上の結合親和性を１６８ｐＭ（Ｐ１Ｘ）、３４０ｐＭ（Ｐ２Ｘ）及び７４８ｐＭ（Ｐ３Ｘ）であると算出した。

【0202】

実施例４：単一抗体によるホスホ−ＥＧＦ受容体シグナル伝達の阻害
Ａ４３１細胞を単一の抗体で処理し、ＥＧＦ依存性のホスホ−ＥＧＦＲ活性を阻害する能力をホスホ−ＥＧＦＲ ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｐ１Ｘ及びＰ２Ｘはそれぞれ３．０９ｎＭ及び４．１９ｎＭのＩＣ５０値にて用量依存性にホスホ−ＥＧＦＲ活性を強力に阻害するが、Ｐ３Ｘによる処理はホスホ−ＥＧＦＲの部分的な阻害を引き出す（図４）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表３にて以下に示す。表３における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0203】

【表3】

【0204】

実施例５：単一抗体及び抗体の対組み合わせによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害及び元の抗体との比較
連続希釈した単一のＰ１Ｘ抗体又はｃａ抗体でＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫ ＥＬＩＳＡによってホスホ−ＥＲＫ阻害を測定した（図５Ａ）。Ｐ１Ｘはホスホ−ＥＲＫ活性の用量依存性の阻害を引き出したが、元の抗体ｃａは部分的な阻害しか引き出さなかった。

【0205】

連続希釈したＰ１Ｘ＋Ｐ３Ｘ抗体又はその元の抗体ｃａ＋ｃｈの対組み合わせによってＡ４３１を処理し、ホスホ−ＥＲＫ ＥＬＩＳＡによってホスホ−ＥＲＫ阻害を測定した（図５Ｂ）。双方の組み合わせは用量依存性にホスホ−ＥＲＫの生成を阻害するが、Ｐ１Ｘ＋Ｐ３Ｘの組み合わせは優れた阻害を提供する。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いた４パラメータロジスティック方程式への適合によって算出したとき、Ｐ１Ｘ＋Ｐ３Ｘの組み合わせはホスホ−ＥＲＫ活性の８２％の阻害を引き出したが、元の抗体の組み合わせは７１％しか引き出さなかった。

【0206】

連続希釈したＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ抗体又はその元の抗体ｃａ＋ｃｄの対組み合わせによってＡ４３１を処理し、ホスホ−ＥＲＫ ＥＬＩＳＡによってホスホ−ＥＲＫ阻害を測定した（図５Ｃ）。双方の組み合わせは用量依存性にホスホ−ＥＲＫの生成を阻害するが、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘの組み合わせは元の抗体の組み合わせに比べてＩＣ９０値にて注目すべき改善を示す。

【0207】

抗体の連続希釈で使用した濃度を表４（図５Ａのデータについて）及び表５（図５Ｂ及び５Ｃのデータについて）にて以下で示す。表４及び５における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0208】

【表4】

【0209】

【表5】

【0210】

表５で示す濃度は使用した抗体の対の合計濃度であることが言及される。使用した比は１：１なので、各個々の抗体は合計濃度の半分を構成する。

【0211】

実施例６：異なる組み合わせ比率のＰ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘによるホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害
連続希釈したＰ１ＸによってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ａ）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表６にて以下に示す。表６における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0212】

【表6】

【0213】

方法論の節に記載されたように実験を実施した。これらの実験条件下でＰ１Ｘは、約２５ｎＭ（２７ｎＭ）のＩＣ５０値を持つ飽和用量にてホスホ−ＥＲＫ活性の８１％を阻害する。従って、ＩＣ５０のプロット上の位置は「２５ｎＭ」によって図６Ａにて示され、２５ｎＭを以下の実験におけるＰ１Ｘの一定濃度と設定した。

【0214】

２５ｎＭの一定濃度のＰ１Ｘと組み合わせた連続希釈した５つの組み合わせ比のＰ３Ｘ＋Ｐ２ＸによってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ｂ）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表７にて以下に示す。表７における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0215】

【表7】

【0216】

表７に示す濃度はＰ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの合計濃度である。Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの個々の濃度は示した比に依存する。方法論の節に記載されたように実験を実施した。使用したＰ２Ｘ：Ｐ３Ｘの比は、１：０、０：１、１：２、２：１及び１：１だった。比はすべて７０％を超えるホスホ−ＥＲＫ活性を阻害し、３つの抗体すべてを含有する組み合わせは最高程度の阻害を提供する。

【0217】

連続希釈した６つの組み合わせ比のＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３ＸによってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ｃ）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表８にて以下に示す。表８における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0218】

【表8】

【0219】

方法論の節に記載されたように実験を実施した。使用したＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘ：Ｐ３Ｘの比は、１：０．０１：１、１：０．１：１、１：１：１、２：０．０１：１、２：０．１：１及び２：２：１だった。比はすべて７０％を超えるホスホ−ＥＲＫ活性を阻害した。

【0220】

連続希釈した５つの組み合わせ比のＰ１Ｘ：Ｐ２ＸによってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した（図６Ｄ）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表９にて以下に示す。表９における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0221】

【表9】

【0222】

表９で示す濃度は使用したＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘの合計濃度であることが言及される。Ｐ１Ｘ及びＰ２Ｘの個々の濃度は示された比に依存する。方法論の節に記載されたように実験を実施した。使用したＰ１Ｘ：Ｐ２Ｘの比は１：２、５：１、９：１、５０：１及び１：５だった。１：５（Ｐ１Ｘ：Ｐ２Ｘ）を除いて比はすべて実験にて使用した濃度範囲の中で７０％を超えるホスホ−ＥＲＫの活性を阻害した。しかしながら、４パラメータのロジスティック阻害の１：５比（Ｐ１Ｘ：Ｐ２Ｘ）データへの適合は、この組み合わせが、実験で使用された用量よりわずかに高く、生理的条件下では十分に達成可能な範囲内である３５．７ｎＭの濃度にて７０％のホスホ-ＥＲＫの阻害を達成するであろうことを予測する。

【0223】

実施例７：Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの２：２：１比の組み合わせによるホスホ−ＥＧＦＲ及びホスホ−ＥＲＫシグナル伝達の阻害
抗体Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの連続希釈の２：２：１モル比の組み合わせ（このモル比でのこの組み合わせを「Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ」と呼ぶ）によってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＧＦＲ及びホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した（図７Ａ）。抗体の連続希釈に使用した濃度を表１０にて以下に示す。表１０における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0224】

【表10】

【0225】

表１０で示す濃度はＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの合計濃度であることが言及される。使用した比は２：２：１であるので、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの個々の濃度はそれぞれ４０％、４０％及び２０％である。方法論の節に記載されたように実験を実施した。３つの抗体の組み合わせは、それぞれ２．３０ｎＭ及び９．８７ｎＭのＩＣ５０値を持つホスホ-ＥＧＦＲ及びホスホ-ＥＲＫ活性双方の強力な阻害剤である。

【0226】

Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３ＸをＰ１Ｘ単独（図７Ｂ）及びＰ２Ｘ単独（図７Ｃ）と比較した。連続希釈した抗体によってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した。図７Ｂ及び７Ｃにて示す実験のための抗体の連続希釈に使用した濃度を表１１にて以下に示す。表１１における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0227】

【表11】

【0228】

表１１で示す濃度はＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの合計濃度であることが言及される。使用した比は２：２：１であるので、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの個々の濃度はそれぞれ４０％、４０％及び２０％である。８０ｎＭのＥＧＦリガンドを用いて細胞を刺激したことを除いて方法論の節に記載されたように実験を実施した。抗体の２：２：１比の組み合わせは、それぞれ部分的な阻害を提供する及び阻害を提供しないＰ１Ｘ及びＰ２Ｘに比べてホスホ−ＥＲＫ活性の強力な阻害剤である。

【0229】

実施例８：Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘによる処理に続くＨ１９７５細胞におけるＥＧＦの下方調節並びにｐＥＲＫ、ｐＡＫＴ及びｐ−ｃ−Ｊｕｎのシグナル伝達の阻害
上記の方法論の節で記載されたように、５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）による１０分間の刺激に先立って１μＭの合計抗体に等しいＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘと共に細胞を２時間、予備インキュベートした。ｔＥＧＦＲ、ｐＥＲＫ、ｐＡＫＴ又はｐ−ｃ−Ｊｕｎに対する抗体によって細胞溶解物の免疫ブロットを別々に探査し、負荷する対照ＰＣＮＡ及び対照の無処理細胞の溶解物に対してバンドの濃度測定を標準化した。Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ処理に応答したＥＧＦ受容体の下方調節を図８Ａに示し、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ処理に応答したｐＥＲＫ、ｐＡＫＴ及びｐ−ｃ−Ｊｕｎのシグナル伝達の阻害を図８Ｂに示す。

【0230】

実施例９：試験管内での腫瘍細胞の増殖の阻害
上述の方法及びその軽微な変更によって試験管内での腫瘍細胞の増殖の阻害を解析した。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）株ＨＣＣ８２７及びＨ１９７５を５０００個／ウェルでウェルに入れ、０．１〜１μＭ（最終濃度）に及ぶ抗体の組み合わせによって処理した。図９Ａ〜９Ｄは、代謝的に生きている細胞の指標である存在するＡＴＰの量に基づいて培養物における生存細胞の数を測定するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）発光細胞生存アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた細胞増殖の阻害を示す。図９Ａ及び９Ｂは、ＥＧＦリガンドの存在下にて、セツキシマブ処理又はアッセイ培地のみ（１％ＦＣＳ）ではそうではない、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの濃度の範囲にわたるＨＣＣ８２７細胞及びＨ１９７５細胞の増殖の強力な阻害を示す。図９Ｃ及び９Ｄは、ＡＲＥＧリガンドの存在下にて、アッセイ培地のみ（１％ＦＣＳ）ではそうではない、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ及びセツキシマブ双方の濃度の範囲にわたるＨＣＣ８２７細胞及びＨ１９７５細胞の増殖の強力な阻害を示す。これらの結果は、高親和性（ＥＧＦ）と低親和性（ＡＲＥＧ）のリガンド双方に応答して試験管内での腫瘍細胞の増殖を阻害するＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの能力を明らかにしており、セツキシマブは低親和性（ＡＲＥＧ）のリガンドで処理した細胞にて有効であるにすぎない。図９Ａ〜Ｄにて示す実験のための抗体の連続希釈に使用した濃度を表１２にて以下に示す。表１２における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0231】

【表12】

【0232】

表１２で示す濃度はＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの合計濃度であることが言及される。使用した比は２：２：１であるので、Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの個々の濃度はそれぞれ４０％、４０％及び２０％である。

【0233】

実施例１０：生体内での腫瘍細胞の増殖の阻害
Ｈ１９７５肺癌細胞の異種移植マウスモデルにて生体内でのＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの有効性を評価した。２×１０^６個のＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞をｎｕ／ｎｕマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍が３００ｍｍ^３の平均サイズに達すると直ちに処理を開始した。ビヒクル対照（ＰＢＳ）；又は以下の成分濃度：マウス比の抗体トリオ−低いＰ１Ｘ＝２．５３ｍｇ／ｋｇ、Ｐ２Ｘ＝７．２６ｍｇ／ｋｇ及びＰ３Ｘ＝０．６６ｍｇ／ｋｇ若しくはマウス比の抗体トリオ−中程度のＰ１Ｘ＝５．０６ｍｇ／ｋｇ、Ｐ２Ｘ＝１４．５２ｍｇ／ｋｇ及びＰ３Ｘ＝１．３３ｍｇ／ｋｇにてマウス比の抗体トリオによって１０匹の群を処理した。２日ごとにマウスを処理した。

【0234】

図１０Ａ（Ｄｕ１４５異種移植モデル）及び図１０Ｂ（Ｈ１９７５異種移植モデル）に示す結果は、生体内で腫瘍細胞の増殖を阻害するＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの能力を明らかにしている。

【0235】

実施例１１：単一抗体によるリガンド拮抗細胞結合アッセイ
Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３ＸがＡ４３１細胞上でのＥＧＦリガンドとＥＧＦ受容体の相互作用に拮抗することができることを明らかにするために細胞結合アッセイを実施した。上記の方法の節で記載したように、１用量の単一抗体と共にＡ４３１細胞を１時間インキュベートし、その後連続希釈したビオチン／ＥＧＦリガンドとインキュベートし、結合したビオチン／ＥＧＦリガンドの量を定量フローサイトメトリーによって測定した。抗体の濃度は表１３にて以下に示し、実施例３にて示した解析によって確定した細胞結合のほぼ飽和する濃度（およそのＥＣ９０濃度）を表す。ビオチン／ＥＧＦの連続希釈に使用した濃度を表１４にて以下に示す。表１３及び表１４における値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）。

【0236】

【表13】

【0237】

【表14】

【0238】

結果は、単一抗体（Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘ）のそれぞれは単独でＡ４３１細胞上にてＥＧＦリガンドとＥＧＦ受容体の相互作用に拮抗することが可能であり、Ｐ１Ｘ及びＰ２ＸはＰ３Ｘよりも強力な阻害活性を示すことを明らかにしている図１１に示す。

【0239】

実施例１２：単一及び組み合わせでの抗体又はＦａｂによるリガンド拮抗細胞結合アッセイ
モノクローナル抗体Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの単一抗体及び複数抗体の組み合わせ並びに一価のＦａｂ断片Ｐ１ＸＦａｂ、Ｐ２ＸＦａｂ及びＰ３ＸＦａｂの単一及び複数の組み合わせがＡ４３１細胞上にてＥＧＦリガンドとＥＧＦ受容体の相互作用に拮抗することができる程度を確定するために細胞結合アッセイを実施した。上記の方法論の節で記載したように、１用量の抗体又はＦａｂと共にＡ４３１細胞を１時間インキュベートし、その後連続希釈したビオチン／ＥＧＦリガンドとインキュベートし、結合したビオチン／ＥＧＦリガンドの量を定量フローサイトメトリーによって測定した。抗体及びＦａｂの濃度は１０ｎＭだった。３つの抗体の組み合わせ（Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ）及び３つの抗体の組み合わせ（Ｐ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ）は２：２：１の比で製剤化し、１０ｎＭの合計濃度で投与した。ビオチン／ＥＧＦの連続希釈に使用した濃度を表１４にて上記に示す。表１４における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0240】

結果は、図１２Ａ（モノクローナル抗体Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの単一及び組み合わせ）及び図１２Ｂ（一価のＦａｂ断片Ｐ１ＸＦａｂ、Ｐ２ＸＦａｂ及びＰ３ＸＦａｂの単一及び組み合わせ）に示す。図１２Ａにおける結果は、３つの抗体すべてが再び単独でＡ４３１細胞上にてＥＧＦリガンドとＥＧＦ受容体の相互作用に拮抗することが可能であり、Ｐ１Ｘ及びＰ２ＸがＰ３Ｘよりも強力な阻害活性を示すことを明らかにしており、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘの３つの組み合わせも強力な阻害活性を示した。図１２Ｂにおける結果は、Ｐ１ＸＦａｂが単独で最強の阻害活性を示し、Ｐ３ＸＦａｂは単独で中程度の阻害活性を示し、Ｐ２ＸＦａｂは単独で最少限の阻害活性を示したにすぎないことを明らかにしている。Ｐ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂの３つの組み合わせも、Ｐ１ＸＦａｂ単独ほど強くはないが、強い阻害活性を示した。

【0241】

実施例１３：Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの抗体又はＦａｂの２：２：１モル比での組み合わせによるホスホ−ＥＧＦＲ及びホスホ−ＥＲＫのシグナル伝達の阻害
連続希釈した、抗体Ｐ１Ｘ、Ｐ２Ｘ及びＰ３Ｘの２：２：１モル比での組み合わせ（Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ）又はＦａｂ、Ｐ１ＸＦａｂ、Ｐ２ＸＦａｂ及びＰ３ＸＦａｂの２：２：１モル比での組み合わせ（このモル比でのこの組み合わせをＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂと呼ぶ）によってＡ４３１細胞を処理し、ホスホ−ＥＧＦＲ及びホスホ−ＥＲＫの阻害をＥＬＩＳＡによって測定した。５０ｎｇ／ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬの濃度で投与されたｒｈＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と共に実験を行った。連続希釈に使用した濃度を表１５にて以下に示す。表１５における各特定の濃度値は若干の軽微な実験変動の影響下にあるので、所与の各特定の濃度は示された濃度のおよその値を示す（たとえば、表にて０．１ｎＭとして示された濃度は約０．１ｎＭの値を表す）ことを当業者は理解するであろう。

【0242】

【表15】

【0243】

結果は図１３Ａ〜Ｄに示すが、図１３Ａ及び１３Ｂは、ホスホ−ＥＧＦＲ阻害アッセイの結果を示し、図１３Ｃ及び１３Ｄは、ホスホ−ＥＲＫ阻害アッセイの結果を示し、図１３Ａ及び１３Ｃは、低用量（５０ｎｇ／ｍＬ又は８ｎＭ）での結果を示し、図１３Ｂ及び１３Ｄは、高用量（５００ｎｇ／ｍＬ又は８０ｎＭ）での結果を示す。

【0244】

ホスホ−ＥＧＦＲの阻害に関して、図１３Ａ及び１３Ｂの結果は、３つの組み合わせ、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３ＸｍＡｂ及びＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ断片の双方が、調べた低用量及び高用量双方にて強い阻害を示したことを明らかにしている。

【0245】

ホスホ−ＥＲＫの阻害に関して、図１３Ｃ及び１３Ｄは、３つの組み合わせ、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３ＸｍＡｂ及びＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ断片の双方が、調べた低用量及び高用量双方にて阻害を示し、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３ＸｍＡｂの組み合わせがＰ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ断片の組み合わせよりも強力な阻害を示したことを明らかにしている。

【0246】

実施例１４：Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ、Ｐ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ又はセツキシマブによる処理に続くＤＵ１４５細胞におけるＥＧＦ受容体の下方調節
それぞれ５０ｎＭ、１００ｎＭ及び５０ｎＭに等しいＰ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ、Ｐ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ又はセツキシマブと共に２、６又は２４時間、細胞を予備インキュベートした。ＩｇＧ分子における２つの結合部位に対するＦａｂ分子における単一の結合部位に対応するためにＦａｂの組み合わせは、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘ及びセツキシマブの２倍の量で投与した。上記の方法論の節で記載したように、膜ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）及び対照としてのＰＣＮＡハウスキーピングタンパク質に対する抗体によって細胞溶解物の免疫ブロットを探査した。処理に応答したＥＧＦ受容体の下方調節を図１４に示す。結果は、Ｐ１Ｘ＋Ｐ２Ｘ＋Ｐ３Ｘによる処理は時間依存性のＥＧＦＲの注目すべき下方調節をもたらしたが、Ｐ１ＸＦａｂ＋Ｐ２ＸＦａｂ＋Ｐ３ＸＦａｂ又はセツキシマブによる処理は免疫ブロットの視覚的検査ではＥＧＦＲの注目すべき下方調節をもたらさなかった。

【0247】

同等物
当業者は単なる日常の実験を用いて、本明細書に記載された特定の実施形態の多数の同等物を認識するであろうし、又は突き止めることができるであろう。そのような同等物は以下のクレームによって包含されるように意図される。複数の従属クレームにて開示される実施形態の任意の組み合わせは本開示の範囲内にあることが熟考される。

【0248】

参照による組み入れ
上文で引用された特許、同時係属特許出願及び特許公開はすべてその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0249】

別表A
抗癌剤

【0250】

配列表要約

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

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