特許 6251570 多量体ＩＬ−１５可溶性融合分子並びにその製造及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6251570

(24)【登録日】2017年12月1日

(45)【発行日】2017年12月20日

(54)【発明の名称】多量体ＩＬ−１５可溶性融合分子並びにその製造及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171211BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20171211BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20171211BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20171211BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20171211BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20171211BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20171211BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20171211BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20171211BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20171211BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20171211BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C07K19/00ZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

   A61K38/00

   A61K38/17

   A61K38/20

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61P31/12

【請求項の数】16

【全頁数】107

(21)【出願番号】特願2013-529432(P2013-529432)

(86)(22)【出願日】2011年9月21日

(65)【公表番号】特表2013-541335(P2013-541335A)

(43)【公表日】2013年11月14日

(86)【国際出願番号】US2011052545

(87)【国際公開番号】WO2012040323

(87)【国際公開日】20120329

【審査請求日】2014年9月18日

(31)【優先権主張番号】61/384,817

(32)【優先日】2010年9月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/527,911

(32)【優先日】2011年8月26日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504090190

【氏名又は名称】アルター・バイオサイエンス・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100189131

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 拓郎

(74)【代理人】

【識別番号】100182486

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 正展

(74)【代理人】

【識別番号】100158872

【弁理士】

【氏名又は名称】牛山 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100147289

【弁理士】

【氏名又は名称】佐伯 裕子

(72)【発明者】

【氏名】ウォン，ヒン シー．

(72)【発明者】

【氏名】ロード，ピーター

(72)【発明者】

【氏名】リウ，バイ

(72)【発明者】

【氏名】チュー，シャオユン

(72)【発明者】

【氏名】ハン，カイピン

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２７９１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００７／００１６７７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 J. Immunol., 2008, Vol.180, No.4, p.2099-2106

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ５／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体であって、
第１の融合タンパク質が、（ａ）第１生物活性ポリペプチド、及びそれと共有結合している（ｂ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド又はその機能的断片を含み；そして
第２の融合タンパク質が、（ｃ）第２生物活性ポリペプチド、及びそれと共有結合している（ｄ）可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能的断片を含み、
第１及び第２融合タンパク質の一方又は両方が、更に免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片を含み、
第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインが、第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成し、該ＩＬ−１５ポリペプチドは成熟ＩＬ−１５配列の７２位でＮからＤへの置換を有するＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）であり、該ＩＬ−１５ＲαポリペプチドはＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉ結合ドメインを含んでいる、
可溶性融合タンパク質複合体。

【請求項2】

第１及び第２生物活性ポリペプチドの一方が第１可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）若しくはその機能的断片を含んでいる、又は、他方の生物活性ポリペプチドが第１可溶性ＴＣＲと異なる第２可溶性ＴＣＲ若しくはその機能的断片を含んでいる、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。

【請求項3】

Ｆｃドメインに融合したＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）及びＮ７２Ｄ突然変異を含むＩＬ−１５変異体ポリペプチド（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含んでなる（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。

【請求項4】

請求項１〜３の何れか一項に記載の第１融合タンパク質をコードする配列を有する、核酸。

【請求項5】

請求項１〜３の何れか一項に記載の第２融合タンパク質をコードする配列を有する、核酸。

【請求項6】

請求項４に記載の核酸を含んでなる、ＤＮＡベクター。

【請求項7】

請求項５に記載の核酸を含んでなる、ＤＮＡベクター。

【請求項8】

請求項４及び５に記載の核酸を含んでなる、ＤＮＡベクター。

【請求項9】

請求項４に記載の核酸、請求項５に記載の核酸、及び、請求項４及び５に記載の核酸の群から選ばれる核酸を含んでなる、細胞。

【請求項10】

方法が、
ａ）第１融合タンパク質をコードする請求項６に記載のＤＮＡベクターを第１宿主細胞内に導入すること、
ｂ）細胞又は培地中に第１融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、培地中で第１宿主細胞を培養すること、
ｃ）宿主細胞又は培地から第１融合タンパク質を精製すること、
ｄ）第２融合タンパク質をコードする請求項７に記載のＤＮＡベクターを第２宿主細胞内に導入すること、
ｅ）細胞又は培地中に第２融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、培地中で第２宿主細胞を培養すること、
ｆ）宿主細胞又は培地から第２融合タンパク質を精製すること、及び
ｇ）第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で、第１及び第２融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、
を含んでなる、請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。

【請求項11】

方法が、
ａ）第１融合タンパク質をコードする請求項６に記載のＤＮＡベクター及び第２融合タンパク質をコードする請求項７に記載のＤＮＡベクターを宿主細胞に導入すること、
ｂ）細胞又は培地中に融合タンパク質を発現させ、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及び
ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること、
を含んでなる、請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。

【請求項12】

方法が、
ａ）複数の細胞を請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、該複数の細胞は更に、請求項１に記載のＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を担持している免疫細胞又は請求項１に記載のＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を担持している免疫細胞、及び請求項１に記載の生物活性ポリペプチドの少なくとも１つによって認識される抗原を担持している標的細胞を含んでいる、
ｂ）標的細胞上の抗原と、免疫細胞上のＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体鎖の間に、免疫細胞を結合及び活性化するのに十分に、特異的結合複合体（架橋）を形成すること、及び
ｃ）結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷すること、
を含んでなる、インビトロで標的細胞を殺傷する方法。

【請求項13】

疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項14】

ＩＬ−１５Ｒ鎖又はＦｃ受容体鎖を担持している免疫細胞を、疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と混合することによって得られる免疫細胞−融合タンパク質複合体混合物を含んでなる、疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項15】

疾患が癌又はウィルス感染症である、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

請求項１〜３の何れか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、哺乳動物における免疫応答を刺激又は抑制するための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本願はその全ての内容が参照により本明細書に取り込まれている、２０１０年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３８４，８１７号及び２０１１年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／５２７，９１１号の優先権を主張する。

【0002】

（政府の支援）
本願の研究支援は、保健社会福祉省、長官に代表されるアメリカ合衆国によって実施された。

【背景技術】

【0003】

多価分子の形成を介して有効親和性を増大すること、或いは複数の特定分子の形成を介して認識の範囲を広げることの何れかを目的とする多量体標的タンパク質を作ることの有用性を過去の研究が明らかにしている。多種のタンパク質相互作用ドメインが２価及び多価結合部位を有する組み換えタンパク質を作るために用いられてきた。初めに、ロイシンのジッパードメインに対する標的ドメインの融合が一般に二量化に用いられた。この手法では、ロイシンジッパードメインの疎水性相互作用が並行α螺旋中の規則的間隔のロイシンによって介在され、それと同時に二量化の相手が、主に荷電される残基である、疎水性コアのすぐ手前にある別のアミノ酸によって認識され、塩橋を形成する（１〜３）。この相互作用はタンパク質のＦｏｓとＪｕｎファミリーによって例示され、これは標的ドメイン特異性の有意な障害なしで優先的にヘテロ二量体を形成する。この手法は多量体を作るための多目的な骨格を提供する（４、５）。しかしながら、治療用タンパク質の開発に対するこの手法の実用性に著しく影響を与える制限がある。最も顕著には、ＦｏｓとＪｕｎは殆ど例外なく核内に蓄積される細胞内タンパク質である。従って、可溶性で分泌型のＦｏｓとＪｕｎの融合は通常、バキュロウィルス感染又は安定に形質転換された昆虫細胞系を用いて、比較的低い収量で容易には拡張できない製造工程で作られる（６、７）。二重特異性分子を作るために、Ｆｏｓ−Ｊｕｎに結合している抗体ドメインを細菌細胞又は哺乳動物細胞内に産生したが、主な制限は、精製工程を複雑にしそして全収量を低下する（８、９）サブユニットのホモ二量化であった（８、９）。更に、昆虫又は細菌細胞によって産生されるタンパク質のグリコシル化のパターンの相違が、治療適用で用いられるときに産生物の潜在的な免疫原性についての懸念を引き起こしている。

【0004】

ロイシンジッパーモチーフに加えて、免疫グロブリン（ＩｇＧ）定常ドメイン、ヘリックス・ターン・ヘリックス自己二量化ペプチド、コラーゲンの三量又は四量サブドメイン及びｐ５３が、それによって多価分子を作る骨格として用いられている（８、１０〜１３）。ＩｇＧ断片を除いて、これらの相互作用ドメインは主として分子骨格として働いて、自らはその他の機能活性を欠いている。更に、これらのドメインを含んでいる融合タンパク質は大抵、安定な多量体形成を促進するための最適化及び特殊化した産生細胞株、そして面倒な又は治療法の開発に関する規制ハードルを負わせる精製方法を必要としている（１０、１２）。これらの骨格の多くは、乏しい薬物動態特性を示しそしてその治療可能性を制限する免疫原性応答のリスクをもたらす非ヒトタンパク質ドメイン又は血漿の非天然成分の何れかの誘導体である。

【発明の概要】

【0005】

本発明は少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を有している可溶性融合タンパク質複合体を提供する。ある特定の実施態様では、第１融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド又はその機能的断片に共有結合している第１生物活性ポリペプチドを包含している。第２融合タンパク質は、可溶性インターロイキン‐１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能的断片に共有結合している第２生物活性ポリペプチドを包含している。複合体中で、第１及び第２融合タンパク質の一方又は両方が更に免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能断片を包含している。複合体中で、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。

【0006】

ある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体中で、第１及び第２生物活性ポリペプチドのうちの１つは第１可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその機能的断片を包含している。ある特定の実施態様では、第１可溶性ＴＣＲを包含している可溶性融合タンパク質複合体は、生物活性ポリペプチドとして第２可溶性ＴＣＲを包含し、それによって増大した結合活性を伴う多価ＴＣＲ融合タンパク質複合体を作る。ある特定の実施態様では、複合体中のＴＣＲは少なくとも２つの異なったＴＣＲを包含する。ある特定の実施態様では、全てのＴＣＲが同じである。２つの異なったＴＣＲが存在するある特定の実施態様では、ＴＣＲは別の標的分子に結合する。２つの異なったＴＣＲが存在するある特定の実施態様では、ＴＣＲは同じ標的分子上の異なったエピトープに結合する。ある特定の実施態様では、ＴＣＲは特定抗原の認識に対して特異的である。

【0007】

ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合複合体中で、ＴＣＲは独立して、α及びβ鎖ＴＣＲ並びに単鎖ＴＣＲポリペプチドを含んでいるヘテロ二量体から選ばれる。ある特定の実施態様では、単鎖ＴＣＲはペプチドリンカー配列によってＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合しているＴＣＲ Ｖ−α鎖を包含している。ある特定の実施態様では、単鎖ＴＣＲは更に、ＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃβ鎖断片包含している。ある特定の実施態様では、単鎖ＴＣＲは更に、ＴＣＲ Ｖ−α鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃα鎖断片を包含している。可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、第１生物活性ポリペプチドはＴＣＲαポリペプチド又はその機能的断片を包含し、そして第２生物活性ポリペプチドはＴＣＲβポリペプチド又はその機能的断片を包含する。

【0008】

ある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体中で、第１及び第２生物活性ポリペプチドの一方又は両方は抗体又はその機能的断片を包含する。ある特定の実施態様では、複合体中の抗体は少なくとも２つの異なった抗体を包含する。ある特定の実施態様では、全ての抗体が同じである。少なくとも２つの異なった抗体が存在するある特定の実施態様では、抗体は異なった標的分子に結合する。少なくとも２つの異なった抗体が存在するある特定の実施態様では、抗体は同じ標的分子上の異なったエピトープに結合する。ある特定の実施態様では、抗体は特定抗原の認識に対して特異的である。

【0009】

可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、抗体は単鎖抗体又は単鎖Ｆｖである。ある特定の実施態様では、単鎖抗体は、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変ドメインに共有結合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含んでいる。ある特定の実施態様では、第１生物活性ポリペプチドは抗体重鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含んでおり、そして第２生物活性ポリペプチドは抗体軽鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる。

【0010】

本発明の可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、ＩＬ−１５ポリペプチドは天然型ＩＬ−１５ポリペプチドと異なったアミノ酸配列を有しているＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドを本明細書ではｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）等で示し、そしてこの変異体を天然アミノ酸、天然配列中のその位置及び変異アミノ酸を用いて示す。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位のＮのＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を示す。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然型ＩＬ−１５ポリペプチドと比べてＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する増大した結合活性によって実証されているように、１Ｌ−１５アゴニストとして機能する。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然型ＩＬ−１５ポリペプチドと比べてＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する減少した結合活性によって実証されているように、１Ｌ−１５アンタゴニストとして機能する。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５変異体は天然型ＩＬ−１５ポリペプチドと比べＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対して増大した結合親和性又は減少した結合活性を有している。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５変異体の配列は天然型ＩＬ−１５の配列と比べて、少なくとも１つの（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）アミノ酸変化を有している。アミノ酸変化は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はＩＬ−１５ＲγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメインにおける１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換又は欠失を包含できる。ある特定の実施態様では、アミノ酸変化は成熟ヒトＩＬ−１５配列（配列番号５１）の８、６１、６５、７２、９２、１０１、１０８、又は１１１位における１つ又はそれ以上のアミノ酸置換又は欠失である。例えば、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８位のＤをＮ又はＡへ、６１位のＤをＡへ、６５位のＮをＡへ、７２位のＮをＲへ又は１０８位のＱをＡへの置換又はこれらの置換の組合わせである。ある特定の実施態様では、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の７２位のＮをＤへの置換である。

【0011】

本発明のある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体中で、Ｆｃドメイン又はその機能的断片は、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、ＩｇＡ Ｆｃドメイン、ＩｇＤ Ｆｃドメイン、ＩｇＥ Ｆｃドメイン、及びＩｇＭ Ｆｃドメイン：又はこれらの何れかの組合わせよりなる群から選ばれるＦｃドメインを包含する。ある特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、変化した補体又はＦｃ受容体結合特性を有するＦｃドメインをもたらすアミノ酸変化を包含する。変化した補体又はＦｃ受容体結合特性を有するＦｃドメインを生ずるアミノ酸変化は当該技術分野で公知である。例えば、ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２の２３４位及び２３５位（番号は抗体コンセンサス配列に基づいている）のロイシン残基（すなわち、．．．ＰＥＬＬＧＧ．．．（配列番号１））のアラニン残基による置換（すなわち、．．．ＰＥＡＡＧＧ．．．（配列番号２））はＦｃガンマ受容体結合の損失をもたらすのに対して、ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２の３２２位（番号は抗体コンセンサス配列に基づいている）のリジン残基（すなわち、．．．ＫＣＫＳＬ．．．（配列番号３））のアラニン残基による置換（すなわち、．．．ＫＣＡＳＬ．．．（配列番号４））は補体活性の損失をもたらす。ある特定の実施態様では、このような突然変異を組合わせることができる。

【0012】

可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、第１生物活性ポリペプチドはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能的断片）と共有結合している。可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、第２生物活性ポリペプチドはポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）と共有結合している。可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）はポリペプチドリンカー配列によってＦＣドメイン（又はその機能的断片）と共有結合している。それぞれのポリペプチドリンカー配列は独立して選択できる。ある特定の実施態様では、ポリペプチドリンカー配列は同一である。ある特定の実施態様では、これは異なっている。

【0013】

ある特定の実施態様では、ＴＣＲドメインに対する抗原はＭＨＣ又はＨＬＡ分子内に存在するペプチド抗原を包含する。ある特定の実施態様では、ペプチド抗原は腫瘍関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドから誘導される（すなわち、少なくともこれらの部分配列を包含する）。ある特定の実施態様では、抗体ドメインに対する抗原は細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる。

【0014】

ある特定の実施態様では、抗体ドメインに対する抗原はＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体或いはリガンド、生育因子の受容体又はリガンド、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原の１つ又はそれ以上である。

【0015】

可溶性融合タンパク質複合体のある特定の実施態様では、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、ＩＬ−１５ポリペプチドと結合できるＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインを包含する。可溶性ヒトＩＬ−１５Ｒαポリペプチドを本明細書では、ｈＩＬ−１５Ｒα、ｈｕＩＬ−１５Ｒα、ｈＩＬ−１５Ｒα、ｈｕＩＬ−１５Ｒαなどと呼ぶ。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５ＲαポリペプチドはＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉ（Ｓｕ）ドメイン又はＩＬ−１５ＲαΔＥ３ドメインの何れかを包含する。

【0016】

ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、多量体化、例えば、二量体化、三量体化又は他の多量体化（例えば、四量体化、五量体化）されている。ある特定の実施態様では、多量体はホモ多量体である。ある特定の実施態様では、多量体はヘテロ多量体である。ある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、化学架橋剤によって結合している。ある特定の実施態様では、ジスルフィド結合が第１可溶性融合タンパク質複合体の第２ポリペプチドのＦｃドメインを第２可溶性融合タンパク質複合体の第２ポリペプチドのＦｃドメインに共有結合する。

【0017】

ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５変異体又はその機能的断片、及び可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能的断片を包含し、ここでＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは更に免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片を包含する。

【0018】

ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、検出可能な標識を含んでいる少なくとも１つの可溶性融合タンパク質を包含する。検出可能な標識は、これに限定されないが、ビオチン、ストレプタビジン、それらの酵素的或いは触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光性、リン光性、或いはケミルミネスセント分子；又はこれらの何れかの組み合わせを包含する。

【0019】

本発明は、本発明の融合タンパク質の何れかをコードする核酸配列を提供する。ある特定の実施態様では、核酸配列は更に１つ又はそれ以上の翻訳及び／又は転写調節配列、例えば、融合タンパク質をコードする配列に操作可能に結合している：プロモーター、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列を包含する。ある特定の実施態様では、核酸配列は複製、発現又は両方のためのベクター中にある。

【0020】

本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法を提供する。方法は：
ａ）第１融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを第１宿主細胞内へ導入すること、
ｂ）細胞中又は培地中に第１融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で第１宿主細胞を培地中で培養すること、
ｃ）宿主細胞又は培地から第１融合タンパク質を精製すること、
ｄ）第２融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを第２宿主細胞内へ導入すること、
ｅ）細胞中又は培地中に第２融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で第２宿主細胞を培地中で培養すること、
ｆ）宿主細胞又は培地から第２融合タンパク質を精製すること、及び
ｇ）第１融合タンパク質の１Ｌ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性１Ｌ−１５Ｒαの間を結合させるのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること：
の工程を包含する。

【0021】

ある特定の実施態様では、方法は更に、発現ベクターから発現されたポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成するのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合することを包含する。

【0022】

本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法を提供し、その方法は：
ａ）第１融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクター及び第２融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを宿主細胞内へ導入すること、
ｂ）細胞中又は培地中に融合タンパク質を発現して第１融合タンパク質の１Ｌ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性１Ｌ−１５Ｒαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、
ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること：
の工程を包含する。

【0023】

ある特定の実施態様では、方法は更に、発現ベクターから発現されたポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成するのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合することを包含する。

【0024】

本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法を提供し、その方法は：
ａ）第１及び第２融合タンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを宿主細胞内へ導入すること、
ｂ）細胞中又は培地中に融合タンパク質を発現して第１融合タンパク質の１Ｌ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性１Ｌ−１５Ｒαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養して、可溶性融合タンパク質複合体を形成して、そして特許請求の範囲第４６項に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成させること、
ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること：
の工程を包含している。

【0025】

ある特定の実施態様では、方法は更に、発現ベクターから発現されたポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成するのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合することを包含する。

【0026】

本発明は標的細胞を死滅させる方法を提供し、方法は：
ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること（ここで複数の細胞は、ＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を有する免疫細胞、又はＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を有している免疫細胞、及び少なくとも１つの生物活性ポリペプチドによって認識される抗原を有している標的細胞を更に包含する）、
ｂ）標的細胞上の抗原と免疫細胞上のＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体鎖との間に特定の結合複合体（架橋）を形成して、免疫細胞を十分に結合させて活性化すること、及び
ｃ）結合して活性化した免疫細胞によって標的細胞を死滅させること：
の工程を包含している。

【0027】

死滅させる方法のある特定の実施態様では、標的細胞は腫瘍細胞又はウィルスに感染した細胞である。

【0028】

死滅させる方法のある特定の実施態様では、生物活性ポリペプチドはＴＣＲを包含する。

【0029】

死滅させる方法のある特定の実施態様では、標的細胞上の抗原はＭＨＣ又はＨＬＡ分子中に存在してＴＣＲによって認識される腫瘍又はウィルスがコードするペプチド抗原を包含する。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球又は顆粒球である。

【0030】

本発明は、病的細胞が疾患関連抗原を発現している、患者における疾患を予防又は治療する方法を提供し、方法は、
ａ）疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを有している本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること；
ｂ）抗原発現病的細胞と免疫細胞を発現しているＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体との間で、免疫細胞を局在化するのに十分な、特定結合複合体（架橋）を形成すること；及び
ｃ）病的細胞を損傷又は殺傷させて患者における疾患を十分に予防又は治療すること：
の工程を包含している。

【0031】

本発明は、病的細胞が疾患関連抗原を発現している、患者における疾患を予防又は治療する方法を提供し、方法は、
ａ）ＩＬ−１５Ｒ鎖又はＦｃ受容体鎖を有している免疫細胞を、疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを包含している本発明の可溶性融合タンパク質複合体と混合すること；
ｂ）免疫細胞と融合タンパク質複合体との混合物を患者にとうよすること；
ｃ）抗原発現病的細胞と免疫細胞を発現しているＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体との間で、特定結合複合体（架橋）を形成して免疫細胞を十分に局在化させこと；及び
ｃ）患者における疾患を予防又は治療するのに十分に異常細胞を損傷又は殺傷すること：
ｄ）病的細胞を損傷又は殺傷させて患者における疾患を十分に予防又は治療すること：
の工程を包含している。

【0032】

病的細胞が疾患関連抗原を発現している、患者における疾患を予防又は治療する方法のある特定の実施態様では、疾患は癌又はウィルス感染症である。ある特定の実施態様では、疾患関連抗原はペプチド／ＭＨＣ複合体である。

【0033】

本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物における免疫応答を刺激する方法を提供する。

【0034】

本発明は、本発明の何れか１つの可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物における免疫応答を抑制する方法を提供する。

【0035】

本発明は、細胞又は組織上に存在している抗原を有している細胞又は組織を検出する方法を提供し、方法は：
ａ）細胞又は組織を、抗原と可溶性融合タンパク質複合体の生物活性ポリペプチドとの間で特定結合複合体を形成する条件下で、検出可能な標識を包含している本発明の可溶性融合タンパク質複合体の少なくと１つと接触させること；
ｂ）抗原と結合しなかった可溶性融合タンパク質複合体の何れをも除去するのに適している条件下で細胞又は組織を洗浄すること；及び
ｃ）抗原を含有している細胞又は組織の指標として特定結合複合体を検出すること：
の工程を包含している。

【0036】

検出方法のある特定の実施態様では、生物活性ポリペプチドはＴＣＲを含み、抗原はＴＣＲによって認識されるＭＨＣ又はＨＬＡ分子中に存在するペプチドを含有する。本明細書で提供される検出方法は高感度である。例えば、この方法では、存在する抗原のコピー数は細胞当り１０００又はそれ以下のコピーである。本明細書で提供される検出方法はインビボ、インビトロ、又はエクスビボで実施できる。

【0037】

本発明は、第１可溶性融合タンパク質複合体と第２可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することによって、本発明の可溶性融合タンパク質複合体の分子あたりの結合活性を増大する方法を提供し、ここでそれぞれの融合タンパク質複合体の第１生物活性ポリペプチドと第２生物活性ペプチドの結合部位は同一又は異なっている。例えば、分子あたりの結合活性は、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、或いは７０％又はそれ以上である。

【0038】

本発明は、第１可溶性融合タンパク質複合体と第２可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することによって、本発明の可溶性融合タンパク質複合体の分子あたりのＩＬ−１５活性を増大する方法も提供する。

【0039】

一態様では、本発明は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）：インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）融合タンパク質複合体を製造する方法を提供し、方法は、ＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）をコードする第１ＤＮＡベクター及びＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２ＤＮＡベクターを宿主細胞（例えば哺乳動物の細胞）内へ導入すること；ＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）及びＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地内で培養すること；及びＩＬ−１５：ＩＬ−１５α融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること：を含んでいる。

【0040】

別の態様では、本発明は、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含んでいる１Ｌ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を製造する方法を提供し、方法は、ＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）をコードする第１ＤＮＡベクター及びＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質をコードする第２ＤＮＡベクターを宿主細胞内へ導入すること；ＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）及びＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地内で培養すること；及び１Ｌ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を宿主細胞又は培地から精製すること：を含んでいる。

【0041】

別の態様では、本発明は、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含んでいる１Ｌ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を製造する方法を提供し、方法は、宿主細胞中でＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）及びＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を同時発現すること；ＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）及びＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること；及びＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること：を含んでいる。

【0042】

別の態様では、本発明は、宿主細胞中でＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質を同時発現すること；ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること；及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでいる、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を製造する方法を提供する。ここでＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体のＩＬ−１５結合部位は両方とも完全に塞がっている。

【0043】

別の態様では、本発明は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５変異体をコードする第１ポリヌクレオチド及びＩＬ−１５受容体融合タンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドを含有している細胞を提供する。一実施態様では、細胞はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄをコードする第１発現ベクター及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする第２発現ベクターを含んでいる。

【0044】

別の態様では、本発明は、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及び２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子を含有している単離された完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を提供する。一実施態様では、複合体は９０〜９５％又はそれ以上精製されて完全に塞がれていて；５．６〜６．５の等電点を有し；約１１４ｋＤａの分子量を有し；そして／或いはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃポリペプチドの何れか又は両方上でグリコシル化される。

【0045】

別の態様では、本発明は、本明細書中で詳しく説明されている発現及び精製方法の何れかによって産生される、単離されて完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を提供する。

【0046】

別の態様では、本発明は、対象における免疫応答を調節する（例えば、増大又は減少する）方法を提供し、方法は完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を対象に投与することを含んでいる。

【0047】

別の態様では、本発明は、腫瘍を有している対象において免疫応答を増強する方法を提供し、方法は完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を対象に投与することを含んでいる。

【0048】

上記態様又は本明細書で詳細に説明されている本発明の他の態様の多様な実施態様では、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、生物活性ポリペプチド（例えば、ＩｇＧの重鎖定常ドメイン、ＩｇＧの重鎖定常ドメインのＦｃドメイン）と共有結合している可溶性ＩＬ−１５Ｒαを含んでいる。上記態様の本発明の別の実施態様では、ＩＬ−１５は、第２生物活性ポリペプチドと共有結合しているＩＬ−１５を含んでいる。別の実施態様では、細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することは、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体と特異的に結合する親和性試薬上にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を捕獲することを含んでいる。別の実施態様では、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含んでいて、親和性試薬はＦｃドメインと特異的に結合する。別の実施態様では、親和性試薬はプロテインＡ又はプロテインＧである。別の実施態様では、親和性試薬は抗体である。別の実施態様では、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することはイオン交換クロマトグラフィーを含んでいる。別の実施態様では、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することはサイズ排除クロマトグラフィーを含んでいる。別の実施態様では、ＩＬ−１５ＲαはＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含んでいる。別の実施態様では、ＩＬ−１５は、突然変異ＩＬ−１５（例えば、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。別の実施態様では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体のＩＬ−１５結合部位は完全に塞がっている。別の実施態様では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の両方のＩＬ−１５結合部位は完全に塞がっている。別の実施態様では、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体は複合体電荷又はサイズ特性に基づいて精製される。別の実施態様では、完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は複合体電荷特性に基づいて陰イオン交換クロマトグラフィーで精製される。別の実施態様では、完全に塞がっているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、低いイオン強度の中性ｐＨ緩衝剤を用いる結合条件及びイオン強度を増大させる緩衝剤を用いる溶出条件と共に４級アミンベースの樹脂を用いて精製される。

【0049】

本発明は、本発明の１つ又はそれ以上の可溶性融合タンパク質複合体、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を製造するための１つ又はそれ以上の特定試薬（例えば、本発明の１つ又はそれ以上の可溶性融合タンパク質複合体をコードするヌクレオチド）、及び／又は本発明の１つ又はそれ以上の可溶性融合タンパク質複合体を用いるための特定物質を包含しているキットも提供する。キット中の物質は、一般的に使用説明書と共に、適切な容器中で提供される。
すなわち、本発明は、以下の（１）から（１０８）に関する。
（１）少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体であって、第１の融合タンパク質が、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド（ｂ）又はその機能的断片と共有結合している第１生物活性ポリペプチド（ａ）を含み、そして、第２の融合タンパク質が、可溶性インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド（ｄ）又はその機能的断片と共有結合している第２生物活性ポリペプチド（ｃ）を含み、第１及び第２融合タンパク質の一方又は両方が更に免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片を含み、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインが第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成している、可溶性融合タンパク質複合体。
（２）第１及び第２生物活性ポリペプチドの一方が第１可溶性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその機能的断片を含んでいる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３）他方の生物活性ポリペプチドが、前記（２）に記載の第１可溶性ＴＣＲ又はその機能的断片を含み、それによって増大した結合活性を有する多価ＴＣＲ融合タンパク質複合体を作製する、前記（２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（４）他方の生物活性ポリペプチドが第１可溶性ＴＣＲと異なる第２可溶性ＴＣＲ又はその機能的断片を含んでいる、前記（２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（５）ＴＣＲが特定抗原の認識に特異的である、前記（２）〜（４）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（６）ＴＣＲが、α及びβ鎖ＴＣＲを含んでいるヘテロ二量体である、前記（２）〜（４）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（７）ＴＣＲが１本鎖ＴＣＲポリペプチドを含んでいる、前記（２）〜（４）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（８）１本鎖ＴＣＲが、ペプチドリンカー配列によってＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合しているＴＣＲ Ｖ−α鎖を含んでいる、前記（７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（９）１本鎖ＴＣＲが、ＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃβ鎖断片を更に含んでいる、前記（８）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１０）１本鎖ＴＣＲが、ＴＣＲ Ｖ−α鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃα鎖断片を更に含んでいる、前記（８）又は（９）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１１）第１生物活性ポリペプチドが、ＴＣＲαポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第２生物活性ポリペプチドが、ＴＣＲβポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１２）第１及び第２生物活性ポリペプチドの一方又は両方が、抗体又はその機能的断片を含んでいる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１３）抗体が、特定抗原の認識に特異的である、前記（１２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１４）抗体が、１本鎖抗体又は１本鎖Ｆｖである、前記（１２）又は（１３）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１５）１本鎖抗体が、ポリペプチドリンカー配列によって免疫グロブリン重鎖可変領域と共有結合している免疫グロブリン軽鎖可変領域を含んでいる、前記（１４）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１６）第１生物活性ポリペプチドが抗体重鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含み、そして第２生物活性ポリペプチドが抗体軽鎖ポリペプチド又はその機能的断片を含んでいる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１７）ＩＬ−１５ポリペプチドが、天然のＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を含んでいるＩＬ−１５変異体である、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１８）ＩＬ−１５変異体が、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する、前記（１７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（１９）ＩＬ−１５変異体が、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較して、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する増大した又は減少した結合活性を有している、前記（１７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２０）ＩＬ−１５変異体の配列が、天然のＩＬ−１５配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有している、前記（１７）〜（１９）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２１）アミノ酸変化が、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はＩＬ−１５ＲγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメイン中のアミノ酸置換又は欠失である、前記（２０）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２２）アミノ酸変化が、成熟ヒトＩＬ−１５配列（配列番号５１）の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１、又は１１２位における１つ又はそれ以上のアミノ酸置換又は欠失である、前記（２０）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２３）アミノ酸変化が、成熟ヒトＩＬ−１５配列の６位のＩをＳに、８位のＤをＮ若しくはＡに、６１位のＤをＡに、６５位のＮをＡに、７２位のＮをＲに、１０４位のＶをＰに、又は１０８位のＱをＡに置換すること、又はこれらの置換の何れかの組み合わせである、前記（２２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２４）アミノ酸変化が、ＩＬ−１５アンタゴニスト活性又は天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する減少した結合活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす、前記（２３）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２５）アミノ酸変化が、成熟ヒトＩＬ−１５配列の７２位でＮをＤに置換することである、前記（２０）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２６）アミノ酸変化が、ＩＬ−１５アゴニスト活性又は天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する増大した結合活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす、前記（２５）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２７）Ｆｃドメイン又はその機能的断片が、ＩｇＧ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、ＩｇＡ Ｆｃドメイン、ＩｇＤ Ｆｃドメイン、ＩｇＥ Ｆｃドメイン、及びＩｇＭ Ｆｃドメインからなる群より選ばれるＦｃドメインを含んでいる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（２８）Ｆｃドメインが、変化した相補体又はＦｃ受容体結合特性を有するＦｃドメインをもたらすアミノ酸変化を含んでいる、前記（２７）に記載の可溶性融合タンパク質。
（２９）アミノ酸変化が、ＩｇＧ１Ｃ_Ｈ２の２３４及び２３５位のロイシン残基の（抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリング）（すなわち、．．．ＰＥＬＬＧＧ ．．．）アラニン残基による置換（すなわち、．．．ＰＥＡＡＧＧ ．．．）、ＩｇＧ１Ｃ_Ｈ２の３３２位のリジン残基の（抗体コンセンサス配列に基づいてナンバリング）（すなわち、．．．ＫＣＫＳＬ ．．．）アラニン残基による置換（すなわち、．．．ＫＣＡＳＬ ．．．）、又はこれらの何れかの組合わせからなる群より選ばれる、前記（２８）に記載の可溶性融合タンパク質。
（３０）第１生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能的断片）と共有結合している、前記（１）〜（２９）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３１）第２生物活性ポリペプチドが、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）と共有結合している、前記（１）〜（３０）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３２）ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）が、ポリペプチドリンカー配列によってＦｃドメイン（又はその機能的断片）と共有結合している、前記（１）〜（３１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３３）ＴＣＲドメインに対する抗原が、ＭＨＣ又はＨＬＡ分子中で提示されるペプチド抗原を含んでいる、前記（５）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３４）ペプチド抗原が、腫瘍関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドに由来している、前記（３３）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３５）抗体ドメインに対する抗原が、細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる、前記（１３）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３４）抗体ドメインに対する抗原が、ＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原を含んでいる、前記（１３）又は（３５）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３５）ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドが、ＩＬ−１５ポリペプチドを結合することができるＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインを含んでいる、前記（１）〜（３４）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３６）ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドが、ＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン又はＩＬ−１５ＲαΔＥ３ドメインの何れかを含んでいる、前記（１）〜（３５）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３７）前記（１）〜（３６）の何れかに記載の第２可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している前記（１）〜（３６）の何れかに記載の第１可溶性融合タンパク質複合体を含んでなる、可溶性融合タンパク質複合体。
（３８）第１可溶性融合タンパク質複合体が、第２可溶性融合タンパク質複合体と同じである、前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（３９）第１可溶性融合タンパク質複合体が、第２可溶性融合タンパク質複合体と異なる、前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（４０）第１可溶性融合タンパク質複合体が、ジスルフィド結合で第２可溶性融合タンパク質複合体と共有結合している、前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（４１）ジスルフィド結合が、第１可溶性融合タンパク質複合体の第２ポリペプチドのＦｃドメインを第２可溶性融合タンパク質複合体の第２ポリペプチドのＦｃドメインに共有結合させる、前記（４０）に記載の可溶性融合複合体。
（４２）前記（１）〜（３６）の何れかに記載の第１融合タンパク質をコードする核酸配列。
（４３）前記（１）〜（３６）の何れかに記載の第２融合タンパク質をコードする核酸配列。
（４４）核酸配列が融合タンパク質をコードする配列に操作可能に結合しているプロモータ、翻訳開始シグナル、及びリーダー配列を更に含んでいる、前記（４２）又は（４３）に記載の核酸配列。
（４５）前記（４２）に記載の核酸配列を含んでなる、ＤＮＡベクター。
（４６）前記（４３）に記載の核酸配列を含んでなる、ＤＮＡベクター。
（４７）前記（４２）及び（４３）に記載の核酸配列を含んでなる、ＤＮＡベクター。
（４８）前記（４２）に記載の配列、前記（４３）に記載の配列、及び前記（４２）及び（４３）に記載の配列の群から選ばれる核酸配列を含んでなる、細胞。
（４９）方法が、ａ）第１融合タンパク質をコードする前記（４５）に記載のＤＮＡベクターを第１宿主細胞内に導入すること、ｂ）細胞又は培地中に第１融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第１宿主細胞を培養すること、ｃ）宿主細胞又は培地から第１融合タンパク質を精製すること、ｄ）第２融合タンパク質をコードする前記（４６）に記載のＤＮＡベクターを第２宿主細胞内に導入すること、ｅ）細胞又は培地中に第２融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で培地中で第２宿主細胞を培養すること、及びｆ）宿主細胞又は培地から第２融合タンパク質を精製すること、及びｇ）第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を結合させるのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合して可溶性融合タンパク質複合体を形成すること、を含んでなる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
（５０）前記（４６）に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、前記（４９）に記載の方法。
（５１）方法が、ａ）第１融合タンパク質をコードする前記（４５）に記載のＤＮＡベクター及び第２融合タンパク質をコードする前記（４６）に記載のＤＮＡベクターを宿主細胞に導入すること、ｂ）細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製すること、を含んでなる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
（５２）前記（４６）に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質複合体を混合することを更に含み、ここで前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を形成する、前記（５１）に記載の方法。
（５３）方法が、ａ）第１及び第２融合タンパク質をコードする前記（４７）に記載のＤＮＡベクターを宿主細胞内に導入すること、ｂ）細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体の形成を可能にする、及び前記（４６）に記載の核酸によってコードされるポリペプチドの間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、ｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することを含んでなる、前記（１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を製造する方法。
（５４）前記（４６）に記載の核酸から発現されたポリペプチド間にジスルフィド結合を形成させるのに十分な条件下で第１及び第２融合タンパク質を混合することを更に含み、ここで前記（３７）に記載の可溶性融合タンパク質複合体を作成する、前記（５３）に記載の方法。
（５５）方法が、ａ）複数の細胞を前記（１）〜（４１）に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること（ここで複数の細胞は更に、前記（１）に記載のＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖を担持している免疫細胞又は前記（１）に記載のＦｃドメインによって認識されるＦｃ受容体鎖を担持している免疫細胞、及び前記（１）に記載の生物活性ポリペプチドの少なくとも１つによって認識される抗原を担持している標的細胞を含んでいる）、ｂ）標的細胞上の抗原と、免疫細胞上のＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体鎖の間に、免疫細胞を結合及び活性化するのに十分に、特異的結合複合体（架橋）を形成すること；及びｃ）結合した活性化免疫細胞によって標的細胞を殺傷することを含んでなる、標的細胞を殺傷する方法。
（５６）標的細胞が、腫瘍細胞又はウィルス感染細胞である、前記（５５）に記載の方法。
（５７）生物活性ポリペプチドがＴＣＲを含んでいる、前記（５５）又は（５６）に記載の方法。
（５８）標的細胞上の抗原が、ＭＨＣ又はＨＬＡ分子内に提示され、ＴＣＲによって認識される、腫瘍又はウィルスによってコードされるペプチド抗原を含んでいる、前記（５７）に記載の方法。
（５９）免疫細胞が、Ｔ細胞、ＬＡＫ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球又は顆粒球である、前記（５５）に記載の方法。
（６０）疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が、ａ）疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる前記（１）〜（４１）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与すること、ｂ）抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体（架橋）を形成すること、及びｃ）患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷すること、を含んでなる、方法。
（６１）疾患細胞が疾患関連抗原を発現している、患者の疾患を予防又は治療する方法であって、方法が、ａ）ＩＬ−１５Ｒ鎖又はＦｃ受容体鎖を担持している免疫細胞を疾患関連抗原を認識する生物活性ポリペプチドを含んでいる前記（１）〜（４１）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体と混合すること、ｂ）免疫細胞−融合タンパク質複合体混合物を患者に投与すること、ｃ）抗原発現疾患細胞と免疫細胞を発現しているＩＬ−１５Ｒ又はＦｃ受容体の間に免疫細胞を局在化するのに十分に特異的結合複合体（架橋）を形成すること、及びｄ）患者の疾患を予防又は治療するのに十分に疾患細胞を損傷又は殺傷することを含んでなる、方法。
（６２）疾患が癌又はウィルス感染症である、前記（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６３）疾患関連抗原がペプチド／ＭＨＣ複合体である、前記（６０）又は（６１）に記載の方法。
（６４）前記（１）〜（４１）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。
（６５）前記（１）〜（４１）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答を抑制する方法。
（６６）少なくとも１つの可溶性融合タンパク質複合体が検出可能な標識を含んでいる、前記（１）〜（４１）の何れかに記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（６７）検出可能な標識が、ビオチン、ストレプタビジン、酵素又はその触媒活性断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光性、リン光性若しくはケミルミネセント分子である、前記（６６）に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
（６８）方法が、ａ）抗原と可溶性融合タンパク質複合体の生物活性ポリペプチドの間に特異的結合複合体を形成する条件下で、細胞又は組織を前記（６６）に記載の少なくとも１つの可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、ｂ）抗原に結合しなかった何れの可溶性融合タンパク質複合体も除去するのに適している条件下で細胞又は組織を洗浄すること、及びｃ）抗原を含有している細胞又は組織の指標であるとして、特異的結合複合体を検出することを含んでなる、細胞又は組織上に提示される抗原を含有している細胞又は組織を検出する方法。
（６９）生物活性ポリペプチドがＴＣＲを含み、そして抗原がＴＣＲによって認識されるＭＨＣ又はＨＬＡ分子内に提示されるペプチド抗原を含んでいる、前記（６８）に記載の方法。
（７０）抗原提示のコピー数が細胞当り多くて１０００コピーである、前記（６８）又は（６９）に記載の方法。
（７１）方法がインビボ、インビトロ、又はエクスビボで行われる、前記（６８）〜（７０）の何れかに記載の方法。
（７２）第１可溶性融合タンパク質複合体と第２可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成すること（ここで、それぞれの融合タンパク質複合体の第１生物活性ポリペプチドと第２生物活性ペプチドの結合部位は同一又は異なっている）を含んでなる、前記（２）又は（１２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りの結合活性を増大する方法。
（７３）分子当りの結合活性が、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、５０％又はそれ以上、６０％又はそれ以上、或いは７０％又はそれ以上増大する、前記（７２）に記載の方法。
（７４）第１可溶性融合タンパク質複合体と第２可溶性融合タンパク質複合体の二量体を形成することを含んでなる、前記（２）又は（１２）に記載の可溶性融合タンパク質複合体の分子当りのＩＬ−１５活性を増大する方法。
（７５）方法が、ａ）ＩＬ−１５をコードする第１ＤＮＡベクター及びＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質をコードする第２ＤＮＡベクターを宿主細胞内に導入すること、ｂ）ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びｃ）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）：インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒα）融合タンパク質複合体を製造する方法。
（７６）ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体が、生物活性ポリペプチドと共有結合している可溶性ＩＬ−１５Ｒαを含んでいる、前記（７５）に記載の方法。
（７７）生物活性ポリペプチドが、ＩｇＧの重鎖定常ドメインである、前記（７６）に記載の方法。
（７８）生物活性ポリペプチドが、ＩｇＧの重鎖定常ドメインのＦｃドメインである、前記（７６）に記載の方法。
（７９）ＩＬ−１５が、第２生物活性ポリペプチドと共有結合しているＩＬ−１５を含んでいる、前記（７５）に記載の方法。
（８０）方法が、ａ）ＩＬ−１５をコードする第１ＤＮＡ及びＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質をコードする第２ＤＮＡを宿主細胞内に導入すること、ｂ）ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びｃ）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含んでいるＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を製造する方法。
（８１）方法が、ａ）ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を宿主細胞内で同時発現すること、ｂ）ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で、宿主細胞を培地中で培養すること、及びｃ）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα／ＦＣ融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでなる、ＩＬ−１５Ｒα／ＦＣ融合タンパク質を含んでいるＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を製造する方法。
（８２）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を特異的に結合する親和性試薬上にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を捕獲することを含んでいる、前記（７５）〜（８１）の何れかに記載の方法。
（８３）ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質が、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃドメインと特異的に結合する親和性試薬を含んでいる、前記（８２）に記載の方法。
（８４）親和性試薬が、プロテインＡ又はプロテインＧである、前記（８３）に記載の方法。
（８５）親和性試薬が抗体である、前記（８２）又は（８３）に記載の方法。
（８６）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、イオン交換クロマトグラフィーを含んでいる、前記（７５）〜（８５）の何れかに記載の方法。
（８７）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を宿主細胞又は培地から精製することが、サイズ排除クロマトグラフィーを含んでいる、前記（７５）〜（８６）の何れかに記載の方法。
（８８）ＩＬ−１５Ｒαが、ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含んでいる、前記（７５）〜（８７）の何れかに記載の方法。
（８９）ＩＬ−１５が突然変異ＩＬ−１５である、前記（７５）〜（８８）の何れかに記載の方法。
（９０）突然変異ＩＬ−１５が、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含んでいる、前記（８９）に記載の方法。
（９１）宿主細胞が哺乳動物の細胞である、前記（７５）〜（９０）の何れかに記載の方法。
（９２）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体のＩＬ−１５結合部位が完全に占有されている、前記（７５）〜（９１）の何れかに記載の方法。
（９３）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の両方のＩＬ−１５結合部位が完全に占有されている、前記（８８）に記載の方法。
（９４）ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体が、複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される、前記（７５）〜（９３）の何れかに記載の方法。
（９５）ａ）宿主細胞内でＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質を同時発現すること、ｂ）ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するのに十分な条件下で宿主細胞を培地中で培養すること、及びｃ）ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製すること（ここで、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の両方のＩＬ−１５結合部位は完全に占有されている）を含んでなる、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を製造する方法。
（９６）完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を、複合体の電荷特性に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーで精製する、前記（９５）に記載の方法。
（９７）完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体を、低イオン強度で中性ｐＨの緩衝液を用いる結合条件及びイオン強度を上昇させる緩衝液を用いる溶出条件で、４級アミンに基づく樹脂を用いて精製する、前記（９５）に記載の方法。
（９８）ＩＬ−１５又はＩＬ−１５突然変異体をコードする第１ポリヌクレオチド及びＩＬ−１５受容体融合タンパク質をコードする第２ポリヌクレオチドを含んでなる、細胞。
（９９）細胞が、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄをコードする第１発現ベクター及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする第２発現ベクターを含んでいる、前記（９８）に記載の細胞。
（１００）二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及び２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子を含んでなる、単離された完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体。
（１０１）複合体が、少なくとも９０〜９５％又はそれ以上精製された完全に占有されている複合体である、前記（１００）に記載の複合体。
（１０２）複合体が、５．６〜６．５の間の等電点を有している、前記（１００）に記載の複合体。
（１０３）約１１４ｋＤａの分子量を有している、前記（１００）に記載の複合体。
（１０４）ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質がグリコシル化されている、前記（１００）に記載の複合体。
（１０５）前記（７５）〜（９７）の何れかに記載の方法に従って産生された、単離された完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体。
（１０６）方法が、前記（１００）〜（１０５）の何れかに記載の完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を対象に投与することを含んでなる、対象における免疫応答を調節する方法。
（１０７）免疫応答を増大又は減少する、前記（１０６）に記載の方法。
（１０８）方法が、前記（１００）〜（１０５）の何れかに記載の完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を対象に投与することを含んでなる、腫瘍を有している対象における免疫応答を増強する方法。
その他の実施態様は以下の開示から明確になるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】図１は、多重鎖ポリペプチドからなるＴ２分子（Ｔ２Ｍ）として示される融合タンパク質を示す。

【図2】図２は、正確なヒトＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子挿入を含有しているベクター（ｐＭＣ．ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−Ｓｕ／ＩｇＧ１．ＰＵＲ）を示す。

【図3】図３は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１核酸配列の配列（配列番号３４）を示す。

【図4】図４は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ペプチドのタンパク質配列（配列番号３５）を示す。

【図5】図５は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／Ｓｕｓｈｉ／ｈＩｇＧ１−ｐＭＳＧＶｃ又はｐＭＳＧＶｃ２６４ＳｕＩｇと表わされるベクターを示す。

【図6】図６は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１核酸配列の配列（配列番号３６）を示す。

【図7】図７は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ペプチドのタンパク質配列（配列番号３７）を示す。

【図8】図８は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ−ｐＭＳＧＶｎ又はｐＭＳＧＶ−ｃ１４９ＩＬ１５Ｎ７２Ｄと表わされるベクターを示す。

【図9】図９は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ核酸配列の配列（配列番号３８）を示す。

【図10】図１０は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄペプチドのタンパク質配列（配列番号３９）を示す。

【図11】図１１は、Ｔ２、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ΔＣＨ１融合タンパク質の精製画分の還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。還元条件下で、Ｔ２分子バンドはｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ＨｕＩｇＧ１ポリペプチドと一致する分子量に移動する。非還元変性条件下で、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１バンドは、二量体ジスルフィド結合したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１複合体及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄポリペプチドと一致する分子量に移動する。

【図12】図１２は、天然のＴ２タンパク質が、四重鎖（２×ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ、２×ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１）分子の予測された分子量で溶出されたことを明らかにしているサイズ排除ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。

【図13】図１３は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる精製したＴ２タンパク質、又は精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質の等モル量を抗ヒトＩｇＧ１抗体でコーティングしたウェル上に捕獲した、インビトロ結合アッセイの結果を示す。結合に続いて、標準的なＥＬＩＳＡ条件下で抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いてタンパク質を検出した。

【図14】図１４は、Ｔ２又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質の等モル量を抗ヒトＩｇＧ１Ａｂでコーティングしたウェル上に捕獲して抗ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体（Ｗ４Ｆ）で検出した、インビトロ結合アッセイの結果を示す。

【図15】図１５は、Ｔ２分子のＴＣＲドメインのペプチド／ＭＨＣ結合活性を評価したインビトロ結合アッセイの結果を示す。Ｔ２（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる）又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質の等モル量を抗ヒトＩｇＧ１Ａｂでコーティングしたウェル上に捕獲して、ｐ５３（ａａ ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ストレプタビジン−ＨＲＰ四量体で検出した。

【図16】図１６は、Ｔ２分子のＩＬ−１５ドメインの活性を明らかにしているインビトロアッセイの結果を示す。マイクロタイターウェルを抗ヒトＩＬ−１５抗体でコーティングして、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる精製したＴ２タンパク質、又は精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質の等モル量をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なＥＬＩＳＡ条件下で抗ヒトＩＬ−１５抗体で検出した。

【図17】図１７は、サイトカイン依存性の３２Ｄβ細胞株を用いてＴ２分子のＩＬ−１５ドメインの機能活性を更に特徴付けるための増殖アッセイの結果を示す。細胞増殖を測定するために、３２Ｄβ細胞（２×１０^４細胞／ウェル）を増大する濃度のＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる）又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質と３７℃で４８時間培養した。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche（登録商標）Applied Science）を製造会社の手順に従って細胞生育の最終４時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるＷＳＴ−１の着色されたフォルマザン色素への変換を４４０ｎｍにおける吸光度測定により確認した。

【図18】図１８Ａ〜Ｂは、ＩＬ−１５応答免疫細胞の増殖を促進するＴ２タンパク質の能力を確認するインビボ霊長類モデル実験の結果を示す。Ｔ２タンパク質を注射した後５日目に血液を採取してＣＤ８メモリーＴ細胞マーカー（ＣＤ８及びＣＤ９５）（Ａ）及びＮＫ細胞マーカー（ＣＤ５６及びＣＤ１６）（Ｂ）について染色を行い、そして処置前に採取した血液と比較した。

【図19】図１９Ａ〜Ｂは、Ｔ２分子のＩｇＧ１ Ｆｃドメインの結合活性を特徴付ける細胞結合アッセイを示す。 Ａ．Ｕ９３７細胞を有しているＦｃガンマ受容体を３３ｎＭのＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）と２０分間培養したアッセイの結果を示しているフローサイトメトリー分析である。細胞を１回洗浄して、ＰＥと共役したｐ５３（ａａ ２６４〜２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体と２０分培養した。Ｕ９３７細胞表面上でのＦｃガンマ受容体との結合をフローサイトメトリーで分析した。 Ｂ．示されているタンパク質の一連の濃度を用いる同様のＵ９３７結合試験を実施して染色細胞に対する平均蛍光強度をプロットした結果を示すフローサイトメトリー分析。

【図20】図２０は、Ｔ２分子のＦｃドメインの抗体依存性細胞傷害活性を介在する生物活性を評価するアッセイの結果を示す。Ｔ２タンパク質、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）を０．１３７ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で９６ウェルに添加した。ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２標的細胞を１０μＭのｐ５３ａａ２６４〜２７２ペプチドでパルスして５０μｇ／ｍｌのカルセイン−ＡＭで標識した。融合タンパク質をウェル当り１×１０^４個の標的細胞と混合して１×１０^６個／ウェルの新鮮なヒトＰＢＭＣを添加した。プレートをＣＯ_２インキュベータ中で２時間３７℃で培養し、１００μｌの条件培地を採取して、溶解細胞から放出したカルセインを定量的に分析した。

【図21】図２１Ａ及びＢは、ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞を各種濃度のｐ５３ａａ２６４〜２７２ペプチドでパルスして、Ｔ２タンパク質の細胞表面のペプチド／ＭＨＣ標的との結合活性を評価するアッセイの結果を示す。ペプチド負荷細胞をそれぞれ８３ｍＭのＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）と培養した。細胞をビオチニル化した抗ＴＣＲ Ａｂ（ＢＦ１）及びストレプタビジン−ＰＥと培養した。次いで、細胞をフローサイトメトリーで抗体染色について分析して（Ａ）、異なった濃度のペプチドを負荷した細胞の平均蛍光染色強度をプロットした（Ｂ）。

【図22】図２２は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１のＴ２分子（細胞培養上澄液中）を、抗ヒトＴＣＲ抗体ＢＦ１でコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕獲して、結合したＴ２分子を抗ヒトＴＣＲ抗体Ｗ４Ｆ−ＢＮを用いて検出したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図23】図２３は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１のＴ２分子（細胞培養上澄液中）を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕獲して、結合したＴ２分子を抗ヒトＩＬ−１５抗体を用いて検出したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図24】図２４は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１のＴ２分子（細胞培養上澄液中）をヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又は抗ヒトＴＣＲ抗体ＢＦ１の何れかでコーティングしたマイクロタイタープレート上に捕獲したＥＬＩＳＡの結果を示す。ＢＦ１が捕獲したＴ２分子を抗ヒトＴＣＲ抗体Ｗ４Ｆ−ＢＮ又は抗ヒトＩＬ−１５抗体の何れかで検出した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂが捕獲したＴ２分子をｐ５３（ａａ１４９〜１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ストレプタビジン−ＨＲＰ四量体又はｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ストレプタビジン−ＨＲＰ四量体の何れかで検出した。

【図25】図２５は、２つの異なったドメイン、すなわち、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖を含むＴ２分子を特徴付けたフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。これらの分子のＦｃ及びＴＣＲ活性をＵ９３７細胞を有しているＦｃ−ガンマ受容体との結合及び ｐ５３（ａａ２６４〜２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体による検出に続くフローサイトメトリーによって評価した。

【図26】図２６Ａ及びＢは、マウス（Ａ）又はサル（Ｂ）にｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなる精製したＴ２タンパク質を注射した薬物動態アッセイの結果を示す。サンプルは表示される時点で採取したた。 Ａ．表示されるようにヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂをウェルをコーティングするために用いて、抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（Ｗ４Ｆ−ＢＮ）を検出のために用いた；又はヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂをプレートをコーティングするために用いて、抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂを検出のために用いて、表示される時点で血液中のＴ２タンパク質の量を定量したＥＬＩＳＡ形式アッセイ。 Ｂ．抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（βＦ−１）を用いてウェルをコーティングして、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出する；又は抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂを用いてプレートをコーティングして、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて検出するか又は抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂを用いてプレートをコーティングして、抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（Ｗ４Ｆ−ＢＮ）を用いて検出した。

【図27】図２７は、ヌードマウスにおけるヒトｐ５３＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ａ３７５メラノーマ細胞株を用いる原発腫瘍生育モデルの結果を示す。腫瘍担持マウスにｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖からなるＴ２タンパク質を３２μｇ／用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ２を３２μｇ／用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）、又は２６４ｓｃＴＣｒ／ｈｕＩｇＧ１を６０μｇ／用量（３ｍｇ／ｋｇ）静脈内投与した。腫瘍の生育を測定してデータを図に示した。

【図28】図２８は、ＩＬ−１５ドメインに各種の点突然変異を有するＴ２分子のＩＬ−１５活性アッセイの結果を、３２Ｄβ細胞の増殖により測定して示す。

【図29】図２９は、ＩＬ−１５及びＩｇＧＦｃドメインに各種の点突然変異を有するＴ２分子を用いる抗体依存性細胞傷害活性アッセイの結果を、ペプチド負荷Ｔ２標的細胞のＰＢＭＣ依存性溶解により測定して示す。

【図30】図３０は、ヒトＮＫ及びＴ細胞応答を刺激するＴ２分子の能力に対するＩＬ−１５及びＦｃ突然変異の効果を検出するアッセイの結果を示す。１．８〜５×１０^５細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣを、表示される突然変異を含む１ｎＭのＴ２分子を含有しているか、又はコントロールとして１０ｎｇ／ｍＬの組み替えヒトＩＬ−２又はＩＬ−１５を有する培地中で４日間３７℃で培養した。次いで、５０μｇ／ｍｌのカルセイン−ＡＭで標識化した後、ＮＫ感受性Ｋ−５６２細胞を標的細胞として用いて、ＮＫ細胞細胞傷害性を評価した。

【図31】図３１は、ＮＫ細胞増殖アッセイの結果を示し、ここではＰＢＭＣを、ＩＬ−１５及びＩｇＧＦｃドメインに各種の点突然変異を含有するＴ２分子と、又はコントロールとして組み替えヒトＩＬ−２又はＩＬ−１５と培養した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含むＴ２分子又はＦｃドメインＬＡＬＡ及びＫＡ突然変異体を有するものがＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖において増大をもたらしたのに対して、ＩＬ−１５Ｎ６５Ｄ又はＤ８Ｎ置換を含有するＴ２分子はそれほど多くのＮＫ細胞増殖活性をもたらさなかった。

【図32】図３２Ａ及びＢは、ＩＬ−１５及びＦｃ突然変異を包含しているＴ２分子の、ｐ５３ペプチドを負荷した（Ｔ２．２６５）及び負荷していない（Ｔ２）Ｔ２細胞に対する抗原特異的結合を試験するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。Ａはフローサイトメトリーのヒストグラムを示し、Ｂはペプチド特異的対非特異的細胞染色のシグナル対ノイズ比を示す。

【図33】図３３Ａ〜Ｃは、Ａ．３２Ｄβ細胞生育をサポートする、Ｂ．各種Ｔ細胞集団の拡張を刺激する、そしてＣ．ＮＫ細胞活性を刺激する各種Ｔ２分子及びＩＬ−１５分子の活性を検出するアッセイの結果を示す。

【図34】図３４は、表示される各種Ｔ２分子のマウスにおける免疫刺激活性を、フローサイトメトリーを用いて検出する血液及び脾臓細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞のパーセント変化によって確認したインビボアッセイの結果を示す。

【図35】図３５Ａ及びＢは、１）オボアルブミンのアミノ酸２５７〜２６４由来のペプチドに特異的なｓｃＴＣＲと融合しているｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄドメイン、及び２）ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１融合体と結合している一本鎖ＣＤ８α／βドメインを含有している多重特異的Ｔ２分子を用いるＥＬＩＳＡの結果を示す。ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍの結合活性をＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合体のそれとＥＬＩＳＡによって比較した。各タンパク質の等モル量を抗ＴＣＲ Ｃβ ｍＡｂ（Ｈ５７）でコーティングしたウェル上に捕獲して、ＯＶＡ ａａ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋｂ四量体又はＩＬ１５、ＣＤ８α、ＣＤ８β若しくはＴＣＲ Ｖα２に対するｍＡｂでプローブした。抗ヒトＩｇでコーティングしたウェルを用いて抗ＴＣＲ Ｖα２でプローブするアッセイも実施した。

【図36】図３６Ａは、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体）の概略図を示す。二量体ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕドメインのモデルは、ヒトＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体の公表されている結晶構造に基づいている（３３）（ＰＤＢ ２Ｚ３Ｑ）。Ｂは、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のＳＥＣ分析を示す。図は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５（上）、ｃ２４６ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ（中）及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｃ２４６ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体）（下）のサイズ分析を示し、点線は比タンパク質ピークを示している。

【図37】図３７は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｃ２４６ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体を含むｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体、及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体を含むｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｃ１４９ｓｃＴＣＲヘテロ二量体の結合活性の特性を示す。 Ａ．Ｔ２細胞を０〜６２．５ｎＭのｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチドでパルスした。細胞を等量（８０ｎＭ）のｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡのＰＥ共役多量体で染色した。 Ｂ．ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ試薬と比べた細胞染色の相対的増大を異なったペプチド濃度で確認した。増大（倍）＝（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体で染色されたＴ２細胞の幾何学的平均）／（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡで染色されたＴ２細胞の幾何学的平均）。 Ｃ．ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｃ１４９ｓｃＴＣＲヘテロ二量体のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１結合活性をＥＬＩＳＡで確認した。抗ｈＩＬ−１５モノクローナル抗体（R & D System）を捕獲抗体として用いた。Ａ２／ｐ５３．２６４−２７２．ＨＲＰ又はＡ２／５３．１４９−１５７．ＨＲＰ四量体をプローブとして用いた。データは３回繰返し測定の平均±ＳＤを表わす。

【図38】図３８は、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体からなるＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体の結合活性の特性を示す。ＥＬ４細胞にＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチドを負荷して、２００ｎＭのＯＴ１ｓｃ／ｂｉｒＡ−ＳＡ−ＰＥ（上）及びＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体−ＳＡ−ＰＥ（下）で染色した。

【図39】図３９は、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｓｃＣＤ８／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体を含むＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体が増強したｐＭＨＣＩ結合活性を示すことを表わす。 Ａ．ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体のネズミＣＤ８発現をＥＬＩＳＡで確認した。抗ｍＴＣＲ Ｈ５７−５９７ ｍＡｂを捕獲抗体として用いた。ビオチニル化抗ネズミＣＤ８α又はＣＤ８β ｍＡｂをプローブとして用いた後、ＳＡ−ＨＲＰを行った。データは３回繰返し測定の平均±ＳＤを表わす。 Ｂ．ＥＬ４細胞に表示される濃度のＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチドを負荷して、２００ｎＭのＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体−ＳＡ−ＰＥ（上）及びＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体−ＳＡ−ＰＥ（下）で染色した。

【図40】図４０は、ＴＣＲα／ｈＩＬ−１５：ＴＣＲβ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ複合体を含むＴＣＲα／βヘテロ二量体を包含する融合タンパク質はｐＭＨＣＩ結合活性を保持することを示す。 Ａ．ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡとＯＴ１ ＴＣＲα／βのヘテロ二量体のＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）／Ｈ−２Ｋｂ複合体への結合活性をＥＬＩＳＡで確認した。抗ｍＴＣＲ Ｈ５７−５９ｍＡｂを捕獲抗体として用いた。Ｋｂ／ＯＶＡ．２５７−２６４四量体をプローブとして用いた。 Ｂ．２６４ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ及び２６４ＴＣＲα／βヘテロ二量体のｐ５３（ａａ２６−２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊２０１複合体への結合活性をＥＬＩＳＡによって確認した。抗ＴＣＲ ｍＡｂを捕獲抗体として用いた。Ａ２／ｐ５３．２６４−２７２．ＨＲＰ四量体をプローブとして用いた。データは３回繰返し測定の平均±ＳＤを表わす。

【図41】図４１は、融合タンパク質のＩＬ−１５結合及び機能活性を示す。 Ａ．３２Ｄβ細胞をＩＬ−１５野生型又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ若しくはＩＬ−１５Ｄ８Ｎ突然変異タンパク質ドメインを含む３２０ｎＭのｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体と培養した。融合タンパク質の結合を順に抗ヒトＴＣＲ Ｃβ Ａｂで検出した。 Ｂ．ＩＬ−１５の野生型又は突然変異タンパク質ドメインを含むｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体の３２Ｄβ細胞の増殖をサポートする能力を実施例に記載されるように確認した。データは２回繰返し測定の平均±ＳＤを表わす。

【図42】図４２は、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５Ｄ８Ｎ、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＴＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ及びＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体のＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）／Ｈ−２Ｋ^ｂ結合活性をＥＬＩＳＡで確認したことを示す。抗ｍ−ＴＣＲ Ｈ５７−５９７ ｍＡｂを捕獲抗体として用いた。Ｋｂ／ＯＶＡ．２５７−２６４．ＨＲＰ四量体をプローブとして用いた。データは３回繰返し測定の平均±ＳＤを表わす。

【図43】図４３は、ＳＰＲで確認したＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）／Ｈ−２Ｋ^ｂ及びコントロールであるＶＳＶ／Ｈ−２Ｋ^ｂ複合体に対するＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質の結合曲線を示す。

【図44】図４４Ａ及びＢは、免疫正常マウスにおけるネズミＢ１６腫瘍細胞株を用いる原発腫瘍生育モデルの結果を示す。腫瘍担持マウスにｒｈＩＬ−１５、Ｔ２Ｍ、Ｔ２ＭΔＣＨ１及びＴ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１タンパク質、又はＰＢＳ（コントロール）を静脈内注射した。腫瘍の生育を測定してデータをＡ示す。動物における体重の処置後変化をＢに示す。

【図45】図４５Ａ及びＢは、免疫正常マウスにおけるネズミＥＧ７腫瘍細胞株を用いる原発腫瘍生育モデルの結果を示す。腫瘍担持マウスにｒｈＩＬ−１５、Ｔ２Ｍ、及びＴ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１タンパク質、又はＰＢＳ（コントロール）を静脈内注射した。腫瘍の生育を測定してデータをＡ示す。動物における体重の処置後変化をＢに示す。

【図46】図４６は、共有結合で及び／又は遺伝子的に他のタンパク質ドメインと融合して融合タンパク質複合体を生成したヒトＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン又はＦｃドメインのタンパク質配列（配列番号４０）を示す。

【図47】図４７は、細胞発現ペプチドＭＨＣ標的に対する、Ｔ２Ｍ及びｓｃＴＣＲ−ｈｕＩｇＧ１タンパク質が介在する抗体依存性細胞傷害活性を確認するアッセイの結果を示す。各種の量の融合タンパク質（Ｔ２Ｍ、Ｔ２Ｍ２又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ−Ｉｇ）を新鮮なヒトＰＢＭＣ及びｐ５３ペプチドでパルスしたＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞（カルセイン標識化）（Ｅ：Ｔ比、４０：１）と混合した。２時間培養した後、培養培地を採取して溶解細胞からのカルセイン放出を定量的に分析した。

【図48】図４８は、マウスにおける各種Ｔ２分子の免疫刺激活性を確認するインビボアッセイの結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｈＩＬ−１５（１ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ１５Ｒα−Ｆｃ（３．６ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ２Ｍ（１１ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ２Ｍ２（１０ｍｇ／ｋｇ）の等モルＩＬ‐１５用量、又は等容量のＰＢＳで試験第１日目にｉ．ｖ．処置した。試験４日目にマウスを屠殺して血液のＷＢＣ数及び脾臓重量を図Ａに示すように確認した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＣＤ８^＋及びＮＫｐ４６^＋細胞のパーセント変化を図Ｂに示すようにフローサイトメトリーで評価した。ＰＢＭＣも図Ｃに示すように、カルセイン放出アッセイにおけるＮＫ感受性Ｙａｃ−１標的細胞の溶解に基づくＮＫ細胞活性を評価するために用いた。

【図49】図４９は、マウスにおける免疫活性に対する各種Ｔ２分子の用量及び経時変化を確認するインビボアッセイの結果を示す。 Ａ．Ｃ５７ＢＬ／６マウスをｈＩＬ−１５（１ｍｇ／ｋｇ）、ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ１５Ｒα−Ｆｃ（４ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ２Ｍ２（各種濃度）の等モルＩＬ−１５用量又はＰＢＳの等容量で試験１日目にｉ．ｖ．処置した。試験４日目に、ＰＢＭＣ ＣＤ８^＋及びＮＫｐ４６^＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーで評価した。 Ｂ．ヌードマウスをＩＬ１５Ｎ２７Ｄ／ＩＬ１５Ｒα−Ｆｃ（０．２ｍｇ／ｋｇ）又はＴ２Ｍ２（２ｍｇ／ｋｇ）で試験第１日目にｉ．ｖ．処置した。処置後４日及び７日目に、ＰＢＭＣ ＮＫｐ４６^＋細胞のパーセントをフローサイトメトリーで評価した。

【図50】図５０は、ヌードマウスにおけるヒトｐ５３＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ａ３７５メラノーマ細胞を用いる原発性腫瘍生育モデルの結果を示す。 Ａ．Ａ３７５ヒトメラノーマ腫瘍細胞（１×１０^６）をヌードマウス（５〜６匹／群）にｓ．ｃ．注射した。腫瘍を確立させて、マウスを等モル用量のＩＬ−１５（０．３５ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５融合体（１．６ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５／ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５／ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｒα複合体（３．２ｍｇ／ｋｇ）、又はＰＢＳでｉ．ｖ．処置した。１１日目に開始して週に３回３週間マウスを処置した。 Ｂ．Ａ３７５腫瘍担持ヌードマウスをＡのように４ｍｇ／ｋｇのＴ２Ｍでもｉ．ｖ．処置した。 Ｃ．Ａ３７５腫瘍担持ヌードマウスを等モル用量のＩＬ−１５（０．２ｍｇ／ｋｇ）、Ｔ２Ｍ２（２ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳでｉ．ｖ．処置した。腫瘍を１日おきに測定して、腫瘍容量（平均値±ＳＥＭ）をプロットした。

【図51】図５１は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）構築物（Ｔ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１及びＴ２Ｍ２とも呼ばれている）の核酸配列（配列番号４１）を示す。

【図52】図５２は、成熟ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）融合タンパク質（Ｔ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１及びＴ２Ｍ２とも呼ばれている）のタンパク質配列（配列番号４２）を示す。

【図53】図５３は、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（配列番号４３）を示す。

【図54】図５４は、成熟抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号４４）を示す。

【図55】図５５は、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ構築物の核酸配列（配列番号４５）を示す。

【図56】図５６は、成熟抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号４６）を示す。

【図57】図５７は、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍ分子のダウディ細胞（Daudi cells）に対するＣＤ２０抗原特異的結合を試験するフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。

【図58】図５８は、ＣＤ２０^＋ヒト腫瘍細胞に対する抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍが介在する抗体依存性細胞傷害活性を確認するアッセイの結果を示す。各種濃度の融合タンパク質（抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍ、ｃ２６４ｓｃ Ｔ２Ｍ（陰性コントロール））又はキメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂ（陽性コントロール）を新鮮なヒトＰＢＭＣ（異なる２人のドナー由来）及びダンディ細胞（カルセイン標識化）（Ｅ：Ｔ比、１００：１）と混合した。培養期間後に、培養培地を採取して溶解細胞から放出したカルセインを定量的に分析した。

【図59】図５９は、ＣＤ２０^＋ヒト腫瘍細胞に対する抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍが介在する抗体依存性細胞傷害活性を確認するアッセイの結果を示す。融合タンパク質（抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍ、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ Ｔ２Ｍ（陰性コントロール）又はキメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂ（陽性コントロール）を各種の比率の新鮮なヒトＰＢＭＣ（異なる２人のドナー由来及びダンディ細胞（カルセイン標識化）と混合した。培養期間後に、培養培地を採取して溶解細胞から放出したカルセインを定量的に分析した。

【図60】図６０は、抗ＣＤ２０軽鎖Ｖドメイン／ヒトカッパ定常ドメイン／ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸配列（配列番号４７）を示す。

【図61】図６１は、成熟抗ＣＤ２０軽鎖Ｖドメイン／ヒトカッパ定常ドメイン／ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号４８）を示す。

【図62】図６２は、抗ＣＤ２０重鎖Ｖドメイン／ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ構築物の核酸配列（配列番号４９）を示す。

【図63】図６３は、成熟抗ＣＤ２０重鎖Ｖドメイン／ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質のタンパク質配列（配列番号５０）を示す。

【図64】図６４は、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合する（して）ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを基礎とするＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の概略図である。

【図65】図６５（Ａ〜Ｄ）は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ調製物のゲル電気泳動分析プロファイルの写真である。 （Ａ）ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲル分析。レーン１、ＩＥＦマーカー。レーン２、ｒプロテインＡカラムで精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体。レーン３、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ。レーン４，ＩＬ−１５ｗｔ。 （Ｂ）ＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲル分析。レーン１、ＩＥＦマーカー。レーン２、Ｑ工程１溶出で精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体。レーン３、Ｑ工程２溶出によるＱ１ｃ。レーン４、Ｑ工程２溶出によるＱ２ｃ。 （Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＲ（還元）分析。レーン１、ＭＷマーカー。レーン２、ｒプロテインＡカラムで精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体。レーン３、Ｑ工程２溶出によるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（Ｑ２ｃ）。レーン４、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（Ｑ流出から）。 （Ｄ）タンパク質の脱グリコシル化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）分析。レーン１、ＭＷマーカー。レーン２及び３はそれぞれＮ−グリコシダーゼＦで消化した及び消化していないＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質を示す。レーン４、ＩＬ−１５ｗｔ。

【図66】図６６は、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０ゲルろ過カラムを用いるＳＥＣクロマトグラムのグラフである。精製されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体が単一ピークとして溶出された。

【図67】図６７は、ＣＤ−１マウスへ静脈内注射した後のＩＬ−１５ｗｔ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の薬物動態プロファイルの比較を示すグラフである。抗ＩＬ−１５ Ａｂ ＥＬＩＳＡはＩＬ−１５ｗｔの濃度を測定する（■）。抗ＩＬ−１５ Ａｂ ＥＬＩＳＡは無傷ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子の濃度を測定する（△）のに対して、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ａｂ ＥＬＩＳＡはＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質の血清濃度を測定する（▼）。観察された濃度をシンボルで表わし、モデル近似曲線をラインで表わしている。

【図68】図６８は、インビトロで構築したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃＩＶＡ）の生物活性のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃとの比較を示しているグラフである。３２Ｄβ細胞をインビトロで構築したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（■）又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（□）と７２時間培養した後、ＷＳＴ−１を４時間添加した。４４０ｎｍで読み取った吸光度によって細胞増殖を定量してホルマゾンレベルを評価した。示されているデータ点は３回繰返しサンプルの平均（±標準偏差）であり、線はＥＣ_５０を決定するのに適しているＳ字型用量応答曲線を表わしている。結果は少なくとも３回の実験を代表している。

【図69】図６９は、ＩＬ−１５ｗｔとＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の脾臓重量及び白血球レベルに対する効果を示す一組のグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当り５匹マウス）に１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体、０．２８ｍｇ／ｋｇ（等モル用量）のＩＬ−１５ｗｔ、又は陰性コントロールとしてＰＢＳの単回用量を静脈内に注射した。脾臓重量（左図）及び血中の白血球数（右図）を注射後４日目に確認した。バーは平均値±標準誤差（ｎ＝５）を表わす。^＊ＰＢＳ及びＩＬ−１５ｗｔと比較してｐ＞０．０５。結果は少なくとも２回の実験を代表している。

【図70】図７０は、マウスリンパ球に対するＩＬ−１５ｗｔ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の効果を示す一組のグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当り５匹マウス）に１ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体、０．２８ｍｇ／ｋｇ（等モル用量）のＩＬ−１５ｗｔ、又は陰性コントロールとしてＰＢＳの単回用量を静脈内に注射した。注射後４日目に、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ４）、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６）及びＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ８）のパーセントを脾臓細胞中で確認し（左図：平均値±標準誤差（ｎ＝５））、そしてＰＢＭＣ（右欄：プール血液中の濃度（ｎ＝５））で確認した。^＊ＰＢＳと比較してｐ＞０．０５。^＊＊ＩＬ−１５ｗｔと比較してｐ＞０．０５。結果は少なくとも２回の実験を代表している。

【発明を実施するための形態】

【0051】

（定義）
以下の定義は以下の明細書で用いられている特定の用語に対して提供されている。

【0052】

本明細書で用いられる用語「を包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、列挙されている要素を包含しているがその他の要素を排除していない組成物及び方法を意味するように意図されている。組成物及び方法を定義するために用いられる場合の「実質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組合わせに対する本質的な意義とは別の要素を除外することを意味するものである。従って、実質的に本明細書で定義されているような要素からなる組成物は、単離及び精製方法由来の微量汚染物質、及びリン酸緩衝食塩水、保存剤等のような薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」はその他の成分及び本発明の組成物を投与する実質的な方法の工程の微量要素以外を除外することを意味するものである。これらの変遷用語のそれぞれによって定義される実施態様は本発明の範囲内である。

【0053】

本明細書で用いられる用語「ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体」は、生物活性ポリペプチドに共有結合している可溶性ＩＬ−１５ＲαのＩＬ−１５Ｒαドメインと非共有結合で結合しているＩＬ−１５を有している複合体である。ＩＬ−１５はＩＬ−１５又は第２生物活性ポリペプチドと共有結合している１Ｌ−１５の何れかであってよい。

【0054】

本明細書で用いられる用語「同時発現された」は、２つの異なったポリペプチドが、２つのポリペプチドが宿主細胞内又は宿主細胞の培養培地内で相互作用又は互いに結合して複合体を形成するように、宿主細胞内で同時に発現されることを意味するように意図されている。

【0055】

本明細書で用いられる用語「親和性試薬」は、他の分子と特異的に結合する組成物の何れかを意味するように意図されている。親和性試薬の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、プロテインＡ、及びプロテインＧを包含する。

【0056】

「抗体」は、特異的エピトープを結合する抗体及びその断片を包含する、免疫グロブリンの何れかである。この用語はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Ｆａｂｓ、Ｆｖｓ、一本鎖抗体、及び一重又は多重免疫グロブリン変異鎖を、或いはＣＤＲドメイン構造を、更に二重特異及び多重特異抗体も包含する。

【0057】

本明細書で用いられる用語「抗原」は、免疫系が、それに対する抗体又は特異的細胞介在免疫応答を引き起こすようにする何れかの物質を意味する。疾患関連抗原は、免疫系が、それに対する抗体又は特的細胞介在免疫応答を引き起こすようにする何れかの疾患と関連している何れかの物質である。

【0058】

本明細書で用いられる用語「生物活性ポリペプチド」は、抗原結合活性を有するＴＣＲ若しくは抗体、ＣＤ８を包含するＣＤ分子、又はＦｃドメインを包含する抗体ドメインを包含する、本明細書で検討しているような望ましい効果を生ずることができるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列；糖若しくは多糖；脂質若しくは糖脂質；糖タンパク質；又はリポタンパク質への言及を意味している。

【0059】

本明細書で用いられる用語「細胞」は、原核、真核、初代細胞又は不死細胞株、組織又は臓器にあるそのような細胞の何れかの群を包含している。哺乳動物特にヒト起源の細胞で、１つ又はそれ以上の病原体に感染できることが好ましい。本発明の「宿主細胞」は、原核生物、真核生物、哺乳動物、鳥類、昆虫、植物又は細菌細胞を包含する、何れかの起源の、トランスフォーム、形質転換、形質導入又は感染した細胞でよく、或いはこれは本明細書に記載の核酸を伝搬するために用いることができる任意起源の細胞であってよい。

【0060】

本明細書で用いられる用語「共役分子」は、化学又はその他の適切な方法で共有結合している（すなわち融合している）ＴＣＲ又は抗体分子、及び通常は化学の又は合成される分子であるエフェクター分子への言及を意味している。所望により、共役分子をペプチドリンカー配列又は担体分子を介して１つの又はいくつかの部位で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカー又は担体を共役分子の構築を支援するために用いることができる。共役分子が共役毒素又は検出可能標識であることが特に好ましい。

【0061】

本明細書で用いられる用語「エフェクター分子」は、ＩＬ−１５Ｒアルファ、ＩＬ−１５ＲαＳｕ、ＩＬ−１５Ｒαエクソン３欠失、ＩＬ−２Ｒベータ又はガンマ−Ｃ、又はこれらの機能的断片のようなＩＬ−１５ドメイン、ＩＬ−１５変異体又はＩＬ−１５受容体、及び更に免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片を含んでいるポリペプチドのようなものを包含する、本明細書で検討しているような所望の効果を生ずることができるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドのようなアミノ酸配列；糖又は多糖；脂質又は糖脂質；糖タンパク質；リポタンパク質；又は化学試薬を示している。

【0062】

用語「融合分子」及び「融合タンパク質」は互換可能に用いられて、遺伝子組み換え、化学の又はその他の適切な方法で共有結合している（すなわち、融合している）生物活性ポリペプチド（通常はＴＣＲ又は抗体）とエフェクター分子（通常はタンパク質又はペプチド配列）への言及を意味している。所望により、融合分子を、ペプチドリンカー配列を介して１部位又はいくつかの部位で融合することができる。あるいは、ペプチドリンカーを融合分子の構築を支援するために用いることができる。融合分子が融合タンパク質であることが特に好ましい。一般に融合分子は共役分子から成っていてもよい。

【0063】

用語「宿主細胞」はクローニングベクター又は発現ベクターの何れかを含有している原核又は真核細胞の何れかへの言及を意味している。この用語は、宿主細胞の染色体又はゲノムにクローン遺伝子（複数を含む）が含まれるように遺伝子操作されている原核又は真核細胞も包含している。

【0064】

本明細書で用いられる用語「免疫応答」は、免疫細胞が、異なった接着及び／又は活性化工程に関与する多元的な工程を介して刺激を受けそして／又は血液からリンパ球、更には非リンパ組織へ集められる過程への言及を意味している。活性化条件が、サイトカイン、成長因子、ケモカイン及びその他の因子の放出を引き起こし、免疫細胞上の接着及びその他の活性化分子の発現を上方制御し、接着、形態変化、及び／又は組織からケモタキシスを伴う溢出を促進し、細胞増殖及び細胞毒性活性を増大し、抗原提示を刺激し、そして記憶細胞タイプの生成を含むその他の表現型変化をもたらす。免疫応答は、炎症又は別の免疫細胞の細胞毒性活性を抑制又は制御する免疫細胞の活性への言及も意味している。免疫応答はインビトロ又はインビボにおける免疫細胞の活性への言及を意味する。

【0065】

本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型に言及するために互換可能に用いられる。ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又はこれらの類縁体を含むことができる。ヌクレオチドは何れかの三次元構造を有することができ、そして公知又は未知の何れかの機能を果たすことができる。用語「ポリヌクレオチド」は、例えば、一重、二重螺旋及び三重螺旋分子、遺伝子又は遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意配列の単離されたＤＮＡ、任意配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを包含する。核酸分子は改変核酸分子（例えば、改変された塩基、糖、及び／又はヌクレオチド間の結合を含む）も含むことができる。

【0066】

用語「ポリペプチド」は、好ましくはその大きさに関わらず本質的に２０種の天然アミノ酸の何れかからなる、何れかのポリマーへの言及を意味している。用語「タンパク質」が比較的大きいタンパク質を参照するために用いられ、そして多くの場合「ペプチド」が小さいポリペプチドを参照するために用いられているが、この分野におけるこれらの用語の使用はオーバーラップしていることが多い。用語「ポリペプチド」は特段の断りがない限り、一般にタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを示す。一般に本発明に関して有用なペプチドは通常、遠心分離又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的分子サイズ測定技術で評価して、約０．１〜１００ＫＤ又は最高約１０００ＫＤの大きさ、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０及び５０ＫＤの間である。

【0067】

用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等は、疾患又は病気を有していないが、疾患又は病気を発症するリスクが高いか罹りやすい対象の疾患又は病気が発症する確立を減少させることへの言及を意味している。予防等は対象が特定の病気又は疾患に決して罹らないように予防することを意味していない。予防は複数用量の投与を必要としてもよい。予防は全ての症状がなくなった対象の疾患の再発を防ぐこと、又は再発寛解疾患の再発を防ぐことを包含する。

【0068】

用語「一本鎖抗体」は、一本鎖形態に基づく抗体への言及を意味している。一本鎖抗体は抗体の最小結合サブユニットから成っていてよい。一本鎖抗体は、一本の安定に畳まれているポリペプチド鎖上で抗体の抗原−結合領域（例えば、相補体決定領域の全て又は幾つか、重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域に存在するＣＤＲ）とのみ結合できる。このように、一本鎖抗体は古典的な免疫グロブリンよりサイズが相当に小さいものであるが、抗体の抗原特異的結合特性を保持している。一本鎖抗体はリガンド、例えば、エフェクター分子又は薬物複合体の広い領域と結合できる。

【0069】

本明細書で用いられる用語「可溶性」は、水性緩衝液、例えば、細胞培地から低いＧ力遠心分離下（例えば、通常の遠心機で約３０，０００回転／分以下）で容易に沈殿しない融合分子、特に融合タンパク質を意味する。更に、融合分子は、低濃度の陰イオン又は非イオン洗浄剤の存在下又は非存在下において中性ｐＨ又はその付近で約５〜３７℃より高い温度で水溶液に維持されるならば可溶性である。これらの条件下で、可溶性タンパク質は低い沈降価、例えば約１０〜５０のスベドベルグ単位を有している。

【0070】

本明細書で参照する水溶液は一般に、ｐＨ、具体的には約５〜９の範囲のｐＨ、及び約２ｍＭ〜５００ｍＭの範囲のイオン強度を確立するために緩衝化合物を有している。たまに、プロテアーゼ阻害剤又は弱い非イオン洗浄剤を添加する。また、所望により、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような担体タンパク質を数ｍｇ／ｍｌ添加してもよい。例示的な水性緩衝剤は、標準的なリン酸緩衝食塩水、トリス緩衝食塩水、又はその他の周知の緩衝剤及び細胞培地製剤を包含する。

【0071】

用語「刺激する」又は「刺激すること」は、生理活性、例えば免疫応答を増大すること、増幅すること、補強すること、強化することへの言及を意味している。刺激は正の変化でよい。例示的な増大は、例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％或いは９０〜１００％までであってよい。その他の例示的な増大は２倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍又は１００倍までもを包含する。

【0072】

用語「抑制する」又は「抑制すること」は、生理活性、例えば免疫応答を減少すること、弱めること、減らすこと、止めること又は安定化することを示している。抑制は負の変化でよい。例示的な減少は、例えば、５％、１０％、２５％、５０％、７５％或いは９０〜１００％までであってよい。例示的な減少は２倍、５倍、１０倍、２０倍、４０倍又は１００倍までもを包含する。

【0073】

用語「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する内在性膜タンパク質の複合体の又はこれに由来するポリペプチドへの言及を意味している。ある場合は、Ｔ細胞は、αβ又はγδヘテロ二量体Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してＭＨＣ産物と結合しているペプチドを認識する。ＴＣＲレパートリーは、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子で用いたものと同じ遺伝子再配列メカニズムにより創生された広汎の多様性を有している［Tonegawa, S. (1988) Biosci. Rep. 8:3-26]。殆どの多様性は、α及びβ鎖の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をコードする可変（Ｖ）及び結合（Ｊ）（或いは多様性、Ｄ）の合流点で創生される[Davis and Bjorkman (1988) Nature 334:395-402]。しかしながら、ＴＣＲは抗体のように、そして恐らく偶然ではなく、体細胞点突然変異を受けない。ＴＣＲは抗体と同じ程度の親和性成熟も受けない。天然に生じるようなＴＣＲは、１０^５〜１０^７Ｍ⁻の親和性を有していると思われるのに対して、抗体は通常１０^５〜１０^９Ｍ⁻の親和性を有している[Davis et al. (1998) Annu. Rev. Immunol. 16:523-544; Eisen et al. (1996) Adv. Protein Chem. 49:1-56]。ＴＣＲに体細胞突然変異が存在しないことは低い親和性に関係しているかもしれないが、ＴＣＲが高い親和性を有することの選択的優位性がないとも反論されている。実際に、Ｔ細胞活性化の連続引き金[Valitutti et al. (1995) Nature 375:148-151]及び動的校正[Rabinowitz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1401-1405]モデルの両方とも、より長いオフ速度（高い親和性に関係している）がシグナル伝達系に弊害をもたらすことを示唆している。より高い親和性ＴＣＲはＴ細胞応答に必要なペプチド特異性を保持できないという可能性もある。例えば、ＭＨＣの溝の内部で結合するペプチドは限られたアクセス可能表面を提示し[Bjorkman, P. J. (1997) Cell 89:167-170]、これは順に相互作用中に生成されるエネルギーの量を制限する。一方、エネルギーをＭＨＣ螺旋に向けることによりＴＣＲの親和性を増やすことは、恐らく負の選択中に胸腺の欠失をもたらす[Bevan, M. J. (1997) Immunity 7:175-178]。用語「ＴＣＲ」は、ＴＣＲ Ｖα及びＶβドメインを含む分子を包含する、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ヘテロ二量体及び一本鎖Ｔ細胞受容体又はその機能的断片を包含する。用語「ＴＣＲ」は、例えば、２００８年３月１９日に出願されて米国特許公開第ＵＳ２００３０１４４４７４号の、標題「T CELL RECEPTOR FUSIONS AND CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF」の米国仮特許出願に開示されているＴ細胞受容体も包含する。

【0074】

用語「ベクター」は、宿主細胞中で自己複製ができて、外来ＤＮＡを受け入れることができる核酸分子である。ベクターはそれ自体の複製起点、外来ＤＮＡ挿入のために用いることができる制限エンドヌクレアーゼ用の１つ又はそれ以上の固有の認識部位、及び通常は抗生物質耐性をコードする遺伝子のような選択可能なマーカー、並びに挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（例えば、プロモーター）をしばしば担持している。一般的なベクターはプラスミドベクター及びファージベクターを包含している。

【0075】

用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖「断片結晶化可能」領域への言及を意味している。一般に、Ｆｃドメインは第２Ｆｃドメインと相互作用して二量体複合体を形成できる、ＦｃドメインはＦｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び／又は相補体系のタンパク質と結合でき、或いはこれらの結合活性を減少又は増大するために改変できる。ＦｃドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ又はＩｇＥ抗体アイソタイプから得ることができ、そしてオプソニン化、細胞溶解、マスト細胞の劣化、好塩球増加及び好酸球増加、並びにの他のＦｃ受容体依存性過程を包含する免疫活性；相補経路の活性化；及びインビボにおけるタンパク質安定性の影響を及ぼす。

【0076】

用いられている略語は：ＩｇＧ、免疫グロブリン；ｈ、ヒト（の）；ＩＬ、インターロイキン；Ｒ、受容体；Ｓｕ、ｓｕｓｈｉドメイン；ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体；ｓｃ、一本鎖；ｓＴＮＦＲ、可溶性腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体；ＮＫ、ナチュラルキラー；ＫＤ、平衡解離定数；ＣＴＬｓ、細胞毒性Ｔリンパ球；ａａ、アミノ酸（複数を含む）；ＯＶＡ、オボアルブミン；ＶＳＶ、水疱性口内炎ウィルス；ＩＭＤＭ、イソコーブ改変ダルベッコ培地；ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；β２ｍ、β２ミクログロブリン；ＳＡ、ストレプタビジン；ＨＲＰ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；ＰＥ、フィコエリトリン；ＡＢＴＳ、２，２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]−ジアンモニウム塩；ＰＬＥ、ペプチド負荷エンハンサー；ｃ２４６ｓｃＴＣＲ、ヒトｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体に特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲ；ｃ１４９ｓｃＴＣＲ，ヒトｐ５３（ａａ１４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１複合体に特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲ；ＯＴ１ｓｃＴＣＲ、ＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体に特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲ；ＳＥＣ、サイズ排除クロマトグラフィー；ｐＭＨＣＩ、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ；ＳＰＲ、表面プラズモン共鳴；ＭＷ、分子量；ｍ、ネズミ；Ａ、吸光度；ＲＵ、応答単位である。

【0077】

本明細書で提供されている範囲は範囲内の全ての値を省略していると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０からなる群の何れかの数、数の組合わせ、又は部分範囲を包含すると理解される。

【0078】

「１より大きい」は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、１００等又はその間の任意の値であると理解される。「少なくとも」特定値、はその値及びその値より大きい全ての値であると理解される。

【0079】

具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語「又は」は包括的であると理解される。

【0080】

具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は単数又は複数であると理解される。

【0081】

具体的に述べられているか又は文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で用いられている用語「約」は、当該技術分野において正常に許容される範囲内、例えば、平均値の２標準偏差内であると理解される。約は、述べられている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解できる。文脈から明らかな場合を除いて、本明細書で提供されている全ての数値は用語、約で修飾できる。
本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基を列挙するリストは、何れかの単一基又は列挙されている基の組合わせとしての可変基の定義を包含する。本明細書の可変基又は態様についての実施態様の列挙は、何れかの単一の実施態様又は他の実施態様又はその部分との組み合わせとしての実施態様を包含する。

【0082】

本明細書に提供されている何れかの組成物又は方法は、本明細書に提供されているその他の何れかの組成物及び方法の１つ又はそれ以上と組合わせることができる。

【0083】

（Ｆｃドメイン）
ＩｇＧクラスの免疫グロブリンはヒト血液中に最も豊富にあるタンパク質である。これらの血中半減期は２１日もの長期に達する。融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃ領域と、各種サイトカイン及び可溶性受容体のような、別のタンパク質のドメインとの結合体であると報告されている（例えば、Capon et al., Nature, 337:525-531, 1989; Chamow et al., Trends Biotechnol., 14:52-60, 1996); 米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，５４１，０８７号を参照されたい）。原型の融合タンパク質はＩｇＧＦｃのヒンジ領域でシステイン残基を介して結合しているホモ二量体タンパク質であって、重鎖可変及びＣ_Ｈ１ドメイン並びに軽鎖のないＩｇＧ分子と類似の分子をもたらす。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体特性は、別の分子との高次相互作用（すなわち、２価又は二重特異性結合）をもたらす点で好都合である。構造的相同性に起因して、Ｆｃ融合タンパク質は類似のアイソタイプを有するヒトＩｇＧのそれに相当するインビボの薬物動態プロファイルを示す。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５融合タンパク質の血中半減期を引き延ばすためにそして／又はその生物活性を増大するために、本発明に開示又は記載されているヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分と共有結合しているＩＬ−１５Ｒαと非共有結合しているＩＬ−１５を含有している融合タンパク質複合体を作成することが望ましい。

【0084】

用語「Ｆｃ」は、単量体又は多量体の形態にあるかに関わらず、全抗体の非抗原結合断片の配列を含んでいる分子又は配列への言及を意味する。天然型Ｆｃの原免疫グロブリン供給源はヒト起源であることが好ましく、何れかの免疫グロブリンであってもよいが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然型Ｆｃは二量体又は多量体形態内へ共有結合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有関係で結合できる単量体ポリペプチドで構成されている。天然型Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に依存して１〜４の範囲にある。天然型Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化由来のジスルフィド結合した二量体である（Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9 を参照されたい）。本明細書で用いられる用語「天然型Ｆｃ」は単量体、二量体、及び多量体形態に対する総称である。ＦｃドメインはプロテインＡ、プロテインＧ、各種のＦｃ受容体及び相補タンパク質に対する結合部位を含有している。

【0085】

ある実施態様では、用語「Ｆｃ変異体」は、天然型Ｆｃから改変されているがサルベージ受容体であるＦｃＲｎへの結合部位を未だ含んでいる分子又は配列への言及を意味する。国際出願第ＷＯ９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日公開）及び同第ＷＯ９６／３２４７８号公報は例示的なＦｃ変異体を、更にはサルベージ受容体との相互作用を記載していて、これは参照により本明細書に組み込まれている。従って、用語「Ｆｃ変異体」は非ヒト天然型Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含んでいる。更に、天然型Ｆｃは、本発明の融合タンパク質に必要がない構造特性或いは生物活性をもたらすので除去されてもよい部位を含んでいる。従って、ある特定の実施態様では、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現に対するＮ−末端異種混交化、（４）グリコシル化、（５）相補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性の細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすか或いはこれに関与する天然型Ｆｃの部位又は残基の１つ又はそれ以上を欠失した分子又は配列を含んでいる。Ｆｃ変異体は以下に更に詳細に記載されている。

【0086】

用語「Ｆｃドメイン」は、天然型Ｆｃ及びＦｃ突然変異分子、並びに上記の配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然型Ｆｃと同様に、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されたか或いは組み替え遺伝子発現により又は別の方法で産生されたかに関わらず、単量体又は多量体形態にある分子を包含する。

【0087】

（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ））
Ｔ細胞はその他の免疫細胞型（多形核球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）と共に免疫系の細胞要素を構成する、細胞のサブグループである。生理的条件下で、Ｔ細胞は免疫監視において並びに外来抗原の排除において機能する。しかしながら、病的条件下では、Ｔ細胞が疾患の原因及び伝播において重要な役割を果すという強力な証拠がある。これらの疾患において、中枢又は末梢における、Ｔ細胞免疫寛容の破綻は自己免疫疾患の原因における基本的な過程である。

【0088】

ＴＣＲ複合体は少なくとも７つの膜貫通タンパク質から成っている。ジスルフィド結合した（αβ又はγδ）ヘテロ二量体は単一型抗原認識ユニットを形成するが、ε、γ、δ、ξ、及びη鎖から成る、ＣＤ３の不変鎖は、Ｔ細胞活性化及び細胞免疫応答の同化をもたらすシグナル伝達経路へのリガンド結合のカップリングに関与する。ＴＣＲ鎖の遺伝子多様性にも関わらず、２つの構造特性が全ての公知サブユニットに共通している。第１に、これらは恐らくα螺旋である、一本鎖膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパク質である。第２に、全てのＴＣＲ鎖は予測される膜貫通ドメイン内に荷電アミノ酸を保有しているという独特な特性を有している。不変鎖はマウスとヒトの間に保存されている、単一の負の電荷を有し、そして可変鎖は１つの（ＴＣＲ−β）又は２つの（ＴＣＲ−α）正電荷を保有している。ＴＣＲの膜貫通配列は多数の種で高度に保存されているので、系統発生的に重要な役割を果しているのだろう。親水性アミノ酸、アルギニン及びリジンを含んでいるオクタペプチド配列が種の間で一致している。

【0089】

Ｔ細胞の応答はＴＣＲに結合している抗原によって調節される。ＴＣＲの１つの型は、免疫グロブリン可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域に類似しているα及びβ鎖からなる膜結合ヘテロ二量体である。ＴＣＲのα鎖が共有結合したＶ−αとＣ−α鎖を包含しているの対して、β鎖はＣ−β鎖と共有結合しているＶ−β鎖を包含している。Ｖ−α及びＶ−β鎖は、主要な組織的適合性複合体（ＭＨＣ）（ヒトではＨＬＡ複合体として知られている）との関連でスーパー抗原又は抗原を結合できるポケット又は裂け目を形成する。概して、Davis Ann. Rev. of Immunology 3: 537 (1985); Fundamental Immunology 3rd Ed., W. Paul Ed. Rsen Press LTD. New York (1993) を参照されたい。

【0090】

ＴＣＲ鎖（αβ又はγδ）の細胞外ドメインも、細胞表面上で発現するための異種膜貫通ドメインとの融合体として遺伝子操作できる。このようなＴＣＲは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ及び／又はキメラ活性化受容体（ＣＡＲ）膜貫通又は活性化ドメインとの融合体を包含する。ＴＣＲは１つ又はそれ以上のαβ又はγδ鎖の抗原結合ドメインを含む可溶性タンパク質であってもよい。このようなＴＣＲはＴＣＲ定常ドメインを有しているか又は有していないＴＣＲ可変ドメイン又はその機能的断片を包含してもよい。可溶性ＴＣＲはヘテロ二量体又は一本鎖分子であってもよい。

【0091】

（融合タンパク質複合体）
本発明の可溶性融合タンパク質及び共役分子複合体は少なくとも２つの可溶性融合タンパク質を含んでいる。ある特定の実施態様では、第１融合タンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）又はその機能的断片と共有結合している第１生物活性ポリペプチドを含み；第２融合タンパク質は可溶性インターロイキン−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）ポリペプチド又はその機能的断片と共有結合している第２生物活性ポリペプチドを含み、そしてここで第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインは第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインと結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する。本発明の融合タンパク質複合体は第１及び第２融合タンパク質の一方又は両方と結合している免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片も含んでいる。Ｆｃドメインが第１及び第２融合タンパク質と結合するＦｃドメインが相互作用して融合タンパク質複合体を形成することが好ましい。このような複合体は免疫グロブリンＦｃドメイン間にジスルフィド結合を形成することにより安定化させることができる。ある特定の実施態様では、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５ポリペプチド、ＩＬ−１５変異体又はその機能的断片及び可溶性ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド又はその機能的断片を包含し、そこではＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドの一方又は両方が免疫グロブリンＦｃドメイン又はその機能的断片を更に包含している。

【0092】

ある特定の実施例では、生物活性ポリペプチドの１つが第１可溶性ＴＣＲ又はその断片を含んでいる。別の又は第２生物活性ポリペプチドが第１可溶性ＴＣＲ又はその機能的断片を含んでいるので、１価ＴＣＲと比べて同種リガンドに対する増大した結合活性を有する多価ＴＣＲ融合タンパク質複合体を作り出す。更に、別の生物活性ポリペプチドは第１可溶性ＴＣＲとは異なる第２可溶性ＴＣＲ又はその機能的断片を含んでいる。ある特定の実施例では、ＴＣＲは、例えば、天然型ＴＣＲと比較して同種リガンドに対するより高い親和性又は増大した結合親和性を有するものとして産生される。本明細書に記載されているような本発明の可溶性ＴＣＲがそのリガンドに対してより高い活性又は親和性を有している場合、細胞表面結合抗原に対する特異的なプローブとして有用である。本発明のある特定の好ましい実施例では、ＴＣＲは特定抗原の認識に対して特異的である。

【0093】

典型的な実施態様では、ＴＣＲはα鎖（本明細書ではα、アルファ、又はａ鎖という）及びβ鎖（本明細書ではβ、ベータ、又はｂ鎖という）を含有しているヘテロ二量体である。別の典型的な実施態様では、ＴＣＲは一本鎖ＴＣＲポリペプチドを含んでいる。一本鎖ＴＣＲはペプチドリンカー配列によってＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合しているＴＣＲ Ｖ−α鎖を含んでいてよい。一本鎖ＴＣＲは更にＴＣＲ Ｖ−β鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃβ鎖断片を含んでいてもよい。一本鎖ＴＣＲは更にＴＣＲ Ｖ−α鎖と共有結合している可溶性ＴＣＲ Ｃα鎖断片を含んでいてもよい。

【0094】

更なる実施態様では、第１及び第２生物活性ポリペプチドの一方又は両方が抗体又はその機能的断片を含んでいる。

【0095】

別の実施態様では、ＴＣＲドメインに対する抗原はＭＨＣ又はＨＬＡ分子中に存在するペプチド抗原を含んでいる。更なる実施態様では、ペプチド抗原は腫瘍関連ポリペプチド又はウィルスがコードするポリペプチドに由来している。

【0096】

別の実施態様では、抗体ドメインに対する抗原は細胞表面受容体又はリガンドを含んでいる。

【0097】

更なる実施態様では、抗原はＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカイン受容体又はリガンド、成長因子受容体又はリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、或いはウィルスがコードする抗原を含んでいる。

【0098】

本明細書で用いられる用語「生物活性ポリペプチド」又は「エフェクター分子」は、本明細書で検討するような所望の効果を生み出すことのできる、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド；糖又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質、又はリポタンパク質のようなアミノ酸配列を意味する。エフェクター分子は化学物質も包含する。生物活性又はエフェクタータンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸も意図されている。従って、適切な分子は調節因子、酵素、抗体又は薬剤、更にはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びオリゴヌクレオチドを包含する。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は天然由来であってもよく或いは公知成分から、例えば、遺伝子組み換え又は化学合成、によって合成でき、そして異種成分を包含できる。生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は通常、遠心分離又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的分子サイズ測定技術で評価して、約０．１〜１００ＫＤ又は最大で約１０００ＫＤの大きさ、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０及び５０ＫＤの間である。本発明の望ましい効果は、これに限定されないが、例えば、増大した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を形成すること、標的細胞を殺傷して、例えば、疾患の予防又は治療において、細胞増殖又は細胞死を誘発して、免疫応答を開始すること、又は診断目的で検出分子として作用することを包含する。このような検出のために、アッセイを用いることができ、例えば、それを増殖するために細胞を培養すること、及び細胞を本発明のＴＣＲ融合複合体と接触させること、次いでＴＣＲ融合複合体が細胞の更なる発生を阻害するか否かを評価することを含んでいるアッセイを用いることができる。

【0099】

本発明に従って本発明の融合タンパク質複合体にエフェクター分子を共有結合することは多くの重要な利点をもたらす。公知構造のペプチドのようなものを包含している、単一のエフェクター分子を含んでいる本発明の融合タンパク質複合体を産生できる。更に、多種のエフェクター分子を同様のＤＮＡベクターに産生できる。すなわち、感染細胞又は病的細胞を認識するために、異なったエフェクター分子のライブラリーを融合タンパク質複合体に結合することができる。更に、治療適用のために、本発明の融合タンパク質複合体の対象への投与よりむしろ、融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ発現ベクターを融合タンパク質複合体のインビボ発現のために投与できる。このような手法は典型的に組み換えタンパク質の製造に関連しているコストのかかる精製工程を避け、そして従来の手法に関連している抗原の取り込み及び処理の複雑さを避けることができる。

【0100】

述べたように、本明細書に開示されている融合タンパク質の成分、例えば、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク毒素、免疫グロブリンドメイン又はその他の生物活性分子のようなエフェクター分子及び何れかのペプチドリンカーを、融合タンパク質が意図されている機能を有するという条件で、ほぼ任意の方法で構造化できる。具体的には、融合タンパク質のそれぞれの成分を所望により、少なくとも１つの適切なペプチドリンカー分別の成分と距離を空けることができる。更に、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の改変、同定及び／又は精製を促進するために、タグを包含できる。より具体的な融合タンパク質は以下に記載されている実施例中にある。

【0101】

（リンカー）
本発明の融合複合体は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと生物活性ポリペプチドの間に挿入されたフレキシブルなリンカー配列も包含していることが好ましい。リンカー配列は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに対する生物活性ポリペプチドの効果的な位置決めが両方のドメインに機能活性を持たせるようにしなければならない。生物活性ポリペプチドがＴＣＲである場合の実施態様では、リンカー配列は、Ｔ細胞受容体が提示ＭＨＣペプチド複合体を認識できるように、そしてエフェクター分子を望ましい位置へ送達できるように、ＴＣＲ分子結合溝を位置付ける。エフェクター分子の良好な提示は、Ｔ細胞を培養してこれを増殖すること、Ｔ細胞を本発明のＴＣＲ融合複合体と接触させること、そしてＴＣＲ融合複合体が細胞の更なる発生を阻害するか否かを評価することの連続工程を含んでいるインビトロアッセイを包含している、以下に開示されているアッセイによって確認されるように、細胞がＴ細胞増殖を誘発又は阻害するか、或いは特定部位に対する免疫応答を開始するか阻害するかの何れかの細胞の活性を調節することができる。

【0102】

ある特定の実施態様では、可溶性融合タンパク質複合体は、第１生物活性ポリペプチドがポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５（又はその機能的断片）に共有結合しているリンカーを有している。

【0103】

別の特定の実施態様では、本明細書に記載されているような可溶性融合タンパク質複合体は、第２生物活性ポリペプチドがポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合しているリンカーを有している。

【0104】

提示抗原を認識するためにＴＣＲ分子の結合溝を、或いは抗原を認識するために抗体分子の結合ドメインを効果的に位置づけることができるペプチドをもたらすヌクレオチド配列によって、リンカー配列がコードされることが好ましい。本明細書で用いられる語句「ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに対する生物活性ポリペプチドの効果的な位置決め」、又は同様の語句は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに結合している生物活性ポリペプチドが、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインが互いに相互作用してタンパク質複合体を形成できるように位置していることを意味するように意図されている。ある特定の実施態様では、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインが免疫細胞と相互作用して免疫反応を開始又は阻害するか、或いは細胞の成長を阻害又は刺激するこを許容するように効果的に位置している。

【0105】

本発明の融合複合体は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと免疫グロブリンＦｃドメインの間に挿入されたフレキシブルなリンカー配列も包含していることが好ましい。リンカー配列は、Ｆｃドメイン、生物活性ポリペプチド及びＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインを、それぞれのドメインが機能活性を持つように、効果的に位置つけるようにしなければならない。ある特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、適切な融合タンパク質複合体形成及び／又は免疫細胞又は相補体系のタンパク質上のＦｃ受容体との相互作用を許容して、オプソニン化、細胞溶解、マスト細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒、並びにその他のＦｃ受容体依存性の過程；を包含するＦｃが介在する効果を刺激し；相補経路を活性化し；そして融合タンパク質複合体のインビボ半減期の増大することを可能にするように効果的に位置決めされている。

【0106】

リンカー配列は生物活性ポリペプチドの２つ又はそれ以上を結合して所望の機能活性を有する一本鎖分子を生成するためにも用いることができる。

【0107】

リンカー配列は好ましくは約７〜２０個のアミノ酸を、より好ましくは約８〜１６個のアミノ酸を含んでいる。リンカー配列は、望ましくない単一構造中に生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子を保持しないようにフレキシブルであることが好ましい。リンカー配列は、例えば、認識部位を融合分子から距離をあけて置くために用いることができる。具体的には、ペプチドリンカー配列を、例えば、これを化学的に架橋して分子柔軟性をもたらすために、生物活性ポリペプチドとエフェクター分子の間に位置付けることができる。リンカーは主にグリシン、アラニン及びセリンのような小さい側鎖を有するアミの酸を含んでいて柔軟性をもたらすことが好ましい。好ましくは、リンカー配列の約８０又は９０％又はそれ以上がグリシン、アラニン、又はセリン残基を、特にグリシンとセリン残基を含有している。ヘテロ二量体ＴＣＲを含んでいる融合タンパク質複合体に関しては、リンカー配列はＴＣＲ分子のａ鎖にも結合できるが、リンカー配列はＴＣＲ分子のβ鎖に適切に結合する。あるいは、リンカー配列はＴＣＲ分子のα及びβ鎖の両方に結合できる。このようにβペプチド鎖がα鎖と共に発現された場合は、結合したＴＣＲポリペプチドは、図１に大まかに描かれているように畳み込まれて機能的なＴＣＲ分子をもたらす。１つの適切なリンカー配列は、ＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧ（すなわちＡｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ）（配列番号５）であり、ＴＣＲのβドメインの第１アミノ酸と結合していることが好ましい。抗体可変領域を共に結合するために良好に用いられている多くのフレキシブルリンカーデザインの何れかを包含する異なったリンカー配列を用いることができる。 Whitlow, M. et al., (1991) Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105 を参照されたい。ある実施例では、エフェクター分子をＴＣＲβ鎖分子と共有結合するために、リンカーのアミノ配列は、ＴＣＲβ鎖のＣ末端残基からエフェクター分子のＮ末端残基までの適切な距離を橋渡しすることができる。適切なリンカー配列を実験的に容易に確認することができる。また、リンカー配列の適切な大きさ及び配列もＴＣＲ分子の予測サイズ及び形状に基づいて従来のコンピュータモデリング技術によって確認できる。

【0108】

一般に、本発明の融合タンパク質複合体の製造は本明細書に開示されている方法により及び、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）、プラスミドＤＮＡの製造、制限酵素を用いるＤＮＡの開裂、オリゴヌクレオチドの製造、ＤＮＡのライゲーション、ｍＲＮＡの単離、ＤＮＡの適切な細胞への導入、宿主の形質転換又はトランスフェクション、宿主の培養に関する広く認められている組み換えＤＮＡ技術によって遂行できる。更に、融合分子はカオトロピック剤及び周知の電気泳動、遠心分離及びクロマトグラフィー方法を用いて単離及び精製できる。これらの方法に関する開示について、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. (1989); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) を概して参照されたい。

【0109】

本明細書で用いられている本発明の生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は酵素のようなその他の生物活性タンパク質のような因子を包含できる。また、生物活性ポリペプチドは、非タンパク質毒素、細胞毒性薬、化学療法剤、検出可能な標識，放射活性物質等のようなその他の化合物との複合体を包含できる。

【0110】

本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を及ぼして細胞免疫性の様々な複数効果の何れかに関与する、細胞によって産生される何れかの因子によって定義される。サイトカインの例は、これに限定されないが、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬー１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカインファミリー、及びＩＬ−１からＩＬ−３５、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β、ＩＮＦγ、ＴＧＦ-β、ＴＮＦα、並びにＴＮＦβを包含する。

【0111】

本発明の一態様では、第１融合タンパク質はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能的断片と共有結合している第１生物活性ポリペプチドを含んでいる。ＩＬ−１５はＴ細胞の活性化及び増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞の活性化及び増殖に作用するＩＬ−１５活性は、ある意味ではＩＬ−２と類似しているが、根本的な違いはよく特徴付けられている（Waldmann, T A, 2006, Nature Rev. Immunol. 6:595-601）。

【0112】

本発明の別の態様では、第１融合タンパク質はＩＬ−１５変異体（本明細書ではＩＬ−１５突然変異体ともよぶ）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含んでいる。ＩＬ−１５変異体は、天然型（又は野生型）ＩＬ−１５タンパク質とは異なったアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。ＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５Ｒαポリペプチドと結合してＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能することが好ましい。アゴニスト活性を伴うＩＬ−１５変異体はスーパーアゴニスト活性を有していることが好ましい。ある実施態様では、ＩＬ−１５変異体はその１Ｌ−１５Ｒαとの関連とは独立してＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして作用する。ＩＬ−１５アゴニストは野生型ＩＬ−１５と比較して相当の又は増加した生物活性によって例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは野生型と比較して減少した生物活性で、又はＩＬ−１５が介在する応答を阻害する能力によって例示される。ある例では、ＩＬ−１５変異体は増大した又は減少した活性でＩＬ−１５ＲβγＣ受容体と結合する。ある実施態様では、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然型ＩＬ−２配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば、置換又は欠失を有していて、このような変化はＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたらす。アミノ酸置換／欠失がＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメイン内にあることが好ましい。アミノ酸置換／欠失がＩＬ−１５Ｒαとの結合或いはＩＬ−１５変異体を産生する能力に影響を及ぼさないことがより好ましい。ＩＬ−１５変異体を生成する適切なアミノ酸置換／欠失は、想定される又は公知のＩＬ−１５構造、公知構造を有するＩＬ−２のような同族分子とＩＬ−１５との比較に基づいて、本明細書で提供されているように、又はその他の実験方法で、合理的な或いは無作為的な突然変異生成及び機能アッセイによって確認できる。更なる適切なアミノ酸置換は同類又は非同類変化及び追加のアミノ酸の挿入である。本発明のＩＬ−１５変異体が、天然の成熟型ヒトＩＬ−１５配列の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１、又は１１２位に１つ又はそれ以上の１つのアミノ酸置換／欠失を含んでいることが好ましく；特にＤ８Ｎ（「Ｄ８は天然型成熟ヒトＩＬ−１５配列のアミノ酸及び残基位置を示し、そして「Ｎ」はＩＬ−１５変異体のその位置で置換されたアミノ酸残基を示す）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換はアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体もたらして、Ｎ７２Ｄ置換はアゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす。

【0113】

サイトカインと同様に、ケモカインは、他の細胞に暴露されたときに細胞免疫の様々な複数効果の何れかに関与する、化学因子又は分子の何れかと定義される。適切なケモカインは、これに限定されないが。ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ_３Ｃケモカインファミリー、ＣＣＬ−１からＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１からＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、及びランテスを包含する。

【0114】

成長因子は、特定の細胞に暴露されると病的細胞の増殖及び／又は分化を誘発する何れかの分子を包含する。成長因子はタンパク質及び化学分子を包含し、その幾つかは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト成長因子及び幹細胞成長因子を包含する。

【0115】

毒素又は細胞毒性薬は、細胞に暴露されたときに致死効果又は生育に対する阻害効果を有する物質の何れかを包含する。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ヤマゴボウ抗ウィルスタンパク質、又はゲロニンのような、植物又は細菌起源の細胞毒素であってよい。このような毒素の生物活性断片は当該技術分野において周知であって、例えば、ＤＴＡ鎖及びリシンＡ鎖を包含する。更に、毒素は、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）のような細胞表面で活性な薬剤であってよい。

【0116】

更に、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、又はシスプラチンのような化学療法剤であってよい。

【0117】

更に、エフェクター分子は診断又は画像検討に適している検出可能な標識化分子であってよい。このような標識はビオチン、又はストレプタビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子又は結晶、酵素又はその触媒活性断片；緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、チクローム、テキサスレッド又は量子ドットのような蛍光標識；放射性核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、レニウム−１８８、又はビスマス−２１２；リン発光或いはケミルミネセント分子、又はＧｄ⁻⁻又は常時性金属イオンをベースにした造影剤のような、ＰＥＴ、超音波又はＭＲＩによって検出可能な標識を包含する。エフェクター又はタグを含んでいるタンパク質の製造及び使用に関連する開示について、例えば、Moskaug, et al. J. Biol. Chem. 264, 15709 (1989); Pastan, I. et al. Cell 47, 641, 1986; Pastan et al., Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents, Ann. Rev. Biochem. 61, 331, (1992); "Chimeric Toxins" Olsnes and Phil, Pharmac. Ther., 25, 355 (1982);ＰＣＴ出願公開第 ＷＯ９４／２９３５０号；ＰＣＴ出願公開第 ＷＯ ９４／０４６８９号;ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５０４６４４９号及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照されたい。

【0118】

共役結合したＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαドメインを包含しているタンパク質融合又は共役複合体はいくつかの重要な用途を有している。例えば、ＴＣＲを含んでいるタンパク質融合又は共役複合体は、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を特異的にＴＣＲを結合できるある特定の細胞へ送達するために用いることができる。従って、タンパク質融合又は共役複合体は、リガンドを含有している細胞を選択的に損傷又は殺傷する手段を提供する。ＴＣＲを含有しているタンパク質融合又は共役複合体のよって損傷又は殺傷可能な細胞又は組織の例は、ＴＣＲによって特異的に結合できる１つ又はそれ以上のリガンドを発現している腫瘍及びウィルス又は細菌に感染した細胞を包含する。損傷又は殺傷を受けやすい細胞又は組織は本明細書に開示されている方法で容易にアッセイできる。

【0119】

本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、天然由来のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えば、ヒト、マウス或いはその他の齧歯動物、又はその他の哺乳動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子とアミノ酸配列において適切に対応する。これらのポリペプチド及びコードする核酸の配列は文献中で公知であって、ヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１、ハツカネズミ筋肉インターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４３３２．１、ヒトインターロイキン−１５受容体α鎖前駆体（ＩＬ−１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｕ３１６２８．１、ツカネズミ筋肉インターロイキン１５受容体、α鎖−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１を包含する。

【0120】

ある設定では、本発明の多価体のタンパク質融合又は共役複合体を、例えば、ｓｃ−ＴＣＲ又はｓｃ−抗体の結合価を増やすために作成することは有用である。特に、融合タンパク質複合体のＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαドメインの間の相互作用は多価複合体を作成する手段を提供する。また、多価融合タンパク質は、例えば、標準的なビオチン−ストレプタビジン標識化技術を用いて１〜４つの間のタンパク質（同一又は異なっている）と共に共有結合又は非共有結合で結合するか、又はラテックスビーズのような適切な固体支持体へ接合して作成できる。化学的に架橋したタンパク質（例えば、デンドリマーへ架橋）も適切な多価の種である。例えば、タンパク質を、ビオチニル化ＢｉｒＡタグ或いはＣｙｓ又はＨｉｓのように化学反応性側鎖を有するアミノ酸残基のように改変できるタグ配列をコードする配列を包含させることにより、改変できる。このようなアミノ酸タグ又は化学反応性アミノ酸を融合タンパク質内の様々な位置に、好ましくは生物活性ポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位から離して、位置付けることができる。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ−末端をタグ又はそのような反応性アミノ酸（複数を含む）を含有している別の融合タンパク質と共有結合させることができる。２つ又はそれ以上の融合タンパク質を適切なデンドリマ−又はその他のナノ粒子と化学的に結合して多価の分子を得るために適切な側鎖を包含させることができる。デンドリマーは、その表面の多数の異なった官能基のうちの何れか１つを有することができる合成化学ポリマーである（D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101 (1993)）。本発明に従って用いるための例示的なデンドリマーは、例えば、システイン残基を結合できる、Ｅ９星形ポリアミンデンドリマー及びＥ９可燃性ポリアミンデンドリマーを包含する。例示的なナノ粒子はリポソーム、コアシェル粒子又はＰＬＧＡをベースとする粒子を包含する。

【0121】

本発明の別の実施態様では、融合タンパク質複合体の一方又は両方のポリペプチドは免疫グロブリンドメインを含んでいる。あるいは、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質は免疫グロブリンドメインと更に結合できる。好ましい免疫グロブリンドメインは、別の免疫グロブリンドメインと相互作用して上で提供されるような多重鎖タンパク質を形成できる領域を含んでいる。例えば、ＩｇＧ１Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３のような、免疫グロブリン重鎖領域は安定に相互作用してＦｃ領域を作り出す。Ｆｃドメインを包含している好ましい免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は相補タンパク質結合活性を包含しているエフェクター機能を有する、及び／又はグリコシル化部位を有する領域も含有している。ある実施態様では、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は相補体の結合活性又はグリコシル化を減少又は増大して、それにより得られたタンパク質の生物活性に影響を及ぼす突然変異を含んでいる。例えば、Ｆｃ受容体への結合を減少させる突然変異を含有している免疫グロブリンドメインを、Ｆｃ受容体担持細胞への低結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成するために用いることができ、これは特異抗原を認識又は検出するように設計された試薬にとって有利である。

【0122】

（核酸及びベクター）
本発明は更に、核酸配列及び特に本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウィルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、又はエピソームのような細胞外複製に適しているベクターによって担持されている。特に、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを本明細書に記載されている調製方法を促進して有意量の融合タンパク質を得るために用いることができる。ＤＮＡ配列を適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質をコードする配列の転写及び翻訳に必須の要素を含有しているベクターに挿入できる。各種の宿主−ベクター系を、タンパク質をコードする配列を発現するために用いることができる。これらは、ウィルスに感染した哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス等）；ウィルスに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウィルス）；酵母ベクターを含有している酵母、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ或いはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌のような微生物を包含する。用いた宿主−ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳要素のうちの何れか１つを用いることができる。概して前記Sambrook et al., 及び前記Ausubel et al., を参照されたい。

【0123】

可溶性融合タンパク質複合体を作成する方法が本発明に含まれていて、方法は本明細書に記載されているように第１及び第２融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを宿主細胞に導入すること、細胞又は培地中に融合タンパク質を発現して、第１融合タンパク質のＩＬ−１５ドメインと第２融合タンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインの間を会合させて可溶性融合タンパク質複合体を形成させるのに十分な条件下で宿主細胞を培養すること、可溶性融合タンパク質複合体を宿主細胞又は培地から精製することを含んでいる。

【0124】

一般に、本発明の好ましいＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、生物活性ポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列を導入するための、エフェクター分子をコードする配列と操作可能に結合する第１クローニング部位を含有しているリン酸ジエステル結合によって結合しているヌクレオチド配列を含有している。

【0125】

ＤＮＡベクターでコードされる融合タンパク質成分はカセット形式で提供されてもよい。用語「カセット」とは、標準的な組み換え方法で各成分を別の成分に容易に置き換えることができることを意味する。特に、カセット形式に構成されたＤＮＡベクターは、コードされた融合複合体を、血清型を有しているか又は発生させる能力を有している病原菌に対して用いられる場合に特に望ましい。

【0126】

融合タンパク質複合体をコードするベクターを作成するために、生物活性ポリペプチドをコードする配列を、適切なリガーゼを用いてエフェクターペプチドをコードする配列に結合する。提示されるペプチドをコードするＤＮＡは適切な細胞株からのように天然の供給源からＤＮＡを単離して、又は公知の合成方法、例えば、リン酸トリエステル方法によって得ることができる。例えば、Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed., 1984)を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドも市販の自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて製造することができる。単離されたら、生物活性ペプチドをコードする遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は当該技術分野で公知のその他の手段で増幅できる。生物活性ポリペプチド遺伝子を増幅するのに適切なＰＣＲプライマーはＰＣＲ産物へ制限酵素認識部位を添加できる。ＰＣＲ産物は好ましくはエフェクターペプチド用のスプライス部位及び生物活性ポリペプチド−エフェクター融合複合体の適切な発現及び分泌に必要なリーダー配列を含んでいる。ＰＣＲ産物がリンカー配列をコードする配列、或いはこのような配列のライゲーションのための制限酵素部位を包含していることも好ましい。

【0127】

本明細書に記載されている融合タンパク質は、標準的な遺伝子組み換えＤＮＡ技術によって産生されることが好ましい。例えば、生物活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されたら、配列をエフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子にライゲート（結合）することができる。生物活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列と直接結合してもよい、又はより典型的には、本明細書で検討されたようなリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を生物活性ポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列の間に置いて適切なリガーゼを用いて結合させてよい。得られるハイブリッドＤＮＡ分子を適切な宿主細胞内で発現させて融合タンパク質複合体を産生できる。ＤＮＡ分子を５’から３’方向に互いにライゲートして、ライゲーション後にコードされるポリペプチドの翻訳フレームが変化しないようにする（すなわち、ＤＮＡ分子をフレーム中で互いにライゲートする）。得られるＤＮＡ分子はインフレーム融合タンパク質をコードする。

【0128】

その他のヌクレオチド配列も遺伝子構築物中に包含させることができる。例えば、エフェクターペプチドと融合した生物活性ポリペプチドをコードする配列の発現を制御する、プロモーター配列（これは融合タンパク質を細胞表面又は培養培地に移動させる）を、リーダー配列を構築物中に含有させるか、又は構築物が挿入されている発現ベクター中に存在させることができる。免疫グロブリン又はＣＭＶプロモータが特に好ましい。

【0129】

変異生物活性ポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインをコードする配列を得るときに、当業者は生物活性の損失又は減少なしで、ある特定のアミノ酸置換、付加、欠失及び翻訳後改変によってポリペプチドを改変できることを認識するだろう。特に、同類アミノ酸置換は周知である。すなわち、１つのアミノ酸を類似した大きさ、荷電、極性及び構造のアミノ酸による置換はタンパク質機能を有意に変化させる可能性は少ない。タンパク質の構成要素である２０の標準アミノ酸は以下のように同類アミノ酸の４群に大まかに分類できる：非極性（親水性）グループはアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを包含する；極性（非荷電、中性）グループはアスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを包含する；正の荷電をもつ（塩基性）グループはアルギニン、ヒスチジン及びリジンを含む；及び負の荷電をもつ（酸性）グループはアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。タンパク質において１つのアミノ酸の同じグループ内の別のアミノ酸による置換は、タンパク質の生物活性に対して不都合な影響を殆ど有さない。別の例では、アミノ酸位置の改変がタンパク質の生物活性を減少又は増強させることができる。このような変化は、不規則に、或いは標的残基の公知又は予測される構造、及び機能の特性に基づく部位特異的突然変異を介して導入できる。変異タンパク質の発現に続いて、改変に起因する生物活性の変化を結合又は機能アッセイを用いて容易に評価できる。

【0130】

ヌクレオチド配列間の相同性は、ＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって確認でき、ここで２重鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は生じる塩基対の程度に依存している。高温度及び／又は低塩含量の条件はハイブリッドの安定性を減少させ、そして選択された程度より低い相同性を有する配列のアニールを阻害するように変化させることができる。例えば、約５５％のＧ−Ｃ含量を有する配列については、４０〜５０Ｃ、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）及び０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリッド及び洗浄条件が約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５Ｃ、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリッド及び洗浄条件が約８２〜９７％の相同性を示し、そして５２Ｃ、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリッド及び洗浄条件は約９９〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する（及び相同性の程度を測定する）ための広範囲のコンピュータプログラムも利用可能で、市販及び無料ソフトウェアの両方の供給源を提供するリストは Ausbel et al.(1999) に見出せる。容易に入手できる配列比較及び複数配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ、the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1997) 及び ClustalW programs である。ＢＬＡＳＴは世界的なウェブ、ncbi.nlm.nih.gov で入手可能であって、ClastalW のバージョンは 2.ebi.ac.uk で入手可能である。

【0131】

融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を果たすことができれば、殆ど任意の順序で構成させることができる。例えば、ある実施多様では、生物活性ポリペプチドはエフェクター分子のＣ又はＮ末端に位置付けられる。

【0132】

本発明の好ましいエフェクター分子は、これらのドメインが意図している機能をもたらすサイズを有するだろう。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を含む多種の方法によって作成されて生物活性ポリペプチドと融合させることができる。例えば、 Means, G. E. and Feeney, R. E. (1974) in Chemical Modification of Proteins, Holden-Day. を参照されたい。 S. S. Wong (1991) in Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Pressも参照されたい。しかしながら、インフレーム融合タンパク質を作成する組み換え操作を用いることが一般に好ましい。

【0133】

述べたように、本発明による融合分子又は共役分子は幾つかの方法で構成できる。例示的な構造では、生物活性ポリペプチドのＣ−末端がエフェクター分子のＮ末端に操作可能に結合している。この結合は所望により組み替え方法で実現できる。しかしながら、別の構造では、生物活性ポリペプチドのＮ末端がエフェクター分子のＣ末端に結合している。

【0134】

その代わりに、或いは更に、必要に応じて、１つ又はそれ以上の追加エフェクター分子を生物活性ポリペプチド又は共役複合体内へ挿入することができる。

【0135】

（ベクター及び発現）
本発明のタンパク質融合複合体を発現するために多数の戦略を用いることができる。例えば、上記の融合タンパク質構築物を、構築物を挿入し次いでライゲーションするために、ベクターに切れ目を入れる制限酵素を用いるような公知の方法によって適切なベクターに組み込むことができる。次いで融合タンパク質の発現のために、遺伝子構築物を含有しているベクターを適切な宿主に導入する。概要は、前記の Sambrook etal. を参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは用いられている宿主に適合し、そしてこれに対して適切なレプリコンを有していなければならない。更に、ベクターは、発現されるべき融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を収容できなければならない。適切な宿主細胞は真核及び原核細胞を包含し、容易に形質転換できて培養培地中で迅速な成長を示すものが好ましい。特に好ましい宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ等のような原核細胞、及び動物細胞及び酵母株、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような真核細胞を包含する。哺乳動物の細胞、特にＪ５８８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが一般に好ましい。その他の適切な宿主は、例えば、Ｓｆ９のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が用いられる。前記の Sambrook を参照されたい。次いで、安定に形質転換された又はトランスフェクトされた細胞株を選択できる。本発明の融合タンパク質複合体を発現する細胞を公知の手順によって確認できる。例えば、免疫グロブリンと結合している融合タンパク質複合体の発現は、結合した免疫グロブリンに特異的なＥＬＩＳＡ及び／又はイムノブロッティングによって確認できる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに結合している生物活性ポリペプチドを含有している融合タンパク質の発現を検出するためのその他の方法は実施例に開示されている。

【0136】

上で大まかに述べたように、宿主細胞は、所望の融合タンパク質をコードする核酸を繁殖させるための予備的目的で用いることができる。従って、宿主細胞は融合タンパク質の産生を特異的に意図している原核又は真核細胞を包含できる。従って、宿主細胞は具体的に、酵母、ハエ、蠕虫、植物、カエル、哺乳動物細胞、及び融合体をコードする核酸を伝播できる器官を包含する。使用可能な哺乳動物細胞の限定しない例は、ＣＨＯ ｄｈｆｒ細胞（Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）、２９３細胞（Graham et al., J Gen. Virol., 36:59 (1977)）又はＳＰ２又はＮＳＯのような骨髄腫細胞（Galfre and Milstein, Meth. Enzymol., 73(B):3 (1981)）を包含できる。

【0137】

所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を伝播できる宿主細胞は、昆虫（例えば、Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、 Fleer, R., Current Opinion in Biotechnology, 3(5):486496 (1992) によって概説されているような、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ．、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、真菌及び植物細胞を包含する非哺乳類真核細胞も包含する。Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓのようなある特定の原核生物も意図されている。

【0138】

所望の融合タンパク質をコードする核酸を宿主細胞をトランスフェクトする標準的な技術によって、宿主細胞内へ導入することができる。用語「トランスフェクトする」又は「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウィルス形質導入及び／又は組み込みを包含する、核酸を宿主細胞内へ導入する全ての従来技術を包含するように意図されている。宿主細胞をトランスフェクトする適切な方法は、前記のSambrook et al. 及びその他の実験用教科書に見出せる。

【0139】

各種のプロモーター（転写開始調節領域）を本発明に従って用いることができる。適切なプロモーターの選択は提案された発現宿主に依存している。それらが選択された宿主内で機能する限り、異種起源由来のプロモーターを用いることができる。

【0140】

プロモーター選択はペプチド又はタンパク質産生の望ましい効率及びレベルにも依存している。ｔａｃのような誘導可能なプロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてタンパク質発現のレベルを劇的に増大するためによく用いられている。タンパク質の過剰発現は宿主細胞に害を及ぼす。従って、宿主細胞生育を制限する可能性がある。誘導可能なプロモーター系の使用は遺伝子発現の誘導前に宿主細胞を受容可能な密度に培養されるようにするので、より高い産物収率を促す。

【0141】

本発明に従って各種シグナル配列を用いることができる。生物活性ポリペプチドをコードする配列と同族のシグナル配列を用いることができる。あるいは、発現宿主における効率的な分泌及びプロセスのために選択又は設計されたシグナル配列も用いることができる。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞の組み合わせは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中に分泌するためのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓａｃＢシグナル配列と、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ α−交配因子又はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ分泌のためのＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列を包含する。シグナル配列はタンパク質をコードする配列とシグナルペプチダーゼ開裂部位をコードする配列を介して又は通常１０未満のコドンからなる短いヌクレオチド架橋を介して直接結合してもよく、ここでこの架橋は下流のＴＣＲ配列の正確なリーディングフレームを保証する。

【0142】

転写及び翻訳を増強する要素は真核タンパク質発現系に対して確認されている。例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを異種プロモーターのどちらかの側に位置づけることは、植物細胞における転写レベルを１０〜４００倍まで上昇できる。発現構築物は適切な翻訳開始配列を包含するべきである。適切な翻訳開始のためにコザックコンセンサス配列を包含するように発現構築物を改変することは、翻訳のレベルを１０倍まで増大できる。

【0143】

選択マーカーがよく用いられ、マーカーを目的の遺伝子とは異なる位置に結合できるように、これは発現構築物の１部であるか又はそれから分離している（例えば、発現ベクターで遂行される）。例は、抗生物質に対して耐性をもたらす（例えば、ｂｌａはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞についてのアンピリシンに対する抵抗をもたらし、ｎｐｔＩＩは各種の原核及び真核細胞についてのカナマイシン耐性をもたらす）か又は宿主の最少培地での生育を可能にする（例えば、ＨＩＳ４はＰ．ｐａｓｏｒｉｓ又はＨｉｓ⁻Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのヒスチジン不在での生育を可能にする）マーカーを包含する。選択可能マーカーはマーカーの他に依存しない発現を許容するそれ自身の転写及び複写開始及び終止調節領域を有している。マーカーとして抗生物質耐性を用いる場合、選択用の抗生物質の濃度が、抗生物質に応じて、一般に、培地１ｍＬ当り抗生物質１０〜６００μｇの範囲で変化するだろう。

【0144】

発現構築物は公知の組み換えＤＮＡ技術を用いて構成される（Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1999）。制限酵素消化及びライゲーションはＤＮＡの２つの断片を結合するために用いる基本的な工程である。ＤＮＡ断片の末端はライゲーションの前に改変を必要とすることがあり、これは突出部に埋めること、ヌクレアーゼ（例えば、ＥｘｏＩＩＩ）で断片の末端部分を欠失すること、部位特異的突然変異、又はＰＣＲで新規な塩基対を加えることによって達成できる。選択された断片の結合を促進するためにポリリンカー及びアダプターを用いることができる。発現構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉの一連の制限、ライゲーション、及び形質転換を用いて段階的に構成化される。発現構築物の構築のために適している多数のクローニングベクターは当該技術分野において公知であって（λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ ＳＫ−１、Stratagene, La Jolla, CA, pET, Novagen Inc., Madison, WI、 Ausubel et al., 1999 で引用されている）、特定の選択は本発明に重要ではない。クローニングベクターの選択は、発現構築物の宿主細胞内への導入のために選択された遺伝子導入系に影響を受けるだろう。各段階の終わりに、得られた構築物を、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリダイゼーション及びＰＣＲ分析で分析できる。

【0145】

発現構築物を宿主内で線状又は環状の何れかのクローニングベクターとして形質転換するか、又はクローニングベクターから除去してそのまま用いるか、若しくは送達ベクター上に導入することができる。送達ベクターは選択された宿主細胞型中への発現構築物の導入及び保持を促進する。発現構築物は多数の公知遺伝子導入システム（例えば、自然の形質転換受容性、化学的媒介形質転換、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、遺伝子銃形質転換、トランスフェクション、又は接合）（Ausubel et al., 1999; Sambrook et al., 1989）の何れかによって宿主細胞内へ導入される。遺伝子導入システムは用いられた宿主細胞及びベクターシステムに応じて選択される。

【0146】

例えば、発現構築物を、プロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓ内に導入することができる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓのエレクトロポレーションは容易に達成されて、スフェロプラスト形質転換に匹敵する形質転換効率を生じる。

【0147】

本発明は更に、目的の融合タンパク質を単離するための製造工程を提供する。この工程では、調節配列と操作可能に結合している目的のタンパク質をコードする核酸がその中に導入されている、宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）は培養倍地中で生産規模に生育させて目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激する。続いて、採取した宿主細胞から又は培養培地から目的の融合タンパク質を単離する。標準的なタンパク質精製技術を、培地又は採取した細胞から目的のタンパク質を単離するために用いることができる。特に、精製技術は、回転ボトル、撹拌フラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、又は発酵槽を包含する各種の実行から、大規模で（例えば、少なくともミリグラム量で）所望の融合タンパク質を発現及び精製するために用いることができる。

【0148】

発現されたタンパク質融合複合体は公知の方法で単離及び精製できる。典型的には、培養培地を遠心分離又はろ過し、次いで上澄液を親和性又は免役親和性クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧ親和性クロマトグラフィー、又は結合したＴＣＲ若しくはその免疫グロブリン領域のような発現された融合複合体と結合するモノクローナル抗体の使用を含む免役親和性プロトコルにより精製する。本発明の融合タンパク質は公知技術の適切な組合わせによって分離及び精製できる。これらの方法は、例えば、塩析沈殿及び溶媒沈殿のような溶解性を利用する方法；透析、限外ろ過、ゲルろ過、及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量の差を利用する方法；イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法及び等電点電気泳動のような等電点の差を利用する方法、Ｎｉ−ＮＴＡのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関する開示については、前記のSambrook et al. 及び Ausubel et al. を概して参照されたい。

【0149】

本発明の融合タンパク質が実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質が少なくとも８０％、又は９０％〜９５％の均質性（ｗ／ｗ）であるように、融合タンパク質が細胞に自然に付随している細胞置換分から単離されていることが好ましい。少なくとも９８％〜９９％の均質性を有している融合タンパク質は、多くの医薬、臨床及び研究適用に対して最も好ましい。実質的に精製されると融合タンパク質は治療適用のために、夾雑物を実質的に含まないはずである。部分的に又は実質的純粋にまで精製されると、可溶性融合タンパク質を治療的に、又は本明細書に記載されているようなインビトロ又はインビボでのアッセイの実施に用いることができる。実質的な純度はクロマトグラフィー及びゲル電気泳動のような各種標準技術によって確認できる。

【0150】

本発明の可溶性ＴＣＲ融合複合体は、ＴＣＲ融合複合体が発現後に培養培地に分泌され得るように十分に切断されているＴＣＲドメインを含有している。従って、切断されたＴＣＲ融合複合体は疎水性残基に富んだ領域、典型的にＴＣＲ分子の膜貫通及び細胞質性ドメインを包含しない。従って、例えば、本発明の好ましい切断型ＴＣＲ分子に関しては、ＴＣＲ分子のβ鎖のおよそ最後のシステインからＣ末端及びα鎖のおよそ最後のシステインからＣ末端が切断型ＴＣＲ融合複合体中に含まれていないことが好ましい。

【0151】

本発明の融合タンパク質複合体は癌性である又は感染している、或いは１つ又はそれ以上の病気に感染するかもしれない各種細胞を用いるインビトロ又はインビボでの使用に適している。

【詳細な説明】

【0152】

ヒトのインターロイキン−１５（ｈＩＬ−１５）は抗原提示細胞上に発現されたヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）によって免疫エフェクター細胞にトランス提示されている。ＩＬ−１５Ｒαは、主に細胞外ｓｕｓｈｉドメイン（ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ）を介して、高い親和性（３８ｐＭ）でＩＬ−１５に結合する。ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕドメインを複数ドメイン融合複合体を構築するための骨格（スカフォールド）として用いることができることをここで明らかにする。２価及び二重特異性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合複合体の両方をこのスカフォールドを用いてｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕ鎖のＮ末端と融合している各種一本鎖（ｓｃ）ＴＣＲドメインの組み合わせを介して形成した。これらの融合体において、ｓｃＴＣＲドメインは抗原結合活性を保持してｈＩＬ−１５ドメインは受容体結合及び生物活性を示す。２価ｓｃＴＣＲ融合体は増大した分子結合力に起因する改善された抗原結合能力を示す一方、２つの異なったｓｃＴＣＲドメインを含有している融合体は２つの同種ペプチド／ＭＨＣ複合体と結合する能力があった。ｓｃＴＣＲ及びｓｃＣＤ８αβドメインを含有している二重特異性ドメインも２価或いは１価のｓｃＴＣＲ分子よりも同族ペプチド／ＭＨＣ複合体との有意に優れている結合を示して、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒαスカフォールドが複数ドメインの所定の標的との相互作用をサポートするのに必要な柔軟性を示すことを明らかにした。驚くべきことに、機能性ＴＣＲは、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕドメインとの融合体として別々にＴＣＲα及びβ鎖を同時発現させることによっても形成できた。最後に、融合したｈＩＬ−１５ドメインを部位特異的突然変異によって操作してスーパーアゴニスト又はアンタゴニストサイトカイン活性をもたらすことができた。同時に、これらの特性は、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５Ｒαドメインを新規な標的免疫分子を作成するための多用途で機能的なスカフォールドとして用いることができることを示している。

【0153】

ＩｇＧドメイン、特にＦｃ断片は、承認された生物製剤を含む多数の治療用分子のための二量体のスカフォールドとして成功裏に用いられている。例えば、エタネルセプトはヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに結合している可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量体化は、エタネルセプトがＴＮＦα活性の阻害を一量体のｓＴＮＦＲより１，０００倍まで強力にすることを可能にして、そして一量体形態より５倍長い血清半減期を有する融合体を提供する。結果的にエタネルセプトはインビボにおけるＴＮＦαの炎症誘発活性を中和して多数の異なった自己免疫適応症について患者の予後を改善するのに効果的である。

【0154】

その二量体化活性に加えて、Ｆｃ断片は、天然のキラー細胞（ＮＫ）、好中球、食細胞及び樹状細胞上に提示されるＦｃγ受容体との相補活性及び相互作用を介して細胞毒性エフェクター機能ももたらす。抗癌治療用抗体及びその他の抗体ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質との関連では、これらの活性は、動物の腫瘍モデル及び癌患者で観察された効果に重要な役割を果たしているようだ。しかし、これらの細胞傷害性エフェクターの応答は多くの治療適用において十分ではないかもしれない。従って、Ｆｃドメインのエフェクター活性を改善して拡張すること、並びにＴ細胞活性を含む、細胞溶解性免疫応答を標的治療分子を介して疾患部位で採用するその他の方法を開発することにかなりの関心がもたれている。ＩｇＧドメインは、二重特異性抗体を形成するためのスカフォールドとして用いて、従来のハイブリドーマ融合技術によって作成された産物を質的及び量的に改善している。この方法はその他のスカフォールドの欠点を回避するが、臨床的開発及び使用をサポートするのに十分なレベルで二重特異性抗体を哺乳動物細胞内で産生するのは困難である。

【0155】

新規な、ヒト由来免疫刺激性多量体スカフォールドを開発する目的で、ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインの使用に焦点を合わせた。ｈＩＬ−１５は、高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）〜１０^ー１１Ｍ）でｈＩＬ−１５受容体α鎖（ｈＩＬ−１５Ｒα）と結合するサイトカインの短い４本α螺旋束ファミリーの一員である。次いで、得られる複合体をＴ細胞及びＮＫ細胞表面上に表示されているヒトＩＬ−２／１５受容体β／共通γ鎖（ｈＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体とトランスに提示する。このサイトカイン／受容体相互作用はエフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の拡張及び活性化を引き起こし、これがウィルス感染及び悪性腫瘍細胞を撲滅するために重要な役割を果す。正常には、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５Ｒαは樹状細胞内で同時に産生されて細胞内で複合体を形成し、これは続いて分泌されて細胞表面上にヘテロ二量体として提示される。従って、ｈＩＬ−１５とｈＩＬ−１５Ｒαの相互作用の特徴が、これらの鎖間結合ドメインが新規なヒト由来免疫刺激性スカフォールドとして働いて標的特異的結合が可能な可溶性二量体分子を作成することを示唆している。本明細書に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ８結合ドメインを含んでいる多数の融合タンパク質の作成及び特性を記載して、標的抗原に対する増大した機能的結合親和性を有する可溶性ホモ二量体及び多部位特異的タンパク質複合体のためのヘテロ二量体の両方を作成するためにｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５Ｒαスカフォールドの使用の可能性を明らかにする。これらの融合タンパク質が免疫エフェクター細胞応答の刺激を可能にする強力なｈＩＬ−１５活性を保持していることも示した。

【0156】

本明細書で、新規な、二量体分子を作成するためのｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕをベースとするスカフォールドの使用の可能性を明らかにする。二量体融合タンパク質複合体はそのｈＩＬ−１５ドメイン及び結合ドメインの免疫刺激性及び標的特異的生物活性を保持して、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５Ｒαの付加が融合ドメインの空間的配置を著しく変更しないこと、及びサイトカイン活性に影響を及ぼさずに適度の構造的柔軟性をもたらすことを示唆した。従って、このスカフォールドは、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体のような、多価融合複合体を形成して、分子、又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｃ１４９ｓｃＴＣＲヘテロ二量体のような、二重特異性分子の全体的結合親和性を増大するために用いることができる。全ての場合で、可溶性融合タンパク質は組み換えＣＨＯ細胞培養で比較的高いレベルで産生されて広範囲の細胞株スクリーニング及び最適化を行わずに細胞培養上澄液中にリットル当り数ミリグラム）、そして細胞培養上澄液から容易に精製できた。ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕをベースとするスカフォールドの有用性が、ポリペプチド鎖２本の細胞外ドメインをｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕのＮ末端と融合することにより、α／βＴＣＲのような可溶性、生物活性、２本鎖分子を作成するために、拡張できたことも明らかにした。この形態が、恐らくｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体の遠位Ｎ末端と融合している相互に折り込まれたＴＣＲα／βと複合体の中間部に位置するｈＩＬ−１５ＲβγＣ結合部位との間の立体障害に起因している、ｈＩＬ−１５活性の中等度の減少をもたらした。その他の形態も可能で従来の方法を用いて作成することができる。

【0157】

ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕをベースとするスカフォールドは、ＣＤ８α／β及びＴＣＲドメインが同じｐＭＨＣＩ複合体と結合可能であるが空間的に異なった位置にある、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体を作成するために用いることもできる。可溶性ｐＭＨＣＩ試薬を用いる先の検討は、ＣＤ８がオフ速度及びオン速度の両方への影響を介して細胞表面でのＴＣＲ：ｐＭＨＣＩ相互作用を安定化して増大することを確認している。ｐＭＨＣＩ特異的Ｔ細胞の活性化に対するＣＤ８の要件がＴＣＲ：ｐＭＨＣＩ親和性と逆相関するように、Ｔ細胞のＣＤ８コレセプター活性への依存性を確認する際にこの効果は重要である。しかしながら、可溶性の精製したＣＤ８α／β、ＴＣＲ及びｐＭＨＣＩタンパク質を用いる幾つかの結合研究は、ＴＣＲ：ｐＭＨＣＩ相互作用がＣＤ８の存在又は非存在による影響を受けないことを示して、共同結合効果を示唆しなかった。

【0158】

ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体を用いる細胞に基づくＳＰＲ結合研究の結果は、これら先の報告とは著しく異なって、同じ可溶性分子上に提示されたＴＣＲ及びＣＤ８ドメインが、１価又は２価ＴＣＲドメインを担持している分子で観察されたよりもより優れたペプチド／ＭＨＣ結合活性を示したことを明らかにしている。この効果は、Ｔ細胞上でのＣＤ８及びＴＣＲ分子へのｐＭＨＣＩ結合に関する観察と一致して、ｐＭＨＣＩ：ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体複合体のより遅いオフ速度及びより速いオン速度の両方に反映される。従って、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体はＴ細胞上のＯＴ１ ＴＣＲの結合を模倣し、これがＣＤ８コレセプター活性のｐＭＨＣへの強い依存性を示す。これらの結果は、ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体及びこの分子の変異体が無細胞系における第三級のＴＣＲ：ｐＭＨＣＩ：ＣＤ８複合体間の分子間相互作用を更に切断するための非常に有用なツールとして機能することを示唆している。また、増強されたｐＭＨＣＩ結合活性を有するｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体ベースの試薬は、結合活性を増大するためにＴＣＲドメインを突然変異させる必要なしで、病的細胞上の抗原提示を検出するのに有用である。

【0159】

ＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合体に関するＳＰＲ実験の結果は、１価ＯＴ１ ＴＣＲα／βヘテロ二量体の固定化ＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体への結合親和性がほぼ６μＭであることが示されている Alam et al. によって報告されたものと異なっている。この実験では、３０μＭの明確なＫＤを示したＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ単量体及びＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｒｉＡ二量体のＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ結合を検出できなかった。１本鎖Ｖα−リンカー−Ｖβ−Ｃβ分子として形成されると、ＯＴＩ ＴＣＲは結合活性を欠失する可能性がある。しかし、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｒｉＡと２本鎖構築物を比較して同等の活性を観察した。更に、先の研究は、ＣＤ８結合を無効にするＫｂ突然変異を有するＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ四量体が、高濃度の四量体を用いたときでさえ、ＯＴ１ ＴＣＲ担持細胞への特異的結合活性を殆ど或いは全く示さないことを明らかにして、ＯＴ１ ＴＣＲとその同族ｐＭＨＣＩの間の非常に低い親和性相互作用を示唆している。対照的に、ＣＤ８結合突然変異がないＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ四量体は、本研究で観察されたＣＤ８のＯＴ１ ＴＣＲ結合活性を増強する能力と一致して、ＯＴ１ ＴＣＲ担持細胞を色鮮やかに染色することが可能であった。

【0160】

ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕをベースとするスカフォールドは、ＩｇＧスカフォールドのＦｃドメインとほぼ同様に多価又は多重特異的の標的治療薬を作成するために利用できる。エフェクターＮＫ及びＣＤ８^＋記憶Ｔ細胞の増殖及び活性化を刺激するその強力な活性を用いて、ｈＩＬ−１５ドメインは抗体依存性の細胞傷害性及びＩｇＧに基づく手法に関連する相補体活性化を越えて、潜在的な免疫治療メカニズムの範囲を拡大する。ＩｇＧ分子のＦｃドメインの活性を操作するために用いられているものと同様の手法を用いて、ＩＬ−１５ドメインが、その機能的活性を増大又は減少するように突然変異できることを明らかにする。ＩＬ−１５ドメインにＮ７２Ｄ突然変異を含んでいるｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ融合分子が生物活性の３〜４倍の増加を示す一方で、ＩＬ−１５Ｄ８Ｎ突然変異は殆ど又は全く活性を表わさないことが示される。ＩＬ−１５スーパーアゴニストに基づく融合タンパク質は癌又は感染性疾患のための標的免疫治療薬として役立つ一方、疾患部位でＩＬ−１５応答細胞を阻害できるＩＬ−１５アンタゴニストは、同種移植拒絶反応及び炎症性自己免疫疾患、特に記憶ＣＤ８Ｔ細胞が疾患病状の一因となっている場合の治療における治療可能性を有している。非標的ＩＬ−１５突然変異／Ｆｃγ２ａアンタゴニストタンパク質は、実験動物モデルにおける膵島及び心臓同種移植の拒絶反応の抑制及び関節炎の発症及び進行を予防するのに有効であることが既に示されている。ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ融合タンパク質に関連しているＩＬ−１５アンタゴニストドメインを用いる同様のアプローチが可能である。さらに、ある特定の状況下では、多量体分子を作成するために機能的に不活性なスカフォールドを有することが望ましい。例えば、ＩＬ−１５Ｒβγとの相互作用を除去する１Ｌ−１５Ｄ８Ｎ突然変異を含んでいるｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ融合体がＩＬ−１５受容体複合体を提示する細胞の優れたＴＣＲ抗原特異的染色をもたらすことを見出した。

【0161】

本明細書における説明の目的のために標的ドメインとしてＴＣＲ及びＣＤ８分子に焦点を合わせているが、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドを、抗体、接着分子、又はその他の受容体に由来するタンパク質ドメインを用いてその他の新規な分子を構築するために使用できることを理解されたい。結晶構造に基づいて改変に利用可能なｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕのＣ末端とのタンパク質ドメイン融合体を創出することも可能である。得られる分子は４つまでの異なった標的認識性能を有することができる。適切な融合パートナーを用いて、これらのタイプの分子は免疫エフェクター細胞と標的細胞の接合を促進して標的細胞の効果的な殺傷を達成できる。また、エフェクター細胞増殖及び細胞毒性をサポートする免疫刺激活性を提供することによって、複合体のＩＬ−１５ドメインはこれらの過程を更に補強できる。各種の多機能分子は、抗癌及び抗ウィルス免疫治療剤として用いるためにこの概念に基づいた。

【0162】

これまでは、標準的な哺乳類細胞における弱い発現レベルが治療薬としての組み換えｈＩＬ−１５の開発を制限していた。本明細書で明らかにしたように、臨床開発及び潜在的に商品化をサポートできるレベルでのｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体の発現を達成することができる。また、ＩＬ−１５Ｒα鎖が、メカニズムに縛られることなく、恐らくサイトカインの薬物動態を改善することによって、ｈＩＬ−１５のインビボ活性を増強することが示されている。ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体のこれら２つの特性は、その多価特質及び／又は多重特異性標的設計と組合わせて、癌及びウィルス感染症に対する免疫治療薬剤としてｈＩＬ−１５の最大の能力を得る機会をもたらしている。

【0163】

実施例に提供されているように、免疫グロブリンＦｃドメインを含有しているｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ融合タンパク質複合体は更なる利点を有することが見出された。Ｆｃドメインの結合が多価及び多重特異性相互作用が可能な多鎖分子の作成を許容する。実際に、同じｓｃＴＣＲの複数ドメインを含んでいる本発明の融合タンパク質複合体は二量体ｓｃＴＣＲ融合体の活性に基づいて予測されたものより増大した抗原結合活性を示した。ある場合では、本発明の融合複合体は、ＩＬ−１５ＲβγＣ担持免疫細胞とＦｃ受容体担持免疫細胞の両方を結合して活性化でき、強力な免疫刺激活性を許容する。２つのＩＬ−１５ドメインを含んでいる本発明のタンパク質融合複合体は、他のＩＬ−１５融合タンパク質と比較したときに想定されるよりも優れたＩＬ−１５活性を示すことが分かった。更に、本発明のタンパク質融合複合体は、ペプチド／ＭＨＣ提示標的細胞に対する抗体Ｆｃ依存性細胞傷害性を介在することにおいてＴＣＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質よりもより有効であった。改善された活性は、タンパク質融合複合体のペプチド／ＭＨＣ複合体との増強された結合及び／又はＦｃ受容体又はＩＬ−１５受容体を提示するエフェクター細胞との増大した反応性の結果であるかもしれない。更に、突然変異生成分析によって、融合タンパク質複合体のＴＣＲ、ＩＬ−１５及びＩｇＧＦｃドメインのそれぞれがその結合及び機能活性を変化させるように容易に且つ独立して操作されて望ましい生物学的効果を有する多重特異的複合体をもたらすことが分かった。

【0164】

本発明の融合タンパク質複合体は、遊離のＩＬ−１５より有意に優れた薬物動態プロファイルを有していることが明らかにされた。また、異なった分析方法で観察された類似したＰＫプロファイルに基づくと、融合タンパク質複合体はポリペプチド鎖解離又は切断の証拠を有していない多鎖分子としてインビボで無傷のままである。更に、本発明の融合タンパク質複合体は動物において標的担持及び非標的担持腫瘍の両方に対する抗腫瘍活性を介在できることが示され、そして等モル用量を投与したｒｈＩＬ−１５よりもより強力な抗腫瘍効果を示した。また、融合タンパク質の有効用量による治療はこれらの動物モデルで良好な耐性を示した。

【実施例】

【0165】

実施例１− ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ−ｈｕＩｇＧ１及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ遺伝子融合体を含有している発現ベクターの構築。
Ｔ２分子（Ｔ２Ｍ）と呼ばれる融合タンパク質は多鎖ポリペプチドから成っている（図１）。本発明の一実施態様では、これらのポリペプチドの１つは、国際特許公開第ＷＯ２００８１４３７９４号公報（参照により本明細書に取り込まれている）に開示されているようにタンパク質結合ドメインとＩＬ−１５（又ＩＬ−１５変異体）の間の融合を含んでいる。Ｔ２の第２ポリペプチドはタンパク質結合ドメイン、ＩＬ−１５Ｒαドメイン及び免疫グロブリンドメインの間の融合を含んでいる。或いは、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質は、更に免疫グロブリンドメインと結合してもよい。好ましい免疫グロブリンドメインは他の免疫グロブリンドメインと相互作用して多鎖タンパク質を形成できるようにする領域を含んでいる。例えば、ＩｇＧ１、Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３のような、免疫グロブリンの重鎖領域は相互作用してＦｃ領域を作成できる。好ましい免疫グロブリンドメインはＦｃ受容体又は相補体タンパク質結合活性を包含する、エフェクター機能を有し、そして又はグリコキシル化部位を有する領域も含んでいる。ある実施態様では、Ｔ２分子の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は相補体の結合活性若しくはグリコキシル化を減少又は補強して、それにより得られるタンパク質の生物活性に影響を及ぼす突然変異を含んでいる。例えば、Ｆｃ受容体との結合を減少する突然変異を含んでいる免疫グロブリンドメインはＦｃ受容体担持細胞に対する低い結合活性を有するＴ２分子を作成するために用いることができ、これはＴＣＲ−特異抗原を認識又は検出するように設計された試薬に対して有利であろう。

【0166】

ヒトＩＬ−１５Ｒαｓｕｓｈｉドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ）及びヒトＩｇＧ１定常領域（ｈｕＩｇＧ１Ｃ_Ｈ１−Ｃ_Ｈ２−Ｃ_Ｈ３）と融合しているｐ５３（ａａ２６４−２７２）１本鎖ＴＣＲ（ｃ２６４ｓｃＴＣＲと呼ぶ）を含有している発現ベクターの構築を以下のように実施した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１遺伝子断片を先に構築したｐＮＥＦ３８−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ベクターからＰａｃＩ及びＭ１ｕＩで制限消化して除去した。遺伝子断片をゲルで精製し、同じ制限酵素で消化したｐＭＳＧＶベクターにライゲートして、ｐＭＳＧＶ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１と呼ぶ構築物をもたらした。ＣＭＶプロモーターを含有しているＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１から精製し、続いてＮｒｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この断片を、ＰａｃＩで消化してあるｐＭＳＧＶ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１内にライゲートして、ＤＮＡポリメラーゼで充填して平滑末端を作成した後ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。得られた構築物をｐＭＣ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１と称した。先に構築された、ｐＮＥＦ３８−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ（国際公開第ＷＯ２００８１４３７９４号公報を参照されたい）由来のｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子断片をフロントプライマー：
５’−ＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＣ−３’（配列番号６）
及びバックプライマ−：
５’−ＴＧＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧ−３’（配列番号７）
を用いて、次のＰＣＲ条件下でＫＯＤ ＨＯＴ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ）によって増幅した：９５Ｃ、２分、１サイクル；９５Ｃ、２０秒、６５Ｃ、２０秒；７０Ｃ、２０秒、３５サイクル；７２Ｃ、１０分、１サイクル。ヒトＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子のＰＣＲ産物をゲルで精製してＥｃｏＲＩで消化した。この遺伝子をＥｃｏＲＩで消化してあるｐＭＣ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１内にライゲートした。ヒトＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉドメインをコードするＤＮＡ断片のｐＭＣ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１内へのクローニングは以下の配列を含んでいるｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ−ｈｕＩｇＧ１融合遺伝子をもたらした：３’−免疫グロブリン重鎖リーダー−２６４ＴＣＲ Ｖ-α−ペプチドリンカー−２６４ＴＣＲ Ｖ-β−ヒトＴＣＲ Ｃ-β−ヒトＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−ヒトＩｇＧ１重鎖。図２に示されている、正確なヒトＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子挿入を含有している得られたベクター（ｐＭＣ．ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−Ｓｕ／ＩｇＧ１．ＰＵＲ）を診断ＰＣＲに基づいて同定し、そしてＤＮＡシークエンシングで再確認した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１遺伝子及びタンパク質はそれぞれ図３及び図４に示される。

【0167】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−ｈｕＩｇＧ１遺伝子融合を含有している異なった発現ベクター（内在ＥｃｏＲＩ部位（及び対応するコード配列）を欠失している）を構築した。このベクターのために、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ遺伝子断片の部分をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ベクターから、フロントプライマー：
５’ＧＴＡＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧ３’（配列番号８）
及びバックプライマー：
５’ＣＴＴＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ３’（配列番号９）
を用いて増幅した。

【0168】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ遺伝子断片のＴＣＲβ定常領域の残りの部分をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ベクターから、フロントプライマー：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号１０）
及びバックプライマー：
５’ＧＡＧＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣ３’（配列番号１１）
を用いて増幅した。

【0169】

ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子断片をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉベクターから、フロントプライマー：
５’ＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＴＧ３’（配列番号１２）
及びバックプライマー：
５’ＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＣ３’（配列番号１３）
を用いて増幅した。

【0170】

ｈｕＩｇＧ１重鎖定常領域遺伝子断片をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ベクターから、フロントプライマー：
５’ＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＡＴＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ３’（配列番号１４）
及びバックプライマー：
５’ＧＴＡＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ３’（配列番号１５）
を用いて増幅した。

【0171】

ＴＣＲβ定常領域配列及びｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ遺伝子を含有している得られた産物を鋳型として用いて、フロントプライマー：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号１０）
及びバックプライマー：
５’ＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＣ３’（配列番号１３）
を用いるＰＣＲによって遺伝子断片を作成した。

【0172】

得られたＰＣＲ産物及びｈｕＩｇＧ１遺伝子断片は、フロントプライマー：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号１０）
及びバックプライマー：
５’ＧＴＡＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ３’（配列番号１５）
を用いるＰＣＲによってＴＣＲβｃ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１融合遺伝子を作成するための鋳型の役割を果した。

【0173】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ ＰＣＲ産物をＰａｃＩ及びＨｐａＩで消化して、ＴＣＲβｃ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１融合遺伝子をＨｐａＩ及びＮｓｉＩで消化した。消化した遺伝子断片をＣＭＶプロモーターを含有しているｐＭＳＧＶレトロウィルスベクター内にライゲートした。得られたベクターをｃ２６４ｓｃＴＣＲ／Ｓｕｓｈｉ／ｈＩｇＧ１−ｐＭＳＧＶ又はｐＭＳＧＶｃ２６４ＳｕＩｇと表した（図５）。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１遺伝子及びタンパク質の配列は、それぞれ図６及び図７に示される。

【0174】

１本鎖ＴＣＲ結合ドメイン（すなわち、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ）とＩＬ−１５（又はＩＬ−１５変異体）の融合を産生する発現ベクターの作成は国際公開第ＷＯ２００８１４３７９４号公報に開示されている。特に有用なＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５の生物活性を減少若しくは消去するもの又はＩＬ−１５の生物活性を増大するものである。例えば、７２位を置換した（すなわち、Ｎ７２Ｄ置換）ヒトＩＬ−１５変異体はＩＬ−１５の生物活性を５〜１０倍増大できる。ＩＬ−１５変異体は以下の表に提供される。

【0175】

【表1】

【0176】

すぐ上の図に記載されているＩＬ−１５変異体を含有している融合タンパク質複合体を、ＴＣＲ特異的抗原である、ｐ５３（ａａ２６４−２７２）／ＨＬＡ−Ａ２．１と結合するそれらの能力について特徴付けた。ｐ５３（ａａ２６４−２７２）／ＨＬＡ−Ａ２．１を提示する細胞を生成するために、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性Ｔ２細胞（２×１０^６／ｍＬ）に２０μＭのｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチドを、１×ＰＬＥ（Altor Bioscience) の存在下３７℃で２〜３時間負荷した。ペプチドで培養されなかったＴ２細胞及びＩＬ−２／１５Ｒβγｃを発現する３２Ｄβ細胞をコントロールに供した。次いで、ｐ５３ペプチド負荷Ｔ２細胞、コントロールＴ２細胞、又は３２Ｄβ細胞（２×１０^５／１００μＬ）を次の二量体融合タンパク質複合体３２０ｎＭと４℃で３０分間培養した：
１）ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ、
２）ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｄ８Ａ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ、及び
３）ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｄ８Ｎ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ。
１６０ｎＭの精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲｈｕＩＬ１５融合タンパク質及び１６０ｎＭの精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ融合タンパク質を４℃で３時間培養して、これらの複合体を生成した。次いで染色する、細胞を洗浄緩衝液（０．５％のＢＳＡと０．０５％のアジ化ナトリウムを含有しているＰＢＳ）で１度洗浄して、０．５μｇのビオチニル化マウスモノクローナル抗ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体（ＢＦ１）で１００μＬの洗浄緩衝液中、４℃で３０分間染色した。細胞を１度洗浄して、０．５μｇのＲ−フィコエリトリン共役ストレプタビジンで１００μＬの洗浄緩衝液中、４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄してフローサイトメトリーで分析するために再懸濁した、

【0177】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｄ８Ａ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ複合体及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｄ８Ｎ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ複合体は、ｐ５３ペプチド負荷Ｔ２細胞を特異的に染色することに関して、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｄ８Ｎ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉと同等の活性を示した。これらの結果は、これらの融合複合体のそれぞれにおいて多価ｓｃＴＣＲドメインが十分に機能的であることを示している。ＩＬ−１５変異体（Ｄ８Ａ及びＤ８Ｎ）を含有している融合タンパク質複合体は３２Ｄβ細胞上に存在している１Ｌ−１５Ｒβγ_ｃ受容体との結合活性を示さない。１Ｌ−１５Ｒβγ_ｃ受容体結合の同様な検討をＩＬ−１５変異体を含有しているその他の融合タンパク質を用いて実施して表１に要約した。結果は、ＩＬ−１５変異体を含有している本発明の融合タンパク質及び融合タンパク質複合体がペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する活性を保持して、１Ｌ−１５Ｒβγ_ｃ受容体との結合活性の減少又は増大を示すことを示唆している。

【0178】

ある特定のＴ２分子に関しては、１Ｌ−１５及びＩＬ−１５Ｒα成分と融合した複数の異なった結合ドメインを有することが有用である。このような分子の活性を説明する一例では、ＨＬＡ−Ａ２と関連して提示されるｐ５３（ａａ１４９−１５７）ペプチドに特異的な、１本鎖ＴＣＲドメイン（ｃ１４９ｓｃＴＣＲと呼ばれる）をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインと結合して、得られた融合タンパク質を、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質と同時に発現させて、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ結合ドメインを有する多鎖Ｔ２タンパク質を産生した。

【0179】

ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ遺伝子融合を生成するために、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ遺伝子断片（ＴＣＲ−α、リンカー、ＴＣＲ−β及びＴＣＲ−β定常断片）をｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１発現ベクターからフロントプライマー：
５’ＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣ３’（配列番号１６）
及びバックプライマー：
５’−ＣＴＴＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ−３’（配列番号９）
を用いて増幅した。

【0180】

ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ベクターのＴＣＲβ定常領域の残分をフロントプライマー：
５’ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号１０）
及びバックプライマー：
５’ＣＡＣＣＣＡＧＴＴＧＴＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣ３’（配列番号１７）
を用いて増幅した。

【0181】

ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ遺伝子をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ発現ベクターからフロントプライマー：
５’ＣＴＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧＡＴＴＴＧ３’（配列番号１８）
及びバックプライマー：
５’ＣＣＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＡＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧ３’（配列番号１９）
を用いて増幅した。

【0182】

ＴＣＲβ定常領域配列及びｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ遺伝子を含有している得られた産物を鋳型として用い、フロントプライマー：
５”ＣＴＧＧＴＧＧＧＴＴＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号１０）
及びバックプライマー：
５’ＣＣＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＡＡＴＣＣＧＧＡＴＣＡＴＴＡＡＧＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＡＴＴＴＧＧ３’（配列番号１９）
を用いるＰＣＲによって遺伝子断片を生成した。

【0183】

ｃ１４９ｓｃＴＣＲ ＰＣＲ産物をＰａｃＩ及びＨｐａＩで消化して、ＴＣＲβｃ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ ＰＣＲ産物をＨｐａＩ及びＢｓｔＢＩで消化した。消化した遺伝子断片をＣＭＶプロモーター含有ｐＭＳＧＶレトロウィルスベクター内にライゲートした。得られたベクターをｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ−ｐＭＳＧＶｎ又はｐＭＳＧＶ−ｃ１４９ＩＬ１５Ｎ７２Ｄと称した（図８）。ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ遺伝子及びタンパク質の配列をそれぞれ、図９及び図１０に示す。

【0184】

実施例２− 融合タンパク質を産生するトランスフェクトした宿主細胞株の生成。
発現ベクターを、いくつかの異なる形質転換、トランスフェクション又は形質導入方法によって多様な宿主細胞株内に導入することができる。このような一方法では、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（５×１０^５）を６ウェルのプレートに播種してＣＯ_２インキュベータ中で１晩培養した。細胞を、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合遺伝子を含有している発現ベクター５μｇで、１０μＬのＭｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１試薬（Mirus）を用いて製造会社のプロトコールに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後１日目に細胞を４ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Invitrogen）を用いて選択した。Ｇ４１８耐性細胞を増殖し、ＴＣＲ／ＩＬ１５融合タンパク質発現細胞を限界希釈法で３回サブクローンして産生細胞株を、捕獲抗体、抗ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体（ＢＦＩ）及び検出抗体であって既に記載されている（出願公開第ＷＯ２００８１４３７９４号公報を参照されたい）ビオチニル化抗ヒトＩＬ−１５抗体（ＢＡＭ２４７、R&D Systems）を用いるＴＣＲ及びｈｕＩＬ１５特異的ＥＬＩＳＡによって、培養培地中に分泌される可溶性融合タンパク質のレベルに基づいてスクリーニングした。次いで、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ産生細胞株を、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ−ｈｕＩｇＧ１融合遺伝子を含有している偽型レトロウィルスベクターで以下のようにして形質導入した。

【0185】

偽型レトロウィルスベクターを産生するために、ポリリジンをコーティングした１０ｃｍのディッシュ（BD Bioscience）内で２×１０^６個の２９３ＧＰパッケージング細胞をＣＯ_２インキュベーター内で２日間３７℃で培養した。次いで、細胞に、リポフェクタミン２０００（Invitrigen）を用いて、９μｇのプラスミドｐＭＣ−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及び４μｇのＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードするプラスミドｐＭＤ−Ｇを同時導入した。トランスフェクション後４８時間目に、ウィルスを含有している上澄液を採取して、０．４５μＭのフッ化ポリビニリデンフィルターを通過させて細胞残屑を除去した。１０μｇ／ｍｌのポリブレン（Sigma-Aldrich）の存在下でウィルスを ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ産生細胞（６ウェルプレート中、１×１０^５細胞／ウェル）に適用した。形質導入後２日目に、細胞を１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択した。ピューロマイシン及びＧ４１８耐性細胞を増殖し、Ｔ２融合タンパク質複合体発現細胞を限界希釈法で３回サブクローンして、産生細胞株を、捕獲抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch）、及び検出抗体であるビオチニル化抗ヒトＩＬ−１５抗体（ＢＡＭ２４７、R&D Systems）でｈｕＩｇＧ１／ｈｕＩＬ１５特異的ＥＬＩＳＡを用いて、培養培地中に分泌される可溶性融合タンパク質のレベルに基づいてスクリーニングした。

【0186】

実施例３− Ｔ２融合タンパク質の生成及び精製。
ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１を発現する細胞株を生育条件（すなわち、小規模培養フラスコ、スピナー、若しくは撹拌フラスコ、又は大規模の中空繊維、ウェーブバッグ若しくは撹拌タンク生物反応器、又は同等の培養容器及び反応器中で、２５〜３７℃で５〜２８日間）下で培養して、培養培地中に可溶性タンパク質としてＴ２分子を産生した。Ｔ２分子を精製するために、培養培地をｐＨ調節してセファロースに共有結合させた抗ＴＣＲ抗体（ＢＦ１）を含有している免疫親和性カラムに付した。カラムを洗浄して、Ｔ２分子を０．５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で溶出した。溶出したタンパク質を濃縮して緩衝液をリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）に交換し、次いでｒプロテインＡ−セファロースカラムに付した。洗浄工程に続いて、タンパク質を０．５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で溶出し、次いでＰＢＳに緩衝液を交換した。得られたタンパク質をクーマシー−染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーで特性化した。

【0187】

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、精製したＴ２タンパク質は、ホモ二量体分子に予想される単一バンドに移動する精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１ΔＣＨ１融合タンパク質と比較して、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１成分に予想される分子量に対応する２つのポリペプチドバンドに移動した（図１１）。非還元変性条件下では、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１バンドは二量体ポリペプチドと一致する分子量に移動するのに対して、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄバンドはその単量体形態と一致していた。サイズ排除ゲルろ過クロマトグラフィーにより、天然のＴ２タンパク質は４本鎖（２×ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ、２×ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１）分子の予想される分子量で溶出された（図１２）。これらの結果は、図１に示すように、Ｔ２分子がｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉドメインの間の相互作用並びにｈｕＩｇＧ１間の共有結合相互作用に一致している多鎖構造を示すことを確認している。

【0188】

同様な哺乳動物細胞発現及び親和性クロマトグラフィー精製方法を本明細書に記載されているその他のＴ２タンパク質複合体を生成するために用いた。

【0189】

実施例４− Ｔ２分子の結合活性のインビトロでの特性化
Ｔ２分子のドメインの結合活性を特性化してこれらの活性をその他の融合タンパク質のそれと比較するためにインビトロアッセイを実施した。ＩｇＧ１ドメインを特性化するために、マイクロタイターウェルを抗ヒトＩｇＧ１抗体でコーティングして、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る、等モル量の精製したＴ２タンパク質、又は精製した ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なＥＬＩＳＡ条件下で抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いて検出した。

【0190】

図１３に示されているアッセイの結果は、Ｔ２分子のＩｇＧ１ドメインが、ＴＣＲ／ＩｇＧ１融合体の相当するドメインと同等の抗体結合活性を示し、Ｔ２ＩｇＧ１ドメインが生来の構造を保持することを示唆していることが明らかになった。Ｔ２分子のＴＣＲドメインを同様のアッセイで評価した。等モル量のＴ２又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質がＩｇＧ１ Ａｂでコーティングしたウェル上に捕獲されて抗ヒトＴＣＲ Ｃβ抗体（Ｗ４Ｆ）で検出された。

【0191】

図１４に示されているように、Ｔ２タンパク質は抗ＴＣＲ抗体に対して、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質より２倍高い反応性を示した。Ｔ２分子の４本鎖ＴＣＲ融合タンパク質組成物をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１融合体のホモ二量体組成物と比較すると、このことは予想される。Ｔ２分子のＴＣＲドメインのペプチド／ＭＨＣ結合活性を評価した。等モル量のＴ２（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質を抗ヒトＩｇＧ１ ａｂでコーティングしたウェルに捕獲して ｐ５３（ａａ ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ストレプタビジン−ＨＲＰ四量体で検出した。図１５に示すように、Ｔ２タンパク質は、ペプチド／ＭＨＣ試薬に対して、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質より３倍高い結合活性を示した。その構造及び抗ＴＣＲ Ａｂ反応性（図１４を参照されたい）に基づくとＴ２タンパク質はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１よりわずかに２倍高い結合活性を示すことが予測されるので、このことは予想外であった。従って、Ｔ２分子構造は、個々の成分に基づいて予測されるものよりもより優れた抗原特異的結合活性をもたらす。この増強した結合活性は、より小さい立体障害、優れた親和性効果、協調相互作用及び／又はＴＣＲドメインとペプチド／ＭＨＣ抗原の間の優れた構造適合の結果であろう。

【0192】

実施例５− Ｔ２ＩＬ−１５ドメインの生物活性の特性化
Ｔ２分子のＩＬ−１５ドメインの活性も評価した。マイクロタイターウェルを抗ヒトＩＬ−１５抗体でコーティングして、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る、精製したＴ２タンパク質、又は精製したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質の等モル量をウェルに適用した。結合及び洗浄工程に続いて、結合したタンパク質を標準的なＥＬＩＳＡ条件下で抗ヒトＩＬ−１５抗体で検出した。

【0193】

図１６に示したように、Ｔ２タンパク質は、それぞれのＴ２分子が２つのＩＬ−１５ドメインを含有しているという仮説に基づいて予測したように、抗ＩＬ−１５ Ａｂに対してｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合体と比較して増大した反応性（１．６倍高い）を示した。Ｔ２分子のＩＬ−１５ドメインの生物活性を、サイトカイン依存性３２Ｄβ細胞株を用いる増殖アッセイで更に特性化した。細胞増殖を測定するために、３２Ｄβ細胞（２×１０^４細胞／ウェル）を濃度を上昇させたＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質と３７℃で４８時間培養した。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche Applied Science）を製造会社の手順に従って、細胞生育の終わりの４時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるＷＳＴ−１の染色されたフォルマザン染料への変換を４４０ｎｍの吸収測定で確認した。

【0194】

図１７に示したように、Ｔ２タンパク質は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質より３倍優れた生物活性を示した。その構造及び抗ＩＬ−１５ Ａｂ反応性（図１６を参照されたい）に基づくと、Ｔ２タンパク質はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄより２倍だけ高いＩＬ−１５活性を示すと予測されるので、このことは予想外であった。これらの結果は共に、これらの成分単独では又は他の融合タンパク質形態と関連しては観察されなかったものより増大したＴＣＲ結合活性及びＩＬ−１５生物活性をもたらすＴ２分子形態の多くの利点を説明している。

【0195】

ＩＬ−１５応答免疫細胞の増殖を促進するＴ２タンパク質の能力を霊長動物モデルで試験した。カニクイザル（２頭、雄１頭、雌１頭）に精製したＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）０．５ｍｇ／ｋｇを静脈内に注射した。５日後に採血した血液をＣＤ８記憶Ｔ細胞マーカー（ＣＤ８及びＣＤ９５）及びＮＫ細胞マーカー（ＣＤ５６及びＣＤ１６）で染色して処置前に採取した血液と比較した。図１８に示すように、Ｔ２処置はＣＤ８^＋ＣＤ９５^＋記憶Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ１６^＋エフェクターＮＫ細胞（Ｂ）の増殖をもたらした。これらの結果はインビボで強力なＩＬ−１５活性を示しているＴ２分子と一致している。

【0196】

実施例６− Ｔ２ Ｆｃドメインの結合及び生物活性の特性化
Ｔ２分子のＩｇＧ１ Ｆｃドメインの結合活性を細胞結合アッセイで特性化した。Ｆｃガンマ受容体担持Ｕ９３７細胞を３３ｎＭのＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）と２０分間培養した。細胞を１度洗浄して、ＰＥ−共役ｐ５３（ａａ ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体と培養した。Ｕ９３７細胞表面上のＦｃガンマ受容体への結合を、図１９Ａに示すように、フローサイトメトリーで分析した。タンパク質の濃度範囲を用いる同様なＵ９３７結合試験も実施して、染色細胞に対する平均蛍光強度を図１９Ｂにプロットした。

【0197】

これらの検討の結果は、Ｕ９３７細胞が、対応するｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質よりＴ２分子によってより効果的に染色されることを示していて、Ｔ２分子のＦｃ受容体結合活性を検証した。Ｆｃドメインの生物活性を評価するために、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を介在するＴ２分子の能力を評価した。この検討では、０．１３７〜１００ｎＭのＴ２タンパク質、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）を９６ウェルプレートに添加した。ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２標的細胞を１０μＭのｐ５３ａａ２６４−２７２ペプチドでパルスして５０ｕｇ／ｍｌのカルセイン−ＡＭで標識化した。融合タンパク質をウェル当り１×１０^４標的細胞と混合して、１×１０^６／ウェルの新鮮なヒトＰＢＭＣを添加した。プレートをＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２時間培養し、１００μｌの条件培地を採取して、溶解細胞からのカルセイン放出を分析した。カルセインをＥｘ−４８５ｎｍ、Ｅｍ−５３８ｎｍ、及びカットオフ−５３０ｎｍで蛍光リーダーを用いて定量した。特異的な細胞溶解を次の式で算出した：特異的溶解＝[ｅｘｐ−（バックグラウンド−自動放出）]／[完全放出−（バックグラウンド−自動放出）]×１００％。Ｅｘｐ＝融合タンパク質＋Ｔ２細胞＋ＰＢＭＣ；バックグラウンド＝培地のみ；自動放出＝Ｔ２細胞のみ；完全放出＝Ｔ２細胞＋０．５％トリトンＸ−１００。

【0198】

データ点当り３通りに決定した結果を図２０に示してＴ２タンパク質の２つの異なったロットを特性化した。結果は、Ｔ２タンパク質が、ペプチド／ＭＨＣ提示標的細胞に対してＴＣＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質よりもより効果的にＡＤＣＣ様活性を介在することを示している。改善された活性は、Ｔ２分子のペプチド／ＭＨＣ複合体への増強された結合及び／又はＦｃ受容体又はＩＬ−１５受容体を提示しているエフェクター細胞との増大した反応性の結果であろう。

【0199】

実施例７− 細胞上に提示されたペプチド／ＭＨＣ複合体と結合するＴ２分子の特性化
Ｔ２タンパク質の細胞上のペプチド／ＭＨＣ標的との結合活性を評価するために、ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２細胞を各種の量のｐ５３ａａ２６４−２７２ペプチドでパルスした。次いで、細胞をそれぞれ８３ｎＭのＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１又はＡ２ＡＬ９ｓｃＴＣＲ／ＩｇＧ１（陰性コントロール）と培養した。細胞をビオチニル化抗ＴＣＲ Ａｂ（ＢＦ１）及びストレプタビジン−ＰＥと培養した。次いで、細胞を、図２１Ａに示すようにフローサイトメトリーで分析した。染色細胞に対する平均蛍光強度を図２１Ｂにプロットした。

【0200】

結果は、Ｔ２分子がｃ２６４ｓｃＴＣＥ／ｈｕＩｇＧ１融合タンパク質と比較して、細胞上のｐ５３ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を検出する増強された能力を表わすことを示す。これらの結果は、Ｔ２タンパク質が、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１融合よりもより効果的に標的細胞上の腫瘍関連ペプチド抗原と結合できることを示唆している。

【0201】

別のペプチド／ＭＨＣ標的に特異的なＴＣＲドメインを含有しているＴ２分子を用いて同様な結果が期待される。例えば、ヒト腫瘍関連タンパク質；ｐ５３、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、チロシナーゼ、スルビビン、ＷＴ１、ＰＲ１、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＥＧＦＲ、ＢＲＡＦ及びその他に由来する様々なペプチドがＨＬＡ分子に結合すること及びＴＣＲ相互作用を介するヒトＴ細胞応答に対する標的であることが知られている。更に、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＣ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ及びその他に由来するウィルスペプチド抗原を提示するＨＬＡ複合体に特異的なＴＣＲが同定されている。これらのＴＣＲは、ＩＬ−１５又はｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉタンパク質と融合でき、そして上記のような適切なペプチド負荷抗原提示細胞上でペプチド／ＭＨＣ反応性について特性化できる。

【0202】

実施例８− ２つの異なったＴＣＲドメインを担持しているＴ２分子の特性化
上で示したように、Ｔ２分子のＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα及びＩｇＧ成分と融合した複数の異なったＴＣＲドメインを有することは有用である。これは、１つ以上の抗原標的活性を単一の多鎖タンパク質内に存在させることができる。この手法の実行可能性を明らかにするために、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−Ｓｕｓｈｉ−ｈＩｇＧ１−ｐＭＳＧＶｃ及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ−ｈＩＬ１５Ｎ７２Ｄ−ｐＭＳＧＶｎ発現ベクターをＩＭＤＭ−１０培地で培養したＣＨＯ細胞内に同時トランスフェクトした。室温で６日間トランスフェクト体を培養した後、培養上澄液を採取した。ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１のＴ２分子をＥＬＩＳＡで特性化した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄの精製したＴ２分子をコントロールとして用いた。ＴＣＲドメインを評価する１つのアッセイでは、ウェルを抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（ＢＦ１）でコーティングし、融合タンパク質を添加して、結合したタンパク質をビオチニル化抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（Ｗ４Ｆ−ＢＮ）で検出した。

【0203】

図２２に示した結果は、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１から成るＴ２分子のＴＣＲドメインが抗ＴＣＲ抗体で検出可能であったことを示している。Ｔ２タンパク質のＩｇＧ１及びＩＬ−１５ドメインを評価するために、上記のようなヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ捕獲及び抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂ検出から成るＥＬＩＳＡを用いた。

【0204】

図２３に示したように、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１から成るＴ２分子はこの形態で検出可能であり、ＩｇＧ及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含有しているタンパク質鎖の間の相互作用を示した。ｃ１４９ｓｃＴＣＲドメインの活性も、抗ヒトＩｇＧ Ａｂ捕獲及びｐ５３（ａａ１４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２ストレプタビジン−ＨＲＰ四量体による検出を用いるＥＬＩＳＡで試験した。

【0205】

図２４に示したように、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１から成るＴ２分子はこの形態で検出可能であり、ＩｇＧ１ドメインを有する分子もｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖の間の相互作用を介する ｐ５３（ａａ １４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体との結合活性も有していることを示した。抗ヒトＩｇＧ Ａｂ捕獲及びｐ５３（ａａ１４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２或いはｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体による検出、又は抗ＴＣＲ Ａｂ（ＢＦ１）捕獲及び抗ＴＣＲ Ａｂ若しくは抗ＩＬ−１５ Ａｂ検出から成る更なるアッセイは、それぞれのドメインがｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖から成るＴ２タンパク質において機能的に結合されたことを立証した（図２４）。

【0206】

別のタンパク質鎖、すなわち、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖上でこれら２つのＴＣＲドメインが発現されるＴ２分子も作成した。これらの分子のＦｃ及びＴＣＲ活性を、続いてＵ９３７細胞と結合して、そしてｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２四量体による検出、次いでフローサイトメトリーによって評価した。

【0207】

図２５に示したように、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成るＴ２分子は、Ｆｃドメインを介するＵ９３７細胞上のＦｃガンマ受容体を結合すること及びｃ２６４ｓｃＴＣＲドメインを介してｐ５３（ａａ ２６４−２７２）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体を認識することが可能であった。これらの検討は複数の機能的ＴＣＲドメイン並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα及びＩｇＧ１ドメインを有するＴ２分子が図１に示す構造を形成できることを立証している。

【0208】

実施例９− マウス及びカニクイザルにおけるＴ２タンパク質薬物動態の特性化
ＩＬ−１５による治療可能性の主な制約はインビボにおけるサイトカインの非常に短い生物学的半減期である。動物モデルにおけるＴ２分子の生物学的薬物動態特性を評価するために、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウス（５匹マウス／時点）に精製したＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）１３５μｇ／マウスを静脈内注射した。このｃ２６４ｓｃＴＣＲが制限されている、ＨＬＡ−Ａ２．１の存在がタンパク質の薬物動態に影響を与え、そして他の非ヒトモデルより薬物動態より関連性のある「ヒト化」観点をもたらすはずであるので、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスモデルを選択した。この試験で、注射後０、１、４、８、２４、４８、７２、及び９６時間点で血液を採取して血清中のＴ２タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。２つの異なったＥＬＩＳＡ形態を用いた：１）ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ捕獲及び抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（Ｗ４Ｆ−ＢＮ）検出、又は２）ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ捕獲及び抗ヒトＩＬ−１５Ａｂ検出。これらのアッセイは無傷タンパク質及び多鎖タンパク質複合体の安定性の評価を可能にする。

【0209】

図２６Ａに示したように、Ｔ２分子は静脈内注射に続いて約９〜１１時間の生物学的半減期を有していた。これは報告されているＩＰ注射後のマウスで観察された〜１時間のヒトＩＬ−１５の半減期（Stoklasek TA et al. 2006. J. Immunol. 177: 6072）よりかなり長い。また、Ｔ２分子は供給された用量と一致した血清濃度に達したのに対して、先に報告された研究（Stoklasek TA et al. 2006. J. Immunol. 177: 6072）ではＩＬ−１５の投与された用量は殆ど血清中で回収されなかった。従って、Ｔ２分子は遊離のヒトＩＬ−１５より有意に優れている薬物動態プロファイルを有している。更に、２つのＥＬＩＳＡを用いて観察された同様なＰＫプロファイルに基づくと、Ｔ２タンパク質は開裂の証拠の無い、多鎖分子として無傷のままであった。

【0210】

霊長動物モデルにおけるＴ２分子の生物学的薬物動態特性を評価するために、カニクイザル（２頭、雄１頭、雌２頭）に精製したＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）０．５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射した。この試験で、注射後０、１、４、８、２４、４８、７２、９６及び１２０時間点で血液を採取して血清中のＴ２タンパク質の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。３つの異なったＥＬＩＳＡ形態を用いた：１）抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（βＦ−１）捕獲及びＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ検出、又は２）抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂ捕獲及びＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｂ検出、又は３）抗ヒトＩＬ−１５ Ａｂ捕獲及び抗ヒトＴＣＲ Ａｂ（Ｗ４Ｆ−ＢＮ）検出。これらのアッセイは無傷タンパク質及び多鎖タンパク質複合体の安定性の評価を可能にする。

【0211】

図２６Ｂに示したように、Ｔ２分子は静脈内注射に続いて約４〜６時間の生物学的半減期を有していた。これは報告されている皮下注射後のサルで観察された〜１時間のＩＬ−１５の半減期（Villinger, F. et al. 2004. Vaccine 22: 3510）よりかなり長い。従って、Ｔ２分子は遊離のＩＬ−１５より有意に優れた薬物動態プロファイルを有しているように思われる。更に、３つのＥＬＩＳＡで観察された同様のＰＫプロファイルに基づくと、これらのデータはＴ２タンパク質が開裂の証拠の無い、多鎖分子として無傷のままであることを示唆しているネズミのＰＫデータをサポートしている。

【0212】

実施例１０− 異種移植腫瘍マウスモデルにおける固形ヒト腫瘍に対するＴ２分子の抗腫瘍活性
Ｔ２分子の治療効果を確認するために、ヌードマウスにおいてｐ５３＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ａ３７５メラノーマ細胞株を有する原発腫瘍増殖モデルにおける抗腫瘍活性を試験した。腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射して、腫瘍を治療開始前に１００ｍｍ^３まで生育させた。腫瘍担持マウスに、３２μｇ／用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）のｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成るＴ２タンパク質、３２μｇ／用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）のｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ２、又は６０μｇ／用量（３ｍｇ／ｋｇ）の２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩｇＧ１を静脈内注射した。マウスを１日おきに１週間処置し（３回注射）、９日の休息期間に続いてその後１日おきに更に一週間処置した（３回注射）。試験中に、腫瘍の生育を測定して腫瘍容量をプロットした（図２７）。結果をＰＢＳのみで処置したマウスにおけるＡ３７５腫瘍の生育と比較した。

【0213】

図２７に示したように、Ａ３７５腫瘍の生育はＴ２分子又はＴＣＲＩＬ２若しくはＴＣＲＩｇＧ融合タンパク質の何れかで処置したヌードマスにおいて阻害された。以前の研究では、このモデルにおけるｐ５３特異的ＴＣＲ−ＩＬ２又はＴＣＲ−ＩｇＧ融合タンパク質の抗腫瘍効果は、エフェクタードメイン活性を、ＴＣＲドメインを介して腫瘍部位を標的化した結果であったことが示された（Belmont et al. 2006 Clin. Immunol. 121:29,、Mosquera et al. 2005 J. Immunol. 174:4781）。この可能性を評価するために、非標的化ＴＣＲドメインを有するタンパク質がＡ３７５腫瘍異種移植マウスモデルで試験されるだろう。ｐ５３に特異的なＴ２タンパク質と比較した非標的化Ｔ２分子のＡ３７５腫瘍に対する減少した有効性は、腫瘍抗原標的化がＴ２分子の抗腫瘍活性で役割を果している証拠を提供するだろう。

【0214】

実施例１１− ＩＬ−１５及びＦｃドメインに突然変異を有するＴ２分子の特性化
国際出願公開第ＷＯ２００８１４３７９４号公報に開示されているように、ＩＬ−１５Ｒβγ鎖と相互作用するその能力を増大又は減少してその生物活性に影響を及ぼす突然変異を１Ｌ−１５ドメインに導入することができる。例えば、上で示したように、Ｎ７２Ｄ置換はＩＬ−１５の生物活性を５〜１０倍増大することができる。別の例では、アンタゴニスト機能をもたらすＩＬ−１５の活性を減少することが有用である。Ｔ２分子形態に関連するこのような突然変異の効果を試験するために、ＩＬ−１５ドメインの８位（すなわち、Ｄ８Ｎ）及び６５位（すなわち、Ｎ６５Ｄ）の置換を含んでいるｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５構築物を作成してｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１タンパク質と同時発現した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５変異体及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖の得られた複合体を、実施例５に記載されているように３２Ｄβ細胞を用いるＩＬ−１５生物活性について試験した。図２８に示したように、ＩＬ−１５Ｄ８Ｎ及びＮ６５Ｄ変異を含んでいるＴ２分子は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメイン又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５融合を含んでいるＴ２分子と比較して３２Ｄβ細胞増殖をサポートするそれらの能力の有意な減少を示した。実施例５の結果と一致して、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインを含んでいるＴ２分子はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５融合体の何れかよりもより高いＩＬ−１５活性を示した。

【0215】

Ｆｃガンマ受容体又は相補体と相互作用するその能力を減少することが先に示されたＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（Hessell, A. J., et al. 2007. Nature 449: 101-1040、参照により本明細書に取り込まれている）内にも突然変異を導入した。例えば、ＩｇＧ１ Ｃ_Ｈ２の２３４位及び２３５位のロイシン残基（抗体コンセンサス配列に基づく番号付け）（すなわち、．．．ＰＥＬＬＧＧ．．．（配列番号１））のアラニン残基による置換（すなわち、．．．ＰＥＡＡＧＧ．．．（配列番号２））は、Ｆｃガンマ受容体結合の損失をもたらすのに対して、ＩｇＧ１Ｃ_Ｈ２の３２２位のリジン残基（抗体コンセンサス配列に基づく番号付け）（すなわち、．．．ＫＣＫＳＬ．．．（配列番号３））のアラニン残基による置換（すなわち、．．．ＫＣＡＳＬ．．．（配列番号４））は相補体活性化の損失をもたらす（Hessell, A. J., et al. 2007. Nature 449: 101-1040、参照により本明細書に取り込まれている）。これらの置換をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１構築物内に導入して、得られたタンパク質をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ又は上記の別のＴＣＲ−ＩＬ１５変異体と同時発現した。これらの複合体がｐ５３ａａ２６４−２７２ペプチド−負荷ＨＬＡ−Ａ２陽性Ｔ２標的細胞に対するヒトＰＢＭＣのＡＤＣＣ活性を介在する能力を実施例６に記載されているようにして評価した。Ｆｃ機能を変化させることが知られているその他の突然変異は、例えば、Lazar et al., PNAS, 103:4005-4010, 2006（参照により本明細書に取り込まれている）に提供されている。

【0216】

図２９に示したように、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１−ＬＡＬＡ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含んでいるＴ２複合体はＦｃ−ＬＡＬＡ変異体によって示されたＦｃガンマ受容体結合の損失と一致して高レベルのＡＤＣＣ活性を介在することができなかった。これと対照的に、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１−ＫＡ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖又は上記のＩＬ−１５変異体（Ｎ６５Ｄ又はＤ８Ｎ）を含んでいる複合体はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１−ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ複合体と同レベルのＡＤＣＣ活性を示した。メカニズムに捕らわれずに、これらのデータも、ＩＬ−１５ドメイン及びＦｃ相補体結合ドメインがＡＤＣＣ活性を介在することとは関連していないという可能性に基づいて予測される。

【0217】

ＩＬ−１５及びＦｃ突然変異の、ヒトＮＫ及びＴ細胞応答を刺激するＴ２分子の能力への影響も試験した。１．８〜５×１０^５細胞／ｍＬのヒトＰＢＭＣを、上記の突然変異を含んでいる１ｎＭのＴ２分子、又はコントロールとして１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−２又はＩＬ−１５を含んでいる培地中、３７℃で４日間培養した。

【0218】

次いで、ＮＫ細胞傷害性を、ＮＫ感受性Ｋ−５６２細胞を標的細胞として用いて評価した後、５０μｇ／ｍｌのカルセイン−ＡＭで標識化した。各種比のＰＢＭＣ及びＫ−５６２細胞を混合してＣＯ_２インキュベーター内、３７℃で２時間培養し、１００μｌの条件培地を採取して、溶解した細胞から放出されたカルセインについて分析した。カルセインをＥｘ−４８５ｎｍ、Ｅｍ−５３８ｎｍ、及びカットオフ−５３０ｎｍで蛍光リ−ダーを用いて定量した。特異的細胞溶解を次の式を用いて計算した：特異的溶解＝[ｅｘｐ−（バックグラウンド−自動放出）／［完全放出−（バックグラウンド−自動放出）]×１００％、Ｅｘｐ＝Ｋ−５６２細胞＋ＰＢＭＣ；バックグラウンド＝培地のみ；自動放出＝Ｋ−５６２細胞のみ；完全放出＝Ｋ−５６２細胞＋０．５％トリトンＸ−１００。

【0219】

図３０に示したように、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含んでいるＴ２分子との培養は、培地だけで培養した後に観察されたものと比較してヒトＰＢＭＣのＮＫ細胞溶解活性を刺激することができた。更に、ＦＣドメインＬＡＬＡ及びＫＡ変異体を含んでいるＴ２分子もＮＫ細胞を刺激できたのに対して、ＩＬ−１５ドメインにＮ６５Ｄ又はＤ８Ｎ置換を含有しているものはＮＫ細胞傷害性を殆ど又は全く刺激しないはずだ。これらの結果と一致して、ヒトＰＢＭＣの、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含んでいるＴ２分子、又はＦｃドメインＬＡＬＡ及びＫＡ変異体を有するものとの培養はＣＤ５６＋ＮＫ細胞の増殖の増大をもたらしたのに対して、ＩＬ−１５Ｎ６５Ｄ又はＤ８Ｎ置換を含んでいるＴ２分子はそれほどのＮＫ細胞増殖活性をもたらさなかった（図３１）。それぞれのＩＬ−１５の機能性に基づいてこのような結果が期待される。

【0220】

ある適用に対しては、Ｔ２分子とＩＬ−１５又はＦｃ受容体との間の減少した相互作用は、これらの受容体を担持している細胞との非特異的結合を減少するために望ましいだろう。これを評価するために、ＩＬ−１５及びＦｃ突然変異を含有しているＴ２分子をペプチドを負荷させたＴ２細胞を用いてＴＣＲ特異的標的細胞認識について評価した。Ｔ２分子又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ストレプタビジン四量体陽性コントロールによる細胞染色を、実施例７に記載された方法を用いてｐ５３ペプチドを負荷させたＴ２細胞（Ｔ２．２６５）及び負荷させていないＴ２細胞（Ｔ２）上で実施した（図３２Ａ）。非負荷細胞の染色に基づくと、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含むＴ２分子は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ストレプタビジン四量体又はＢＦ１抗体コントロールと比較して、有意な細胞結合を示すことが明確である。Ｆｃ ＬＡＬＡ又はＩＬ−１５Ｎ６５Ｄ若しくはＤ８Ｎ突然変異の導入はこの細胞結合を減少して、Ｆｃ及びＩＬ−１５受容体の両方との相互作用がＴ２複合体結合に役割を果していることを示唆している。Ｆｃ ＬＡＬＡとＩＬ−１５Ｎ６５Ｄ又はＤ８Ｎ突然変異との組合わせは、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１−ＬＡＬＡ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ Ｄ８Ｎを含む分子が上記ＢＦ１抗体陰性コントロールを負荷していないＴ２細胞との結合を示さないように、Ｔ２複合体結合を更に減少する。ｐ５３ペプチド負荷細胞の染色もＦｃ又はＩＬ−１５突然変異の導入によって達成される。しかしながら、ペプチド負荷対非負荷細胞のＴ２分子染色の平均蛍光強度を比較したとき（特異的対非特異的の比）、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１−ＬＡＬＡ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ Ｄ８Ｎ鎖を含むＴ２分子がｐ５３ペプチド抗原に対して最も高い染色特異性をもたらすことが明確である（図３２Ｂ）。これらの結果は、Ｔ２分子のＴＣＲ、ＩＬ−１５及びＩｇＧＦｃドメインのそれぞれの結合活性が容易に独立して操作されて望ましい生物活性を有する多重特異的複合体をもたらすことを示している。

【0221】

別の場合では、ＩＬ−１５ドメイン及びＩｇＧＦｃドメイン活性を改変して、Ｔ２複合体の治療インデックスを最適化して毒性を最小化することが有用である。例えば、その治療効果の一部をＡＤＣＣ活性に依存している標的複合体はＩＬ−１５成分の耐容用量レベルを超える高いレベルの用量（すなわち、１〜２０ｍｇ／ｋｇ）を必要とするかもしれない。そのような場合は、その活性を減少する突然変異をＩＬ−１５ドメイン中に含有している複合体がより良い治療活性及びより低い毒性をもたらすと期待される。上記のＩＬ−１５ドメイン中のＮ６５Ｄ又はＤ８Ｎ置換、又はＩＬ−１５活性を減少することが見出されている、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａを包含する、その他の置換を含有しているＴ２分子は特に注目される。

【0222】

実施例１２− 非標的化Ｔ２分子の特性化
いくつかの適用では、Ｔ２複合体を用いて特異抗原を標的化する必要はない。このような分子では、ＴＣＲ結合ドメインのような抗原特異的ドメインは突然変異によって又は完全に欠失させることによって不活性化できる。本明細書に記載されている方法を用いて、Ｔ２ＭΔＴＣＲと称するｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｈｕＩＬ１５ Ｄ８Ｎ鎖を含むような分子の活性を、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ鎖を含むＴ２分子（Ｔ２Ｍと称する）及びｈｕＩｇＧ１鎖を欠失しているＴ２分子（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ、Ｔ２ＭΔＩｇ又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体と称する）と比較した。実施例５に記載されているように３２Ｄβ細胞生育をサポートする能力を試験したときに、Ｔ２ＭΔＴＣＲは組み換えヒトＩＬ−１５を用いて観察されたものの＞２４倍である非常に強いＩＬ−１５活性を示した（図３３Ａ）。

【0223】

ヒト免疫細胞生育をサポートするＴ２ＭΔＴＣＲの能力も評価した。１×１０^６細胞／ｍｌのヒトＰＢＭＣをＴ２Ｍ（０．５ｎＭ）、Ｔ２ＭΔＴＣＲ（０．５ｎＭ）、又はＴ２ＭΔＩｇ（１ｎＭ）の存在下又は非存在下で培地と７日間培養した。細胞を抗ＣＤ４５ＲＯ及び抗ＣＤ８、又は抗ＣＤ８、抗ＣＤ９５、及び抗ＣＣＲ７、又は抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ１６で染色して、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。図３３Ｂに示される８つの異なったドナーから得た平均した結果は、Ｔ２ＭΔＴＣＲ及びその他のＴ２分子が、エフェクター記憶Ｔ細胞を包含する、各種ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞及びＮＫ細胞サブセットの増殖を効果的に刺激できたことを示唆している。これらの細胞のＮＫ細胞活性を実施例１１に記載されている方法を用いて試験した。図３３Ｃに示される２つのドナーＰＢＭＣ調製物からの代表的な結果は、Ｔ２ＭΔＴＣＲ及びその他のＴ２分子がＮＫ細胞溶解活性を効果的に刺激できたことを示唆している。これらの結果の全てが、Ｔ２ＭΔＴＣＲタンパク質は強力な免疫刺激性分子であることを示唆している。

【0224】

実施例１３− Ｔ２分子のインビボ活性
Ｔ２分子の免疫刺激活性を更に特性化するために、Ｔ２Ｍ、Ｔ２ＭΔＴＣＲ、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを欠失しているＴ２ＭΔＴＣＲ（Ｔ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１）、Ｆｃ−ＬＡＬＡ突然変異を有するＴ２Ｍ（Ｔ２ＭＬＡＬＡ）及びＩＬ−１５Ｄ８Ｎ突然変異を有するＴ２（Ｔ２ＭＤ８Ｎ）をＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＮＫ及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖を誘発するそれらの能力について試験した。更に、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ複合体を評価した。

【0225】

マウスにＩＬ−１５の２．５μｇ用量に相当する量の融合タンパク質を１日目と４日目に静脈内に注射した。８日目に、血液細胞と脾臓細胞を採取し、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞について染色して、フローサイトメトリーで分析した。図３４に示した結果はＴ２分子が血液及び脾臓のＮＫ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の両方をインビボで増殖させるのに効果的であることを示唆している。Ｔ２ＭＬＡＬＡはＴ２Ｍと同様の活性を示して、ＦｃＲ結合及びシグナル伝達はＮＫ及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖に有意な役割を果さないであろうことを示唆した。Ｔ２ＭＤ８Ｎ処置はＴ２Ｍと比較すると減少した活性をもたらし、ヒトＰＢＭＣを用いるインビトロにおける分子の免疫刺激活性をＤ８Ｎ突然変異が消失するという知見を確認した。ＴＣＲの欠失（Ｔ２ＭΔＴＣＲ及びＴＣＲ）とＣＨ１の欠失（Ｔ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１）は減少した活性を示した。これらの結果はこれらのより小さい分子のより短い半減期に起因しているかもしれない。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ＋ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ複合体もＴ２Ｍと比較して減少したインビボ活性を示して、Ｔ２分子がより強力な免疫刺激性化合物であることを示唆しているインビトロ結果を立証した。

【0226】

実施例１４− 多重特異的Ｔ２分子
多重結合ドメインのスカフォールドとして作用するＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα／ＩｇＧＦｃの融合ドメインの能力を更に特性化するために、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄと結合したＨ−２Ｋ^ｂ−制限ＯＶＡａａ２５７−２６４ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２０））に特異的な１本鎖ＴＣＲドメイン（ＯＴ１ｓｃＴＣＲ）とｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１融合と結合した１本鎖ＣＤ８α／βドメインを含む、融合タンパク質複合体（ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍ）を作成した。１本鎖ＣＤ８α／βドメインは、（Ｇ_４Ｓ）_４ペプチドリンカー（配列番号２１）を介してネズミＣＤ８βの細胞外ドメインと結合しているネズミＣＤ８αの細胞外ドメインを含んでいる。ＣＤ８が、ＴＣＲ特異的ペプチド／ＭＨＣ接合部と遠位のＭＨＣ分子内の部位と結合することが十分に特性化される。従って、ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍ複合体のＯＴｓｃＴＣＲとｓｃＣＤ８α／βドメインの両方がＯＶＡａａ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋ^ｂ−分子上の異なった部位で相互作用すると期待される。

【0227】

これを試験するために、ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍの結合活性をＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合体のそれとＥＬＩＳＡで比較した。それぞれのタンパク質の等モル量を抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ（Ｈ５７）でコーティングしたウェウル上に捕獲して、ＯＶＡａａ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋ^ｂ四量体又はＩＬ１５、ＣＤ８α、ＣＤβ或いはＴＣＲ Ｖα２に対するｍＡｂでプローブした。アッセイを抗ヒトＩｇでコーティングしたウェルで実施して、抗ＴＣＲ Ｖα２でプローブした。

【0228】

図３５Ａに示したように、ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍタンパク質は抗ＩＬ−１５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＴＣＲ Ｖα２及びヒトＩｇ抗体に対して反応性を示した。Ｔ２Ｍ融合複合体の多価形態に基づいて期待されるように、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄより抗ＴＣＲ Ｖα２ｍＡｂに対して約３倍高い反応性があった。しかしながら、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合体はＯＶＡａａ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋ^ｂ四量体との結合を殆ど或いは全く示さなかったのに対してＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍタンパク質では結合が明らかに表れた（図３５Ｂ）。これらの結果は、ＯＴ１−ＣＤ８−Ｔ２Ｍ複合体のＯＴｓｃＴＣＲ及びｓｃＣＤ８α／βドメインの両方がＯＶＡａａ２５７−２６４／Ｈ−２Ｋ^ｂ分子と結合して親和性の高い安定な相互作用をもたらすことを示唆している。

【0229】

実施例１５− 機能的スカフォールドとしてのＩＬ１５：ＩＬ−１５Ｒαドメイン
（ペプチド／ＭＨＣクラスＩ（ｐＭＨＣＩ）四量体の製造）−
上記のようなＣ５７ＢＬ／６マウスリンパ球から抽出した全ＲＮＡから、ネズミＨ−２Ｋｂ遺伝子をクローンした。細胞外領域をＨＬＡ−Ａ^＊０２０１コード配列（３１）を置き換えるＨＬＡ−Ａ^＊０２０１重鎖発現ベクター（３１）内にライゲートした。β２ｍ、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１及びＨ−２Ｋｂ発現ベクターを個々にＥ．ｃｏｌｉ内に形質転換し、記載（３１）のようにして組み替えタンパク質の発現を誘発して、不溶性封入体として発現した。ペプチドと共に複合体活性及び溶解性タンパク質を、http://www.microbiology.emory.edu/altman/ jdaWebSite_v3/ptetPrepOverview.shtmlに記載されているリフォールディング方法で得た。ｐ５３（ａａ２６４−２７２）及び（ａａ１４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１試薬をそれぞれＡ２／ｐ５３．２６４−２７２及びＡ２／ｐ５３．１４９−１５７と称し、ＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチド／２ＫｂをＫｂ／ＯＶＡ。２５７−２６４と称する。

【0230】

（ＥＬＩＳＡ）−
免役プレート（Maxisorb, Nunc, Rochester, NY）を、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕獲するための（ＢＦ１）８Ａ３．３１ｍＡｂで、或いはＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質を捕獲するためのＨ５７−５９７ｍＡｂでコーティングした。洗浄した後、結果の部に詳述したような各種プローブを用いてタンパク質を検出した。次いで、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]−ジアンモニウム塩）基質を加えて、９６ウェルプレートリーダー（Versamax, Sunnyvale, CA）を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

【0231】

（フローサイトメトリー）−
ｃ２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質複合体を特性化するために、Ｔ２細胞をペプチド負荷エンハンサー（ＰＬＥ、Altor BioScience Corp., Miramar, FL）の存在下、３７℃で２時間ｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチドでパルスした。ＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質複合体について、ネズミリンパ腫ＥＬ４細胞を１００μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチド及びＰＬＥで３７℃で６時間パルスした。各種のｂｉｒＡ融合タンパク質（ＳＡ−ＰＥと複合した）を加えて４℃で１時間培養した。サンプルを２回洗浄して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（BD Biosciences, San Jose, CA）を用いてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリーで分析した。

【0232】

ＩＬ−１５ドメインの結合活性を評価するために、３２Ｄβ細胞を３２０ｎＭのｃ２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質複合体と４℃で３０分間培養した。タンパク質の結合を、ビオチニル化（ＢＦ１）８Ａ３．３１ｍＡｂで１５分間、及びＳＡ−ＰＥ（それぞれ５μｇ／ｍｌ）で１５分間順に検出した。染色した細胞を上記のようにフローサイトメトリーで分析した。

【0233】

（細胞増殖アッセイ）−
先に記載されている（２５）ようにして細胞増殖を測定した。すなわち、３２Ｄβ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、等モル濃度のＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕの存在下又は非存在下で、濃度を増大させたｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５又はｓｃＴＣＲ−ｈＩＬ１５突然変異タンパク質と３７℃で４８時間培養した。細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を製造会社の手順に従って細胞増殖の最後の４時間の間に添加した。代謝的に活性な細胞によるＷＳＴ−１の着色フォルマザン色素への変換を４４０ｎｍにおける吸光度測定によって確認した。Ｐｒｉｚｍ４ソフトウェア（GraphPad Software, La Jolla, CA）で適合させる非線形回帰可変傾斜曲線によって実験データから作成した用量依存曲線でＥＣ_５０を確認した。

【0234】

（表面プラズモン共鳴）−
Ｏｔ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質のそれらの同種ｐＭＨＣＩとの親和定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００計器（GE Healthcare, Piscataway, NJ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）手法を用いて確定した。ビオチニル化ｐＭＨＣＩ複合体を、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣＬ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のｐ２０界面活性剤、ｐＨ７．４）中２μｇ／ｍｌのタンパク質を流速１０μｌ／分で注入して、ＳＡ５センサーチップ（GE Healthcare, Piscataway, NJ）のストレプタビジンでコーティングした表面上に固定化した。これは固定化したｐＭＨＣＩ複合体の１０００〜１２００ＲＵをもたらした。

【0235】

精製したＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質をＨＢＳ中で１μＭ、０．５μＭ及び０．２５μＭに希釈する。それぞれの濃度を流速１０μｌ／分で新たに固定化したｐＭＨＣＩ表面上、並びにビオチンでブロックしたコントロールのストレプタビジン表面（ベースライン）上に１度注入し（５０μｌ）て、結合曲線を記録した。解離定数（Ｋ_Ｄ）及び結合（ｋ_ｏｎ）と解離（ｋ_ｏｆｆ）の比を、ＢＩＡ評価４．１．１ソフトウェア（GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ）を用いて、修正した結合曲線（ベースラインを差し引いた）から計算した。

【0236】

（ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５Ｒαスカフォールドを用いるｓｃＴＣＲ二量体の作成）−
ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５と称する生物活性な、二元機能を有する融合タンパク質は、ｈＩＬ−１５のＮ末端を３つのドメイン、ｐ５３（ａａ２６４−２５７）ペプチド抗原（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ）に特異的なＨＬＡ−Ａ^＊０２０１−制限キメラＴＣＲと融合することによって生成できることを先に示した（２５）（図３６Ａ）。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ及びヒトＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉ結合ドメイン（ａａ１−６６）（ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ）を用いて同様な融合タンパク質を構築し、これはｈＩＬ−１５結合に応答可能な構造要素を含有することが示されている。この融合タンパク質は遺伝子学的にｂｉｒＡペプチドタグと結合してストレプタビジンの存在下でビオチニル化及びそれに続く多量体化を可能にする（３２）。この融合タンパク質をｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡと称し、そのＣＨＯ細胞からの発現及び精製はｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５のそれと同様であった（２５）。これらの融合タンパク質は細胞培養上澄液のリットル当りミリグラムのレベルで容易に産生できる（データは示されていない）。

【0237】

ｈＩＬ−１５とｈＩＬ−１５ＲαＳｕドメインの間の高い特異的結合活性に基づいて、この融合タンパク質はヘテロ二量体複合体を形成できると推測した。更に、ヒトＩＬ−１５：ＩＬ１５Ｒα複合体の結晶構造の実験は、２つのタンパク質のＮ−末端がほぼ５０Å離れて複合体の反対端にあることを示唆した（３３）。従って、ｓｃＴＣＲドメインのこれらの領域との融合は複合体形成を阻害しないことが期待される。

【0238】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５とｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ融合タンパク質の間の結合の最初の証拠が、ｈＩＬ−１５及びｃ２４６ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５タンパク質を捕獲するためのプレートに結合したｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡを用いるＥＬＩＳＡで観察された（２５）。二量体ｃ２６４ｓｃＴＣＲ融合タンパク質複合体（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体と称する）を更に特性化するために、等モル量の精製ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５とｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＢｉｒＡ融合タンパク質を混合して１０分以上室温で結合させた。複合体及び個々のタンパク質融合体をサイズ排除クロマトグラフィーで評価した。

【0239】

図３６Ｂに示すように、精製ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５とｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＢｉｒＡ融合タンパク質調製物中の主要種は単量体タンパク質（それぞれ、分子量（ＭＷ）＝１１５及び１１３ｋＤａ）と一致するＳＥＣプロファイルを示したのに対して、２つのタンパク質の混合物は二量体複合体に対応する分子量（ＭＷ＞１９２ｋＤａ）を有する主要ピークをもたらした。従って、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体調製物中により大きい分子量の種が出現したことはヘテロ二量体複合体が生成されたことの証拠である。

【0240】

ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体を単量体ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ＢｉｒＡタンパク質と、ＴＣＲ特異抗原、ｐ５３（ａａ２４６〜２７２）／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１を結合するそれらの能力について比較した。それぞれの場合に、タンパク質をビオチンリガーゼでビオチニル化した後、ＳＡ−ＰＥと複合体化して（３２）先に記載されるように（３２）多量体フローサイトメトリー染色試薬を作成した。様々な濃度のｐ５３（ａａ２６４−２７２）ペプチドでパルスされたＨＬＡ−Ａ^＊０２０１−陽性Ｔ細胞を染色するために用いる場合、両方の試薬は、ペプチドの濃度依存的に増大する抗原特異的結合を示した（図３７Ａ）。しかしながら、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体を含む染色試薬は単量体由来Ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ対応物より最大３倍より良く染色した（図３７Ｂ）。メカニズムに囚われることなく、これらのデータはＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα相互作用による二量体化がｓｃＴＣＲの機能活性を保存して、増大した親和性を通してその同種ＨＬＡ／ペプチドとのｓｃＴＣＲ複合体の効果的な親和性を増大することを示唆している。ｂｉｒＡタグによるビオチニル化を複合体のｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５のＣ−末端を対象としたときに同様な結果が観察された（データは示していない）。このことは複合体のＣ末端が、二量体化又は融合タンパク質複合体の抗原結合ドメインの何れにも影響を与えずに、有意な大きさの分子のプローブ（ストレプタビジンのＭＷはほぼ６０ｋＤａである）と、共役するために利用しやすいことを明らかにしている。

【0241】

これらの検討を、二重特異的分子を生成する可能性を試験するために拡張した。１４９〜１５７のアミノ酸残基に広がるヒトｐ５３タンパク質のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１制限エピトープを認識する第２ｓｃＴＣＲ（ｃ１４９ｓｃＴＣＲ）を作成した（２４）。このｓｃＴＣＲをｈＩＬ−１５と融合して、ｃ１４９ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５と称する、得られたタンパク質をＣＨＯ細胞内でｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５αＳｕ／ｂｉｒＡ融合体と同時発現した。組み換えＣＨＯ細胞培養液の上澄液中で観察されたこの融合複合体を抗ＩＬ−１５抗体を用いて固定化してＨＲＰ−標識化ｐ５３（ａａ２６４−２７２）又はｐ５３（ａａ１４９−１５７）ペプチド／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１四量体の何れかでプローブした。図３７Ｃに示すように、抗ＩＬ−１５抗体が捕獲した融合タンパク質複合体は両方のペプチド負荷ＨＬＡ四量体と結合できた。この結果は、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドと融合したときに、個々のｓｃＴＣＲ分子が機能活性を保持して、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体の空間配置が個々におよそ４０ｋＤａの分子量を有しているｓｃＴＣＲドメインの充填に有意には影響を及ぼさないことを明らかにしている。

【0242】

ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドのタンパク質二量体化に対する汎用性を明らかにするために、一方がｈＩＬ−１５のＮ−末端に融合していて他方がｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡタンパク質のＮ−末端に融合している２つの１本鎖ＯＴ１ ＴＣＲを対合して第２二量体ｓｃＴＣＲ融合複合体を作成した。ＯＴ１は、ネズミＨ−２Ｋｂとの関連で、アミノ酸残基２５７−２６４に広がるＯＶＡタンパク質のエピトープを認識するとよく特徴付けられたＴＣＲである（３４）。組み換えＣＨＯ細胞発現のために、ＯＴ１１本鎖ＴＣＲ（ＯＴ１ｓｃＴＣＲ）遺伝子を作成して、ｈＩＬ−１５とＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ構築物と融合した。親和性精製したＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合タンパク質は捕獲試薬として抗マウスＴＣＲ Ｃβ Ｈ５７抗体、及びＨＲＰ標識化、ＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチド負荷Ｈ−２Ｋｂ四量体を用いるＥＬＩＳＡでｐＭＨＣＩ結合活性を有することが見出された（図４２）。ＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体とＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ単量体の間の結合活性の相違を区別するために、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体についての上記方法と同様だが、ＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチドを負荷したＨ−２Ｋｂ陽性ＥＬ４細胞を用いてフローサイトメトリー分析を行った。

【0243】

図３８に示すように、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体を含むＳＡ−ＰＥ四量体は実際に、単量体ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ融合体を含むものより有意によく染色した。ストレプタビジンセンサーチップ上に固定化されたビオチニル化ＯＶＡ（ａａ２５７−２６４）ペプチド負荷Ｈ２−Ｋｂ／ｂｉｒＡ複合体に対するＯＴ１ｓｃＴＣＲ単量体及び二量体の結合親和性を評価するために表面プラズモン共鳴アッセイも実施した。ＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体に対するＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体の見掛け上の結合親和性（ＫＤ）は約３０μＭであると推定されたのに対して、単量体ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｂｉｒＡ融合タンパク質については結合が観察されなかった（表１）。これらのデータは、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５Ｒα相互作用による二量体化がｓｃＴＣＲの生物活性を保存して、増大した親和性によってｓｃＴＣＲ分子のその同種ｐＭＨＣＩ複合体との効果的な親和性を増大することを裏付けている。

【0244】

（Ｏｔ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体の作成）−
ＣＤ８分子がＯＴ１ ＴＣＲとその同種ＯＶＡペプチド／Ｈ２−Ｋｂ複合体の間の相互作用に極めて重要な役割を果していることが先に明らかにされているので（３５〜３７）、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドは、細胞表面で発現されるＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂに対するＯＴ１ＴＣＲ結合親和性を、そして細胞及び接着分子非存在条件下でＣＤ８分子が増大するか否かを評価する機会をもたらす。これを実施するために、最初に、フレキシブルなリンカーを用いてネズミＣＤ８のα及びβ鎖の細胞外ドメインを融合して１本鎖形態のネズミＣＤ８分子（ｓｃＣＤ８）を作成した。この融合遺伝子をレトロウィルス発現ベクター中でｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡと融合した。次いで、組み換えレトロウィルスをＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５融合タンパク質を発現しているＣＨＯ細胞株を感染するために用いた。ヘテロ二量体融合タンパク質複合体を培養した組み替えＣＨＯ細胞の上澄液から抗ＴＣＲ抗体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを上記のように用いて精製した。この精製したタンパク質を捕獲試薬として抗ＴＣＲ抗体及びプローブとしてビオチニル化抗ｍＣＤ８α又は抗ｍＣＤ８βｍＡｂの何れかを用いるＥＬＩＳＡに付した。

【0245】

図３９Ａに示すように、抗ＴＣＲＡｂ固定化融合複合体はＣＤ８α及びＣＤ８βの両方を含んでいるので、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体の形成を示唆している。フローサイトメトリー分析を用いて、細胞表面上に提示される様々な量のＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体に対するＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体の結合活性をＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体と比較した。図３９Ｂに示すように、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体を含む染色試薬は、わずか１０ｎｇ／ｍｌのＯＶＡペプチドを負荷したＥＬ４細胞上で、ＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体を容易に検出できたのに対して、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体を含む相当する試薬を用いたときはこのペプチド濃度で殆ど或いは全く染色が観察されなかった。ペプチドでパルスされていないＥＬ４細胞上で、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体のより高いバックグラウンド染色が観察されて、細胞表面上でＣＤ８ドメインとＭＨＣ分子の間でペプチド非依存的な相互作用が生じたことを示唆している。Ｔ細胞上で発現されたＣＤ８分子と結合するｐＭＨＣＩ四量体について同様な効果が報告されている（３８）。

【0246】

ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体のペプチド特異的相互作用の結果を表面プラズモン共鳴分析で更に確認した。ＯＴ１ｓｃＴＣＲ／ｓｃＣＤ８ヘテロ二量体のＯＶＡペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体に対する結合親和性（ＫＤ）を、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体について観察された〜３０μＭより有意に高い、２．６μＭであると推定した（表１、図４３）。どの融合タンパク質もコントロールＶＳＶペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体との結合を示さなかった。

【0247】

ＯＴ１ｓｃＴＣＲ二量体の２価特性がこのアッセイ形式で増大した機能的親和性をもたらすと期待されることを考えると、特異的ｐＭＨＣＩ結合活性の相違は驚くべきことである。更に、可溶性ＴＣＲ、ＣＤ８α／β及びｐＭＨＣＩタンパク質を独立した成分として用いて行った同様なＳＰＲ結合研究はＣＤ８タンパク質とペプチド／Ｈ−２Ｋｂ複合体の間に単に弱い相互作用（ＫＤ３０〜１００μＭ）のみを示し、ＴＣＲ：ペプチド／Ｈ−２Ｋｂ相互作用に対するＣＤ８の協調的効果を示さなかった（３９〜４１）。まとめると、これらのデータは、ＯＴ１ｓｃＴＣＲ融合体へのＣＤ８α／βドメインの付加は、２価ＯＴ１ｓｃＴＣＲ分子の作成よりもｐＭＨＣＩ結合により大きい影響を及ぼすことを示している。本発明者らの結果は更に、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドは、複雑なタンパク質−タンパク質相互作用に適合する柔軟性を有する機能的な二重特異性分子を作成するために用いることができることを明らかにしている。また、本発明らは機能的なＣＤ８分子を可溶性１本鎖分子として構築できることを初めて示して、ｓｃＣＤ８ドメインがヘテロ二量体分子内でＯＴ１ｓｃＴＣＲと複合体を形成すると、その他の接着分子が存在していない無細胞条件下で、ＴＣＲ：ｐＭＨＣＩ相互作用を増強することを明らかにした。

【0248】

（機能的ＴＣＲα／βヘテロ二量体の作成）−
上で示したように、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαドメインのＮ−末端は複合体の遠位末端にあり、このスカフォールドが多鎖タンパク質のポリペプチドと融合するために適しているか否かという問題を提起している。ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドを用いて可溶性で、生物活性なヘテロ二量体ＴＣＲα／βを構築できるか否かを確認するために、細胞外ＯＴ１ ＴＣＲ Ｖα−Ｃα及びＶβ−ＣβドメインのＣ−末端をそれぞれ、ｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡのＮ−末端に結合した。公表されているα／βＴＣＲの結晶構造に基づくと、適切に折り畳まれたＯＴ１ ＴＣＲα／β分子のＴＣＲ Ｃα及びＣβ Ｃ−末端アミノ酸は〜１８Å離れていると推測される（４２）。ＯＴ１ ＴＣＲα／ｈＩＬ−１５及びＯＴ１ ＴＣＲβ／ｈＩＬ−１５αＳｕ／ｂｉｒＡ融合遺伝子を２つの別々の発現ベクター内にクローンしてＣＨＯ細胞内に同時にトランスフェクトした。分泌された融合タンパク質複合体を上記のように抗ＴＣＲ Ｃβ ｍＡｂアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。還元条件下のクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると、精製されたタンパク質のバンドが、２つの融合分子それぞれの計算された単量体ＭＷ（４０ｋＤａ）と一致して、５０ｋＤａに移動した（データは示されていない）。

【0249】

精製したタンパク質を更に機能的ＥＬＩＳＡ（抗ＴＣＲ Ｃβ ｍＡｂで捕獲：ＯＶＡペプチド／Ｈ２−Ｋｂ四量体でプローブ）で特性化した。図４０Ａに示すように、精製したタンパク質は１本鎖形態にあるＯＴ１ ＴＣＲと同等のｐＭＨＣＩ結合活性を有していることが分かった。同様な結果が、ｐ５３特異的２６４ＴＣＲのＶα−Ｃα及びＶβ−Ｃβ鎖とのｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡ融合体で観察された（図４０Ｂ）。哺乳動物細胞内で可溶性α／βＴＣＲヘテロ二量体を産生する以前の試みは殆どうまくいかなかった（４３、４４）。従って、本発明者らの結果は、トランスフェクト細胞内でｈＩＬ−１５及びｈＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｂｉｒＡドメインの結合によってＴＣＲα及びβ鎖が適切に折り畳まれていたことを示唆している。興味深いことに、ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドのＮ−末端との融合は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｃ１４９ｓｃＴＣＲヘテロ二量体複合体を用いて観察されたように機能的に独立した結合ドメインにとって十分な空間配置を提供できるる一方、ＯＴ１ ＴＣＲ及び２６４ＴＣＲのα及びβ鎖のような近接して対合している鎖の折り畳みを可能にする柔軟性を保持している。

【0250】

（ｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ融合複合体についてのｈＩＬ−１５ドメインの生物活性）−
ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体のｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαドメインのＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５ＲβγＣ）結合能力をｈＩＬ−１５Ｒβ及びネズミγＣ（ｍγＣ）鎖を担持している３２Ｄβ細胞を用いるフローサイトメトリー分析で評価した。これらの検討は野生型ｈＩＬ−１５ドメインを含有しているｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体を、更にｈＩＬ−１５Ｒβ鎖との結合を増強する（Ｎ７２Ｄ）又は減少する（Ｄ８Ｎ）ことが先に示されている（２５）ＩＬ−１５突然変異タンパク質ドメインを有する二量体も用いて実施した。また、本発明者らは、これらの突然変異がｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体の形成に影響を及ぼさないことを明らかにしている（２５）。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体と培養した後、３２Ｄβ細胞を抗ＴＣＲ ｍＡｂで染色して細胞に結合している融合タンパク質二量体を検出した。図４１Ａに示したように、３２Ｄβ細胞はｈＩＬ−１５野生型又はｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄドメインを含有しているｃ２６４ｓｃＴＣＲ二量体によって確実に染色されたが、ｈＩＬ−１５Ｄ８Ｎドメインを含有しているものでは染色されず、複合体のＩＬ１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ部分が予測されたＩＬ−１５ＲβγＣ結合活性を保持していることを示唆した。

【0251】

融合タンパク質二量体のｈＩＬ−１５生物活性も３２Ｄβ細胞を用いる細胞増殖アッセイで試験した。図４２Ｂに示すように、単量体（ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５融合体）又は二量体（ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５：ｓｃＴＣＲ／ｈＩＬ−１５ＲαＳｕ）融合形態中のｈＩＬ−１５野生型ドメインは濃度依存的に３２Ｄβ細胞の生育をサポートできた、〜３００ｐＭの半数最大刺激（half-maximal stimulation：ＥＣ_５０）を示した。ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＤ８Ｎドメインは、これらが単量体又は二量体融合体中の何れに存在しているかに関わらず、それぞれ融合タンパク質の生物活性を増大又は消去した。これらの結果は、Ｎ７２Ｄ又はＤ８Ｎ突然変異体を担持している非融合ＩＬ−１５サイトカインで観察された機能活性と一致している（２５）。従って、２つの独立したＴＣＲドメインを含有している融合タンパク質複合体の形成はＩＬ−１５ドメインの生物活性を有意には変化させない。対照的に、ＯＴ１ ＴＣＲα／βヘテロ二量体複合体に関してはＩＬ−１５活性の少なくとも３倍の損失があり（データは示されていない）、ヘテロ二量体ＴＣＲ構造の形成が、ある程度、ｈＩＬ−１５ドメインのｈＩＬ−１５ＲβｍγＣと相互作用する能力を阻害することを示唆した。更に、これらの結果は、ｈＩＬ−１５ドメインが受容体結合及び機能活性を増強又は減少できるように容易に操作できて、よって異なる適用においてｈＩＬ−１５：ｈＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドの使用に更に柔軟性をもたらすことを示している。

【0252】

実施例１６− 免疫正常マウスにおけるＴ２分子の毒性プロファイル及び抗腫瘍活性
Ｔ２分子、ＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインを欠失しているＴ２Ｍ（Ｔ２ＭΔＣＨ１）及び非標的化Ｔ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１タンパク質複合体の更なるインビボ効果を確認するために、腫瘍担持免疫正常Ｃ５７ＢＬマウスにおいて毒性及び抗腫瘍活性を試験した。Ｂ１６（５×１０^５／マウス）又はＥＧ７（１×１０^６／マウス）ネズミ腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄマウスに試験０日目に皮下に注射した。試験１、４、８及び１１日目に腫瘍担持マウスに、５１又は２５．５μｇ／用量のＴ２タンパク質（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１鎖から成る）、４７．７μｇ／用量のＴ２ＭΔＣＨ１（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ＣＨ２−ＣＨ３鎖から成る）（Ｔ２タンパク質の５１μｇ／用量と等モル）、１６．６又は８．３μｇ／用量のＴ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１（ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ＣＨ２−ＣＨ３鎖から成る）（それぞれＴ２タンパク質の５１及び２５．５μｇ／用量と等モル）、又は１．２μｇ／用量のｒｈＩＬ−１５（Ｔ２タンパク質の２５．５μｇ／用量と等モル）を静脈内に注射した。試験期間中、動物の体重及び腫瘍の容量を測定して結果をプロットした（図４４Ａ−Ｂ及び４５Ａ−Ｂ）。

【0253】

Ｔ２Ｍ、Ｔ２ＭΔＣＨ１及びＴ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１タンパク質による処置はＰＢＳ処置後に観察されたものより有意にＢ１６（図４４Ａ）及びＥＧ７（図４５Ａ）腫瘍の生育を阻害して、それぞれの融合タンパク質複合体は等モル濃度で投与されたｒｈＩＬ−１５よりもより有効であった。また、腫瘍担持マウスの体重変化の測定の通り、Ｔ２Ｍ、Ｔ２ＭΔＣＨ１及びＴ２ＭΔＴＣＲΔＣＨ１処置の細胞毒性効果は殆ど或いは全くなかった（図４４Ｂ及び４５Ｂ）。メカニズムにとらわれることなく、これらのデータは、免疫正常マウスにおいてこれらの分子のインビボ免疫刺激活性と一致している（実施例１３）。

【0254】

実施例１７− Ｔ２Ｍ及びその誘導体の免疫刺激及び抗腫瘍活性の更なる特性化
同様な標的化ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ複合体を更に特性化するために、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ−１５及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ−１５Ｒα／ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質を同時発現する組み換えＣＨＯ細胞株を作成した。ある場合は、ヒトＩｇＧ１ドメインは全重鎖定常（ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）を包含し、第２の場合は、ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（すなわち、ΔＣＨ１）又はＦＣドメインを上記のようにして用いた。ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン又はＦｃドメインのタンパク質配列を図４６に示す。簡単にするために、この実施例では、得られたｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄスーパーアゴニスト：ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｒα／ＩｇＧ１ ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３複合体をＴ２分子（Ｔ２Ｍ）と、そしてｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄスーパーアゴニスト：ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｒα／ＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３複合体をＴ２Ｍ２（上記のようにＴ２ＭΔＣＨ１とも）と称する。これらの複合体の利点はＦｃドメインを介する二量体化及びＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαドメインの間の相互作用が、ＩＬ−１５Ｒβγ陽性細胞及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）陽性細胞と結合可能な四量体標的化分子を生ずることである。また、これらのドメインそれぞれの活性を同種受容体との相互作用を減少する突然変異体によって分析できる。組み替えＣＨＯ細胞による可溶性発現の後、これらの複合体を抗ＴＣＲ ＣβｍＡｂ−セファロース及びプロテインＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーで精製して均質にした。サイズ排除クロマトグラフィーが、無傷の複合体について期待されているサイズに分子が移動したことを示した。

【0255】

上記分析と同様に、ＥＬＩＳＡに基づく方法が、Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２のｓｃＴＣＲ及びＩＬ−１５ドメインがそれらそれぞれの結合活性を保持することを確認している。更に、Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２のＩｇＧ１ドメインは、ｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ１融合体のそれに匹敵する活性を有するペプチド／ＨＬＡ四量体での特異的検出を可能にするＦｃ受容体（ＦｃＲ）担持細胞を結合する能力を保持している。Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２はｐ５３（ａａ２６４−２７２）／ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示している標的細胞に対するヒトリンパ球のＡＤＣＣ活性を介在することができた（図４７）。これらの結果は、Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２がｓｃＴＣＲ−ＩｇＧ融合体について先に記載される抗体様エフェクター機能を保持していることを立証する。ＦｃＲ結合活性を減少するＦｃ突然変異（ＬＡＬＡ）を含有している複合体を用いる検討は機能的ＦｃドメインがＡＤＣＣ活性に必要であったことを明らかにした。Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２はＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞株の生育もサポートしたが、Ｔ２Ｍ２はＴ２Ｍより約〜３倍低いインビトロＩＬ−１５活性を示した。マウスにおける免疫応答を刺激するこれらの分子の能力も評価した。ＩＬ−１５（１ｍｇ／ｋｇ）によるＣ５７ＢＬ／６マウスの処置は、白血球（ＷＢＣ）数、脾臓重量又は血中のＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団に殆ど或いは全く影響を与えなかったのに対して、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα−ＩｇＧ ＣＨ２−ＣＨ３複合体（ＩＬ−１５の用量と等モルで）による処置は、同様なＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα−Ｆｃ複合体で先に観察された結果と一致して、脾腫及び上昇した血液ＣＤ８＋Ｔ細胞レベルをもたらした（図４８Ａ及びＢ）。Ｔ２Ｍ２複合体は等モル用量でより強力な免疫刺激効果を示して（３２Ｄβ細胞に対してより低いＩＬ−１５活性を示したにもかかわらず）、Ｔ２Ｍ及びＴ２Ｍ２複合体の両方はＷＢＣレベル、脾臓重量及び血液ＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増加を刺激した。同様な処置によるＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞数に対する効果が脾臓において観察された。Ｔ２Ｍ２及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ＩＬ−１５Ｒα−ＩｇＧ複合体で処置したマウスから単離した脾細胞が、ＮＫ感受性ＹＡＣ細胞に対して細胞溶解活性を示した（図４８Ｃ）。用量応答検討は、０．４ｍｇ／ｋｇという低い単回用量レベルでもこれらの効果が観察されることを示している（図４９Ａ）。Ｔ２Ｍ２及びＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ＩＬ−１５Ｒα−ＩｇＧによるヌードマウスの処置は、血液及び脾臓中のＮＫ細胞のパーセントが処置後４日目に増加して、これが処置後７日目にベースライン値付近まで減少したことを示した（図４９Ｂ）。まとめると、これらの結果は、Ｔ２Ｍ２複合体がマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞応答を、ＩＬ−１５のそれよりそしてＮＫ細胞については ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ＩＬ−１５Ｒα−ＩｇＧ複合体のそれより有意に高い活性で刺激可能であったことを示している。

【0256】

これらの複合体の抗腫瘍活性をヌードマウスにおける皮下Ａ３７５異種移植モデルで更に試験した。初期の研究では、組み換えヒトＩＬ−１５、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｒα複合体は、ｓ．ｃ．Ａ３７５腫瘍異種移植に対してＰＢＳ又はｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５Ｒα融合タンパク質処置と比較して効果を示さなかった（図５０Ａ）。このモデルにおけるＴＣＲ−ＩＬ１５融合の効果の欠如は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ２融合体を用いて報告されている結果と対照的に、これらのタンパク質がＮＫ細胞応答を刺激できないことに起因していると思われる。上で示したように、Ｔ２Ｍ複合体をこのモデルで試験すると、ＮＫ細胞増殖を刺激するこれらの能力と一致して、これらは中等度だが統計的に有意な抗腫瘍活性を示した（図５０Ｂ）。しかし、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５融合の等モル量による処置とは対照的に、Ｔ２Ｍの用量スケジュール（３週間１日おきに４ｍｇ／ｋｇ）は有意な体重減少及び最終投与後６匹マウスのうち２匹の死亡をもたらした。臨床所見はマウスの不活発化、猫背姿勢、及び赤みかかった肌を含んでいた。別のモデルにおけるＩＬ−１５タンパク質複合体の同時研究は、繰返し１日おき投与は良好な耐容性がないこと及び週に１回の投与が過剰な毒性なしで免疫刺激をもたらすことを立証した。１日おきから週に１回への用量計画の変更によって、ＮＫ細胞増殖の誘発に有効であることを示した用量レベルで、Ｔ２Ｍ２複合体がＩＬ−１５又はＰＢＳ処置と比較して有意により強い抗腫瘍活性を示した（図５０Ｃ）。更に重要なことは、この週に１回の投与計画が腫瘍担持ヌードマウス及び免疫正常マウスにも良好な耐容性をもたらした。

【0257】

ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５融合体及びＴ２Ｍ複合体の毒性プロファィルを上記のインビボ活性試験と同時に評価した。上に示したように、ｓｃＴＣＲ−ＩＬ１５融合体による３週間の１日おき処置は腫瘍担持ヌードマウスに良好な耐容性をもたらしたが、Ｔ２Ｍ（４ｍｇ／ｋｇ）処置は動物の＞３０％死亡率をもたらした。これを更に、１週間１日おきに９、１８、又は３６ｍｇ／ｋｇのＴ２Ｍ又は等モル量のＴ２Ｍ２複合体を投与したＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂ−トランスジェニックマウスで評価した。処置の開始１週間後に、体重及び臨床所見において用量及び時間に依存する効果が見られた。３６ｍｇ／ｋｇのＴ２Ｍを投与されたマウスは当量のＴ２Ｍ２で処置されたマウスで観察された１２％減少と比較して体重の２０％損失を示した。〜９ｍｇ／ｋｇのＴ２Ｍ又はＴ２Ｍ２で処置されたマウスは１週間の期間を越えても体重の変化が観察されなかった。興味深いことに、Ｔ２Ｍで観察されたより高い毒性は、Ｔ２Ｍ２で処置したマウスがＴ２Ｍで処置されたマウスより高いレベルのＷＢＣ数及びＮＫ細胞レベルを示したように、増大した免疫細胞の活性化と相関しなかった。マウスの体重、脾臓重量及び免疫細胞に対する最小効果を０．４ｍｇ／ｋｇのＴ２Ｍ２の単回用量ｉ．ｖ．投与後に観察した。更に、カニクイザルでの予備検討がＴ２Ｍの０．５ｍｇ／ｋｇ単回ｉ．ｖ．用量が観察された毒性効果を何も引き起こさず、しかしＣＤ８＋記憶Ｔ細胞及びエフェクターＮＫ細胞増殖を誘発できたことを示した。これらの検討の結果は、強力な免役刺激及び抗腫瘍活性並びに好ましい毒性及び薬物動態プロファイルを有する標的化ＩＬ−１５融合複合体を作成できることを示している。これらの検討を介して、最適化されたＴＣＲ−標的化Ｔ２Ｍ２（ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄ及びｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３鎖から成るＴ２ＭΔＣＨ１とも称する）を定義して特性化した。ｃ２６４ｓｃＴＣＲ／ｈｕＩＬ１５ＲαＳｕｓｈｉ／ｈｕＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図５１及び５２に示す。

【0258】

実施例１８− 抗体標的ドメイン含んでいるＴ２分子の特性化
更なる疾患標的分子を作成するためのｈｕＩＬ−１５：ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕスカフォールドの有用性を明らかにするために、抗ヒトＣＤ２０単鎖抗体のＣ−末端をｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）鎖のＮ末端と結合して構築物を作成した。抗ヒトＣＤ２０単鎖抗体（抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ）配列は柔軟なリンカー配列を介して結合しているリツキシマブ抗体の重鎖及び軽鎖Ｖドメインのコード領域を包含している。抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図５３及び５４に示す。抗ＣＤ２０ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ構築物の核酸及びタンパク質配列をそれぞれ、図５５及び５６に示す。これらの配列を上記のような発現ベクター内にクローンして発現ベクターをＣＨＯ細胞内にトランスフェクトした。２つの構築物の同時発現が、可溶性抗ＣＤ２０ ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０ ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ複合体（抗ＣＤ２０ ｓｃＡｂ Ｔ２Ｍと称する）の形成及び分泌を可能にして、これをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてＣＨＯ細胞培養上澄液から精製した。

【0259】

上記の分析とと同様に、ＥＬＩＳＡに基づく方法は、抗ＣＤ２０ ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：抗ＣＤ２０ ｓｃＡｂ／ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ複合体の形成を立証した。更に、上記のような３２Ｄβ細胞を用いる１Ｌ−１５受容体結合及び細胞増殖アッセイは、この複合体がＩＬ−１５結合及び生物活性を示すことを示唆した。次いで、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ複合体をヒトＣＤ２０^＋バーキットリンパ腫ダウディ細胞株に対する抗原特異的結合活性について試験した。ダウディ細胞を抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ Ｔ２Ｍ又はＰＢＳと培養した。洗浄工程に続いて、細胞に結合した融合タンパク質複合体を、ＰＥと共役しているヤギ抗ヒトＩｇ抗体（ＧＡＨ−Ｉｇ−ＰＥ）を用いてフローサイトメトリーで検出した（図５７）。抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ複合体は、ｃ２６４ｓｃＴＣＲ Ｔ２Ｍ又はＧＡＨ−Ｉｇ−ＰＥでは観察されなかったダウディ細胞との有意な結合を示し、これらの細胞との特異的な反応性を示唆した。

【0260】

抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ複合体がＡＤＣＣに基づくメカニズムを介してＣＤ２０^＋腫瘍細胞を殺傷できたか否かを確認する試験も実施した。カルセイン−ＡＭで標識したダウディ標的細胞をヒトＰＭＢＣ（Ｅ：Ｔ‐１００：１）及び各種濃度の抗ＣＤ２０ｓｃＴ２Ｍ、ｃ２６４ｓｃＴＣＲＴ２Ｍ（陰性コントロール）又はキメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂ（陽性コントロール）と混合した。培養期間後に、標的細胞溶解を上記のように評価した。図５８に示すように、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ複合体はＣＤ２０^＋ヒトリンパ腫細胞に対するＡＤＣＣ活性を介在することにおいて非常に効果的であった。異なったエフェクターと標的細胞の比を試験する同様な検討でこのことが立証されて、ここで抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ複合体（２ｎＭで）はキメラ抗ＣＤ２０ｍＡＢに匹敵する活性を示した（図５９）。

【0261】

これらの結果に基づくと、抗ＣＤ２０ｓｃＡｂＴ２Ｍ分子は標準的な異種移植腫瘍モデル（例えば、 Rossi et al. Blood 2009;114:3864; Gillis et al. Blood. 2005;105:3972;及び Xuan et al. Blood 2010;115:2864-2871を参照されたい）においてヒトリンパ腫細胞に対して抗腫瘍活性を示すことが期待される。

【0262】

更に、それぞれが個々にｈｕＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１Ｃｈ２−ＣＨ３（Ｆｃ）鎖と融合している（又はその逆）抗ＣＤ２０軽鎖及び重鎖ドメインを含むＴ２Ｍ構築物を本明細書に記載のように作成して発現できる。２つのこのような融合構築物の核酸及びタンパク質配列を図６０〜６３に示す。これらの融合タンパク質を含む精製した複合体は、上記のように、Ｆｃドメイン及びＩＬ−１５生物活性、並びにＣＤ２０に特異的な結合活性を示すことが期待される。これらの複合体はＣＤ２０^＋腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性を介在すること及びインビボでＣＤ２０^＋腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性が期待される。

【0263】

その他のＣＤ抗原、サイトカイン又はケモカインの受容体又はリガンド、成長因子の受容体又はリガンド、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、陽性／陰性同時刺激受容体又はリガンド、死受容体又はリガンド、腫瘍関連抗原、ウィルスコード及び細菌コード抗原、並びに細菌特異的抗原に特異的な抗体配列を用いてｓｃＡｂ又は抗体認識ドメインを含む同様なＴ２Ｍ構築物を容易に作成できる。特に興味深いのは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ１４７、ＣＤ２２１、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、ＣＥＡ、ＯＸ４０リガンド、ｃＭｅｔ、組織因子、ネクチン−４、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＥＧＦＬ７、ＦＧＦＲ、ＩＬ−６受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＧＤ２、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、細胞死受容体５、ＭＵＣ１、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ、Ｔｒａｉｌ Ｒ２、葉酸受容体、アンジオポエチン−２、αｖβインテグリン受容体及びＨＬＡ−ＤＲ抗原のエピトープに特異的な抗体ドメインを有するＴ２Ｍである。ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＣ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＲＳＶ及びその他のウィルスに由来するウィルス抗原に対する抗体ドメインも興味深く、特にＨＩＶエンベロープスパイク並びに／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１エピトープを認識するものが興味深い。このような抗体ドメインは当該技術分野で公知の配列から作成できるか或いは当該技術分野で公知の各種供給源（すなわち、脊椎動物宿主又は細胞、コンビナトリアルライブラリー、ランダム合成ライブラリー、コンピュータモデリング等）から新たに単離できる。

【0264】

更に、前述の通り、ＩＬ−１５ドメイン及びＩｇＧ Ｆｃドメインの活性を増大又は減少して、抗体標的Ｔ２複合体の治療インデックスを最適化しそして毒性を最小化することは有益である。Ｆｃドメインの活性を改変する方法は上に記載されていて当該技術分野で十分に特性化されている。このような場合、その活性を減少する突然変異をＩＬ‐１５ドメインに含んでいる複合体はよりすぐれた治療活性及びより低い毒性をもたらすことが期待される。ＩＬ−１５ドメインに上記のＮ６５Ｄ又はＤ８Ｎ置換、又はＩＬ−１５活性を減少することが知られている、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａを包含するその他の置換を含んでいる抗体標的Ｔ２分子が特に興味深い。

【0265】

実施例１９： ＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合遺伝子の同時発現
以前の研究は組み替えＩＬ−１５は哺乳動物の細胞によって発現されにくいことを示している（A. Ward et al., Protein Expr Purif 68 (2009) 42-48）。しかしながら、ＩＬ−１５Ｒαを用いる細胞内複合体形成はＥＲにおいてＩＬ−１５分解を抑制することが報告されている（C. Bergamaschi et al., J Biol Chem 283 (2008) 4189-4199）。従って、ＩＬ−１５は、これをＩＬ−１５Ｒαと同時発現するとより高いレベルで産生できると仮定された。Ｎ末端にいわゆる「ｓｕｓｈｉ」ドメイン（Ｓｕ）を含んでいる、可溶性ＩＬ−１５Ｒα断片はサイトカイン結合に関与する殆どの構造要素を担持することが知られている。可溶性ＩＬ−１５ＲαＳｕ（その膜貫通ドメインを含まない）とＩＬ−１５は溶液中で非常に安定なヘテロ二量体複合体を形成でき（複合体のＫｄ＝１００ｐＭ（G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12））、そしてこれらの複合体はＩＬ−１５Ｒβγ_ｃ複合体を介して免疫応答を調節（すなわち、刺激又は阻害）できる（E. Mortier et al., J Biol Chem 281 (2006) 1612-1619; M.P. Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 9166-9171; T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080; G. Bouchaud et al., J Mol Biol 382 (2008) 1-12）。従って、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃから成る複合体の産生のために選択した（図６４を参照されたい）。ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインをヒトＩｇＧ−Ｆｃ領域と遺伝的に融合して精製及び鎖間ジスルフィド結合による二量体化を促進した。ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃを同時発現するために、２つの個別レトロウィルスに基づく発現ベクター、ｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを構築して、ＣＨＯ細胞に同時にトランスフェクトした。組み替えＣＨＯ細胞を、２つの発現ベクターによってもたらされたネオマイシン及びピューロマイシン耐性要素に基づいて選択し、次いで、限定希釈クローニングを用いて個々の生産細胞株を作成した。無血清規定培地中で、ＥＬＩＳＡに基づき、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を約１００ｍｇ／Ｌ産生できるクローンを同定した。この結果は、ＩＬ−１５が哺乳動物細胞中でＩＬ−１５ＲαＳｕドメインと同時発現されると高レベルで発現され得るということを明らかにした。

【0266】

実施例２０： ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の精製及び特性化
ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃとＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを組み替えＣＨＯ細胞内で同時発現して細胞内で構築すると、細胞培養上澄液内に４つの異なったタンパク質の形態が予測された：１）２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄサブユニットで完全に占有されている二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子、２）１つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄサブユニットで部分的に占有されている二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子、３）ＩＬ−１５結合がない少量の遊離ホモ二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子、及び４）遊離ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ。ＩＬ−１５Ｎ７２ＤはＦｃ領域を欠失しているので、培養上澄液中の全てのＦｃを担持する融合タンパク質から遊離ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを分離するためにｒプロテインＡに基づくアフィニティー精製工程を用いた。

【0267】

次いで、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の多種の形態を分離するためにイオン交換クロマトグラフィーを展開した。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ二量体分子の計算した等電点（ｐＩ）は８．５である。予測通りに、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０溶液中のこのタンパク質はその後ＱＳＦＦ樹脂に結合しないことが分かった。また、計算したＩＬ−１５Ｎ７２ＤのｐＩは４．５である。従って、部分的に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（すなわち、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ＋１つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子）と完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（すなわち、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ＋２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ分子）の全体の電荷は異なることが予測された。このことは、プロテインＡの精製した調製物のＩＥＦゲル分析と一致していて、これは５．６〜６．５と６．８〜７．５のｐＩを有する２つの主要な複合体のグループが完全に占有されている複合体と部分的に占有されている複合体の予測されるｐＩとそれぞれに一致することを明らかにした（図６５Ａ）。各タンパク質群のｐＩバンド間の不均質性は恐らくＩｇＧ１鎖におけるグリコシル化及びＣ−末端リジン変異体の程度に起因している。従って、異なったイオン強度を有する緩衝液をＱＳＦＦから完全に占有されている複合体と部分的に占有されている複合体を別々に溶出するために用いた。１３０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて単一タンパク質画分（Ｑ工程１）をＱＳＳＦから溶出して、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子の部分占有を確認するＥＬＩＳＡに基づいて、主に部分的に占有されている複合体を含有していることが分かった。３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いる次の工程で、Ｑ１ｃ及びＱ２ｃと称する２つのタンパク質画分がＱＳＦＦから溶出された。これらの調製物に行ったＥＬＩＳＡ分析が、Ｑ１ｃ画分が部分的に占有されている複合体（全体の１０％）と完全に占有されている複合体（９０％）の混合物を含んでいたのに対してＱ２ｃ画分が完全に占有されている複合体のみを含んでいたことを示した（データは示していない）。これらの知見は精製したタンパク質製剤のＩＥＦゲル分析と一致している（図６５Ｂ）。Ｑ工程１から溶出したタンパク質は５．６〜７．５の範囲の広いｐＩを有している：ｐＩが６．８〜７．５のタンパク質は部分的に占有されている複合体を示している。Ｑ工程２溶出の画分Ｑ１ｃは５．６〜６．５の範囲のｐＩを有するタンパク質（すなわち、完全に占有されている複合体）を主に含んでいたが、５．６〜７．５のｐＩを有する少量の夾雑タンパク質を含んでいた。Ｑ２ｃ画分は５．６〜７．５の範囲のｐＩを有するタンパク質のみを含んでいた。

【0268】

ＳＥＣ分析で、精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＱ２ｃ調製物が高純度で単一分子として溶出することが分かった（図６６）。ホモ二量体の推定分子量は約１１４ｋＤａであり、これはＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃの融合タンパク質の推定アミノ酸配列に基づいて算出した分子量９２ｋＤａより大きかった。これは哺乳動物細胞で生産したタンパク質のグリコシル化に起因していると思われる。

【0269】

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６５Ｃ）で、精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ調製物は４０ｋＤａ、１６ｋＤａ及び１３ｋＤａの分子量を有する３つのタンパク質を含んでいることが分かった。しかしながら、Ｎ−グリコシダーゼＦで消化した後は、〜３７ｋＤａ及び１３ｋＤａの分子量を有する２つのタンパク質のみが検出された（図６５Ｄ）。これらの分子量はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ‐１５又はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄの計算した分子量にごく近い。このことはこれら２つのタンパク質が哺乳動物細胞で生産中にグリコシル化されて、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄは１３ｋＤａと１６ｋＤａの分子量を有する２つの主要なグリコシル化形態で産生されたことを示唆している。図６５Ｃに示されている異なった精製画分中にあるこれらのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ種の相対存在量は、ＥＬＩＳＡ及びＩＥＦゲル分析で確認された複合体の占有のレベルと一致している。

【0270】

ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃは還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されてこれらのＮ−末端アミノ酸配列はエドマン分解法で確認された。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃとＩＬ−１５Ｎ７２Ｄについて、それぞれ約１５のＮ−末端アミノ酸配列が得られた。これらのタンパク質の確認されたＮ−末端アミノ酸配列は２つの遺伝子コード領域から推定されるこれらのアミノ酸配列と一致した。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の１３及び１６ｋＤａに現れた２つの主要バンドに対するアミノ酸配列はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄであることが確認された。この配列確認は哺乳動物細胞におけるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄのグリコシル化の証拠を再びもたらした。

【0271】

実施例２１： ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の薬物動態特性
ＩＬ−１５及びインビトロで構築されたＩＬ１５：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ複合体は、マウスにこれらのタンパク質を腹腔内注射したときに、それぞれ１時間及び２０時間の血清半減期を有していたことが先に報告されている（T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080）。ＩＬ−１５及び同時に発現させた、精製したＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ複合体を静脈内に投与したときに同様に挙動するか否かを評価するために、それらの薬物動態パラメータをＣＤ−１マウスで確認した。静脈内投与は、ヒトにおいてＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ−Ｆｃ複合体に関して用いられる薬剤送達のルートであると思われるので静脈内投与を選択した。雌のマウスに１．０ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ又は０．２８ｍｇ／ｋｇのＩＬ−１５（等モル用量）を静脈内に注射して、ＩＬ−１５については注射後１５分から８時間、そしてＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃについては３０分から７２時間の様々な時点に血液を採取した。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃの血清濃度を２つのＥＬＩＳＡ形態、無傷の複合体を検出する第１法（抗ＩＬ−１５ＡＢ検出）及びＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質のみを検出する別法（抗ヒトＩｇＧ ＦｃＡｂ検出）を用いて評価した。ＩＬ−１５の濃度は標準的なＩＬ−１５特異的ＥＬＩＳＡで評価した。

【0272】

単回静脈内急速注射後のＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−１５についての予測フィット及び実際のデータを図６７に示す。抗ＩＬ−１５Ａｂに基づく、又は抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ａｂに基づくＥＬＩＳＡを用いるＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃの推定半減期はそれぞれ、約２５時間又は１８時間であった。これらの結果は、インビボでこの融合タンパク質は開裂せず、そしてＩＬ−１５はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ分子から有意には解離しなかったことを示している。ＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃのクリアランス（Ｃｌ）は０．０５９〜０．０５１ｍＬ／時間に及んで、定常状態における分布の容積（Ｖｓｓ）はアッセイの形式に依存して２．１〜１．３ｍＬに及んだ。これと比べると、ＩＬ−１５は０．２４時間の吸収半減期及び０．６４時間の消失半減期を有していた。ＩＬ−１５のＣｌは４９ｍＬ／時間であり、そしてＶｓｓは１８．４ｍＬであった。これらの結果は、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃが、ＩＬ−１５より＞２４倍長い消失半減期を示し、そして＞８００倍遅く排泄されることを示している。

【0273】

実施例２２： ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体のインビトロ及びインビボ生物活性
同時発現及び精製されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の生物活性をＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞増殖アッセイを用いて評価した。このアッセイのために、インビトロで構築した（ＩＶＡ）ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ ＩＶＡ）もＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃを１：１の比で４０℃で３０分混合して作成した。図６８に示すように、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体は３２Ｄβ細胞の生育をサポートするＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ ＩＶＡと同等の活性を有していた。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体は１５．６１ｐＭのＥＣ_５０を示し、そしてＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ ＩＶＡは１５．８３ｐＭのＥＣ_５０を示した。このことは、同時発現されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体は細胞内で適切に処理されて精製後も完全なＩＬ−１５活性を保持していることを明らかにしている。従って、本明細書に提示されている方法は、個々に産生したインビトロ構築及びある場合はリフォールディングタンパク質を用いる現在の戦略よりもｃＧＭＰグレードの臨床材料を作成するための優れた手段を示している。

【0274】

ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体とＩＬ−１５ｗｔも、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＮＫ細胞及びＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を誘発するそれらの能力について比較した。図６９に示すように、ＩＬ−１５ｗｔは０．２８ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後４日目にＮＫ及びＣＤ８^＋細胞の増殖に対して有意な効果を有していない。これに対して、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体は血中及び脾臓内のＮＫ及びＣＤ８^＋細胞の増殖を有意に促進し、これは血中のリンパ球増加症及び脾腫を導いた（図６９及び７０）。これらの知見はＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体がインビボでＩＬ−１５の生物活性を有意に増大したという先の報告と一致している（M.P. Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103 (2006) 9166-9171; T.A. Stoklasek et al., J Immunol 177 (2006) 6072-6080; S. Dubois et al., J Immunol 180 (2008) 2099-2106; M. Epardaud et al., Cancer Res 68 (2008) 2972-2983; A. Bessard et al., Mol Cancer Ther 8 (2009) 2736-2745）。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体のこの増大した活性は、Ｎ７２Ｄ突然変異タンパク質のＩＬ−１５Ｒβγｃ複合体との増大した結合活性（X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607）、インビボにおけるＩＬ−１５Ｒα鎖による最適化されたサイトカインのトランス提示（樹状細胞及びマクロファージ上のＦｃＲ受容体を介して）、サイトカインドメインの二量体特性（ＩＬ−１５Ｒβγ_ｃとの結合について増大した親和性）及びＩＬ−１５と比較して増大したインビボ半減期（２５時間対＜４０分）との組み合わせの結果と思われる。

【0275】

要約すると、本明細書に記載されている結果は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ遺伝子は組み換えＣＨＯ細胞において同時発現させることができて、完全に占有されているＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体は単純に拡張可能な精製方法を用いて細胞培養上澄液から高度に精製できることを明らかにする。

【0276】

上記実施例は以下の材料及び方法を用いて実施した。

【0277】

（タンパク質複合体発現のためのベクターの構築）
ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合遺伝子をヒトＩＬ−１５Ｒα（ヒトＩＬ−１５Ｒαのａ
ａ１−６６）のｓｕｓｈｉドメイン及びヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片をコードするＤＮＡ鋳型の
オーバーラップＰＣＲ増幅によって構築した。シグナルペプチド−ＩＬ−１５ＲαＳｕコ
ード領域（R.L. Wong et al., Protein Eng Des Sel 24 (2011) 373-383）及びヒトＩｇ
Ｇ１−Ｆｃ遺伝子断片（L.A. Mosquera et al., J Immunol 174 (2005) 4381-4388）をプ
ライマー対：
ＢＡ４９４：５’−ＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣ
ＡＧＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１６）；
ＢＡ５５０Ｒ：５’−ＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＣＴＣ
ＴＡＡＴＧＣＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＧＧＧＧＧＴＴＧ−３’（配列番号２２）、及び
ＢＡ５５０Ｆ：５’ＧＡＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２３）；
ＢＡ３９３Ｒ：５’−ＧＴＡＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＧＣＧＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＣ
ＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１５）
をそれぞれ用いて増幅した。得られたＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合遺伝子をピューロマ
イシン耐性発現ベクターｐＭＳＧＶ−１（M.S. Hughes et al., Hum Gene Ther 16 (2005
) 457-472）内にライゲートして発現ベクターｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃを
構築した。

【0278】

ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄのコード配列（X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607）を、ＩＲＥＳ領域の後にネオマイシン耐性遺伝子を搭載している改変レトロウィルス発現ベクターｐＭＳＧＶ−１（M.S. Hughes et al., Hum Gene Ther 16 (2005) 457-472）内にクローンして発現ベクターｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを構築した。

【0279】

（ＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体の同時発現）
ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃの融合タンパク質（図６４を参照されたい）を同時発現するために、ｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃとｐＭＳＧＶ−ＩＬ−１５Ｎ７２ＤをＣＨＯ細胞内に同時にトランスフェクトした後、２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Hyclone, Logan, UT）と１０μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Hyclone, Logan, UT）を含有している培地中で選択した。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質も、コントロールとして組み換えヒト野生型ＩＬ−１５（ＩＬ−１５ｗｔ）を負荷するのに用いるために、別にＣＨＯ細胞で発現させた。融合タンパク質の産生のために、組み替えＣＨＯ細胞を無血清規定培地（ＳＦＭ４ＣＨＯ、Hyclone, Logan, UT）中で３７℃で生育した。培養物の生育細胞密度が最大に達したとき、可溶性複合体を蓄積するために培養温度を３０℃に下げた。次いで、培養物の生育細胞密度が約１０％生育細胞に達したときに培養上澄液を採取した。

【0280】

（精製手順）
組み替えＣＨＯ細胞培養培地を遠心分離し、濾過して細胞と残骸を除去してから、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で上澄液をｐＨ８．０に調整した。可溶性ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体をアフィニティー及びイオン交換クロマトグラフィーに基づくプロセスの２工程を用いて精製した。

【0281】

ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体はＩｇＧ１−Ｆｃドメインを含んでいるので、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (GE Healthcare) カラムを精製処理の第１工程として用いた。サンプルを負荷する前に、カラムを５カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、５ＣＶの０．１Ｎ ＮａＯＨで１時間消毒し、次いで７ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した。上澄液を１１ｍＬのカラム上に２ｍＬ／分で負荷させて、次いでカラムを８ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、７ＣＶの洗浄緩衝液（０．１Ｍ Ｎａ−クエン酸、ｐＨ５．０）で洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した。次いで、タンパク質を０．２Ｍ Ｎａ−クエン酸（ｐＨ４．０）で溶出して、採取したピーク画分のｐＨを０．２Ｍのクエン酸を用いて直ちにｐＨ３．５に調整した：標準ウィルス排除工程として、溶出したタンパク質を３０分間この低ｐＨで維持した。低ｐＨ維持工程の後に、溶出した調製物のｐＨを２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いてｐＨ７．７に調整した。調製物をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５遠心濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、Millipore, Billerica, MA）を用いて濃縮して緩衝液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に変えた後、０．２２μｍフィルター（Corning Life Sciences, Lowell, MA）を用いて滅菌濾過した。

【0282】

次いで、タンパク質調製物をＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ (ＱＳＦＦ; GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ) イオン交換カラムに付した。５ｍＬのカラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄し、５ＣＶの０．１Ｎ ＮａＯＨで１時間消毒し、次いで緩衝液Ａで平衡化した。調製物中のタンパク質濃度を最初に２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で＜１ｍｇ／ｍＬに調整した後、１ｍＬ／分の速度でＱＳＦＦカラム上で負荷させた。次いで、以下の３工程勾配プロセすを用いてタンパク質をカラムから溶出した：第１工程として、４ＣＶに対して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、第２工程として、４ＣＶに対して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、そして最終工程として、２ＣＶに対して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１Ｍ ＮａＣｌ。タンパク質ピーク画分を採取し、緩衝液をＰＢＳ（Hyclone, Logan, UT）に交換して、０．２２μｍフィルターを用いて濾過した。タンパク質濃度を、Ａ_２８０ｎｍ＝０．７９ｍｇ／ｍＬの吸光係数を用いるＵＶ分光光度計によって２８０ｎＭで確認した。この吸光係数はＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の推定アミノ酸配列に基づいて計算した。

【0283】

Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生してリフォールディングしたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ｗｔ（Ｚｈｕ、１００９＃３３１５）で溶液中に複合体を構築するために、別に発現したＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃを上記のようにｒプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これらのインビトロで構築した複合体を生物活性の評価、及び同時発現複合体におけるＩＬ−１５結合部位の占有程度の推定のための標準として用いた。

【0284】

（ゲル電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析）
精製したタンパク質を異なったタイプのゲル電気泳動方法で分析した。これはＮｕＰＡＧＥ１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（還元及び非還元条件下）、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（自然条件）、及びＩＥＦ ｐＨ３〜１０ゲル（ｐＩ確認用）を包含する。これら全てはInvitrogen (Carlsbad, CA）から供給された。実験方法は製造会社の記載のように実施した。泳動用緩衝液としてＰＢＳ（Hyclone, Logan, UT）を用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０ (GE Healthcare Bio-Sciences)クロマトグラフィーを純度を試験するため及びタンパク質の分子量を推定するために用いた。

【0285】

（Ｎ−末端アミノ酸配列及びグリコシル化の分析）
興味深いタンパク質バンドを、ＰＶＤＦ膜上にブロットしてポンソーＳ溶液で染色する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。Ｎ−末端アミノ酸配列決定をエドマン分解法（Molecular Structure Facility, UC Davis, Davis, CA）を用いて実施した。

【0286】

融合複合体がグリコシル化されているか否かを試験するために、イオン交換クロマトグラフィー後の高度に精製されたタンパク質５０μｇを、２μＬのＮ−グリコシダーゼ（Calbiochem, La Jolla, CA）で、総容量５０μＬのＰＢＳ中、室温で４８時間消化した後、還元条件下でＮｕＰＡＧＥ１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中電気泳動に付した。

【0287】

（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体のＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ占有の確認）
精製したＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃにＩＬ−１５ｗｔ（Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生してリフォールディングした、J. Yovandich, NCI, Fredrick, MD より提供された）を様々な比で１５時間４℃で負荷した。培養後、ＩＬ−１５ｗｔ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体を上記のようにｒプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製した複合体を、２つのＥＬＩＳＡ形態、無傷の複合体を検出する１つの方法（抗ヒトＩｇＧＦｃで捕獲して抗ＩＬ−１５で検出する）及びＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質のみを検出するもう１つの方法（抗ヒトＩｇＧＦｃで捕獲して抗ヒトＩｇＧＦｃで検出する）を用いて評価した。無傷ＩＬ−１５ｗｔ：ＩＬ−１５αＳｕ／Ｆｃ複合体とＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質濃度の間の比は、複合体のＩＬ−１５結合部位の占有率を反映している。[占有率（％）＝無傷複合体（ｎｇ／ｍＬ）／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ（ｎｇ／ｍＬＩ）×１００％]。次いで、完全に占有されている複合体（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃとＩＬ−１５ｗｔを１：３の比で前もって結合した）を精製後に精製したＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体の占有率を定量化するための標準として用いた。

【0288】

（ＩＬ−１５生物活性の確認）
先に記載されている（X. Zhu et al., J Immunol 183 (2009) 3598-3607）ように、ＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞株を用いるインビトロ細胞増殖アッセイを、精製した複合体とＩＬ−１５ｗｔタンパク質のＩＬ−１５生物活性を評価するために用いた。

【0289】

（薬物動態の評価）
ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体及びＩＬ−１５ｗｔの薬物動態プロファイルを雌のＣＤ−１マウス（１時点当りマウス４匹、Harlan, Indianapolis, IN）において、ＩＬ−２について先に記載されている（H. J. Belmont et al., Clin Immunol 121 (2006) 29-39）ようにして評価した。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の血清濃度を上記のような２つのＥＬＩＳＡ形態で評価した。ＩＬ−１５ｗｔ濃度を抗ＩＬ−１５捕獲剤（ＭＡＢ６４７； R&D Systems, Minneapolis, MN）及び抗ＩＬ−１５検出剤（ＢＡＭ２４７； R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いるＥＬＩＳＡで評価した。それぞれのＥＬＩＳＡ形態からのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ濃度はＰＫ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２．０ (Summit Research Services, Montrose, CO)を用いる１分画モデルと一致した。ＩＬ−１５ｗｔで処置したマウスから得られたデータは２分画モデルとして最もよくモデル化された。

【0290】

（リンパ球刺激）
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、６週齢、Harlan, Indianapolis, IN）にＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体１ｍｇ／ｋｇ又はヒトＩＬ−１５ｗｔ０．２８ｍｇ/ｋｇ（等モル用量）それぞれの、或いは陰性コントロールとしてＰＢＳの単回用量を静脈内に注射した。処置後４日目に、プール血液（１群当り５匹のマウス）及び脾細胞を採取した。ヒストパック（Sigma, St. Louis, MO）を用いて血液からＰＢＭＣを単離した。次いで、ＰＢＭＣ及び脾細胞をＰＥで標識した抗ＣＤ１９、ＰＥで標識した抗ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ４及びＦＩＴＣで標識した抗ＣＤ８抗体（BioLegend, San Diego, CA）で染色した。染色した細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（BD Bioscience, San Jose, CA）で分析した。全ての動物実験はＡｌｔｏｒ’ｓ ＩＡＣＵＣ承認プロトコールに従って実施された。

【0291】

以下のペプチドを前期実施例に示される検討で用いた。

【0292】

【表2】

【0293】

以下の融合タンパク質のタンパク質ドメインリンカー配列を示される実施例に用いた。

【0294】

【表3】

【0295】

以下に列挙した参考文献並びに本願で引用された全ての参考文献、特許、及びＧｅｎＢａｎｋナンバー（本願の優先日以前に入手可能なバージョンにおける）はそれらが独立して組み込まれているようにそれぞれが参照により組み込まれている。

【0296】

1. Kouzarides, T., and Ziff, E. (1988) Nature 336, 646-651
2. Kouzarides, T., and Ziff, E. (1989) Nature 340, 568-571
3. Kouzarides, T., and Ziff, E. (1989) Cancer Cells 1, 71-76
4. Rieker, J. D., and Hu, J. C. (2000) Methods Enzymol 328, 282-296
5. Busch, R., Pashine, A., Garcia, K. C., and Mellins, E. D. (2002) J Immunol Methods 263, 111-121
6. Stern, L. J., and Wiley, D. C. (1992) Cell 68, 465-477
7. Sloan, V. S., Cameron, P., Porter, G., Gammon, M., Amaya, M., Mellins, E., and Zaller, D. M. (1995) Nature 375, 802-806
8. de Kruif, J., and Logtenberg, T. (1996) Journal of Biological Chemistry 271,7630-7634
9. Kostelny, S., Cole, M., and Tso, J. (1992) J Immunol 148, 1547-1553
10. Holliger, P., and Hudson, P. J. (2005) Nat Biotechnol 23, 1126-1136
11. Hayden-Ledbetter, M. S., Cerveny, C. G., Espling, E., Brady, W. A., Grosmaire, L. S., Tan, P., Bader, R., Slater, S., Nilsson, C. A., Barone, D. S., Simon, A., Bradley, C., Thompson, P. A., Wahl, A. F., and Ledbetter, J. A. (2009) Clinical Cancer Research 15, 2739-2746
12. Kubetzko, S., Balic, E., Waibel, R., Zangemeister-Wittke, U., and Pluckthun, A. (2006) J Biol Chem 281, 35186-35201
13. Cuesta, A. M., Sanchez-Martin, D., Sanz, L., Bonet, J., Compte, M., Kremer, L., Blanco, F. J., Oliva, B., and Alvarez-Vallina, L. (2009) PLoS One 4, e5381
14. Mohler, K., Torrance, D., Smith, C., Goodwin, R., Stremler, K., Fung, V., Madani, H., and Widmer, M. (1993) J Immunol 151, 1548-1561
15. Feldmann, M. (2002) Nat Rev Immunol 2, 364-371
16. Weiner, L. M. (2007) Nat Rev Cancer 7, 701-706
17. Baeuerle, P. A., Kufer, P., and Bargou, R. (2009) Curr Opin Mol Ther 11, 22-30
18. Shen, J., Vil, M. D., Jimenez, X., Iacolina, M., Zhang, H., and Zhu, Z. (2006) J Biol Chem 281, 10706-10714
19. Lu, D., and Zhu, Z. (2009) Methods Mol Biol 525, 377-404, xiv
20. Jackman, J., Chen, Y., Huang, A., Moffat, B., Scheer, J. M., Leong, S. R., Lee, W. P., Zhang, J., Sharma, N., Lu, Y., Iyer, S., Shields, R. L., Chiang, N., Bauer, M. C., Wadley, D., Roose-Girma, M., Vandlen, R., Yansura, D. G., Wu, Y., and Wu, L. C. (2010) J Biol Chem (In Press)
21. Mortier, E., Quemener, A., Vusio, P., Lorenzen, I., Boublik, Y., Grotzinger, J., Plet, A., and Jacques, Y. (2006) J Biol Chem 281, 1612-1619
22. Waldmann, T. A. (2006) Nat Rev Immunol 6, 595-601
23. Bergamaschi, C., Rosati, M., Jalah, R., Valentin, A., Kulkarni, V., Alicea, C., Zhang, G. M., Patel, V., Felber, B. K., and Pavlakis, G. N. (2008) J Biol Chem 283, 4189-4199
24. Theobald, M., Biggs, J., Dittmer, D., Levine, A. J., and Sherman, L. A. (1995) Proc Natl Acad Sci U S A 92, 11993-11997.
25. Zhu, X., Marcus, W. D., Xu, W., Lee, H. I., Han, K., Egan, J. O., Yovandich, J. L., Rhode, P. R., and Wong, H. C. (2009) J Immunol 183, 3598-3607
26. Deer, J. R., and Allison, D. S. (2004) Biotechnol Prog 20, 880-889
27. Zhao, Y., Bennett, A. D., Zheng, Z., Wang, Q. J., Robbins, P. F., Yu, L. Y. L., Li, Y., Molloy, P. E., Dunn, S. M., Jakobsen, B. K., Rosenberg, S. A., and Morgan, R. A. (2007) J Immunol 179, 5845-5854
28. Belmont, H. J., Price-Schiavi, S., Liu, B., Card, K. F., Lee, H. I., Han, K. P., Wen, J., Tang, S., Zhu, X., Merrill, J., Chavillaz, P. A., Wong, J. L., Rhode, P. R., and Wong, H. C. (2006) Clin Immunol 121, 29-39
29. Yang, S., Rosenberg, S. A., and Morgan, R. A. (2008) J Immunother 31, 830-839
30. Card, K. F., Price-Schiavi, S. A., Liu, B., Thomson, E., Nieves, E., Belmont, H., Builes, J., Jiao, J. A., Hernandez, J., Weidanz, J., Sherman, L., Francis, J. L., Amirkhosravi, A., and Wong, H. C. (2004) Cancer Immunol Immunother 53, 345-357
31. Garboczi, D. N., Hung, D. T., and Wiley, D. C. (1992) PNAS 89, 3429-3433
32. Zhu, X., Belmont, H. J., Price-Schiavi, S., Liu, B., Lee, H. I., Fernandez, M., Wong, R. L., Builes, J., Rhode, P. R., and Wong, H. C. (2006) J Immunol 176, 3223-3232
33. Chirifu, M., Hayashi, C., Nakamura, T., Toma, S., Shuto, T., Kai, H., Yamagata, Y., Davis, S. J., and Ikemizu, S. (2007) Nat Immunol 8, 1001-1007
34. Hogquist, K. A., Jameson, S. C., Heath, W. R., Howard, J. L., Bevan, M. J., and Carbone, F. R. (1994) Cell 76, 17-27
35. Daniels, M. A., and Jameson, S. C. (2000) J Exp Med 191, 335-346.
36. Nugent, C. T., Renteria, R. O., Kuus-Reichel, K., and Kumar, A. (2005) Immunol Lett 98, 208-215
37. Schott, E., and Ploegh, H. L. (2002) Eur J Immunol 32, 3425-3434
38. Neveu, B., Echasserieau, K., Hill, T., Kuus-Reichel, K., Houssaint, E., Bonneville, M., and Saulquin, X. (2006) Int. Immunol. 18, 1139-1145
39. Kern, P., Hussey, R. E., Spoerl, R., Reinherz, E. L., and Chang, H.-C. (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 27237-27243
40. Arcaro, A., Gregoire, C., Bakker, T. R., Baldi, L., Jordan, M., Goffin, L., Boucheron, N., Wurm, F., van der Merwe, P. A., Malissen, B., and Luescher, I. F. (2001) J Exp Med 194, 1485-1495
41. Wang, R., Natarajan, K., and Margulies, D. H. (2009) J Immunol 183, 2554-2564
42. Garboczi, D. N., Ghosh, P., Utz, U., Fan, Q. R., Biddison, W. E., and Wiley, D. C. (1996) Nature 384, 134-141
43. Lin, A., Devaux, B., Green, A., Sagerstrom, C., Elliott, J., and Davis, M. (1990) Science 249, 677-679
44. Traunecker, A., Dolder, B., Oliveri, F., and Karjalainen, K. (1989) Immunol Today 10, 29-32
45. Laugel, B., van den Berg, H. A., Gostick, E., Cole, D. K., Wooldridge, L., Boulter, J., Milicic, A., Price, D. A., and Sewell, A. K. (2007) J Biol Chem 282, 23799-23810
46. Wooldridge, L., van den Berg, H. A., Glick, M., Gostick, E., Laugel, B., Hutchinson, S. L., Milicic, A., Brenchley, J. M., Douek, D. C., Price, D. A., and Sewell, A. K. (2005) J Biol Chem 280, 27491-27501
47. Gakamsky, D. M., Luescher, I. F., Pramanik, A., Kopito, R. B., Lemonnier, F., Vogel, H., Rigler, R., and Pecht, I. (2005) Biophys J 89, 2121-2133
48. Cole, D. K., Dunn, S. M., Sami, M., Boulter, J. M., Jakobsen, B. K., and Sewell, A. K. (2008) Mol Immunol 45, 2700-2709
49. Alam, S. M., Davies, G. M., Lin, C. M., Zal, T., Nasholds, W., Jameson, S. C., Hogquist, K. A., Gascoigne, N. R., and Travers, P. J. (1999) Immunity 10, 227-237
50. Cheever, M. A. (2008) Immunol Rev 222, 357-368
51. Ferrari-Lacraz, S., Zanelli, E., Neuberg, M., Donskoy, E., Kim, Y. S., Zheng, X. X., Hancock, W. W., Maslinski, W., Li, X. C., Strom, T. B., and Moll, T. (2004) J Immunol 173, 5818-5826
52. Zheng, X. X., Gao, W., Donskoy, E., Neuberg, M., Ruediger, M., Strom, T. B., and Moll, T. (2006) in Transplantation Vol. 81, pp. 109-116
53. Ferrari-Lacraz, S., Zheng, X. X., Fueyo, A. S., Maslinski, W., Moll, T., and Strom, T. B. (2006) Transplantation 82, 1510-1517

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図31A】

【図31B】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図34】

【図35A】

【図35B】

【図36A】

【図36B】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44A】

【図44B】

【図45A】

【図45B】

【図46】

【図47】

【図48AB】

【図48C】

【図49】

【図50AB】

【図50C】

【図51-1】

【図51-2】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55-1】

【図55-2】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62-1】

【図62-2】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]