特許 6253400 画像形成方法、及び、画像形成装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6253400

(24)【登録日】2017年12月8日

(45)【発行日】2017年12月27日

(54)【発明の名称】画像形成方法、及び、画像形成装置

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20171218BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20171218BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

   G01N21/64 E

【請求項の数】15

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2013-270349(P2013-270349)

(22)【出願日】2013年12月26日

(65)【公開番号】特開2015-125326(P2015-125326A)

(43)【公開日】2015年7月6日

【審査請求日】2016年7月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000376

【氏名又は名称】オリンパス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100074099

【弁理士】

【氏名又は名称】大菅 義之

(74)【復代理人】

【識別番号】100182936

【弁理士】

【氏名又は名称】矢野 直樹

(72)【発明者】

【氏名】中正 英二

(72)【発明者】

【氏名】石渡 裕

【審査官】 瀬戸 息吹

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１０２２９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０７８９８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／０１６４３１４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平０９−１７９０３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６０２５９５６（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開平０９−０１５５０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２１８３７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１６８８０８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−０１４９３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／０２１２２４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開平１１−２３１２２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−２０９０８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２８５６５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／０１８１１３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００６−３００７１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 M.Shribak，Quantitative orientation-independent DIC microscope with fast switching shear direction and bias modulation，Journal of the Optical Society of America A，米国，The Optical Society，２０１３年 ４月 １日，Vol. 30, No. 4，pp. 769-782

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ １９／００ − ２１／３６

Ｇ０１Ｎ ２１／６２ − ２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する像コントラスト画像形成工程と、
前記複数枚の画像に基づいて前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出して、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成する位相成分画像形成工程と、
前記位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する空間周波数分解工程と、
前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出する位相分布算出工程と、
前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出し、算出した前記生体試料の位相分布から位相分布画像を形成する生体試料の位相分布合成工程と、
前記位相分布合成工程で形成された前記生体試料の位相分布画像と、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した前記生体試料の画像とを合成する異種画像合成工程と、を有する
ことを特徴とする生体試料の画像形成方法。

【請求項2】

請求項１に記載の画像形成方法において、
前記顕微鏡は、観察物体の位相分布を像強度分布として撮像する微分干渉顕微鏡であり、さらに、
前記顕微鏡のシァー方向を切り替える工程と、
切り替え前後の２方向のシァー方向で算出された前記生体試料の２つの位相分布を合成する工程と、を有する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の画像形成方法において、さらに、
観察面に対するデフォーカス状態での光学的応答特性を用いて前記構造成分にデコンボリューション処理を行って前記構造成分の第２の位相分布を算出する第２位相分布算出工程と、
前記構造成分の第２の位相分布と前記観察面に対する合焦状態での光学的応答特性を用いて算出された前記構造成分の位相分布とを比較する位相分布比較工程と、
位相分布の比較結果に基づいて、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除くボケ位相分布除去工程と、を有し、
前記生体試料の位相分布合成工程は、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布が取り除かれた位相分布と、前記屈折成分の位相分布とを合成する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項4】

請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の画像形成方法において、さらに、
観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点面変更工程と、
各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から前記観察面に漏れこむ位相分布を識別する漏れ位相分布識別工程と、
識別された位相分布を前記構造成分の位相分布から取り除く漏れ位相分布除去工程と、
を有する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項5】

請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の画像形成方法において、
前記異種画像合成工程は、
前記位相分布画像の座標情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報とに基づいて画像間の位置合わせを行う工程と、
位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する工程と、を有する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項6】

請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の画像形成方法において、
前記異種画像合成工程は、
前記位相分布画像の座標情報及び角度情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報及び角度情報とに基づいて画像間の位置合わせを行う工程と、
位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する工程と、を有する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項7】

請求項５または請求項６に記載の画像形成方法において、
前記異種画像合成工程は、さらに、前記位相分布画像の倍率情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の倍率情報とに基づいて画像間の倍率合わせを行う工程を有する
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項8】

請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の画像形成方法において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料が発光した光に基づいて形成される画像である
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項9】

請求項８に記載の画像形成方法において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である
ことを特徴とする画像形成方法。

【請求項10】

生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、
像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、
前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像に基づいて、前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出し、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成し、前記位相成分画像を画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解し、前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出し、前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出し、算出した前記生体試料の位相分布から位相分布画像を形成する演算ユニットと、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した前記生体試料の画像と、前記演算ユニットで形成された前記生体試料の位相分布画像と、を合成する合成ユニットと、を有する
ことを特徴とする画像形成装置。

【請求項11】

請求項１０に記載の画像形成装置において、
前記合成ユニットは、
前記位相分布画像の座標情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報とに基づいて画像間の位置合わせを行い、
位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する、
ように構成される
ことを特徴とする画像形成装置。

【請求項12】

請求項１０に記載の画像形成装置において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である
ことを特徴とする画像形成装置。

【請求項13】

請求項１０乃至請求項１２のいずれか１項に記載の画像形成装置において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記顕微鏡で取得される
ことを特徴とする画像形成装置。

【請求項14】

請求項１３に記載の画像形成装置において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料が発光した光に基づいて形成される画像である
ことを特徴とする画像形成装置。

【請求項15】

請求項１４に記載の画像形成装置において、
前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である
ことを特徴とする画像形成装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体試料の画像を形成する方法及び装置に関し、特に、生体試料の位相分布に基づく画像と生体試料が発光した光に基づく画像とを合成して生体試料の画像を形成する方法及び装置に関する。

【背景技術】

【0002】

生体細胞または生体組織（これらをまとめて、以降、生体試料と記す）の観察法としては、様々な観察法が知られているが、現時点において、生体試料を３次元的に観察する場合に用いられる観察法としては、蛍光共焦点顕微鏡を用いた蛍光観察法が最も一般的である。

【0003】

しかしながら、蛍光観察法では、蛍光を発する物質（蛍光物質）を特定のたんぱく質や酵素と結びつけることで生体試料の生化学的な現象及び物理学的な現象を可視化することができる一方で、生体試料全体の形状や生体細胞の形状を把握することが難しい。これは、蛍光観察法では、蛍光物質と結びついているたんぱく質や酵素のみが発光するからである。例えば、蛍光物質を細胞膜や細胞質と結び付けることで細胞の形状を把握することは可能であるが、このような追加の作業が行われた場合であっても、蛍光物質と結びついていない細胞の形状は把握できず、生体試料全体の形状を把握することはできない。

【0004】

このため、近年では、蛍光観察法のような生体試料の生化学的な現象及び物理学的な現象を可視化するのに適した観察法で取得した生体試料の画像を、生体試料の形状や構造を把握するのに適した他の観察法で取得した生体試料の画像と合成して、その合成画像（以降、このような異なる観察法で取得された画像を合成して形成された画像を、異種合成画像と記す）によって生体試料を観察する技術が提案されている。これに関連する技術は、例えば、特許文献１に開示されている。

【0005】

なお、上述の技術において、生体試料の形状や構造を把握するのに適した観察法としては、特許文献１に開示される微分干渉（ＤＩＣ）観察法や、位相差観察法など、位相物体である生体試料の位相分布を像強度分布に変換して可視化する観察法が一般的である。また、生体試料の生化学的な現象及び物理学的な現象を可視化するのに適した観察法としては、特許文献１に開示される蛍光観察法の他に、生体試料が発光した光を検出する任意の方法が採用され得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開平０９−１７９０３４号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ところで、ＤＩＣ観察法は、厳密には、生体試料の位相分布の微分値を可視化するものであり、位相分布自体を可視化するものではない。また、位相差観察法も、位相分布自体を可視化するものではないという点において、ＤＩＣ観察法と同様である。さらに、ＤＩＣ観察法と位相差観察法では、セクショニング効果が生じないため、焦点面からずれた面のボケ像の影響を強く受けた画像が生成されてしまうといった課題もある。

【0008】

これらの理由から、ＤＩＣ観察法や位相差観察法では、生体試料の正確な形状や構造を把握することが難しい。従って、これらの観察法で取得された画像を用いて形成された異種合成画像から、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することは難しい。

【0009】

以上のような実情を踏まえ、本発明は、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる画像を形成する技術を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の第１の態様は、位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を、像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する像コントラスト画像形成工程と、前記複数枚の画像に基づいて前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出して、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成する位相成分画像形成工程と、前記位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する空間周波数分解工程と、前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出する位相分布算出工程と、前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出し、算出した前記生体試料の位相分布から位相分布画像を形成する生体試料の位相分布合成工程と、前記位相分布合成工程で形成された前記生体試料の位相分布画像と、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した前記生体試料の画像とを合成する異種画像合成工程と、を有する生体試料の画像形成方法を提供する。

【0011】

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の画像形成方法において、前記顕微鏡は、観察物体の位相分布を像強度分布として撮像する微分干渉顕微鏡であり、さらに、前記顕微鏡のシァー方向を切り替える工程と、切り替え前後の２方向のシァー方向で算出された前記生体試料の２つの位相分布を合成する工程と、を有する画像形成方法を提供する。

【0012】

本発明の第３の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の画像形成方法において、さらに、観察面に対するデフォーカス状態での光学的応答特性を用いて前記構造成分にデコンボリューション処理を行って前記構造成分の第２の位相分布を算出する第２位相分布算出工程と、前記構造成分の第２の位相分布と前記観察面に対する合焦状態での光学的応答特性を用いて算出された前記構造成分の位相分布とを比較する位相分布比較工程と、位相分布の比較結果に基づいて、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除くボケ位相分布除去工程と、を有し、前記生体試料の位相分布合成工程は、前記構造成分の位相分布から前記デフォーカスによるボケが生じた位相分布が取り除かれた位相分布と、前記屈折成分の位相分布とを合成する画像形成方法を提供する。

【0013】

本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の画像形成方法において、さらに、観察面に対して焦点面を光軸方向に変化させる焦点面変更工程と、各焦点面で算出された前記構造成分の位相分布を比較して、前記観察面の上下に存在する前記生体試料の構造から前記観察面に漏れこむ位相分布を識別する漏れ位相分布識別工程と、識別された位相分布を前記構造成分の位相分布から取り除く漏れ位相分布除去工程と、を有する画像形成方法を提供する。

【0014】

本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の画像形成方法において、異種画像合成工程は、前記位相分布画像の座標情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報とに基づいて画像間の位置合わせを行う工程と、位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する工程と、を有する画像形成方法を提供する。

【0015】

本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の画像形成方法において、異種画像合成工程は、前記位相分布画像の座標情報及び角度情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報及び角度情報とに基づいて画像間の位置合わせを行う工程と、位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する工程と、を有する画像形成方法を提供する。

【0016】

本発明の第７の態様は、第５の態様または第６の態様に記載の画像形成方法において、異種画像合成工程は、さらに、前記位相分布画像の倍率情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の倍率情報とに基づいて画像間の倍率合わせを行う工程を有する画像形成方法を提供する。

【0017】

本発明の第８の態様は、第１の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の画像形成方法において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料が発光した光に基づいて形成される画像である画像形成方法を提供する。

【0018】

本発明の第９の態様は、第８の態様に記載の画像形成方法において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である画像形成方法を提供する。

【0019】

本発明の第１０の態様は、生体試料の位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡であって、前記像強度分布の像コントラストを変化させる像コントラスト変化ユニットを有する顕微鏡と、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、前記像コントラスト変化ユニットを制御する制御ユニットと、前記制御ユニットによる制御により取得された前記複数枚の画像に基づいて、前記生体試料の位相分布に対応する成分と前記生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出し、前記位相分布に対応する成分を前記生体試料の位相分布以外に対応する成分で割り算することで規格化された位相成分画像を形成し、前記位相成分画像を画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解し、前記周波数成分の各々に対して各々に対応する光学的応答特性を用いてデコンボリューション処理を行い、前記生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分の位相分布と前記生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された構造成分の位相分布を算出し、前記屈折成分の位相分布と前記構造成分の位相分布を合成して前記生体試料の位相分布を算出し、算出した前記生体試料の位相分布から位相分布画像を形成する演算ユニットと、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した前記生体試料の画像と、前記演算ユニットで形成された前記生体試料の位相分布画像と、を合成する合成ユニットと、を有する画像形成装置を提供する。

【0020】

本発明の第１１の態様は、第１０の態様に記載の画像形成装置において、前記合成ユニットは、前記位相分布画像の座標情報と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像の座標情報とに基づいて画像間の位置合わせを行い、位置合わせが行われた前記位相分布画像と前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像とを合成する、ように構成される画像形成装置を提供する。

【0021】

本発明の第１２の態様は、第１０の態様に記載の画像形成装置において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である画像形成装置を提供する。

【0022】

本発明の第１３の態様は、第１０の態様乃至第１２の態様のいずれか１つに記載の画像形成装置において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記顕微鏡で取得される画像形成装置を提供する。

【0023】

本発明の第１４の態様は、第１３の態様に記載の画像形成装置において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料が発光した光に基づいて形成される画像である画像形成装置を提供する。

【0024】

本発明の第１５の態様は、第１４の態様に記載の画像形成装置において、前記位相分布画像とは異なる方法で取得された前記画像は、前記生体試料の蛍光画像である画像形成装置を提供する。

【発明の効果】

【0025】

本発明によれば、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる画像を形成する技術を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法のフローチャートである。

【図2】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法の別のフローチャートである。

【図3】観察面に対する合焦状態での構造成分に対応する光学的応答特性を示す図である。

【図4】生体試料の３次元的な構造を説明するための図である。

【図5】合焦状態での光学的応答特性により得られる位相分布を模式的に示した図である。

【図6】デフォーカスによるボケが生じた位相分布を再生する方法の一例を説明するための図である。

【図7】観察面に対するデフォーカス状態での構造成分に対応する光学的応答特性を示した図である。

【図8】本発明の一実施形態に係る位相分布計測方法のさらに別のフローチャートである。

【図9】デフォーカスによるボケが生じた位相分布を再生する方法の別の例を説明するための図である。

【図10】本発明の一実施形態に係る異種合成画像形成方法のフローチャートである。

【図11】本発明の実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図12】観察面に対する合焦状態での屈折成分に対応する光学的応答特性を示す図である。

【図13A】図１１に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。

【図13B】図１３Ａから観察位置を光軸方向に３μｍ上方に変化させたときに、図１１に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。

【図13C】図１３Ｂから観察位置を光軸方向に３μｍ上方に変化させたときに、図１１に示す顕微鏡システムによって得られるｉＰＳ細胞の位相分布を示す図である。

【図14】本発明の実施例１に係る異種合成画像形成方法のフローチャートである。

【図15】本発明の実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図16】図１５に示す顕微鏡システムに含まれる偏光板の回転について説明するための図である。

【図17】本発明の実施例３に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図18A】図１７に示す顕微鏡システムによって得られる小腸のクリプト組織の細胞の位相分布画像を示す図である。

【図18B】図１８Ａに示す小腸のクリプト組織の細胞の蛍光画像を示す図である。

【図18C】図１８Ａと図１８Ｂに示す画像を合成した画像を示す図である。

【図19】本発明の実施例４に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図20】本発明の実施例４に係る異種合成画像形成方法のフローチャートである。

【図21】本発明の実施例５に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図22】本発明の実施例６に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図23】本発明の実施例７に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図24】本発明の実施例８に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【図25】本発明の実施例９に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

まず、本願発明が対象とする試料である生体試料について説明する。
３次元的な構造を有する生体試料は、無色透明ではあるが、その内部組成の違いなどにより透過する光の位相を変化させるという性質を有している。このことから、生体試料は３次元に連続的に変化する位相分布を有する位相物体であると看做すことができる。このため、生体試料の３次元的な位相分布を得ることができれば、その３次元構造を知ることができる。

【0028】

本願発明では、生体試料（位相物体）のうちの光軸方向に特定の厚みのある観察領域の位相分布を検出する。生体試料の３次元的な位相分布は、光軸方向の位置が異なる複数の観察領域の位相分布を接続することにより得られる。これは、観察物体内の蛍光色素の３次元位置座標を検出して、検出した位置座標から３次元像を形成する蛍光共焦点顕微鏡とは全く異なる技術である。

【0029】

次に、生体試料に限らない位相物体全般の位相分布の計測に関する本願発明者によるこれまでの研究成果と、本願発明者が新たに見出した生体試料の位相分布の計測に関する課題について概説する。

【0030】

特開２００８−１０２２９４号公報には、位相物体は、明視野観察が行われると合焦位置では像は発生しないが焦点から外れた位置で像コントラストが発生するという特性を有することが開示されている。また、特開平９−１５５０４号公報には、微分干渉顕微鏡で位相物体を観察したときの像強度分布には位相分布の微分を表す像強度分布以外に複数の像成分が含まれることが開示されている。

【0031】

本願発明者は、特開平９−１５５０４号公報で示した複数の像成分には、特開２００８−１０２２９４号公報で示したデフォーカスによって発生した像成分が含まれること、及び、位相物体が３次元的に構造を有する場合にはデフォーカスによって発生した像成分（観察領域外の位相分布による像成分）が観察に与える影響も無視できないこと、を新たに見出した。

【0032】

また、特開平９−１５５０４号公報には、微分干渉顕微鏡で生じる２つの偏光のリターデーション量を変化させることにより像コントラストを変化させた画像を複数枚取り込み、それらに対して差演算と和演算を行い、それによって得られた差演算画像を和演算画像で規格化することで、位相物体の位相分布に微分干渉顕微鏡の光学的応答特性（ＯＴＦ：Optical Transfer Function光学的伝達関数ともいう）をコンボリューションした像成分のみを抽出できることが開示されている。この技術は、観察位置を移動させることなく偏光のリターデーション量を変化させても特開２００８−１０２２９４号公報で示すデフォーカス量に対応した像成分が変化しないことを利用するものである。より詳細には、偏光のリターデーション量を対称（±θ）に変化させて取得した画像を差演算することでデフォーカス量に対応した像成分を取り除き、観察物体の位相分布と微分干渉顕微鏡の光学的応答特性とがコンボリューションされた像強度分布のみを求めるというものである。なお、特開平９−１５５０４号公報には、このようにして算出した像強度分布を微分干渉顕微鏡の光学的応答特性を用いてデコンボリューションすることで観察物体の位相分布が得られることについても、開示されている。

【0033】

微分干渉顕微鏡の光学的応答特性の値は、空間周波数が０に近い低周波帯域とカットオフ周波数近傍の周波数帯域とで０に近づく。このため、デコンボリューション処理の際に０割が発生し得るが、この問題はウィナーフィルターを工夫することで改善できる。特開２００６−３００７１４号公報は、このような対応では緩やかな勾配を持つ物体の位相分布を求めるときには精度が低下するという課題を示し、部分的に積分処理することでこの課題を改善できることを開示している。

【0034】

本願発明者は、特に生体試料の観察では、核などに位相分布が緩やかな勾配を持つ部分が多いためデコンボリューション処理を行う際に偽像が発生することがあること、顆粒状の組織などが多いため積分処理を行う際にノイズが連鎖することがあること、を新たに見出した。また、生体試料（生体組織や細胞コロニー）は光軸方向に構造が広がっているため、ノマルスキープリズムのローカライズ位置の微小なずれで視野ムラが発生し、観察領域内にうねりが発生することについても、新たに見出した。
以下では、このような新たな課題を改善して、生体試料の観察領域内の位相分布を精度良く求める方法について、図１を参照しながら説明する。

【0035】

まず、微分干渉顕微鏡など位相分布を像強度分布に変換する顕微鏡によって形成される生体試料の光学像を撮像素子における像コントラストを変化させながら取り込み、像コントラストの異なる複数枚の画像を形成する（図１のステップＳ１（像コントラスト画像形成工程））。

【0036】

そして、形成した複数枚の画像に基づいて生体試料の位相分布に対応する成分と生体試料の位相分布以外に対応する成分とを算出する。この位相分布以外に対応する成分には、例えば、生体試料の吸収による成分や照明分布による成分などが含まれる。その後、算出した位相分布に対応する成分を位相分布以外に対応する成分で割り算することで、規格化された位相分布に対応する成分の画像（以下、規格化された位相成分画像）を形成する（図１のステップＳ３（位相成分画像形成工程））。なお、この手順は、例えば、特開平０９−０１５５０４号公報に開示されている。

【0037】

次に、得られた規格化された位相成分画像を、空間周波数が最も低い背景成分と、生体試料の内部で屈折した光によって形成された屈折成分と、生体試料の内部の構造で回折した光によって形成された空間周波数が最も高い構造成分と、に分解する。つまり規格化された位相成分画像を、画像の空間周波数により複数の周波数成分に分解する（図１のステップＳ５（空間周波数分解工程））。

【0038】

なお、上述した視野ムラは、空間周波数で考えると観察範囲内で高々４周期程度の周波数成分からなるため、その影響は背景成分に表れると考えられる。また、例えば核など、位相分布が緩やかな勾配を持つ生体試料の部分は、顕微鏡のカットオフ周波数の高々１０分の１程度の周波数帯域を有するため、屈折成分として検出される。また、例えば顆粒状の組織などの生体試料の微細構造は、これらよりも高い周波数帯域を有するため、構造成分として検出される。

【0039】

さらに、像強度分布である屈折成分及び構造成分の各々と各々に対応する光学的応答特性とをデコンボリューション処理し、屈折成分の位相分布と構造成分の位相分布とを別々に算出する（図１のステップＳ７（位相分布算出工程））。そして、それらを合成することによって、生体試料の位相分布を算出し、算出した位相分布から位相分布画像を形成する（図１のステップＳ９（生体試料の位相分布合成工程））。

【0040】

以上のように、規格化された位相成分画像を３つの成分に分解し、さらに、デコンボリューション処理には、背景成分を除く屈折成分と構造成分の２つの成分を用いる。このため、背景成分に表れる視野ムラの影響を抑えることができる。また、屈折成分と構造成分は、それぞれに応じた別々の光学的応答特性でデコンボリューション処理される。このため、偽像の発生やノイズの連鎖を抑制することができる。従って、この方法によれば、より正確な生体試料の位相分布を取得することができる。また、正確な生体試料の位相分布から生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。

【0041】

なお、規格化された位相成分画像をフーリエ変換して周波数だけに注目して３つの周波数成分に分解すると、分解することによってノイズが発生することがある。このため、上記の方法では、規格化された位相成分画像を３成分に分解する際に、画像を平均化処理するローパスフィルタリングを用いることが望ましい。例えば、規格化された位相成分画像に、比較的大きな平均化領域を持つ平均化フィルターでコンボリューション処理を複数回行うことにより、背景成分の画像を形成する。さらに、規格化された位相成分画像から背景成分の画像を引き算して得られる画像に、平均化領域を背景成分より小さくした平均化フィルターでコンボリューション処理を複数回行うことにより、屈折成分の画像を形成する。最後に、規格化された位相成分画像から背景成分の画像と屈折成分の画像を引き算して、構造成分の画像を形成する。このように、規格化された位相成分画像にカーネルサイズが異なるフィルターで画像の平均化処理を行って、規格化された位相成分画像を背景成分、屈折成分、構造成分に分解することが望ましい。

【0042】

また、微分干渉顕微鏡を用いる場合であれば、シァー（shear）方向に対して垂直な方向の位相分布に対応する像コントラストは得られないため、画像の像強度分布からシァー方向の位相分布を算出することは困難である。このため、シァー方向を切り替えることで、図１に示す方法により直交する２つのシァー方向で位相分布を算出し、得られた位相分布を合成することが望ましい。なお、シァー方向を切り替えて得られた２つの位相分布を合成する技術は、特開平９−１５５０４号公報にも開示されている。

【0043】

図１に示す方法により例えば、ステップＳ１で２つのシァー方向の微分干渉画像を得るためには、ノマルスキープリズムを切り替えることにより、または、単一のノマルスキープリズムを回転させることにより、シァー方向を切り替える必要がある。ノマルスキープリズムの平行度や取り付け角度などを調整した場合であっても、切り替え前後では数ピクセル程度の画像の移動が発生してしまうため、算出される位相分布に位置ずれが生じることを避けることは困難である。そして、この位置ずれを補正することなくこれらの位相分布を合成すると、合成した位相分布にブレが生じてしまう。このため、直交する２つのシァー方向で算出された位相分布を合成する場合には、シァー方向の切り替え時に発生する画像移動を検出して、これらの画像の合成前に、位置を補正することが望ましい。

【0044】

なお、構造成分をデコンボリューション処理して算出した位相分布は、シァー方向にほぼ垂直な方向に広がっている構造以外の分布は物体構造に対応した分布となる。このため、シァー方向を切り替えて算出した構造成分の２つの位相分布の類似性は、他の成分（背景成分、屈折成分）の場合と比較して非常に高くなる。この特性を利用して、例えば、２方向のシァー方向で算出された構造成分の２つの位相分布の相関からシァー方向を切り替える際に発生する画像の位置ずれ量を算出し、算出された位置ずれ量を用いて切り替え前後の２方向のシァー方向で算出した生体試料の２つの位相分布の位置ずれを補正することが望ましい。これにより、合成後の位相分布のブレを抑制することができる。なお、相関は、例えば位相限定相関法によって得ることができる。また、このシァー方向の違いにより発生する位置ずれを補正し、合成することは図１では、ステップＳ７とステップＳ９の間に行なわれることが望ましい。

【0045】

位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡は無染色で生体細胞や組織を観察することが可能な顕微鏡であるが、観察物体が３次元的に複雑な構造を持つと、観察位置の上下にある生体細胞や組織のボケ像が観察像に混入する。これにより、実際の観察位置の構造とは異なる像強度分布が発生するため、生体細胞や組織の構造の確認が難しくなり、変異や変質の確認が困難となる場合がある。以下では、このような課題を改善して、生体試料の観察領域内の位相分布をさらに精度良く求める方法について、図２から図７を参照しながら説明する。

【0046】

一般に光学的応答特性ＯＴＦは、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）で表される。ここで、ＭＴＦは変調伝達関数（ＭＴＦ：Modulation Transfer Function）であり、ＰＴＦは位相伝達関数（ＰＴＦ：Phase Transfer Function）である。観察物体が光学系の合焦位置にあり、且つ、光学系が無収差であるときには、ＰＴＦ＝０となるため、ＯＴＦは、ＭＴＦとなり、ＭＴＦのみに依存する。ただし、観察物体が光学系の合焦位置から外れるときや収差が発生したときにはＰＴＦ≠０となるため、ＯＴＦとして、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いる必要がある。上述した特開平９−１５５０４号公報では、説明を簡略化するために、観察物体が合焦位置にあり且つ光学系が無収差であると仮定して、デコンボリューション処理を行うときにＭＴＦのみに依存するＯＴＦを用いている。

【0047】

なお、図３は、観察物体が光学系の合焦位置にあり、且つ、光学系が無収差であるときの顕微鏡のＯＴＦを示した図である。図３に示すＬ１とＬ２は、それぞれ、同じ対物レンズとコンデンサレンズを備えた明視野顕微鏡と微分干渉顕微鏡のＯＴＦを示している。なお、明視野顕微鏡のＭＴＦは、対物レンズの開口数（以降、ＮＡと記す）とコンデンサレンズのＮＡにより定まるのに対して、微分干渉顕微鏡のＭＴＦは、明視野顕微鏡のＭＴＦとｓｉｎ（πΔｆ）の積で定まる。なお、ここで、Δはシァー量であり、ｆは空間周波数である。このような明視野顕微鏡のＭＴＦと微分干渉顕微鏡のＭＴＦとの関係は、例えば、特開２００８−１０２２９４に記載されている。

【0048】

３次元的な構造を有する生体試料には、観察光学系の合焦位置（図４のＺ）に位置する部分（構造Ｃ２）と合焦位置から外れた位置（図４の＋ΔＺ、−ΔＺ）に位置する部分（構造Ｃ１、Ｃ３）が存在する。なお、図４は、紙面左右方向がある光軸方向の位置での光軸に垂直な面内の観察物体の位置を、上下方向の楕円の厚みが位相量を、示すよう模式化した図である。特開平９−１５５０４号公報のように、ＭＴＦのみに依存するＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行うと、図５に示すように、合焦位置に位置する部分（構造Ｃ２）に対応した位相分布が再生されるとともに、合焦位置から外れた位置にある部分（構造Ｃ１、Ｃ３）の位相分布がＰＴＦの影響を受けてその位相分布より小さい位相量で再生される。これは、合焦位置から外れた位置にある部分はその位相分布とＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）のコンボリューションにより得られる像強度分布であり、本来はＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理を行うべきところを、ＭＴＦを用いてデコンボリューション処理が行われたためである。

【0049】

一方で、合焦位置から外れた位置に対応したＰＴＦを計算により算出してＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理を行うと、この合焦位置から外れた部分に対応した位相分布が再生されるとともに、合焦位置に位置する部分の位相分布はＰＴＦの影響を受けてその位相分布より小さい位相量で再生される。これは、合焦位置に位置する部分はその位相分布とＭＴＦのコンボリューションにより得られる像強度分布であり、本来はＭＴＦを用いてデコンボリューション処理を行うべきところを、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）を用いてデコンボリューション処理が行われたためである。つまり、合焦位置に位置する部分の位相分布は、実際の位相分布をｅｘｐ（−２πｉ・ＰＴＦ）でコンボリューションしたものと等価となるので、小さい位相量で再生される。

【0050】

この特徴を利用することで、観察物体の中で合焦位置にある部分（構造Ｃ２）の位相分布と合焦位置から外れた位置にある部分（構造Ｃ１、Ｃ３）の位相分布とを分離する。

【0051】

具体的には、まず、図２のステップＳ１１からステップＳ１７の手順により、図３に示す観察面に対する合焦状態（観察面に光学系の焦点面が位置する状態）でのＯＴＦを用いて屈折成分の位相分布及び構造成分の位相分布を算出する。なお、ステップＳ１１からステップＳ１７は、図１のステップＳ１からステップＳ７に対応する処理である。ステップＳ１７では、観察面に対する合焦状態でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて位相分布（図６の位相分布Ｂ１）を算出する。

【0052】

次に、観察面に対するデフォーカス状態（光学系の焦点面が観察面からずれた位置にある状態）でのＯＴＦを用いて、ステップＳ１５で得られた構造成分にデコンボリューション処理を行って構造成分の第２の位相分布（図６の位相分布Ｂ２、Ｂ３）を算出する（図２のステップＳ１９（第２位相分布算出工程））。

【0053】

ここで、デフォーカス状態でのＯＴＦとは、合焦位置でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）と、合焦位置から外れた位置でのＰＴＦ（つまり、デフォーカスにより発生するＰＴＦ）とから算出されるＯＴＦであり、ＭＴＦ・ｅｘｐ（２πｉ・ＰＴＦ）である。図６の位相分布Ｂ２は合焦位置Ｚから＋ΔＺ外れた位置でのＯＴＦを用いて算出された構造成分の位相分布であり、図６の位相分布Ｂ３は合焦位置Ｚから−ΔＺ外れた位置でのＯＴＦを用いて算出された構造成分の位相分布である。また、図６の位相分布Ｂ１は、合焦位置ＺでのＯＴＦを用いてステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布である。

【0054】

さらに、ステップＳ１９で算出した第２の位相分布と、ステップＳ１７で既に算出されている観察面に対する合焦状態での位相分布である構造成分の位相分布と、を比較する（図２のステップＳ２１（位相分布比較工程））。

【0055】

上述したように合焦状態でのＯＴＦでデコンボリューションして得られた位相分布では、生体試料の合焦位置にある部分の位相量が大きく算出され、デフォーカス状態でのＯＴＦでデコンボリューションして得られた位相分布では、生体試料の合焦位置からずれたその特定の位置にある部分の位相量が大きく算出される。この特徴を利用して、比較工程では、位相分布画像上で、合焦位置にある部分を１とし合焦位置からずれた位置にある部分を０とした２値画像を形成して、それによって、合焦位置から外れた領域（例えば、顕微鏡の焦点深度外の領域）を識別する。図６の例では、構造Ｃ２がある部分を１とし、構造Ｃ１、Ｃ３がある部分を０とした２値画像を形成する。

【0056】

なお、ＰＴＦは合焦位置から外れる（デフォーカス）量に対応して変化するが、同じデフォーカス量であっても物体の空間周波数によってＰＴＦがＯＴＦに与える影響は異なる。図７は、合焦状態でのＯＴＦを実線で、デフォーカス状態でのＯＴＦを破線で示している。より詳細には、図７に示すＬ１ｄは、デフォーカス状態での明視野顕微鏡のＯＴＦを示している。また、図７に示すＬ２ｄｒ、Ｌ２ｄｉは、それぞれデフォーカス状態での微分干渉顕微鏡のＯＴＦの実部、虚部を示している。図７に示すＬ１とＬ２は、図３と同様に、合焦状態における明視野顕微鏡と微分干渉顕微鏡のＯＴＦである。

【0057】

図７に示すように、物体の空間周波数が比較的高い領域でＰＴＦのＯＴＦへの影響（つまり、合焦状態のＯＴＦとデフォーカス状態のＯＴＦの差異）は大きくなることから、合焦位置にある部分と合焦位置から外れた位置にある部分とを分離して２値画像を形成する際には、上述したように、空間周波数の高い構造成分を用いることが望ましい。これにより、デフォーカス量に対する位相量の変化を他の成分を用いる場合に比べて大きくすることが可能となり、分離の感度を高くすることができる。

【0058】

ステップＳ２１の比較工程が完了すると、その比較結果に基づいて、ステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布からデフォーカスによるボケが生じた位相分布を取り除く（図２のステップＳ２３（ボケ位相分布除去工程））。

【0059】

ここでは、まず、ステップＳ１９で算出された構造成分の第２の位相分布とステップＳ２１で形成された２値画像との積を取ることで、合焦位置から外れた位置にある構造成分の位相分布を抽出する。その後、抽出された位相分布をデフォーカス状態でのＯＴＦでコンボリューション処理を行うことで、合焦位置でデフォーカスによるボケが生じた構造成分の位相分布を算出する。さらに、ステップＳ１７で算出された構造成分の位相分布から、算出されたボケが生じた構造成分の位相分布を引き算する。これにより、合焦位置に位置する物体の構造成分の位相分布が分離されて抽出される。

【0060】

最後に、ステップＳ２３で抽出された構造成分の位相分布とステップＳ１７で算出された屈折成分の位相分布を合成して、生体試料の位相分布を算出する（図２のステップＳ２５（生体試料の位相分布合成工程））。さらに、算出した位相分布から生体試料の位相分布画像を形成してもよい。

【0061】

以上のようにして、観察位置の上下に位置する構造のボケ像の混入を取り除くことで、観察位置の構造をより正確に認識することが可能となる。従って、図２に示す方法によれば、生体試料の観察領域内の位相分布をさらに精度良く求めることができるため、無染色で細胞や組織の３次元的な構造をさらに精度良く検査することができる。また、生体試料が３次元的に入り組んだ構造を有する場合であっても位相分布を精度良く再生することができる。さらに、正確な生体試料の位相分布から生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。

【0062】

なお、図２では、説明の都合上、合焦位置と合焦位置から外れた位置という表現を用いている。ＰＴＦの変化に対して再生される位相分布の変化が小さいすぎるため合焦位置（観察面）から焦点深度内の位置の位相分布については分離することができない。このため、より厳密には、図２に示す方法によれば、焦点深度を越えるデフォーカス量に対応する位置のボケた位相分布を分離することが可能である。

【0063】

図１及び図２に示す方法は、光軸方向の特定のＺ位置で生体試料の画像を複数取り込み、それらの画像から形成された規格化された位相成分画像を背景成分、屈折成分、構造成分に分解し、屈折成分と構造成分から生体試料の位相再生を行う方法である。特に図２に示す方法は、Ｚ位置を変化させることなくＯＴＦを変化させてデコンボリューション処理を行うことで、Ｚ位置から外れた位置にある物体部分からの影響を取り除いた位相分布を再生するものである。即ち、上述した図２に示す方法は、特定のＺ位置で取得した画像のみから特定のＺ位置を合焦位置とする生体試料の位相分布を再生する方法である。

【0064】

一方、特開２００８−１１１７２６号には、各Ｚ位置での規格化された位相成分画像または位相成分画像から再生された位相分布を比較し、位相成分画像のコントラストが最大になるＺ位置または再生された位相分布の位相量の値が最大になるＺ位置をその物体に対する合焦位置とする技術が開示されている。特開２００８−１１１７２６号で示す手法は、金属やシリコンウェハー表面の構造を検出する方法として優れている。しかしながら、この手法では画素毎に一つのＺ位置の位相分布しか取得することができないため、この手法を生体細胞や組織のように３次元的に重なりを持つ物体に対してそのまま適用すると、３次元的な構造を有する生体試料の位相分布を取得することができない。

【0065】

そこで、以下では、３次元的な構造を有する生体試料の位相分布を取得するために、複数のＺ位置で取得した画像から特定のＺ位置を合焦位置とする生体試料の位相分布を再生する方法について、図８を参照しながら説明する。

【0066】

まず、Ｚ位置（つまり、焦点面）を注目するＺ位置（つまり、観察面）に設定して、図８のステップＳ３１からステップ３７の手順により屈折成分の位相分布と構造成分の位相分布を算出する。なお、ステップＳ３１からステップＳ３７は、図１のステップＳ１からステップＳ７に対応する処理である。なお、ステップＳ３７では、図３に示す観察面に対する合焦状態でのＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて位相分布を算出する。

【0067】

次に、Ｚ位置を移動させる（図８のステップＳ３９（焦点面変更工程））。つまり、観察面に対して対物レンズの焦点面を光軸方向に移動させる。その後、再び、ステップＳ３１からステップＳ３７の処理を実行する。なお、ステップＳ３１からステップＳ３９までの処理は、少なくとも、注目しているＺ位置である位置Ｚ１、その位置Ｚ１からプラス方向に移動した位置Ｚ２、位置Ｚ１からマイナス方向に移動した位置Ｚ３に対して繰り返し行われる。即ち、少なくとも注目しているＺ位置とその上下に隣接するＺ位置で行われる。

【0068】

その後、各Ｚ位置（焦点面）で算出された構造成分の位相分布を比較して、そのＺ位置の上下に存在する生体試料の構造からそのＺ位置に漏れこむ位相分布を識別する（図８のステップＳ４１（漏れ位相分布識別工程））。

【0069】

ステップＳ４１では、まず、Ｚ位置毎に、そのＺ位置での構造成分の位相量が上下に隣接するＺ位置での構造成分の位相量よりも大きくなる光軸と直交するＸＹ平面内の領域を、そのＺ位置を合焦位置とする部分として抽出する。ここで構造成分の位相分布を用いる理由は、構造成分の位相分布が屈折成分の位相分布と比較してデフォーカス量に対して大きく変化する性質を有しているため、屈折成分の位相分布を含む合成後の位相分布や屈折成分の位相分布を用いた場合に比べて合焦位置となる部分をより正確に検出できるからである。なお、図９の位相分布Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３は、それぞれ位置Ｚ１、位置Ｚ２、位置Ｚ３でＭＴＦのみに依存するＯＴＦ（つまり、ＭＴＦ）を用いて算出された構造成分の位相分布である。

【0070】

ステップＳ４１では、その後、Ｚ位置毎に、そのＺ位置の上下に隣接するＺ位置と間のデフォーカスにより発生するＰＴＦを考慮してＯＴＦを算出する。そして、Ｚ位置毎に、構造成分の位相成分から抽出された領域の位相分布に、ＰＴＦを考慮して算出したＯＴＦを用いてコンボリューション処理を行う。これにより、上下に隣接するＺ位置でボケ像として検出される位相成分、換言すると、各Ｚ位置の上下に存在する生体試料の構造から各Ｚ位置に漏れこむ位相分布、が識別される。

【0071】

その後、ステップＳ４１で識別された各Ｚ位置に漏れこむ位相分布を各Ｚ位置の構造成分の位相分布から取り除く（図８のステップＳ４３（漏れ位相分布除去工程））。これは、各Ｚ位置の構造成分の位相分布から各Ｚ位置に漏れこむ位相分布を引き算することで実現される。

【0072】

最後に、ステップＳ４３で算出されたＺ位置に漏れこむ位相分布が取り除かれた構造成分の位相分布と屈折成分の位相分布とを合成して、生体試料の位相分布を算出する（図８のステップＳ４５（生体試料の位相分布合成工程））。さらに、算出した位相分布から生体試料の位相分布画像を形成してもよい。

【0073】

以上のように、図８に示す方法では、特開２００８−１１１７２６に示す手法とは異なり、観察位置の上下に位置する構造のボケ像の混入を取り除くことができる。このため、観察位置の構造をより正確に認識することが可能となる。従って、図８に示す方法によれば、生体試料の観察領域内の位相分布を精度良く求めることができるため、無染色で細胞や組織の３次元的な構造をさらに精度良く検査することができる。また、生体試料が３次元的に入り組んだ構造を有する場合であっても位相分布を精度良く再生することができる。さらに、正確な生体試料の位相分布から生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。

【0074】

図８に示す方法は図２に示す方法と併用されてもよく、これらの方法を併用することで、ボケ像の影響を更に小さくすることが可能である。また、上述したように、図２に示す方法と図８に示す方法によれば、いずれも注目するＺ位置以外から注目するＺ位置にボケ像として重畳される位相分布を除去して、焦点深度内の位相分布のみを抽出することができる。このため、焦点深度を計算または比較計測することで求めて、焦点深度内の位相分布を焦点深度で割り算することで、生体試料の各Ｚ位置での屈折率分布を求めることができる。更に、Ｚ位置毎に算出した屈折率分布を組み合わせて、生体試料の３次元的な屈折率分布を求めることも可能である。

【0075】

なお、異なるＺ位置で合焦した部分のボケ像をＺ位置の画像から除去する方法としては、非特許文献１（Ｄａｖｉｄ Ａ． Ａｒｇａｒｄ，Ｙ． Ｈｉｒａｏｋａ，Ｐｅｔｅｒ Ｓｈａｗ， Ｊｏｈｎ Ｗ．Ｓｅｄａｔ“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ ３０（１９８９））に開示される方法がある。この方法は、蛍光顕微鏡を用いた場合に、注目する焦点位置以外のＺ位置から漏れこむ蛍光を除去する方法として知られている。また、この方法は蛍光顕微鏡以外の観察法とは親和性が良くないことも知られている。その理由は、蛍光像は焦点移動が発生すると焦点移動に対応して像にボケが発生するが、蛍光顕微鏡以外の観察法では、形成される像が複数の成分を持ち、各成分の焦点移動に伴う像強度の変化が異なるからである。このため、非特許文献１を微分干渉顕微鏡や位相差顕微鏡のような像強度分布を位相分布に変換する顕微鏡にそのまま適用することは困難である。

【0076】

以下、図８に示す方法と非特許文献１の技術を比較し、それらの類似点と差異点について説明する。まず、図８に示す方法では、規格化された位相成分画像が形成される。規格化された位相成分画像は観察物体の位相分布に光学的応答特性がコンボリューションされた画像信号からなる画像であり、蛍光顕微鏡の像特性と同じ特性を有している。このため、図８に示す方法と非特許文献１の技術では像特性について類似している。一方、図８に示す方法では、規格化された位相成分画像を背景、屈折、構造の各成分に分解する。これは、図８に示す方法では、背景成分は焦点移動には関与しないこと、屈折成分は緩やかに変化する位相分布であり複数のＺ位置で共有され、焦点移動の影響を受け難いこと、構造成分は焦点移動の影響を受けて異なるＺ位置にボケ像が重畳されやすいこと、が考慮されているからである。この点については、図８に示す方法と非特許文献１は大きく異なっている。

【0077】

次に、上述した位相計測方法によって算出された生体試料の位相分布から形成された生体試料の位相分布画像を用いて異種合成画像を形成する方法について、図１０を参照しながら説明する。なお、図１０では、位相分布画像と合成する他の観察法により取得した画像として蛍光画像を例示しているが、生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した画像であれば任意の画像を位相分布画像と合成しても良い。

【0078】

まず、上述した位相計測方法（図１、図２、図８など）を用いて生体試料の位相分布を算出して、算出した位相分布から生体試料の位相分布画像を形成する（図１０のステップＳ５１（位相分布画像形成工程））。

【0079】

続いて、生体試料の蛍光画像を取得し（図１０のステップＳ５３（蛍光画像取得工程））、最後に、位相分布画像と蛍光画像を合成して異種合成画像を形成する（図１０のステップＳ５５（異種合成画像形成工程））。なお、蛍光画像は、位相分布画像と同じ装置で取得されてもよく、また、異なる装置で取得されても良い。

【0080】

図１０に示す方法によれば、生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像が合成に用いられるため、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる異種合成画像を形成することができる。例えば、蛍光物質と結びついたタンパク質などの活性の様子は、異種合成画像を構成する蛍光画像が示す蛍光の輝度やFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）のRatioの変化などによって知ることが可能であり、生体試料全体の形状は異種合成画像を構成する位相分布画像によって知ることが可能である。
以下、上述した位相計測方法及び異種合成画像形成方法の実施例について具体的に説明する。なお、実施例１から実施例３までは、位相分布画像を形成した装置とは別の装置によって生体試料の生化学的な現象を可視化した画像を取得した例であり、実施例４から実施例９は、これらの画像を同一の装置で取得した例である。

【実施例1】

【0081】

図１１を参照しながら、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置の構成について説明する。

【0082】

図１１に示される顕微鏡システム１００は、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置であり、位相分布画像と蛍光画像を合成して異種合成画像を形成する画像形成装置である。顕微鏡システム１００は、顕微鏡１と、顕微鏡１を制御するコンピュータ２０と、コンピュータ２０の指示に従って顕微鏡１を駆動する複数の駆動機構（駆動機構２１、駆動機構２２、駆動機構２３、駆動機構２４）と、生体試料Ｓの画像を表示するモニタ２５を含んでいる。

【0083】

顕微鏡１は、培養細胞などの生体試料Ｓの構造を像強度分布として撮像素子の受光面に投影する微分干渉顕微鏡であり、倒立顕微鏡として構成されている。より詳細には、顕微鏡１は、照明系、ステージ８、結像系、及び、撮像素子を備えたＣＣＤカメラ１３を備えている。なお、ＣＣＤカメラ１３は、受光素子が２次元に配列された２次元光検出器である。

【0084】

ステージ８は、生体試料Ｓを配置する電動ステージであり、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２２によって光軸方向に移動するように構成されている。照明系には、光源２、レンズ３、視野絞り４、像コントラスト変化ユニット５、ノマルスキープリズム６、及びコンデンサレンズ７が含まれ、結像系には、対物レンズ９、ノマルスキープリズム１０、検光子１１、及び結像レンズ１２が含まれている。ここで、コンデンサレンズ７の開口数（ＮＡ）は、例えば０．５５である。対物レンズ９は水浸対物レンズであり、対物レンズ９の倍率は、例えば６０倍であり、開口数（ＮＡ）は１．２である。

【0085】

光源２からの出射した光は、レンズ３及び視野絞り４を介して入射する像コントラスト変化ユニット５で直線偏光に変換され、ノマルスキープリズム６で常光と異常光とに分離されて、コンデンサレンズ７によりステージ８上に配置された生体試料Ｓに照射される。生体試料Ｓを透過した常光と異常光は、対物レンズ９を介して入射するノマルスキープリズム１０で合成され、検光子１１及び結像レンズ１２によってＣＣＤカメラ１３の受光面に結像する。このようにして微分干渉像が得られる。

【0086】

ここで、像コントラスト変化ユニット５は、偏光板５ａとλ／４板５ｂを有し、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２４により偏光板５ａが回転制御されることで直線偏光の位相を変化させて楕円偏光に変換する、セナルモン法を採用した位相変調器である。顕微鏡システム１００では、コンピュータ２０が、駆動機構２４を通じて像コントラスト変化ユニット５を制御することで、顕微鏡１によってＣＣＤカメラ１３に投影される像強度分布の像コントラストを連続的に変化させることができる。また、ステッピングモータ等を用いて像コントラストを離散的に変化させてもよい。

【0087】

また、ノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０は、それぞれ、コンデンサレンズ７、対物レンズ９の瞳位置またはその共役位置近傍に配置されている。顕微鏡システム１００では、ノマルスキープリズム６及びノマルスキープリズム１０は、シァー方向を切り替えるために、コンピュータ２０の指示に従って駆動機構２１、駆動機構２３により回転制御される。

【0088】

即ち、コンピュータ２０は、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得するように、ＣＣＤカメラ１３及び像コントラスト変化ユニット５を制御するとともに、シァー方向を切り替えるように、ノマルスキープリズム６及びノマルスキープリズム１０を制御する制御ユニットとして機能する。また、コンピュータ２０は、駆動機構２３を通じてステージ８を光軸方向に移動させることができるため、焦点面を光軸方向に変化させる焦点位置制御ユニットとしても機能する。さらに、後述するように、コンピュータ２０は、コンピュータ２０による制御により取得された像コントラストの異なる複数枚の画像から生体試料の位相分布を算出し、位相分布画像を形成する演算ユニットとしても機能する。
次に、以上のように構成された顕微鏡システム１００による位相計測方法について具体的に説明する。

【0089】

まず、コンピュータ２０は、駆動機構２１、駆動機構２３にノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０を回転させて、シァー方向がＣＣＤカメラ１３の受光面上で基準方向に対して４５°方向になるように設定する。その後、コンピュータ２０は、駆動機構２３に偏光板５ａを回転させることによりリターデーションを±θ、０に順番に変化させて、ＣＣＤカメラ１３から像コントラストの異なる３枚の微分干渉画像I1(−θ)、I1(０)、I1(θ)を取り込む。

【0090】

次に、コンピュータ２０は、駆動機構２１、駆動機構２３にノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０を９０°回転させて、シァー方向がＣＣＤカメラ１３の受光面上で基準方向に対して−４５°方向になるように設定する。その後、コンピュータ２０は、駆動機構２４に偏光板５ａを回転させることでリターデーションを±θ、０に順番に変化させて、ＣＣＤカメラ１３から像コントラストの異なる３枚の微分干渉画像I2(−θ)、I2(０)、I2(θ)を取り込む。

【0091】

なお、ノマルスキープリズムの方向によらず位相変調器（像コントラスト変化ユニット５）で発生するリターデーションが±θ、０になるように、駆動機構２４による偏光板５ａの回転は、ノマルスキープリズムの回転に伴って発生するリターデーション量のずれを予め計測した値を用いてオフセット補正するように制御される。

【0092】

次に、コンピュータ２０は、取得した微分干渉画像を用いて以下の演算を行うことで、規格化された位相成分画像をシァー方向毎に形成する。ここで、Def1、Def2は、規格化された位相成分画像である。
Def1=｛I1(θ)−I1(−θ)｝／｛I1(θ)＋I1(−θ)−I1(0)｝
Def2=｛I2(θ)−I2(−θ)｝／｛I2(θ)＋I2(−θ)−I2(0)｝

【0093】

その後、コンピュータ２０は、規格化された位相成分画像Def1、Def2のそれぞれに対して、平均化領域（カーネルサイズ）が100x100の平均化フィルターで平均化処理を数回行い、背景成分の画像BG1、BG2を形成する。さらに、規格化された位相成分画像Def1、Def2のそれぞれから背景成分の画像BG1、BG2を引き算する。それによって得られる視野ムラなどの外乱が除去された画像(Def1−BG1)、(Def2−BG2)のそれぞれに対して、平均化領域（カーネルサイズ）が20x20の平均化フィルターで平均化処理を数回行い、屈折成分の画像GR1、GR2を形成する。さらに、規格化された位相成分画像Def1、Def2から背景成分の画像BG1、BG2と屈折成分の画像GR1、GR2を引き算して構造成分の画像ST1(=Def1−BG1−GR1)、ST2(=Def2−BG2−GR2)を形成する。

【0094】

次に、コンピュータ２０は、構造成分の画像ST1、ST2に図３で示した微分干渉顕微鏡の合焦状態でのＯＴＦ（図３のＬ２）を用いてデコンボリューション処理を行い、物体の微細構造を表す、構造成分の位相分布PhS1、PhS2を算出する。

【0095】

なお、図３に示す光学的応答特性は、周波数が０である帯域とカットオフ周波数である帯域の２つの帯域でその値が０に近づく。このため、デコンボリューション処理のときに０割りが生じてしまうため、ウィナー手法を採用して０割りを防止する。構造成分の画像ST1、ST2では、周波数が０に近い帯域の画像成分が小さいため、ウィナー手法を採用して計算誤差を小さくすることができる。

【0096】

コンピュータ２０は、構造成分の位相分布PhS1、PhS2からノマルスキープリズムのシァー方向を切り替えることによって生じる画像間の相対的な位置ずれ量を算出する。構造成分の位相分布PhS1、PhS2は同じ物体（生体試料Ｓ）をノマルスキープリズムのシァー方向を変えて求めた構造成分の位相分布である。このため、それぞれのシァー方向に対して略垂直な構造に関する位相分布以外は類似した位相分布となる。従って、構造成分の位相分布PhS1、PhS2に位相限定相関法を適応することで２つの画像間の相対的な位置ずれ量（δx、δy）を算出することができる。

【0097】

さらに、コンピュータ２０は、屈折成分の画像GR1、GR2が生体試料の緩やかな位相の変化を有していることを考慮して、屈折成分の画像GR1、GR2に図３に示すＯＴＦの代わりに図１２で示すＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行う。これにより、緩やかな位相変化を表す、屈折成分の位相分布PhG1、PhG2を算出する。

【0098】

なお、合焦状態での屈折成分に対応するＯＴＦ（図１２のＬ３）は、微分干渉顕微鏡のＭＴＦが明視野顕微鏡のＭＴＦとｓｉｎ（πΔｆ）の積であること、及び、屈折成分が構造成分に比べて低い周波数成分でありその条件下では図３のＬ１で示すように明視野顕微鏡のＭＴＦは１とみなすことができること、からｓｉｎ（πΔｆ）として算出される。

【0099】

構造成分の位相分布PhS1、PhS2と屈折成分の位相分布PhG1、PhG2を算出すると、コンピュータ２０は、これらを合成して観察物体（生体試料Ｓ）の位相分布Ph1、Ph2を算出する。なお、観察物体の位相分布Ph1、Ph2は、視野ムラなどの外乱を取り除いた像強度分布の画像(Def1−BG1)、(Def2−BG2)に対応する位相分布であるので、以下の式により算出される。
Ph1＝PhS1＋PhG1
Ph2＝PhS2＋PhG2

【0100】

最後に、シァー方向の影響を排除するために、直交するシァー方向で得られた観察物体の位相分布Ph1、Ph2を合成する。この際、画像間の相対的な位置ずれ量（δx、δy）を用いて位相分布Ph1、Ph2を補正してから合成する。これにより、シァー方向の影響が排除された生体試料の位相分布Phを得ることができる。

【0101】

上記の方法により得られた生体試料の位相分布Phには、対物レンズ９の合焦位置近傍（焦点深度内）に存在する部分の位相分布に、合焦位置から若干外れた位置（例えば±２μm程度外れた位置）に存在する部分のボケた位相分布が混入していると想定される。このようなボケた位相分布を取り除くためには、コンピュータ２０は、さらに、以下のような演算を行う。

【0102】

まず、コンピュータ２０は、構造成分の画像ST1、ST2に、図７で示すような、焦点面から２μｍ程度デフォーカスした状態でのＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を行い、構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2を算出する。

【0103】

次に、コンピュータ２０は、デフォーカス状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2と合焦状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhS1、PhS2とを比較する。２μm程度のデフォーカス状態でのＯＴＦを用いて算出した構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2では、デフォーカスした位置に存在する物体の位相分布のボケが低減されていて、デフォーカスした位置に存在する物体の位相分布が構造成分の位相分布PhS1、PhS2内よりも、大きな値で算出される。これを考慮して、合焦位置近傍にある部分と２μｍ程度合焦位置から外れた位置にある部分とを識別して、構造成分の位相分布PhSd1、PhSd2から２μｍ程度合焦位置から外れた位置にある部分の位相分布PhSP1、PhSP2を抽出する。

【0104】

さらに、コンピュータ２０は、抽出された位相分布PhSP1、PhSP2に、デフォーカス状態でのＯＴＦを用いてコンボリューション処理を行って、合焦位置におけるボケが再生された位相分布PhSR1、PhSR2を算出する。

【0105】

最後に、コンピュータ２０は、ボケが再生された位相分布PhSR1、PhSR2を構造成分の位相分布PhS1、PhS2から引き算する。これにより、合焦位置近傍に存在する構造成分の位相分布がより正確に算出される。

【0106】

図１３Ａ、図１３Ｂ、及び図１３Ｃは、顕微鏡システム１００により観察位置を光軸方向に０．５μｍステップで変化させ、培養液中のマウスのｉＰＳ細胞の位相分布を計測することで得られた複数の位相分布画像の一部である。より詳細には、ＮＡ＝０．５５のコンデンサレンズで照明した培養液中のマウスのｉＰＳ細胞の位相分布を、６０ｘ、ＮＡ＝１．２の水浸対物レンズを用いて計測したものである。なお、図１３Ａは最も深い観察位置で計測した位相分布画像、図１３Ｂは図１３Ａの観察位置から３μｍ上方に位置する観察位置で計測した位相分布画像、図１３Ｃは図１３Ｂの観察位置から３μｍさらに上方に位置する観察位置で計測した位相分布画像である。また、図１３Ｃには、光軸方向から見た画像Ｍ１に加えて、画像Ｍ１に示すＡ−Ａ’断面及びＢ−Ｂ’断面における断面図の画像Ｍ２及び画像Ｍ３が示されている。画像Ｍ２及び画像Ｍ３は、図１３Ａから図１３Ｃに示す画像を含む光軸方向に０．５μｍステップで変化させて取得された複数の位相分布画像から生成された画像である。

【0107】

図１３Ａでは、画像の中央部分にｉＰＳ細胞のコロニーを、周辺部に分化した別の細胞を観察することができる。さらに、ｉＰＳ細胞のコロニーには、コロニーを構成する細胞の間隔が密になっている部分と細胞の間隔が比較的広がっている部分とが存在することも観察することができる。

【0108】

さらに、図１３Ａと比較して観察位置が３μｍ上方にある図１３Ｂでは、中央に位置するｉＰＳ細胞のコロニーの存在を確認することはできるが、図１３Ａでは周辺部に位置していた分化した細胞の存在は確認できない。この違いにより細胞の厚みの違いを認識することができる。また、図１３Ｂでは、中央部分に位置するｉＰＳ細胞のコロニーに分化した細胞が重なっている様子が見て取れるため、ｉＰＳ細胞の一部が分化してコロニー上部に横たわっていることを認識することができる。さらに、図１３Ａと図１３Ｂを比較するとｉＰＳ細胞のコロニーを形成する細胞の形状が異なっている。このことから、図１３Ａと図１３Ｂでは、コロニーを形成している細胞群のうちの光軸方向の異なる位置にある細胞が観察されていると認識することができる。

【0109】

図１３Ｂと比較して観察位置が３μｍ上方にある（つまり、図１３Ａと比較すると観察位置が６ｍ上方にある）図１３Ｃでも、ｉＰＳ細胞のコロニーとコロニー上部に横たわる分化した細胞を観察することができる。図１３Ｃには、ｉＰＳ細胞のコロニーを形成する、図１３Ａや図１３Ｂで観察された細胞とは別の細胞の存在を確認することができる。

【0110】

このように顕微鏡システム１００により得られる位相分布画像からは、コロニーの高さやコロニーを形成する各細胞の厚みに関する情報を得ることが可能であり、光軸方向それぞれの位置にある細胞の状態も確認することができる。具体的には、図１３Ａから図１３Ｃを参照すると、ｉＰＳ細胞だけではなく分化した細胞についても、細胞１個当たりの高さ（厚み）は、数μｍ以上になることがわかる。

【0111】

また、細胞内の小器官についてもμｍオーダの大きさを有していることが想定され、且つ、細胞や細胞小器官は連続的に変化していることから、観察位置を変化させて位相分布を計測すると、複数の観察位置に連続的に重複して検出されることになる。特定の観察位置で計測された位相分布と前後の観察位置で計測された位相分布との相関（類似性）を求めることにより、各観察位置で計測された位相分布の連続性を判断することができる。この連続性を利用して、複数の観察位置で計測された位相分布を連続的につなぎ合わせることで、細胞や細胞小器官の位相分布を正確に求めることができる。また、位相分布を観察位置の間隔で割り算することで各観察位置での細胞や細胞小器官の相対的な屈折率分布を求めることもできる。

【0112】

以上のように、本実施例に係る顕微鏡システム１００によれば、ｉＰＳ細胞の正確な位相分布を取得することができるため、ｉＰＳ細胞の位相再生結果から、培養されているｉＰＳ細胞の内部構造を位相分布として計測することができる。即ち、生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。また、コロニー内部で正常な細胞と変異している細胞を判別することもできる。さらに、ｉＰＳ細胞の未分化状態を識別することもできる。つまり、コロニー内の細胞状態（細胞の形態変化、コロニーの変化、死細胞の分布、細胞間の接着性）、分化による細胞の変性を評価することが可能である。なお、ｉＰＳ細胞に限られずＥＳ細胞であっても同様である。

【0113】

図１４は、本実施例に係る異種合成画像形成方法のフローチャートである。図１４を参照しながら、上述した顕微鏡システム１００で形成された位相分布画像と他の顕微鏡システムで取得された蛍光画像とを合成して異種合成画像を形成する方法について具体的に説明する。

【0114】

まず、利用者は、顕微鏡システム１００に生体試料Ｓを設置し（図１４のステップＳ６１）、その後、観察条件を設定する（図１４のステップＳ６３）。ここでは、例えば、任意の観察法（明視野観察やＤＩＣ観察）で生体試料Ｓを観察しながらＺ位置を調整して生体試料Ｓへのピント合せが行われる。また、ゲイン、ビニング、画像取得時間、照明強度などのＣＣＤカメラ１３のパラメータの設定、Ｚスタックのパラメータの設定、タイムラプスのパラメータの設定などが行われる。

【0115】

観察条件の設定が完了すると、コンピュータ２０が駆動機構を通じて像コントラスト変化ユニット５やノマルスキープリズム（ノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０）を制御しながら生体試料Ｓを複数回撮像して、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得する（図１４のステップＳ６５）。さらに、コンピュータ２０が取得したそれらの画像から生体試料Ｓの位相分布画像を形成する（図１４のステップＳ６７）。なお、ステップＳ６５とステップＳ６７は、図１０のステップＳ５１に相当する。

【0116】

位相分布画像が形成されると、コンピュータ２０が位相分布画像を調整する（図１４のステップＳ６９）。ここでは、例えば、輝度の調整などの画像処理を行って生体試料Ｓの形状や構造が良好に観察できるように位相分布画像を調整する。なお、ボケ像が十分に除去できていない場合やセクショニング効果が十分に得られていない場合には、必要に応じて観察条件を再設定して画像を取り直し、位相分布画像を改めて形成してもよい。

【0117】

位相分布画像の調整が完了すると、Ｚ位置を次の位置に変更し、ステップＳ６５からステップＳ６９の処理を繰り返す。この繰り返しは、ステップＳ６３で設定したＺスタックのパラメータ及びタイムラプスのパラメータによって決定される回数だけ実行される。

【0118】

その後、利用者は、蛍光画像を取得するために顕微鏡システム１００とは別の顕微鏡システム（例えば、共焦点蛍光顕微鏡システム）に生体試料Ｓを設置し（図１４のステップＳ７１）、その後、観察条件を設定する（図１４のステップＳ７３）。なお、ステップＳ７３での作業の詳細は、ステップＳ６３と同様である。

【0119】

観察条件の設定が完了すると、その別の顕微鏡システムが生体試料Ｓの蛍光画像を取得し（図１４のステップＳ７５）、さらに、蛍光画像を調整する（図１４のステップＳ７７）。なお、ステップＳ７７での作業の詳細は、ステップＳ６９と同様である。

【0120】

蛍光画像の調整が完了すると、ステップＳ７３で設定したパラメータによって決定される回数だけステップＳ７５及びステップＳ７７の処理を繰り返す。

【0121】

その後、顕微鏡システム１００で形成した位相分布画像と別の顕微鏡システムで取得した蛍光画像を合成して異種合成画像を形成する（図１４のステップＳ７９）。ここでは、例えば、別の顕微鏡システムで取得した蛍光画像を顕微鏡システム１００のコンピュータ２０にコピーして、コンピュータ２０がこれらの画像を合成する。

【0122】

合成に当たっては、予め取得した、位相分布画像と蛍光画像の各々のＸＹＺ情報（座標情報）とθ情報（角度情報）に基づいて画像間の位置合わせが行われる。さらに、観察倍率が異なる場合に位相分布画像と蛍光画像の各々の倍率情報に基づいて画像間の倍率合わせが行われてもよい。位相分布画像のＸＹＺ情報や倍率情報は、例えば、ステップＳ６５で取得され、蛍光画像のＸＹＺ情報や倍率情報は、例えば、ステップＳ７５で取得される。

【0123】

最後に、異種合成画像を構成する位相分布画像と蛍光画像の位置ずれを調整する（図１４のステップＳ８１）。ここでは、利用者がモニタ２５に表示されている異種合成画像を見ながら調整してもよく、また、コンピュータ２０が位置ずれを自動的に調整してもよい。位置ずれの調整は、例えば、位置合わせのために予め生体試料中に設けられたマーカを用いて行ってもよい。マーカは、例えば、位相分布画像においてコントラストが生じ、且つ、蛍光を発する、ビーズのようなものである。また、金属粒子のように位相分布も蛍光も生じないような暗点のようなものであってもよい。また、マーカの形状は、点形状に限られず任意の形状であってもよい。

【0124】

以上のように、本実施例に係る異種合成画像形成方法では、まず、生体試料Ｓの形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成して、さらに、形成された位相分布画像と蛍光画像を合成する。これにより、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる異種合成画像を形成することができる。

【0125】

なお、図１４では、位相分布画像と合成する画像として蛍光画像を例示したが、位相分布画像と合成する画像は蛍光画像に限られない。生体試料Ｓが発光した光に基づく生体試料Ｓの生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した画像であればよく、例えば、生体試料Ｓが自発的に周期的に発光する光（例えば、サーカディアンリズムに関連して発光する光）に基づく画像や、生体試料Ｓに投入した薬物によって誘発された生体試料Ｓからの発光に基づく画像であってもよい。また、ＳＨＧ顕微鏡により取得された画像であってもよい。さらに、生化学的な発光に基づく画像に限らず、生体試料で反射した音波、生体試料から発せられる磁場や熱分布、放射線などに基づく画像であってもよい。

【0126】

また、図１４では、位相分布画像を先に形成し、その後、蛍光画像を取得する例を示したが、蛍光画像を先に取得して、その後、位相分布画像を先に形成してもよい。また、像コントラストの異なる複数枚の画像と蛍光画像を取得後に、位相分布画像を形成しても良い。図１４に示す方法は、必要に応じて順番を変更して実行されても良い。

【実施例2】

【0127】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、位相分布画像が顕微鏡システム１００の代わりに顕微鏡システム１０１で形成される点を除き、実施例１に係る方法と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１０１について説明し、その他の説明を省略する。

【0128】

図１５に示される顕微鏡システム１０１は、顕微鏡１ａを備える顕微鏡システムである。顕微鏡システム１０１は、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置であり、位相分布画像と蛍光画像を合成して異種合成画像を形成する画像形成装置である。顕微鏡システム１０１は、光源２の代わりにＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２を備える点、像コントラスト変化ユニット５の代わりに位相変調手段３０を備える点、及び、駆動機構２４の代わりに駆動機構２６を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。

【0129】

ＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２は、例えば、単色ＬＥＤ光源である。顕微鏡システム１０１では、コンピュータ２０が、駆動機構２６を通じてＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２の発光を制御する。

【0130】

位相変調手段３０は、光軸に対して回転可能な２つの偏光板（偏光板３３、偏光板３４）と、ＬＥＤ光源３１からの光とＬＥＤ光源３２からの光を合成してレンズ３の光軸の方向に出射する光合成手段であるビームスプリッタ３５と、光学軸を所定の方向に向けて配置されたλ／４板３６とを備えている。ビームスプリッタ３５は、例えば、ハーフミラーを備えている。

【0131】

偏光板３３、偏光板３４は、それぞれＬＥＤ光源３１とビームスプリッタ３５の間、ＬＥＤ光源３２とビームスプリッタ３５の間に配置されている。偏光板３３及び偏光板３４は、駆動機構（ここでは駆動機構２６）を通じてコンピュータ２０によって回転制御され、λ／４板（ここでは、λ／４板３６）とともにそれぞれセナルモン法を採用した位相変調器として機能する点は、図１１の偏光板５ａと同様である。

【0132】

偏光板３３と偏光板３４には、偏光板３３と偏光板３４を連動して回転させる図示しない構造が設けられていて、その構造により、図１６に示すように、偏光板３３の振動方向３３ａと偏光板３４の振動方向３４ａがλ／４板３６の光学軸（Ｓ軸、Ｆ軸）に対して同じ角度で逆方向に回転するように構成されている点が、図１１の偏光板５ａとは異なっている。

【0133】

さらに、偏光板３３と偏光板３４には、偏光板３３と偏光板３４の一方の回転角をオフセットする機構が設けられている。この機構により、ビームスプリッタ３５のハーフミラーなどで生じるリターデーション量を補償するように、偏光板３３と偏光板３４の一方の回転角をオフセットする。

【0134】

以上のように構成された顕微鏡システム１０１によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。さらに、顕微鏡システム１０１では、偏光板３３及び偏光板３４が任意の対称な回転角に設定された状態で、コンピュータ２０がＬＥＤ光源３１及びＬＥＤ光源３２を順番に発光させることで、リターデーション量の異なる設定で標本Ｓが撮像された像コントラストの異なる２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を取得することができる。なお、ＬＥＤ光源の発光制御は、実施例１に係る顕微鏡システム１００における偏光板５ａの回転制御に比べて高速な切替えが可能であるため、本実施例に係る顕微鏡システム１０１によれば、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を素早く取得することができる。従って、実施例１に係る顕微鏡システム１００よりも高速な位相分布の計測が可能となる。

【0135】

なお、本実施例に係る顕微鏡システム１０１では、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なり、微分干渉画像I1(０)を取得することなく、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）のみを取得している。上述した位相計測方法では、微分干渉画像I1(０)も使用されているが、微分干渉画像I1(０)は位相量の大きな物質で生じる誤差を補償するために用いられるものであるので、２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）のみからでも位相分布を計測することができる。

【実施例3】

【0136】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、位相分布画像が顕微鏡システム１００の代わりに顕微鏡システム１０２で形成される点を除き、実施例１に係る方法と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１０２について説明し、その他の説明を省略する。

【0137】

図１７に示される顕微鏡システム１０２は、レーザ走査型の微分干渉顕微鏡である顕微鏡１ｂを備えている顕微鏡システムである。顕微鏡システム１０２は、実施例１及び実施例２に係る顕微鏡システムと同様に、上述した位相計測方法を実施する位相計測装置であり、位相分布画像と蛍光画像を合成して異種合成画像を形成する画像形成装置である。

【0138】

顕微鏡システム１０２は、顕微鏡１の代わりに顕微鏡１ｂを備える点、駆動機構２４の代わりに駆動機構２７を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００とは異なっている。さらに、顕微鏡１ｂは、光源２、視野絞り４及び像コントラスト変化ユニット５の代わりに検出手段４０を備える点、検光子１１、結像レンズ１２及びＣＣＤカメラ１３の代わりに照明手段５０を備える点が、実施例１に係る顕微鏡１とは異なっている。即ち、顕微鏡１ｂは、ステージ８の下方から生体試料Ｓにレーザ光を照射して生体試料Ｓを透過したレーザ光を検出するように構成されている。

【0139】

照明手段５０は、レーザ光源５１と、ビーム走査装置５２と、リレーレンズ５３と、ミラー５４と、を備えている。レーザ光源５１は、可視域のレーザ光を出射するレーザであってもよく、また、可視光に比べて波長が長く散乱が生じにくい近赤外域のレーザ光を出射するレーザであってもよい。標本Ｓが厚い場合には、近赤外域のレーザ光を出射するレーザが望ましい。ビーム走査装置５２は、レーザ光源５１から出射したレーザ光で標本Ｓを走査するための装置であり、例えば、対物レンズ９の瞳共役位置でレーザ光を偏向させるガルバノミラーなどを備えている。

【0140】

検出手段４０は、２つの光検出器である光電子増倍管（ＰＭＴ４１、ＰＭＴ４２）と、位相変調手段３０と、を備える差動検出手段である。位相変調手段３０は、実施例２に係る顕微鏡１ａの位相変調手段３０と同様の構成を有していて、具体的には、光軸に対して回転可能な２つの偏光板（偏光板３３、偏光板３４）と、ハーフミラーを備えるビームスプリッタ３５と、光学軸を所定の方向に向けて配置されたλ／４板３６とを備えている。なお、ここでは、ビームスプリッタ３５は、標本Ｓからのレーザ光を２つに分けてＰＭＴ４１とＰＭＴ４２に導く光分離手段として機能する。

【0141】

通常の差動検出手段では、偏光ビームスプリッタ（ＰＢＳ）によって光が分離されるためリターデーションの設定に制約がある。これに対して、顕微鏡システム１０２の差動検出手段（検出手段４０）は、標本に応じたリターデーションの設定を可能とするために、振動方向（振動方向３３ａ、振動方向３４ａ）がλ／４板３６の光学軸（Ｓ軸、Ｆ軸）に対して同じ角度で逆方向に回転するように構成された偏光板３３と偏光板３４を備えている点が、通常の差動検出手段とは異なっている。

【0142】

以上のように構成された顕微鏡システム１０２によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。さらに、顕微鏡システム１０２では、光源として、バンド幅が狭く高い単色性を有するレーザ光を出射するレーザ光源５１が用いられることから、Ｓ／Ｎが大きくコントラストが高い微分干渉画像を取得することができる。また、レーザ光の狭いバンド幅はデコンボリューション処理の高精度化にも寄与する。このため、微分干渉画像からより正確な位相分布を算出することができる。従って、顕微鏡システム１０２によれば、実施例１に係る顕微鏡システム１００よりも正確な位相分布を算出することができる。

【0143】

なお、通常の顕微鏡（ワイドフィールド型の顕微鏡）で光源としてレーザ光源を採用した場合、コヒーレント照明に起因して解像力の低下やスペックルの発生といった望ましくない現象が生じるが、顕微鏡システム１０２のような走査型の顕微鏡では、このような現象は生じない。このため、走査型の顕微鏡はレーザ光の使用に好適である。

【0144】

その一方で、走査型の顕微鏡はワイドフィールド型の顕微鏡に比べて画像の取得に時間がかかるため、位相分布の算出に要する時間も長くなりやすい。この点について、顕微鏡システム１０２では、作動検出手段（検出手段４０）を用いて像コントラストの異なる複数の画像を同時に取得することで、位相分布の算出の高速化を図っている。具体的には、レーザ光源５１から出射して差動検出手段（検出手段４０）に入射したレーザ光は、ビームスプリッタ３５でＰＭＴ４１へ向かうレーザ光とＰＭＴ４２へ向かうレーザ光とに分離され、その後、それぞれ、対称な回転角度に設定された偏光板３３、偏光板３４を介してＰＭＴ４１、ＰＭＴ４２に入射する。これにより、顕微鏡システム１０２では、ビーム走査装置５２による１回の標本走査で、リターデーション量の異なる設定で標本Ｓが撮像された像コントラストの異なる２枚の微分干渉画像（I1(−θ)、I1(θ)）を同時に取得することができる。

【0145】

図１８Ａは、顕微鏡システム１０２によって得られた小腸のクリプト組織の細胞の位相分布画像を示す図である。図１８Ａに示す小腸のクリプトの画像には、クリプトの３次元構造が良好に表わされている。従って、図１８Ａから、顕微鏡システム１０２を用いることで生体組織の３次元構造を観察することが可能であり、例えば、組織内に変位細胞が存在する場合であれば、この変位細胞を標識化することなく識別して観察し得る、ことが確認できる。図１８Ｂは、図１８Ａに示す小腸のクリプト組織の細胞の蛍光画像を示す図であり、この画像では、細胞質内のたんぱく質に発現しているＧＦＰの量が蛍光強度として表示されている。さらに、図１８Ｃは、図１８Ａと図１８Ｂに示す画像を合成した画像を示す図である。

【実施例4】

【0146】

図１９に示される顕微鏡システム１０３は、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１の代わりに顕微鏡１ｃを含む点、後述する蛍光キューブ６１を光路に対して挿脱する駆動機構２８を含む点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。また、顕微鏡システム１０３は、蛍光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点も、顕微鏡システム１００とは異なっている。

【0147】

顕微鏡１ｃは、蛍光画像を取得するための照明手段６０として、ノマルスキープリズム１０と検光子１１の間に挿脱自在に配置された蛍光キューブ６１と、レンズ６２と、蛍光画像を取得するための光源６３を含む点が、実施例１に係る顕微鏡１と異なっている。その他の構成は顕微鏡１と同様である。なお、顕微鏡１ｃは、微分干渉顕微鏡であり、且つ、蛍光顕微鏡である。また、蛍光キューブ６１は、ダイクロイックミラー、励起フィルター、及び吸収フィルターで構成されている。

【0148】

顕微鏡システム１０３で蛍光画像を取得する場合には、コンピュータ２０は、駆動機構２８を通じて蛍光キューブ６１を光路中に挿入して、光源６３を発光させる。その結果、光源６３から出射された励起光が生体試料Ｓに照射されて、生体試料Ｓから生じた蛍光がＣＣＤカメラ１３に入射する。これにより、顕微鏡システム１０３は蛍光画像を取得することができる。

【0149】

なお、検光子１１が蛍光を吸収するとＣＣＤカメラ１３に入射する蛍光の光量が少なくなってしまうため、検光子１１は蛍光キューブ６１の挿入と同時に光路外に取り除かれることが望ましい。

【0150】

顕微鏡システム１０３で位相分布画像を取得する場合には、コンピュータ２０は、駆動機構２８を通じて蛍光キューブ６１を光路から取り除いて、光源２を発光させる。その後は、実施例１で上述した方法によって、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得し、位相分布画像を形成する。

【0151】

以上のように構成された顕微鏡システム１０３によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。さらに、顕微鏡システム１０３では、生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した蛍光画像も取得することができる。従って、顕微鏡システム１０３によれば、他の顕微鏡システムと画像のやり取りする必要がないため、実施例１に係る顕微鏡システム１００に比べて、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を容易に形成することができる。また、位相分布画像と蛍光画像を同じ顕微鏡で取得するため、画像間の位置ずれが生じにくい。

【0152】

図２０は、本実施例に係る異種合成画像形成方法のフローチャートである。図２０を参照しながら、顕微鏡システム１０３で行われる異種合成画像を形成する方法について具体的に説明する。

【0153】

まず、利用者は、顕微鏡システム１０３に生体試料Ｓを設置し（図２０のステップＳ９１）、その後、観察条件を設定する（図２０のステップＳ９３）。ここでは、例えば、任意の観察法（明視野観察、ＤＩＣ観察、蛍光観察）で生体試料Ｓを観察しながらＺ位置を調整して生体試料Ｓへのピント合せが行われる。また、ゲイン、ビニング、画像取得時間、照明強度などのＣＣＤカメラ１３のパラメータの設定、Ｚスタックのパラメータの設定、タイムラプスのパラメータの設定などが行われる。なお、これらの設定は、位相分布画像を取得する場合と蛍光画像を取得する場合で異なる設定であってもよい。

【0154】

観察条件の設定が完了すると、コンピュータ２０は、駆動機構を通じて蛍光キューブ６１を光路から取り除いて、光源２を発光させる。さらに、像コントラスト変化ユニット５やノマルスキープリズム（ノマルスキープリズム６、ノマルスキープリズム１０）を制御しながら生体試料Ｓを複数回撮像して、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得する（図２０のステップＳ９５）。

【0155】

次に、コンピュータ２０は、駆動機構を通じて蛍光キューブ６１を光路中に挿入して、光源６３を発光させて蛍光画像を取得する（図２０のステップＳ９７）。その後、コンピュータ２０は、ステップＳ９５で取得した画像から生体試料Ｓの位相分布画像を形成する（図２０のステップＳ９９）。

【0156】

位相分布画像が形成されると、コンピュータ２０が位相分布画像と蛍光画像を調整する（図２０のステップＳ１０１）。ここでは、例えば、輝度の調整などの画像処理を行って生体試料Ｓが良好に観察できるように位相分布画像と蛍光画像を調整する。なお、位相分布画像においてボケ像が十分に除去できていない場合やセクショニング効果が十分に得られていない場合には、必要に応じて観察条件を再設定して画像を取り直し、位相分布画像を改めて形成してもよい。

【0157】

画像の調整が完了すると、位相分布画像と蛍光画像を合成して異種合成画像を形成し（図２０のステップＳ１０３）、さらに、異種合成画像を構成する位相分布画像と蛍光画像の位置ずれを調整する（図２０のステップＳ１０５）。ここでは、利用者がモニタ２５に表示されている異種合成画像を見ながら調整してもよく、また、コンピュータ２０が位置ずれを自動的に調整してもよい。位置ずれの調整は、例えば、位置合わせのために予め生体試料中に設けられたマーカを用いて行ってもよい。

【0158】

その後、Ｚ位置を次の位置に変更し、ステップＳ９５からステップＳ１０５までの処理を繰り返す。この繰り返しは、ステップＳ９３で設定したＺスタックのパラメータ及びタイムラプスのパラメータによって決定される回数だけ実行される。なお、２回目以降のステップＳ１０１及びステップＳ１０５では、初回と同じ調整量で調整が行われればよい。

【0159】

以上により、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる異種合成画像を形成することができる。

【0160】

なお、顕微鏡システム１０３は、蛍光キューブ６１を交換して蛍光波長の異なる複数の蛍光画像を取得しても良く、複数の蛍光画像と位相分布画像を合成して異種合成画像を形成しても良い。また、顕微鏡システム１０３は、熱に起因するステージ８のドリフトや振動の影響を低減するために、タイムラプス撮影毎にオートフォーカスを自動的に行ってもよい。また、十分な明るさが得られる場合であれば、蛍光キューブ６１を光路中に挿入した状態で像コントラストの異なる複数枚の画像を取得して位相分布画像を形成しても良い。この場合、蛍光キューブ６１によって光源２から出射した光のうち所定の波長帯域の光が生体試料Ｓに照射されることで色収差の影響が軽減されるため、試料によっては位相分布画像の可視性が改善される。また、結像レンズ１２とＣＣＤカメラ１３の間にダイクロイックミラーを設けてダイクロイックミラーの反射光路上に蛍光検出用により高い感度を有するＣＣＤカメラを設けても良い。

【実施例5】

【0161】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、顕微鏡システム１０３の代わりに顕微鏡システム１０５で行われる点を除き、実施例４と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１０５について説明し、その他の説明を省略する。

【0162】

図２１に示される顕微鏡システム１０５は、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１ｃの代わりに顕微鏡１ｅを含む点、駆動機構２８を含まない点が、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と異なっている。なお、顕微鏡システム１０５は、蛍光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点は、顕微鏡システム１０３と同様である。

【0163】

顕微鏡１ｅは、レーザ走査型の顕微鏡であり、位相分布画像と蛍光画像は、それぞれレーザ光で生体試料Ｓを走査することによって取得される。顕微鏡１ｅは、視野絞り４を含まない点、光源２の代わりにＰＭＴ７５を含む点が、顕微鏡１ｃと異なっている。また、検光子１１、結像レンズ１２、ＣＣＤカメラ１３、及び、蛍光画像取得用の照明手段６０の代わりに、照明兼検出手段７０及びミラー５４を備える点も、顕微鏡１ｃと異なっている。顕微鏡１ｅは、微分干渉顕微鏡であり、蛍光顕微鏡である。

【0164】

照明兼検出手段７０は、レーザ光源５１と、ビーム走査装置５２と、リレーレンズ５３と、ダイクロイックミラー７１と、共焦点レンズ７２、共焦点絞り７３、ＰＭＴ７４を備えている。レーザ光源５１は、例えば、可視光に比べて波長が長く散乱が生じにくい近赤外域のレーザ光を出射するレーザである。ビーム走査装置５２は、レーザ光源５１から出射したレーザ光で標本Ｓを走査するための２次元走査装置であり、例えば、対物レンズ９の瞳共役位置でレーザ光を偏向させるガルバノミラーなどを備えている。ダイクロイックミラー７１は、レーザ光を透過し蛍光を反射する光学特性を有している。

【0165】

顕微鏡システム１０５では、レーザ光源５１から発せられたレーザ光をＰＭＴ７５で検出することにより、上述した位相計測方法を用いて像コントラストの異なる複数枚の画像を取得して位相分布画像を形成する。また、レーザ光源５１から発せられたレーザ光の照射により生体試料Ｓから発生した蛍光をＰＭＴ７４で検出することにより、蛍光画像を取得する。なお、照明兼検出手段７０は、焦点面以外から発生した蛍光が共焦点絞り７３により遮断され焦点面から発生した蛍光のみがＰＭＴ７４で検出される、共焦点光学系を有する共焦点検出手段である。

【0166】

以上のように構成された顕微鏡システム１０５によっても、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と同様に、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる異種合成画像を容易に形成することができる。

【0167】

さらに、顕微鏡システム１０５では、光源としてレーザ光源５１が用いられることから、実施例３で上述した理由により、生体試料Ｓの位相分布をより正確に表わした位相分布画像を形成することができる。また、セクショニング効果を発揮する共焦点検出手段を用いて蛍光画像が取得されるため、蛍光物質と結びついた物質の三次元座標も把握することができる。従って、顕微鏡システム１０５によれば、実施例４に係る顕微鏡システム１０３よりも正確に生体試料Ｓを観察可能な異種合成画像を形成することができる。なお、顕微鏡システム１０５は、例えば、図１７に示す差動検出手段４０を備えても良く、その場合、像コントラストの異なる複数枚の画像を差動検出手段４０を介して取得しても良い。また、顕微鏡システム１０５は、さらに、共焦点絞り７３とＰＭＴ７４の間にダイクロイックミラーや分光グレーティングなどを設けて、波長毎に蛍光画像を取得しても良い。

【実施例6】

【0168】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、顕微鏡システム１０３の代わりに顕微鏡システム１０８で行われる点を除き、実施例４と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１０８について説明し、その他の説明を省略する。

【0169】

図２２に示される顕微鏡システム１０８は、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１ｃの代わりに顕微鏡１ｈを含む点が、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と異なっている。なお、顕微鏡システム１０８は、蛍光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点は、顕微鏡システム１０３と同様である。

【0170】

顕微鏡１ｈの蛍光画像を取得する構成は、スピニングディスク型の蛍光共焦点顕微鏡であり、一方、位相分布画像を取得する構成は、ワイドフィールド型の微分干渉顕微鏡である。顕微鏡１ｈは、照明手段６０の代わりに照明兼検出手段８０及びミラー５４を含む点が、顕微鏡１ｃと異なっている。

【0171】

照明兼検出手段８０は、レーザ光源５１と、ダイクロイックミラーを含むミラーユニットである蛍光キューブ８５と、集光レンズ８１と、共焦点ディスク８２と、集光レンズ８３と、ＣＣＤカメラ８４とを備えた共焦点光学系を有する共焦点検出手段である。共焦点ディスク８２は、例えば、ニポウディスクやスリットディスクなどの回転ディスクである。

【0172】

顕微鏡システム１０８でも、駆動機構２８を通じてミラー５４を光路中に挿入して蛍光画像を取得し、駆動機構２８を通じてミラー５４を光路から取り除いて位相分布画像を取得する。

【0173】

以上のように構成された顕微鏡システム１０８によっても、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と同様に、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる異種合成画像を容易に形成することができる。また、スピニングディスク（共焦点ディスク８２）によってセクショニング効果を発揮する手段を用いて蛍光画像を取得することができるため、蛍光物質と結びついた物質の三次元座標も把握することができる。さらに、顕微鏡システム１０８では、蛍光画像が二次元光検出器であるＣＣＤカメラ８４で取得されるため、高速に走査画像である蛍光画像を取得することができる。

【実施例7】

【0174】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、顕微鏡システム１０３の代わりに顕微鏡システム１１０で行われる点を除き、実施例４と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１１０について説明し、その他の説明を省略する。

【0175】

図２３に示される顕微鏡システム１１０は、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１ｃの代わりに顕微鏡１ｊを含む点が、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と異なっている。なお、顕微鏡システム１１０は、蛍光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点は、顕微鏡システム１０３と同様である。

【0176】

顕微鏡１ｊは、シート照明手段９０を含む点、照明手段６０の代わりに、ノマルスキープリズム１０と検光子１１の間に交換自在に配置された波長選択フィルター９３を含む点が、顕微鏡１ｃと異なっている。顕微鏡１ｊは、微分干渉顕微鏡であり、蛍光顕微鏡である。

【0177】

シート照明手段９０は、レーザ光源９１と、レンズ９２とを含んでいる。レンズ９２は、例えば、シリンドリカルレンズである。シート照明手段９０は、レーザ光源９１から出射されたレーザ光をレンズ９２によってシート状のレーザ光に変換し、側面から生体試料Ｓをシート状に照射するように構成されている。

【0178】

顕微鏡システム１１０で蛍光画像を取得する場合には、コンピュータ２０は、駆動機構２８を通じて波長選択フィルター９３を蛍光が透過するフィルターに変更して、レーザ光源９１を発光させる。そして、シート照明手段９０からのシート状のレーザ光の照射により生体試料Ｓから発生した蛍光をＣＣＤカメラ１３で検出することにより、蛍光画像を取得する。

【0179】

顕微鏡システム１１０で位相分布画像を取得する場合には、コンピュータ２０は、駆動機構２８を通じて波長選択フィルター９３を光源２の光源波長の光を透過するフィルターに変更して、光源２を発光させる。その後は、実施例１で上述した方法によって、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得し、位相分布画像を形成する。

【0180】

以上のように構成された顕微鏡システム１１０によっても、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と同様の効果を得ることができる。また、セクショニング効果を発揮するシート照明手段を用いて蛍光画像が取得されるため、蛍光物質と結びついた物質の三次元座標も把握することができる。従って、顕微鏡システム１１０によれば、実施例４に係る顕微鏡システム１０３よりも正確に生体試料Ｓを観察可能な異種合成画像を形成することができる。

【0181】

なお、顕微鏡システム１１０は、複数のＣＣＤカメラを設けて、位相分布画像と蛍光画像を異なるＣＣＤカメラで取得するように構成されてもよい。また、本実施例に係る顕微鏡システム１１０は、蛍光画像の代わりに暗視野画像を、位相分布画像と合成してもよい。暗視野画像は、金属コロイド粒子を注入してラベリングされた生体試料Ｓをシート照明手段９０で照明し、生体試料Ｓからの散乱光をＣＣＤカメラ１３で検出することによって取得することができる。

【実施例8】

【0182】

本実施例に係る異種合成画像形成方法は、顕微鏡システム１０３の代わりに顕微鏡システム１１１で行われる点を除き、実施例４と同様である。従って、以下では、顕微鏡システム１１１について説明し、その他の説明を省略する。

【0183】

図２４に示される顕微鏡システム１１１は、位相分布画像と蛍光画像を合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１ｃの代わりに顕微鏡１ｋを含む点が、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と異なっている。なお、顕微鏡システム１１１は、蛍光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点は、顕微鏡システム１０３と同様である。

【0184】

顕微鏡１ｋは、照明手段６０の代わりに、全反射照明手段である照明手段９４を含む点が、顕微鏡１ｃと異なっている。照明手段９４は、光源６３の代わりにレーザ光源９５と光ファイバー９６からなるファイバー光源を含む点が、照明手段６０と異なっている。光ファイバー９６の出射端は、レンズ６２の光軸からずれた位置に配置されている。このため、ファイバー光源から出射されたレーザ光は、レンズ６２の光軸からずれた位置に光軸と平行に入射し、対物レンズ９から大きな角度で出射される。これにより、レーザ光が生体試料Ｓで全反射し、生体試料Ｓがエバネッセント光によって励起される。顕微鏡１ｋは、微分干渉顕微鏡であり、全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence microscope）である。

【0185】

以上のように構成された顕微鏡システム１１１によっても、実施例４に係る顕微鏡システム１０３と同様の効果を得ることができる。従来の全反射蛍光顕微鏡では、カバーガラス近傍の試料の画像しか取得できず試料全体の形状を把握することが難しいのに対して、顕微鏡システム１１０では、位相分布画像と蛍光画像が合成されているため、試料全体の形状も把握することができる。なお、顕微鏡システム１１１は、複数のＣＣＤカメラを設けて、位相分布画像と蛍光画像を異なるＣＣＤカメラで取得するように構成されてもよい。また、十分な明るさが得られる場合であれば、蛍光キューブ６１を光路中に挿入した状態で像コントラストの異なる複数枚の画像を取得して位相分布画像を形成しても良い。この場合、蛍光キューブ６１によって光源２から出射した光のうち所定の波長帯域の光が生体試料Ｓに照射されることで色収差の影響が軽減されるため、試料によっては位相分布画像の可視性が改善される。

【実施例9】

【0186】

図２５に示される顕微鏡システム１１２は、位相分布画像と生体試料Ｓが発光した光に基づく発光画像とを合成した異種合成画像を形成する画像形成装置であり、顕微鏡１の代わりに顕微鏡１ｌを含む点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。また、顕微鏡システム１１２は、発光画像と位相分布画像の両方を取得することができる点も、顕微鏡システム１００とは異なっている。

【0187】

なお、発光画像とは、例えば、生体試料Ｓが自発的に周期的に発光する光（例えば、サーカディアンリズムに関連して発光する光）に基づく画像や、生体試料Ｓに投入した薬物によって誘発された生体試料Ｓからの発光に基づく画像である。

【0188】

顕微鏡１ｌは、生体試料Ｓが発光する波長の光を選択的に透過させる波長選択フィルター９３を含む点が顕微鏡１と異なっている。

【0189】

顕微鏡システム１１２では、光源２から発せられた光をＣＣＤカメラ１３で検出し、上述した位相計測方法を用いて像コントラストの異なる複数枚の画像を取得して位相分布画像を形成する。また、生体試料Ｓが発光した光をＣＣＤカメラ１３で検出することにより、発光画像を取得する。

【0190】

なお、像コントラストの異なる複数枚の画像を、波長選択フィルター９３を介して取得することで、ＣＣＤカメラ１３で検出される波長が制限される。このため、色収差の影響が抑えた位相分布画像を形成することができる。また、像コントラストの異なる複数枚の画像を取得する際に、生体試料Ｓから発せられた光も同時に検出される可能性があるが、生体試料Ｓから発せられた光は微弱であるので、位相分布画像に及ぼす影響は限定的である。

【0191】

以上のように構成された顕微鏡システム１１２によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に生体試料の形状や構造を正確に把握することができる位相分布画像を形成することができる。さらに、顕微鏡システム１１２では、生体試料の生化学的な現象及び／又は物理学的な現象を可視化した発光画像も取得することができる。従って、顕微鏡システム１１２によれば、位相分布画像と発光画像を合成した異種合成画像を容易に形成することができる。

【0192】

上述した実施例は、発明の理解を容易にするために本発明の具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。例えば、上述した実施例では、微分干渉顕微鏡の構成を備えた顕微鏡システムを用いているが、必ずしも顕微鏡システムに含まれる顕微鏡は微分干渉顕微鏡の構成を有するものに限定されるものではなく、像強度分布を位相分布に変換する顕微鏡の構成を有するものであればよい。特開平７−２２５３４１号公報には、位相差顕微鏡の位相膜の位相量を変化せることで像コントラストを変化させ規格化された位相成分画像を形成する技術が開示されている。この技術を採用した位相差顕微鏡を備えた顕微鏡システムであってもよい。

【0193】

また、上述した実施例に示すように、顕微鏡システムは、ワイドフィールド型の顕微鏡システムであっても、走査型の顕微鏡システムであってもよい。また、光源も任意の光源を使用する可能であり、顕微鏡システムには、コヒーレント照明とインコヒーレント照明のいずれが採用されても良い。

【0194】

また、上述した実施例では、顕微鏡システムは、図１及び図２に示す方法を実行する例を示したが、図８に示す方法を実行してもよい。また、特開２０１２−７３５９１号公報には、偏斜照明を使った顕微鏡が開示されており、照明の方向を変化せることで像コントラストを変化させることができる。これを使っても同様の効果を得ることができる。

【0195】

また、顕微鏡システムは、算出された生体試料の位相分布を用いて正常な細胞と変異している細胞（変位細胞）との判別を画像処理により行なう判別処理部を備えた観察装置として構成されてもよい。この場合、観察装置は、部位ごとの屈折率分布や生体試料の位相分布画像をモニタ２５等に表示する際に、変位細胞を他の細胞と識別して表示してもよい。また、判別処理部では、例えば、細胞の形状（他の細胞とは形状が異なるなど）、大きさ（細胞の外形に突起部が存在するなど）、明るさ（他の細胞よりも明るいまたは暗いなど）等に基づいて、変位細胞を判別してもよい。

【0196】

本発明の画像形成方法及び画像形成装置は、特許請求の範囲に規定された本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。図１３Ａから図１３Ｃ及び図１８Ａから図１８Ｃに示す画像から明らかなように、本願発明によれば、細胞レベルから組織レベル（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞または幹細胞が分化することによって形成された組織も含む）までの任意の生体試料を観察して、生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生じている生体試料中の部位の位置や生化学的な現象及び／又は物理学的な現象が生体試料の形状や構造に及ぼす影響を正確に把握することができる。

【符号の説明】

【0197】

１、１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｅ、１ｈ、１ｊ、１ｋ、１ｌ顕微鏡
２、６３ 光源
３、６２、９２ レンズ
４ 視野絞り
５ 像コントラスト変化ユニット
５ａ、３３、３４ 偏光板
５ｂ、３６ λ／４板
６、１０ ノマルスキープリズム
７ コンデンサレンズ
８ ステージ
９ 対物レンズ
１１ 検光子
１２ 結像レンズ
１３、８４ ＣＣＤカメラ
２０ コンピュータ
２１、２２、２３、２４、２６、２７、２８ 駆動機構
２５ モニタ
３０ 位相変調手段
３１、３２ ＬＥＤ光源
３３ａ、３４ａ 振動方向
３５ ビームスプリッタ
４０ 検出手段
４１、４２、７４、７５ ＰＭＴ
５０、６０、９４ 照明手段
５１、９１、９５ レーザ光源
５２ ビーム走査装置
５３ リレーレンズ
５４ ミラー
６１、８５ 蛍光キューブ
７０、８０ 照明兼検出手段
７１ ダイクロイックミラー
７２ 共焦点レンズ
７３ 共焦点絞り
８１、８３ 集光レンズ
８２ 共焦点ディスク
９０ シート照明手段
９３ 波長選択フィルター
９６ 光ファイバー
１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０８、１１０、１１１、１１２ 顕微鏡システム
Ｓ 生体試料

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】