【実施例】
【0124】
材料
それぞれARPKD及びADPKDのモデルである、先天性多嚢胞腎(cpk)マウス及びpkd1−低次形態(pkdlhm)マウスで実験を行った(Chiu et al. Am J Pathol 2006 169: 1925-1938; Lantinga van-Leeuwen et al Hum Mol Genet 2004 13: 3069-3077)。
【0125】
実施例1−cpkマウスの腎臓の血管系及びリンパ管系の評価
方法
先天性多嚢胞腎(cpk)マウス;染色体劣性PKD(ARPKD)のモデルの腎臓の血管系及びリンパ管系を、リアルタイムPCR及び疾患の様々な進行段階における免疫組織化学によって調べた。cpkマウスは、劣性遺伝である表現型を示し、ヒトARPKDに臨床的に類似しているようであるが、ヒトARPKDは、このヒト疾患の基となるpkhd1ではなく嚢胞における変異によって引き起こされる。
【0126】
結果
cpkマウスのより小さい皮質嚢胞を取り囲んでいる血管系は、濃く染まったCD31が野生型同腹仔よりも顕著であった;構造的に、これらの血管は拡張し、無秩序であった。より大きい随質嚢胞では、血管系の退行が見られた。これには、内皮マーカーVegfrl、Vegfr2、Tie1、Tie2、及びPv1の腎臓のmRNAレベルの低下を伴っていた。VEGFR−3免疫染色を使用すると、リンパ管系は、野生型同腹仔よりもcpkマウスでより顕著であり、LYVE−1及びポドプラニンのmRNAレベルが上方制御された。
【0127】
結論
PKDにおける血管系は、血管とリンパ管との間のバランスの変化で無秩序になる。
【0128】
実施例2−リンパ管新生を変更する因子を用いたPKDマウスモデルの処置
100ng/体重gの組換えVEGFCをCys1
cpk/cpkマウス、染色体劣性(AR)PKDのモデルに7日目から1週間、毎日腹腔内に投与した(
図1a)。VEGFC処置Cys1
cpk/cpkマウスは、形態全体によって評価されるPKDの重症度が低下し(
図1b)、腎臓/体重の比が著しく低下した(PBS及びVEGFCが投与されたCys1
cpk/cpkで7.5%±0.4及び5.3±0.6、p<0.001、
図1c)。しかしながら、VEGFC処置は、血中尿素窒素の濃度、腎分泌機能の指標に影響を与えなかった(
図1d)。組織学では、VEGFC処置動物は、皮質及び髄質における顕著な嚢胞が減少し(
図1f〜
図1g、
図1i〜
図1j)、嚢胞の平均サイズが著しく小さくなった(PBS及びVEGFCが投与されたCys1
cpk/cpkで0.11mm
2±0.01及び0.07±0.01、p<0.01、
図1k)。VEGFCが投与されたCys1
+/+マウスは、処置の悪影響を一切示さなかった(
図1c、
図1h)。
【0129】
次に、Pkd1の2つの低次形態対立遺伝子;ヒトADPKDで最も一般的に変異するマウスの遺伝子相同体を有するPkd1
nl/nlマウスを用いて実験を行った。組換えVEGFCでPkd1
nl/nlを処置し、1〜3週間注目した(
図2a)。VEGFCは、形態全体を改善し(
図2b)、腎臓/体重の比を著しく低下させた(PBS及びVEGFCが投与されたPkd1
nl/nlで8.6%±1.3及び3.8±1.6、p<0.05、
図2c)。VEGFCはまた、これらのPkd1
nl/nlマウスの血中尿素窒素の濃度を著しく低下させ(PBS及びVEGFCが投与されたPkd1
nl/nlで37.1mg/dL±5.3及び23.0±4.2、p<0.05、
図2d)、このマウスの正常な尿細管を維持した(
図2f〜
図2g、
図2i〜
図2j)。VEGFCはまた、Pkd1
nl/nlマウスの各嚢胞の平均サイズを著しく縮小させた(PBS及びVEGFCが投与されたPkd1
nl/nlで0.17mm2±0.03及び0.09±0.02、p<0.05、
図2k)。
【0130】
未処置Pkd1
nl/nlマウスの皮質管と髄質管との間に位置するCD31
+及びVEGFR3
+毛細管は、野生型と比較するとパターンの変化を示した(
図3a〜
図3h)。Pkd1
nl/nlマウスのVEGFC処置は、これらの異常なパターンを正常化させた(
図3i〜
図3l)。これは、CD31
+内皮細胞及びVEGFR3
+内皮細胞の増殖(
図3m及び
図3n)及びCD206
+マクロファージの著しい減少(
図3o)に関連し、後者の細胞は、PKD嚢胞の成長に機能的に関係していた。VEGFR2を嚢胞上皮細胞で検出できず、VEGFR3もこれらの細胞で免疫検出されなかった(
図3p、
図3q)。これは、VEGFRCの嚢胞の成長に対する直接的な効果に反する。
【0131】
結論
腎血管系を標的とする処置は、ARPKD及びADPKDの両方について新規な治療法であり得る。全ての処置したマウスは、生存し健康に見えるが、これらのマウスの腎臓のサイズ及び平均嚢胞サイズは、未処置の仲間の平均嚢胞サイズの約半分であった。
【0132】
実施例3−代替の因子及び遺伝子治療の使用
材料及び方法
ARPKD及びADPKDのマウスモデルのそれぞれで実験を行う。VEGF−Dは、VEGF−Cで成功することが分かった投与計画(実施例2を参照されたい)を用いて組換えタンパク質として最初に投与し、リンパ管に特異的に作用するように操作されたVEGF−C
158と比較する(Joukov et al. 1998)。
【0133】
様々な投与計画、及びマウスで血管成長因子を過剰発現させるために以前に使用したアデノウイルス遺伝子治療(Long et al Kidney Int 2008 74: 300-309)も利用する。
【0134】
具体的には、アデノウイルス系(例えば、Regeneron Pharmaceuticals社の)を用いて、目的の遺伝子を過剰発現させることができる。これらは、成長因子、例えば、アンジオポイエチンに使用することができる(Long et al Kidney Int 2008 74: 300-309)。1匹の動物あたり1回の注射で、1〜2日の内に発現が始まり、3週間続いた。
【0135】
実験的な時間経過及び投与計画は、cpkにおける迅速な嚢胞の発生及びpkd1hm動物における遅い進行を反映する。主な結果は、腎機能、腎臓のサイズ、及び嚢胞の面積によって評価されるPKDの進行速度、及びVEGF治療法を安全にするための毒性評価である。補助パラメータは、VEGF−D、C、及び他のVEGFの発現/レベル;免疫組織化学及びin situハイブリダイゼーションを用いたリンパ管及び血管の密度及び分布の評価;並びに迅速なコスト効率の良い標的RT
2プロファイラーPCRアレイを用いた、広範なリンパ管/血管及びPKD関連分子をカバーする遺伝子発現の変化の測定値である。後者の技術によって検出される変化は、in situハイブリダイゼーション、免疫組織化学、及び/又はウエスタンブロット法によって確認される。
【0136】
処置戦略
(i)cpkマウス
群:(i)VEGF−D、(ii)VEGF−C
156、又は(iii)PBSの7日目から14日目までの毎日の注射
2週間目及び3週間目に各群の6〜8匹の動物を屠殺し;残りを生存させ続け、後に屠殺して長く生存したcpkを評価する。正常なマウス3〜6か月間のより長期間に亘ってさらなる副作用を評価する。
【0137】
cpkマウスは、7日目までには嚢胞を発症し始め、8日目から14日目の間に大量の嚢胞が増殖し、3〜4週間で死ぬため、治療法は早期に開始しなければならない。タンパク質の直接注射は、上記概説された実験プロトコルの通りに利用される。新生仔cpkマウスに、VEGF−DもしくはVEGF−C
156(能動的処置群)、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS;対照)を毎日腹腔内に注射し;この投与計画は、我々の前のVEGF−C実験を再現する。加えて、一部の実験では、cpkマウスの生存期間を(英国内務省(UK Home Office)によって規定された健康評価限界の範囲内で)評価して、これらの治療法によって寿命がどの程度延びたかを決定する。正常なヘテロ接合体cpk及び野生型同腹仔の半数を、腫瘍形成及び他の副作用について監視するために3か月間又は6か月間放置する。マウスを屠殺の前にメタボリックケージに入れて24時間の分析用の尿、及び血中尿素窒素、血清クレアチニンを収集して、腎機能に対する効果を比較する。VEGFレベルも測定する。
【0138】
(ii)pkd1hmマウス:短期間;形成の防止
7日目に再び治療法を開始し、最大3週間、毎日処置する。実験プロトコルは、以下に概説され、3つの群を用いてcpk実験を再現する。処置の最後(即ち、3週間目)、6週間目、及び9週間目にマウスを屠殺し、同様にその1日前にメタボリックケージで上記のように血液を採取する。
【0139】
(ii)pkd1hmマウス:長期間;発症した嚢胞の処置
妥当な数の嚢胞が予想される4週目に治療法を開始する。(i)VEGF−D及び(ii)VEGF−C
156で前の実験を群で繰り返し、今回はアデノウイルスベクター及び(iii)PBSを用いて過剰発現させる。一部の嚢胞マウスに、腎での分布を評価するためにVEGFではなくレポーター構築物、例えば、β−ガラクトシダーゼを含むアデノウイルスを注射する。6週間目、9週間目、及び12週間目に群を評価し;良好な過剰発現は6週間目と予想され、この過剰発現は、9週間目に低下し、12週間目に本質的に終了すると予想される。マウスが、嚢胞性であるが健康である場合又は正常な対照である場合は、より長い期間放置する。これらの両方を、腫瘍又は他の潜在的な副作用を排除するために徹底的に検査する。
【0140】
4週間目に処置した群:(i)アデノウイルス過剰発現構築物VEGF−D、(ii)アデノウイルス過剰発現構築物VEGF−C
156、(iii)PBS。
【0141】
予想される3〜6週間のVEGF−D又はVEGF−C
156の過剰発現の期間。
【0142】
6週間目、9週間目、及び12週間目に各群の6〜8匹の動物を屠殺して血液及び尿を採取。後者のサンプルは、生存及び副作用の分析のために18週間目から採取する。
【0143】
実験のエンドポイント:全ての実験では、各時点で各群の6〜8匹の動物から腎臓を摘出する。これは、測定されるパラメータにおいて少なくとも50%の差異を実証するために権限を持って統計分析を行うのに適した動物の数である(Chiu et al. Am J Pathol 2006 169: 1925-1938; Long et al Kidney Int 2008 74: 300-309)。
【0144】
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