特許 6261934 萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、及びその利用、並びにアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6261934

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、及びその利用、並びにアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180104BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180104BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180104BHJP

   A01N 63/00 20060101ALI20180104BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20180104BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12Q1/68 A

   A01N63/00 C

   A01P3/00

【請求項の数】5

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2013-213332(P2013-213332)

(22)【出願日】2013年10月11日

(65)【公開番号】特開2015-73509(P2015-73509A)

(43)【公開日】2015年4月20日

【審査請求日】2016年7月1日

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２４年度、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、生物系特定産業技術研究支援センター、「アブラナ科野菜の萎黄病抵抗性要因の解明とその利用技術の開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願；平成２４年度、独立行政法人科学技術振興機構、復興促進プログラム（Ａ−ＳＴＥＰ）探索タイプ「一代雑種品種の両親系統における組合せ能力早期検定法の開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】304027279

【氏名又は名称】国立大学法人 新潟大学

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】岡崎 桂一

(72)【発明者】

【氏名】藤本 龍

(72)【発明者】

【氏名】川邊 隆大

(72)【発明者】

【氏名】清水 元樹

(72)【発明者】

【氏名】蒲 子▲じん▼

(72)【発明者】

【氏名】加治 誠

(72)【発明者】

【氏名】長岡 朝彦

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 Mol Breeding, 2012, vol.30, no.2, p.809-818

【文献】 育種学研究，2012，vol.14,別冊１号，p.74

【文献】 NCBI, ACCESSION No. FJ842771, 25-NOV-2009，[検索日：2017年5月16日]，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/227438124?sat=4&satkey=38925243

【文献】 Mol Genet Genomics, 2009, vol.282, p.617-631

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

萎黄病菌抵抗性を有することを特徴とする下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。

【請求項2】

請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。

【請求項3】

請求項１に記載のポリヌクレオチドが導入されたことを特徴とする形質転換体。

【請求項4】

請求項１に記載のポリヌクレオチド、及び請求項２に記載のベクターの少なくともいずれかを含み、萎黄病菌への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与することを特徴とする組成物。

【請求項5】

被検植物体中の配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を検出する工程と、
前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を指標として、被検植物体の萎黄病菌への抵抗性の有無を評価する工程とを含むことを特徴とするアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体、該ポリヌクレオチド、及び該ベクターの少なくともいずれかを含む組成物、並びにアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

アブラナ科植物には、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワーなどが属する種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、ハクサイ、カブなどが属する種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）、ダイコンが属する種（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）の３種がある。
前記アブラナ科植物を侵す萎黄病は、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ菌（以下、「萎黄病菌」と称することがある）によるもので、休眠胞子が長年に渡り土壌中に残存するため、薬剤での防除が極めて困難であるという問題がある。また、前記萎黄病は、温暖化が進行する中、今後ますます生産上の大きな問題となることが予想される。
そのため、生産現場では前記萎黄病菌による病害に対する抵抗性品種の開発が切望されている。

【0003】

これまでに、萎黄病菌に対する抵抗性を有する遺伝子として、トマトとメロンでそれぞれ１個の病害抵抗性遺伝子が単離されている（例えば、非特許文献１〜２参照）。しかしながら、アブラナ科植物での報告ではない。

【0004】

一方、本発明者らによって、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａの萎黄病抵抗性品種の探索が行われ、その結果、前記萎黄病抵抗性が優性の単因子優性遺伝子によって支配されており、前記萎黄病抵抗性遺伝子が第７染色体に座乗していることが明らかにされている（非特許文献３参照）。しかしながら、前記探索では、具体的な萎黄病抵抗性遺伝子の特定まではされておらず、萎黄病菌に対する抵抗性品種の選抜や、形質転換体の作製へ適用できる状況ではない。

【0005】

したがって、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の選抜や、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の形質転換体の作製などに用いることができる萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチドの提供が強く望まれているのが現状である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｓｉｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｓａｒｉｕｍ Ｉ２ Ｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ Ｔｏｍａｔｏ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｓｉｘ Ｈｏｍｏｌｏｇｓ ａｎｄ Ｏｎｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｃｏｐｙ、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１９９８ ｖｏｌ． １０、１０５５−１０６８

【非特許文献2】Ｊｏｏｂｅｕｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｕｓ Ｆｏｍ−２ ｏｆ ｍｅｌｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｅａｔｕｒｅｓ、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、ｖｏｌ．３９ ２８３−２９７

【非特許文献3】Ｐｕ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、 ２０１２、 ３０、８０９−８１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の選抜や、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の形質転換体の作製などに用いることができる萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体、該ポリヌクレオチド、及び該ベクターの少なくともいずれかを含む組成物、並びに、被検植物体が萎黄病菌への抵抗性を有するか否かを、煩雑な病原菌接種試験法と比べて、容易に判定することができ、かつ再現性を有するアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。
即ち、本発明のポリヌクレオチドは、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドであり、萎黄病菌抵抗性を有することを特徴とする。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0009】

本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。

【0010】

本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドが導入されたことを特徴とする。

【0011】

本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを含み、萎黄病菌への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与することを特徴とする。

【0012】

本発明のアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法は、
被検植物体中の配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を検出する工程と、
前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を指標として、被検植物体の萎黄病菌への抵抗性の有無を評価する工程とを含むことを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明によると、従来における前記諸問題を解決することができ、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の選抜や、萎黄病菌に対する抵抗性を有するアブラナ科植物の形質転換体の作製などに用いることができる萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドが導入された形質転換体、該ポリヌクレオチド、及び該ベクターの少なくともいずれかを含む組成物、並びに、被検植物体が萎黄病菌への抵抗性を有するか否かを、煩雑な病原菌接種試験法と比べて、容易に判定することができ、かつ再現性を有するアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、試験例１の連鎖地図を示した図である。

【図2A】図２Ａは、ＡｎｊｕとＧＣにおけるＦｏｃＢｏ１−Ａ、及びＦｏｃＢｏ１−Ｂの遺伝子構造を比較した図である。

【図2B】図２Ｂは、ＡｎｊｕとＧＣにおけるＦｏｃＢｏ１−Ｂの遺伝子構造とインデル箇所を示した図である。

【図3】図３は、試験例３の罹病性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２４（Ｓ１１）と、抵抗性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２３（Ｒ０９）とについてのＢｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９の発現量を調べた結果を示す図である。

【図4A】図４Ａは、試験例３の＜表現型との相関−２＞において、系統１（ＲＪＫＢ−Ｔ２４×ＲＪＫＢ−Ｔ２３）由来のＦ２集団についての表現型と遺伝子型とを調べた結果を示す図である。

【図4B】図４Ｂは、試験例３の＜表現型との相関−２＞において、系統２（ＲＪＫＢ−Ｔ２２（Ｓ２７）×ＲＪＫＢ−Ｔ２１（Ｒ２９））由来のＦ２集団についての表現型と遺伝子型とを調べた結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

（ポリヌクレオチド）
本発明のポリヌクレオチドは、萎黄病菌に対する抵抗性を有するポリヌクレオチドであり、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかである。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。

【0016】

前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号：１に記載の塩基配列のみからなるものであってもよいし、前記配列番号：２に記載の塩基配列のみからなるものであってもよいし、前記配列番号：３に記載の塩基配列のみからなるものであってもよいし、前記配列番号：１に記載の塩基配列、前記配列番号：２に記載の塩基配列、又は前記配列番号：３に記載の塩基配列にその他の塩基配列が含まれるものであってもよい。
前記その他の塩基配列としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。

【0017】

前記ポリヌクレオチドは、萎黄病菌に対する抵抗性を有する限り、前記配列番号：１に記載の塩基配列、前記配列番号：２に記載の塩基配列、又は前記配列番号：３に記載の塩基配列において、１個若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加されていてもよい。
前記数個の数としては、前記ポリヌクレオチドが萎黄病菌に対する抵抗性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１個〜９個が挙げられる。

【0018】

また、前記ポリヌクレオチドは、萎黄病菌に対する抵抗性を有する限り、特に制限はなく、前記配列番号：１に記載の塩基配列、前記配列番号：２に記載の塩基配列、又は前記配列番号：３に記載の塩基配列と配列同一性を有するものであってもよい。
前記配列同一性としては、萎黄病菌に対する抵抗性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性の決定方法としては、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｅｉ. ＵＳＡ、 １９９０、 ８７、 ２２６４−２２６８；Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｅｉ. ＵＳＡ、 １９９３、 ９０、 ５８７３）により決定することができる。

【0019】

前記ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いる方法、前記ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により変異を導入する方法などが挙げられる。

【0020】

前記ポリヌクレオチドの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡなどが挙げられる。これらの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡは、例えば、キャベツから調製することができ、前記配列番号：２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ、及び前記配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡは、例えば、ハクサイから調製することができる。

【0021】

−萎黄病菌−
前記萎黄病菌は、アブラナ科植物を侵す萎黄病菌であり、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである。

【0022】

前記ポリヌクレオチドが萎黄病菌に対する抵抗性を有するか否か確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例で示すように、萎黄病菌を接種したアブラナ科植物の表現型と、該アブラナ科植物中における前記ポリヌクレオチドの有無を調べることにより、確認することができる。

【0023】

前記ポリヌクレオチドは、萎黄病菌に対する抵抗性を有するので、例えば、後述する本発明の萎黄病菌に対する抵抗性を有する形質転換体の作製に好適に用いることができる。

【0024】

（ベクター）
本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の構成を含む。

【0025】

前記ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、プラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。これらの中でもアグロバクテリウムベクターが好ましい。

【0026】

前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マーカー遺伝子、制御配列などが挙げられる。

【0027】

本発明のベクターは、適当なベクターに前記ポリヌクレオチドや、必要に応じて前記その他の構成を連結若しくは挿入することにより得ることができる。
ベクターに前記ポリヌクレオチドなどを連結若しくは挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。

【0028】

（形質転換体）
本発明の形質転換体は、前記ポリヌクレオチドが導入されたものである。
前記形質転換体は、例えば、前記ベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。

【0029】

前記ベクターを宿主中に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法などが挙げられる。

【0030】

前記ベクターが宿主に導入されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などが挙げられる。

【0031】

本発明における形質転換の対象としては、植物体全体であってもよいし、植物器官であってもよいし、植物組織であってもよいし、植物培養細胞であってもよい。
前記植物器官の具体例としては、種子、葉、花弁、茎、根などが挙げられる。
前記植物組織の具体例としては、表皮、師部、柔組織、木部、維管束などが挙げられる。

【0032】

前記形質転換に用いられる植物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、アブラナ科植物が好ましい。
前記アブラナ科植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キャベツ、ハクサイ、コマツナ、カブ、ブロッコリー、シロイヌナズナ、ナタネ、ダイコンなどが挙げられる。

【0033】

前記形質転換体は、前記ポリヌクレオチドが導入されているので、萎黄病菌に対する抵抗性を有する。

【0034】

（組成物）
本発明の組成物は、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明のベクターの少なくともいずれかを含み、さらに必要に応じてその他の成分を含む。
前記組成物は、例えば、上述のベクターや形質転換体を製造する際に用いることができる。そのため、前記組成物は、萎黄病菌への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与するために用いることができる。
したがって、本発明は、前記ポリヌクレオチド、及び前記ベクターの少なくともいずれかを用いる萎黄病菌への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与する方法にも関する。
前記アブラナ科植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キャベツ、ハクサイ、コマツナ、カブ、ブロッコリー、シロイヌナズナ、ナタネ、ダイコンなどが挙げられる。

【0035】

（判定方法）
本発明のアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法は、検出工程と、評価工程とを少なくとも含み、さらに必要に応じてその他の工程を含む。
前記アブラナ科植物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キャベツ、ハクサイ、コマツナ、カブ、ブロッコリー、シロイヌナズナ、ナタネ、ダイコンなどが挙げられる。
前記萎黄病菌は、アブラナ科植物を侵す萎黄病菌であり、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍである。

【0036】

＜検出工程＞
前記検出工程は、被検植物体中の配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を検出する工程である。

【0037】

−検出−
前記被検植物体中の配列番号：１から３のいずれかに記載に塩基配列の有無を検出する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が好ましい。

【0038】

−−被検植物体−−
前記ＰＣＲ法では、前記被検体植物から取得したＤＮＡを鋳型として用いる。
前記ＤＮＡを取得する対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、種子、葉、花弁、茎、根、表皮、師部、柔組織、木部、維管束などが挙げられる。
前記ＤＮＡを取得する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
前記ＤＮＡの態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどが挙げられる。

【0039】

−−プライマー−−
前記ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を確認することができれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列内の配列に対応するプライマーであってもよいし、前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列で示される遺伝子の近傍領域の配列に対応するプライマーであってもよい。

【0040】

前記配列番号：１に記載の塩基配列の有無を確認するためのプライマーセットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：４及び配列番号：５に記載のプライマーセット、下記配列番号：６及び配列番号：７に記載のプライマーセットが好ましい。
ＦｏｃＢｏ１−Ｆｗ ： ５’−ａｇａａｔｃｇｔｇｃａｔｃｔｃｔｃｃａｇａｇｔｇｔ−３’（配列番号：４）
ＦｏｃＢｏ１−Ｒｖ ： ５’−ｃｔａａｔａａｇｃｔｃｃａａａｔｔｔｇｇａｔｔｔａｔｇ−３’（配列番号：５）
ＭＴＫ−Ｆｗ ： ５’−ａｇｃｔｔａｔａｇｇａｇａａｃｃａｔｃｃａａｇａｔ−３’（配列番号：６）
ＭＴＫ−Ｒｖ ： ５’−ｃｃｔａｇｇｃａｔｃａｔｃｔｔｃａｔｃｃａｃｔｃａ−３’（配列番号：７）

【0041】

前記配列番号：４及び配列番号：５に記載のプライマーセットは、前記配列番号：１に記載の塩基配列内の配列に対応したものであり、被検植物体中における前記配列番号：１に記載の塩基配列の有無を高い精度で効率よく検出することができる。
前記配列番号：６及び配列番号：７に記載のプライマーセットは、前記配列番号：１に記載の塩基配列で示される遺伝子の近傍領域に対応するものであり、被検植物体が、前記配列番号：１に記載の塩基配列をホモで有するか、又はヘテロで有するかをも確認することができる。

【0042】

前記配列番号：２又は配列番号：３に記載の塩基配列の有無を確認するためのプライマーセットとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、下記配列番号：１６及び配列番号：１７に記載のプライマーセットが好ましい。
Ｆｗ ： ５’−ｔｃａｇｇｇｃｔｃａｔｔｔｔａｇａｔｇｇａ−３’（配列番号：１６）
Ｒｖ ： ５’−ｔｇａｇａｔａｇａｃｃａｇａｔｔｔｔｃｔｇａｇｃ−３’（配列番号：１７）

【0043】

前記配列番号：１６及び配列番号：１７に記載のプライマーセットは、前記配列番号：２又は配列番号：３に記載の塩基配列内の配列に対応したものであり、被検植物体中における前記配列番号：２又は配列番号：３に記載の塩基配列の有無を高い精度で効率よく検出することができる。

【0044】

＜評価工程＞
前記評価工程は、前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を指標として、被検植物体の萎黄病菌への抵抗性の有無を評価する工程である。
具体的には、前記検出工程により、前記被検植物体中に前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列が検出された場合には、前記被検植物体は、萎黄病菌への抵抗性を有すると評価することができる。一方、前記検出工程により、前記被検植物体中に前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列が検出されなかった場合には、前記被検植物体は、萎黄病菌への抵抗性を有さないと評価することができる。

【0045】

＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法に用いるＤＮＡを調製するＤＮＡ調製工程などが挙げられる。

【0046】

前記判定方法によれば、効率的に高度病害抵抗性品種を選抜し、育成することができ、野菜の安定生産に寄与することができる。さらに、農薬を使わない栽培が可能となり、環境や食への安全性の向上に対する効果も極めて大きい。

【実施例】

【0047】

以下、本発明の試験例を説明するが、本発明は、これらの試験例に何ら限定されるものではない。

【0048】

（試験例１：萎黄病菌抵抗性遺伝子の探索−１）
＜ＢＡＣ及びコスミドの単離＞
キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）の萎黄病抵抗性品種（安寿（以下、「Ａｎｊｕ」と称することがある））から、第７染色体に座乗している萎黄病抵抗性遺伝子領域を含むＢＡＣを以下のようにして単離した。
萎黄病に罹病性のブロッコリー品種‘グリーンコメット （Ｐ０４）’ＤＨ系統（以下、「ＧＣ」と称することがある））を種子親に、抵抗性を示すキャベツ品種‘安寿 （Ｐ０１）’ＤＨ系統（以下、「Ａｎｊｕ」と称することがある））を花粉親として用い、Ｆ１雑種を得た。前記Ｆ１雑種のＦ２個体を用い、萎黄病抵抗性遺伝子周辺で染色体組み換えを起こしている個体の選抜を行い、連鎖地図を作成したところ（図１参照）、ＦｏｃＢｏ１の座乗位置をＢＧＡ０４とＢＧＡ０５マーカーの間の０．７ｃＭの間に絞り込んだ。その後、ＢＧＡ０４マーカーを用いＢｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｌｂｏｇｌａｂｒａのＢＡＣライブラリーからＢＧＡ０４マーカー座を含むＢＡＣクローン＃５８を選抜した。＃５８の部分シークエンス結果と、この領域に対応する公知のＢ． ｒａｐａゲノムデータベースの情報から、耐病性遺伝子の特徴であるＮＢＳ−ＬＲＲ構造をもつ遺伝子を特定した。Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ａｌｂｏｇｌａｂｒａは萎黄病に罹病性なので、萎黄病抵抗性の‘安寿’からＤＮＡを抽出してコスミドライブラリーを作製し、ＢＡＣクローン＃５８領域に対応し、ＮＢＳ−ＬＲＲ構造をもつ遺伝子を含む領域を含むコスミドクローン＃２７Ａ０６を単離した。

【0049】

＜ＢＡＣ及びコスミドの解析＞
前記ＢＡＣクローン＃５８領域とコスミドクローン＃２７Ａ０６のシークエンス解析の結果、この領域には耐病性遺伝子の特徴であるＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを有する遺伝子は２つだけであった。そこで、萎黄病菌抵抗性遺伝子の候補遺伝子を、ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを有する、ＦｏｃＢｏ１−ＡとＦｏｃＢｏ１−Ｂとに絞り込んだ。

【0050】

＜塩基配列の決定＞
前記ＢＡＣ及びコスミドの全塩基配列を次世代シークエンサー（Ｈｉｓｅｑ２０００、イルミナ社製）により決定し、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ、及び前記ＦｏｃＢｏ１−Ｂのゲノム塩基配列と、ｃＤＮＡ配列とを決定した。
また、キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）の萎黄病感受性品種（グリーンコメット）についても、前記安寿と同様にして、ＦｏｃＢｏ１−Ａ、及びＦｏｃＢｏ１−Ｂのゲノム塩基配列と、ｃＤＮＡ配列とを決定した。

【0051】

＜比較＞
前記Ａｎｊｕと、前記ＧＣの、ＦｏｃＢｏ１−Ａ、及びＦｏｃＢｏ１−Ｂの遺伝子構造を比較したものを図２Ａに示し、前記Ａｎｊｕと、前記ＧＣのＦｏｃＢｏ１−Ｂの遺伝子構造とインデル箇所を示したものを図２Ｂに示す。
また、前記Ａｎｊｕと、前記ＧＣのＦｏｃＢｏ１−Ａの遺伝子構造とインデル箇所を比較した結果を表１に示す。

【0052】

【表1】

表１中、Ｅはエクソンを示し、Ｉはイントロンを示す。

【0053】

前記図２Ａ、図２Ｂ、及び表１に示すように、萎黄病抵抗性品種である前記Ａｎｊｕでは、ＦｏｃＢｏ１−Ａについては、全長４ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を確保できたのに対して、ＦｏｃＢｏ１−Ｂでは、全長にわたり塩基の挿入や欠失が見られ機能のない遺伝子と考えられた。
一方、萎黄病感受性品種である前記ＧＣでは、ＦｏｃＢｏ１−Ａでは、エクソン２に１塩基の挿入があり、フレームシフトが起こっていたほか、３’端には１，８８２ｂｐの欠失が見られた。これらの変異により、前記ＧＣのＦｏｃＢｏ１−Ａは、機能を消失していると考えられた。
上記比較の結果から、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ（配列番号：１、ｃＤＮＡ配列）が萎黄病菌抵抗性を付与していると考えられた。

【0054】

（試験例２：萎黄病菌に対する抵抗性の判定−１）
前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子を指標として、アブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性を判定することができるか否かを以下のようにして試験した。

【0055】

＜ＰＣＲ＞
−プライマーセット−
プライマーセットとして、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子内の配列に対応する以下のプライマーセットを用意した（以下、「プライマーセット−１」と称することがある）。
ＦｏｃＢｏ１−Ｆｗ ： ５’−ａｇａａｔｃｇｔｇｃａｔｃｔｃｔｃｃａｇａｇｔｇｔ−３’（配列番号：４）
ＦｏｃＢｏ１−Ｒｖ ： ５’−ｃｔａａｔａａｇｃｔｃｃａａａｔｔｔｇｇａｔｔｔａｔｇ−３’（配列番号：５）

【0056】

また、別のプライマーセットとして、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子近傍領域に対応する以下のプライマーセットを用意した（以下、「プライマーセット−２」と称することがある）。
ＭＴＫ−Ｆｗ ： ５’−ａｇｃｔｔａｔａｇｇａｇａａｃｃａｔｃｃａａｇａｔ−３’（配列番号：６）
ＭＴＫ−Ｒｖ ： ５’−ｃｃｔａｇｇｃａｔｃａｔｃｔｔｃａｔｃｃａｃｔｃａ−３’（配列番号：７）

【0057】

−ＰＣＲ反応−
下記表２に記載の品種から、以下のようにして鋳型となるＤＮＡを調製した。
−−ＤＮＡの調製−−
各植物個体から直径約１ｃｍの葉片組織を採取し、２ｍＬチューブに入れ、「Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ． １９８０」らの「ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｈｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法」を一部改変してゲノムＤＮＡの抽出を行った。イソプロピルアルコールでＤＮＡを沈殿後、サンプルを２０分間遠心分離し、沈殿を回収し、７０％エタノールで沈殿を洗浄後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加えペレットを溶解し、−２０℃で保存した。

【0058】

前記ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーセット−１、又はプライマーセット−２を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲミクスチャーの組成は、以下のとおりである。
（１） ９４℃、３分間を１サイクル、
（２） ９４℃、３０秒間、次いで、６０℃、３０秒間、次いで、７２℃３０秒間を３０サイクル、
（３） ７２℃、３分間。
〔ＰＣＲミクスチャー〕
・ 酵素（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２× Ｐｒｅｍｉｘ、タカラバイオ株式会社製）） ・・・ ５μＬ
・ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ・・・ ０．２μＭ（終濃度）
・ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ・・・ ０．２μＭ（終濃度）
・ 鋳型ＤＮＡ ・・・ ２０ｎｇ〜５０ｎｇ
・ ｄＨ_２Ｏ ・・・ 残部（上記各物質との合計量で１０μＬとなる量）

【0059】

前記ＰＣＲ産物について、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの有無を調べた。結果を表２に示す。
表２中、前記プライマーセット−１を用いた場合に、バンドが得られたものは「＋」で示し、バンドが得られなかったものは「−」で示す。また、「Ａ」（ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子有りの場合に得られるバンド）、「Ｂ」（ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子無しの場合に得られるバンド）は、前記プライマーセット−２を用いた場合に得られたバンドの種類を示す。

【0060】

＜接種試験＞
下記表２に記載の品種について、以下のようにして接種試験を行い、表現型を解析した。結果を表２に示す。表２中、Ｒは、萎黄病菌に対する抵抗性を有することを示し、Ｓは、萎黄病菌に対する感受性を有する（即ち、罹病性である）ことを示す。
東北農業研究センターから分譲されたキャベツ分離菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．ｓｐ ｃｏｎｇｌｕｔｉｎａｎｓ Ｃｏｎｇ：１−１株を用いた。ＰＤＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｃｅ Ａｇａｒ）培地で培養した菌を液体ＰＳＡ（Ｐｏｔａｔｏ Ｓｕｃｒｏｓｅ Ａｇａｒ）培地に植菌し、暗所下で２６℃、１週間培養を行った。得られた菌培養液５０ｍＬを、土壌８０ｇ、米ぬか２０ｇ、４％スクロース溶液３０ｍＬ、及びパーライトを混合した滅菌土へ加え、よく混ぜ、２６℃、暗所条件で２週間培養し、種病土を作製した。この種病土と市販の培養土とを１：９の比で混合して、接種検定用の土壌培地とした。
抵抗性試験には、両親（ＧＣ、Ａｎｊｕ）をコントロールに用いた。罹病指数は、コントロールの抵抗性品種Ａｎｊｕ（Ｐ０１）と差がなく変化のないものを「０」、子葉及び葉の全体が黄変したものを「１」、枯死したものを「２」とする３段階で評価し、罹病指数が、「１」又は「２」のものを罹病性（Ｓ）とし、「０」のものを抵抗性（Ｒ）とした。
接種検定に用いた植物は、７×７セルポットに播種し、約１０日間、２６℃の人工気象機内にて生育させた後、接種検定用の土壌培地を充填した直径６ｃｍビニールポットに移植し、２６℃条件下で３週間生育させ、罹病性及び抵抗性を判定した。

【0061】

【表2】

【0062】

表２の結果から、接種試験による表現型の解析において、抵抗性品種であった場合には、前記プライマーセット−１を用いたＰＣＲ産物においてバンドが確認された。一方、接種試験による表現型の解析において、罹病性品種であった場合には、前記プライマーセット−１を用いたＰＣＲ産物においてバンドが確認されなかった。
また、前記プライマーセット−２を用いたＰＣＲ産物では、３パターンのバンドが確認された。具体的には、ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子のみを有する品種では、Ａバンドのみが確認され、ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子を有さない品種では、Ｂバンドのみが確認され、ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子をヘテロで有する品種では、ＡバンドとＢバンドの両方のバンドが確認された。
以上の結果から、前記ＰＣＲの結果と、前記接種試験の結果とは完全に一致しており、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子の有無を指標とするＤＮＡ検査により、アブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性を判定することができることが示された。

【0063】

（試験例３：萎黄病菌抵抗性遺伝子の探索−２）
キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）の近縁種であるハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）における萎黄病菌抵抗性遺伝子を以下のようにして探索した。

【0064】

＜ＲＮＡシークエンス法＞
萎黄病菌に対して罹病性であるハクサイのＲＪＫＢ−Ｔ２４系統と、萎黄病菌に対して抵抗性であるハクサイのＲＪＫＢ−Ｔ２３系統について、以下のようにしてＲＮＡシークエンス法を行い、萎黄病菌に対して抵抗性であるハクサイのＲＪＫＢ−Ｔ２３系統にのみ発現し、ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを有する遺伝子として、Ｂｒａ００８０５５、Ｂｒａ００８０５６、Ｂｒａ０１２１１６、Ｂｒａ０１２５４０、Ｂｒａ０１２６８８、Ｂｒａ０１２６８９、Ｂｒａ０２２０７１を選び出した。
ＲＮＡシークエンス法は、ハクサイ自殖系統（Ｉｎｂｒｅｄ Ｌｉｎｅ）の萎黄病罹病性のＲＪＫＢ−Ｔ２４と抵抗性のＲＪＫＢ−Ｔ２３とを用い、以下のように行った。
トータルＲＮＡを、播種後１４日目（１４ＤＡＳ）のＲＪＫＢ−Ｔ２４とＲＪＫＢ−Ｔ２３の本葉第１葉及び本葉第２葉から抽出した。トータルＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００によりシークエンス解析を行った。得られたシークエンスデータをＢｒａｓｓｉｃａ Ｄａｔａｂａｓｅで公開されているゲノム情報をリファレンスゲノムとしてマッピングした。
その結果、検出された発現遺伝子約２万９千個の中から、ＲＪＫＢ−Ｔ２４とＲＪＫＢ−Ｔ２３との間で発現量の差が確認でき、かつＮＢＳ−ＬＲＲモチーフをもつ遺伝子を７１個選抜した。なお、ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを持つ遺伝子の同定にはＢｒａｓｓｉｃａ Ｄａｔｅｂａｓｅで公表されているハクサイのＮＢＳ−ＬＲＲモチーフ遺伝子リストを参考にした。７１個の遺伝子の中から、抵抗性のＲＪＫＢ−Ｔ２３系統で発現し、罹病性のＲＪＫＢ−Ｔ２４系統で発現が認められない７個の遺伝子を選んだ。

【0065】

＜表現型との相関−１＞
ハクサイの近交系１０系統について、前記ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを有する遺伝子の有無と、萎黄病菌に対する罹病性若しくは抵抗性との関係を以下のようにして調べた。

【0066】

−プライマーセット−
前記ＴＩＲ−ＮＢＳ−ＬＲＲモチーフを有する遺伝子を検出するためのプライマーセットとして、以下のプライマーセットを用意した。
〔Ｂｒａ００８０５５〕
Ｆｗ ： ５’−ｇｔｔｔｃａｇａｇａａｇａａａｔｔｃｇｔｇｇｇｇｇ−３’（配列番号：８）
Ｒｖ ： ５’−ｃｇｇｇａｔａｇｃａｔｇｇａｇｇａｃｃｔｔｃｔｔｇ−３’（配列番号：９）
〔Ｂｒａ００８０５６〕
Ｆｗ ： ５’−ｃｃａｔｇｔｃｇｇｃｃｇｔｇｃｔｔｃｃｔ−３’（配列番号：１０）
Ｒｖ ： ５’−ｇｇｇｃｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｇａａａ−３’（配列番号：１１）
〔Ｂｒａ０１２１１６〕
Ｆｗ ： ５’−ｃａａｇａａｇａａｇｃｔａｃｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃ−３’（配列番号：１２）
Ｒｖ ： ５’−ｃｃａａｃａａｔａｔｃｔｇａｔｃａｔｔｃｃｃａｔｃａ−３’（配列番号：１３）
〔Ｂｒａ０１２５４０〕
Ｆｗ ： ５’−ａｇａａｇａｃａａｔｇｇａｇｇａａａａａｇａａｇｔ−３’（配列番号：１４）
Ｒｖ ： ５’−ｔｇａａｇａｔｃｔｔｔｃａｇｔｇｔｔａｔｇｔｃｃａ−３’（配列番号：１５）
〔Ｂｒａ０１２６８８〕
Ｆｗ ： ５’−ｔｃａｇｇｇｃｔｃａｔｔｔｔａｇａｔｇｇａ−３’（配列番号：１６）
Ｒｖ ： ５’−ｔｇａｇａｔａｇａｃｃａｇａｔｔｔｔｃｔｇａｇｃ−３’（配列番号：１７）
〔Ｂｒａ０１２６８９〕
Ｆｗ ： ５’−ａｇａｔｇｔｃｇｔｔｇａｇａａｇｔｃｔｇａｔａｃｃ−３’（配列番号：１８）
Ｒｖ ： ５’−ｔｔｇｔｔｇｔｔｃｔｇｔｔａｔｃａｔｇｇｇａｔｔａ−３’（配列番号：１９）
〔Ｂｒａ０２２０７１〕
Ｆｗ ： ５’−ｇｇｇｔｃｇｇｇｔｇｇａａａｔｇｃａｃｇｇ−３’（配列番号：２０）
Ｒｖ ： ５’−ｇｃｇｃｃａｃａａｃｔｃｃｔｔｃｃｃａｃａ−３’（配列番号：２１）

【0067】

−ＰＣＲ反応−
下記表３に記載の品種から、以下のようにして鋳型となるＤＮＡを調製した。
−−ＤＮＡの調製−−
各植物個体から直径約１ｃｍの葉片組織を採取し、２ｍＬチューブに入れ、「Ｍｕｒｒａｙ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ． １９８０」らの「ＣＴＡＢ（Ｃｅｔｈｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法」を一部改変してゲノムＤＮＡの抽出を行った。イソプロピルアルコールでＤＮＡを沈殿後、サンプルを２０分間遠心分離し、沈殿を回収し、７０％エタノールで沈殿を洗浄後、ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ加えペレットを溶解し、−２０℃で保存した。

【0068】

前記ＤＮＡを鋳型とし、前記プライマーセットを用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。なお、ＰＣＲミクスチャーの組成は、以下のとおりである。
（１） ９４℃、３分間を１サイクル、
（２） ９４℃、３０秒間、次いで、６０℃、３０秒間、次いで、７２℃３０秒間を３０サイクル、
（３） ７２℃、３分間。
〔ＰＣＲミクスチャー〕
・ 酵素（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（２× Ｐｒｅｍｉｘ、タカラバイオ株式会社製）） ・・・ ５μＬ
・ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ・・・ ０．２μＭ（終濃度）
・ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ・・・ ０．２μＭ（終濃度）
・ 鋳型ＤＮＡ ・・・ ２０ｎｇ〜５０ｎｇ
・ ｄＨ_２Ｏ ・・・ 残部（上記各物質との合計量で１０μＬとなる量）

【0069】

前記ＰＣＲ産物について、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの有無を調べた。結果を表３に示す。
表３中、前記プライマーセットを用いた場合に、バンドが得られたものは「＋」で示し、バンドが得られなかったものは「−」で示す。

【0070】

【表3】

表３中、Ｒは、萎黄病菌に対する抵抗性を有することを示し、Ｓは、萎黄病菌に対する感受性を有することを示す。

【0071】

表３の結果から、Ｂｒａ０１２６８８（以下、「ＦｏｃＢｒ１−Ａ」又は「ＦｏｃＢｒ１Ａ」と称することがある）、及びＢｒａ０１２６８９（以下、「ＦｏｃＢｒ１−Ｂ」又は「ＦｏｃＢｒ１Ｂ」と称することがある）の有無と、ハクサイ近交系における萎黄病菌に対する抵抗性の有無とが一致した。

【0072】

＜Ｂｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９の発現量の確認＞
罹病性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２４と、抵抗性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２３とについて、以下のようにしてＲＮＡシークエンス法を行い、それぞれにおけるＢｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９の発現量を調べた。結果を図３に示す。
罹病性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２４と、抵抗性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２３のＲＮＡシークエンス分析から得られたショートリードをＢｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９のゲノム領域にあてたところ、ＲＪＫＢ−Ｔ２３系統ではｍＲＮＡの発現を示すたくさんのショートリードがＢｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９領域に貼り付けることができたが、ＲＪＫＢ−Ｔ２４ではこの２つの遺伝子領域にはショートリードが検出されなかった。このことは、罹病性系統のＢｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９の遺伝子の発現がないことを示している。

【0073】

図３中、ドットは、ＲＮＡシークエンス法により得られた遺伝子の発現量を示す。
図３の結果から、罹病性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２４では、Ｂｒａ０１２６８８及びＢｒａ０１２６８９が発現していないことが確認された。
また、抵抗性系統であるＲＪＫＢ−Ｔ２３では、Ｂｒａ０１２６８８は強く発現しているのに対し、Ｂｒａ０１２６８９はほとんど発現していなかった。
この結果から、Ｂｒａ０１２６８８が萎黄病菌に対する抵抗性を有する遺伝子であると考えられた。

【0074】

＜表現型との相関−２＞
罹病性品種と抵抗性品種との交雑を２つの組合せ（系統１：ＲＪＫＢ−Ｔ２４×ＲＪＫＢ−Ｔ２３、系統２：ＲＪＫＢ−Ｔ２２×ＲＪＫＢ−Ｔ２１）で行い、その後代（Ｆ２）を以下のようにして作製した。
−交雑−
罹病性のハクサイ自殖系統のＲＪＫＢ−Ｔ２４とＲＪＫＢ−Ｔ２２を種子親として抵抗性のＲＪＫＢ−Ｔ２３とＲＪＫＢ−Ｔ２１を花粉親として、それぞれのＦ１を作成した。
−Ｆ２の作製−
ＲＪＫＢ−Ｔ２４×ＲＪＫＢ−Ｔ２３、又はＲＪＫＢ−Ｔ２２×ＲＪＫＢ−Ｔ２１の交雑から得られたそれぞれのＦ１を自家受粉して、それぞれの系統においてＦ２を作製した。

【0075】

前記Ｆ２の表現型と、Ｂｒａ０１２６８８遺伝子の有無との関係を以下のようにして調べた。

【0076】

−プライマーセット−
前記Ｂｒａ０１２６８８遺伝子を検出するためのプライマーセットとして、上述の配列番号：１６、及び配列番号：１７のプライマーセットを用意した。

【0077】

−ＰＣＲ反応−
前記＜表現型との相関−１＞と同様にしてＰＣＲを行った。
前記ＰＣＲ産物について、アガロースゲル電気泳動を行い、バンドの有無を調べた。結果を図４Ａ、及び図４Ｂに示す。

【0078】

＜接種試験＞
前記Ｆ２について、前記試験例２と同様にして接種試験を行い、表現型を解析した。結果を図４Ａ、及び図４Ｂに示す。

【0079】

図４Ａ、及び図４Ｂ中、前記ＰＣＲ産物に、バンドが検出されたものは「＋」で示し、バンドが得られなかったものは「−」で示す。また、前記接種試験の結果、抵抗性であったものは「Ｒ」で示し、感受性であったものは「Ｓ」で示す。
図４Ａ、及び図４Ｂの結果から、前記Ｂｒａ０１２６８８遺伝子（ゲノム配列（配列番号：２）、ｃＤＮＡ配列（配列番号：３））の有無と、萎黄病菌に対する抵抗性の有無との対応関係に矛盾はないことがわかった。
なお、図４Ａの「５８」の個体では、接種試験でのミスか、あるいは何らかの理由で生き残った例外的な個体であると考えられる。
以上の結果から、前記Ｂｒａ０１２６８８遺伝子の有無を指標とするＤＮＡ検査によっても、アブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性を判定することができることが示された。

【0080】

また、前記Ｂｒａ０１２６８８遺伝子と、前記ＦｏｃＢｏ１−Ａ遺伝子の配列相同性を確認したところ、９５．５％と極めて高い相同性を有することもわかった。

【0081】

本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞ 萎黄病菌抵抗性を有することを特徴とする下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：２に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：３に記載の塩基配列を含むＤＮＡ。
＜２＞ 前記＜１＞に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクターである。
＜３＞ 前記＜１＞に記載のポリヌクレオチドが導入されたことを特徴とする形質転換体である。
＜４＞ 前記＜１＞に記載のポリヌクレオチド、及び前記＜２＞に記載のベクターの少なくともいずれかを含み、萎黄病菌への抵抗性をアブラナ科植物に対して付与することを特徴とする組成物である。
＜５＞ 被検植物体中の配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を検出する工程と、
前記配列番号：１から３のいずれかに記載の塩基配列の有無を指標として、被検植物体の萎黄病菌への抵抗性の有無を評価する工程とを含むことを特徴とするアブラナ科植物の萎黄病菌に対する抵抗性の判定方法である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]