特許 6262715 ヒト化およびキメラ抗Ｃ３因子抗体、ならびにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6262715

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】ヒト化およびキメラ抗Ｃ３因子抗体、ならびにその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20180104BHJP

   C12N 15/02 20060101ALI20180104BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20180104BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C12N15/00 C

   A61K39/395 N

   A61P29/00

   A61P27/02

   A61P29/00 101

   A61P37/02

   A61P19/02

   A61P25/00

   A61P37/06

   A61P11/00

   A61P11/06

   A61P31/14

   A61P31/16

   A61P31/12

【請求項の数】16

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2015-504684(P2015-504684)

(86)(22)【出願日】2013年4月2日

(65)【公表番号】特表2015-514112(P2015-514112A)

(43)【公表日】2015年5月18日

(86)【国際出願番号】US2013034990

(87)【国際公開番号】WO2013152024

(87)【国際公開日】20131010

【審査請求日】2016年3月10日

(31)【優先権主張番号】61/619,860

(32)【優先日】2012年4月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514165152

【氏名又は名称】ノーベルメッド セラピューティクス インコーポレイテッド．

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】バンサル，レカ

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／１１８７１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５０４８７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１３６３１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J.Biol.Chem., 2009, Vol. 284, No. 16, pp. 10473-10479

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインと、配列番号１９、配列番号２１および配列番号２３のアミノ酸配列を有する３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインと、を含む抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

ヒト化フレームワーク領域配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０から選択されるヒト化フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、および配列番号２４から選択されるヒト化フレームワーク領域または非天然フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２から選択されるヒト化フレームワーク領域または非天然フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、および配列番号４８から選択されるヒト化フレームワーク領域または非天然フレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

前記抗体またはその抗原結合部分が、新たに産生されるＰＣ３ｂＢｂの形成を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

前記抗体またはその抗原結合部分が、新たに産生されるＣ３ａ、Ｃ５ａ、ＳＣ５ｂ−９の形成を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

前記抗体またはその抗原結合部分が、好中球、単球、および血小板の活性化を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項9】

前記抗体またはその抗原結合部分が、赤血球の溶解を阻害する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分。

【請求項10】

治療有効量の請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物。

【請求項11】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分を含む、炎症性障害の処置に使用するための医薬組成物であって、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、またはＣ５ｂ−９を含む炎症媒介物質の異常なレベルが前記障害において見出される、医薬組成物。

【請求項12】

前記炎症性障害が、自己免疫疾患、関節リウマチ、若年性関節炎、全身エリテマトーデス、多発性硬化症、または、身体の免疫系が調整を受ける他の自己免疫疾患である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分を含む、眼疾患の処置に使用するための医薬組成物であって、補体活性化が疾病病状に関与する、医薬組成物。

【請求項14】

前記眼疾患が、湿性および乾性加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、糖尿病黄斑浮腫、病的近視、フォン・ヒッペル・リンドウ病、糖尿病性網膜症、目のヒストプラスマ症、糖尿病性網膜症、脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、地図状萎縮、結晶腔疾患（ｄｒｕｓｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、ならびに網膜血管新生を含む群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分を含む、補体関連障害の処置に使用するための医薬組成物であって、前記障害が、喘息性または気道の炎症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、気腫、気管支炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｓｔａｓｉｓ）、嚢胞性線維症、結核、過敏性肺炎、職業性喘息、サルコイド、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、鼻炎、副鼻腔炎、運動誘発性喘息、公害による喘息、咳喘息、肺寄生虫症、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染、ライノウイルス（ＲＶ）感染、およびアデノウイルス感染を含む群から選択される、医薬組成物。

【請求項16】

副経路が、疾患病理に寄与するか、または状態もしくは疾患により引き起こされる少なくとも１つの症状を増悪させる、前記状態もしくは疾患に罹患しているか、またはそれを発症するリスクがある、哺乳類における副経路活性化の阻害に使用するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗Ｃ３ｂヒト化抗体またはその抗原結合部分を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２００９年９月２３日出願の米国特許出願第１２／５３２，７４０号の優先権を主張する、２０１２年４月３日出願の米国特許仮出願第６１／６１９，８６０号の優先権を主張し、これらの主題は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

本発明は、エフェクター機能および免疫原性が低下した補体経路阻害機能を備えたヒト化およびキメラ抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントに関する。本発明のヒト化およびキメラモノクローナル抗体は、古典的経路の活性化を阻害することなく、Ｃ３ｂへのＢ因子の結合を選択的にブロックする。これらの抗体は、Ｃ５に対するＣ３ｂの相互作用を阻害せず、それゆえ副経路を阻害することにおいて独特の機能を有する。そのような抗体は、副補体経路が病理的役割を担う疾患適応症にとって有用な処置となる。

【背景技術】

【0003】

補体系は、古典的経路、レクチン経路および副補体経路（ＡＰ）の３つの異なる経路を介して活性化される。古典的経路は、抗原−抗体複合体を介して活性化される。レクチン経路は、古典的経路の変形であり、副経路は、外来材料、人工表面、死んだ組織、細菌、死んだ酵母細胞により活性化される。

【0004】

古典的補体経路は、病原体に対する宿主防御にとって重要である。古典的経路の活性化が、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９分子を生成させ、宿主防御に応答して様々な細胞を活性化させる。病的な状態において、副経路の活性化の結果、アナフィラトキシンＣ３ａ、Ｃ５ａが形成され、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）としても公知の組織障害性Ｃ５ｂ−９分子が形成される。これらの分子は、細胞の活性化および炎症媒介物質の放出を介して炎症を媒介する。溶解性孔形成複合体（ｌｙｔｉｃ ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）としての役割に加え、半分解性ＭＡＣ（ｓｕｂｌｙｔｉｃ ＭＡＣ）の付着が炎症において重要な役割を担い得ることを示す強力な証拠が存在する。

【0005】

副補体経路は、病的炎症において活性化される。高レベルのＣ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９が、複数の急性および慢性疾患状態と関連して見出された。これらの炎症分子は、好中球、単球および血小板を活性化する。それゆえ疾患誘導性ＡＰ活性化の阻害は、補体活性化が疾患経路で役割を担う疾患における臨床的利益にとって重要となる。

【0006】

補体系は、免疫防御の肝要な役割に加えて、多くの臨床状態における組織損傷に寄与する。補体の生化学的カスケードに含まれる活性は、宿し得る破壊酵素の見境ない放出がある。つまり、治療有効性の補体阻害剤を開発してこれらの有害作用を予防することが、差し迫って求められている。

【0007】

ＡＰ活性化が疾患の病理に寄与する疾患状態では、高レベルのＣ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９分子が、該疾患に象徴的に血清、血漿、血液または他の体液に見出される。異なるメカニズムによるこれらの分子それぞれの産生および阻害は、疾患にとって重要である。活性Ｃ３コンバターゼの形成を阻害するための１つの可能なメカニズムが、抗Ｃ３ｂ抗体の使用によるものである。つまりＣ３ｂの枯渇、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃの中和、またはＣ３ｂの不活性化を介したＡＰ活性化のブロック／阻害または予防は、依然として重要な治療方針である。

【0008】

本願は、新規でありＣ３ｂへの標的結合をもたらすヒト化およびキメラ抗体配列を開発した。Ｃ３ｂによるＢへの結合は、Ｃ３ｂによるＣ５への結合とは異なり、この抗体により阻害される。Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９は全て、炎症を誘導し、ＡＰ活性化プロセスも増幅させる。Ｃ３ｂに結合し、Ｂとの相互作用を予防する抗Ｃ３ｂ物質としては、限定するものではないが、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、ナノ抗体、それらの全長およびフラグメント、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＩｇＧｓが挙げられる。アプタマー（Ａｐａｔａｍｅｒ）、小分子、およびＳｉＲＮＡも、ＢへのＣ３ｂ結合を中和して、ＡＰによるＣ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９産生を予防することができる。その結果、細胞活性化、炎症および炎症媒介物質の放出も、予防される。ＡＰの活性化は、様々な急性および慢性ヒト疾患につながるため、抗Ｃ３ｂ物質でのブロックは、炎症プロセスもブロックし、抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体で処置された哺乳動物に臨床的利益をもたらす。

【0009】

補体は、病原性に関与するいくつかの因子のうちの１つであり、臨床制御に有効な特質を与える重要な病理メカニズムとなり得る。効果的な補体阻害薬の必要性は、様々な疾患状態において補体を介した組織損傷の重要性の認識が進むことにより重視されるようになった。それにもかかわらず現在、補体活性化を特異的に標的とし阻害する、ヒト用の承認薬は一切存在しない。

【0010】

入手可能な臨床および研究データに基づけば、ほとんどの急性および慢性の設定において、Ｃ３ｂおよびＣ５ａの産生は、補体経路の活性化により媒介されると思われる。臨床設定において、Ｃ３ｂおよびＣ５ａの両者は、独立して関与することが示され、全ての経路の適切な阻害方法の開発が、強く望まれている。アナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａの両者は、白血球および血小板を活性化させることが公知である。細胞活性化に多く用いられる指標は、白血球ではＣＤ１１ｂ、血小板ではＣＤ６２Ｐの細胞内発現である。複数の炎症分子の放出が、これらの活性化マーカに媒介される血小板−白血球結合により惹起される。そのようなコンジュゲート結合の１つの結果が、循環からの血小板の除去であり、それは血小板減少症の発症に寄与し得る現象である。

【0011】

本発明は、抗Ｃ３ｂ抗体の使用により、病的状態におけるＣ３ｂの機能的活性、およびその進行作用を阻害するように設計される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、Ｃ３開裂を抑制すること、ならびにＢ因子へのＣ３ｂの結合およびプロペルジンへのＣ３ｂの結合を抑制することにより、Ｃ３ｂ依存性補体活性化を阻害する方法に関する。Ｂ因子に結合して、Ｂ因子へのＣ３ｂ結合を阻害する抗体は公知である。Ｃ３ｂに結合して、副経路活性化のみを阻害する抗体が、本発明に含まれる。Ｃ３ｂ存性補体活性化は、Ｃ３阻害剤分子により阻害され得る。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の一態様において、Ｃ３阻害剤分子は、全長抗Ｃ３抗体または抗Ｃ３抗体フラグメントを含み得る。抗Ｃ３抗体フラグメントは、Ｆ_ａ、Ｆ_{（ａｂ）２}、Ｆ_ｖ、または一本鎖Ｆ_ｖであってもよい。抗Ｃ３抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、または脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）であってもよく、Ｃ３およびそのフラグメントに結合する能力を有していてもよい。本発明は、問題となる補体系活性化を含む複数の疾患状態の処置のための抗Ｃ３抗体およびＣ３ｂ抗体の両方の使用を開示する。

【0014】

別の態様において、本発明は、対象においてＣ３ｂ依存性補体活性化の有害作用を阻害する方法に関する。該方法は、Ｃ３ｂ依存性補体活性化を阻害するのに効果的なＣ３ｂ阻害剤量を対象に投与することを含む。これに関連して、語句「Ｃ３ｂ依存生補体活性化」は、３種の補体経路全ての活性化を指す。本発明の幾つかの態様において、Ｃ３ｂ阻害剤は、抗Ｃ３ｂ抗体またはそのフラグメントであり、別の態様において、抗Ｃ３抗体は、低いエフェクター機能を有する。更に別の態様において、Ｃ３ｂ阻害剤は、Ｃ３ｂ阻害性ペプチドである。本発明の方法、組成物、および薬剤は、不適切な補体活性化が疾患病状に関与する急性または慢性病的状態に罹患したヒトをはじめとし、哺乳動物対象においてインビボでＣ３ｂ依存性補体活性化の有害作用を阻害するのに有用である。

【0015】

別の態様において、本発明は、相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）、およびフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）の様々な組み合わせを含む抗Ｃ３抗体を作製する。ＣＤＲは、軽鎖と重鎖との組み合わせを含む。ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびそのフレームワーク領域が、副補体経路が役割を担う上述の疾患の処置に用いられる。可変領域のアミノ酸配列内で任意の順序でＣＤＲを含む抗体が、本発明に含まれる。そのため本発明は、９０％の配列同一性が維持される限り、ＣＤＲまたはフレームワーク領域の議論された配列および任意の配列変化を含む。そのような抗体は、Ｃ３ｂ分子のみに１：１の化学量論比で結合し、つまり該抗体を用いることにより、血漿試料における活性化率を評価し得ることになる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】古典的補体経路および副補体経路の２つの補体経路を示す。この図は、２種の経路を分けており、Ｃ３ｂで２種の経路を一本化していない。

【図2】ＢへのＣ３ｂ結合のみを阻害し、プロペルジンへのＣ３ｂ結合は阻害しないクローンを同定および選択するスクリーニング試験を示す。

【図3】基質に結合したＣ３ｂに対する抗Ｃ３ｂの飽和結合親和性を示す。

【図4】高親和性でのＣ３ｃへの抗Ｃ３ｂの結合を示す。

【図5】Ｃ３ｄｇへの抗Ｃ３ｂの結合の非存在を示す。

【図6】Ｃ３ｂへのプロペルジン結合の阻害の欠如を示す。

【図7】抗Ｃ３ｂが正常ヒト血清において副補体経路を阻害することを示す。

【図8】抗Ｃ３ｂが古典的補体経路を阻害しないことを示す。

【図9】抗Ｃ３ｂ ＩｇＧが、プロペルジンを含有する複合体ＰＣ３ｂＢｂの形成を阻害することによりＣ３コンバターゼの形成を阻害することを示す。

【図10】抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が、新たに形成されたＣ３ｂの形成を阻害することによりＣ３コンバターゼの形成を阻害することを示す。

【図11】抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が、全血炎症モデルにおいてＣ３ａの形成を阻害することを示す。

【図12】抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が全血炎症モデルにおいてＳＣ５ｂ−９の形成を阻害することを示す。

【図13】抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が全血炎症モデルにおいてＴＮＦ−αの形成を阻害することを示す。

【図14】キメラ抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が基質結合Ｃ３ｂに結合することを示す。

【図15】キメラ抗Ｃ３ｂ Ｆａｂ２が正常なヒト血清においてＡＰ活性化を阻害することを示す。

【図16】Ｃ３ｂへの抗Ｃ３ｂの結合が、１：３．２の化学量論的関係を有することを示す。

【図17】抗Ｃ３ｂマウス重鎖（配列番号１）および抗Ｃ３ｂマウス軽鎖（配列番号２）の両方を示す。

【図18】配列番号１〜配列番号１０を示す。

【図19】配列番号１１〜配列番号２４を示す。

【図20】配列番号２５〜配列番号３２を示す。

【図21】配列番号３３〜配列番号４０を示す。

【図22】配列番号４１〜配列番号４８を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

当業者によって使用されるものを含む標準的用語は一般的かつ標準的であり、本願全体にわたって無条件で使用している。

【0018】

以下の定義は、本発明を説明するために本明細書および特許請求の範囲で使用される用語に関して明確にするために示されている。

【0019】

本明細書で用いられる用語「副経路」は、伝統的には、例えば真菌および酵母細胞壁由来のザイモサン、グラム陰性菌外膜由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、ならびにウサギ赤血球に加え、多くの純粋な多糖類、ウサギ赤血球、ウイルス、細菌、動物腫瘍細胞、寄生虫および損傷細胞により惹起される補体因子Ｃ３からの自発的なタンパク分解性Ｃ３ｂ生成から生じると考えられてきた補体活性化を指す。

【0020】

本明細書で用いられる用語「抗体」は、任意の抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギおよびヒトなどの霊長類）由来の、Ｃ３ｂまたはそのポリペプチドもしくは部分に特異的に結合する抗体および抗体フラグメントを包含する。模範的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および組換え抗体；多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）；ヒト化抗体；マウス抗体；キメラ（即ち、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒト）、モノクローナル抗体、および抗イディオタイプ抗体に加え、脱免疫化抗体が挙げられ、それらは、任意のインタクト分子またはそのフラグメントであってもよい。

【0021】

本明細書で用いられる用語「抗体フラグメント」は、一般に抗原結合領域またはその可変領域を含む、全長抗Ｃ３ｂ抗体から得られた部分またはそれらに関連する部分を指す。抗体フラグメントの例示としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）_２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントおよびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0022】

本明細書で用いられる用語「アプタマー」は、特定の標的に結合する核酸分子を指す。

【0023】

本明細書で用いられる用語「Ｃ３ｂ依存性補体活性」は、全ての可能な経路を介して起こる補体活性化を指す。

【0024】

本明細書で用いられる用語「Ｃ３ｂ阻害剤」は、抗Ｃ３ｂ抗体およびそのＣ３ｂ結合フラグメント、天然および合成ペプチドをはじめとし、Ｃ３ｂと結合または相互作用して、Ｃ３ｂ依存性補体活性化を効果的に阻害する任意の物質を指す。本発明の方法に有用なＣ３ｂ阻害剤は、Ｃ３ｂ依存性補体活性化、つまり全ての活性化を２０％を超えて低下させ得る。一実施形態において、Ｃ３ｂ阻害剤は、補体活性化を９０％を超えて低下させる。

【0025】

本明細書で用いられる「キメラ抗体」は、非ヒト種（例えば、げっ歯類）抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含み、その抗体分子の残りの部分がヒト抗体由来である、組換えタンパク質である。

【0026】

本明細書で用いられる用語「古典的経路」は、（１）外来性粒子に結合する抗体により惹起され、認識分子Ｃ１ｑの結合を必要とするＣ１複合体の補体活性化と、（２）抗原−抗体複合体の形成を介して起こる補体活性化、の両方を指す。

【0027】

本明細書で用いられる「ヒト化抗体」は、ヒト抗体フレームワークに移植される、非ヒト免疫グロブリン由来の特異的な相補性決定領域と一致する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、典型的にはその抗体の相補性決定領域だけが非ヒト起源である組換えタンパク質である。本明細書で用いられる用語「レクチン経路」は、マンナン結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリンなど、血清および非血清の炭水化物結合タンパク質の特異的結合を介して起こる補体活性化を指す。

【0028】

本明細書で用いられる「膜侵襲複合体」（「ＭＡＣ」）は、膜に挿入して膜を破壊する、５つの末端補体成分（Ｃ_５〜Ｃ_９）の複合体を指す。ＭＡＣは、Ｃ５ｂ−９とも呼ぶこともできる。

【0029】

本明細書で用いられる「対象」は、限定するものではないがイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヒト、非ヒト霊長類およびげっ歯類を含む全ての哺乳動物を包含する。副経路は、補体活性化の独立した経路として広く許容される役割に加え、最初に古典的およびレクチン経路を介して惹起される補体活性化のための増幅ループももたらし得る。この副経路により媒介される増幅メカニズムにおいて、古典的またはレクチン補体カスケードのいずれかからの活性化から生じるＣ３コンバターゼ（Ｃ４ｂ２ｂ）は、Ｃ３をＣ３ａおよびＣ３ｂに開裂し、それによりＣ３ｂＢｂ（副経路Ｃ３コンバターゼ）の形成に関与し得るＣ３ｂを提供する。

【0030】

本明細書で用いられる「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含むが、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合に望ましい構造をｓｃＦｖに形成させる、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間のポリペプチドリンカーを更に含む。

【0031】

本発明の抗体は、ヒト疾患の処置のためのキメラおよびヒト化抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ならびに抗原結合フラグメントである。本発明の抗体は、この要件を満たすのに有用となる高親和性抗体を提供し得る。本発明の抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体は、Ｃ３ｂに結合することができ、Ｂ因子へのＣ３ｂ結合を阻害することができる。

【0032】

Ｃ３ｂに結合し得て、Ｂ因子へのＣ３ｂ結合を阻害し得る、特徴的ＣＤＲを有する動物および植物の両方に由来する抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体が、本願に含まれる。本発明の抗体のＣＤＲ間に６０％を超える相同性を有し得るＣＤＲが、本願に含まれる。キメラおよびヒト化抗Ｃ３ｂ抗体を生成するのに用いられるマウスモノクローナル抗体が、本願に含まれる。

【0033】

本発明の抗体は、本発明の抗体が（１）古典的補体経路を阻害しないこと；（２）０．３３：１モル当量で標的タンパク質に結合し得ること；（３）Ｃ３ではなくＣ３ｂと交叉反応し得ること；および（４）Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ−９およびＴＮＦαの産生を阻害し得ること、において先行技術と異なる。本発明の抗体は、Ｃ３ｂに対して生成されており、そのためインタクトＣ３分子のフラグメントであるＣ３ａとは交叉反応しない。

【0034】

Ｃ３ｂは、古典的経路および副経路Ｃ３コンバターゼの一部であり、そのため抗Ｃ３ｂは、両方の経路を阻害すると予測される。本発明の抗体は、副経路のみを阻害せず、古典的経路の活性化には影響を有さない。これらの抗体は、古典的経路に影響を及ぼさずに、Ｃ３ｂへのＢ因子結合を阻害し得る。これらの抗体は、古典的経路の増幅ループの影響を有することなく、副経路を独占的に阻害し得る。

【0035】

本発明の抗体は、新しいＣ３コンバターゼの形成を阻害し得る。これらの抗体は、古典的経路に影響を及ぼさずに、Ｃ３ｂへのＢ因子結合を阻害し得る。これらの抗体は、古典的経路の増幅ループの影響を有することなく、副経路を独占的に阻害し得る。

【0036】

抗Ｃ３ｂ抗体は、副経路の活性化により生成されたＣ３ｂを中和する能力に基づいて選択され得る。１：１のモル当量で、Ｃ３の３０％のみがＣ３ｂに変換されることが決定づけられた。活性化された全Ｃ３ｂ量は、全血炎症モデルにおいて決定され、３０％〜４０％の範囲内になり得、約５０％にも及ぶ可能性がある。

【0037】

本発明の抗体は、古典的経路活性化に影響を有し得ない。つまり本発明のモノクローナル抗体は、古典的経路を阻害することができない。本発明の抗体ｍＡｂは、Ｂ因子タンパク質への結合を介してＡＰ活性化のみに関与するＣ３ｂ上の領域に結合し得る。

【0038】

本発明の別の態様は、ｍＡｂの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびにそれらの組み合わせを含む抗体に関する。可変重鎖ＣＤＲ１、２および３領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２、１４および１６に示す。可変軽鎖ＣＤＲ１、２および３領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２１、および２３に示し、その抗体は、ヒトＣ３ｃおよび／またはＣ３ｂに特異的に結合する。

【0039】

該抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。可変領域内のＣＤＲは、９０％類似〜約９９％類似であってもよい。

【0040】

本発明の別の態様は、抗体がアプタマーまたはそのＤＮＡフラグメントであり得る。完全抗体と同様に、アプタマーは、Ｃ３ｂに結合して、ＰＣ３ｂＢｂ複合体またはＢＣ３ｂ複合体の形成を予防することができる。

【0041】

本発明の抗体、本発明のＣＤＲ、および本発明のフレームワークを、図２７〜３１に列挙する。

【0042】

本発明の抗体は、治療性にすることができる。マウス、キメラ、ヒト化、および霊長類化抗体が、現在考慮されている治療性のものである。しかし近年の科学的進歩により、抗体を別のタイプの抗体様分子に交換することもできるようになり、その場合、抗体様分子の相互作用は、低ピコモル〜高ピコモル〜低ナノモルの範囲内に含まれ得る。

【0043】

キメラ抗体およびヒト化抗体の両方が、ヒトフレームワーク定常領域を有する。ヒト化およびヒトのフレームワーク領域は、前記ＣＤＲ領域の親和性および効力を上昇させるために、天然のヒトフレームワーク領域、または非天然ヒトフレームワーク領域のいずれかである。定常領域は、前記抗体内に存在しても、または存在しなくてもよい。植物、細菌および哺乳動物細胞系内の定常領域を用いて、または用いずに抗体を産生するのに、様々な方法を利用することができる。

【0044】

抗Ｃ３ｂ抗体の機能的活性は、古典的経路の増幅ループに影響を及ぼさずに、ＡＰ活性化を阻害する抗Ｃ３ｂ抗体の能力として定義される。本発明のこれらの抗体は、（１）Ｃ３ｂへのＢ結合を阻害すること、（２）ＰＣ３ｂＢｂ形成／またはＣ３ｂＢｂ形成を減少させること、（３）遊離Ｃ３ｂの濃度を低下させること、（４）Ｃ３ｂの形成を減少させること、（５）Ｃ３ａ、Ｃ５ａおよびＣ５ｂ−９の形成を減少させること、（６）単球ＣＤ１１ｂ発現を減少させること、（７）好中球ＣＤ１１ｂ発現を減少させること、（８）血小板ＣＤ６２Ｐ発現を減少させること、（９）白血球−血小板コンジュゲートの形成を減少させること、（１０）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）を減少させること、ならびに（１１）好中球エラスターゼ形成を減少させること、が可能である。

【0045】

本発明は、副経路由来のＣ３ｂ依存性補体活性化の有害作用を阻害する方法も提供する。Ｃ３ｂ阻害剤は、一次療法として単独で用いること、または他の方法との併用療法で、他の処置の利益を増強する補体として用いることができる。

【0046】

阻害剤は、小分子、アプタマー、ＤＮＡフラグメント、ＣＤＥドメインを提示する小ペプチドＳｉＲＮＡであってもよい。これらの阻害剤は、Ｃ５、Ｃ９、およびＣ５に関連するＣ３ｂに結合するプロペルジンを阻害する。

【0047】

本発明は、補体の生化学的カスケードを阻害するための抗Ｃ３ｂ抗体の新たな使用を提案する。本発明は、全ての補体経路に関連する細胞傷害を阻害するための治療ターゲットとしてＣ３ｂの使用を記載する。

【0048】

疾患状態
本発明の別の態様において、該抗体は、インビボで、急性または慢性の病的傷害に罹患したヒトなどの対象において、副経路を介した補体活性化を阻害するのに用いることができる。本発明は、限定するものではないが、以下の疾患、障害、損傷、および処置と併せて用いることができる。

【0049】

体外循環疾患および障害：心肺バイパス後の炎症、術後肺機能不全、心肺バイパス、血液透析、白血球フェレーシス、血漿フェレーシス、血小板フェレーシス、ヘパリン誘導性体外膜型ＬＤＬ沈降法（ＨＥＬＰ）、灌流後症候群、体外膜型人工肺（ＥＣＭＯ）、心肺バイパス（ＣＰＢ）、灌流後症候群、全身性炎症反応、および多臓器不全。

【0050】

心臓血管疾患および障害：急性冠動脈症候群、川崎病（動脈炎）、高安動脈炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、血管漏出症候群、経皮的冠動脈介入（ＰＣＩ）、心筋梗塞、急性心筋梗塞後の虚血再灌流傷害、アテローム性硬化症、血管炎、免疫複合体性血管炎、関節リウマチ関連の血管炎（悪性関節リウマチとも呼ばれる）、全身エリテマトーデス関連の血管炎、敗血症、動脈炎、動脈瘤、心筋症、拡張型心筋症、心臓手術、末梢血管病、腎血管病、心臓血管病、脳血管病、腸間膜／腸の血管病、糖尿病性血管症、静脈ガス塞栓症（ＶＧＥ）、ウェゲナー肉芽腫、ヘパリン誘導性体外膜型人工肺、およびベーチェット症候群。

【0051】

骨／骨格筋疾患および障害：関節炎、炎症性関節炎、非炎症性関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、骨関節炎、骨粗しょう症、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット症候群、およびシェーグレン症候群。

【0052】

移植疾患および障害：移植片拒絶、異種移植片拒絶、移植片対宿主病、臓器または移植片の異種移植、臓器または移植片の同種移植、および超急性拒絶

【0053】

目／眼科疾患および障害：湿性および乾性加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、脈絡膜新生血管（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＮＶ）、網膜損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜微小血管症、目のヒストプラスマ症、ブドウ膜炎、糖尿病黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、糖尿病性網膜微小血管症、病的近視、網膜中心静脈閉塞症（ＣＲＶＯ）、角膜血管新生、網膜血管新生、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、目のヒストプラスマ症、およびプルチェル網膜症。

【0054】

出血／血液疾患および障害：敗血症、全身炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、出血性ショック、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、劇症抗リン脂質抗体症候群（ＣＡＰＳ）、寒冷凝集素病（ＣＡＤ）、自己免疫性血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、エンドトキシン血症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、不定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、敗血症、敗血症性ショック、鎌形赤血球性貧血、溶血性貧血、特発性好酸球増加症候群、および抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＬＳ）。

【0055】

呼吸／肺疾患および障害：喘息、ウェゲナー肉芽腫、輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＩＬ）、抗糸球体基底膜抗体病（グッドパスチャー病）、好酸球性肺炎、過敏性肺炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張（ａｌｌｅｒｇｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｓｔａｓｉｓ）、反応性気道疾患症候群、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）感染、パラインフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染、アデノウイルス感染、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）、結核、肺寄生虫症、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、サルコイドーシス、気腫、気管支炎、嚢胞性線維症、間質性肺疾患、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、輸血関連急性肺傷害、虚血／再灌流急性肺傷害、綿肺、ヘパリン誘導性体外膜型人工肺、アナフィラキシーショック、およびアスベスト誘発性の炎症。

【0056】

中枢および末梢神経系／神経疾患および障害：多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症、ギランバレー症候群、ミラー・フィッシャー症候群、卒中、卒中後の再灌流、アルツハイマー病、多巣性運動ニューロパチー（ＭＭＮ）、脱髄、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、退行性椎間板変性症（ＤＤＤ）、髄膜炎、髄膜炎による脳神経傷害、変異型クロイツフェクト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）、特発性多発神経障害、脳／大脳外傷（限定するものではないが、出血、炎症、および浮腫を含む）、および神経因性疼痛。

【0057】

外傷性損傷および障害：出血性ショック、血液量減少性ショック、脊髄損傷、神経損傷、大脳外傷、脳虚血再灌流、挫滅傷、創傷治癒、重度火傷、および凍傷。

【0058】

腎疾患および障害：腎臓再灌流傷害、溶連菌感染後糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、グッドパスチャー病、膜性腎炎、バージャー病／ＩｇＡ腎症、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜様糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（間質性毛細管性糸球体腎炎）、急性感染後糸球体腎炎、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ループス腎炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病性腎炎、および腎皮質壊死症（ＲＣＮ）。

【0059】

臓器の再灌流傷害および障害：限定するものではないが、心臓、脳、腎臓、および肝臓を含む。

【0060】

生殖器および泌尿生殖器疾患および障害：疼痛性膀胱疾患および障害、知覚性膀胱疾患および障害、自然流産、男性および女性の不妊による疾患、妊娠による疾患、胎児母体間免疫寛容、子癇前症、泌尿生殖器の炎症性疾患、胎盤機能不全による疾患および障害、流産による疾患および障害、慢性細菌性膀胱炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ａｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｙｓｔｉｔｉｓ）、および間質性膀胱炎。

【0061】

皮膚／皮膚科学的疾患および障害：火傷、乾癬、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、好酸球性海面状態、蕁麻疹、熱傷、類天疱瘡、後天性表皮水疱症、自己免疫水疱性皮膚疾患、水疱性類天疱瘡、強皮症、血管性浮腫、遺伝性血管神経症性浮腫（ＨＡＥ）、多形性紅斑、妊娠性疱疹、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、および疱疹状皮膚炎。

【0062】

胃腸疾患および障害：クローン病、セリアック病／グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、腸管虚血、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎。

【0063】

内分泌疾患および障害：橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、ストレス性不安（ｓｔｒｅｓｓ ａｎｘｉｅｔｙ）、およびプロラクチンに影響を及ぼす他の疾患、増殖またはインスリン様増殖因子、副腎皮質刺激ホルモン放出、膵臓炎、アジソン病、限定するものではないが、Ｉ型およびII型糖尿病などの糖尿病、サルコイドーシス、糖尿病性腎症微小血管症、非肥満糖尿病（ＩＤＤＭ）、血管症、神経症、またはＩＤＤＭもしくは２型糖尿病の腎症合併、およびインスリン抵抗性。

【0064】

悪性腫瘍の処置：化学療法および放射線療法から生じる疾患および障害。

【0065】

本発明の別の例において、本発明の抗体は、傷害、例えば虚血再灌流傷害（Ｉ／Ｒ）を処置する。Ｉ／Ｒ傷害の病理生理学は複雑であり、少なくとも２種の主要な因子がそのプロセス、つまり補体活性化および活性酸素を介した傷害を伴う好中球刺激に寄与する。

【0066】

補体活性化の阻害は、数多くのＩ／Ｒ動物モデルにおいて組織障害および損傷を抑制するのに有効であったため、研究により、Ｉ／Ｒ傷害における中枢的媒介物質としての補体を同定する証拠が増えている。初期試験において、腎臓および心臓のＩ／Ｒの際に有益と報告されたコブラ毒因子の輸注後に、Ｃ３枯渇が得られた。しかし補体受容体１（ｓＣＲ１）の可溶性形態は、冠動脈内皮に沿ったＣ５ｂ−９複合体付着を減少させる心筋Ｉ／Ｒ傷害の予防に利用された最初の補体特異性阻害剤であり、再灌流後の白血球浸潤の減少は、心筋Ｉ／Ｒによる梗塞減弱の際のｓＣＲ１処置に関連した。Ｃ３が遺伝的に欠損する動物は、骨格筋または腸管虚血の後の局所組織壊死が少ない。

【0067】

膜侵襲複合体は、補体誘導性傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｉｎｊｕｒｙ）の最も重要な媒介物質であり、Ｃ５欠損動物における試験ではＩ／Ｒ傷害モデルにおいて局所および遠隔部傷害の減少が示された。補体活性化の阻害剤である可溶性Ｃｒｒｙ（補体受容体関連遺伝子Ｙ）は、マウス腸管再灌流開始の前および後の両方で与えられると、傷害に対する有効性を示した。骨格筋虚血のモデルにおいて、可溶性補体受容体１（ｓＣＲ１）の使用は、再灌流の開始後に与えられると、筋肉障害も減少させる。ブタ心筋Ｉ／Ｒモデルにおいて、再灌流前にアナフィラトキシンＣ５ａへのモノクローナル抗体（「ＭｏＡｂ」）で処置された動物は、梗塞の減弱を示した。Ｃ５ ＭｏＡｂで処置されたラットは、梗塞サイズ、好中球浸潤、および心筋のアポトーシスにおける減少を示した。

【0068】

別の例において、Ｃ３ｂ阻害剤は、限定するものではないが、大動脈瘤修復、臓器移植、または切断もしくは外傷を受けた四肢もしくは指の再接合術などの幾つかの障害の再灌流の前および／またはその間および／またはその後に投与することができる。Ｃ３ｂ阻害剤は、動脈内、頭蓋内、静脈内、皮下、筋肉内、または他の非経口投与により様々な方法で投与することができる。非ペプチド作動性阻害剤では潜在的に経口で、最も適切には動脈内または静脈内投与による。投与は、最適な治療効果のために医師の決定ように周期的に繰り返されてもよい。

【0069】

実施例１
特段の断りのない限り、試薬は全て、入手可能なハイグレードのものであった。補体タンパク質、古典的副経路および古典的経路の緩衝液、検出抗体、ならびに赤血球は全て、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（テキサス州タイラー所在）またはＱｕｉｄｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州サンディエゴ所在）から得た。フローサイトメトリーの抗体は、カリフォルニア州サンホセ所在のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。ＴＭＢ基質は、メリーランド州ゲイザーズバーグ所在のＫｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌｉｍｉｔｅｄから得た。二次抗体は全て、カリフォルニア州サンクレメンテ所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｑｕａｌｅｘから、ＢＳＡおよび他の試薬は、全てミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。

【0070】

ＥＬＩＳＡプレートリーダー(ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０および２５０)は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから得て、フローサイトメータは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒであった。Ｖａｒｉｔｙ ３Ｄプログラムを、データ解析に用い、曲線あてはめは、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎプログラムを用いて実施した。溶血反応速度アッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓのＳｅｃｔｒａＭａｘを用いて実施し、ＥＬＩＳＡプレートは、マサチューセッツ州ローウェル所在のＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒから得た。

【0071】

ヒト化およびキメラ抗体は、本願に存在する配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である親マウスモノクローナル抗体のＣＤＲを含む。マウスは、ヒトＣ３ｂ（テキサス州タイラー所在のＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を注射され、マウス血清は、Ｃ３ｂ結合およびＡＰ阻害活性についてスクリーニングされた。プロペルジン陽性マウス由来脾臓細胞を、標準の手順を利用して骨髄腫細胞と融合させた。限界希釈法を利用して、融合細胞を単細胞集団にクローニングした。９６ウェルプレート中の細胞を増殖させ、プロペルジン結合および副経路阻害を利用して上清を試験した。ＡＰ活性化をブロックする細胞を同定し、Ｃ５ｂ−９形成を阻害する細胞を用いて更にスクリーニングした。これらのクローンは、高親和性でのＣ３ｂへのＢ因子結合を阻害する７Ｄ１１の下で分類された。タンパク質分解消化を利用して、インタクトＩｇＧをＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ_２’フラグメントに変換した。７Ｄ１１を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＰＴＡ−８８０６としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に寄託された。

【0072】

抗Ｃ３ｂ ＩｇＧは高親和性でヒトＣ３ｂおよびＣ３ｃに結合するが、Ｃ３ｄｇには結合しない
Ｃ３ｂへの抗Ｃ３ｂ ＩｇＧの親和性は、低ｐＭ〜低ｎＭの範囲内である。該抗体およびそのフラグメントは、高親和性でＣ３ｂおよびＣ３ｃに結合する。 ポリスチレン製マイクロタイタープレートに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のヒトＣ３ｂを４℃で一晩コーティングさせた。Ｃ３ｂ溶液を吸引した後、ウェルをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で１時間ブロッキングした。ペプチドまたはＣ３ｂコーティングを有さないウェルを、バックグランド対照とした。ブロッキング溶液中のモノクローナル抗Ｃ３ｂ抗体ＩｇＧ、Ｆａｂ２、およびＦａｂのアリコットを、Ｃ３ｂコーティングウェルに添加し、１時間インキュベートして結合を生じさせた。室温で１時間のインキュベーション期間の後、プレートをＰＢＳで５回すすぎ、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスモノクローナル抗体と共にインキュベートした。このインキュベートの後、プレートをすすぎ、結合したペルオキシダーゼを、ＴＭＢ試薬を用いて同定した。

【0073】

図示するように、抗Ｃ３ｂは、Ｃ３ｂ（図３）およびＣ３ｃ（図４）に結合する。その抗体結合部位は、Ｃ３ｄには存在しない（図５）。

【0074】

実施例２：抗Ｃ３ｂ ＩｇＧはプロペルジン−Ｃ３ｂ相互作用を阻害しない
Ｃ３ｂに対する抗Ｃ３ｂ ＩｇＧの親和性は、低ｐＭ〜低ｎＭの範囲内である。該抗体およびそのフラグメントは、高親和性でＣ３ｂおよびＣ３ｃに結合する。 これらの抗体およびそのフラグメントは、Ｃ５へのプロペルジン結合を阻害しない。ポリスチレン製マイクロタイタープレートに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のヒトＣ３ｂを４℃で一晩コーティングさせた。Ｃ３ｂ溶液を吸引した後、ウェルをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で１時間ブロッキングした。ペプチドまたはＣ３ｂコーティングを有さないウェルを、バックグランド対照とした。２ｎＭビオチン化プロペルジンを含有するブロッキング溶液中のモノクローナル抗Ｃ３ｂ抗体ＩｇＧ、Ｆａｂ２、およびＦａｂのアリコットを、Ｃ３ｂコーティングウェルに添加し、１時間インキュベートさせて結合を生じさせた。室温で１時間のインキュベーション期間の後、プレートをＰＢＳで５回すすぎ、ペルオキシダーゼをコンジュゲートされたニュートラビジン（ｎｅｕｔａｖｉｄｉｎ）と共にインキュベートした。このインキュベートの後、プレートをすすぎ、結合したペルオキシダーゼを、ＴＭＢ試薬を用いて同定した。

【0075】

図示するように、抗体は、Ｃ３ｂへのプロペルジン結合を阻害せず、結合に関与するＣ３ｂ上のプロペルジン部位とは異なる部位の存在が示唆される。

【0076】

実施例３：抗Ｃ３ｂ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂは、副経路（ＡＰ）依存性ウサギ赤血球（ｒＲＢＣ）溶解を阻害する
この赤血球溶解アッセイは、ｒＲＢＣの表面の末端補体複合体の形成に基づく。結果としてｒＲＢＣは、溶解される。９００ｎｍでの光散乱の漸減は、赤血球溶解の直接的な指標である。典型的にはｒＲＢＣを、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有ゼラチンベロナール緩衝液中の正常ヒト血清中でインキュベートする。これらの条件下で、ｒＲＢＣの表面は、正常ヒト血清中での副経路の活性化を惹起する。副経路の活性化は、ｒＲＢＣの表面でのＣ５ｂ−９複合体形成に誘導する。Ｃ５ｂ−９複合体形成を阻害する薬剤は、細胞溶解を阻害すると予測される。抗Ｃ３ｂ抗体およびそのフラグメントの効果を評価するために、様々な濃度のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦａｂを、９００ｎｍでの読み取りが可能な温度制御されたＥＬＩＳＡプレートリーダーで、一定濃度のウサギ赤血球を含む３７℃のＡＰ緩衝液中、正常ヒト血清（１０％ＮＨＳ）と共にインキュベートした。光散乱の漸減（インタクト細胞の溶解による）を、時間の関数として９００ｎｍで測定した。データは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０プレートリーダーおよびＳｏｆｔＭａｘソフトウエアで記録および分析した。計算では、総阻害を各濃度のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂで計算し、結果を非溶解対照の％率として表した。各濃度のデータを、ＭｉｃｒｏＣａｌ Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅでシグモイドプロットにプロットした。

【0077】

図７に示すように、IｇＧ抗Ｃ３ｂは、赤血球溶解を阻害するＩＣ５０で、正常ヒト血清中のＡＰ依存的なｒＲＢＣ溶解を阻害する。該抗体は、およそ６９ｎＭのＩＣ５０で溶解を阻害することができる。

【0078】

実施例４：抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体は古典的経路の活性化を阻害しない
本発明のモノクローナル抗体は、宿主防御に必要とされる古典的経路を阻害しない。抗体感作したヒツジ赤血球を、カルシウム（５ｍＭ ＣａＣｌ_２／ＭｇＣｌ_２）緩衝液を含有するゼラチンベロナール緩衝液中で１％または１０％正常ヒト血清と共にインキュベートした。抗体感作したヒツジ細胞は、古典的経路を活性化する。結果としてＣ５ｂ−９が、溶解を起こした赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ａｃｕｓｅｄ ｌｙｓｉｓ）の表面に形成される。本発明者らは、１％および１０％正常ヒト血清を試験した。両条件下で、抗Ｃ３ｂは、赤血球溶解を阻害した。典型的なアッセイにおいて、赤血球をＣＰ緩衝液中の１％／１０％正常ヒト血清中でインキュベートして、補体活性化を起こさせる。ＣＰ活性化の結果、Ｃ５ｂ−９が、細胞溶解を起こした赤血球の表面に形成される。細胞溶解による光散乱の漸減を、時間の関数として７００ｎｍで測定する。

【0079】

図８に示すように、抗Ｃ３ｂ ＩｇＧは、両方の血清濃度で、抗体感作ヒツジ細胞の溶解を阻害しない。血清対照は、任意の作用を示さなかった。これらの結果から、抗Ｃ３ｂ抗体が古典的経路の活性化に影響を及ぼさずに副補体経路を選択的に阻害し得ることが示唆される。

【0080】

実施例５：抗Ｃ３ｂ ＩｇＧおよびそのフラグメントは副補体経路のＣ３コンバターゼ（ＰＣ３ｂＢｂ）の形成を阻害する
副補体経路は、正常ヒト血清中で、腸チフス菌由来のリポ多糖により活性化される。本発明者らは、本発明の抗プロペルジン抗体がＰＣ３ｂＢｂの形成を阻害するか否かを実証するためにこのパラダイムを利用した。本発明者らは、抗プロペルジン抗体およびそのフラグメントの存在下および非存在下で、Ｐ、Ｃ３ｂ、Ｂｂ、およびＣ５ｂ−９の付着を測定した。Ｃ３およびＣ５コンバターゼの形成を、適切な抗体で検出した。抗プロペルジン抗体の存在下では、用量依存的なＣ３およびＣ５コンバターゼ形成阻害が、認められた。典型的なアッセイにおいて、ポリスチレン製マイクロタイタープレートウェルを、ＰＢＳ中の２μｇ／５０μｌのＬＰＳ（腸チフス菌由来リポ多糖）でコーティングした。ウェルをＰＢＳ中の１％ＢＳＡと共にインキュベートして、ウェル中の非占有部位をブロッキングした。室温での２時間のブロッキングおよびＰＢＳでのすすぎに続いて、ＡＰ緩衝液中の正常ヒト血清（１０％）を、様々な濃度の抗体およびフラグメントと混合した。混合物をＬＰＳコーティングのウェルに入れてインキュベートした。プレートを３７℃で２時間インキュベートして、補体ＡＰ活性化を起こさせた。インキュベーションに続いて、プレートをＰＢＳで徹底的に洗浄して、Ｃ３コンバターゼの成分を、適切な抗体で検出した。本発明者らは、ブロッキング溶液中の１：２０００のウサギ抗ヒトＣ３ｃと、ブロッキング溶液中の１：２０００のヤギ抗ヒトＰと、ブロッキング溶液中の１：５００のヤギ抗ヒトＢｂ因子と、ブロッキング溶液中の１：２０００のＨＲＰＯコンジュゲート抗ヒト（ａｎｔｉ−ｈｕｍａ）Ｃ５ｂ−９とでＣ３ｂを検出した。プレートを各抗体と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、プレートをＰＢＳですすいで、結合した抗体を、Ｃ３ｂ検出については１：２０００のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギで、Ｐ検出についてはブロッキング溶液中の１：２０００のペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギで検出した。プレートは全て、ＰＢＳでの徹底的な洗浄に続いてＴＭＢで発色させた。青色を１Ｍオルトリン酸でクエンチした。図９は、Ｐ付着の用量依存的阻害を示す。

【0081】

図９は、Ｐ付着の用量依存的付着を示し、図９は、形成付着の用量依存的付着を示す。これらのデータは、抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体がコンバターゼ形成を防止し、ＡＰ活性化を阻害する直接的証拠を示している。

【0082】

実施例６：抗Ｃ３ｂは全血中での副補体および細胞活性化を阻害する
抗Ｃ３抗体は、対象における心肺バイパス（ＣＰＢ）および／または透析処置などの体外循環処置において用いることができる。これらの処置において、循環血を対象の血管から導管を通して再度、対象の血管に戻すことができる。導管は、対象の血液中で補体活性化、血小板活性化、白血球活性化、または血小板−白血球接着のうちの少なくとも１つを誘発し得る材料を含む内腔表面を有することができる。抗Ｃ３ｂ抗体を、補体活性化、血小板活性化、白血球活性化、または血小板−白血球接着のうちの少なくとも１つを減少させるのに有効な量で対象の血流に導入して、循環血を導管に通過させることができる。対象の血液は、抗Ｃ３抗体またはそのフラグメントの段階的導入の前および／または導入中および／または導入後に導管を通過させることができる。好ましくは、抗プロペルジン抗体は、補体成分Ｃ３から補体成分Ｃ３ａおよびＣ３ｂへの副経路依存的変換、ならびに／またはＣ５ｂ−９の副経路依存的形成、ならびに／または副経路依存的白血球活性化を減少させる。

【0083】

全血チュービングループモデルは、生物材料で誘導されたＡＰ活性化を示す。このモデルは、心肺バイパスおよび透析の体外循環モデルを模倣している。単離されたばかりのヒト血液を、抗凝固剤として５単位／ｍＬヘパリンを含有する５０ｍＬポリプロピレン管に採取した。ヘパリン処理された血液を、様々な濃度の抗Ｃ３ｂを含有するｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−１４８で希釈した。チュービングループの半分に、希釈された血液２．０ｍＬを充填して、体外処置で用いられるポリエチレン管で垂直方向に３７℃で回転させた。インキュベーションおよび回転の後、血液試料を２．０ｍＬ試験管に移し替えた。これらの血液試料のアリコットを、フローサイトメトリー用に保存した。残りの血液量を遠心分離して（４０００×ｇ、４０℃で５分間）、血漿試料を採取した。補体活性化の阻害：チュービングループのプラスチック表面は、副経路を活性化させる。結果として、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、およびＣ５ｂ−９が形成される。ベースラインを超える高レベルが、市販品でのＥＬＩＳＡ法を利用して測定することができる。チュービングループに用いた血漿試料で、Ｃ３ａ＆Ｃ５ｂ−９キット（Ｑｕｉｄｅｌ）およびウサギ赤血球溶解アッセイを利用して補体活性について評価した。生物材料表面で誘導された副経路活性化の結果、Ｃ３は、Ｃ３ａおよびＣ３ｂに変換される。同様にＣ５は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂに開裂される。

【0084】

図１１は、３１μｇ／ｍｌのＩＣ_５０でのＣ３ａ形成の用量依存性阻害を示している。抗Ｃ３ｂは、図１２に示すように、Ｃ５ｂ−９形成を阻害した。

【0085】

実施例７：体外循環後のＮＭ９４０５によるＴＮＦ−α形成の阻害
活性化された単球は、炎症媒介物質であるＴＮＦ−αを放出する。単球は、Ｃ３ａにより活性化される。抗Ｃ３ｂ処理された体外循環中の血液試料は、ＴＮＦ−αの用量依存的阻害を示す。

【0086】

ＴＮＦ−αは、複数の疾患病状に関係づけられた強力な炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、他の炎症媒介物質を動員して炎症反応を増悪させ、アポトーシスならびに細胞および組織の損傷を誘発する炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦ−α阻害は、炎症反応阻害の重要なマーカである。抗ＴＮＦ薬および生物製剤の検証により、疾患の重要な利益がもたらされた。チュービングループ循環に続いて、血漿試料をＴＮＦ−αアッセイ（ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にも供した。

【0087】

図１３に示されたように、抗Ｃ３ｂは、ＴＮＦ−α形成の用量依存的阻害を示し、ＩＣ_５０は約４４μｇ／ｍｌで観察された。

【0088】

実施例８：モノクローナル抗体の産生
マウスモノクローナル抗体の産生は、当業者により記載されており、一般的方法となっている。典型的には抗原、この場合Ｃ３ｂタンパク質を、モノクローナル抗体を産生する手法でマウスに投与した。ヒト化およびキメラ抗体が、ＣＤＲグラフティングにより、一般的な定常領域を利用して産生された。Ｃ３ｂに特異的なマウスモノクローナル抗体を、副経路阻害アッセイに基づいて選択した。Ｃ３ｂは、古典的経路の一部でもあり、意外にもこの抗Ｃ３ｂ抗体は、古典的経路を阻害せず、副経路のみを阻害する。マウス抗体は、キメラおよびヒト化抗体に変換された。

【0089】

実施例９：キメラ抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体はＣ３ｂに結合する
キメラ抗Ｃ３ｂ抗体Ｆａｂは、基質結合Ｃ３ｂに結合する。ポリスチレン製マイクロタイタープレートウェル（９６ウェル培地は結合プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のＣ３ｂ（２μｇ／５０μｌ／ウェル、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州タイラー所在）を４℃で一晩コーティングした。Ｃ３ｂ溶液を吸引した後、ウェルを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有するＰＢＳで１時間、室温でブロッキングした。Ｃ３ｂコーティングを有さないウェルを、バックグランド対照とした。ブロッキング溶液中のキメラ抗体のアリコットを、Ｃ３ｂコーティングＥＬＩＳＡウェルに添加した。結合したキメラ抗体の量を、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ軽鎖抗体で検出した。

【0090】

図１４は、クローンのうち２種が基質結合Ｃ３ｂに結合することを示している。

【0091】

実施例１０：キメラ抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体は副補体経路を阻害する
キメラ抗Ｃ３ｂ抗体Ｆａｂは、Ｃ３ｂに結合し、副経路に依存的な赤血球溶解を阻害する。アッセイは、実施例３に記載されたものと同様である。

【0092】

実施例１１：抗Ｃ３ｂモノクローナル抗体は０．３３：１（抗体：Ｃ３ｂ）の比でＣ３ｂを中和する
様々な濃度の抗Ｃ３ｂ抗体を、一定濃度の正常ヒト血清に添加した。血清−抗体混合物を、実施例３に示したように、ウサギ赤血球に添加して溶血アッセイに供した。抗体は、高濃度では赤血球溶血を阻害し、変曲点はほぼ１０００ｎＭの抗体濃度であった。存在する総Ｃ３は、３２００ｎＭの範囲内である。これらのデータから、抗体：Ｃ３の比が０．３３：１となる化学量論比が示唆される。

【0093】

実施例１２：マウスＣＤＲのヒトフレームワーク領域へのＣＤＲグラフティング
マウスＣＤＲを様々なフレームワークにグラフティングして、図１７および１８に示されたヒト化抗体を生成した。フレームワークおよびＣＤＲは両者とも、図１９に含まれ、フレームワークは、図２０、２１、および２２に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]