特許 6262829 動物排泄物の環境影響を減少させるための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6262829

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】動物排泄物の環境影響を減少させるための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A23K 20/189 20160101AFI20180104BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20180104BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20180104BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20180104BHJP

   A23K 50/30 20160101ALI20180104BHJP

   A23K 50/60 20160101ALI20180104BHJP

   A23K 50/75 20160101ALI20180104BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20180104BHJP

【ＦＩ】

   A23K20/189ZNA

   A61K45/00

   A61P3/00

   A61P43/00 171

   A23K20/147

   A23K50/30

   A23K50/60

   A23K50/75

   C12N9/16 B

【請求項の数】27

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2016-223377(P2016-223377)

(22)【出願日】2016年11月16日

(62)【分割の表示】特願2014-557691(P2014-557691)の分割

【原出願日】2013年2月7日

(65)【公開番号】特開2017-79743(P2017-79743A)

(43)【公開日】2017年5月18日

【審査請求日】2016年12月15日

(31)【優先権主張番号】61/599,729

(32)【優先日】2012年2月16日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100081422

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 光雄

(74)【代理人】

【識別番号】100084146

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 宏

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・エム・アンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】セルゲイ・ポドコビロフ

(72)【発明者】

【氏名】ユエファン・ホアン

(72)【発明者】

【氏名】カート・シュースター

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・エドワード・フェレル

【審査官】 門 良成

(56)【参考文献】

【文献】 特開平６−３１９５３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平４−３４９８８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第７９１４７８２（ＵＳ，Ｂ２）

【文献】 特開平８−２０５７８５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ２３Ｋ ２０／１８９

Ａ２３Ｋ ２０／１４７

Ａ２３Ｋ ５０／３０

Ａ２３Ｋ ５０／６０

Ａ２３Ｋ ５０／７５

Ｃ１２Ｎ ９／１６

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｐ ３／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される１つ以上の有害な化合物の量を減少させることにより、動物排泄物の環境影響を減少させるための、アルカリホスファターゼを含む組成物の使用であって、前記アルカリホスファターゼが、配列番号１で示されるアルカリホスファターゼ、または配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有し、位置１０２にセリンを含むアルカリホスファターゼである、使用。

【請求項2】

前記有害な化合物が、アンモニアまたはリンである、請求項１記載の使用。

【請求項3】

前記動物が、幼若動物である、請求項１または２に記載の使用。

【請求項4】

前記動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタまたはウシである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有する、配列番号１の成熟型アルカリホスファターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項6】

前記酵素が、離乳期、育成期および／または仕上げ期の１つ以上の間に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項7】

前記酵素が、動物飼料または動物飼料の添加物として製剤化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

１つ以上のさらなる活性成分が、前記動物に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される１つ以上の有害な化合物の量を減少させる有効量のアルカリホスファターゼ、および１つ以上の経口的に許容可能な担体を含む、動物への経口投与に適した組成物であって、前記アルカリホスファターゼが、配列番号１で示されるアルカリホスファターゼ、または配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有し、位置１０２にセリンを含むアルカリホスファターゼである、組成物。

【請求項10】

前記有害な化合物が、アンモニアまたはリンである、請求項９記載の組成物。

【請求項11】

前記動物が、幼若動物である、請求項９または１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタまたはウシである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有する、配列番号１の成熟型アルカリホスファターゼである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１の位置３３〜５７２のアミノ酸のアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有するアルカリホスファターゼである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記酵素が、離乳期、育成期および／または仕上げ期の１つ以上の間に投与されるように適合されている、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記酵素が、動物飼料または動物飼料の添加物として製剤化される、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記組成物が、１つ以上のさらなる活性成分を含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

動物におけるリンの消化を増加させるための、有効量のアルカリホスファターゼを含む組成物の使用であって、前記アルカリホスファターゼが、配列番号１で示されるアルカリホスファターゼ、または配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有し、位置１０２にセリンを含むアルカリホスファターゼである、使用。

【請求項19】

前記動物が、幼若動物である、請求項１８に記載の使用。

【請求項20】

前記動物が、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタまたはウシである、請求項１８または１９に記載の使用。

【請求項21】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有する、配列番号１の成熟型アルカリホスファターゼである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項22】

前記アルカリホスファターゼが、離乳期、育成期および／または仕上げ期の１つ以上の間に投与される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項23】

前記アルカリホスファターゼが、動物飼料または動物飼料の添加物として製剤化される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項24】

動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される１つ以上の有害な化合物の量を減少させるため、動物の飼料転換率を増加させるため、動物の飼料効率を増加させるため、および／または動物の成長速度を高めるための、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項25】

配列番号１のアルカリホスファターゼ、または配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有し、位置１０２にセリンを含むアルカリホスファターゼ。

【請求項26】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１と少なくとも９４％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有する、配列番号１の成熟型アルカリホスファターゼである、請求項２５記載のアルカリホスファターゼ。

【請求項27】

前記アルカリホスファターゼが、配列番号１の位置３３〜５７２のアミノ酸のアルカリホスファターゼであり、位置１０２にセリンを有するアルカリホスファターゼである、請求項２５に記載のアルカリホスファターゼ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、動物排泄物の環境影響を減少させるための方法を提供する。特に、本発明は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させるのに有効な酵素を動物に投与する工程を含む方法、およびそのような方法における使用に適した組成物を提供する。動物におけるリンの消化を増加させるための方法も提供される。

【背景技術】

【0002】

動物排泄物は、有害な影響（例えば、その動物、他の動物、ヒトまたは環境に対する有害な影響）を及ぼす１つ以上の化合物を含むまたは放出することがある。そのような化合物の１つは、アンモニア（ＮＨ_３）である。別のそのような化合物は、リン（Ｐ）である。

【0003】

大気中のアンモニアは、環境ならびに動物の生産能力、健康および幸福に対して不都合な影響を及ぼし得る。例えば、養鶏施設における、アンモニアの発生および排出は、主に家禽の排泄物の微生物学的分解に起因する。５０ｐｐｍほど低いアンモニアレベルでも、家禽にとっては有害であり得るが、そのような低レベルは、気付かれないままであることがある。５０ｐｐｍのアンモニアへの曝露は、ラント種の鳥の５〜１０％に関与し得、１羽あたり０．５ポンドの肉の損失および／または飼料効率の８ポイントの損失に関連し得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ゆえに、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させる方法（例えば、動物排泄物のアンモニアおよび／またはリンの含有量を減少させるための方法）が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0005】

いくつかの実施形態において、動物排泄物の環境影響を減少させるための方法が提供され、その方法は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、動物排泄物中のアンモニアの量を減少させるため方法が提供され、その方法は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるアンモニアの量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、動物排泄物中のリンの量を減少させるための方法が提供され、その方法は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるリンの量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。動物におけるリンの消化を増加させるための方法も提供され、その方法は、有効量のアルカリホスファターゼをその動物に投与する工程を含む。

【0006】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、経口的に投与され得る。

【0007】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、アルカリホスファターゼであり得る。

【0008】

これらの方法のいずれかにおいて、動物は、家禽またはブタ動物であり得る。

【0009】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、離乳期（ｓｔａｒｔｅｒ ｐｈａｓｅ）、育成期（ｇｒｏｗｅｒ ｐｈａｓｅ）および／または仕上げ期（ｆｉｎｉｓｈｅｒ ｐｈａｓｅ）の１つ以上の間に投与され得る。

【0010】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、動物飼料（例えば、離乳飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｆｅｅｄ）、育成飼料（ｇｒｏｗｅｒ ｆｅｅｄ）または仕上げ飼料（ｆｉｎｉｓｈｅｒ ｆｅｅｄ））として製剤化され得る。

【0011】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、動物飼料の添加物として製剤化され得る。

【0012】

いくつかの実施形態において、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物が提供される。いくつかの実施形態において、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるアンモニアの量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物が提供される。いくつかの実施形態において、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるリンの量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物が提供される。

【0013】

これらの組成物のいずれかにおいて、組成物は、酵素に対する経口的に許容可能な担体を含み得る。

【0014】

これらの組成物のいずれかにおいて、酵素は、アルカリホスファターゼであり得る。

【0015】

これらの組成物のいずれもが、家禽またはブタへの投与に好適であり得る。

【0016】

これらの組成物のいずれもが、動物飼料（例えば、離乳食餌、育成食餌または仕上げ食餌）であってもよいし、動物飼料添加物であってもよい。

【0017】

以下の記述において使用されるように、用語「ａ」または「ａｎ」は、別段特定されない限り、１つ以上を包含すると理解されるべきである。

【0018】

本明細書中で使用されるとき、用語「動物」とは、ヒトおよび他の動物（コンパニオンアニマル（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウシおよび他の反芻動物、スイギュウ、ウマ、ブタ（例えば、子ブタまたは雄ブタ）、ヒツジ、家禽（ｆｏｗｌ）または家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウおよびガチョウ）および水産養殖動物（例えば、魚類ならびにエビおよびウナギ））を含む）を含む任意の動物のことを指す。幼若動物は、離乳（または離乳前）カテゴリーまたは育成カテゴリーに入る動物である。好ましくは、幼若動物は、離乳（または離乳前）カテゴリーに入る。ブタの場合、２５キログラム未満の動物も、幼若動物とみなされる。

【0019】

動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物（例えば、アンモニア（ＮＨ_３）またはリン（Ｐ））の量を減少させるのに有効な酵素を動物に投与する工程を含む方法およびそのような方法における使用に適した組成物が本明細書中に記載される。その方法は、家禽およびブタの生産を含む動物生産の状況においていくつかの利点を提供する。例えば、その方法は、動物生産システムへのリン酸投入量の減少、動物糞便中のアンモニアの減少、動物舎の屋内アンモニア濃度を希薄化するための循環空気の所要量の減少（およびそれに伴う省エネルギー）、および排気をさらに処理する必要性の低下などの利点を提供し得る。

【0020】

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、下記に報告される結果は、本明細書中に記載される方法が、動物（例えば、幼若ブロイラー）がその食餌中に存在するリンを利用および消化することを助け得、そしてその後、成長速度をより良好にし得ることおよび排出による栄養分損失をより少なくし得ることを示唆する。さらにまたはあるいは、酵素処置によって、腸内の好ましい細菌集団の代謝および増殖が高まることがあり、食餌中のより一層の過剰量の窒素が、通常は分解されてＮＨ_３として排出される尿酸の代わりに細菌タンパク質として糞便に残るので、本明細書中に記載される方法は、ＮＨ_３排出を減少させ得る。さらに、処置動物の糞便におけるより低いｐＨとより少ない窒素含有量の両方が、糞便中での気体ＮＨ_３の形成を抑止および阻止し得、ＮＨ_３排出を減少させ得る。尿酸（家禽糞便中の主要な窒素源）のｐＨと分解との関係は、ｐＨの急激な上昇が家禽糞便の尿酸含有量の減少に関連し得ると報告されている。Ｅｌｌｉｏｔ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９８２，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＡＳＡＥ ２５：４１３−２４は、貯蔵糞便における高ｐＨが、ＮＨ_３としての窒素損失の大部分をもたらし得ることを示唆した。さらに、動物排泄物のリン含有量の減少は、細菌叢などの糞便の他の特性に影響し得る。

【0021】

特定の実施形態において、酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（ＥＣ３．１．３．１）である。アルカリホスファターゼは、原核生物、および哺乳動物（ヒトを含む）を含む真核生物に存在する。例えば、アルカリホスファターゼは、天然には、母乳および腸に存在し、消化および消化制御において重要な役割を果たす。アルカリホスファターゼは、治療の状況（例えば、癌、糖尿病および体重減少の処置）において使用するために研究されている。様々なアルカリホスファターゼの１次構造の比較から、高い相同性が示された（Ｅ．ｃｏｌｉと哺乳動物との間で２５〜３０％の相同性）。Ｍｉｌｌａｎ，１９８８ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８，９９５−１００４；Ｈａｒｒｉｓ，１９８９ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １８６，１３３−１５０。アルカリホスファターゼファミリーとしては、組織特異的ＡＰ（胎盤ＡＰ（ＰＬＡＰ）、生殖細胞ＡＰ（ＧＣＡＰ）および腸管ＡＰ（ｌＡＰ）、ならびに主に肝臓、腎臓および骨に位置する組織非特異的ＡＰ（ＴｎＡＰ）が挙げられる。米国特許第６，８８４，６０２号は、酵母におけるアルカリホスファターゼの発現を報告している。数百の微生物アルカリ（ａｌａｋａｌｉｎｅ）ホスファターゼが記載されている。例えば、ＢＲＥＮＤＡ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ−ｅｎｚｖｍｅｓ．ｏｒｇｌｐｈｐ／ｒｅｓｕｌｔ ｆｌａｔ．ｐｈｐ４？ｅｃｎｏ＝３．１．３．１を参照のこと。さらに、高い活性などの所望の特性を有する酵素を産生するように生物を操作することができる。例えば、Ｄｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．ＢｉｏＩ．３１６：９４１−５３（２００２）；Ｄｅａ１ｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：１３９６７−７３（１９９５）；Ｋｏｕｔｓｉｏｕｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ’ｇ Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２１：３１９−２７（２００８）を参照のこと。

【0022】

本発明は、配列番号１のアルカリホスファターゼ、または配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼも提供する。以下は、配列番号１である：
ＶＮＫＬＬＫＧＬＡＩＧＧＩＶＬＡＶＶＳＡＧＴＬＡＶＡＫＥＮＡＳＲＡＥＳＳＮＧＱＳＫＮＬＩＶＬＩＧＤＧＭＧＰＡＱＶＳＡＡＲＹＦＱＱＨＫＮＮＩＮＳＬＮＬＤＰＹＹＶＧ
ＱＡＴＴＹＡＤＲＧＥＤＧＧＨＩＶＳＧＩＶＴＳＳＡＳＡＧＴＡＦＡＴＧＮＫＴＹＮＡＡＩＳＶＳＮＥＤＶＳＲＰＦＡＳＶＬＥＡＡＥＬＳＧＫＳＴＧＬＶＴＴＡＲＩＴＨＡＴＰＡ
ＶＹＡＳＨＶＲＳＲＤＮＥＮＡＩＡＦＱＹＬＤＳＧＩＤＶＬＬＧＧＧＥＳＦＦＶＴＫＥＥＫＧＫＲＮＤＫＮＬＬＰＥＦＥＡＫＧＹＫＶＶＫＴＧＱＳＬＫＳＬＳＡＫＤＡＫＶＬＧＬ
ＦＧＧＳＨＩＡＹＶＰＤＲＳＤＥＴＰＳＬＡＥＭＴＳＫＡＬＥＩＬＳＴＮＥＮＧＦＡＩＭＩＥＧＧＲＩＤＨＡＧＨＡＮＤＦＰＴＭＶＱＥＡＬＤＦＤＥＡＦＫＶＡＩＤＦＡＫＫＤＧ
ＮＴＳＶＶＶＴＡＤＨＥＴＧＧＬＳＬＳＲＤＮＩＹＥＬＮＶＤＬＷＮＫＱＫＮＳＳＥＳＬＶＳＡＬＮＥＡＫＴＩＡＤＶＫＫＩＶＳＤＮＴＷＩＴＤＬＴＮＥＥＡＱＹＩＬＤＧＤＧＳ
ＳＹＫＲＥＧＧＹＮＡＶＩＳＫＲＬＬＶＧＷＳＧＨＧＨＳＡＶＤＶＧＶＷＡＹＧＰＩＡＤＫＶＫＧＱＩＤＮＴＲＩＡＴＡＳＡＥＶＬＧＶＤＬＫＫＡＴＡＤＬＱＳＫＹＬＹＰＫＦＫ
ＩＮＲＮＫＥＶＬＦＰＡＫＰＬＡＥＡＬＧＧＫＹＱＡＡＮＧＴＡＴＩＳＧＭＳＧＴＩＴＶＤＬＮＡＫＫＡＫＬＳＧＮＳＳＳＩＴＩＤＶＤＮＤＶＬＹＬＰＬＴＡＦＳＱＩＴＧＱＴＬ
ＫＷＤＡＬＳＥＲＩＭＬＫ

【0023】

本発明は、配列番号１と少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するアルカリホスファターゼも提供する。本発明は、上記アルカリホスファターゼの少なくとも１つを含む組成物、ならびに動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される１つ以上の有害な化合物の量を減少させるため、動物の飼料転換率を増加させるため、動物の飼料効率を増加させるためおよび／または動物の成長速度を高めるために、そのようなアルカリホスファターゼを使用する方法も提供する。

【0024】

配列同一性とは、配列比較アルゴリズムを使用するまたは手動でのアラインメントおよび目視検査によって比較され、比較範囲または測定される指定の領域にわたって対応が最大になるようにアラインメントされるとき、特定のパーセンテージの同一アミノ酸残基を有する（すなわち、例えば、少なくとも７０％の同一性を共有する）配列のことを指す。

【0025】

特定の実施形態において、上記方法は、動物の廃棄物に存在するまたは動物の廃棄物から放出されるアンモニア（ＮＨ_３）またはリンの量を減少させるのに有効な量のアルカリホスファターゼなどの酵素を動物に投与する工程を含む。その量は、動物、動物の食餌および他の因子に応じて変動し得、当該分野で公知の方法を使用して当業者によって容易に決定され得、実施例に例証され得る。例えば、所与の動物が所与の条件下で生育されたときの動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるアンモニア（ＮＨ_３）および／またはリンの量は、測定することができ、同等の条件下で生育されただけでなくアルカリホスファターゼなどのある量の酵素も投与された動物の動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される量と比較することもできる（この点において、下記の実施例に記述されるように、糞便の特性は齢とともに変化し得るので、同齢の処置動物とコントロール動物とを比較することが有益であり得る）。酵素の投与に伴う糞便のアンモニア（ＮＨ_３）および／もしくはリンの含有量または放出の減少は、有効量の酵素が投与されたことを示唆する。

【0026】

酵素は、典型的には、経口的に投与される。しかしながら、本発明は、酵素が、公知の慣習に従って他の経路によって腸または消化管に投与される（例えば、坐剤などを介して）実施形態も包含する。

【0027】

酵素は、経口投与に適した任意の形態（例えば、液体、固体、粉末、ゲルなど）で提供され得る。酵素は、単独で投与され得るか、または経口投与に適した任意の組成物として製剤化され得る。いくつかの実施形態において、経口投与に適した組成物は、動物への経口投与にとって安全であると広く認識される。例えば、経口投与に適した組成物は、動物への経口投与にとって安全であると広く認識されている成分だけ、およびそのように認識されている量の前記成分を含み得、かつ動物への経口投与にとって安全であると広く認識されないいかなる成分も含まないか、またはそのように認識されていない量の前記成分を含まない。さらにまたはあるいは、経口投与に適した組成物は、動物への経口投与に対して許容されているもしくは禁止されていない成分だけ、およびそのような量の前記成分を含み、かつ動物への経口投与に対して許容されていないもしくは禁止されているいかなる成分も含まないかまたはそのような量の前記成分を含まない。

【0028】

いくつかの実施形態において、組成物は、酵素に対する経口的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用されるとき、「経口的に許容可能な担体」は、経口投与に適した任意の生理的に許容可能な担体を含む。経口的に許容可能な担体としては、動物飼料製品における使用および／または動物への経口投与に適した、動物飼料組成物、水性組成物ならびに液体および固体の組成物（液体および固体の動物飼料添加物を含む）が挙げられるがこれらに限定されない。好適な担体は、当該分野で公知であり、その好適な担体としては、米国特許第６，７８０，６２８号に記載されている担体が挙げられる。

【0029】

いくつかの実施形態において、組成物は、動物飼料である。本明細書中で使用されるとき、用語「動物飼料」は、畜産の分野におけるその従来の意味を有する。例えば、動物飼料は、家畜がその栄養的価値のために消費する可食の材料を含む。動物飼料は、飼料配給量（ｆｅｅｄ ｒａｔｉｏｎｓ）、例えば、動物の栄養所要量を満たす組成物を含み、動物の栄養所要量を満たさない組成物も含む。いくつかの実施形態において、動物飼料は、離乳期間中に使用するために製剤化された離乳飼料である。他の実施形態において、動物飼料は、育成期間中に使用するために製剤化された育成飼料である。他の実施形態において、動物飼料は、仕上げ期間において使用される仕上げ飼料である。

【0030】

動物飼料の実施形態の特定の例において、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）の量は、飼料１米トンあたり少なくとも約１０，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約１５，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約２０，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約２５，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約３０，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約３５，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約４０，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約４５，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１米トンあたり少なくとも約５０，０００国際単位（ＩＵ）、飼料１トンあたり少なくとも約６０，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約７０，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約８０，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約９０，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約１００，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約２００，０００ＩＵ、飼料１トンあたり少なくとも約５００，０００ＩＵもしくは飼料１トンあたり少なくとも約３，０００，０００ＩＵまたはそれ以上である。

【0031】

いくつかの実施形態において、酵素の量は、約２５〜約７５ＭＵ／トンの範囲内である（ＭＵ＝１２４，０００ＩＵ）。いくつかの実施形態において、酵素の量は、少なくとも約２ＭＵ／トン（２４０，０００ＩＵ／トンまたは２６４ＩＵ／ｋｇ）である。

【0032】

動物飼料実施形態の他の特定の例において、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）の量は、少なくとも約１０ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも約１５ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも約２０ＩＵ／ｋｇ飼料、例えば、少なくとも２０ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも２５ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも３０ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも３５ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも４０ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも４５ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも５０ＩＵ／ｋｇ飼料、少なくとも５５０ＩＵ／ｋｇまたはそれ以上である。

【0033】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物（例えば、アンモニア（ＮＨ_３）および／またはリン）の量を減少させるおよび／またはリンの消化を増加させるのに有効な量のアルカリホスファターゼなどの酵素を含む動物飼料を提供する。

【0034】

飼料組成物は、当該分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、酵素は、当業者によって適切であると見なされる製造プロセス中の任意の段階において他の飼料成分に加えられ得る。１つの実施形態において、酵素は、溶液（例えば、製造プロセス中に他の飼料成分に加えられる液体酵素濃縮物）として提供される。あるいは、酵素含有溶液が、実質的に最終的な形態の動物飼料に噴霧される。別の実施形態において、酵素は、固体組成物（例えば、粉末）（例えば、製造プロセス中に他の飼料成分に加えられる固体組成物）として提供される。酵素含有飼料を製造するための例示的な方法は、ＷＯ９７／４１７３９に記載されている。

【0035】

いくつかの実施形態において、組成物は、動物飼料以外である。例えば、組成物は、動物飼料以外の液体組成物または動物飼料以外の固体組成物であり得る。そのような組成物は、動物への直接投与に好適であり得るか、または飼料添加物（例えば、給餌の前に飼料に加えられるもの）もしくは飼料サプリメント（給餌の前に他の飼料成分で希釈されるサプリメントおよび自由選択の別個の根拠に基づいて動物に提供されるサプリメントを含む）として使用され得る。動物飼料以外の液体組成物の例としては、液体酵素濃縮物（典型的には、動物に経口投与する前に、他の成分で希釈されるかまたは他の成分と混和される液体酵素濃縮物を含む）が挙げられる。

【0036】

組成物が酵素溶液などの動物飼料以外の液体組成物である実施形態において、その液体組成物または溶液は、溶液１リットルあたり少なくとも約４０，０００国際単位（ＩＵ）（例えば、少なくとも４０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも５０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも６０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも７０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも８０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも９０，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも１００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約５００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約６００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約７００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約８００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約９００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約１，０００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約２，０００，０００ＩＵ／Ｌ、少なくとも約５，０００，０００ＩＵ／Ｌまたは少なくとも約２００，０００，０００ＩＵ／Ｌ）の量で酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）を含み得る。

【0037】

いくつかの実施形態において、動物飼料以外のある量の液体組成物（例えば、約５００ｍＬまたは１０００ｍＬの溶液）は、上に記載された酵素レベルを有する飼料配合物に到達するようにある量の飼料（例えば、１トンの飼料）に適用されるか、またはそのような量の飼料と混和される。他の実施形態において、動物飼料以外のある量の液体組成物は、動物排泄物に存在するもしくは動物排泄物から放出される有害な化合物（例えば、アンモニア（ＮＨ_３）および／またはリン）の量を減少させるおよび／またはリンの消化を増加させるのに有効な量の酵素を含む動物飼料を調製するために、ある量の飼料に適用されるかまたはとそのような飼料と混和される。

【0038】

組成物が動物飼料以外の固体組成物である実施形態において、その組成物は、少なくとも約４０，０００ＩＵ／ｋｇ（例えば、少なくとも４０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも５０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも６０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも７０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも８０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも９０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも１００，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも１２０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも１４０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも１６０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも１８０，０００ＩＵ／ｋｇ、少なくとも２００，０００ＩＵ／ｋｇもしくは少なくとも６０，０００，０００ＩＵ／ｋｇまたはそれ以上）の量で酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）を含み得る。

【0039】

いくつかの実施形態において、動物飼料以外のある量の固体組成物は、上に記載された酵素レベルを含む飼料配合物に到達するようにある量の飼料に適用されるか、またはそのような量の飼料と混和される。他の実施形態において、動物飼料以外のある量の固体組成物は、動物排泄物に存在するもしくは動物排泄物から放出される有害な化合物（例えば、アンモニア（ＮＨ_３）および／またはリン）の量を減少させるおよび／またはリンの消化を増加させるのに有効な量の酵素を含む動物飼料を調製する量の飼料と混和される。

【0040】

他の実施形態において、酵素は、経口摂取用のカプセルまたは錠剤の形態で提供される。

【0041】

当該分野における従来のとおり、用語「ＩＵ」または「国際単位」とは、その酵素にとって最適な条件下において１分あたり１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量のことを指す。本明細書中で使用されるとき、「ＭＵ」（Ｍｉｌｌｉｏｎ Ｃｈｅｍｇｅｎ単位）＝１２０，０００ＩＵ（１ＩＵ＝８．３３ＣｈｅｍＧｅｎＵ）である。多くの酵素に対する重量当量（Ｗｅｉｇｈｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）は、当該分野で公知であり、標準的なアッセイを用いて測定することができる。当該分野で公知であるように、緩衝液および／または基質の選択は、測定される単位に影響し得る。アルカリホスファターゼ活性に対する標準的なアッセイは、当該分野で公知である。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ１．１：９−１４（１９７９）；Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｉｎｅ Ｅｃｏｌ．Ｐｒｏｇ．Ｓｅｒ．１６４：２１−３５（１９９８）；Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４９：１７１−７６（２０１１）；Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｎｏｔｅｓ ７４：７−９を参照のこと。

【0042】

本発明の１つの実施形態において、本発明の乾燥組成物は、完成飼料１メートルトンあたり１００ｇより多い量で存在する。本発明の１つの実施形態において、本発明の乾燥組成物は、完成飼料１メートルトンあたり５００ｇより多い量で存在する。

【0043】

本発明の１つの実施形態において、本発明の乾燥組成物は、濃縮プレミックス１メートルトンあたり１０ｇ〜３０ｇの量で存在する。本発明の１つの実施形態において、本発明の乾燥組成物は、濃縮プレミックス１メートルトンあたり約２０ｇの量で存在する。

【0044】

本発明の１つの実施形態において、本発明の液体組成物は、完成飼料（液体）１メートルトンあたり１００ｍｌ未満の量で存在する。本発明の１つの実施形態において、本発明の液体組成物は、完成飼料（液体）１メートルトンあたり５０〜１００ｍｌの量で存在する。

【0045】

本明細書中に記載される方法および組成物の任意の実施形態における使用に対して、アルカリホスファターゼなどの酵素は、商業的供給源から入手することができる。あるいは、酵素（アルカリホスファターゼを含む）は、酵素を産生する微生物（例えば、細菌、真菌および酵母）から得ることができる。

【0046】

さらに、酵素は、当該分野で公知の組換え技術法を用いて、例えば、酵素を産生するように宿主細胞を遺伝的に操作することによって、例えば、酵素をコードする遺伝子の転写および翻訳を引き起こすことによって、得ることができる。公知のアミノ酸配列またはそれらの配列をコードする公知のヌクレオチド配列を用いて、当業者は、酵素の組換え発現に適した遺伝子をデザインすることができる。さらにまたはあるいは、アルカリホスファターゼなどの公知の酵素をコードするヌクレオチド配列を使用してＤＮＡライブラリーを探索することにより、本明細書中に記載される方法における使用に適した酵素をコードする他のヌクレオチド配列を識別することができる。当該分野で公知であるように、そのようなＤＮＡライブラリーは、規定の生物もしくは生物集団から得ることができるか、または自然源から得ることができ、ゆえに、培養しにくい微生物由来のＤＮＡに相当する。

【0047】

本明細書中に記載される方法および組成物の任意の実施形態において、アルカリホスファターゼなどの酵素は、動物飼料に使用される植物によって発現され得る。例えば、トウモロコシを、アルカリホスファターゼを発現するように遺伝的に操作することができ、得られた遺伝的に改変されたトウモロコシ生成物を、飼料に使用することができる。他の遺伝的に改変されたまたは古典的に改変された系、例えば、細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；酵母、例えば、Ｐｉｃｈｉａ、Ｙａｒｒｏｗ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ）および他の真菌類（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、ＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍおよびＨｕｍｉｃｏｌａ）を用いて産生させることもできる。特定の実施形態において、アルカリホスファターゼなどの酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓから得られる。

【0048】

組成物が酵素の組み合わせを含む実施形態において、それらの酵素は、個々に別個の生物によって産生されてもよいし、それらの酵素の２つ以上が、単一の生物によって産生されてもよい。例えば、単一の生物を、当該分野で公知の方法によって２腫以上の酵素を産生するように組換え的に操作することができる。

【0049】

上で述べたように、本発明は、動物排泄物の環境影響を減少させるための方法を含み、その方法は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。本発明はまた、動物排泄物中のアンモニアの量を減少させるための方法も含み、その方法は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるアンモニアの量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。本発明はまた、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるリンの量を減少させるための方法も含み、その方法は、動物排泄物に存在するリンの量を減少させる有効量の酵素を動物に投与する工程を含む。その酵素は、単独で、または上に記載された任意の組成物（動物飼料などの経口組成物、動物飼料以外の液体組成物、または動物飼料以外の固体組成物を含む）として、投与され得る。その動物は、任意の動物（ヒトまたは食肉生産動物を含む）であり得、健常な動物あるいは感染症または他の疾患もしくは状態に罹患している動物であり得る。

【0050】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、経口的に投与され得、アルカリホスファターゼであり得る。

【0051】

これらの方法のいずれかにおいて、動物は、家禽動物（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウまたはガチョウ）またはブタ動物（例えば、子ブタまたは雄ブタ）であり得る。これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、離乳期、育成期および／もしくは仕上げ期の１つ以上の間に、または任意の段階もしくはすべての段階において投与され得る。

【0052】

これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、動物飼料（離乳飼料、育成飼料または仕上げ飼料を含む）として製剤化され得る。あるいは、これらの方法のいずれかにおいて、酵素は、動物飼料の添加物として製剤化され得る。

【0053】

上で述べたように、本発明は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出される有害な化合物の量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物も含む。本発明は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるアンモニアの量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物も含む。本発明は、動物排泄物に存在するまたは動物排泄物から放出されるリンの量を減少させる有効量の酵素を含む、動物への経口投与に適した組成物も含む。これらの組成物のいずれかにおいて、組成物は、その酵素に対する経口的に許容可能な担体を含み得る。上で述べたように、酵素の有効量は、動物ごとおよび酵素ごとに異なり得るが、上に記載されたようにおよび実施例３に例証されるように、当業者によって容易に決定され得る。

【0054】

これらの組成物のいずれかにおいて、酵素は、アルカリホスファターゼであり得る。

【0055】

これらの組成物のいずれかにおいて、組成物は、家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウまたはガチョウ）またはブタ（例えば、子ブタまたは雄ブタ）への投与に好適であり得る。

【0056】

これらの組成物のいずれかにおいて、組成物は、離乳飼料食餌または育成飼料食餌などの動物飼料であり得る。あるいは、これらの組成物のいずれかにおいて、組成物は、動物飼料添加物であり得る。

【0057】

本発明の実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のさらなる活性成分が使用され得る。さらなる活性成分の例は、本発明の酵素と同じまたは異なる特性を有し得る別の酵素である。

【0058】

以下の実施例は、本発明をさらに例証するものであって、本発明は、詳細に例示される実施形態に限定されない。

【実施例】

【0059】

実施例１
２つの飼料添加物処理（マンナナーゼＨＴ−「ＨＴ」およびアルカリホスファターゼ「ＡＰ」）からの、ブロイラー糞便サンプルのアンモニア（ＮＨ_３）排出を、６週間の成長完了（ｇｒｏｗ−ｏｕｔ）期間中に評価した。マンナナーゼＨＴを６０ＭＵ／トン（２４０，０００ＩＵ／トン）で加え、ＡＰを１４１ＭＵ／トンの平均値で加えた。３つの処理（コントロールを含む）によるブロイラーの飼料および水の消費量、糞便生成量ならびに飼料効率を測定し、報告した。新鮮糞便サンプルの窒素含有量、水分含有量およびｐＨを解析した。この実験を、気温および換気速度が制御された排出容器内で行った。

【0060】

ブロイラー鳥への添加物の供給は、気体の排出および生成成績に対して以下の影響を及ぼすと示された：
（ａ）ＨＴまたはＡＰを与えられたブロイラーに対して観察された飼料消費量、飼料効率、糞便水分含有量およびｐＨは、コントロール食餌を与えられた鳥と比べて有意差はなかったが、ＡＰ食餌からの糞便は、コントロール群の糞便よりも低いｐＨを示した。
（ｂ）ＨＴ群とコントロール群との間にＮＨ_３の排出率（ＥＲ）および累積排出量に差はなかった。
（ｃ）ＡＰ食餌を与えられたブロイラーは、コントロール食餌およびＨＴ食餌を与えられたブロイラーよりもＮＨ_３排出が少ない傾向があった。
（ｄ）ＮＨ_３ＥＲは、２８および４２日から劇的に変化し、指数関数的に増加した。
（ｅ）ＡＰ食餌によるＮＨ_３ＥＲの有効性は、３つの試験期間中、齢依存的である傾向があった。
（ｔ）５日間の貯蔵期間にわたる全体のＮＨ_３ＥＲ率は、ＡＰ群の３５日齢の鳥では−７．４％および２８日齢の鳥では４２．２％だった。

【0061】

材料および方法
１１７羽の１日齢の雌Ｒｏｓｓ７０８ヒヨコを、３つの育雛室（ｂｒｏｏｄｉｎｇ ｈｏｕｓｅｓ）（７．４ｆｔ×７．４ｆｔ，Ｗ×Ｌ）に等しく分配した。単一の檻を備える各育雛室内の鳥に４日齢においてＣｏｃｃｉｄｉａ生ワクチンを接種し、それらの鳥は、水および３種の実験食餌（ＨＴ、ＭＴまたはコントロールを含む離乳食餌）のうちの１つを自由に摂取できた。育雛室は、同じ温度設定および照明プログラムを有した。２０日齢になった後、９６羽を、換気された家禽舎（９ｆｔ×９ｆｔ，Ｗ×Ｌ）内の成長完了ケージに移し、１ケージ（３０ｉｎ×５９ｉｎ，Ｗ×Ｌ）あたり８羽の群で収容した。

【0062】

引き続いて、成長完了に向けてそれらの鳥に対して３種の育成食餌を与えた。各ケージ内の８羽はすべて、３つの処理のうちの１つ由来だった。３５日齢になった後、６羽を各ケージに残して、動物福祉の基準を満たした。合計１２個のケージを、位置の影響を最小にするために、ランダムに３種の食餌に割り当てた。各ケージ内の鳥の新鮮糞便を、５日間にわたるＮＨ３排出の評価および解析のために２３、２８、３５および４２日目に糞便パンを用いて回収した。

【0063】

１２個の５ガロン（１９リットル）排出容器（ＥＶ）を使用して、評価を行った。各バッチの１２個の糞便サンプルを回収し、２．２ｌｂ（１ｋｇ）２．２ｌｂ（１ｋｇ）の糞便サンプルを、各サンプルが５０インチ^２（３２４ｃｍ^２）の表面積を有するようにランダムに１２個のＥＶに入れ、６８°Ｆ（２０℃）の気温および６．４ｆｔ^３／時（３Ｌ／分）の気流速度を用いた５日間にわたって、気体の排出について測定した。吸気口と排気口の両方に、気密性の蓋を設置した。テフロン管（直径１１４ｉｎまたは０．６３５ｃｍ）を排出容器系において使用した。それらの容器を陽圧下で操作した。隔膜ポンプ（Ｍｏｄｅｌ ＤＤＬ−８０，Ｇａｓｔ Ｉｎｃ．，Ｂｅｎｔｏｎ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、排出容器に新鮮な空気を供給した。その新鮮な供給空気の流速は、空気流量制御装置（０〜１００ＬＰＭ、ステンレス鋼の湿った部品を備える、Ａａｌｂｏｒｇ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）を用いて制御され、測定された。供給空気は、１２個の同一の流量計（０．２〜５ＬＰＭ，ステンレス鋼弁，Ｄｗｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ，ＩＮ）を介して空気をさらに分割する分配マニホールドに接続された。各容器は、１．５ヘッドスペースを均一に混合するために、蓋の２ｉｎ（５ｃｍ）下に位置する小型の撹拌ファン（１２ＶＤＣ）を備えた。それらの容器から排出された気体を、建物の排気口に通じる通常の１．５ｉｎ（３．７５ｃｍ）のＰＶＣ管に接続した。１２個の容器の各々からの排気サンプルおよび供給空気サンプルを、安定化のための最初の３分および測定のための最後の２分とともに、５分間隔で連続的に採取し、解析した。これにより、各容器に対して６５分間の測定サイクルがもたらされた。この連続的なサンプリングを、１２個のソレノイド弁（Ｔｙｐｅ６０１４，２４Ｖ，ステンレス鋼弁本体．Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の制御された操作によって行った。毎週検証して必要に応じてゼロ校正された光音響マルチガスアナライザー（ＩＮＮＯＶＡ １４１２，ＩＮＮＯＶＡ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＮＨ_３較正用ガスを用いてＮＨ_３濃度を測定した。気温を、タイプＴ熱電対（０．５°Ｆ分解能）を用いて測定した。熱電対、マルチガスアナライザーおよび質量流量計からのアナログ出力を、１秒間隔でサンプリングし、１分間隔で測定および制御ユニット（ＵＳＣ−２４１６，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）に記録を残した。

【0064】

排出測定を完了するために７週間を用いた。糞便の栄養分および特性（全ケルダール態窒素（ＴＫＮ）、アンモニア態窒素、水分およびｐＨを含む）の解析のために、凍結糞便サンプル（０．２５ｌｂ／サンプル）をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｌａｗａｒｅの土壌および水の検査研究室に送付した。ＪＭＰ９．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して統計解析を行った。食餌の影響は、Ｐ値≦０．０５において有意であると見なした。

【0065】

生成成績および糞便特性
３種の食餌からのブロイラーの生成成績および新鮮糞便特性を、表１および２に示す。

【表1】

【表2】

【0066】

生成成績および糞便特性について、３種の食餌の間に有意差は無かった（０．０５のＰ）。３種の食餌からの窒素含有量（アンモニア態窒素：ＮＨ_４^＋−Ｎおよび全ケルダール態窒素：ＴＫＮ）は、類似のレベルだった（Ｐ＞０．２８）。ＨＴおよびＡＰ食餌は、成長完了の間、わずかにより低い糞便ｐＨを有する傾向があった。より幼若な鳥の新鮮糞便は、より高齢の鳥よりも酸性だった。

【0067】

アンモニアの排出および減少
３種の食餌に対する５日間の貯蔵期間にわたるＮＨ_３の１日ＥＲおよび累積排出量を表３に要約し、示す。

【表3】

【0068】

ＮＨ_３ＥＲは、ＡＰ食餌に対する５日間の貯蔵期間中、２３および２８日が最も低かった。ＨＴ食餌とコントロール食餌との間にＮＨ_３ＥＲおよび累積排出量の差は無かった。ＡＰ食餌とコントロール食餌との間にいくらかの有意差があった（Ｐ＜０．０５）。例えば、２８日齢の鳥の４日目および５日目のＮＨ_３ＥＲは、有意に低かった（Ｐ＝０．０２）。ＮＨ_３ＥＲは、２８および４２日から劇的に変化し、指数関数的に増加した。例えば、５日間の貯蔵の２日目の３５日齢の鳥のＥＲは、１８．２ｍｇ／羽／日であり、これは、２８日齢の鳥のＥＲ（１．０１ｍｇ／羽／日）よりもかなり高かった。この変化は、糞便のｐＨが５．５未満から６．５に上昇する傾向に関連し得る。アンモニア態Ｎは、ＮＨ_４^＋の形態であり、低ｐＨでは揮発性ではない。

【0069】

ＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性は、この試験期間中、齢依存的である傾向があった。ＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性は、鳥の齢が上がるにつれて低下した（表４）。

【表4】

【0070】

比較すると、ＮＨ_３ＥＲの減少は、貯蔵時間後に、ＡＰ食餌の場合、２３日齢の鳥の５７．７％から４２日齢の鳥の１９．１％まで様々だった。５日間の全ＮＨ_３排出減少率は、ＡＰレジメンの場合、３５日齢の鳥で−７．４％および２８日齢の鳥で４２．２％だった。

【0071】

微生物の活性がかなり変動するので、変動する食餌の有効性の結果は、糞便特性、特に、水分含有量およびｐＨの変化に起因し得る。生産条件下において、幼若な鳥を含むブロイラー舎は、限られた換気、暖房エネルギーの節約およびガス使用量の減少に起因して鳥のレベルにおいてより高いＮＨ_３濃度を有する傾向がある。幼若な鳥を含むブロイラー舎からのＮＨ_３排出を減少させることは、健常な群を確立することおよび高ＮＨ_３濃度に関連する疾患発生のリスクを低下させることを助けるだろう。

【0072】

実施例２
この研究では、酵素飼料添加物（アルカリホスファターゼ−ＡＰ）を与えられたブロイラーチキンのアンモニア（ＮＨ_３）排出を、３０日の成長完了期間中に評価した。それらのブロイラーを、１２日齢まで木の削りくずの上で育雛させ、残りの成長完了期間はケージに移動させた。新鮮糞便を、１４、２２および３０日目に回収し、気温および換気速度を制御して、排出容器内でＮＨ_３排出について試験した。ブロイラーの飼料および水の消費量、糞便生成量ならびに飼料効率を測定し、報告した。新鮮糞便サンプルの栄養分含有量、水分およびｐＨを解析した。ブロイラー鳥への酵素添加物の供給は、気体の排出および生成成績に対して以下の影響を及ぼすと示された：
（ａ）ＡＰ食餌は、２２および３０日齢においてブロイラーの成長および飼料効率比を改善した
（ｂ）ＡＰ食餌は、２２日齢において糞便のｐＨを低下させ、１４および２２日齢においてリンを６および７％減少させた
（ｃ）ＮＨ_３排出が、１４日齢における４日間で有意に２３．８％減少した。
（ｄ）４日間にわたる全ＮＨ_３排出の減少率は、３０日齢の鳥で５．９％および２２日齢の鳥で３０．７％だった。

【0073】

材料および方法
新しい木の削りくずが入った４つの温度制御小屋（７．４ｆｔ×７．４ｆｔ，Ｗ×Ｌ）を、育雛のために使用した。各育雛室は、１つのカップ式給水器（直径１フィート）および１つの給餌器（直径１フィート）とともに、１つの１．５ｋＷ室内暖房具および１５０Ｗ加熱ランプを備えた。同じ飼育者の群の１４８日齢雌Ｒｏｓｓ７０８雌ヒヨコの２つの群（３日の隔たり）を集め、２つの育雛室に等しく分配した（１つの育雛室につき７４羽）。単一の檻を備える各育雛室内の鳥にＣｏｃｃｉｄｉａ生ワクチンを接種し、それらの鳥は、水および２種の実験食餌（ＡＰおよびコントロール）を自由に摂取できた（ＡＰは、離乳食餌と育成食餌の両方に６０ＭＵ／トンで加えられていた）。それらの育雛室は、同一の温度設定および照明プログラムを有した。それらの鳥は、２種の食餌：コントロールおよびＡＰを自由に摂取できた。１２日後、１ケージあたり１２羽の群を、２つの同一の育雛室（９ｆｔ×９ｆｔ，Ｗ×Ｌ）内の成長完了ケージ（３０ｉｎ×３０ｉｎ，Ｗ×Ｌ）に移した（育雛室１つにつき１２個のケージ）。各ケージは、２つのニップル式給水器、１つのトラフ（ｔｒｏｕｇｈ）給水器（２．５ｉｎ×３０ｉｎ，Ｗ×Ｌ）および１つのトラフ給餌器（５ｉｎ×３０ｉｎ，Ｗ×Ｌ）を有した。鳥の数を、２２日齢において１ケージあたり８羽に減少させた。合計２４個のケージを、育雛室の影響を最小にするために、ランダムなブロックデザインによって２つの育雛室に割り当てた。同じ育雛室の中の鳥は、同じ齢だった。照明プログラムは、育雛期間の場合、２３：１時間（明期：暗期）であり、残りの成長完了の場合、２４時間明期だった。各育雛室の温度を、５分間隔で測定し、温度ロガー（ＨＯＢＯ Ｕ２３，Ｏｎｓｅｔ Ｃｏｍｐ．，Ｐｏｃａｓｓｅｔ，ＭＡ）によって記録した。鳥を０、１２、１４、２２および３０日目に計量した。飼料の使用量を毎日記録し、飼料効率比（ＦＣＲ）を計算した。離乳食餌は、以下のとおりだった：

【表5】

【0074】

育成食餌は、以下のとおりだった：

【表6】

【0075】

ステンレス鋼の糞便パンを使用して、ブロック１のケージから１２、２０および２８日目に、ならびにブロック２のケージから１３、２１および２９日目に、２日間にわたって新鮮糞便を回収した。１２個の２．２ｌｂ（１ｋｇ）糞便サンプルを、それぞれブロック１については１４、２２および３０日目に、ブロック２については１５、２３および３１日目に、ＮＨ_３排出試験のために採取した。さらなる０．５ｌｂサンプルを−２０℃冷凍庫で保管し、栄養分および特性の解析のために、認定された研究室（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）に送付した（その解析は、全ケルダール態窒素（ＴＫＮ）、アンモニア窒素（ＮＨ_３−Ｎ）、リン（Ｐ_２０_５として報告される）、カリウム（Ｋ_２０）、硫黄（Ｓ）、水分およびｐＨを含んだ）。

【0076】

１２個の５ガロン（１９リットル）排出容器（ＥＶ）を使用して、ＮＨ_３排出評価を行った。各ブロックの１２個の糞便サンプルを回収し、２．２ｌｂの糞便サンプルを、各サンプルが５０インチ^２（３２４ｃｍ^２）の表面積を有するようにランダムに１２個のＥＶに入れ、７５°Ｆ（２４Ｃ）の気温および６．４ｆｔ^３／時（３Ｌ／分）の気流速度を用いた４日間にわたって、気体の排出について測定した。吸気口と排気口の両方に、気密性の蓋を設置した。テフロン管（直径０．６３５ｃｍまたは１／４ｉｎ）を排出容器系において使用した。それらの容器を陽圧下で操作した。隔膜ポンプ（Ｍｏｄｅｌ ＤＤＬ−８０，Ｇａｓｔ Ｉｎｃ．，Ｂｅｎｔｏｎ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、排出容器に新鮮な空気を供給した。その新鮮な供給空気の流速は、空気流量制御装置（０〜１００ＬＰＭ、ステンレス鋼の湿った部品を備える、Ａａｌｂｏｒｇ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）を用いて制御され、測定された。供給空気は、１２個の同一の流量計（０．２〜５ＬＰＭ，ステンレス鋼弁，Ｄｗｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ，ＩＮ）を介して空気をさらに分割する分配マニホールドに接続された。各容器は、ヘッドスペースを均一に混合するために、蓋の２ｉｎ（５ｃｍ）下に位置する小型の撹拌ファン（１２ＶＤＣ）を備えた。容器から排出された気体を、建物の排気口に通じる通常の１．５ｉｎ（３．７５ｃｍ）のＰＶＣ管に接続した。１２個の容器の各々からの排気、供給空気および周囲空気のサンプルを、安定化のための最初の３分および測定のための最後の２分とともに、５分間隔で連続的に採取し、解析した。これにより、各容器に対して６５分間の測定サイクルがもたらされた。この連続的なサンプリングを、１２個のソレノイド弁（Ｔｙｐｅ６０１４，２４Ｖ，ステンレス鋼弁本体．Ｂｕｒｋｅｒｔ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）の制御された操作によって行った。毎週検証して必要に応じてゼロ校正された光音響マルチガスアナライザー（ＩＮＮＯＶＡ １４１２，ＩＮＮＯＶＡ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびＮＨ_３較正用ガスを用いてＮＨ_３濃度を測定した。気温を、タイプＴ熱電対（０．５°Ｆ分解能）を用いて測定した。熱電対、マルチガスアナライザーおよび質量流量計からのアナログ出力を、１秒間隔でサンプリングし、１分間隔で測定および制御ユニット（ＵＳＢ−２４１６，Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）に記録を残した。

【0077】

類似の齢の２つのブロックからのデータをプールし、食餌および齢の影響について解析した。ゆえに、１４〜１５日齢、２２〜２３日齢および３０〜３１日齢に相当するそれぞれ１４、２２および３０日齢の３つの年齢群を使用した。ＪＭＰ９．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、統計解析を行った。食餌の影響は、Ｐ値≦０．０５において有意であると見なした。

【0078】

生成成績および糞便特性
２種の食餌からのブロイラーの生成成績を表５に示す。

【表7】

【0079】

いずれの齢の糞便生成率も、ＡＰ食餌との有意差は無かった。ＡＰ食餌を摂取した鳥は、２２および３０日齢においてより良い成長速度を有した（Ｐ＝０．０３７および０．００６）。３０日齢では、ＡＰ群は、コントロール群より良いＦＣＲ（１．３６に対して１．３１）を有した（Ｐ＝０．０３）。

【0080】

２種の食餌の糞便特性を表６に示す。

【表8】

【0081】

この表は、ＡＰ食餌が、２２日齢において糞便のｐＨを低下させ（Ｐ＝０．０５）、１４日齢（Ｐ＝０．０５）および２２日齢（Ｐ＝０．０２）においてリンを減少させた（２．２２対２．３６％および２．１２対２．２７％）ことを示している。さらに、ＡＰ食餌が糞便中により少ないＮＨ_３−ＮおよびＴＫＮをもたらし得る傾向がある。

【0082】

これらの結果は、ＡＰ食餌が、幼若ブロイラーが窒素およびリンを利用および消化することを助け得、それにより、成長速度がより良くなり、排出による栄養分損失がより少なくなることを示唆する。糞便におけるより低いｐＨとより少ない窒素含有量の両方が、糞便中での気体ＮＨ_３の形成を抑止および阻止し得、ＮＨ_３排出を減少させ得る。

【0083】

アンモニアの排出
２種の食餌についての４日間にわたるＮＨ_３の１日排出率（ＥＲ）および累積排出量を表７に要約し、示す。

【表9】

【0084】

ＮＨ_３のＥＲおよび累積排出量は、ＡＰ食餌の場合、１４日齢において、４日間の貯蔵期間にわたって有意に減少した（ｐ≦０．０４）。ブロイラー糞便の累積ＮＨ_３排出は、ＡＰ食餌によって、４日間の貯蔵後に２３．８％減少した。１日排出率は、同様の減少傾向を有した。２２および３０日齢では、大きなばらつきに起因して２種の食餌の間にＮＨ_３のＥＲおよび累積排出量の差はなかった。しかしながら、ＡＰ食餌がなおも２２日齢においてＥＲおよび累積排出量を減少させる傾向がある（Ｐ＝０．１）。

【0085】

ＡＰ食餌による累積排出量の減少率は、２２日齢において３１〜３８％の範囲だった（表８）。

【表10】

【0086】

ＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性は、試験期間中、齢依存的だった。鳥の齢は、より幼若な鳥の糞便中のより少ない窒素含有量およびより低いｐＨに起因して、ＮＨ_３排出に有意に影響する（Ｐ＜０．０１）。この変化は、糞便のｐＨが５．７３から６．４４に上昇する傾向に関係し得る。アンモニア態Ｎは、ＮＨ_４^＋の形態であり、低ｐＨでは揮発性ではない。微生物の活性およびＮＨ_３の揮発は、温度に直接影響されるので、温度もまたＮＨ_３排出に対して重要な役割を果たす。微生物の活性がかなり変動したので、変動する食餌の有効性の結果は、糞便特性、特に、窒素含有量およびｐＨの変化に起因し得る。

【0087】

生産条件下において、幼若な鳥を含むブロイラー舎は、限られた換気に起因して鳥のレベルにおいてより高いＮＨ_３濃度を有する傾向がある。幼若な鳥を含むブロイラー舎からのＮＨ_３排出を減少させることは、健常な群を確立することおよび高ＮＨ_３に関連する疾患発生のリスクを低下させることを助けるだろう。

【0088】

実施例３
この研究は、実施例２から選択される添加物の有効性を検証することによって、処置群において３６ＭＵ／トンで加えられたアルカリホスファターゼを含む食餌が、非ＡＰ処置コントロールと比べて、商業的条件下においてＮＨ_３排出を減少させ得ることを証明するために行われる。

【0089】

このフィールド検証試験を、１６区画（各々６ｍ×６ｍ（２０ｆｔ×２０ｆｔ））に分割された４８ｍ×１３．５ｍ（１６０ｆｔ×４５ｆｔ）の大きさの１つの小屋を使用して行った。この研究で使用された６つの部屋を別々に管理したが、それらの部屋は、同じ鳥の遺伝的性質および生産段階を共有したことから、２つの異なる食餌を与えられた６つの群のより良い比較が可能だった。３つの部屋は、コントロール食餌にランダムに割り当てられた（ｓｉｇｎｅｄ）群を保持し、その他の部屋は、ＡＰ食餌を与えられる鳥を含んだ。３８日間の成長完了期間にわたるブロイラーを、小屋にランダムに割り当てたコントロールまたは処置を用いて、その小屋内で飼育した。各部屋は、新しい木の削りくずとともに、５３０羽の純系の鳥（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｒｕｎ ｂｉｒｄｓ）（雌雄混合，Ｃｏｂｂ×Ｃｏｂｂ）の初期配置を有した。その生産部屋は、断熱天井、中央の通路に沿った箱形吸気口、１つの育雛用ヒーター（３０，０００ＢＴＵ）、１つの０．３ｍ（１２ｉｎ）遠心ファン、およびその部屋の側壁に配置された１つの直径０．６ｍ（２４ｉｎ）のファンを有する。独立した環境制御装置は、気温、換気ファンおよびヒーターの操作ならびに照明プログラムの制御を調整する。温度センサーおよびロガー（ＴＭＣ６およびＵ１２，Ｏｎｓｅｔ，Ｐｏｃａｓｓｅｔ，ＭＡ）によって、気温をモニターした。

【0090】

コントロール部屋と処置部屋の両方に対する生成成績データ（飼料消費量、体重、飼料効率および鳥の死亡率を含む）を収集した。各部屋の鳥の生体重を、鳥用の秤によって測定し、記録した。それらの鳥に給餌し、死亡率を毎日記録した。３つの時期給餌ストラテジーを使用した：０日目〜１３日目は離乳、１４〜３１日目は育成および３２〜３８日目は仕上げ。各部屋に加えられる飼料を計量し、記録した。試験の終わりに、鳥を再度計量し、飼料効率比（ＦＣＲ）を計算した。

【0091】

多点空気サンプリング（Ｐａｋ ＩＩＩ，ＣＡＩ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）およびデータ収得システム（ＳＣＡＤＡ３０００，Ｓｅｎｓａｐｈｏｎｅ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ）を使用して、５秒間隔でコントロール（Ｃｔｒｌ）部屋および処置（Ｔｒｔ）部屋をモニターした。各ファンのＯＮ／ＯＦＦ状態をＡＣ−ＤＣリレーによってモニターした。部屋の静圧を、差圧センサー（Ｔ−ＶＥＲ−ＰＸＵ−Ｌ，Ｏｎｓｅｔ，Ｐｏｃａｓｓｅｔ，ＭＡ）を用いて測定した。光音響マルチガスアナライザー（Ｉｎｎｏｖａ Ｍｏｄｅｌ １４１２，ＣＡＩ，Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ）を使用して、ＮＨ_３、ＣＯ_２の濃度および排気の露点温度を測定した。Ｉｎｎｏｖａ １４１２アナライザーは、非常に正確かつ安定で応答性に優れていると示されている。各部屋のファンから排気サンプルを吸い込み、解析して、大気に排出されたその部屋の空気が良好であることを保証した。サンプリングポートは、床から１．８ｍ（６ｆｔ）上の高さで壁から２フィート離して、２つのファンの間に配置した。その空気サンプリングの間隔は、１部屋につき１４０秒に設定した（５サンプル／部屋×２８秒／サンプル）。気体の濃度に加えて、対応する建物の換気率を、ＦＡＮＳユニットを備える排気ファンの現場較正ならびにファンの動作状態および部屋の静圧の連続的なモニタリングによって測定する（方程式１）。
ＶＲ＝ａ＋ｂ×ＳＰ ［１］
式中、ＶＲ＝ファンの換気率，ｍ^３／時；
ａ、ｂ＝ファン曲線係数；および
ＳＰ＝静圧，Ｐａ。

【0092】

３つの寝わらサンプルを、栄養分の解析および化学的解析（アンモニア窒素（ＮＨ_３−Ｎ）、全ケルダール態窒素（ＴＫＮ）、水分含有量およびｐＨを含む）のために、各部屋から採取した。ＮＨ_３排出率を、濃度および換気率を用いて計算した［方程式２］。
ＥＲ＝ＶＲ／ｎ×（Ｃ_ｅ−Ｃ_ｉ）×（１７．０３１ｇ／ｍｏｌ）／（２２．４１４Ｌ／ｍｏｌ）［２］
式中、ＥＲ＝排出率，ｍｇ／羽−時；
ＶＲ＝換気率，ｍ^３／時；
Ｃ_ｅ＝排出ＮＨ_３濃度，ｐｐｍｖ；
Ｃ_ｉ＝吸入ＮＨ_３濃度，ｐｐｍｖ；および
ｎ＝１部屋あたりの鳥の数

【0093】

２種の食餌に対する３８日間の成長完了期間にわたる１日のＮＨ_３排出率（ＥＲ）および累積排出量を計算し、データ解析のために使用した。各食餌からのデータをプールし、食餌および齢の影響について解析した。ＪＭＰ９．０（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、統計解析を行った。食餌の影響の有意性を、Ｐ値≦０．０５の場合は^＊＊およびＰ値≦０．１の場合は^＊として示した。

【0094】

生成成績および糞便特性
２種の食餌からのブロイラーの生成成績を表９に示す。

【表11】

【0095】

２種の食餌の間に体重増加および生存率の有意差は無かった。ＡＰ食餌を摂取した鳥は、３２日齢においてより良い成長速度を有した（Ｐ＝０．０８）。しかしながら、コントロール鳥は、処置群よりも低いＦＣＲを有した（Ｐ＝０．００２）。３１日齢の後に、食餌の変化によって引き起こされ得る処置群の成長曲線が低下するという明らかな傾向があった。それは、３８日間のモニタリングの終了時に、２種の食餌の間にＮＨ_３−Ｎ、ＴＫＮ、ｐＨおよび水分含有量の差が無いことを示す。

【0096】

アンモニアの排出
２種の食餌に対する３８日間の成長完了期間にわたる１日のＮＨ_３排出率（ＥＲ）および累積排出量を表１０に要約し、示した。

【表12】

【0097】

ＡＰ食餌のＮＨ_３排出量は、Ｐ≦０．０５レベルでは２８日齢まで、およびＰ≦０．１レベルでは３１日齢まで、コントロール食餌よりも有意に少なかった。ＮＨ_３排出減少率は、１２日齢における４０％から２７日齢における１９％および３１日齢における１０％まで低下した。１日の排出率は、同様の減少傾向を有した。このフィールド試験は、ＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性が以前の研究室での研究（Ｌｉ，２０１１）において齢依存的だったという同様の結果を示す。より幼若な鳥の糞便中のより少ない窒素含有量およびより低いｐＨに起因して、鳥の齢は、ＮＨ_３排出に有意に影響した。生産条件下において、寝わらは再利用され、幼若な鳥を含むブロイラー舎は、限られた換気のせいで鳥のレベルにおいてより高いＮＨ_３濃度を有する傾向がある。幼若な鳥を含むブロイラー舎からのＮＨ_３排出を減少させることは、鳥レベルのＮＨ_３濃度を低下させ、高ＮＨ_３濃度を伴う不良な空気質に関連する疾患発生のリスクを低下させる。

【0098】

実施例２および３に基づくと、ブロイラー鳥へのＡＰ添加物の給餌は、ＮＨ_３排出および生成成績に対して以下の影響を及ぼすと示された：
１）３８日間の成長完了の間に、ＡＰ食餌による鳥の体重、生存率および寝わら特性に有意差は観察されなかった。ＡＰ食餌を摂取した鳥は、より良い成長速度を有した。しかしながら、コントロール群は、より良い飼料効率比を有した。
２）ＡＰ食餌は、２２日齢において糞便ｐＨを低下させ（Ｐ＝０．０５）、１４および２２日齢においてリンを６および７％減少させた（Ｐ＝０．０２）。ＡＰ食餌は、糞便中のＮＨ_３−ＮおよびＴＫＮを減少させ得る傾向があった。
３）新鮮糞便からのＮＨ_３排出は、ＡＰ食餌を与えたとき、１４日齢において４日間で２３．８％有意に減少した。ＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性は、３つの試験期間中、齢依存的だった。４日間にわたる全体のＮＨ_３排出減少率は、３０日齢の鳥では５．９％および２２日齢の鳥では３０．７％だった。
４）フィールド条件下でのＡＰ食餌によるＮＨ_３排出減少の有効性は、３８日間の成長完了期間中、齢依存的だった。ＮＨ_３排出は、２７日齢において１９％および３１日齢において１０％有意に減少した。３８日間にわたる全体のＮＨ_３排出減少率は、４．７％だった。
５）これらの結果は、ＡＰ食餌が、幼若ブロイラーが窒素およびリンを利用および消化することを助け得、それにより、成長速度がより良くなり、排出による栄養分損失がより少なくなることを示唆する。糞便におけるより低いｐＨとより少ない窒素含有量の両方が、糞便中での気体ＮＨ_３の形成を抑止および阻止し得、ＮＨ_３排出を減少させ得る。

【0099】

実施例４
用量漸増試験をシチメンチョウにおいて行った。その実験は、ランダム化されたブロックデザインとして計画され、４つの食餌処置（コントロールおよび３つの異なるレベルのアルカリホスファターゼ）を、各々１２個のバッテリーケージ（檻）の４つのブロックにランダムに割り当てた。シチメンチョウは、４週までこれらの食餌を無制限に摂取できた。鳥の２４日齢において、糞便を回収した。その糞便を、上記の実施例１および２に記載されたように解析した。

【0100】

試験食餌は、アルカリホスファターゼを４つの異なるレベル：Ａ：０（コントロール）；Ｂ：２２ＭＵ／トン飼料；Ｃ：４９ＭＵ／トン飼料；およびＤ：７４ＭＵ／トン飼料で含んだ（１ＭＵ＝１２０，０００ＩＵ）。その食餌は、下に示されるような栄養分が補充された典型的な離乳食餌だった。

【表13】

^１ＮａＳｅＯ３プレミックスは、０．３ｍｇＳｅ／ｋｇ完成飼料を提供した。
^２ミネラルプレミックス（．１％含有）の各キログラムは、完成飼料１ｋｇあたり以下を供給した：６０ｍｇのＺｎ（ＺｎＳ０_４Ｈ_２０として）；６０ｍｇのＭｎ（ＭｎＳ０_４Ｈ_２０として）；４０ｍｇのＦｅ（ＦｅＳ０_４Ｈ_２０として）；５ｍｇのＣｕ（ＣｕＳ０_４として）；１．２５ｍｇのＩ（Ｃａ（Ｉ０_３）_２として）；１ｍｇのＣｏ（ＣｏＳ０_４として）。
^３ビタミンプレミックス（．１％含有）の各キログラムは、完成飼料１ｋｇあたり以下を供給した：ビタミンＡ，１３，２００ＩＵ；コレカルシフェロール，４，０００ＩＵ；アルファ−トコフェロール，６６ＩＵ；ナイアシン，１１０ｍｇ；パントテン酸，２２ｍｇ；リボフラビン，１３．２ｍｇ；ピリドキシン，８ｍｇ；メナジオン，４ｍｇ；葉酸，２．２ｍｇ；チアミン，４ｍｇ；ビオチン，０．２５３ｍｇ；ビタミンＢ１２，０．０４ｍｇ；エトキシキン，１００ｍｇ。

【表14】

【0101】

データは、食餌Ａ、ＢおよびＤの間の用量反応関係を示している。食餌Ｃを用いて得られた結果は、用量反応関係に当てはまらなかったが、なおもコントロールと比べて低いＮＨ_３ＥＲを示した。

【0102】

糞便特性
糞便特性について３種のＡＰ食餌の間に有意差は無かった（０．０５のＰ）。しかしながら、ＡＰを含むＢ、ＣおよびＤの食餌は、より低い糞便ｐＨおよびより少ないＴＫＮを有し、細菌集団の代謝および増殖を変化させ得、より少ないＮＨ_３の形成および揮発をもたらし得る傾向があった。Ａ、ＢおよびＣ食餌からのそれぞれ６．３７、６．１５および６．３８に対して、Ｄ食餌からの新鮮糞便は、５．８３という最も低いｐＨを有した。Ｂ、ＣおよびＤのＴＫＮは、２．４５、２．３８および２．５７％であり、これらは、Ａ食餌からの３．６１％よりも低かった。

【0103】

アンモニアの排出および減少
Ｄ食餌のＮＨ_３ＥＲが、７日間の貯蔵期間にわたって最も低かった。大きなばらつきに起因して、４種の食餌の間にＮＨ_３ＥＲおよび累積排出量に差は無かった（Ｐ＞０．０５）。ＮＨ_３排出の大きなばらつきは、糞便サンプルの不均一な水分含有量が原因であり得る。４８個のサンプルのすべての糞便の水分含有量が、５４〜８３％で様々だった。食餌の影響は有意でないが、結果はなおも、ＮＨ_３排出の平均値を比較すると、その排出が減少し得ることを明らかにしている。全体のＮＨ_３ＥＲ減少は、６．５から４０％まで様々だった（７日間の貯蔵時間の後、Ａ食餌と比べて、Ｂ（２０．６％）、Ｃ（６．５％）およびＤ（４０％）食餌）。微生物の活性がかなり変動するので、変動する食餌の有効性の結果は、糞便特性、特に、水分含有量およびｐＨの変化に起因し得る。商業的生産条件下において、異なる水分レベルを有する糞便の間のＮＨ_３排出の大きなばらつきは、無効にされ得る。糞便サンプルは、より均一であるべきであり、糞便サンプルの回収は、より慎重に行われるべきであることが示唆される。

【0104】

要約すると、シチメンチョウへの添加物の給餌は、アンモニア排出および糞便特性に対して以下の影響を及ぼすと示された：
１）Ｂ、ＣおよびＤ食餌（ＡＰを含む）における糞便は、Ａ食餌（コントロール）よりも低いｐＨおよびより少ない全窒素含有量を示した。
２）糞便の水分含有量の大きな範囲が原因である大きなばらつきに起因して、４種の食餌の間のＮＨ_３ＥＲおよび累積排出量に有意差は無かった。Ｂ、ＣおよびＤ食餌（ＡＰ）を摂取したシチメンチョウは、Ａ食餌（コントロール）よりも少ないＮＨ_３排出を有する傾向があった。
３）７日間にわたる全体のＮＨ_３排出減少率は、Ｃ食餌の場合、−６．５％およびＤ食餌の場合、４０％だった。

【0105】

実施例５
哺乳ブタの離乳時における乾燥飼料への移行は、そのブタの一生の中で最もストレスの多い期間である。そのブタは、新しい食餌レジメンへの適応に加えて、新しい群給餌構造および免疫系への潜在的な疾患攻撃に適応しなければならない。

【0106】

豚肉生産者に対する別の難題は、全農地栄養バランス（ｗｈｏｌｅ ｆａｒｍ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂａｌａｎｃｅ）、特に水質に影響を及ぼし得る栄養分に現在焦点が当てられている環境規制である。特にリンは、過剰量で糞便中に排泄される栄養分であり、どれだけの糞便が農耕地に適用できるかが規定されている制限的栄養物質になっている。通常のトウモロコシはＰを含むが、ブタに給餌されたとき、そのＰのおよそ１５％だけしか消化できない。ゆえに、ブタのＰの所要量を満たすように無機Ｐを食餌に加えなければならず、その食餌中の消化されないＰは排泄される。

【0107】

ブタの成長、飼料摂取量、飼料効率および健康状態に基づいて、哺乳ブタの食餌中のアルカリホスファターゼの価値を評価する必要がある。さらに、離乳後にブタの腸が成長し、食餌が変更され続けるにつれて、哺乳ブタの食餌中のリンの利用可能性および排泄されるＰの量を測定する必要がある。この研究の目的は、栄養分の消化性および排出に基づいて、哺乳ブタの食餌中のアルカリホスファターゼの栄養上および環境上の価値を判断することである。

【0108】

アルカリホスファターゼが補充された食餌を与えられた哺乳ブタの栄養分の消化性およびそのブタからの排出を評価するために、代謝試験を行う。１２頭の去勢ブタを、食餌処置１つあたり６頭の去勢ブタで使用する。離乳後７日間にわたって、ブタに第１期の従来のトウモロコシ−ダイズ−ホエーベースのペレット食餌を与える。次いで、ブタを体重および系統によって、２つの食餌処置のうちの１つにブロック分けする。

【0109】

ブタを、代謝期間の最初の６日間にわたって対にして代謝檻に収容し、１日２回給餌されるほぼ無制限の第２期の実験食餌に適応させた後、個別の代謝クレートに分け、４日間、摂取量を制限して給餌した後、３日間のすべての尿および糞の回収を始めた。回収中は、ブタを、ニップル式給水器が取り付けられた個別のステンレス鋼代謝クレート（２．３３×２．８３ｆｔ．）に収容する。網および回収パンをクレートの真下に置くことにより、尿および糞を別々にかつすべて回収することができる。アンモニアの揮発を防ぐために、尿回収バケツを、１００ｍＬの１０％ＨＣｌを用いて酸性化する。

【0110】

３日間の回収期間の前の４日間およびその３日間の回収期間中、ブタにＢＷ^．７５の９％の割合で０７：３０および１７：００に１日２回給餌する。回収の毎朝、すべての残滓、尿および糞を回収し、測定し、後の解析のために−２０Ｃで凍結する。各ブタの毎日のサンプルを後の解析のためにプールする。糞を解凍し、脱イオン水と混合して、５０：５０（重量基準）スラリーを調製し、それを混合し、次いで窒素アッセイ用の糞スラリーとして維持される１サンプル、および凍結乾燥され、他のすべての栄養分アッセイのために使用されるサンプルとしてサブサンプリングする。

【0111】

解析の前に、食餌をＷｉｌｅｙ Ｍｉｌｌ（Ｔｈｏｍａｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ，ＮＪ）において１ｍｍの篩に通して粉砕する。１００℃における１６時間の乾燥時間の後、乾物を測定する。総Ｎ（Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｍｍｅｒｓ，１９７２）およびＡｍｍＮ（Ｂｒｅｍｎｅｒ ａｎｄ Ｋｅｅｎｅｙ，１９６５）をミクロケルダール法によって測定する。総Ｐを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｄｕ−６分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を使用して比色分析的に（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ｒｉｌｅｙ，１９６２）測定する。食餌、糞および尿エネルギーを、ボンベ熱量計によって測定する。エネルギーカプセル内のｓｕｌｋａ ｆｌｏｃ上で４ｍＬの尿を乾燥させ、次いで、ボンベ熱量計内でそのｓｕｌｋａ ｆｌｏｃおよび尿を燃焼させ、次いで、脱イオン水で処理されたｓｕｌｋａ ｆｌｏｃとの差によってその尿エネルギーを測定することによって、尿エネルギーを測定する。

【0112】

ブタは、実験単位だった。ＳＡＳのＧＬＭ手順を使用して、処置間の統計的差異を判定する。統計的有意性をＰ＜０．０５によって示し、統計的傾向をＰ＜０．１０によって示す。２種の実験食餌を代謝研究中に使用した：１）コントロールおよび２）コントロール＋６０ＭＵ ＡＰ。これらの食餌によって、従来の食餌とＡＰ補充食餌との比較が可能になり、それらの食餌を以下で述べる。

【表15】

【0113】

結果を、哺乳初期の期間中の乾物（ＤＭ）、エネルギー、窒素（Ｎ）およびリン（Ｐ）の消化性および排出に対するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）酵素の効果という表題の表１１に提供する。

【表16】

【0114】

第１週は、与えられた食餌のブタの成長速度に対する食餌の影響は無かった。しかしながら、第２週（６〜１３日目）に、アルカリホスファターゼを与えられたブタは、補充されていないブタよりもわずかに速く成長する（９．４％）傾向があった（Ｐ＜０．１２）（表１１）。

【0115】

アルカリホスファターゼは、ＤＭ、エネルギー、または窒素の消化性もしくは排出に影響しなかった（Ｐ＞０．２６）。しかしながら、わずかに高い飼料摂取量および解析された食餌由来のリンに起因して、ＡＰ食餌を与えられたブタは、より多いリンを摂取した（Ｐ＜０．０１）が、糞および尿中へのリンの排泄は同様だった。これにより、コントロール食餌を与えられたブタよりも、ＡＰを与えられたブタにおいて高いリン消化性（Ｐ＜０．０３）および多いリン貯留（Ｐ＜０．０２）がもたらされた。

【0116】

理論に拘束されるものではないが、ＡＰ酵素が離乳したブタの腸の生理機能を改善する機会が存在する可能性があり、これは、リンのより効率的な利用をもたらす可能性がある。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]