特許 6262969 Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6262969

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/569 20060101AFI20180104BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20180104BHJP

   C07K 16/10 20060101ALN20180104BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/569 L

   G01N33/543 521

   !C07K16/10ZNA

【請求項の数】12

【全頁数】16

(21)【出願番号】特願2013-187141(P2013-187141)

(22)【出願日】2013年9月10日

(65)【公開番号】特開2015-55475(P2015-55475A)

(43)【公開日】2015年3月23日

【審査請求日】2016年7月1日

(73)【特許権者】

【識別番号】591125371

【氏名又は名称】デンカ生研株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】稲野 浩一

(72)【発明者】

【氏名】宮澤 恭

(72)【発明者】

【氏名】石川 治

【審査官】 赤坂 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０２９４８７９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Bucher D et al.，M protein (M1) of influenza virus: antigenic analysis and intracellular localization with monoclonal antibodies，J Virol，１９８９年 ９月，63(9)，3622-3633

【文献】 He JL et al.，Preparation of monoclonal antibodies against poor immunogenic avian influenza virus proteins，J Immunol Methods，２０１３年 １月３１日，387(1-2)，43-50

【文献】 Ye ZP et al.，Functional and antigenic domains of the matrix (M1) protein of influenza A virus，J Virol，１９８７年 ２月，61(2)，239-246

【文献】 Bucher D et al.，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，１９９１年，Vol. 29, No. 11，2484-2488

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、検体中のＡ型インフルエンザウイルスとの抗原抗体反応を利用した免疫測定によりＡ型インフルエンザウイルスを測定することを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法。

【請求項2】

前記モノクローナル抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスの、H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8およびH16N3の各亜型ウイルスと抗原抗体反応する、請求項１記載の方法。

【請求項3】

前記免疫測定がサンドイッチ法である請求項１又は２記載の方法。

【請求項4】

Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）に同時に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いる請求項３記載の方法。

【請求項5】

前記２種類のモノクローナル抗体が、いずれもＡ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域に結合する、請求項４記載の方法。

【請求項6】

Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域に結合する第１のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の２３２〜２４１番目のアミノ酸領域に結合する第２のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片とを用いる請求項５記載の方法。

【請求項7】

前記免疫測定がイムノクロマト法である請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片との混合物を用いる請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

第１の抗体またはその抗原結合性断片が支持体上に固定化された検出領域、第２の抗体またはその抗原結合性断片を検体と共に供給する標識体領域および検体移動領域を備えた免疫測定器具であって、前記第１の抗体及び第２の抗体の少なくとも１つはＡ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体である免疫測定器具。

【請求項10】

前記第１及び第２の抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）に同時に結合できる２種類のモノクローナル抗体である請求項９記載の免疫測定器具。

【請求項11】

Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項12】

Ａ型インフルエンザウイルスの、H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8およびH16N3の各亜型ウイルスと抗原抗体反応する、請求項１１記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法並びにそれに用いられる免疫測定器具及びモノクローナル抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザは冬期に流行する感染症で、高熱、上気道炎、倦怠感などの臨床症状を呈するが、それらの症状のみではアデノ、ＲＳ、パラインフルエンザ、ヒトメタニューモなど他のウイルスに起因する感染症と区別することは必ずしも容易ではない。

【0003】

インフルエンザの確定診断法としては、ウイルス分離、血清学的診断、核酸検出（ＰＣＲ法）などがあるが、これらの方法は診察室等の日常の医療現場で簡単に行えるものではないため、より簡便な診断方法が求められていた。近年になり、簡便性と迅速性を兼ね備えた、イムノクロマト法を原理とする抗原検出試薬が開発されると、広く診断補助に利用されるようになった。

【0004】

インフルエンザウイルスは分節状のマイナス鎖ＲＮＡをゲノム遺伝子とするウイルスで、ＨＡ、ＮＡ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、ＮＳの８分節から成る。インフルエンザウイルスは、構成するタンパク質のうち、マトリックスタンパク質（Ｍ１）と核タンパク質（ＮＰ）の抗原性の違いにより、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。該タンパク質は抗原性がそれぞれ異なるため、異なる型の間で交差反応を示さない。

【0005】

Ａ型インフルエンザウイルスのＭ分節にはＭ１とＭ２という異なる２つの遺伝子がコードされており、それぞれから構成タンパク質が合成される。これらのタンパク質はＢ型インフルエンザウイルスのＭ１とＢＭ２に相当するが、Ａ型のＭ２はＢ型のＢＭ２と構造が大きく異なる。Ｍ１はウイルスエンベロープの内側を裏打ちする形で局在しており、これが実質的な殻の役割を果たしていると考えられている。

【0006】

インフルエンザに対する治療薬として、オセルタミビルリン酸塩、ザナミビル水和物、ペラミビル水和物、ラニナミビルオクタン酸エステル水和物、アマンタジン塩酸塩が用いられているが、Ｍ２阻害剤であるアマンタジン塩酸塩はＢ型インフルエンザウイルスの感染増殖を阻害しないためＡ型インフルエンザの治療にのみ用いられる。さらに前４者はノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤として同一の作用点を示す治療薬であるが、インフルエンザの型によって解熱時間やウイルス残存率などの有効性に差異があることが指摘されている。（非特許文献２）。したがって、インフルエンザの型の鑑別は、その後の適切な治療薬選択のために重要である。

【0007】

Ａ型インフルエンザウイルス同士であっても、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）の抗原性の違いから、複数の亜型に細分類される。これまでに１６種類のＨＡ、９種類のＮＡが報告されており、その組み合わせにより宿主の動物種が限定される要因となるが、ヒトのインフルエンザの原因として知られるH1N1、H3N2、H1N2、H2N2の４種類の他に、H5N1やH7N9のようにまれに他の動物宿主からヒトへの感染も起こりうる。従来の免疫測定器具においても、各亜型に対する反応は確認されていたが、その反応性は一様ではなく、低い反応性の亜型も存在していた。

【0008】

従来のインフルエンザの検出には抗ＮＰ抗体（特許文献１ないし３）、抗Ｍ２抗体（特許文献４）などが特に用いられていた。また、Ｍ１と抗原抗体反応する抗Ｍ１抗体を研究に用いた報告（非特許文献３および４）等があるが、診断補助を目的とした免疫測定器具には用いられていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】特開2007-285749

【特許文献2】特許4936428号掲載公報

【特許文献3】WO 2005/007698

【特許文献4】特許4932940号掲載公報

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】ウイルス 第 56 巻 第１号，pp.109-116，2006

【非特許文献2】J Infect. 2008 Jan;56(1):51-7. Epub 2007 Oct 15.（A comparison of the effectiveness of zanamivir and oseltamivir for the treatment of influenza A and B.）

【非特許文献3】Journal of Immunological Methods Volume 387, Issues 1-2, 31 January 2013, Pages 43-50（Preparation of monoclonal antibodies against poor immunogenic avian influenza virus proteins）

【非特許文献4】Virus Genes. 1989 Nov;3(2):111-26.（Monoclonal antibody analysis of influenza virus matrix protein epitopesinvolved in transcription inhibition.）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

従来の免疫測定法では、抗ＮＰモノクローナル抗体などが用いられていたが、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型によっては反応性が低かった。

【0012】

本発明の目的は、広い亜型に対して反応性の高い抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を用いた免疫測定によるＡ型インフルエンザウイルスの測定方法を提供することである。また、本発明の目的は、上記本発明の方法に用いる免疫測定器具及びモノクローナル抗体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本願発明者らは、鋭意研究の結果、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１を抗原とし、Ａ型インフルエンザウイルスと特異的に反応する抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を作出することに成功し、さらに、このモノクローナル抗体を用いてＡ型インフルエンザウイルスを免疫測定することにより、従来の抗ＮＰモノクローナル抗体を用いる免疫測定では検出困難なＡ型インフルエンザウイルス亜型も測定できることを見出し、本発明を完成した。

【0014】

すなわち、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片と、検体中のＡ型インフルエンザウイルスとの抗原抗体反応を利用した免疫測定によりＡ型インフルエンザウイルスを測定することを含む、Ａ型インフルエンザウイルスの測定方法を提供する。

【0015】

また、本発明は、第１の抗体またはその抗原結合性断片が支持体上に固定化された検出領域、第２の抗体またはその抗原結合性断片を検体と共に供給する標識体領域および検体移動領域を備えた免疫測定器具であって、前記第１の抗体及び第２の抗体の少なくとも１つはＡ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体である免疫測定器具を提供する。さらに、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域又は２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と特異的に反応するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を提供する。

【発明の効果】

【0016】

本発明の方法によれば、広い亜型のＡ型インフルエンザウイルスを免疫測定することができる。また、本発明により、上記本発明の方法に用いられる新規な免疫測定器具及びモノクローナル抗体が提供された。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明のイムノクロマト免疫測定器具の好ましい１形態を模式的に示した図である。

【図2】下記実施例において作製した本発明のモノクローナル抗体の反応性をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図である。

【図3】下記実施例において作製した本発明のモノクローナル抗体の反応性を調べたペプチドアレイ解析の結果を示す図である。

【図4】Ａ型インフルエンザウイルスの各亜型のＭ１のＣ末端側のアミノ酸配列と、下記実施例で作製した本発明のモノクローナル抗体が結合する領域を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１（以下Ａ−Ｍ１と略す）と抗原抗体反応する。Ａ−Ｍ１は２５２アミノ酸残基から構成されるタンパク質であり、ウェスタンブロット法による検出に該抗体を用いることで、分子量２０〜３５ｋＤに抗原抗体反応による特異的なシグナルを検知することができる。本明細書において「特異的」とは、タンパク質と該抗体が混じり合う液系において、該抗体がＡ−Ｍ１以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、または何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体のＡ−Ｍ１との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。

【0019】

Ａ−Ｍ１のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＤ３７４９０等に記載されている（配列番号１）。各亜型のＡ−Ｍ１アミノ酸配列のうち、１２７〜２５２番目のアミノ酸配列を並べて比較したものを図４に示す。

【0020】

本発明のモノクローナル抗体はＡ−Ｍ１アミノ酸配列の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域、または２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と結合する（下記実施例参照）。

【0021】

本発明のモノクローナル抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させて反応に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）は本発明の範囲に含まれる。また、モノクローナル抗体のクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭやＩｇＹでもよい。

【0022】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの、H1N1、H1N2、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8およびH16N3の各亜型ウイルスのＭ１と特異的に反応する。より好ましくは、公知の全てのＡ型インフルエンザウイルス株のＭ１と特異的に反応する（下記実施例参照）。

【0023】

好ましい形態では、本発明に用いるモノクローナル抗体は、他の感染症の病原体と特異的な抗原抗体反応しない。例えば、Ｂ型インフルエンザウイルス、アデノウイルス 、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、オウム病クラミジア、トラコーマ・クラミジア、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、大腸菌、インフルエンザ菌、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア菌、緑膿菌、セラチア菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、化膿レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、Ｃ群レンサ球菌、Ｇ群レンサ球菌、と抗原抗体反応をしない。

【0024】

本発明に用いるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、Ａ−Ｍ１又はその部分ペプチド（１２７〜２５２番目のアミノ酸領域から成るポリペプチド又はその部分ペプチド）を被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。

【0025】

免疫原とするＡ−Ｍ１は培養ウイルス液から得ることもできるが、Ａ−Ｍ１をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。

【0026】

免疫原とするＡ−Ｍ１またはその部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、または未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いてＭ１あるいはその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。

【0027】

免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免役した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、Ａ−Ｍ１と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。

【0028】

腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。

【0029】

本発明のＡ型インフルエンザウイルスの測定方法では、上記のようにして作製した抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体（以下、「抗Ａ−Ｍ１抗体」と略すことがある）又はその抗原結合性断片と検体中のＡ型インフルエンザウイルスとの抗原抗体反応を利用した免疫測定によりＡ型インフルエンザウイルスを測定する。このための免疫測定法としては、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法など、当業者にとって周知のいずれの方法も用いることができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。

【0030】

固相に固定化された抗体（抗体１）（以下、実施例の前までの記述において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「抗体」は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）と、標識された抗体（抗体２）と、Ａ−Ｍ１とを含む複合体を形成させる工程を含む、いわゆるサンドイッチ法を検出原理とした免疫測定においては、抗体１および抗体２のいずれか一方に、Ａ−Ｍ１アミノ酸配列の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域、または２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と結合する抗Ａ−Ｍ１抗体を用いる。さらに、抗体１及び抗体２のいずれかにいずれか一方に、Ａ−Ｍ１アミノ酸配列の１７３〜１８６番目のアミノ酸領域と結合する抗体を用い、他方にＡ−Ｍ１アミノ酸配列の２３２〜２４１番目のアミノ酸領域と結合する抗Ａ−Ｍ１抗体を用いることが好ましい。なお、これらの抗体は、当然ながら、Ａ−Ｍ１に同時に結合できる。

【0031】

本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの広範囲な亜型と高い親和性で結合するが、従来から用いられている、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）に対する抗体もいくつかの亜型に対しては高い親和性で結合することができ、亜型によっては、本発明のモノクローナル抗体よりも公知の抗Ａ−ＮＰ抗体の方がより高い親和性で結合するものもある。したがって、免疫測定に用いる抗体として、本発明のモノクローナル抗体と、公知の抗Ａ−ＮＰ抗体との混合物とすることにより、広範囲の亜型の測定感度をさらに高めることが可能である（下記実施例５参照）。

【0032】

免疫測定としては、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマト法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は、上記した本発明の抗Ａ−Ｍ１抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。

【0033】

サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。

【0034】

前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法が好ましい。

【0035】

本発明では、抗Ａ−Ｍ１抗体を用いてラテラルフロー式に免疫測定を行うことができる免疫測定器具をも提供する。本発明が提供する免疫測定器具は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成り、抗体１および抗体２の少なくとも一方が本発明の抗Ａ−Ｍ１抗体である免疫測定器具である。

【0036】

なお、検出領域の数および標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１に限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２以上の抗原を同一の免疫測定器具にて検出することができる。

【0037】

図１は、本発明の免疫測定器具の好ましい１形態を示した図である。イが支持体、ロが標識体領域、ハが検出領域、ニがサンプルパッド、ホが吸収帯、ヘがバッキングシートを指している。

【0038】

図１の上が上面図、下が切断断面図である。図の例では、バッキングシート上に２個の検出領域が形成された支持体、吸収帯、標識体領域、サンプルパッドらがそれぞれ積層されている。そして図示のように、吸収帯の一方の端部と支持体の一方の端部、支持体の他方の端部と標識体領域の一方の端部、標識体領域の他方の端部とサンプルパッドの一方の端部がそれぞれ重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。

【0039】

支持体は、抗原を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体およびそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。

【0040】

標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm〜0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。

【0041】

検出領域は、抗原を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、Ａ−Ｍ１抗原を捕捉するための抗Ａ−Ｍ１抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設け、さらにＢ型インフルエンザウイルスを検出するための検出領域を設けることが、実際の診断補助のためには好ましい。

【0042】

サンプルパッドは、検体または検体を用いて調製された試料を滴加するための部位であり、吸水性を持つ多孔性材料である。該材料には一般的に用いられるセルロース、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm〜1mm程度のパッド状であることが好ましい。なお、サンプルパッドと前述の標識体領域はあくまで機能的な区別であって、必ずしも個別の材料である必要はない。すなわち、サンプルパッドとして設置した材料の一部領域が標識体領域の機能を有することも可能である。

【0043】

吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。

【0044】

バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯らが、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これら材料らが最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いたほうが好ましい。

【0045】

図１で説明した形態の免疫測定器具において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯らの一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の免疫測定器具も本明細書の範囲に含まれる。

【0046】

図１の形態に基づき、本発明の免疫測定器具の使用方法について述べる。

【0047】

測定は、検体または検体を用いて調製された試料をサンプルパッドに滴加することにより開始される。滴加する検体試料は予め、界面活性剤を含む緩衝液を用いて２〜２０倍程度に希釈されていることが好ましい。

【0048】

サンプルパッドに滴加された検体試料は毛管作用によって標識体領域、支持体、吸収帯へと順次、水平方向に展開される。標識体領域では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体へと展開される。検体試料中に抗原が存在する場合において、支持体の検出領域では捕捉抗体により抗原が特異的に捕捉され、なおかつ抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域では抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体−抗原複合物を検出領域にて検知することができる。

【実施例】

【0049】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0050】

（実施例１）抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１モノクローナル抗体の作製
１．Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗原の調製
Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７株ウイルスＲＮＡから逆転写反応により構築したｃＤＮＡライブラリーを基にＭ１をコードするＤＮＡをプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでＭ１を発現させた。Ｍ１は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、該精製品を精製Ｍ１抗原と呼ぶ。

【0051】

２．抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１モノクローナル抗体の作製
精製Ｍ１抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、精製Ｍ１抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

【0052】

得られた腹水から、プロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりＩｇＧを精製し、精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体を得た。

【0053】

（参考例１）
１．抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
Ａ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

【0054】

得られた腹水からプロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、精製抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。本明細書において、該精製抗体を抗Ａ−ＮＰ抗体と呼ぶ。

【0055】

（実施例２）着色ポリスチレン粒子を用いたインフルエンザウイルス抗原検出試薬
１．抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例１で作製した抗Ａ−Ｍ１抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をＰＥＴフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、４５℃、３０分間乾燥させ、抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗Ｍ１抗体固定化メンブレンと呼ぶ。

【0056】

２．抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
参考例１で作製した抗ＮＰ抗体を用いて前述の実施例２−１と同様の方法により、抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗ＮＰ抗体固定化メンブレンと呼ぶ。

【0057】

３．抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体および抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例１で作製した抗Ａ−Ｍ１抗体および参考例１で作製した抗Ａ−ＮＰ抗体を所定の割合で混合して、1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をＰＥＴフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、４５℃、３０分間乾燥させ、抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体＋抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗Ｍ１＋ＮＰ抗体固定化メンブレンと呼ぶ。

【0058】

４．抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
実施例１で作製した抗Ａ−Ｍ１抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｍ１抗体固定化粒子と呼ぶ。

【0059】

５．抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
参考例１で作製した抗Ａ−ＮＰ抗体を用いて前述の実施例２−３と同様の方法により、抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗ＮＰ抗体固定化粒子と呼ぶ。

【0060】

６．抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体および抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
実施例１で作製した抗Ａ−Ｍ１抗体および参考例１で作製した抗Ａ−ＮP抗体を所定の割合で混合して、1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗Ａ型インフルエンザウイルスＭ１抗体＋抗Ａ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｍ１＋ＮＰ抗体固定化粒子と呼ぶ。

【0061】

７．抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
４および５で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量１．０μｇを塗布し、４５℃、３０分間乾燥させた。本明細書において、乾燥パッドと呼ぶ。

【0062】

また、上記とは別に６で作製した抗Ｍ１＋ＮＰ抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量１．０μｇを塗布し、４５℃、３０分間乾燥させた。本明細書において、Ｍ１＋ＮＰ乾燥パッドと呼ぶ。

【0063】

８．Ａ型インフルエンザウイルス試験片の作製
１および２で作製した抗体固定化メンブレンと７で作製した乾燥パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて５ｍｍ幅に切断し、Ａ型インフルエンザウイルス試験片とした。本明細書において、Ｍ１試験片と呼ぶ。なお、貼り合わせの際に、抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの少なくとも一方に抗Ａ−Ｍ１抗体が含まれる組み合わせとなるようにＭ１試験片を作製した。

【0064】

また、上記とは別に３で作製した抗Ｍ１＋ＮＰ抗体固定化メンブレンと７で作製したＭ１＋ＮＰ乾燥パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて５ｍｍ幅に切断し、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１＋ＮＰ試験片とした。本明細書において、Ｍ１＋ＮＰ試験片と呼ぶ。

【0065】

９．Ａ型インフルエンザウイルス抗原の検出
８で作製したＭ１試験片およびＭ１＋ＮＰ試験片のサンプルパッドに、Ａ型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液（10mM ADA（pH6.0）、2%ポリオキシエチレンセチルエーテル、1％ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、0.25M塩化カリウムと0.25M塩化リチウム、3％BSA）を６０μＬ滴加し、８分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。本試験において、全ての組み合わせの試験片、すなわち抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの一方または両方に抗Ａ−Ｍ１抗体が含まれるとき＋となった。

【0066】

（実施例３）抗Ａ−Ｍ１抗体の抗原認識領域（エピトープ）の解析
１．Ａ型インフルエンザウイルスリコンビナントＭ１の調製
実施例１−１で構築したｃＤＮＡライブラリーを基に、Ｍ１アミノ酸配列の１〜１２６番目をコードするＤＮＡおよび１２７〜２５２番目をコードするＤＮＡをそれぞれプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでリコンビナントＭ１を発現させた。リコンビナントＭ１は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、前者のアミノ酸配列から成るリコンビナントＭ１をＭ１−Ｎ、後者のアミノ酸配列から成るリコンビナントＭ１をＭ１−Ｃと呼ぶ。

【0067】

２．ウェスタンブロット法による反応性確認
A/New Caledonia/20/99株、Ｍ１−Ｎ、Ｍ１−Ｃを用いて実施例１で得られた抗体の反応性を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％アクリルアミドゲルを用いて常法で行った。電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した。スキムミルクでブロッキングを行った後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１μｇ／ｍＬに調整した抗Ａ−Ｍ１抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、３０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、化学発光検出試薬を用いてシグナルを検出した。試験した抗体はA/New Caledonia/20/99株と反応することが確認され、Ｍ１−Ｎとは反応せず、Ｍ１−Ｃと反応した。結果を図２に示す。

【0068】

３．ペプチドアレイによるエピトープの解析
エピトープをより詳細に明らかにするため、Ｍ１−Ｃから更に細分化したペプチドを用いた。該ペプチドは、Ｍ１−Ｃ配列中の１０または１１の連続するアミノ酸配列から成り、セルロースメンブレン上に一定間隔となるように固定化した。該ペプチドの配列と固定化した位置番号を表１に示す。メンブレンはスキムミルクでブロッキングを行った後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１μｇ／ｍＬに調整した抗Ａ−Ｍ１抗体を室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、３０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体を室温で１時間反応させた。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ＴＢＳで十分に洗浄し、化学発光検出試薬を用いてシグナルを検出した。結果を図３に示す。抗体aは位置番号１０および１１のペプチドと反応し、抗体bは位置番号２２のペプチドと反応した。抗体aおよび抗体bのエピトープと推定されたアミノ酸配列を図４に示した。

【0069】

【表1】

【0070】

（実施例４）免疫測定器具を用いたＡ型インフルエンザウイルス各亜型株の免疫測定
１．抗Ａ−Ｍ１抗体から成る免疫測定器具の作製
抗体固定化メンブレンと乾燥パッドに実施例３−３の抗体aおよび抗体bを用いた試験片を、実施例２に記載の方法と同様に作製した。（本発明器具１）

【0071】

２．抗ＮＰ抗体から成る免疫測定器具の作製
対照として、実施例２−６と同様の方法で、抗ＮＰ固定化メンブレンと抗ＮＰ固定化粒子を用いた試験片を作製した（従来器具）。

【0072】

３．Ａ型インフルエンザウイルス各亜型株の免疫測定
１で作製した免疫測定器具のサンプルパッドに、Ａ型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液を５０μＬ滴加し、８分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの、H1N1、H2N2、H2N3、H3N2、H3N8、H4N6、H5N1、H5N2、H6N2、H7N1、H7N7、H7N9、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8およびH16N3の各亜型ウイルスの測定において＋となった。

【0073】

４．Ａ型インフルエンザウイルス各亜型株との反応性比較
１および２で作製した免疫測定器具を用いて３と同様の方法で免疫測定を行い、本発明器具１と従来器具の反応性を比較した。本発明器具１は、従来器具では検出できなかった７の亜型（１２のウイルス株）においても全て検出が確認され、従来器具と比べて高い検出感度であることが示された。結果を表２に示す。

【0074】

【表2】

【0075】

（実施例５）Ａ型インフルエンザウイルスＭ１試験片とＡ型インフルエンザウイルスＮＰ試験片およびＡ型インフルエンザウイルスＭ１＋ＮＰ試験片によるＡ型インフルエンザウイルスの検出感度の比較
１．抗Ａ−Ｍ１抗体および抗Ａ−ＮＰ抗体から成る免疫測定器具の作製
実施例２−８で作製したＭ１＋ＮＰ試験片をそのまま使用した（本発明器具２）。

【0076】

２．抗Ａ−Ｍ１抗体からなる免疫測定器具および抗Ａ−ＮＰ抗体からなる免疫測定器具の作製
対照として、実施例４−１，２で作製した本発明器具１および従来器具をそのまま使用した。

【0077】

３．各測定器具を用いたＡ型インフルエンザウイルスの検出感度の比較
１および２で作製した各免疫測定器具のサンプルパッドに、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）を適宜希釈して含んだ検体浮遊液をそれぞれ５０μＬ滴加し、８分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。その結果、本発明器具１では従来器具よりも検出感度が低かったが、本発明器具２では従来器具に近い性能を得ることができた。このことからＡ型インフルエンザウイルスの株によってＮＰを検出する方が高感度に検出できる場合があることが明らかになったが、Ｍ１検出とＮＰ検出を合わせることで、株による違いを緩和することができることが示された。結果を表３に示す。

【0078】

【表3】

【符号の説明】

【0079】

イ 支持体
ロ 標識体領域
ハ 検出領域
ニ サンプルパッド
ホ 吸収帯
ヘ バッキングシート

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]