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特許6263121ポルフィリン−リン脂質の結合した微小気泡及びそれらの造影剤としての使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6263121
(24)【登録日】2017年12月22日
(45)【発行日】2018年1月17日
(54)【発明の名称】ポルフィリン−リン脂質の結合した微小気泡及びそれらの造影剤としての使用
(51)【国際特許分類】
A61K 49/22 20060101AFI20180104BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20180104BHJP
【ＦＩ】
A61K49/22
A61K49/00
【請求項の数】44
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2014-534894(P2014-534894)
(86)(22)【出願日】2012年10月11日
(65)【公表番号】特表2014-532062(P2014-532062A)
(43)【公表日】2014年12月4日
(86)【国際出願番号】CA2012000937
(87)【国際公開番号】WO2013053042
(87)【国際公開日】20130418
【審査請求日】2015年8月4日
(31)【優先権主張番号】61/546,663
(32)【優先日】2011年10月13日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507148294
【氏名又は名称】ユニバーシティー ヘルス ネットワーク
(74)【代理人】
【識別番号】100087398
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 勝文
(74)【代理人】
【識別番号】100067541
【弁理士】
【氏名又は名称】岸田 正行
(74)【代理人】
【識別番号】100103506
【弁理士】
【氏名又は名称】高野 弘晋
(74)【代理人】
【識別番号】100105072
【弁理士】
【氏名又は名称】小川 英宣
(72)【発明者】
【氏名】ジェン，ガン
(72)【発明者】
【氏名】ラベル，ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】ハイン，エリザベス
【審査官】
春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１１／０４４６７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特表２００９−５４０９０４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Deshpande N, et al.，Molecular ultrasound imaging: current status and future directions，Clinical Radiology，２０１０年，Vol.65, No.7，p.567-581
【文献】
Kim C, et al.，Multifunctional microbubbles and nanobubbles for photoacoustic and ultrasound imaging，Journal of Biomedical Optics，２０１０年，Vol.15, No.1，010510，doi: 10.1117/1.3302808
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ４９／００−４９／２２
Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９
ＰｕｂＭｅｄ
ＣｉＮｉｉ
医中誌ＷＥＢ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
カプセル化されたガスを備えた単分子層を含む微小気泡であって、前記単分子層はポルフィリン-リン脂質結合体を含み、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む微小気泡。
【請求項2】
１００モル％までのポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項3】
４０モル％までのポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項4】
３０モル％までのポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項5】
２０モル％までのポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項6】
５乃至２０モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項7】
５乃至１５モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項8】
１０乃至１５モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項9】
約１５モル％のポルフィリン-リン脂質結合体を含む請求項１記載の微小気泡。
【請求項10】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体が、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、広義のポルフィリンおよびポルフィリン異性体から成る群より選択される請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項11】
広義のポルフィリンが、テキサフィリン、サプフィリンまたはヘキサフィリンであり、ポルフィリン異性体が、ポルフィセン、転化されたポルフィリン、フタロシアニンまたはナフタロシアニンである請求項１０記載の微小気泡。
【請求項12】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるリン脂質が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項13】
リン脂質が、１２〜２２個の炭素のアシル側鎖を含む請求項１２記載の微小気泡。
【請求項14】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリンがピロフェオホルビド-a 酸である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項15】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリンがバクテリオクロロフィル誘導体である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項16】
ポルフィリン-リン脂質結合体におけるリン脂質が、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたは1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項17】
ポルフィリン-リン脂質結合体がピロ（Pyro）-脂質である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項18】
ポルフィリン-リン脂質結合体がオキシ-バクテリオクロロフィル-脂質である請求項１乃至９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項19】
ポルフィリンが、０〜２０個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合される請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項20】
ペグ（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）乳化剤をさらに含む請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項21】
ペグ（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）乳化剤が約１０００〜約５０００の分子量を有する請求項１９記載の微小気泡。
【請求項22】
ペグ（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）乳化剤は、Ｎ−ポリ(エチレン グリコール メチル エーテル) ５０００ カルバモイル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）、 １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ―［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２０００）、 １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、ポリオキシエチレン ４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ）及びこれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１９記載の微小気泡。
【請求項23】
ＰＥＧまたはＰＥＧ脂質が約１０モル％の量で存在する請求項２０乃至２２のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項24】
微小気泡が実質的に球形であり、約０．８μｍ〜１８μｍの直径である請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項25】
微小気泡が実質的に球形であり、約１μｍ〜９μｍの直径である請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項26】
微小気泡が実質的に球形であり、約２μｍ〜４μｍの直径である請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項27】
ポルフィリン-リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属、任意的に金属の放射性同位体、を含む請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項28】
金属がＺｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ及びＰｄから成る群より選択される請求項２７記載の微小気泡。
【請求項29】
ガスが生物学的に不活発なガスである請求項１乃至２８のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項30】
ガスがフッ素化ガスである請求項１乃至２８のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項31】
ガスが、大気、０２、Ｎ２、Ｈ２、Ｃ０２、Ｎ２０、貴ガス、炭化水素ガス、ペルフルオロカーボン、ヘキサフルオロ硫黄、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン及びこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項１乃至２８のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項32】
単分子層の残部は、他のリン脂質で実質的に構成される請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項33】
リン脂質は、陰イオンリン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール及びこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項３２記載の微小気泡。
【請求項34】
リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジアラチドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＬｇＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［リン光体（phosphor）-rac-（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）及びこれらの組み合わせから成る群より選択される、請求項３２記載の微小気泡。
【請求項35】
微小気泡は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール及びこれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１つの添加物を含む溶液中に形成される、請求項１乃至３４のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項36】
前記ポリエチレングリコールは、分子量が１０００〜６０００である請求項３５記載の微小気泡。
【請求項37】
標的分子をさらに含む請求項１乃至３６のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項38】
前記ポルフィリン-リン脂質結合体において、前記１種のポルフィリン、前記ポルフィリン誘導体または前記ポルフィリン類似体は、前記１種のリン脂質の前記脂質側鎖に、ｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で共有結合されている請求項１乃至３７のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項39】
微小気泡を製造する方法であって、
ガス、ポルフィリン-リン脂質結合体、及び他のリン脂質を混合することを含み、
前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む方法。
ガス、ポルフィリン-リン脂質結合体、及び他のリン脂質を混合することを含み、
前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む方法。
【請求項40】
ガスと混合するに先立って、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、前記他のリン脂質と混合されて脂質薄膜を形成し、続いて緩衝液中で水和される請求項３９記載の方法。
【請求項41】
前記ポルフィリン-リン脂質結合体において、前記１種のポルフィリン、前記ポルフィリン誘導体または前記ポルフィリン類似体は、前記１種のリン脂質の前記脂質側鎖に、ｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で共有結合されている請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項42】
画像化の遂行で使用されるための請求項１乃至３８のいずれか１項に記載の微小気泡。
【請求項43】
超音波画像化で使用されるための請求項４２記載の微小気泡。
【請求項44】
光音響画像化で使用されるための請求項４２記載の微小気泡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（発明の分野）この発明は、微小気泡の分野に関し、より明確には、リン脂質側鎖に結合したポルフィリンから形成された微小気泡に関する。
【背景技術】
【0002】
（発明の背景）微小気泡は、超音波イメージングのための音響コントラストを与える気体充填微小球である。現在、微小気泡は、超音波心臓検査を用いて、診療所において心臓診断のために慣例的に使用され［１］、また、癌の診断及び治療の手掛かりのために使用されている［２］，［３］。超音波は、最も手頃で利用しやすい画像診断療法のうちの１つであり、それゆえに、新たに可能となるどのような超音波造影技術も、既存の臨床のインフラストラクチャーに迅速で広範囲の影響を与える可能性を有している。微小気泡研究の拡大する分野は、診断の適用を越えて拡張する。前臨床研究は、種々の疾患および血液脳関門の交差［７］，［８］を治療するための超音波トリガ薬物及び遺伝子導入［５］，［６］ならびに病態生理学［４］を評価するための分子イメージングに、標的（ｔａｒｇｅｔ）微小気泡を使用している。
【0003】
臨床的に使用される微小気泡は、典型的には、自己組織化リン脂質シェルに組み込まれ、フッ素化ガスから形成されている。そのため、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）は、標的領域への微小気泡の結合を確認するために［９］、または超音波での破裂の際に微小気泡の破壊の証拠のために［１０］、微小気泡シェルに容易に組み込むことができる。しかしながら、微小気泡シェルの安定性に対するこれらの分子の存在の影響は、広く研究されておらず、また、シェルの残りの部分に対するフルオロフォアの総割合は最小だった。以前に、私々は、完全にポルフィリンを結合したリン脂質からリン脂質二重層状の構造を形成するための新しいパラダイムを導入した［１１］。高いポルフィリン特徴により、これらの構造は、蛍光、光音響、ＭＲ及びＰＥＴに適した強健な固有の多モードの画像化特性とともに、ユニークな物理的性質を実証した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
（発明の要約）一の側面では、カプセル化されたガスを備える単分子層を含む微小気泡が提供され、前記単分子層はポルフィリン-リン脂質結合体を含み、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む。
【0005】
さらなる側面では、微小気泡を製造する方法であって、ガス、ポルフィリン-リン脂質結合体、及び他のリン脂質を混合することを含み、
前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む方法が提供される。
【0006】
さらなる側面では、本明細書に記載される微小気泡を提供すること；かかる微小気泡を対象に投与すること；及び、超音波を用いて標的領域を画像化すること、を含む、対象の標的領域上での超音波画像化を遂行する方法が提供される。
【0007】
さらなる側面では、本明細書に記載される微小気泡を提供すること；かかる微小気泡を対象に投与すること；及び、標的領域で光音響の信号を測定または検知すること、を含む、対象の標的領域を画像化する方法が提供される。望ましくは、本方法は、さらに、標的領域で光音響の信号の増加を測定または検知するに先立って、標的領域で微小気泡を破裂させることを含む。
【0008】
さらなる側面では、画像化を遂行するために、本明細書に記載される微小気泡の使用法が提供される。
【0009】
さらなる側面では、画像化の遂行で用いるために、本明細書に記載される微小気泡が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本発明の実施形態は、以下の説明及び添付図面を参照することで最も理解しやすいであろう。図面において：【図1】図１は、ポルフィリン・シェル（「ｐｏｒｓｈｅ」）微小気泡を容易に形成することが可能であることを示す。Ａ）ガス（底部）をカプセル化して形成されたポルフィリン−脂質（上部）及びｐｏｒｓｈｅ微小気泡の概要図。Ｂ）１５ｍｏｌの％ポルフィリン−脂質（ｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ−ｌｉｐｉｄ）で生じた微小気泡の画像。Ｃ）標準微小気泡手順を用いてｐｏｒｓｈｅ微小気泡を生成するための簡単なワンポット合成。
【図2】図２は、ＤＳＰＣ、ＰＥＧ４０Ｓ及び０．０１ＭのＰＢＳの緩衝剤を使用して、ポルフィリン−脂質の混入が、微小気泡構成の産出を改善することを示す。微小気泡の数は、製剤に含まれたポルフィリン−脂質の量の関数として数えられた。微小気泡は３つの一般に用いられているフッ素化されたガスから形成された：ペルフルオロプロパン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐａｎｅ（ＰＦＰ））、ペルフルオロブタン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｂｕｔａｎｅ（ＰＦＢ））及びヘキサフルオロ硫黄（Ｓｕｌｆｅｒ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＳＦ６））。５〜１５％のポルフィリン−脂質の包含は、リン脂質、界面活性剤及び緩衝剤のこの特定の混合のための最適な微小気泡製剤に帰着する。
【図3】図３は、ｐｏｒｓｈｅ微小気泡が血清中の改善された安定性を有することを示す。微小気泡は、ポルフィリン−脂質が１５モル％で、またはその脂質なしで形成され、３７℃のウシ血清中で培養された。吸光度は、光散乱に基づいた、残りの微小気泡の数を表す。ポルフィリン微小気泡は、ポルフィリン-脂質なしで形成された微小気泡の２倍の半減期を有し、血清中でより安定していた。
【図4】図４は、ポルフィリン−脂質微小気泡が、ポルフィリン−脂質なしで形成された微小気泡と比較して、２〜３ミクロン前後の優れたサイズ分布を持っていることを示す。微小気泡はコールター・カウンタを使用して測定された。ポルフィリン−脂質で形成された微小気泡が２〜４ミクロンのサイズで大規模かつ明確な集団を有していることが注目される。伝統的な脂質微小気泡は、しばしば、多分散のサイズ分布を示す。
【図5】図５は、ｐｏｒｓｈｅ微小気泡のための周波数の関数としての音響減衰を示す。グレー：１．５〜８．５ＭＨｚ変換器。黒：７〜２７．５ＭＨｚ変換器。Ｐｏｒｓｈｅ微小気泡は、９〜１０ＭＨｚ間で共振周波数を示す。
【図7】図７は、マウス頚静脈の増強された標準及び造影超音波イメージングのためのｐｏｒｓｈｅ微小気泡の使用を示す。尾静脈注射によってマウスにＰｏｒｓｈｅ微小気泡が注入され、Ｂモード及びコントラストモード画像の両方が獲得された。１８ＭＨｚの変換器周波数が画像化に使用された。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（好ましい実施形態の詳細な説明）本明細書で記載する「ｐｏｒｓｈｅ」微小気泡は、ガス（好ましくはフッ化されたガス）をカプセル化するポルフィリン・リン脂質シェルで構成された微小気泡の新しいクラスである。
【0012】
一の側面では、カプセル化されたガスを備える単分子層を含む微小気泡であって、前記単分子層はポルフィリン-リン脂質結合体を含み、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む微小気泡が提供される。
【0013】
アプリケーションの微小気泡を形成するのに使用されるポルフィリン-リン脂質結合体の例は、本出願人による国際公開ＷＯ１１／０４４６７１号に記載される。
【0014】
一の形態では、カプセル化されたガスを備えた単分子層を含む微小気泡であって、前記単分子層はポルフィリン-リン脂質結合体を含み、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む微小気泡が提供される。
【0015】
異なる実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体は、５，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，及び９０モル％を含む、１００モル％までの異なるモル％で存在することができる。
【0016】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体が、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、テトラフェニルポルフィリン、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、ケトクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン、ベンゾバクテリオクロリン、広義のポルフィリンおよびポルフィリン異性体から成る群より選択される。好ましくは、広義のポルフィリンは、テキサフィリン、サプフィリンまたはヘキサフィリンであり、ポルフィリン異性体は、ポルフィセン、転化されたポルフィリン、フタロシアニンまたはナフタロシアニンである。
【0017】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体におけるリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールを含む。好ましくは、リン脂質は、１２〜２２個の炭素のアシル側鎖を含む。
【0018】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリンは、ピロフェオホルビド-a 酸である。
【0019】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体におけるポルフィリンは、バクテリオクロロフィル誘導体である。
【0020】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体におけるリン脂質は、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンまたは1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリンである。
【0021】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体は、ピロ（Pyro）-脂質である。
【0022】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体は、オキシ-バクテリオクロロフィル-脂質である。
【0023】
幾つかの実施形態では、ポルフィリンは、０〜２０個の炭素の炭素鎖リンカーによってリン脂質上のグリセロール基に結合される。
【0024】
幾つかの実施形態では、微小気泡は、ペグ（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）乳化剤をさらに含み、好ましくは、約１０００〜約５０００の分子量を有する。好ましい実施形態では、ペグ（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）乳化剤は、Ｎ−ポリ(エチレン グリコール メチル エーテル) ５０００ カルバモイル）−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン（ＭＰＥＧ５０００−ＤＰＰＥ）、 １，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ―［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２０００）、 １，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）、ポリオキシエチレン ４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ）及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。特定の実施形態では、ＰＥＧかＰＥＧ脂質が約１０モル％の量で存在する。
【0025】
幾つかの実施形態では、微小気泡は、実質的に球形であり、約０．８μｍ〜１８μｍの直径であり、好ましくは約１μｍ〜９μｍの直径であり、さらに好ましくは約２μｍ〜４μｍの直径である。
【0026】
幾つかの実施形態では、ポルフィリン-リン脂質結合体は、その中にキレート化された金属、任意的に金属の放射性同位体、を含む。金属は、好ましくは、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｆｅ及びＰｄから成る群より選択される。
【0027】
幾つかの実施形態では、カプセル化されたガスが生物学的に不活発なガスである。
【0028】
微小気泡で使用するのに適切なガスは、次のものを含む：大気、０２、Ｎ２、Ｈ２、Ｃ０２、Ｎ２０、貴ガス、炭化水素ガス、ペルフルオロカーボン、他のフッ素化ガス及びこれらの組み合わせ。フッ素化ガスは、それらが、生体外及び生体内での微小気泡のより大きな安定性に帰着する水に可溶でないという理由で好ましい。使用され得る不溶性ガスの他の例は、ヘキサフルオロ硫黄、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン及びこれらの組み合わせを含む。
【0029】
微小気泡製剤に使用される好ましいリン脂質は、１２〜２４の炭素及び頭部（ｈｅａｄｇｒｏｕｐｓ）での異なる炭素鎖長を包含し、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸及びホスファチジルグリセロールを含む。さらなる実施形態では、リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジベヘノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１，２−ジアラチドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、１，２−ジリグノセロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＬｇＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［リン光体（phosphor）-rac-（１−グリセロール）］（ＤＰＰＧ）及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【0030】
微小気泡は、様々な種類と濃度のｐＨ緩衝剤を用いた溶液及び塩類で形成することが可能である。増大化される貯蔵及び取り扱い安定性のために、緩衝液中に添加物を含めることができる。幾つかの実施形態では、微小気泡は、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール（好ましくは１０００〜６０００の分子量で）及びこれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１つの添加物を含む溶液中に形成される。
【0031】
幾つかの実施形態では、微小気泡は、さらに標的分子を含む。
【0032】
さらなる側面では、微小気泡を製造する方法であって、ガス、ポルフィリン-リン脂質結合体、及び他のリン脂質を混合することを含み、前記ポルフィリン-リン脂質結合体が、１種のリン脂質の脂質側鎖に、好ましくはｓｎ−１またはｓｎ−２の位置で、共有結合された１種のポルフィリン、ポルフィリン誘導体またはポルフィリン類似体を含む方法が提供される。
【0033】
好ましくは、ガスと混合するに先立って、ポルフィリン-リン脂質結合体は、前記他のリン脂質と混合されて脂質薄膜を形成し、続いて緩衝液中で水和される。
【0034】
さらなる側面では、対象の標的領域上での超音波画像化を遂行する方法であって、本明細書に記載される微小気泡を提供すること；前記微小気泡を対象に投与すること；及び、超音波を用いて標的領域を画像化すること、を含む方法が提供される。
【0035】
さらなる側面では、対象の標的領域を画像化する方法であって、本明細書に記載される微小気泡を提供すること；前記微小気泡を対象に投与すること；及び、前記標的領域で光音響の信号を測定及び／又は検知すること、を含む方法が提供される。好ましくは、かかる方法はさらに、光音響の信号を測定及び／又は検知することに先立って、標的領域で微小気泡を破裂させることを含む。
【0036】
さらなる側面では、画像化を遂行するために本明細書に記載される微小気泡の使用が提供される。
【0037】
さらなる側面では、画像化の遂行で用いるために、本明細書に記載される微小気泡が提供される。
【0038】
ある実施形態では、画像化は、胸画像化、腫瘍画像化、頚動脈の新血管新生画像化あるいは内視鏡的画像化である。
【0039】
以下の実施例は、本発明の種々の側面の例示であり、本明細書に示されるような発明の広い側面を制限するものではない。
【0040】
〔実施例〕〔方法〕
【0041】
（ポルフィリン−脂質微小気泡の構成）脂質薄膜は、１２ｍｍ×３５ｍｍの透明ガラスのねじ込み瓶（フィッシャーサイエンティフィック社製）内で、クロロホルムに溶かされた１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ，アバンティ ポーラ リピッド社製）とポルフィリン−脂質（ピロフェオホルビド-脂質）とを混合することで作製された。薄膜は、窒素ガスの流れの下で乾燥させられ、さらに真空下で３０分間乾かされた。脂質薄膜は、０．０１Ｍのリン酸緩衝食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４）及び脱イオン化された水に溶かされたポリオキシエチレン-４０ステアレート（ＰＥＧ４０Ｓ，シグマアルドリッチ社製）を用いて、水和するまで、アルゴンガスの下で−２０℃で格納された。脂質濃度の合計は、容量０．５ｍｌにおいて０．５ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌのいずれかであった。各々のバイル（vile）の頭隙は、ガスで満たされた。各バイル（vile）は、６５℃に加熱された水槽中に置かれて、包含された脂質の遷移温度以上に溶液温度が上げられた。当該加熱されたバイル（vile）は、脂質薄膜を溶液に分散させるために超音波（ブランソニック (Bransonic)２５１０モデル）で１０秒間処理され、ガスがもう一度頭隙に加えられた。微小気泡は、バイアルミックス（ブリストル-マイヤーズ スクイブ社製、Vial-Mix：登録商標）内で４５秒間震動させることにより形成された。
【0042】
〔微小気泡の濃度及びサイズ分布の特性評価〕ポルフィリン−脂質及び均一な微小気泡は、示されたモル％のポルフィリン−脂質、１０モル％のＰＥＧ４０Ｓ及び残部のＤＳＰＣを用いて製剤された。ガラス瓶の頭隙は、ヘキサフルオロ硫黄（ＳＦ６，シグマアルドリッチ社製）、ペルフルオロブタン（ＰＦＢ，Ｆｌｕｏｒｏｍｅｄ Ｌ．Ｐ社製）またはペルフルオロプロパン（ＰＦＰ，Ｆｌｕｏｒｏｍｅｄ Ｌ．Ｐ社製）ガスで満たされた。振動による微小気泡の活性化の後、微小気泡は６時間以内に使用された。各々の微小気泡製剤のサイズ分布及び濃度（泡の数／ｍｌ）は、コールター・カウンターシステム（マルチサイザーＩＩＩ；ベックマン・コールター社製）を使用して測定された。様々な量の微小気泡が１０ｍｌのイソトン-II 電解質溶液（ベックマン・コールター社製）に加えられて、微小気泡１００,０００〜３００,０００個の微小気泡のカウント数を得た；稀釈は、微小気泡濃度の計算で説明された。個数及びサイズ分布は、０．８μｍ〜１８μｍの直径の微小気泡が検知される３０μｍの口径を使用して測定された。各々の微小気泡の製剤に対して、３つのサンプルが測定された。
【0043】
〔血清中の生体外の微小気泡安定性〕微小気泡の安定性は、３７℃で、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中の１５モル％のポルフィリン−脂質で及びその脂質なしで形成された微小気泡の間で比較された。微小気泡は、９６の井戸プレート中の４．７×１０８微小気泡／ｍｌの濃度でＦＢＳを用いて培養された。３７℃での培養を開始した後の４時間に至るまで、プレートリーダースペクトラマックスプラス384（モレキュラーデバイス社製）を用いて、５８０ｎｍで０分、１分、５分、１０分、１５分で、その後１５分間隔で吸光度を記録した。プレートは、各々の測定に先立って５秒間混合された。吸光度は、微小気泡の濃度を代表する。３つのサンプルの安定性は、各々の製剤に対して測定された。
【0044】
〔微小気泡の音響特性〕音響特性は、ＰＦＰガスを用い、総脂質濃度０．５ｍｇ／ｍｌにおいて、１５モル％のポルフィリン−脂質，１０モル％のＰＥＧ４０Ｓ，７５モル％のＤＳＰＣからなるｐｏｒｓｈｅ微小気泡の容量１ｍｌで遂行された。１分間のデカンテーションの後、各ガラス瓶の底から抽出された全容量は、標準規格注射針１８を使用して、０．５ｍｌであった。抽出の後に、かかる薬剤が新たな１．５ｍｌのガラス瓶内に置かれ、上部がＰＦＰガスで覆われ、パラフィルム（フィッシャーサイエンティフィック社製）で緩く密閉された。続いて、ガラス瓶は、コールター・カウンタ及び希薄測定に先立って、手作業で１０秒間、緩やかに混合された。全ての測定は、室温で行なわれた。デ・ヨング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）ら（ｄｅ Ｊｏｎｇ他，超音波学 １９９２，３０，９５−１０３）によって最初に記載された方法を使用して、周波数に依存する減衰測定を行って、音響応答を評価した。これについては、ゲルツ（Goertz）他（ゲルツ他，Ultrasound Med Biol ２００７年，３３，１３７６−１３８８）で報告された構成に類似する狭周波数帯パルス反射法が使用された。１．５−２７ＭＨｚの周波数帯域を対象とするために、２台の変換器（モデル＃５９５３９６，５ＭＨｚ，焦点７６ｍｍ，直径１２．７ｍｍの、オリンパスＮＤＴカナダ社製； モデル＃ＩＳＯ２００２ＨＲ，２０ＭＨｚ，焦点３８ｍｍ，直径６．３５ｍｍ、ヴァルペイ・フィッシャー社製）が使用された。かかる変換器は、水槽内に位置し、それらのビームは、薄められた薬剤を含有する試料室を通過し、マイラー（ｍｙｌａｒ）ウィンドーを通過して、アルミニウム反射器に合焦させられた（図２で開示）。０．５ＭＨｚのインターバルで一定間隔で配置された中心周波数を備えたパルスを生成するために、任意の波形ジェネレータ（モデルＡＷＧ５００２Ｃ，テクトロニクス社製）が使用された。続いて、入力波形が５３ｄＢ増幅され（モデルＡ−１５０，ＥＮＩ社製）、次に、２台の変換器のうちの１台に送られた。受信時に、エコーが３５ｄＢ増幅され（モデルＡＵ１５８３，Ｍｉｔｅｑ社製）、オフライン分析のために、帯域通過フィルタリングされた後にディジタル化された（４００ＭＨｚのサンプリング周波数（アジレント・テクノロジー社製））。全ての波形に対する焦点でのピーク負圧は、直径０．０７５ｍｍニードルチップハイドロホン（モデル１５４４，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｃｏｕｓｔｉｃｓ社製）を使用して、２５キロパスカル（ｋＰａ）であることが正確に測定された。実験は、生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）中に薬剤が希釈されて（１：７５００）行われ、希釈の１分後に音響測定が開始された。実験は、合計３つのサンプルについて、サンプル当たり１回行なわれた。薬瓶（バイアル）から薬剤を抽出した後に直ちにサイズ測定を行い、減衰実験は、同じバイアル抽出からのサンプルを使用してコールターカウンター測定値に従って実施した。微小気泡シェル特性は、デ・ヨング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）ら（Ｎ．デ・ヨング、Ｌ・ホフ（Hoff）、Ｔ．スコットランド（Ｓｋｏｔｌａｎｄ）、Ｎ．ボム（Ｂｏｍ）、超音波学 １９９２，３０，９５−１０３）に最初に記載された一般的なアプローチを用いて評価された。ここで使用されたアプローチの具体的詳細は、他所で議論される（Ｄ．Ｅ．ゲルツ（Ｇｏｅｒｔｚ）、Ｎ．デ・ヨング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）、Ａ．Ｆ．ヴァン デア ステーン（Ｓｔｅｅｎ）、Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２００７年，３３，１３７６−１３８８．）。
【0045】
〔マウス頚静脈の生体内微小気泡超音波画像化〕大学健康ネットワークガイドラインに従って、動物実験が行なわれた。ポルフィリン−脂質微小気泡は、雌のＢＡＬＢ／ｃＪマウスの頸静脈中で画像化された。化学脱毛剤（ネア；カーターホーナー（Carter-Horner））を用いて、マウスの首から体毛が取り除かれた。マウスは、心拍及び呼吸モニタリング用のＥＣＧ電極にすべての脚を貼り付けてプラットフォーム上であお向けで寝かされた。マウスは、その血管を拡張するために約５分間プラットフォーム上で加温された。尾静脈から微小気泡（〜１．５×１０９泡／ｍｌ）の３０μｌボーラスを注入するために、２７Ｇ針が使用された。頸静脈は、コントラストモードにおける１８ＭＨｚの変換器が装備されたＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社のＶｅｖｏ２１００スキャナを使用して画像化された。画像は、ポルフィリン−脂質微小気泡の注射の前及び注射の４秒後に得られた。画像のコントラストは、直線的に自動調節された。
【0046】
〔皮下のマウス腫瘍の生体内微小気泡超音波画像化〕左脇腹の皮下にＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を持つ雌の無胸腺（ａｔｈｙｍｉｃ）ヌード・マウスが、尾静脈から、１．５ｘ１０９までのｐｏｒｓｈｅ微小気泡／ｍｌの５０μｌボーラスが、２６ゲージ留置カテーテルを使用して注射され、続いて１５０μｌの生理食塩水洗浄がなされた。マウスは、注射時に１２〜１４週齢であった。尾部は、カテーテル法に先立って尾静脈を拡大するために、加熱された生理食塩水の小袋を用いて暖められた。腫瘍は、同時対比（ｃｏｎｔｒａｓｔ）モード及びＢモード画像中に、フィリップスｉＵ２２ ｘＭＡＴＲＩＸ超音波システム（フィリップスメディカルシステムズ社製）及び、５−１２ＭＨｚの動作周波数及び０．０７の機械的なインデックスでのＬ１２−５プローブを使用して、画像化された。
【0047】
〔ファントム（phantom）内の微小気泡の光音響及び超音波画像化〕光音響特性評価は、５ｎｓの幅及び１０Ｈｚの繰り返し率のレーザパルスを供給するのに使用されるＱ-スイッチＮｄ：ＹＡＧレーザによって送り出された波長調整可能な光学パラメータ式発振器（ＯＰＯ）レーザ（Ｓｕｒｅｌｉｔｅ ＯＰＯ ＰＬＵＳ；Continuum；波長同調性：６５０〜１０６０ｎｍ）を使用して、完結した。コリメートレーザパルスが手製のアキシコンレンズを通過して移動した時に、リング形の光ビームが形成された。これは、光学のコンデンサを通って合焦され、水タンク中の超音波震源域を同軸で整列させた。生成された光音響的な波は、１２５μｍ及び１４０μｍの軸及び横軸解像度で、単一要素の１０ＭＨｚの変換器（Ｖ３１５；パナメトリクス−ＮＤＴ）によってそれぞれ検知された。試料容器は、超音波ゲルと結合された薄い透明な膜で覆われ、光学的及び音響的に透過的な窓を有する水槽の下に配置した。水性試料は、直径９ｍｍ、深さ３ｍｍの井戸を満たした。検出されたＰＡ信号は、低雑音増幅器（５０７２ＰＲ，パナメトリクス−ＮＤＴ）によって一次増幅され、デジタルオシロスコープ（ＴＤＳ５０５４，テクトロニクス社製）によって記録された。超音波イメージングのために、我々は、光音響イメージング用のものと同一の変換器及びラスタ走査システムを利用した。超音波モードでは、低雑音増幅器は、超音波パルス送信機と受信機の両方として機能した。光音響及び超音波生成は、次の３つのサンプルから測定して画像化した：標準微小気泡（ポルフィリン - 脂質０％）、ｐｏｒｓｈｅ微小気泡（ポルフィリン- 脂質１５％）、及び１５％のポルフィリン-脂質微小気泡に存在するようなピロ酸と同一のモル濃度で共培養された標準微小気泡。
【0048】
結果ここでは、ガス、好ましくはフッ素化ガスをカプセル化するポルフィリン-リン脂質シェル（ｓｈｅｌｌ）で構成された微小気泡の新しいクラスについて説明する。これらのポルフィリン・シェル微小気泡すなわち「ポルシェ（ｐｏｒｓｈｅ）微小気泡」は、標準的な加振方法（図１）を用いて容易に合成することが可能であり、種々のユニークな物理的性質を有していた。
【0049】
ポルフィリン-リン脂質が特定の濃度（５〜２０モル％のポルフィリン-リン脂質が最も多くの泡を生成した）で標準的な微小気泡製剤に代用された場合に、生じる微小気泡は、より高い産出で形成されることが見出された（図２）。任意の理論によって拘束されることなく、我々は、ポルフィリンの成分がシェルを安定させて更なるガス分解を防ぎ、より大きな産出に帰着するものと仮定する；但し、高い産出を維持するために、幾らかの標準的なリン脂質が必要とされた。ペルフルオロプロパン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐａｎｅ）ガスをカプセル化する１５ｍｏｌ％のポルフィリン−脂質製剤は、これらのＭＢが、組み込まれたポルフィリン−脂質を相対的に大量に備えた高い産出で生成されたので、さらなる研究用に選択された。
【0050】
ｐｏｒｓｈｅ ＭＢの性質は、単にＤＳＰＣとＰＥＧ４０Ｓを使用してポルフィリン−脂質のないＰＢＳで形成されたＭＢと比較された。ＭＢの安定性に関するポルフィリン−脂質の影響を評価するために、ポルフィリン−脂質なしで形成されたＭＢ及びｐｏｒｓｈｅ ＭＢが、ウシ胎仔血清中で３７℃で培養された。光散乱による光学的な吸光度は、ＭＢの濃度の基準として使用され、４時間の期間にわたってモニタされた。Ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、ポルフィリン-脂質なしのＭＢよりもはるかに高い安定性を示し、血清内でほぼ２倍の長さで残り（図３）、さらにそのポルフィリン−脂質がＭＢのシェルに組み込まれただけでなく、より安定したＭＢをもたらしたことが実証された。 現在臨床的に使用される微小気泡は、通常、生体内での血清中わずか数分の間だけ存続する。ｐｏｒｓｈｅ微小気泡のより長い存続（ほぼ２倍）は、血清中の標準的な微小気泡を凌駕し、さらに、ポルフィリン−脂質が微小気泡シェルを安定させることを示唆する。循環時間の任意の延長は、非常に望ましいものである。
【0051】
単分散微小気泡は、多分散微小気泡の集団と比較して、優れた超音波信号を生成することが認められる［１２］。我々のポルフィリン・シェル微小気泡は、優れた単分散性を有することが示された（図４）。高い単分散性は、非常に望ましい、未だ得ることが困難な微小気泡の特性である。単分散性のこの水準は、ポルフィリン-脂質がシェルに組み込まれたときにのみ観察された。この単分散のサイズ集団が、それ以上の精製工程のない、単純な製造方法によって達成されたことは注目に値する。
【0052】
ｐｏｒｓｈｅ ＭＢの狭い容積測定のサイズ分布は、周波数の増加とＵＳの減衰の急騰を生み出し、これは、９〜１０ＭＨｚでピークを示し、２７．５ＭＨｚまで徐々に漸減した（図５）。 幾つかの商用脂質ベースのＭＢより高い共振周波数（ｆ ｒｅｓ）を有し、ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、胸画像化、頚動脈の新血管新生、表面的な腫瘍及び内視鏡検査法の画像化を含む、５〜１５ＭＨｚの周波数帯域を利用するアプリケーションの画像化には好都合であり得る。
【0053】
ｐｏｒｓｈｅ微小気泡の機械的性質は、デ・ヨング（ｄｅ Ｊｏｎｇ）らにより導入された音響理論モデル［１３］、及び、音響減衰（図５）及びサイズ分布（図４）からの入力データを用いて測定された。シェル強度の評価は、以前に幾つかの商用脂質ＭＢについて報告されており、また、ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、これらの薬剤より３〜５倍堅いことが見出され（図６）、減少したガス透過率及びより大きな耐崩壊性の結果として、堅いシェルになることを示唆している。
【0054】
さらに、ポルフィリン・シェル微小気泡は、本質的に、多モードの画像化に適している。多数のポルフィリンは、ポルフィリン・シェル（典型的な１５ｍｏｌ％の微小気泡構成に対して１００万以上のポルフィリン）へ統合される。これは、ハイブリッドＰＥＴまたはＭＲイメージング法、あるいは新たな超音波ガイド光イメージング技法に適したものである。
【0055】
Ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、脂質ＭＢに関連した非線形の特性を維持して超音波造影を提供した。Ｐｏｒｓｈｅ微小気泡は、健康なマウス中の頚静脈を識別し（図７）、静脈注射の後に人間の乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）異種移植片を運ぶマウス中の皮下の腫瘍を画像化することが可能であった（図８）。
【0056】
ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、ポルフィリン−脂質の存在によって、７００ｎｍでピークに達する光音響信号を生成することが可能になる（図９）。ポルフィリン−脂質なしで形成されたＭＢ、ｐｏｒｓｈｅ ＭＢ、及び等モルの遊離ポルフィリン（ピロフェオホルビド：ｐｙｒｏｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ）で共に培養されたポルフィリン−脂質のないＭＢは、７００ｎｍ、５ｎｓパルスレーザー及び１０ＭＨｚの単一元素ＵＳ変換器を使用して、井戸の試料において光音響的に画像化された（図１０ａ上側）。ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、ポルフィリン−脂質なしで創設されたＭＢよりも１０倍大きいＰＡ信号、及び遊離ポルフィリンと混合されたポルフィリン−脂質のないＭＢよりも６倍大きなＰＡ信号を生成した（図１０ｂ）。これは、ＭＢがＰＡ信号を生成するためにポルフィリンが存在しなければならないだけでなく、ポルフィリンが脂質と結合してＭＢのシェル内に存在しなければならないことを実証するものである。ＭＢの集団の全てが、強いＵＳ信号（図１０ａ下側、図１０ｂ）を生成し、ｐｏｒｓｈｅ ＭＢは、２重のモダリティ（dual-modality）のＵＳ／ＰＡ造影剤として機能する能力を有することが確認された。
【0057】
ポルフィリン−脂質微小気泡の破裂は、高出力超音波または超音波処理を使用して遂行されることができる。微小気泡を破裂させる際、小さなポルフィリン−脂質アセンブリー（ナノメートル規模）が形成されるであろうし、それは、ポルフィリン−脂質の最密充填密度を維持するかもしれないし、維持しないかもしれない。ポルフィリン−脂質微小気泡の破裂は、医用画像に関するアプリケーション、及び軟繊維へのより小さなポルフィリン−脂質アセンブリーの外部的に引き起こされる送達による薬物送達に役立つことができる。
【0058】
これらの独自的であるが補完的な有利な特性は、ポルシェマイクロバブルが両方の既存の超音波イメージングのための改良された造影剤に理想的に適合するだけでなく、マルチモーダルイメージングの手法（例えば光音響イメージング）を新興する。
【0059】
発明の好ましい実施態様を本明細書において説明したが、本発明の意図または添付された請求の範囲から離れることなく、それらに対する変更を行うことができることを当業者は理解するであろう。以下の参考文献リストを含む、本明細書に言及された全ての参照文献は、引用することによってその全体が組み込まれる。
【0060】
参考文献［１］ Ｓ．リウ(Liu)及びＭ．Ａ．ヴァンナン（Vannan），「通常業務におけるエコー造影の使用（"Use of Echo Contrast in Routine Practice"）」，事例に基づく心エコー検査（in Case Based Echocardiography），Ｔ．アブラハム(Abraham)，Ed.ロンドン(London)：スプリンガー(Springer) ロンドン，２０１０年，第１１７−１２５頁
［２］ Ｆ．モリヤス（Moriyasu），Ｋ．イトウ（Itoh）「局所的肝臓障害の特性評価及び検知におけるペルフルブタン（Ｐｅｒｆｌｕｂｕｔａｎｅ）微小気泡強化超音波の有効性：フェーズ３複数医療機関による臨床試験（"Efficacy of Perflubutane Microbubble-Enhanced Ultrasound in the Characterization and Detection of Focal Liver Lesions: Phase 3 Multicenter Clinical Trial"）」米国Ｘ線医学会誌（American Journal of Roentgenology），２００９年７月，第１９３巻，第１号，第８６−９５頁。
［３］ Ｈ．Ｐ．ウェスコット（Weskott），「造影超音波のための新興役割（"Emerging roles for contrast-enhanced ultrasound"）」，臨床血液レオロジーおよび微小循環，２００８年１月，第４０巻，第１号，第５１−７１頁。
［４］ Ａ．Ｌ．クリバノフ（Klibanov），「配位子を持ったガス充填の微小気泡：ターゲット分子イメージングのための超音波造影剤（"Ligand-Carrying Gas-Filled Microbubbles: Ultrasound Contrast Agents for Targeted Molecular Imaging"）」，バイオコンジュゲートケミストリー（Bioconjugate Chemistry），第１６巻，第１号，第９−１７頁。
［５］ Ａ．ローリー（Lawrie），Ａ．Ｆ．ブリスケン（Brisken)，Ｓ．Ｅ．フランシス(Francis)，Ｄ．Ｃ．カンバーランド(Cumberland)，Ｄ．Ｃ．クロスマン(Crossman)及びＣ．Ｍ．ニューマン(Newman)，「血管遺伝子導入用の微小気泡に増強された超音波（"Microbubble-enhanced ultrasound for vascular gene delivery"）」、遺伝子治療（Gene Therapy），２０００年１２月，第７巻，第２３号，第２０２３−２０２７頁。
［６］ Ｓ．ハーノット（Hernot），「超音波・トリガー薬物及び遺伝子導入における微小気泡（"Microbubbles in ultrasound-triggered drug and gene delivery"）」，Advanced Drug Delivery Reviews，第６０巻，第１０号，第１１５３−１１６６頁
［７］ Ｍ．キノシタ（Kinoshita），Ｎ．マクダノルド（McDannold），Ｆ．Ａ．ジョレス（Jolesz），Ｋ．ハイニネン（Hynynen），「ＭＲＩに誘導された集束超音波の血液脳関門破壊によるマウス脳へのハーセプチンの非侵襲的局所的導入（"Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound- induced blood-brain barrier disruption"）」，米国科学アカデミー（２００６年８月，第１０３巻，第３１号，第１１７１９−１１７２３頁）の議事録
［８］ Ｍ．キノシタ（Kinoshita），Ｎ．マクダノルド（McDannold），Ｆ．Ａ．ジョレス（Jolesz），Ｋ．ハイニネン（Hynynen），「ＭＲＩに誘導された集束超音波による脳血液関門を通じた抗体の標的化導入（"Targeted delivery of antibodies through the blood-brain barrier by MRI-guided focused ultrasound"）」，生化学・生物物理学のリサーチ・コミュニケイションズ，第３４０巻，第１０８５−１０９０頁
［９］ Ｊ．Ｒ．リントナー（Lindner)， Ｊ．ソング（Song），Ｊ．クリスティアンゼン(Christiansen)，Ａ．Ｌ．クリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ），Ｆ．スー（Xu），及びＫ．レイ（Ley），「Ｐ−セレクチンに狙いを定めた微小気泡を用いた炎症及び腎組織損傷の超音波評価（"Ultrasound Assessment of Inflammation and Renal Tissue Injury With Microbubbles Targeted to P-Selectin"）」，血液循環（Circulation）、２００１年１０月，第１０４巻，第１７号，第２１０７−２１１２頁
［１０］ Ｄ．Ｍ．スカイバ（Ｓｋｙｂａ），Ｒ．Ｊ．プライス（Price），Ａ．Ｚ．リンカ（Ｌｉｎｋａ），Ｔ．Ｃ．スカラク（Ｓｋａｌａｋ）及びＳ．カウル（Ｋａｕｌ），「超音波及び組織についてのその局所効果による微小気泡の血管内の破壊の直接の生体内のビジュアル化（"Direct In Vivo Visualization of Intravascular Destruction of Microbubbles by Ultrasound and its Local Effects on Tissue"）」，血液循環（Circulation），１９９８年７月，第９８巻，第４号，第２９０−２９３頁
［１１］ Ｊ．Ｆ．ラヴェル(Lovell)他，（「多モードのバイオフォトニック造影剤として用いるためのポルフィリン二分子層により生成されたポリフィゾムナノ小胞（"Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents"）」，Nat Mater，２０１１年４月，第１０巻，第４号，第３２４−３３２頁
［１２］ Ｊ．Ｅ．ストリータ（Streeter），Ｒ．ゲスナー（Gessner），Ｉ．マイル(Miles)及びＰ．Ａ．デートン(Dayton)，「造影剤の粒度分布を調整することによる超音波分子イメージングにおける感度の向上化：インビボ研究（"Improving sensitivity in ultrasound molecular imaging by tailoring contrast agent size distribution: in vivo studies"）」分子像(Molecular Imaging)、２０１０年４月，第９巻、第２号，第８７−９５頁
［１３］ Ｎ．デ ジョン（ｄｅ Ｊｏｎｇ）；Ｌ．ホフ（Ｈｏｆｆ）；Ｔ．スコットランド（Ｓｋｏｔｌａｎｄ）；Ｎ．ボム（Ｂｏｍ），「カプセル化されたガスが充填されたマイクロスフェアの吸収と散布：理論的考察および幾つかの測定（"Absorption and scatter of encapsulated gas filled microspheres: theoretical considerations and some measurements"）」，超音波学（Ultrasonics），第２号，１９９２年３月，第３０巻，第９５−１０３頁