特許 6263133 ＵＫ−２生合成遺伝子とそれを用いたＵＫ−２生産性向上法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6263133

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】ＵＫ−２生合成遺伝子とそれを用いたＵＫ−２生産性向上法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180104BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20180104BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180104BHJP

   C12P 17/16 20060101ALI20180104BHJP

   C12R 1/625 20060101ALN20180104BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12Q1/68 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12P17/16

   C12P17/16

   C12R1:625

【請求項の数】15

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2014-560583(P2014-560583)

(86)(22)【出願日】2013年7月8日

(65)【公表番号】特表2015-523053(P2015-523053A)

(43)【公表日】2015年8月13日

(86)【国際出願番号】JP2013069081

(87)【国際公開番号】WO2014010714

(87)【国際公開日】20140116

【審査請求日】2016年6月16日

(31)【優先権主張番号】特願2012-153986(P2012-153986)

(32)【優先日】2012年7月9日

(33)【優先権主張国】JP

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-11437

(73)【特許権者】

【識別番号】000006091

【氏名又は名称】Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】小林 浩詠

(72)【発明者】

【氏名】隅田 奈緒美

(72)【発明者】

【氏名】矢内 耕二

【審査官】 厚田 一拓

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０７−２３３１６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第０３／０３５６１７（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００ − １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＵｎｉＰｒｏｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるための核酸であって、下記（ａ）〜（ｑ）からなる群から選択される少なくとも一の単離された核酸
（ａ） 配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｂ） 配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｃ） 配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｄ） 配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１〜４個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｅ） 配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｆ） 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｇ） 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列において１〜４０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：１５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｈ） 配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｉ） 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：１９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｊ） 配列番号：２１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：２１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｋ） 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２３に記載のアミノ酸配列において１〜４０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：２３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｌ） 配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２５に記載のアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：２５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｍ） 配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：２７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｎ） 配列番号：２９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：２９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｏ） 配列番号：３１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：３１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｐ） 配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：３３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸
（ｑ） 配列番号：３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３５に記載のアミノ酸配列において１〜４０個のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、又は配列番号：３５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸。

【請求項2】

（ａ）〜（ｑ）に記載の核酸を全て含む、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

配列番号：１に記載の塩基配列からなる、請求項２に記載の核酸。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸が挿入された、ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるためのベクター。

【請求項5】

被験細菌における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在を検出する、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法。

【請求項6】

前記核酸の存在を検出する方法がＰＣＲ法である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記ＰＣＲ法が、配列番号：４５に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：４６に記載の塩基配列からなるプライマーを用い核酸を増幅する方法である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法により、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在が検出された、ＵＫ−２の生合成が誘導され、親株と比較してＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体。

【請求項9】

請求項４に記載のベクターの導入により、ＵＫ−２の生合成が誘導され、親株と比較してＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体。

【請求項10】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸がゲノム中に挿入されている、ＵＫ−２の生合成が誘導され、親株と比較してＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体。

【請求項11】

請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸の塩基配列からなる核酸が１細胞あたり１又は２コピー以上存在している形質転換体。

【請求項12】

ストレプトバーティシリウム、ストレプトマイセス、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムのうちのいずれかである、請求項８〜１１に記載の形質転換体。

【請求項13】

請求項８〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体の培養物からＵＫ−２を採取することを含む、ＵＫ−２を製造するための方法。

【請求項14】

請求項８〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体の培養物からＵＫ−２を採取する工程と、採取したＵＫ−２から下記式（１）で表わされるＵＫ−２の誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２の誘導体を製造するための方法

【化1】

［式（１）中、
Ｒは、２−メチルプロパノイル基、トランス−２−メチル−２−ブテノイル基、３−メチルブタノイル基又は２−メチルブタノイル基を表し、
Ｒ^１は、Ｃ_ｌ−６アルキル基、ベンジル基、Ｃ_１−１０アルキルカルボニル基（該Ｃ_１−１０アルキルカルボニル基はカルボキシル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｃ_１−４アルキルオキシカルボニル基若しくはベンジルオキシカルボニルアミノ基により置換されていてもよい）、ベンゾイル基、Ｃ_１−４アルキルオキシカルボニル基、（Ｃ_１−４）アルキルオキシカルボニル（Ｃ_１−４）アルキル基、ニトロ基により置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル（Ｃ_１−４）アルキル基、Ｃ_１−６アルキルスルホニル基、ジ（Ｃ_１−６）アルキルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基又は下記式（２）で表わされる置換基を表す。

【化2】

（式（２）中、
Ｑは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｍは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｔは、Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、ＳＣ（Ｏ）Ｏ及び下記式（３）で表わされる置換基からなる群より選択され、

【化3】

Ｇは、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルオキシＣ_１−６アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_２−６アルキニル基、Ｃ_３−６シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基からなる群より選択される。Ｇ及びＭはオキソ基を有していてもよいイソベンゾフラン環を形成していてもよく、Ｍ及びＱは３〜８員炭素環系を形成していてもよい。）］。

【請求項15】

請求項８〜１２のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体の培養物からＵＫ−２Ａを採取する工程と、採取したＵＫ−２Ａから下記式（４）、（５）、（６）又は（７）で表わされるＵＫ−２Ａの誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２Ａの誘導体を製造するための方法。

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イネいもち病防除剤等に有用な化合物であるＵＫ−２の生合成に必要な遺伝子（以下、「ＵＫ−２生合成遺伝子」と称する）とＵＫ−２の生産性向上法に関する。より詳しくは、本発明は、ＵＫ−２生合成遺伝子、ＵＫ−２生合成遺伝子が挿入されたベクター、該ベクターが導入された形質転換体、ＵＫ−２生合成遺伝子の存在を検出することにより、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法、該方法によりＵＫ−２生合成遺伝子の存在が検出された細菌、ＵＫ−２生合成遺伝子がゲノム中に挿入されている細菌、ＵＫ−２生合成遺伝子が１細胞あたり１又は２コピー以上存在している細菌、並びにこれら細菌等を利用したＵＫ−２及びＵＫ−２Ａ誘導体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＵＫ−２は、放線菌により二次代謝物として生産される化合物であり、糸状菌及び酵母をはじめとする種々の真菌に対して、アンチマイシン同様の強い抗真菌作用を示す。さらに、ＵＫ−２は、培養細胞に対する細胞毒性が低いことから、イネいもち病防除剤や、農園芸用防黴剤、医療用抗真菌剤に有用であることが見出されている（特許文献１、２）。また、側鎖の構造の違いにより、これまでにＵＫ−２Ａ〜Ｄという４種の類縁体が天然に存在することが明らかとされている（非特許文献１）。

【0003】

ＵＫ−２の工業生産は、放線菌（ストレプトバーティシリウム属に属する細菌等）を培養しＵＫ−２を採取することにより実施される。しかしながら、一般に、天然から分離された微生物の生産するＵＫ−２（ＵＫ−２に関する全ての要素）の量は微量である。そのため、目的物（ＵＫ−２）を産業的に安価で利用するためには、その生産性を向上させる必要がある。

【0004】

目的物の生産性を向上させるためには、目的物を生産する微生物の培養方法の検討、培地成分の検討、及び前駆体の添加といった発酵条件の改良、並びに紫外線照射又は突然変異誘発剤による突然変異を利用した菌株の改良が行われる。さらに近年では、これらの方法に加えて遺伝子組換えを利用した生産性の向上も行われるようになってきた。

【0005】

遺伝子組換えによる生産性向上における一般的な手法は、目的物の生合成に必要な遺伝子の発現を増強する方法であり、例えば、特許文献３には、この手法によりアゴノマイセタレスにおけるＰＦ−１０２２の生産性を向上できることが開示されている。

【0006】

しかしながら、この手法を利用するためには、目的物の生合成に必要な遺伝子又は公知の手法により合成された該遺伝子が単離されており、かつ目的物を生産させるための微生物（生産用微生物）において形質転換法が確立されていることが必要である。ＵＫ−２については、その生合成遺伝子が未解明であるため、ＵＫ−２生合成遺伝子を利用した形質転換を行うことが出来ず、遺伝子組換えによって生産性を向上させることができなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特公平０７−２３３１６５号公報

【特許文献2】国際公開第１９９９／１１１２７号

【特許文献3】国際公開第２００１／０１８１７９号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｕｅｋｉ Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、１９９６年７月２５日、４９巻、７号、６３９〜６４３ページ

【非特許文献2】Ｎａｍｗａｔ Ｗ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２００２年９月、１８４巻、１７号、４８１１〜４８１８ページ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＵＫ−２の生合成に必要な遺伝子を単離し、該遺伝子を導入することによって、ＵＫ−２の生産性が向上した形質転換体を提供することを目的とする。さらに、該形質転換体を用いることによって、ＵＫ−２を安価で大量に製造することも目的とする。また、前記遺伝子の存在を検出することにより、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

ＵＫ−２は特徴的なヒドロキシピコリン酸骨格を有している。一方、バージニアマイシン（Ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ）という化合物もヒドロキシピコリン酸骨格を有しており、さらに、ＶｉｓＡ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ２−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＶｉｓＢ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ＡＭＰ ｌｉｇａｓｅ）がこの生合成に関与することが明らかになっている（非特許文献２）。

【0011】

そこで、本発明者らは前記課題を解決すべく、ＵＫ−２を生産するストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡライブラリーを調製し、当該株のゲノムＤＮＡの塩基配列を網羅的に決定した。そして、ＶｉｓＡ及びＶｉｓＢのアミノ酸配列と、前記ゲノムＤＮＡがコードする推定タンパク質のアミノ酸配列との相同性解析を実施し、これら２つのアミノ酸配列と高い相同性を示す産物をコードする遺伝子が連続して位置するゲノム部位を見出した。さらに、その部位の近傍には非リボソーム型ペプチド合成酵素（Ｎｏｎ−ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＮＲＰＳ））と相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子及びポリケチド合成酵素（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＫＳ））と相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子が配置されていることも見出した。

【0012】

これら酵素はＵＫ−２骨格の形成するために必要と考えられ、また放線菌の二次代謝遺伝子はクラスターを形成していることから、このゲノム領域がＵＫ−２生合成遺伝子クラスターであると推定した。

【0013】

そして、このようにして得られた、ＵＫ−２生合成に必要な酵素等をコードしていると推定される遺伝子の塩基配列情報に基づき、プローブを作製し、該プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションによって、前記ゲノムＤＮＡライブラリーから、ＵＫ−２生合成遺伝子クラスターと推定されるＤＮＡ（前記ゲノム領域からなるＤＮＡ）を単離することに成功した。また、このＤＮＡを利用して、前記ゲノム領域に存在する遺伝子を破壊したストレプトバーティシリウム属３−７株を作製し、当該株においてはＵＫ−２が生産されないことを見出し、前記ゲノム領域がＵＫ−２生合成遺伝子クラスターであることを実証した。さらに、ストレプトバーティシリウム属３−７株に、単離したＵＫ−２生合成遺伝子クラスターが挿入されているベクターを導入して形質転換することにより、当該形質転換体のＵＫ−２の生産性を、親株のそれと比較して、約１０〜６０倍に向上させることができることも見出した。さらに、これら形質転換体のＵＫ−２生合成遺伝子クラスターのコピー数は２コピーであることを確認した。

【0014】

すなわち、本発明は、ＵＫ−２生合成遺伝子、ＵＫ−２生合成遺伝子が挿入されたベクター、該ベクターが導入された形質転換体、並びに該形質転換体を利用したＵＫ−２等の製造方法に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
＜１＞ ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるための核酸であって、下記（ａ）〜（ｑ）からなる群から選択される少なくとも一の単離された核酸
（ａ） 配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｂ） 配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：４に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ） 配列番号：７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：６に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｄ） 配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：９に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：８に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｅ） 配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：１０に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｆ） 配列番号：１３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：１２に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ） 配列番号：１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：１４に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｈ） 配列番号：１７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：１６に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｉ） 配列番号：１９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：１９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：１８に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｊ） 配列番号：２１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２０に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｋ） 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２２に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｌ） 配列番号：２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２４に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｍ） 配列番号：２７に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２６に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｎ） 配列番号：２９に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：２８に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｏ） 配列番号：３１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：３０に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｐ） 配列番号：３３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：３２に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸
（ｑ） 配列番号：３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸、配列番号：３５に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号：３４に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸。
＜２＞ （ａ）〜（ｑ）に記載の核酸を全て含む、＜１＞に記載の核酸。
＜３＞ 配列番号：１に記載の塩基配列からなる、＜２＞に記載の核酸。
＜４＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の核酸が挿入された、ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるためのベクター。
＜５＞ 被験細菌における、＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の核酸の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在を検出する、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法。
＜６＞ 前記核酸の存在を検出する方法がＰＣＲ法である、＜５＞に記載の方法。
＜７＞ 前記ＰＣＲ法が、配列番号：４５に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：４６に記載の塩基配列からなるプライマーを用い核酸を増幅する方法である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞ ＜５＞〜＜７＞のいずれか一に記載の方法により、＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の核酸の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在が検出された、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌。
＜９＞ ＜４＞に記載のベクターの導入により、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌。
＜１０＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の核酸がゲノム中に挿入されている、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌。
＜１１＞ ＜１＞〜＜３＞のいずれか一に記載の核酸の塩基配列からなる核酸が１細胞あたり１又は２コピー以上存在している細菌。
＜１２＞ ストレプトバーティシリウム、ストレプトマイセス、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌及びコリネバクテリウム・グルタミクムのうちのいずれかである、＜８＞〜＜１１＞のいずれか一に記載の細菌。
＜１３＞ ＜８＞〜＜１２＞のいずれか一に記載の細菌を培養し、該細菌の培養物からＵＫ−２を採取することを含む、ＵＫ−２を製造するための方法。
＜１４＞ ＜８＞〜＜１２＞のいずれか一に記載の細菌を培養し、該細菌の培養物からＵＫ−２を採取する工程と、採取したＵＫ−２から下記式（１）で表わされるＵＫ−２の誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２の誘導体を製造するための方法

【0015】

【化1】

【0016】

［式（１）中、
Ｒは、２−メチルプロパノイル基、トランス−２−メチル−２−ブテノイル基、３−メチルブタノイル基又は２−メチルブタノイル基を表し、
Ｒ１は、Ｃｌ−６アルキル基、ベンジル基、Ｃ１−１０アルキルカルボニル基（該Ｃ１−１０アルキルカルボニル基はカルボキシル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル基若しくはベンジルオキシカルボニルアミノ基により置換されていてもよい）、ベンゾイル基、Ｃ１−４アルキルオキシカルボニル基、（Ｃ１−４）アルキルオキシカルボニル（Ｃ１−４）アルキル基、ニトロ基により置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル（Ｃ１−４）アルキル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、ジ（Ｃ１−６）アルキルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基又は下記式（２）で表わされる置換基を表す。

【0017】

【化2】

【0018】

（式（２）中、
Ｑは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｍは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｔは、Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、ＳＣ（Ｏ）Ｏ及び下記式（３）で表わされる置換基からなる群より選択され、

【0019】

【化3】

【0020】

Ｇは、Ｈ、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルオキシＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基からなる群より選択される。Ｇ及びＭはオキソ基を有していてもよいイソベンゾフラン環を形成していてもよく、Ｍ及びＱは３〜８員炭素環系を形成していてもよい。）］。
＜１５＞ ＜８＞〜＜１２＞のいずれか一に記載の細菌を培養し、該細菌の培養物からＵＫ−２Ａを採取する工程と、採取したＵＫ−２Ａから下記式（４）、（５）、（６）又は（７）で表わされるＵＫ−２Ａの誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２Ａの誘導体を製造するための方法。

【0021】

【化4】

【0022】

【化5】

【0023】

【化6】

【0024】

【化7】

【0025】

なお、本明細書において「アシル」の語は、カルボン酸ＲＣＯＯＨ（Ｒは炭化水素基）からＯＨを除いた残基ＲＣＯ−を示す。本明細書中で「アリール」の語はフェニル又はナフチルを示す。本明細書「ヘテロアリール」の語は、１つ以上のヘテロ原子を含む５又は６員芳香環のいずれかを示し、ここでそのようなヘテロ原子はＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択されたものであり、並びに芳香環の残りの原子は炭素原子である。好適な例としては、これらに限定するものではないが、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、フラン、チオフェン、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、キノリン、キノキソリン及びチアジアゾールが挙げられる。

【発明の効果】

【0026】

本発明によれば、ＵＫ−２生合成遺伝子を細菌等の宿主細胞に導入することによって、ＵＫ−２の生産性が向上した形質転換体を提供することが可能となる。さらに、該形質転換体を用いることにより、ＵＫ−２を安価で大量に製造することも可能となる。また、前記遺伝子の存在を検出することにより、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法を提供することも可能となる。

【発明を実施するための形態】

【0027】

＜ＵＫ−２生合成遺伝子＞
本発明は、ＵＫ−２生合成遺伝子を提供する。後述の実施例において示す通り、本発明者らによって、ストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡから、新規なＵＫ−２生合成遺伝子として、表２に示す１７の遺伝子が単離された。

【0028】

従って、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の１つの態様は、「ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるための核酸であって、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、単離された核酸」であり、典型的には「ＵＫ−２の生合成を誘導し、ＵＫ−２の生産性を向上させるための核酸であって、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２又は３４に記載の塩基配列からなる、単離された核酸」である。

【0029】

本発明において「ＵＫ−２の生産性の向上」とは、細菌等が生来有していたＵＫ−２の生産性が向上することのみならず、生来ＵＫ−２の生産能を有していなかった細菌等がＵＫ−２の生産能を有するようになることも意味する。

【0030】

本発明において「単離」とは、本来存在する状態とは異なる状態で存在するように人為的に処理することを意味する。本発明のＵＫ−２生合成遺伝子は、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２又は３４に記載の塩基配列情報に基づき適当なプライマーを合成し、それを用いてストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、単離することができる。また、後述の実施例に示すように、前記ＰＣＲによって得られた増幅産物をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、ストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子を単離することもできる。さらに、前記塩基配列情報に基づき、化学的に全合成することにより、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子を調製することもできる。

【0031】

本発明において「ＵＫ−２」とは下記式（８）；

【0032】

【化8】

【0033】

（式中、Ｒは直鎖若しくは分岐の飽和脂肪族アシル基又は直鎖若しくは分岐の不飽和脂肪族アシル基を示す）で表わされる化合物のことであり、好ましくは、Ｒがイソブチリル基（２−メチルプロパノイル基）である化合物（ＵＫ−２Ａ）、Ｒがチグロイル基（ｔｒａｎｓ−２−メチル−２−ブテノイル基）である化合物（ＵＫ−２Ｂ）、Ｒがイソバレリル基（３−メチルブタノイル基）である化合物（ＵＫ−２Ｃ）及びＲが２−メチルブタノイル基である化合物（ＵＫ−２Ｄ）である。

【0034】

また、本発明において「ＵＫ−２生合成遺伝子」とは、ＵＫ−２の生合成を誘導できる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。「ＵＫ−２の生合成を誘導できる活性」は、例えば、後述の実施例９に記載の方法にて評価することができる。すなわち、被検タンパク質をコードする核酸が挿入されているベクターを導入する等して、被検タンパク質を宿主細胞（例えば、ストレプトバーティシリウム属３−７株）において強制的に発現させ、当該宿主細胞におけるＵＫ−２の生産量を測定する。この生産量が、被検タンパク質を発現させていない宿主細胞のそれと比べて多い場合に、当該被検タンパク質はＵＫ−２の生合成を誘導できる活性を有していると評価することができる。

【0035】

現在の技術水準においては、当業者であれば、前記ＵＫ−２生合成遺伝子の塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列とは異なるが、ＵＫ−２の生合成に関与するタンパク質をコードする核酸を取得することが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の他の態様は、「単離された核酸であって、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸」である。ここで「複数」とは、改変後のＵＫ−２の生合成に関与するタンパク質が、ＵＫ−２の生合成を誘導する活性を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常１〜５０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜８個、１〜４個）である。

【0036】

このような改変体をコードする核酸は、当業者であれば、前記ＵＫ−２生合成遺伝子の塩基配列情報に基づき、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を利用して調製することが可能である。

【0037】

さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、前記ＵＫ−２生合成遺伝子の塩基情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、ストレプトバーティシリウム属３−７株以外の株や、他の菌から、ＵＫ−２の生合成を誘導する活性を有するタンパク質をコードする核酸（相同遺伝子）を取得することが可能である。従って、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の他の態様は、「単離された核酸であって、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２又は３４に記載の塩基配列からなる核酸と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸」である。

【0038】

このような相同遺伝子を単離するためには、通常、厳密な条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

【0039】

また、このような方法にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。従って、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の他の態様は、「単離された核酸であって、配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５に記載のアミノ酸配列と９５%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする核酸」である。

【0040】

配列の相同性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラムを利用して決定することができる。

【0041】

本発明のＵＫ−２生合成遺伝子は、後述の実施例において示す通り、ＵＫ−２の生産性が向上した形質転換体の作製に利用できる他、ＵＫ−２生合成遺伝子クラスターをスクリーニングするためにも有効に利用することができる。

【0042】

このような形質転換体の作製やＵＫ−２生合成遺伝子クラスターのスクリーニングにおいては、前述のＵＫ−２生合成遺伝子を単独で用いるよりも、複数組み合わせて用いることが好ましい。組み合わせるＵＫ−２生合成遺伝子の数としては、その組み合わせにより、ＵＫ−２の生合成を誘導しうる限り、特に制限はない。例えば、２以上、好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上である。形質転換体におけるＵＫ−２の生産性を顕著に向上させることができることから、１７のＵＫ−２生合成遺伝子の組み合わせが最も好ましい。

【0043】

組み合わせるＵＫ−２生合成遺伝子は、一つの核酸として存在してもよく、別々の核酸として存在してもよい。

【0044】

本発明は、１７のＵＫ−２生合成遺伝子を含む一つの核酸（ＵＫ−２生合成遺伝子クラスター）として、「配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸」を提供する。配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸における、上記遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の位置は、後述の表１に示す通りである。

【0045】

「配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸」は、後述の実施例に示すように、前記ＵＫ−２生合成遺伝子の塩基配列情報等に基づき、適当なプライマーを合成し、別途作製したストレプトバーティシリウム属３−７株のコスミドゲノムＤＮＡライブラリーを鋳型とする該プライマーを用いたＰＣＲを行い、得られた増幅産物をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーションを行うことによって単離することができる。

【0046】

＜ベクター＞
本発明によれば、上記本発明のＵＫ−２生合成遺伝子が挿入されたベクターが提供される。本発明のベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発明のベクターは、細菌等の宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明のベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。

【0047】

本発明のベクターは、当業者であれば、導入する宿主細胞の種類に合わせて、公知のベクターから適宜選択することができる。公知のベクターとしては、例えば、コスミドベクター（ＳｕｐｅｒＣｏｓ１コスミドベクター等）、ファージベクター、ｐＵＣ系プラスミド（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクター等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド、ｐＢＲ３２２プラスミドが挙げられる。

【0048】

本発明の「ベクター」は、宿主細胞において、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がコードするタンパク質を発現させるために、当該遺伝子の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するためのマーカー遺伝子等を含んでいることが好ましい。

【0049】

「発現を制御するＤＮＡ配列」としては、例えば、プロモーター、エンハンサー及びターミネーターが挙げられる。また、細菌において、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンも挙げられる。本発明のベクターは、例えば、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の上流にプロモーターを、下流にターミネーターをそれぞれ作動可能に連結することによって構築することができる。

【0050】

「マーカー遺伝子」は、形質転換された宿主細胞（形質転換体）の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。マーカー遺伝子としては、使用する宿主細胞が細菌の場合は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。特に、放線菌の場合は、アプラマイシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、バイオマイシン耐性遺伝子などが挙げられ、酵母の場合は、トリプトファン生合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル生合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン生合成遺伝子（ＬＥＵ２）などが挙げられ、カビの場合は、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などが挙げられ、植物の場合には、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。

【0051】

＜形質転換体等＞
本発明によれば、前記本発明のベクターが導入された形質転換体（例えば、前記本発明のベクターの導入により、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌）が提供される。

【0052】

また、本発明によれば、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がゲノム中に挿入されている、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体が提供される。

【0053】

前記本発明のベクターが導入されることによって形質転換される宿主細胞又は前記本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がゲノム中に挿入される宿主細胞は、特に制限はなく、例えば、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、ＵＫ−２の生産性の観点から、好ましくは放線菌であり、より好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌及びストレプトマイゼス属に属する細菌であり、さらに好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌であり、特に好ましくは、ストレプトバーティシリウム属３−７株である。

【0054】

本発明のベクターの宿主細胞への導入方法としては、特に制限はなく、接合伝達、ファージによる形質導入、カルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった公知の形質転換の方法の中から、当業者であれば、適宜供試する宿主細胞の種類に応じて選択し、用いることができる。また、前記「マーカー遺伝子」を含むベクターを宿主細胞に導入した場合には、前記薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加した培地又は前記栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物が欠失している培地にて培養することにより、本発明の形質転換体を効率良く調製することができる。

【0055】

また、本発明によれば、発酵条件の改良や突然変異誘導等によりＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌が提供される。さらに、後述の実施例に示す通り、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子を少なくとも２コピー有することによって、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が顕著に向上されることが明らかになった。従って、本発明によれば、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子が１細胞あたり１又は２コピー以上存在している細菌も提供される。かかる細菌としては、ＵＫ−２の生産性の観点から、好ましくは放線菌であり、より好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌及びストレプトマイゼス属に属する細菌であり、さらに好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌である。また、ＵＫ−２の生産性の観点から、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の１細胞あたりのコピー数としては好ましくは２以上である。なお、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の１細胞あたりのコピー数は、例えば後述の実施例において示すようなＰＣＲ法により同定することができる。

【0056】

＜ＵＫ−２の生産性を判定するための方法＞
本発明者らによって、ＵＫ−２の生合成に必要な遺伝子が単離され、同定されたことにより、当該遺伝子の存在を検出することによってＵＫ−２の生産性を判定することができるようになった。従って、本発明によれば、被験細菌における、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在を検出する、ＵＫ−２の生産性を判定するための方法も提供される。

【0057】

本発明の方法における「被験細菌」としては特に制限はなく、例えば、放線菌（ストレプトバーティシリウム属に属する細菌、ストレプトマイゼス属に属する細菌等）、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、コリネバクテリウム・グルタミクムが挙げられる。

【0058】

本発明のＵＫ−２の生産性を判定するための方法において検出される、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子の塩基配列は、すなわち本発明の核酸の塩基配列は、前述の（ａ）〜（ｑ）からなる群から選択される少なくとも一の核酸の塩基配列である。

【0059】

前記核酸等の検出は、該核酸等を含むゲノムＤＮＡや該ゲノムＤＮＡからの転写産物を対象として直接的に行うことができるが、該転写産物からの翻訳産物（本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がコードするタンパク質）を対象として間接的に行うこともできる。また、前記核酸等の検出には、公知の手法を用いることができる。前記ゲノムＤＮＡを対象とする場合においては、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法、ゲノムＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング法、サザンブロッティング法、ゲノムマイクロアレイを用いた解析法を用いることができる。前記転写産物を対象とする場合においては、例えば、ＰＣＲ法、ダイレクトシークエンシング法、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いた解析法を用いることができる。前記翻訳産物を対象とする場合においては、例えば、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いた免疫学的手法（ウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、免疫組織化学的染色法、イメージングサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、抗体アレイを用いた解析法等）が挙げられる。これらの方法のうち、好ましくはＰＣＲ法であり、より好ましくは、配列番号：４５に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号：４６に記載の塩基配列からなるプライマーを用いて核酸を増幅するＰＣＲ法である。

【0060】

また、本発明の方法において、ＵＫ−２の生産性をより精度高く判定できるという観点から、前記核酸（本発明のＵＫ−２生合成遺伝子）１個の存在を検出するよりも、複数個の前記核酸の存在を検出することが好ましい。検出する核酸の数としては、例えば、２以上、好ましくは５以上、さらに好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、前記１７の核酸全てを検出することが特に好ましく、前記１７の核酸全てを含む一つの核酸（配列番号：１に記載の塩基配列からなる核酸）を検出することが最も好ましい。さらに、前述の公知の手法によって核酸の存在を検出するにあたり、その検出の対象となるのは通常、該核酸の全長のみならず、その一部であることがある。従って、本発明の方法においても、前記核酸等の検出は、前記核酸等の一部を検出するものであってもよい。本発明の方法に検出される前記核酸の一部の鎖長としては、当業者であれば検出手法に合わせて適宜選択することができる。

【0061】

そして、かかる方法により、被験細菌において前記核酸の存在を検出することができれば、該被験細菌はＵＫ−２の生産性を有していると判定される。また、かかる方法は、前記核酸の存在を検出することができた該試験細菌を、ＵＫ−２の生産に適した状況にて培養することにより、その生産性を確認する工程を含んでいてもよい。

【0062】

また、本発明によれば、本発明のＵＫ−２の生産性を判定するための方法により、本発明の核酸の塩基配列又は該配列に相補的な塩基配列からなる核酸の存在が検出された、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌も提供される。かかる細菌としては、ＵＫ−２の生産性の観点から、好ましくは放線菌であり、より好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌及びストレプトマイゼス属に属する細菌であり、さらに好ましくはストレプトバーティシリウム属に属する細菌である。

【0063】

なお、本明細書において、上述の本発明のＵＫ−２生合成遺伝子を有する細菌等、すなわち、本発明のＵＫ−２の生産性を判定するための方法により、前記核酸の存在が検出された、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌、本発明のベクターの導入により、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子がゲノム中に挿入されている、ＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された形質転換体、本発明のＵＫ−２生合成遺伝子が１細胞あたり１又は２コピー以上存在している細菌、発酵条件の改良や突然変異誘導等によりＵＫ−２の生合成が誘導され、ＵＫ−２の生産性が向上された細菌については、以下「本発明の細菌等」と総称する。

【0064】

＜ＵＫ−２の製造方法＞
本発明によれば、本発明の細菌等を培養し、該細菌等の培養物からＵＫ−２を採取することを含む、ＵＫ−２を製造するための方法が提供される。

【0065】

前記細菌等の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、ＵＫ−２の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。また、培地のｐＨは、特に制限はなく、培養する細菌等の種類に応じて調整すればよく、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度が挙げられる。

【0066】

培養条件は、培養する細菌等の種類や用いる培地の種類等に応じて、当業者であれば適宜選択、設定することができる。例えば、培養方法としては、好気的条件での振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法等の公知の培養法の中から選択することができるが、通気撹拌培養法が好ましい。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２６℃〜３７℃付近に設定される。また、培養時間は、ＵＫ−２の蓄積が最高に達する２日〜２５日間が好ましい。

【0067】

本発明において「培養物」とは、本発明の細菌等を培養することによって得られる、増殖した細菌等、該細菌等の分泌産物及び該細菌等の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。

【0068】

ＵＫ−２は、前記培養物において、細菌等及び培地の両方に蓄積される。従って、前記培養物の培地からＵＫ−２を採取する方法としては、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、ジクロロメタン等の水とは任意に混合せず、しかもＵＫ−２を有効に抽出できる有機溶媒を用いて抽出する方法が挙げられる。また、前記培養物の細菌等からは、例えば、濾過又は遠心分離等の手段にて回収した細菌等を、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出することにより、ＵＫ−２を採取することができる。さらに、前記培養物の細菌等をガラスビーズ等を用いて破砕した後に、前記培地からの抽出と同様に抽出することにより、ＵＫ−２を採取することができる。

【0069】

また、前記培養物からのＵＫ−２の採取においては、このようにして調整された有機溶媒等の抽出画分に、溶媒転溶、順相及び逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトマトグラフィー、結晶化等の公知の精製を組み合わせて施すことにより、ＵＫ−２を単離、精製することができる。

【0070】

＜ＵＫ−２誘導体の製造方法＞
前述の通り、本発明によれば、ＵＫ−２を安価で大量に製造することができるため、本発明の製造方法によって得られたＵＫ−２を材料として、ＵＫ−２の誘導体を安価で大量に製造することもできる。

【0071】

従って、本発明は、本発明の細菌等を培養し、該細菌等の培養物からＵＫ−２（ＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄ）を採取する工程と、採取したＵＫ−２から下記式（１）で表わされるＵＫ−２の誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２の誘導体を製造するための方法をも提供することができる。

【0072】

【化9】

【0073】

［式（１）中、
Ｒは、２−メチルプロパノイル基、トランス−２−メチル−２−ブテノイル基、３−メチルブタノイル基又は２−メチルブタノイル基を表し、
Ｒ^１は、Ｃ_ｌ−６アルキル基、ベンジル基、Ｃ_１−１０アルキルカルボニル基（該Ｃ_１−１０アルキルカルボニル基はカルボキシル基、ベンジルオキシカルボニル基、Ｃ_１−４アルキルオキシカルボニル基若しくはベンジルオキシカルボニルアミノ基により置換されていてもよい）、ベンゾイル基、Ｃ_１−４アルキルオキシカルボニル基、（Ｃ_１−４）アルキルオキシカルボニル（Ｃ_１−４）アルキル基、ニトロ基により置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル（Ｃ_１−４）アルキル基、Ｃ_１−６アルキルスルホニル基、ジ（Ｃ_１−６）アルキルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基又は下記式（２）で表わされる置換基を表す。

【0074】

【化10】

【0075】

（式（２）中、
Ｑは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｍは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＦ_３、Ｐｈ、ＣＨ＝ＣＨ_２及びシクロプロピルからなる群より選択され、
Ｔは、Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、ＳＣ（Ｏ）Ｏ及び下記式（３）で表わされる置換基からなる群より選択され、

【0076】

【化11】

【0077】

Ｇは、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルキルオキシＣ_１−６アルキル基、Ｃ_２−６アルケニル基、Ｃ_２−６アルキニル基、Ｃ_３−６シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基からなる群より選択される。Ｇ及びＭはオキソ基を有していてもよいイソベンゾフラン環を形成していてもよく、Ｍ及びＱは３〜８員炭素環系を形成していてもよい。）］。

【0078】

また、前記式（２）で表わされる置換基において、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基及びヘテロアリール基は、下記置換基群から選択される少なくとも一の置換基により置換されていてもよい：
Ｃ₁₋₆アルキル基、Ｃ₂₋₆アルケニル基、Ｃ₂₋₆アルキニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキル基、Ｃ₅₋₆シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、Ｃ₁₋₆アルコキシ基、Ｃ₂₋₆アルケノキシ基、Ｃ₃₋₆シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、アシルオキシ基、Ｃ₁₋₆アルキルアシルオキシ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシルオキシ基、アリールアシルオキシ基、ヘテロアリールアシルオキシ基、Ｃ₁₋₆アルキルオキシアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルオキシアシル基、アリールオキシアシル基、ヘテロアリールオキシアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシル基、アリールアシル基、ヘテロアリールアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルアシルアミノ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシルアミノ基、アリールアシルアミノ基、ヘテロアリールアシルアミノ基、Ｃ₁₋₆アルキルアミノアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアミノアシル基、アリールアミノアシル基、ヘテロアリールアミノアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルチオ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロアリールチオ基、Ｃ₁₋₆アルキルスルホニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ヘテロアリールスルホニル基、Ｃ₁₋₆アルキルスルフィニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、ヘテロアリールスルフィニル基並びにＲ^Y及びＲ^Xが独立にＨ、Ｃ₁₋₆アルキル基、Ｃ₂₋₆アルケニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基である−Ｃ（ＮＯＲ^X）Ｒ^Y（ここで、前記アルキル又はシクロアルキル含有置換基は、１つ以上のハロゲンで置換されていてもよい）。

【0079】

なお、前記置換基は、さらに下記置換基群から選択される少なくとも一の置換基により置換されていてもよい：
Ｃ₁₋₆アルキル基、Ｃ₂₋₆アルケニル基、Ｃ₂₋₆アルキニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキル基、Ｃ₅₋₆シクロアルケニル基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン原子、ニトロ基、ヒドロキシ基、シアノ基、Ｃ₁₋₆アルコキシ基、Ｃ₂₋₆アルケノキシ基、Ｃ₃₋₆シクロアルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、アシルオキシ基、Ｃ₁₋₆アルキルアシルオキシ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシルオキシ基、アリールアシルオキシ基、ヘテロアリールアシルオキシ基、Ｃ₁₋₆アルキルオキシアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルオキシアシル基、アリールオキシアシル基、ヘテロアリールオキシアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシル基、アリールアシル基、ヘテロアリールアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルアシルアミノ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアシルアミノ基、アリールアシルアミノ基、ヘテロアリールアシルアミノ基、Ｃ₁₋₆アルキルアミノアシル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルアミノアシル基、アリールアミノアシル基、ヘテロアリールアミノアシル基、Ｃ₁₋₆アルキルチオ基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロアリールチオ基、Ｃ₁₋₆アルキルスルホニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ヘテロアリールスルホニル基、Ｃ₁₋₆アルキルスルフィニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、ヘテロアリールスルフィニル基並びにＲ^Y及びＲ^Xが独立にＨ、Ｃ₁₋₆アルキル基、Ｃ₂₋₆アルケニル基、Ｃ₃₋₆シクロアルキル基、アリール基又はヘテロアリール基である−Ｃ（ＮＯＲ^X）Ｒ^Y（ここで、前記アルキル又はシクロアルキル含有置換基は、１つ以上のハロゲンで置換されていてもよい）。

【0080】

また、本発明は、本発明の細菌等を培養し、該細菌等の培養物からＵＫ−２Ａを採取する工程と、採取したＵＫ−２Ａから下記式（４）、（５）、（６）又は（７）で表わされるＵＫ−２Ａの誘導体を合成する工程とを含む、ＵＫ−２Ａの誘導体を製造するための方法をも提供することができる。

【0081】

【化12】

【0082】

【化13】

【0083】

【化14】

【0084】

【化15】

【0085】

前記培養物からのＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄの採取は、前述の通り、例えば、前記有機溶媒等の抽出画分に、溶媒転溶、順相及び逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトマトグラフィー、結晶化等の公知の精製を組み合わせて施すことにより、ＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄを単離、精製することができる。より具体的には、前記有機溶媒等の抽出画分を減圧濃縮し、これをクロロホルムに転溶してシリカゲルクロマトグラフィーに付し、これをクロロホルム／メタノールのステップワイズにて溶出すれば、ＵＫ−２Ａ及びＵＫ−２Ｄを約３：１の割合で含有し、ここに微量のＵＫ−２Ｂ及びＵＫ−２Ｃが混入した画分を得ることができる。さらにこれをＣ−１８カラムを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて処理することにより、ＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄを単離することができる（特許文献１ 参照）。

【0086】

そして、このようにして採取したＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄを材料とし、例えば、国際公開第２００３／０３５６１７号又は国際公開第９９／４００８１号に記載の合成方法により、前記式（１）、（４）、（５）、（６）又は（７）で表わされるＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ又はＵＫ−２Ｄの誘導体を合成することができる。

【実施例】

【0087】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0088】

なお、本実施例に記載の微生物の寄託は次の通りである。ストレプトバーティシリウム属３−７株（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．３−７）は、平成２３（２０１１）年１１月９日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４３７である。なお、２０１２年４月に特許微生物寄託業務は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧称：ＩＰＯＤ）から独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ、〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に承継された。

【0089】

ストレプトバーティシリウム属３−７株は、特公平０７−２３３１６５号公報に記載のＳＡＭ２０８４株に、紫外線照射による変異処理を人工的に１回施すことにより、本発明者らによって樹立された。ＳＡＭ２０８４株は、日本国京都府の土壌から得られた、国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４６で識別されるＵＫ−２生産菌株である。

【0090】

（実施例１）
＜ゲノムＤＮＡライブラリーの作製＞
ＵＫ−２の生合成に必要な遺伝子を単離するために、先ず、ＵＫ−２を生産することのできるストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡライブラリーを以下に示す方法にて調製した。

【0091】

ストレプトバーティシリウム属３−７株を改変ＹＥＭＥ（０．３％ディフコイーストエキストラクト、０．５％ディフコバクトペプトン、０．３％オキシドモルトエキストラクト、３．０％シュークロース、１．０％グルコース、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ）５０ｍｌに植菌し、３０℃、１８時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、７５００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し得られた菌体からＳａｌｔｉｎｇ ｏｕｔ法［プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｈ），２０００年 参照］を用いてゲノムＤＮＡを調製した。

【0092】

得られたゲノムＤＮＡを制限酵素ＭｂｏＩで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＸｂａＩで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化した市販のコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（ストラタジーン社製）に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、エピセンター社製のＭＡＸＰＬＡＸラムダパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ ＭＲＡに感染させることによりコスミドゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。

【0093】

（実施例２）
＜ＵＫ−２生合成遺伝子の推定＞
実施例１に示した方法で調製したゲノムＤＮＡをもとに、株式会社ジナリスに委託し、Ｒｏｃｈｅ ＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍシークエンサー用のＭａｔｅ−ｐａｉｒ ｌｉｂｒａｒｙを構築した後、このシークエンサー用いて配列を決定した。これとは別に、ゲノムＤＮＡをもとに、このシークエンサー用のＦｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｂｒａｒｙを構築した後、このシークエンサー用いて配列を決定した。Ｍａｔｅ−ｐａｉｒ ｌｉｂｒａｒｙから得られた配列とＦｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｂｒａｒｙから得られた配列のコアセンブリーを行うことにより、Ｃｏｎｔｉｇ配列とＳｃａｆｆｏｌｄ配列を得た。

【0094】

ＵＫ−２は特徴的な３−ヒドロキシピコリン酸骨格を有している。一方、Ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎもヒドロキシピコリン酸骨格を有しており、この生合成に関与する２遺伝子（ｖｉｓＡ、ｖｉｓＢ）が公開されている（非特許文献２ 参照）。そこで、この２遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列とＵＫ−２生産菌ゲノムから得られた推定アミノ酸配列との相同性解析を実施し、ヒドロキシピコリン酸骨格形成に関与する遺伝子の存在を調査した。得られた結果を表１及び２に示す。

【0095】

【表1】

【0096】

【表2】

【0097】

前記調査の結果、ＶｉｓＡ、ＶｉｓＢと高い相同性を示した遺伝子が連続して位置していた箇所を、ストレプトバーティシリウム属３−７株由来のゲノム上に１箇所見出した（表１ 参照）。さらに、これらの近傍にはＵＫ−２骨格を形成するために必要と考えられるＮｏｎ−ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＮＲＰＳ）及びＰｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＫＳ）に関連した遺伝子が配置されていることも見出した（表２ 参照）。放線菌の二次代謝遺伝子はクラスターを形成することから、この付近がＵＫ−２生合成遺伝子クラスターであると推定した。また、ＵＫ−２生合成遺伝子クラスターに配置されている各遺伝子（ＯＲＦ）と、それらがコードするタンパク質の推定される機能とのアライメントは以下の通りである。

【0098】

ＯＲＦ１は生合成遺伝子クラスターの制御に関与している可能性がある遺伝子である。ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７、ＯＲＦ１６は３−ヒドロキシピコリン酸骨格の生合成に関わる遺伝子である。ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ１７はベンジルマロン酸骨格の生合成に関わる遺伝子である。ＯＲＦ１３はピコリン酸骨格とセリン、乳酸の生合成に関わる遺伝子である。ＯＲＦ１１とＯＲＦ１２はピコリン酸とセリン、乳酸の代謝とベンジルマロン酸の生合成に関わる遺伝子である。ＯＲＦ８はピコリン酸、セリン、乳酸、ベンジルマロン酸の代謝とＰｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＰＫＳ）のチオエステル結合の切断に関わる遺伝子である。

【0099】

（実施例３）
＜ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング＞
実施例１で作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、ＵＫ−２生合成遺伝子群の上流に位置するＯＲＦ５の一部の配列を使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。

【0100】

実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｖｉｓＡ’−Ｆ：５’−ＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号：３６）とｖｉｓＡ’−Ｒ：５’−ＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号：３７）のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、ＤＭＳＯ溶液を２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．２５μｌずつ、酵素を０．３μｌ、滅菌水を１６．２μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９５℃、１０分間の前処理の後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間のインキュベーションを３０サイクル、さらに７２℃で５分間のインキュベーションを行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事を確認した。そこで、残りの反応液を核酸精製用混合溶液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１，Ｖ／Ｖ）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約１．３ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。

【0101】

前記ＤＮＡ断片をプローブにし、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約５０００個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＵＫ２−Ｂ４４を単離した。

【0102】

さらに、ＵＫ−２生合成遺伝子群の下流に位置するＯＲＦ１３の一部をプローブとして使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。

【0103】

実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃａｉＣ−Ｆ：５’−ＧＣＧＣＴＣＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号：３８）とｃａｉＣ−Ｒ：５’−ＣＧＧＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号：３９）のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、ＤＭＳＯ溶液を２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．２５μｌずつ、酵素を０．３μｌ、滅菌水を１６．２μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９５℃、１０分間の前処理の後、９５℃で３０秒間、５９℃で３０秒間、７２℃で２分２０秒間のインキュベーションを３０サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液を前記核酸精製用混合溶液で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約２．３ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。

【0104】

前記ＤＮＡ断片をプローブにし、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約５０００個のコロニーをスクリーニングした。複数個の陽性クローンが得られ、このうちの１クローンよりプラスミドｐＵＫ２−Ｅ４を単離した。

【0105】

（実施例４）
＜生合成遺伝子クラスターを含むプラスミドｐＵＫ２−３の構築＞
上記で得られた推定生合成クラスターの上流域１〜２１５３１を含むプラスミドｐＵＫ２−Ｂ４４と下流域１６２１１〜３４６４１領域を含むｐＵＫ２−Ｅ４とを利用して生合成クラスター全領域を含むプラスミドを構築することとした。まず、両プラスミドを制限酵素ＣｌａＩとＰｓｐＸＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、それぞれ約２８ｋｂｐ、約１９ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収し、ＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、ｐＵＫ２−１６を作製した。

【0106】

次に、［グスト（Ｇｕｓｔ，Ｂ．）ら著、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、（米国）、２００３年、第１００巻、ｐ．１５４１−１５４６］で説明されているリダイレクト法の技術を用いて、このプラスミドｐＵＫ２−１６を放線菌の接合伝達可能なベクターとすることとした。まず、プラスミドｐＵＫ２−１６をＥ． ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０株にエレクトロポレーション法により導入し、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／ｐＵＫ２−１６株を得た。本株をクロラムフェニコール、カナマイシン及びアンピシリンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌ濃度で含む１００ｍｌのＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）に植菌し、３０℃で一晩培養し、得られた培養物をクロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン及びＬ−アラビノースをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭの濃度で含んだ６５ｍｌ容量の試験管に調製した１０ｍｌのＳＯＢ培地（２％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．０５％塩化ナトリウム、０．０１８６％塩化カリウム）に１００μｌを植菌し、３０℃で４時振とう培養した。培養液の全量を集菌し、氷中で冷却した１０％のグリセリン溶液で２回洗浄し、１００μｌの１０％のグリセリン溶液に再懸濁しエレクトロポレーション用セルとした。一方で、プラスミドｐＭＪＣＯＳ１（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｎｏｒｗｉｃｈ））由来のアプラマイシン耐性遺伝子、ｏｒｉＴ、ａｔｔＰ，ＩｎｔφＣ３１を含む５．２ｋｂのＳｓｐＩ断片を精製した。このように調製した５０μｌのセルとＤＮＡ断片（約１００ｎｇ）を予め氷冷した２ｍｍギャップのキュベットに移し、エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ６００：ビーエム機器株式会社製）を実施した。処理後、冷却したＬＢ液体培地を１ｍｌ添加し、３７℃で１時間静置培養した。これをアンピシリンとアプラマイシンとを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養し、生育した株をアンピシリンとアプラマイシンとを含むＬＢ液体培地で培養し、プラスミドｐＵＫ２−３を単離した。つまり、このｐＵＫ２−３は、ＵＫ２生合成クラスターと推測される領域全長とベクター部分にｏｒｉＴ、ａｔｔＰ，ＩｎｔφＣ３１及びアプラマイシン耐性遺伝子を有した、放線菌に接合伝達可能なプラスミドである。

【0107】

（実施例５）
＜生合成遺伝子欠損用ベクターの構築＞
ストレプトバーティシリウム属３−７株のゲノムＤＮＡから、ＯＲＦ１２とＯＲＦ１３の一部である約７．５ｋｂｐを欠損させた遺伝子破壊株を、以下に示す方法によって作製した。

【0108】

実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃａｉＣ−Ｆ：５’−ＧＣＧＣＴＣＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号：３８）と４１ｃ２９−Ｒ：５’−ＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＴＴ−３’（配列番号：４０）のオリゴＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、ＤＭＳＯ溶液を２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．２５μｌずつ、酵素を０．３μｌ、滅菌水を１６．２μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９５℃、１０分間の前処理後、９５℃で３０秒間、６０℃で５秒間、７２℃で７分間のインキュベーションを３０サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約７．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。このＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入し、プラスミドＴＯＰＯ−４１ｃ２９を得た。

【0109】

続いてプラスミドＴＯＰＯ−４１ｃ２９の挿入断片の内部にアプラマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミドＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９−Ａｍを以下のようにして作製した。

【0110】

プラスミドｐＩＪ７７３［グスト（Ｇｕｓｔ，Ｂ．）ら著，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，（米国），２００３年，第１００巻，ｐ．１５４１−１５４６］をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重消化し、アガロースゲル電気泳動後、定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収し、目的とするアプラマイシン耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを鋳型にして、４１ｃ３０−ａｐｒａＦ：５’−ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＧＣＣＴＡＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ−３’（配列番号：４１）と、４１ｃ３０−ａｐｒａＲ：５’−ＧＧＴＣＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡＧＧＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号：４２）の、２種類の合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を使用し、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００を用いて行った。

【0111】

反応液は、ゲノムＤＮＡを０．５μｌ（０．５μｇ相当量）、酵素に添付の２倍濃度反応用緩衝液を２５μｌ、ＤＭＳＯ溶液を２．５μｌ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各０．２５μｌずつ、酵素を０．３μｌ、滅菌水を１６．２μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、２分間の前処理の後、９４℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃で１分３０秒間のインキュベーションを１０サイクル行った後、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１分３０秒間のインキュベーションを１５サイクル行い、さらに７２℃で５分間の反応を行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事を確認した。

【0112】

次に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０［グスト（Ｇｕｓｔ，Ｂ．）ら著，「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」，（米国），２００３年，第１００巻，ｐ．１５４１−１５４６］にＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９を導入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／ＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９株を得た。本株をクロラムフェニコール、カナマイシン及びアンピシリンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌの濃度で含む１００ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で一晩培養した。６５ｍｌ容量の試験管に、１０ｍｌのＳＯＢ培地を仕込み、クロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、Ｌ−アラビノースを、それぞれ２５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ 濃度で添加した。これに、一晩培養したＥ．ｃｏｌｉ ＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／ＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９株の培養液１００μｌを移植し、３０℃で４時間振とう培養した。培養液の全量を、４℃、３０００ｒｐｍ、５分間の遠心で集菌した後、氷中にて冷却した１０％のグリセリン溶液１０ｍｌに懸濁した。この操作を繰返した後、冷却した１０％のグリセリン溶液１００μｌに再懸濁させた。次に、エッペンドルフチューブに５０μｌの菌体懸濁液を採取し、上述のｐＩＪ７７３由来のアプラマイシン耐性遺伝子を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片溶液を５μｌ加えた。これを、予め氷中にて冷却した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベット（ビーエム機器株式会社製：ＢＭ６２００）に移した。エレクトロポレーションは、Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ６００（ビーエム機器株式会社製）にて、１２．５ｋＶ、２５μＦ、１２８Ωの条件にて行った。処理後の菌体には、予め氷中にて冷却したＬＢ液体培地を１ｍｌ添加し、３７℃で１時間静置培養した。これを、アンピシリンとアプラマイシンとをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ濃度で添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で終夜培養し、アンピシリン及びアプラマイシンの両者に耐性を示す株を得た。この株を、アンピシリンとアプラマイシンとをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ濃度で添加したＬＢ液体培地で培養し、プラスミドＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９−Ａｍを単離した。

【0113】

（実施例６）
＜生合成遺伝子欠損株の造出＞
Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２株［プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｈ），２０００年］に、定法に従いプラスミドＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９を導入し、Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９を得た。

【0114】

ストレプトバーティシリウムとＥ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９のコンジュゲーションは以下のようにして実施した。まず、ストレプトバーティシリウム株を６５ｍｌ容量の試験管に、１０ｍｌ調製した液体培地（Ｓ＃１）［ウエキ（Ｕｅｋｉ，Ｍ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本）、１９９６年、第４９巻、ｐ．６３９−６４３］に植菌し、３０℃にて２４時間培養した後、ＭＳ寒天培地（２％大豆粉、２％マンニトール、２％寒天）に塗布し、３０℃にて２日間培養した。培養後、２０％グリセロール３ｍｌで菌糸をかきとり、回収し、宿主の菌糸液を調製した。

【0115】

３０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌後、３ｍｌの２０％グリセリン溶液に菌体を懸濁した。一方、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ＴＯＰＯ−Δ４１ｃ２９−Ａｍを、アンピシリン及びアプラマイシンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したＬＢ液体培地で、３７℃、１８時間培養した後、培養液１ｍｌを１００ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン及びアプラマイシンをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ含む）に移植し、３７℃、４時間培養した。培養液５０ｍｌを３０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌し、菌体を２０ｍｌ のＬＢ液体培地に懸濁した。この操作を２回繰り返した後、菌体を２ｍｌの ＬＢ液体培地に懸濁した。

【0116】

ストレプトバーティシリウムの菌体懸濁液１００μｌとＥ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｃｏｓｍｉｄ２０３−７の菌体懸濁液１００μｌを、１．５ｍｌ容のチューブの中で合併し、遠心で集菌した。これを、１００μｌの２０％グリセリン溶液に懸濁した後、２０ｍｌ容量の１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＭＳ寒天培地に塗布した。３０℃で１８時間培養後、アプラマイシン４００μｇとナリジキ酸１５００μｇとを含む滅菌水１ｍｌを重層した。３０℃、５日間培養した後、寒天培地上で生育したストレプトバーティシリウムのコロニーを釣菌し、アプラマイシン２５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５０μｇ／ｍｌをぞれぞれ添加した１／２ＭＳ寒天培地（寒天：２％、マンニトール：１％、ダイズ粉末：１％、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）２日間、３０℃で培養後した。いずれのプレートにおいても生育したコロニーをＳ＃１培地に植菌し、３０℃、２４時間培養し、改変ＹＥＭＥ培地（６５ｍｌ容量の試験管に１０ｍｌ）に植菌し３０℃、１日間振とう培養し、その１ｍｌをさらに新たな改変ＹＥＭＥ培地（２５０ｍｌ容量の三角フラスコに５０ｍｌ）に植菌して継代培養した。この操作を５回繰り返した後、適当な生菌数となるように希釈した培養液を、アプラマイシン２５０μｇ／ｍｌを含む１／２ＭＳ寒天培地に塗布し、３０℃４日培養した。生育したコロニーをアプラマイシン２５０μｇ／ｍｌ、カナマイシン２５０μｇ／ｍｌをそれぞれ添加した１／２ＭＳ寒天培地にレプリカし、カナマイシン含有培地では生育せず、アプラマイシン含有培地で生育した、カナマイシン感受性株を２株（Ｄ１株、Ｄ２株）選抜した。

【0117】

得られた２株のゲノムＤＮＡを調製し、プライマー４１ｃ３０Ｆ４：５’−ＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＣＧＣＧ−３’（配列番号：４３）と４１ｃ３０ＲＲ２：５’−ＧＴＣＧＴＣＧＧＡＴＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧ−３’（配列番号：４４）の組合わせでＰＣＲ反応を行い、約０．５ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られず、２株がデザイン通り破壊株であることを確認した。

【0118】

（実施例７）
＜生合成遺伝子欠損株の培養、並びに培養液中のＵＫ−２Ａの定量＞
破壊株Ｄ１株、Ｄ２株を２５０ｍｌ容の三角フラスコに５０ｍｌ調製したＳ＃１培地に植菌し、３０℃、２４時間振とう培養後、培養液１ｍｌを生産培地［ウエキ（Ｕｅｋｉ，Ｍ）ら著、「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，（日本）、１９９６年、第４９巻、ｐ．６３９−６４３］に植菌し、３０℃、４日間振とう培養した。得られた培養液１ｍｌにアセトン４ｍｌを添加しＵＫ−２Ａを抽出、濾過し抽出液を得た。このうち５μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣシステムＬＣ−２０１０Ｃ（島津製作所製）を用いて分析した。分析条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ４．６Ｘ２５０ｍｍ、移動相：アセトニトリル：水：リン酸＝６０：４０：０．１、流速：１．１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、ＵＶ波長：３４０ｎｍとした。得られたパターンをＵＫ−２Ａ標準品と比較し、ＵＫ−２Ａに由来するピークを特定し、その面積からＵＫ−２Ａの定量を行った。

【0119】

同時に形質転換体の親株であるストレプトバーティシリウム属３−７株についても、同様に培養及び培養液中のＵＫ−２Ａの定量を行った。その結果、Ｄ１株、Ｄ２株のＵＫ−２Ａ生産性は、０μｇ／ｍｌであった。

【0120】

（実施例８）
＜生合成遺伝子クラスターが導入された形質転換体の造出＞
構築したｐＵＫ２−３のストレプトバーティシリウム属３−７株への導入を、放線菌では一般的に使用される手法［プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｈ），２０００年、ｐ．３１１−３３８］に従って、行った。まず、定法に従いプラスミドｐＵＫ２−３をエレクトロポレーションによりＥ． ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２株に導入しＥ．ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｐＵＫ２−３を得た。本株をクロラムフェニコール、カナマイシン及びアプラマイシンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したＬＢ液体培地で、３７℃、１８時間培養した後、培養液１ｍｌを１００ｍｌのＬＢ液体培地（クロラムフェニコール、カナマイシン及びアプラマイシンをそれぞれ２５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ含む）に移植し、３７℃、４時間培養した。培養液５０ｍｌを３０００ｒｐｍ、５分間遠心して集菌し、菌体を５０ｍｌのＬＢ液体培地に懸濁した。この操作を２回繰り返した後、菌体を１００μＬのＬＢ液体培地に懸濁した。

【0121】

一方、ストレプトバーティシリウム属３−７株をＭＳ寒天培地に塗布し、３０℃にて２日間培養した。培養後、２０％グリセロール１ｍｌで菌糸をかきとり、宿主の菌糸液とした。

【0122】

上記の通りに調製した宿主の菌糸液５００μｌとプラスミドｐＵＫ２−３を保持する大腸菌液５００μｌを混合して集菌した後、終濃度１０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭｇＣｌ_２を１０ｍＭ添加した希釈したＭＳ寒天培地に塗布した。３０℃、２０時間培養後、アプラマイシン６ｍｇ及びナリジキシン酸０．５ｍｇを含む滅菌水０．５ｍｌを重層し、更に、３０℃、５日間培養し、アプラマイシン耐性株として形質転換体を得た。

【0123】

（実施例９）
＜遺伝子導入された形質転換体の培養、並びに培養液中のＵＫ−２Ａの定量＞
遺伝子導入された形質転換体の培養は、実施例７に記載の方法で行った。その結果、表３に示したとおり、遺伝子導入された形質転換体のＵＫ−２Ａ生産性は、親株の５８〜７７倍に向上していた。

【0124】

【表3】

【0125】

（実施例１０）
＜遺伝子導入された形質転換体の培養、並びに培養液中のＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２ＣとＵＫ−２Ｄの合算量の定量＞
遺伝子導入された形質転換体の培養は、実施例７に記載の方法で行った。得られた培養液１ｍｌにアセトン４ｍｌを添加しＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ、ＵＫ−２Ｄを抽出し、濾過して抽出液を得た。このうち５μｌをＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣソリューションシステム（島津製作所製）を用いて分析した。分析条件は、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３ ４．６Ｘ１５０ｍｍ、移動相：リン酸二水素ナトリウム二水和物７．８gを水約８００ｍＬに溶かし、リン酸を用いてｐＨ４．０に調整し、水を加えて１０００ｍｌとすることによって調製したリン酸水溶液３５０ｍＬに、液体クロマトグラフ用アセトニトリル６５０ｍＬを加えた溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、ＵＶ波長：２３０ｎｍとした。得られたパターンをＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ及びＵＫ−２Ｄの標準品と比較し、ＵＫ−２Ａ、ＵＫ−２Ｂ、ＵＫ−２Ｃ及びＵＫ−２Ｄに由来する各々のピークを特定し、その面積からＵＫ−２Ａの量と、ＵＫ−２Ｂの量と、ＵＫ−２Ｃ及びＵＫ−２Ｄの合算量とについて、定量を行った。

【0126】

その結果、表４に示したとおり、遺伝子導入された形質転換体において、ＵＫ−２Ａと、ＵＫ−２Ｂと、ＵＫ−２Ｃ及びＵＫ−２Ｄとの生産性は、それぞれ親株の３７〜５７倍、１０〜１１倍、１２〜１３倍に向上していた。

【0127】

【表4】

【0128】

（実施例１１）
＜形質転換体におけるＵＫ−２生合成遺伝子クラスターのコピー数の定量＞
実施例９でＵＫ−２生産性の向上が確認された形質転換体２株と、宿主細胞であるストレプトバーティシリウム属３−７株とのゲノムＤＮＡを実施例１に示した方法で調製した。これを鋳型にしてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、添付のプロトコールに従いＰＣＲ反応を行い、得られた増幅断片を定量した。得られた結果を表５に示す。

【0129】

なお、このＰＣＲ反応において、導入したＵＫ−２生合成遺伝子クラスター内の領域を増幅するため、下記プライマーセットをデザインし、合成して用いた。
ＵＫ−２ Ｆ２（ＲＴ）：５’−ＧＣＡＣＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＧＧＧＴＴＧ−３’(配列番号：４５）
ＵＫ−２ Ｒ２（ＲＴ）：５’−ＡＴＣＧＣＣＧＣＧＴＡＣＡＣＣＡＴＧＡＣ−３’(配列番号：４６）
また、内在性コントロールとして、ＵＫ−２生合成遺伝子クラスター以外の領域を増幅するため、下記プライマーセットをデザインし、合成して用いた。
ｃｏｎｔ Ｆ１（ＲＴ）：５’−ＣＧＡＡＧＧＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧ−３’(配列番号：４７）
Ｃｏｎｔ Ｒ１（ＲＴ）：５’−ＡＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＧＡＧ−３’(配列番号：４８）

【0130】

【表5】

【0131】

表５に示す通り、形質転換体のＵＫ−２生合成遺伝子クラスターのコピー数は親株３−７株の２倍になっていることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0132】

以上説明したように、本発明によれば、ＵＫ−２生合成遺伝子又はＵＫ−２生合成遺伝子クラスターを導入することによって、ＵＫ−２の生産性が向上した形質転換体を提供することが可能となる。

【0133】

したがって、本発明の形質転換体を用いることにより、ＵＫ−２を安価で大量に製造することができるため、本発明は、イネいもち病防除剤、農園芸用防黴剤、医療用抗真菌剤の製造において有用である。

【受託番号】

【0134】

１．
（１）識別の表示：Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．３−７
（２）受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１４３７
（３）受託日：２０１１年１１月９日
（４）寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
（５）２０１２年４月に特許微生物寄託業務は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（旧称：ＩＰＯＤ）から独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）に承継された。

【配列表フリーテキスト】

【0135】

配列番号３６〜４８
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列

【配列表】

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