特許 6263559 従来型樹状細胞によるＩＦＮ‐ラムダの産生及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6263559

(24)【登録日】2017年12月22日

(45)【発行日】2018年1月17日

(54)【発明の名称】従来型樹状細胞によるＩＦＮ‐ラムダの産生及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20180104BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180104BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALI20180104BHJP

   A61K 31/713 20060101ALN20180104BHJP

   A61P 31/00 20060101ALN20180104BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20180104BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   C12N15/00 A

   C12N5/0784

   !A61K31/713

   !A61P31/00

   !A61P35/00

【請求項の数】4

【外国語出願】

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2016-1627(P2016-1627)

(22)【出願日】2016年1月7日

(62)【分割の表示】特願2012-543533(P2012-543533)の分割

【原出願日】2010年12月17日

(65)【公開番号】特開2016-121157(P2016-121157A)

(43)【公開日】2016年7月7日

【審査請求日】2016年1月12日

(31)【優先権主張番号】61/287,777

(32)【優先日】2009年12月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】10005348.7

(32)【優先日】2010年5月21日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】509296443

【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100069556

【弁理士】

【氏名又は名称】江崎 光史

(74)【代理人】

【識別番号】100111486

【弁理士】

【氏名又は名称】鍛冶澤 實

(74)【代理人】

【識別番号】100139527

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 克礼

(74)【代理人】

【識別番号】100164781

【弁理士】

【氏名又は名称】虎山 一郎

(72)【発明者】

【氏名】ホーホライン・フーベルトゥス

【審査官】 今村 明子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／０８８４０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００６／０５４１７７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表平０７−５０７９９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００４−５１７８０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１０９０８３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００９／１０２４９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００８−５０７５３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１２３９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／１３１９２６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Immunol., 2009.08, Vol.183, p.2522-2528

【文献】 Journal of Virology，２００９年 ９月 ９日，Vol.83,No.23，p.12266-12278

【文献】 Gene Therapy，２００５年，Vol.12，p.1394-1404

【文献】 J. Immunol., 2008, Vol.180, p.2474-2485

【文献】 Blood, 2002, Vol.99, No.6, p.2122-2130

【文献】 Experimental and Molecular Medicine, 2009.02, Vol.41, No.2, p.61-66

【文献】 Nature, 2005, Vol.433, 887-892

【文献】 Nature Immunology, 2002, Vol.4, No.1, p.63-68

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ９／ ００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ３１／ ００−３１／８０

Ａ６１Ｋ ３３／ ００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４７／ ００−４７／６９

Ａ６１Ｐ １／ ００−４３／００

Ｃ１２Ｑ １／ ０４

Ｃ１２Ｎ ５／０７８４

Ｃ１２Ｎ １５／ ０９

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の集団を生成又は採取するインビトロの方法であって、前記ｅＣＤ８＋ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、
（ａ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；（ｂ）前記従来型樹状細胞を、前記従来型樹状細胞の数を増加する薬剤と接触させる工程、ここで薬剤はＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドであり；
（ｃ）前記従来型樹状細胞を、ＨＳＶ‐１またはパラポックスウイルスであるｄｓＤＮＡ、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）またはマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）であるｄｓＲＮＡ、ポリＩＣ、ポリＡＵ、ポリＩＣＬＣ、ポリｄＡｄＴから成る群から選択される二本鎖（ｄｓ）核酸と接触させる工程；および
（ｄ）ＣＤ８＋および／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞から、ＩＦＮ‐λ産生Ｃｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２−陽性細胞を単離する工程；
を含むインビトロの方法。

【請求項2】

前記細胞の集団が、ＩＦＮ‐λ産生のエンハンサーと共に更に培養される方法であって、
前記エンハンサーが、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであるか；またはＴＮＦファミリーの成員であり、ＴＮＦファミリーの成員が、ＣＤ４０‐リガンド、又はＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γから選択されるサイトカインである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を検出又はスクリーニングするインビトロの方法であって、
（ａ）樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）ＢＤＣＡ３＋樹状細胞を選択する工程；
（ｃ）前記ＢＤＣＡ３＋樹状細胞を、ＨＳＶ‐１またはパラポックスウイルスであるｄｓＤＮＡ、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）またはマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）であるｄｓＲＮＡ、ポリＩＣ、ポリＡＵ、ポリＩＣＬＣ、ポリｄＡｄＴから成る群から選択される二本鎖（ｄｓ）核酸と接触させる工程；
（ｄ） ＩＦＮ‐λの産生を検出する工程；及び
（ｅ） ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在とＩＦＮ‐λの産生を関連づける工程を含むインビトロの方法。

【請求項4】

臓器又は血液の生検において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在をスクリーニング又は検出する請求項３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫治療の分野、特に樹状細胞によるインターフェロン（ＩＦ）の産生の分野に関する。本発明は、ＩＦＮ‐ラムダ（ＩＦＮ‐λ）の産生に関与する特定の樹状細胞タイプ、及びこの産生を調整する方法に関する。特に、本発明は、インビトロ及び生体内におけるＩＦＮ‐λの産生のための組成物及び方法に関する。よって、本発明は、対象において、特定の樹状細胞タイプにおいてＩＦＮ‐ラムダの産生を誘導することによって、抗感染応答、特に抗ウイルス応答を誘導することができる二本鎖（ｄｓ）核酸の治療への適用に関する。特に、本発明は、特にウイルス感染によって引き起こされる感染症又は癌の予防及び／又は治療における、ＣＤ８＋従来型樹状細胞（ＣＤ８＋ ｃＤＣ）を標的とするｄｓ核酸及び／又はそれらの等価物（ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ）に関する。更に、本発明は、ＩＦＮ‐λを産生する、並びに／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを生成又は採取する方法に関する。また、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを検出又はスクリーニングする方法に関する。くわえて、本発明はｃＤＣにおけるＩＦＮ‐ラムダの産生を誘導する生体外の方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＩＦＮ‐ラムダ（ＩＦＮ‐λ）１、２、３サイトカインファミリーは、それぞれ、ＩＬ‐２９、ＩＬ‐２８Ａ、及びＩＬ‐２８Ｂとも呼ばれ、近年になって同定された（Ｋｏｔｅｎｋｏら，２００３；Ｓｈｅｐｐａｒｄら，２００３）。ＩＦＮ‐ラムダ（ＩＦＮ‐λ）は、強力な免疫調節及び抗ウイルスサイトカインであり、近年、ヒトにおいてＣ型肝炎ウイルスの排除に関係があるとされている。ＩＬ‐２８Ａ（ＩＦＮ‐λ２とも呼ばれる）、ＩＬ‐２８Ｂ（ＩＦＮ‐λ３）、及びＩＬ‐２９（ＩＦＮ‐λ１）は、ＩＩ型サイトカイン受容体リガンドであるＩＩＩ型インターフェロンである。ＩＦＮ‐λは、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ‐Ｉ）及びサイトカインのＩＬ‐１０ファミリーに関連し、ＩＦＮ‐λ固有の１つの鎖（ＩＦＮ‐λＲ１又はＩＬ‐２８Ｒα）及びＩＬ‐１０関連のサイトカインと共通のもう１つの鎖（ＩＬ‐１０Ｒ２）からなるヘテロ二量体受容体を介してシグナル伝達する。ＩＦＮ‐λは、抗ウイルス、抗腫瘍、及びさまざまな免疫調節機能を有し、いろいろな意味でＩＦＮ‐Ｉの機能に類似している（Ｌｉら，２００９）。ＩＦＮ‐Ｉ受容体の遍在する発現とは対照的に、ＩＦＮ‐λ受容体の発現は、例えば上皮細胞及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）などの限られた細胞タイプに制限される（Ａｎｋら，２００８；Ｓｏｍｍｅｒｅｙｎｓら，２００８）。ウイルス若しくはポリＩＣ又はＣｐＧ‐オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）などの核酸の類似体にさらすことは、ＩＦＮ‐Ｉの産生を引き起こすことが知られている条件であり、それはまたＩＦＮ‐λを誘導し、おしなべて、類似したシグナル伝達構成要素に依存する（Ａｎｋら，２００８；Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄら，２００７年；Ｏｎｏｇｕｃｈｉら，２００７年）。ＩＦＮ‐λは、トル様受容体（ＴＬＲ）により誘導される粘膜のウイルス感染に対する防御において役割を担っており、最近の報告は、ＩＬ‐２８Ｂ遺伝子をＣ型肝炎感染の除去及び回復する能力に関連づけている（Ａｎｋら，２００８；Ｇｅら，２００９）。よって、ＩＦＮ‐λの細胞起源及びその産生調節を理解することが極度に重要である。

【0003】

例えば単球由来の樹状細胞（ＤＣ）及び形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）などの幾つかの細胞タイプは、ＩＦＮ‐λを産生すると記載されてきているが、生体内における二本鎖（ｄｓ）核酸により誘導されるＩＦＮ‐λの細胞起源は、依然としてとらえどころがない（Ｃｏｃｃｉａら，２００４；Ａｎｋら，２００８；Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄら，２００５）。単球由来のＤＣは、ＣＤ８＋従来型ＤＣ（ＣＤ８＋ ｃＤＣ）でもＣＤ８＋ ｃＤＣの等価物（ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ）でもなく、なぜならｅＣＤ８＋ ｃＤＣは成長に、ＧＭ‐ＣＳＦではなくＦｍｓ関連のチロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３）‐リガンド（ＦＬ）を必要とするからである。ＧＭ‐ＣＳＦは、ＩＬ‐４又はＴＮＦ‐α（ＴＮＦ‐α）などの他のサイトカインと組み合わされるかもしれないが、単球由来のＤＣは、成長に、ＧＭ‐ＣＳＦに完全に依存する。ＧＭ‐ＣＳＦ依存性のＤＣは、定常状態のＤＣの等価物ではなく、なぜならＧＭ‐ＣＳＦ又はＧＭ‐ＣＳＦ受容体の欠乏は、リンパ器官における通常のｐＤＣ又はｃＤＣサブセットの存在に影響を与えないからである（Ｎａｉｋら，２００８）。ＧＭ‐ＣＳＦとＦＬとの組み合わせを使って、細胞がインビトロで生成される場合、ＧＭ‐ＣＳＦ ＤＣのみが成長し、ｐＤＣもｅＣＤ８＋ ｃＤＣも成長しない（Ｇｉｌｌｉｅｔら，２００２）。

【0004】

ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩＣ）は、ウイルス感染中に生成されるウイルス二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの模倣物であり、生体内において、ＴＲＩＦ依存性のＴＬＲ３又はＣａｒｄｉｆ（ＩＰＳ‐１、ＭＡＶＳ、ＶＩＳＡとしても知られている）依存性のＲｉｇ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）によって認識される。それは、免疫刺激剤として一般に使用され、ＤＣを標的とするワクチンのモデルにおいて、Ｔｈ１ＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導するための優れたアジュバントである（Ｌｏｎｇｈｉら，２００９）。

【0005】

従来型樹状細胞（ｃＤＣ）は、効果的な抗原提示細胞であるだけでなく、サイトカインの自然の供給源としても知られている。マウスｃＤＣのなかで、ＣＤ８ααホモ二量体（ＣＤ８＋）の発現により定義されるサブセットは、例えば脾臓、リンパ節、胸腺及び肝臓などのさまざまな臓器におけるＩＬ‐１２ｐ７０の主要な産生源としてと同定された（Ｒｅｉｓ ｅ Ｓｏｕｓａら，１９９７；Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００１；Ｐｉｌｌａｒｉｓｅｔｔｙら，２００４）。ＣＤ８＋ ｃＤＣの別の機能的な特徴は、それらの交差提示能力である（Ｓｈｏｒｔｍａｎら，２００９）。

【0006】

ＣＤ８＋ ｃＤＣは、明らかに機能的に異なったＤＣサブセットである。しかしながら、これら機能的属性は、必ずしもＣＤ８の発現に対応しているとは限らないことがある。よって、ＣＤ８分子とは別に、表面マーカーの他の組み合わせを、ＣＤ８＋ ｃＤＣ又はＣＤ８発現を欠きうるそれらの機能的な等価物（ｅＣＤ８＋）を同定するのに使用することができる。ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣクラスＩＩが高い細胞の中で、ＣＤ２０５、ＣＤ１０３、Ｎｅｃｌ２、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＤ２４の高い発現をＣＤ１１ｂ及びＣＤ１７２ａ陰性又はＣＤ１７２ａの低い発現を伴って、多様な組合せを使用することができる。（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，２００８；Ｓｈｏｒｔｍａｎら，２００９）。

【0007】

ＤＣサブセットは、骨髄前駆体細胞から、Ｆｌｔ３‐リガンド（ＦＬ）であるＦＬＤＣの存在下において、インビトロで生成することができる（Ｂｒａｓｅｌら，２０００）。ＦＬＤＣ ｃＤＣは、ＣＤ８及びＣＤ４の発現を欠いているが、上記のマーカーを使って、脾臓ｃＤＣに類似した、機能的に異なるサブセットに分けることができる。ＦＬＤＣサブセットの１つは、ｅＣＤ８＋として同定されれているが、それは、成長においてＣＤ８＋ ｃＤＣと同じ転写制御因子に依存し、Ｃｌｅｃ９ａの高い発現、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１７２ａの低い発現などの幾つかの特徴的な表面マーカーを発現し、ＴＬＲの類似の発現プロフィールを示すからである。機能的に、ｅＣＤ８＋ＤＣは、類似のＴＬＲ‐リガンド応答性も、高いＩＬ‐１２ｐ７０産生及び効率的な交差提示も示す。脾臓における生体内転移及び回復の際、ｅＣＤ８＋ＤＣは、ＣＤ８をそれらの表面に発現する（Ｎａｉｋら，２００５）。

【0008】

異なる核酸感知システムであるＴＬＲ３、ＴＬＲ７、又はＴＬＲ９及びＲＬＨの発現は、ＤＣサブセットによってさまざまである（Ｈｏｃｈｒｅｉｎ ａｎｄ Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ，２００８）。また、これら受容体の結合後の下流の機能も、異なるＤＣによって多様である。ｐＤＣは、核酸感知にＴＬＲ７及びＴＬＲ９を主に使用し、ＩＦＮ‐Ｉ及びＩＦＮ‐λの高い産生をもたらす。ｃＤＣのなかで、ＣＤ８＋ ｃＤＣは、ＴＬＲ３を高発現するが、ＴＬＲ７の発現を欠いている（Ｅｄｗａｒｄｓら，２００３）。更に、ＣＤ８⁻ ｃＤＣとは対照的に、ＣＤ８＋ ｃＤＣは、ＲＬＨをほとんど発現せず、その結果として、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルスであるセンダイウイルス又はインフルエンザウイルスを検出することができないことがプロテオミクスによって見いだされた（Ｌｕｂｅｒら，２０１０）。

【0009】

ＣＤ８は、ヒトＤＣで発現されない一方で、ＣＤ４は、全てのＤＣサブセットによって発現され、よって他のマーカーが、ヒトＤＣサブセットを定義し、可能性としてマウス及びヒトの対応物をアラインメントするのに用いられなければならない。ＢＤＣＡ１‐４と指定される抗体のセットが確立されており、ｐＤＣ及びｃＤＣサブセット間の識別に使用される（Ｄｚｉｏｎｅｋら，２０００）。ヒトＢＤＣＡ３陽性のＤＣは、マウスｅＣＤ８＋ＤＣと同様、高レベルのＣｌｅｃ９ａ及びＮｅｃｌ２を選択的に発現するが、少量のＣＤ１１ｂのみを発現するため、それらは、ヒトｅＣＤ８＋ＤＣとして提案されている。（Ｓｈｏｒｔｍａｎら，２００９）。全ゲノム転写分析は、ネズミＣＤ８＋ ｃＤＣのヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣとの近い関係を実証した（Ｒｏｂｂｉｎｓら，２００８）。マウスｅＣＤ８＋ ｃＤＣと同様に、ヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣは、例えば血液、脾臓、肺、扁桃腺、リンパ節、結腸及び肝臓などのさまざまな臓器で見いだされている。ヒト胸腺のＣＤ１１ｂ^ｌｏｗｃＤＣは、マウス胸腺ＣＤ１１ｂ^ｌｏｗＤＣと、高いＩＬ‐１２ｐ７０産生で関連するものの、これらヒトとマウスＤＣサブセット間の機能的な関連は稀である（Ｖａｎｄｅｎａｂｅｅｌｅら，２００１；Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００１）。

【0010】

Ｍｉｙａｋｅら（２００９）は、ポリＩＣはＩＰＳ‐１及びＴＲＩＦに依存する方法を介してＮＫ細胞を活性化することを記載している。両経路は、ＮＫ細胞を介してＢ１６腫瘍抑制に関与した。ＣＤ８ａ＋ ｃＤＣは、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮ‐α／β）、ＩＬ‐６及びＩＬ‐１２ｐ４０の源として同定され、ＮＫ細胞によるＩＦＮ‐ガンマ産生を尺度にＮＫ細胞活性化に関与している。

【0011】

Ｓｃｈｕｌｚら（２００５）は、ウイルス感染した細胞に存在するｄｓＲＮＡはＴＬＲ３を介して樹状細胞により認識されることを記載している。そして、ポリＩＣＣＤ８ａ＋ ｃＤＣを活性化する（ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ８０などの表面マーカーの増加が検出され、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６及びＩＦＮ‐α／βの遺伝子活性化、ただし、タンパク質ではＩＬ‐６タンパク質のみが検出されることができた）。ＴＬＲ３はこの活性化に必要であり、その活性化されたＣＤ８ａ＋ ｃＤＣは、交差提示を介してより強いＣＴＬ誘導を誘導することが示された。

【0012】

Ｄｉｅｂｏｌｄら（２００９）は、レプリコンプラスミドはＣＤ８ａ＋ ｃＤＣによりＴＬＲ３依存的な方法で検出されるｄｓＲＮＡ中間体を誘導することを記載している。対照的に、ＣＴＬの活性化はＴＬＲ３に依存しなかった。

【0013】

国際公開第２００６／０５４１７７号は、特定の腫瘍がＴＬＲ３を発現し、これらの腫瘍はポリＡＵなどのＴＬＲ３‐アゴニストで治療される可能性を記載している。

【0014】

国際公開第２００９／０８８４０１号は、ＴＬＲリガンドと、ＴＬＲ３アゴニストであるそれらの１つとの組み合わせは、増加した（適応した）免疫応答、特に抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するであろうことを記載している。また、請求項はＴＬＲ３アゴニスト及び他のＴＬＲアゴニストの組み合わせでの樹状細胞の活性化を含み、例えばＴ‐細胞により産生されるサイトカインの強化などの強化されたＣＤ８Ｔ細胞応答を主張している。

【0015】

国際公開第２００４／０６０３１９号は、ＴＬＲアゴニスト及びＴＮＦ／Ｒアゴニストの組み合わせは抗原特異的免疫応の量を増加することを記載している。これらの抗原に特異的な応答は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞）からか又はキラーＴ細胞（ＣＤ８Ｔ細胞）からかのいずれかであった。

【0016】

国際公開第９４／２８３９１号は、ＦＬＴ３のリガンドは造血幹細胞又はその他の免疫細胞増殖に使用されることができることを記載している。Ｆｌｔ３‐リガンドの異なる形態が記載されている。

【0017】

国際公開第２００８／１３１９２６号は、Ｍ‐ＣＳＦはＦｌｔ３‐リガンド又はＧＭ‐ＣＳＦから独立して使用され、樹状細胞の生成を誘導できることを記載している。特にｐＤＣの産生はＦＬから独立しており、ｃＤＣの産生はＧＭ‐ＣＳＦから独立していた。

【0018】

Ａｎｋら（２００８）は、多くの異なる細胞タイプがＴＬＲリガンド又はウイルスに対してＩＦＮ‐ラムダを産生することを記載している。また、それは、ＩＦＮ‐ラムダ受容体発現を分析し、生体内ウイルス感染モデルを使用している。ポリＩＣ又はＣｐＧ‐ＯＤＮの局所的（膣内）適応は、マウスを致死的な膣内ＨＳＶ‐２抗原投与から防御した。また、その文献は、脾臓からのｃＤＣ、ｐＤＣ、Ｂ‐細胞、Ｔ‐細胞及びマクロファージはＨＳＶ‐２に応答してＩＦＮ‐ラムダｍＲＮＡを産生したことを記載している。

【0019】

Ｓｈｅｐｐａｒｄら（２００３）は、ＩＦＮ‐ラムダの存在、並びにそれらはＩＦＮ‐Ｉ及びサイトカインのＩＬ‐１０ファミリーに関連することを記載している。その文献は、ポリＩＣ治療後又はＥＭＣＶ感染後のヒトＰＢＭＣのＩＦＮ‐ラムダ（ＩＬ‐２８Ａ、ＩＬ‐２８Ｂ、ＩＬ‐２９）、ＩＦＮ‐アルファ及びＩＦＮ‐ベータのｍＲＮＡを示す。３つのＩＦＮ‐ラムダ、及びＩＦＮ‐アルファ及びＩＦＮ‐ベータのｍＲＮＡは、ポリＩＣ又はウイルスのいずれかにさらすと上方制御された。

【0020】

Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅら（２００２）は、さまざまな成長因子に応答するＤＣサブセットの増加を記載し、例えばｆｌｔ３‐リガンドに応答するＣＤ８ａｃＤＣの増加を示している。ＣｐＧに応答するＩＬ‐１２ｐ４０及びＩＬ‐１２ｐ７０産生が分析され、ＣＤ８ａ＋ ｃＤＣ及びＦＬの後、ＰｒｏＧＰ（ＦＬとＧ‐ＣＳＦの融合タンパク質）に対して、ＣＤ８ａ^ｉｎｔｃＤＣが、ＩＬ‐１２ｐ７０の主要な産生源であった。

【0021】

しかしながら、上記の引用文献及び特許出願のいずれも、ＩＦＮ‐ラムダの源である細胞について手掛かりを提供していない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0022】

【特許文献1】国際公開第２００６／０５４１７７号

【特許文献2】国際公開第２００９／０８８４０１号

【特許文献3】国際公開第２００４／０６０３１９号

【特許文献4】国際公開第９４／２８３９１号

【特許文献5】国際公開第２００８／１３１９２６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0023】

したがって、ｄｓ核酸により誘導されたＩＦＮ‐λの主要な産生源であるｃＤＣの特定のタイプを提供することが、本発明の目的である。

【課題を解決するための手段】

【0024】

本発明は次の項目を提供する：
［１］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）におけるＩＦＮ‐λ産生の誘導に使用する二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を含む組成物であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現する組成物。好ましくは、前記従来型ｃＤＣはヒトｃＤＣである。
［２］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞におけるＩＦＮ‐λ産生を誘導する医薬組成物の調製のための二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体の使用であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現する使用。好ましくは、前記従来型ｃＤＣはヒトｃＤＣである。
［３］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞におけるＩＦＮ‐λ産生を、それを必要としている対象において誘導する方法であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、前記対象に二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与する工程を含む方法。好ましくは、前記従来型ｃＤＣはヒトｃＤＣである。
［４］ＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防及び／又は治療の方法において用いられる、項目［１］の組成物、項目［２］の使用、又は項目［３］の方法。
［５］前記二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体が、生体外において、対象から（単離された）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）に投与される、項目［１］又は［４］の組成物、項目［２］又は［４］の使用、若しくは項目［３］又は［４］の方法。
［６］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤が、前記二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体の投与前に、前記単離されたｃＤＣに生体外において投与される、項目［５］の組成物、使用、又は方法。
［７］前記ｄｓ核酸が、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡである、項目［１］〜［６］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［８］前記誘導が、ＭｙＤ８８依存的なＴＬＲから独立している、項目［１］〜［７］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［９］前記誘導が、（アダプター分子である）ＭｙＤ８８から独立している、項目［１］〜［８］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１０］前記誘導が、（Ｒｉｇ様ヘリカーゼのアダプター分子である）Ｃａｒｄｉｆから独立している、項目［１］〜［９］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１１］前記誘導が、ＴＲＩＦから独立している、項目［１］〜［１０］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１２］前記誘導が、ＴＬＲ‐７及び／又はＴＬＲ‐９から独立している、項目［１］〜［１１］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１３］前記誘導が、ＴＬＲ‐３によって媒介される、項目［１］〜［１２］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１４］前記誘導が、ＩＲＦ３及び／又はＩＲＦ７によって媒介される、項目［１］〜［１３］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１５］前記誘導が、ＩＲＦ８によって媒介される、項目［１］〜［１４］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１６］前記誘導が、ＩＦＮ‐ＩＲによって媒介される、項目［１］〜［１５］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１７］前記組成物がＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を更に含む、項目［１］〜［１６］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［１８］前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞のレベルを増加する薬剤が、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである、項目［１７］の組成物、使用、又は方法。
［１９］前記組成物がｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を更に含む、項目［１］〜［１８］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［２０］ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤が、ＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、前記ＴＬＲ‐リガンドが、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、前記ＴＮＦファミリーの成員が、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド又はサイトカインであって、前記サイトカインが、好ましくは、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである薬剤である、項目［１９］の組成物、使用、又は方法。
［２１］二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と組み合わせてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を含む、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防及び／又は治療の方法に用いる組成物であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、
（ａ）対象に、前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を投与すること；及び
（ｂ）対象に、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与して、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞においてＩＦＮ‐λ産生を誘導することを含む組成物。
［２２］必要としている対象において、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、
（ａ）対象に、前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を投与する工程；及び
（ｂ）対象に、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与して、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞においてＩＦＮ‐λ産生を誘導する工程を含む方法。
［２３］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞のレベルを増加する前記薬剤が、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである、項目［２１］の組成物、又は項目［２２］の方法。
［２４］前記ＩＦＮ‐λ依存性の疾患が、感染症又は癌である、項目［１］〜［２３］のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［２５］前記ＩＦＮ‐λ依存性の疾患が、血液、脾臓、肺、扁桃腺、リンパ節、結腸又は肝臓の疾患である、項目［２４］の組成物、使用、又は方法。
［２６］前記感染症が、ウイルス感染症である、項目［２４］又は［２５］の組成物、使用、又は方法。
［２７］前記ウイルス感染症が、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡを含むウイルスによる感染症である、項目［２６］の組成物、使用、又は方法。
［２８］前記ウイルス感染が、持続性のウイルス感染症、好ましくは、肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症、より好ましくは、肝炎ウイルス感染症である、項目［２６］又は［２７］の組成物、使用、又は方法。
［２９］ＩＦＮ‐λを産生する、及び／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の集団を生成又は採取するインビトロの方法であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、
（ａ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；（ｂ）前記従来型樹状細胞を、前記従来型樹状細胞のレベルを増加する薬剤と接触させる工程であって、前記薬剤が、好ましくは、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである工程；及び
（ｃ）前記従来型樹状細胞を、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と接触させる工程を含むインビトロの方法。
［３０］前記細胞の集団が、ＩＦＮ‐λ産生のエンハンサーと共に更に培養される、項目［２９］の方法。
［３１］前記エンハンサーが、ＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、前記ＴＬＲ‐リガンドが、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、前記ＴＮＦファミリーの成員が、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド、又はサイトカインであって、前記サイトカインが、好ましくは、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである、項目［３０］の方法。
［３２］項目［２９］〜［３１］のいずれか一項の方法によって入手可能なＩＦＮ‐λ産生ヒトＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の集団、及び、随意に薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
［３３］ヒトＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を検出又はスクリーニングするインビトロの方法であって、
（ａ）樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）ＢＤＣＡ３＋樹状細胞を選択する工程；
（ｃ）前記ＢＤＣＡ３＋細胞を、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と接触させる工程；（ｄ）ＩＦＮ‐λの産生を検出する工程；及び
（ｅ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在とＩＦＮ‐λの産生を関連づける工程を含むインビトロの方法。
［３４］生検、好ましくは臓器又は血液の生検において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在をスクリーニング又は検出する項目［３３］の方法。
［３５］ｃＤＣを二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と、生体外で接触させることを含む、（ヒト）従来型樹状細胞（ｃＤＣ）の集団におけるＩＦＮ‐λの産生を誘導する方法。［３６］Ｆｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドで前処理されたｃＤＣが、生体外において前記ｄｓ核酸と接触させられる項目［３５］の方法。
［３７］前記ｄｓ核酸の類似体が、ポリＩＣ、ポリＡＵ、ポリＩＣＬＣ、ポリｄＡａＴである前述の項目のいずれか一項の組成物、使用、又は方法。
［３８］感染症又は癌、好ましくはウイルス感染症の予防及び／又は治療に用いられるＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とする二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体含む組成物。
［３９］ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体、並びにｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を含む配合剤。
［４０］ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤が、ＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、前記ＴＬＲ‐リガンドが、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、前記ＴＮＦファミリーの成員が、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド又はサイトカインであって、前記サイトカインが、好ましくは、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである薬剤である、項目［３９］の配合剤。
［４１］感染症又は癌、好ましくはウイルス感染症を患う対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加するのに用いるＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンド。
［４２］前記ウイルス感染が、持続性のウイルス感染症、好ましくは、肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症、より好ましくは、肝炎ウイルス感染症である、項目［３８］の組成物又は［４１］のＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンド。
［４３］ＩＦＮ‐λを産生する、並びに／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取するインビトロの方法であって、
（ａ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させる工程の工程を含むインビトロの方法。
［４４］前記細胞の集団が、ＩＦＮ‐λ産生のエンハンサーと共に更に培養される、項目［４３］の方法。
［４５］前記エンハンサーが、ＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、前記ＴＬＲ‐リガンドが、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、前記ＴＮＦファミリーの成員が、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド、又はサイトカインであって、前記サイトカインが、好ましくは、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである、項目［４４］の方法。
［４６］項目［４３］〜［４５］のいずれか一項の方法によって入手可能なＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団、及び、随意に薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
［４７］ヒトＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを検出又はスクリーニングするインビトロの方法であって、
（ａ）細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）細胞を、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐ラムダの産生を刺激又は誘導できるｄｓ核酸又はその類似体と接触させる工程；
（ｃ）ＩＦＮ‐λの産生を検出する工程；及び
（ｄ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在とＩＦＮ‐λの産生を関連づける工程を含むインビトロの方法。
［４８］生検、好ましくは臓器又は血液の生検において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在をスクリーニング又は検出する項目［４７］の方法。
［４９］ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と、生体外で接触させることを含む、ｃＤＣの集団におけるＩＦＮ‐λの産生を誘導する方法。
［５０］Ｆｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドで前処理されたｃＤＣが、生体外において前記ｄｓ核酸と接触させられる項目［４９］の方法。

【0025】

本明細書において使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容から判断して明らかにそうでない場合を除いて複数の対照物を含むことを留意しなければいけない。よって、例えば、「１つの薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」への参照は、１つ以上のそのような異なる試薬を含み、「その方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」は、本明細書において記載されている方法を変更又は置換できうる当業者に公知の等価な工程及び方法への参照を含む。

【0026】

本開示に引用された全ての刊行物及び特許はそれら全体が参考により組み込まれる。参照により取り込まれた資料が明細書と矛盾する又は不一致である限りにおいては、明細書がいかなるそのような資料に優先する。

【0027】

特に指示がない限り、一連の要素があとに続く「少なくとも」という用語は、列挙されるリストの全ての要素に言及すると理解される。当業者は、本明細書において記載されている本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を理解し、日常的な実験以上のことを行わずに確認することができるであろう。そのような等価物は本発明に包含されることを意図する。

【0028】

本明細書及び付随する特許請求の範囲の全体を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び”「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）などの変形は、１つの規定の完全体又は工程若しくは一群の完全体又は工程の包括を示すのであって、その他の完全体又は工程若しくは一群の完全体又は工程の除外を示すのではないと理解されたい。本明細書において使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語によって置換可能であり、本明細書において使用する場合、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語によって置換可能なことがある。

【0029】

本明細書において使用する場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項要素で明確に述べられていない、いかなる要素、工程、又は成分も排除する。本明細書において使用する場合、「から本質的になるｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」は、請求項の基本的で新規な特徴に実質的に影響しない材料又は工程を排除しない。

【0030】

本明細書における各例では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語はどれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えられうる。

【0031】

本明細書において記載されている、「好ましい実施形態」とは、「本発明の好ましい実施形態」を意味する。同様に、本明細書において記載されているように、「さまざまな実施形態」及び「別の実施例」とは、それぞれ「本発明のさまざまな実施形態」及び「本発明の別の実施形態」を意味する。

【0032】

幾つかの文献が、本明細書の本文の全体を通して引用されている。本明細書において引用されている各文献（例えば全ての特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、取り扱い説明書など）は、上記又は下記を問わず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における一切の内容は、本発明が先行発明を理由としてこうした開示に先行する権利を与えられないことを容認するものとは解釈されない。

【発明を実施するための形態】

【0033】

本発明は、ＣＤ８＋従来型ＤＣ（ＣＤ８＋ ｃＤＣ）及びＣＤ８＋ ｃＤＣの等価物（ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ）において、ｄｓＲＮＡはＩＦＮ‐λ産生を誘導するという発見に基づいており、一方で、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）が異なる機構によるＩＦＮ‐λ産生に関与していることは先行技術において公知である。

【0034】

本願の発明者らは、驚くべきことに、ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡとしてのｄｓ核酸類も、ポリＩＣなどの合成ｄｓ核酸類似体も、ＣＤ８＋従来型ＤＣ（ＣＤ８＋ ｃＤＣ）及びＣＤ８＋ ｃＤＣの等価物（ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ）において、大量のＩＦＮ‐λを誘導するが、ｐＤＣ又はその他のｃＤＣサブセットにおいては誘導しないことを見いだした。ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させることは、ＩＦＮ‐ラムダの産生を刺激する。

【0035】

形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）は、大量のＩＦＮ‐アルファ（ＩＦＮ‐α）をも産生する条件の下で、大量のＩＦＮ‐λを産生する。ｐＤＣを介するこの産生は、トル様レセプター（ＴＬＲ）アダプター分子であるＭｙＤ８８の存在に完全に依存している。幾つかのノックアウトマウスを使って、本発明の発明者らは、合成ｄｓ核酸類似体に応答するＣＤ８＋ ｃＤＣのＩＦＮ‐λ産生が、ＭｙＤ８８依存的なＴＬＲから独立しており、ＴＬＲのアダプター分子であるＭｙＤ８８から独立しており、Ｒｉｇ様ヘリカーゼのアダプター分子であるＣａｒｄｉｆから独立しており、トル様受容体の（ＴＬＲ）の活性化に応答するインターフェロン‐βを誘導するＴＩＲ‐ドメインを含有するアダプター（ＴＲＩＦ）であるＴＲＩＦから独立しており、ＴＬＲ‐７から独立しており、及び／又はＴＬＲ‐９から独立していることを示すことができた。

【0036】

ＴＬＲ‐７はｓｓＲＮＡを認識し、ＴＬＲ‐９はｄｓＤＮＡを認識し、一方、ＴＬＲ‐３はｄｓＲＮＡを認識する。興味深いことに、ヒト従来型樹状細胞（即ちＢＤＣＡ３＋ 細胞）は、ＴＬＲ‐９を発現せず、ヒト形質細胞様樹状細胞はＴＬＲ‐９を発現する。しかしながら、それでもなお、ヒト従来型樹状細胞はｄｓＤＮＡを認識することができ、よって、付随する実施例に示されているように、誘導されてＩＦＮ‐ラムダを産生する（実施例１１を参照のこと）。

【0037】

くわえて、更なるノックアウトマウスの使用により、本発明の発明者らは、ＩＦＮ‐λ産生はＴＬＲ‐３（即ちｄｓＲＮＡを認識するレセプター）により媒介されることを見いだした。更に、本発明の発明者らは、ＩＦＮ‐λ産生はＩＲＦ３及び／又はＩＲＦ７、ＩＲＦ８及び／又はＩＦＮ‐ＲＩにより媒介されることを見いだした。

【0038】

ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＩＲＦ８は、インターフェロン調節転写因子（ＩＲＦ）ファミリーの成員であり、一方、ＩＦＮ‐ＲＩはＩ型ＩＦＮ受容体である。

【0039】

具体的には、本発明において、マウスＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、インビトロ及び生体内における、ｄｓ核酸（ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡ）及びポリＩＣなどの合成ｄｓ核酸類似体に応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源として同定された。刺激の性質及びサイトカイン環境がＣＤ８＋ ｃＤＣがＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０産生するかどうかを決定した。生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λは、大部分のＤＣを欠いているマウスにおいて、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドの欠如のため抑止されたが、ＩＦＮ‐αの産生はそうではなかった。ＴＬＲ３は生体内におけるポリＩＣにより誘導されるＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＲＬＨは関与しないことが示された。また、ＭｙＤ８８依存的なＩ型ＩＦＮ産生に必要とされるＩＲＦ７も、このＩＦＮ‐λ産生に関与することが示された。マウスＣＤ８＋ＤＣの等価物であると提案されているＢＤＣＡ３＋ ヒトＤＣは、ポリＩＣ刺激に際し、最も高いＩＦＮ‐λ１及びＩＦＮ‐λ２産生を示した。マウス及びヒトＣＤ８＋ ｃＤＣ等価物が、ｄｓ核酸（ｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡ）及びポリＩＣなどの合成ｄｓ核酸類似体に応答するＩＦＮ‐λの主要な源として同定された。

【0040】

試験した全ての種の中では、樹状細胞は、血液、皮膚、及び全リンパ器官中に存在する稀な細胞である。例えば、脾臓において、それらは全脾細胞のわずか約１％を占めるのみである。しかし、これら稀な細胞が正常な免疫応答に非常に重要であることは明らかである。ＤＣ枯渇マウスは、ウイルス感染（Ｃｉａｖａｒｒａら，２００６）、寄生虫感染（Ｊｕｎｇら，２００２；Ｌｉｕら，２００６ａ）、及び細菌感染（Ｊｕｎｇら，２００２）に対して、欠陥のある免疫応答を示す。

【0041】

大部分のＤＣサブタイプの広範な研究は、マウス系で実施されている。あらゆるマウスリンパ器官及び血液内では、ＤＣの２つの異なる種類、すなわち従来型ＤＣ（ｃＤＣ）及び形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）があることが明らかである。同じ状況がヒトを含めてその他の哺乳類種に存在する。したがって、本発明のＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、表現型、機能及び起源により更に分けられることができる。ネズミ脾臓内で、３つの主要なｃＤＣサブセットが定義された（表１を参照のこと）。ＣＤ８‐アルファ（ＣＤ８α）分子及びＣＤ４分子の選択的な発現に基づいて、それらは、ＣＤ８＋ＤＣ（ＣＤ８^ｐｏｓ、ＣＤ４^ｎｅｇ）、ＣＤ４＋ ＤＣ（ＣＤ８^ｎｅｇ、ＣＤ４^ｐｏｓ）及び二重陰性ＤＮ‐ＤＣ（ＣＤ８^ｎｅｇ、ＣＤ４^ｎｅｇ）と命名されている。

【0042】

表１．脾臓ｃＤＣサブセット細胞表面上における選択された分子の差異のある発現

【0043】

【表1】

【0044】

本発明のＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、上記の表１に従って選択された分子の差異のある発現によって更に特徴付けることができる。とりわけ、表１がマウス分子を提供するのみである場合、必要ならば当業者は脾臓ｃＤＣサブセットの細胞表面上にヒト対応分子を容易に見つけることができ、逆もまた同様であろう。

【0045】

表現型の差異にくわえて、幾つかの機能的な違いが同定されており、例えばＣＤ８＋ＤＣは主要な交差提示細胞であり、主要なＩＬ‐１２ｐ７０産生源であり、ＴＬＲ３を介してｄｓＲＮＡに応答することができる。対照的に、それらはｓｓＲＮＡ受容体であるＴＬＲ７及びＲＩＧ‐Ｉを欠いているため、ｓｓＲＮＡに対して応答することができない。

【0046】

ｐＤＣは、ＣｐＧ‐ＤＮＡ又はセンダイウイルス（ＳｅＶ）に応答してＩＦＮ‐λを産生することが知られているが、本願の発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ８＋ ｃＤＣは、ｄｓＲＮＡに応答するＩＦＮ‐λの唯一の産生源であることを見いだした。

【0047】

動物からのＤＣサブセットの単離以外に、ＤＣサブセットは、Ｆｌｔ３‐リガンド（又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンド）を利用して、マウス骨髄前駆体をｃＤＣ及びｐＤＣへ進めることによって生成することができる（Ｂｒａｓｅｌら，２０００；Ｂｒａｗａｎｄら，２００２；Ｇｉｌｌｉｅｔら，２００２；Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００２；Ｆａｎｃｋｅら，２００８）。これらの系は多数の未成熟ｃＤＣ及びｐＤＣを生成し、特にマウスｐＤＣを定義するのに役立っている。

【0048】

Ｆｌｔ３‐リガンド培養中のＤＣのサブセット：ｐＤＣ及びｃＤＣサブセットは、表面マーカーを用いて以下のように定義される：
ｐＤＣ：ＣＤ１１Ｃ^ｐｏｓ、ＣＤ１１ｂ^ｌｏｗ、Ｂ２２０^ｈｉｇｈ、ＣＤ４５ＲＡ^ｈｉ、ＣＤ２４^ｌｏｗ、Ｓｉｒｐ‐α^ｐｏｓ
ＣＤ８^ｎｅｇ ＤＣのｃＤＣ等価物（ｅＣＤ８^ｎｅｇ ＤＣ）：ＣＤ１１ｃ^ｐｏｓ、ＣＤ１１ｂ^ｈｉｇｈ、Ｂ２２０^ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＡ^ｎｅｇ、ＣＤ２４^ｌｏｗ、Ｓｉｒｐ‐α^ｐｏｓ
ＣＤ８＋ＤＣのｃＤＣ等価物（ｅＣＤ８＋ＤＣ）： ＣＤ１１ｃ^ｐｏｓ、ＣＤ１１ｂ^ｌｏｗ、Ｂ２２０^ｎｅｇ、ＣＤ４５ＲＡ^ｎｅｇ、ＣＤ２４^ｈｉｇｈ、Ｓｉｒｐ‐α^ｎｅｇ

【0049】

ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣはＩＦＮ‐λの主要な産生源であるという発見によって、この特徴を、異なる臓器の異なる混合細胞集団中でＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを同定するために使用することができる。
それらの混合集団中において、ＩＦＮ‐λ産生はＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在に対応し、よって、それらが産生するそれら特有のサイトカインを介してｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在を検出することができる。

【0050】

定義
本発明において、ＩＦＮ‐λは、ＩＦＮ‐λ１、ＩＦＮ‐λ２、又はＩＦＮ‐λ３であることができ、それらは、それぞれＩＬ‐２９、ＩＬ‐２８Ａ及びＩＬ‐２８Ｂとも称される。

【0051】

本発明において、「ｄｓ」という用語は、「二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ）」及び「二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ）」という用語にそれぞれ等しく使用される。同様に、「ｓｓ」という用語は、「一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄ」及び「一本鎖（ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｒａｎｄｅｄ）」という用語に等しく使用される。ｄｓ核酸は、ｄｓＲＮＡ及びｄｓＤＮＡの両方を含む。

【0052】

ポリＩＣは、１つの鎖がイノシン酸のポリマーで、もう１つの鎖がシチジル酸のポリマーである、不一致なｄｓＲＮＡである。ポリＩＣは、合成二本鎖ＲＮＡであり、よってｄｓＲＮＡの合成類似体とすることができる。ポリＩＣは免疫系の科学研究にとって普通の道具である。好ましい実施形態では、本発明によるｄｓ核酸又はその類似体はポリＩＣである。しかしながら、ＴＬＲ３を介してのみ独占的にシグナル伝達する合成ｄｓＲＮＡであるポリアデニル酸‐ポリウリジル酸（ポリＡＵ）のように、更なるｄｓ核酸類合成類似体は等しく本発明に好適である（Ｗａｎｇら，２００２）。同様に、等しく好適であるのは、カルボキシメチルセルロース及びポリＬ‐リジンと複合されたポリＩＣであるポリ（ＩＣＬＣ）（Ｌｏｎｇｈｉら，２００９）、又はリポソームと複合されたポリ（ｄＡ‐ｄＴ）^＊ポリ（ｄＡ：ｄＴ）の合成ｄｓＤＮＡであるポリ（ｄＡ：ｄＴ）（Ｉｓｈｉｉら，２００６）である。Ｗａｎｇら（２００２）、Ｌｏｎｇｈｉら（２００９）及びＩｓｈｉｉら（２００６）に記載されている更なるｄｓ核酸類の合成類似体は、本発明に等しく好適なｄｓ核酸類合成類似体として、参照により本明細書に組み込まれる。また好適なのは、トランスフェクションする試薬と組み合わせて提供されうる、人工ｄｓオリゴヌクレオチド（センス及びアンチセンス）である。

【0053】

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な希釈剤又は担体」という表現は、薬剤の活性化合物と共投与することができ、活性化合物がその示された機能を果たすことができる物質を含むことを意図している。そのような担体の例としては、溶液、溶媒、分散媒質、遅延薬剤、エマルションなどが挙げられる。そのような薬学的活性成分物質のための媒質の使用は、当分野で周知である。本発明に使用に好適なその他の従来の担体は、本発明の範囲に包含される。

【0054】

本発明においては、「有効量」という用語は、所望の効果、特に医学及び／又は生物学的な効果を実現するのに必要又は十分である量を意味する。

【0055】

本発明において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐ラムダの産生を刺激又は誘導するｄｓ核酸又はその類似体は、好ましくは、その類似体を含むｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡである。好適なｄｓＤＮＡは、例えばミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ又は胸腺ＤＮＡなどの、原核生物又は真核生物又はウイルス起源でありうるゲノムＤＮＡなどの天然のｄｓＤＮＡを含みうる。ＤＮＡの取り込みを容易にするために、リポソーム、エレクトロポーレーション、ナノ粒子などの強化された取り込みのための方法が用いられうる。

【0056】

１つの実施形態では、本発明によるｄｓ核酸又はその類似体は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス又はｓｓＲＮＡウイルスによって提供される。
その類似体を含む本発明によるｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、又はプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスによって提供することができる。よって、１つの実施形態では、本発明によるｄｓ核酸の類似体は、ｄｓ核酸にプロセスされる又はプロセスされることができるｓｓ核酸である。ｄｓ核酸の更なる類似体は、ポリＩＣ、ポリＡＵ、ポリＩＣＬＣ、ポリｄＡｄＴである。これらの類似体は、本発明の組成物、使用、及び方法において適用されることを想定されている。

【0057】

さまざまな実施形態において、ウイルスは、トガウイルス、フラビウイルス、アストロウイルス、ピコルナウイルス、カリチウイルス、ヘペウイルス、ノダウイルス、アルテリウイルス、又はコロナウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスである。さまざまな実施形態において、ウイルスはレオウイルス又はビルナウイルスなどのｄｓＲＮＡウイルスである。さまざまな実施形態において、ウイルスはＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、又はＳＩＶなどのレトロウイルスである。さまざまな実施形態において、ウイルスは、アスファウイルス、イリドウイルス、ポリオーマウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、又はヘパドナウイルスなどのｄｓＤＮＡウイルスである。好ましい実施形態では、ウイルスはオルソポックスウイルス又はパラポックスウイルスなどのポックスウイルスである。好ましくは、ポックスウイルスは痘瘡ウイルス、牛痘ウイルス、ラクダ痘ウイルス又はワクシニアウイルスである。特に好ましいのはＭＶＡウイルスである。さまざまな実施形態において、ウイルスは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１又はＨＳＶ２）、水痘帯状疱疹ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン‐バールウイルス、及びカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのヘルペスウイルスである。

【0058】

さまざまな実施形態において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐λの産生を刺激するｄｓ核酸又はその類似体は、ｄｓＤＮＡウイルス又はｓｓＲＮＡウイルスによって産生される。好ましい実施形態では、ウイルスはポックスウイルス、ヘルペスウイルス、トガウイルス、又はコロナウイルスである。

【0059】

さまざまな実施形態において、本発明によるｄｓ核酸又はその類似体は、ＤＣ上のトル様受容体（ＴＬＲ）３を介して認識される。

【0060】

本発明によるＤＣの単離及び特徴付け
本明細書において使用する場合、「ｃＤＣ」と略されることもある「従来型樹状細胞」又は「ＣＤ８＋従来型樹状細胞」という用語は、表面マーカー（分子）の発現などの本明細書において記載されている特徴によって特徴付けられるマウスＣＤ８＋従来型樹状細胞を包含する（表１を参照のこと）。

【0061】

ＣＤ８は、ヒトｃＤＣ上には発現されないが、それでもなお、前記用語はヒト従来型樹状細胞（ヒトｃＤＣ）も包含する。ヒトｃＤＣは、本明細書において「マウスＣＤ８＋ＤＣの等価物」又は「ｅＣＤ８＋従来型樹状細胞」として特徴付けられることがあり、「ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ」と略されることもある。ヒトｃＤＣは、本明細書において記載されている特徴によって特徴付けられ（例えば表１を参照のこと）、特に、ＢＤＣＡ３抗体によって認識されることによって特徴付けられることができる。特に、ＢＤＣＡ１〜４を指定する抗体のセットが開発されてきており、ｐＤＣ及びｃＤＣサブセットを識別する（Ｄｚｉｏｎｅｋら，２０００）。ＢＤＣＡ３抗体の認識に基づいて、ＢＤＣＡ３陽性のｃＤＣはマウスＣＤ８＋ ｃＤＣに対するヒト等価物として提案されている。マウスＣＤ８＋ＤＣに共通して、ＢＤＣＡ３陽性のｃＤＣは、高いレベルのＣｌｅｃ９ａ及びＮｅｃｌ２、少量のＣＤ１１ｂを選択的に発現する（Ｓｈｏｒｔｍａｎら，２００９）。したがって、以下に詳細に記載されるように、ヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣもＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２の発現によって特徴付けられることができる。

【0062】

上記のように、本発明によるｅＣＤ８＋樹状細胞は従来型ＤＣのサブセットを表し、それに応じて本発明によるｅＣＤ８＋樹状細胞をｅＣＤ８＋ ｃＤＣと命名する。

【0063】

樹状細胞（ＤＣ）は、２つの主要な集団、すなわち（１）非リンパ系組織の遊走及びリンパ組織に存在するＤＣ及び（２）形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）に分けることができる細胞の異種集団である。「古典的」又は「従来型」ＤＣ（ｃＤＣ）という用語は、リンパ器官に存在するＤＣをｐＤＣに対置するために近年使用されるようになってきた。他方で、非リンパ系器官ＤＣは主として組織ＤＣと呼ばれている。非リンパ系組織ＤＣもｐＤＣと異なり、初期の非リンパ系組織ＤＣは遊走してリンパ節に見いだすことができ、ｃＤＣはそうではないが、ｃＤＣという用語は、リンパ系組織又は非リンパ系組織に存在しようとしまいが全ての非ｐＤＣを指す。

【0064】

本発明の文脈において、ＣＤ８＋樹状細胞は、その成長が、ＧＭ‐ＣＳＦに依存しない、従来型、非形質細胞様樹状細胞として定義される。１つの実施形態では、本発明による樹状細胞は、実施例２のように単離される。１つの実施形態では、樹状細胞は実施例５のように単離される。

【0065】

本発明においては、前駆体細胞はインビトロ及び生体内においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣ形成を強化する薬剤と培養されることができる。好ましい実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣ形成を強化する薬剤は、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである。Ｆｌｔ３‐リガンドの添加は、ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの数を３０倍以上増加することができる。ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを増加するためのＦｌｔ３‐リガンドの投与は、ＩＦＮ‐ラムダの産生を増加するためのｄｓ核酸又はその類似体を使ったＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの刺激と組み合わせることができる。

【0066】

更に、本発明によれば、前駆体細胞は、サイトカインと培養されることができる。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、及びＩＦＮ‐γからなるグループから選択される。

【0067】

１つの実施形態では、本発明による樹状細胞はＣＤ８に対する抗体を使用して単離される。１つの実施形態では、樹状細胞はＢＤＣＡ３に対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、本発明による樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２に対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５に対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃに対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ２４に対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ２４及び／又はＣＤ１１ｂに対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ２４及び／又はＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１７２ａに対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ２４及び／又はＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１７２ａ及び／又はＭＨＣ‐ＩＩに対する抗体を使用して単離される。さまざまな実施形態において、樹状細胞はＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２及び／又はＣＤ２０５及び／又はＣＤ１１ｃ及び／又はＣＤ２４及び／又はＣＤ１１ｂ及び／又はＣＤ１７２ａ及び／又はＭＨＣ‐ＩＩ及び／又はＣＤ１０３に対する抗体を使用して単離される。

【0068】

本発明によるｃＤＣの単離は、陰性又は低発現表面抗原と合わせて陽性発現表面抗原に基づくことができる。ｅＣＤ８＋細胞に高発現する表面マーカーは、Ｃｌｅｃ９Ａ、Ｎｅｃｌ２、ＣＤ８、ＣＤ１０３、ＣＤ２４、ＣＤ２０５、ＣＤ３６、ＣＤ９７、ＣＤ１６２、ＭＨＣ‐Ｉ、ＭＨＣ‐ＩＩ、ＣＤ１１ｃ、及びＢＤＣＡ３（＝ＣＤ１４１）であり、一方で、その他の免疫細胞から同様にＤＣサブセットを識別するために使用されることができる陰性又は低発現表面抗原は、ＢＤＣＡ１（＝ＣＤ１ｃ）、ＢＤＣＡ２、ＢＤＣＡ４、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１７２ａ、ＰＤＣＡ１、ＢＳＴ２、及びＦ４／８０抗原である。

【0069】

ＣＤ８＋ ｃＤＣは、明らかに機能的に異なったＤＣサブセットである。しかしながら、これら機能的属性は、必ずしもＣＤ８の発現に対応しているとは限らないことがある。よって、ＣＤ８分子とは別に、その他の表面マーカーの組み合わせは、ＣＤ８＋ ｃＤＣ又はＣＤ８発現を欠きうるそれらの機能的な等価物（ｅＣＤ８＋）を特徴付けるのに使用されることができる。ＣＤ１１ｃ＋ ＭＨＣクラスＩＩ ｈｉｇｈの細胞の中で、陰性又は低発現のＣＤ１１ｂ及びＣＤ１７２ａを伴う、高発現のＣＤ２０５、ＣＤ１０３、Ｎｅｃｌ２、Ｃｌｅｃ９ａ、ＣＤ２４のさまざまな組合せが、本明細書において前述のように使用されることができる。よって、さまざまな実施形態において、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋樹状細胞は、上記のように陰性又は低発現表面抗原と合わせて、陽性発現表面抗原によって特徴付けられる。更に、さまざまな実施形態において、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋樹状細胞は、上記のように高発現表面マーカーによって特徴付けられる。好ましい実施形態では、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋樹状細胞は高発現のＣｌｅｃ９Ａを有する。別の好ましい実施形態では、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋樹状細胞は高発現のＮｅｃｌ２を有する。更により好ましい実施形態では、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋従来型樹状細胞は高発現のＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２を有する。

【0070】

本発明によるさまざまな実施形態では、本発明によるＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣはヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞である。

【0071】

本発明によるさまざまな実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣは高発現のＣｌｅｃ９Ａ及び／又はＮｅｃｌ２を有する。高発現のＣｌｅｃ９ａ及びＮｅｃｌ２は、共に参照により本明細書に組み込まれるＨｏｃｈｒｅｉｎら（２００８）及びＳｈｏｒｔｍａｎら（２００９）に記載の通り検出されることができる。

【0072】

治療への適用
第１の態様では、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）におけるＩＦＮ‐λ産生の誘導に使用する二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を含む組成物であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現する組成物を提供する。

【0073】

第２の態様では、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）におけるＩＦＮ‐λ産生を誘導する医薬組成物の調製のための二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体の使用であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現する使用を提供する。

【0074】

第３の態様では、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）におけるＩＦＮ‐λ産生を、それを必要としている対象において誘導する方法であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、前記対象に二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与する工程を含む方法を提供する。

【0075】

ＩＦＮ‐λは、抗ウイルス、抗腫瘍及びさまざまな免疫調節機能を有する（Ｌｉら，２００９）。従って、本発明によるＩＦＮ‐λを産生するｃＤＣは、潜在的な抗ウイルス、抗腫瘍及び／又は免疫調節機能を有する。これらの機能のいずれも、ＩＮＦ‐λ依存性の疾患、即ち、ＩＮＦ‐λを使った治療が、そのような疾患を患う対象に有益である疾患の予防及び／又は治療に使用されることができる。ＩＦＮ‐λ依存性の疾患は、感染症又は癌であることができる。

【0076】

幾つかの実施形態では、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患は、血液、脾臓、肺、扁桃腺、リンパ節、結腸又は肝臓の疾患である。本明細書において記載されているように、ｃＤＣは、特に血液、脾臓、扁桃腺、リンパ節及び／又は肝臓に存在する。従って、これらの場所において、ｃＤＣが感染症の病原体と戦うために抗ウイルス及び／又は免疫調節活性を発揮するようにＩＦＮ‐λの産生源を有することは、非常に有益であると考えられる。感染症はウイルス感染症でありうる。ウイルス感染症は、そのゲノムか複製中間体かのいずれかとしてｄｓＲＮＡ又はｄｓＤＮＡを含むウイルスによって引き起こされうる。

【0077】

幾つかの好ましい実施形態では、ウイルス感染症は、本明細書において記載されているものであり、より好ましくは、持続性のウイルス感染症、更により好ましくは、肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症、特に好ましくは、肝炎ウイルス感染症である。上記のように、ｃＤＣは肝臓に存在し、よって、ＩＦＮ‐λの産生を感染症が進行する場所に直接誘導することは好都合である。

【0078】

同様に、ＩＦＮ‐λは、免疫調節活性を発揮すると仮定され、それによって肝癌細胞などの癌細胞を認識及び攻撃／消滅する免疫細胞を活性化する。

【0079】

前述したことを考慮すると、本発明は、感染症、好ましくはウイルス感染症又は癌の予防及び／又は治療のための方法を提供し、その方法は、それを必要としている対象にＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体を含む組成物を投与することを含む。言い換えれば、本発明は、感染症、好ましくはウイルス感染症又は癌の予防及び／又は治療のための薬剤の製造における、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体を含む組成物の使用を提供する。

【0080】

また、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体、並びにｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を含む配合剤を提供する。

【0081】

幾つかの好ましい実施形態では、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体は、対象からのＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）に生体外において投与される。前記ｄＤＣは単離される、即ち対象から採取されるのが好ましい。前記対象は、好ましくはＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防又は治療を必要としている。前記ＤＣは対象から当該技術分野において一般公知の手段及び方法によって採取される。「生体外で（ｅｘ ｖｉｖｏ）」という用語は、「インビトロで（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」という用語と互換性があり、人体から離れて制御された環境において行われる行動を意味する。本明細書及び当該技術分野において使用する場合、この用語は多くの場合「培養で（ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）」という用語と交換可能に使用される。

【0082】

本発明により提供される組成物及び配合剤は、組成物又は配合剤に含まれるｄｓ核酸又はその類似体がＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的としているという点で特徴付けられる。
ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするために、それらの細胞におけるＩＦＮ‐λ産生のための刺激、即ちｄｓ核酸類又はその類似体は、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣの１つ以上の表面マーカー結合分子とともに担体と連結又は組み込まれうる。ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣに対する表面マーカー結合分子は、例えばＣＤ１ｄ、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１０３、ＣＤ１３５、ＣＤ１４１、ＣＤ１６２、ＣＤ２０５、ＣＤ２０７、Ｎｅｃｌ２、Ｃｌｅｃ９ａ、ＸＣＲ１、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２、及び／又はＴＬＲ１３に対する抗体でありうる。よって、好ましい実施形態では、本発明により提供された組成物及び配合剤は、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣの１つ以上の表面マーカー結合分子とともに担体に連結された又は組み込まれたｄｓ核酸又はその類似体を含む。

【0083】

他の可能性としては、ＣＤ８＋ ｃＤＣ又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣによって発現された表面マーカーに対する天然又は人工リガンド、例えば糖脂質（ＣＤ１ｄに対して）、ＭＨＣ‐Ｉ（ＣＤ８に対して）、フィブロネクチン（ＣＤ１１ｃに対して）、ラミニン（ＣＤ４９ｆに対して）、ＣＤ６２Ｐ（ＣＤ２４に対して）、酸化された低比重リポタンパク質（ＣＤ３６に対して）、ＣＤ４０‐リガンド（ＣＤ４０に対して）、Ｅカドヘリン（ＣＤ１０３）、Ｆｌｔ３‐リガンド（ＣＤ１３５に対して）、トロンビン（ＣＤ１４１に対して）、Ｐセレクチン（ＣＤ１６２に対して）、マンノース、Ｎ‐アセチルグルコサミン又はフコース含有分子（ＤＥＣ２０７に対して）、クラスＩ拘束性Ｔ細胞関連分子（ＣＲＴＡＭ）（Ｎｅｃｌ２に対して）、死細胞（Ｃｌｅｃ９ａに対して）、ＸＣＲ１‐リガンド（ＸＣＲ１に対して）、ＴＬＲ１０‐リガンド（ＴＬＲ１０に対して）、トキソプラズマ抗原又はプロフィリン（ＴＬＲ１１に対して）、ＴＬＲ１２‐リガンド（ＴＬＲ１２に対して）、及び／若しくはＴＬＲ１３リガンド（ＴＬＲ１３に対して）が挙げられる。よって、更に好ましい実施形態では、本発明により提供された組成物及び配合剤は、ＣＤ８＋ ｃＤＣ又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣによって発現された表面マーカーに対するそのような天然又は人工リガンドとともに担体に連結された又は組み込まれたｄｓ核酸又はその類似体を含む。

【0084】

上記のＣＤ８＋ ｃＤＣに選択的な結合分子は、例えば共有結合、アダプター分子結合複合体（例えばビオチン‐アビジン複合体）、ミクロスフェア、ナノ粒子、ウイルス様粒子及び／又はリポソームへの結合によって、直接的又は間接的に刺激（ｄｓ核酸類又はその類似体）につながれうる。

【0085】

本明細書において使用する場合、「ＣＤ８＋細胞及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を標的とする（又はそのいかなる文法上の形態）」ｄｓ核酸又はその類似体は、ｄｓ核酸類が特定のＴＬＲを介して認識されることも含む。特に、ｄｓＲＮＡはＴＬＲ‐３を介して認識され、ｄｓＤＮＡはＴＬＲ‐９を介して認識され、及びｓｓＲＮＡはＴＬＲ‐７を介して認識される。換言すれば、「標的とする」は、好ましくは、ｃＤＣによるｄｓＲＮＡの認識がＴＬＲ‐３により媒介されることを含む。

【0086】

従って、ヒトｃＤＣの場合、ｄｓ核酸の認識、特にｄｓＲＮＡはＴＬＲ‐３により媒介され、即ち、ｄｓ核酸、特にｄｓＲＮＡはＴＬＲ‐３を介してｃＤＣに標的される。

【0087】

とりわけ、ヒト及びマウスｃＤＣはＴＬＲ‐７を発現せず、ヒトｃＤＣはＴＬＲ‐９も発現しない。それでもなお、実施例１１に示すようにｄｓＤＮＡはヒトｃＤＣによって認識される。従って、ｄｓＤＮＡは、ＴＬＲから独立して、即ちＭｙＤ８８に依存的なＴＬＲ、特に本明細書において記載されているＴＬＲ‐７及び／又はＴＬＲ‐９から独立して、ヒトｃＤＣに標的されることができる。

【0088】

ｄｓ核酸類はまた、Ｃｌｅｃ９ａ及び今まで未知の取り込み受容体を介してＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣによって選択的に認識される死細胞とともに適用されうる。インビトロにおけるウイルス感染の後、死細胞及び死にかかっている細胞は、選択的なＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣ刺激とともに、死の前の細胞によって生成されるｄｓ核酸類の別の標的となる適用であろう。よって、インビトロにおける細胞のウイルス感染は、感染しているウイルスにより提供されるｄｓ核酸が詰まっている死細胞又は死にかかっている細胞を提供する。そのような死細胞又は死にかかっている細胞は、選択的にＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣに捕えられ、感染しているウイルスにより提供されるｄｓ核酸での刺激によって前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおけるＩＦＮ‐λ産生を引き出す。インビトロにおけるウイルス感染に使用される細胞は、そのような細胞がウイルスのｄｓ核酸が詰まっている死細胞又は死にかかっている細胞が投与される対象にとって免疫原性ではない限り、いかなる細胞でもありうる。

【0089】

好ましい実施形態では、本発明による配合剤は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体及びｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を含み、前記強化薬剤は、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである。本願の発明者らは、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣはｄｓ核酸類及びその他の刺激の組み合わせにより強化された量のＩＦＮ‐λを産生し、後者の刺激（例えば、特定のＴＬＲリガンド（図２Ａを参照のこと）又はＣＤ４０リガンド）自体はＩＦＮ‐λ産生を誘導しないことを見いだしたので、ｄｓ核酸はＩＦＮ‐λ産生をする強化刺激とともに適用されうる。よって、例えばＣＤ４０リガンド及びｄｓ核酸の連携は、それぞれＣＤ８＋ ｃＤＣ及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とすること、並びにＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣ由来のＩＦＮ‐λの産生を強化することの両方を達成する。したがって、好ましい実施形態では、それを必要としている対象にＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体を含む組成物投与することを含む感染症又は癌の予防及び／又は治療のための上記の方法は、ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤の投与を更に含む。より好ましくは、前記強化薬剤は、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４又はＩＦＮ‐γである。

【0090】

別の好ましい実施形態では、組成物又は本発明の方法及び使用に適用される組成物は、ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を更に含む。
好ましくは、ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤は、ＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、そのＴＬＲ‐リガンドは、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、そのＴＮＦファミリーの成員は、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド又はサイトカインであって、そのサイトカインは、好ましくは、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである薬剤である。

【0091】

好ましい実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）によるｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する前記薬剤は、生体外においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣに投与される。投与前に、前記ｃＤＣは対象から単離される。

【0092】

別の好ましい実施形態では、組成物又は本発明の方法及び使用に適用される組成物は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を更に含む。好ましくは、前記薬剤はＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである。言い換えれば、好ましい実施形態では、本発明は感染症又は癌を患う対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加するのに使用するためのＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドを提供する。

【0093】

好ましい実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する前記薬剤は、生体外においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣに投与される。投与前に、前記ｃＤＣは対象から単離される。

【0094】

例えば、本発明は、感染症又は癌を患う対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加する方法又は使用を提供し、それは、それを必要としている対象にＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞のレベルを増加する薬剤投与することを含む。好ましくは、前記薬剤はＦｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドである。

【0095】

Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドは、対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加するのに十分である投与量にて対象に適用されるべきである。好ましい実施形態では、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンドは、Ｍ‐ＣＳＦ又はＩＬ‐３４である。感染症又は癌を患う対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加する方法のさまざまな実施形態では、ｄｓ核酸又はその類似体は、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドに付加して、対象に投与されることができる。ｄｓ核酸又はその類似体の前記付加的投与は、感染症又は癌を患う対象においてＩＦＮ‐λの産生を刺激する。

【0096】

ｃＤＣは、対象に豊富に存在しないので、対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベル増加することは有益だろうということを前提に、本発明は、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と組み合わせてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を含む、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防及び／又は治療の方法に用いる組成物であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、その方法は、
（ａ）対象に、前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を投与すること；及び
（ｂ）対象に二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与して、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞においてＩＦＮ‐λ産生を誘導することを含む組成物に関する。

【0097】

工程（ａ）及び（ｂ）はそれぞれに引き続き実施されることが想定されている。しかしながら、両工程の実施に間隔があってもよい。例えば、ＩＦＮ‐λ産生のためにｃＤＣが、ｄｓ核酸又はその類似体に接触させられる前に、ｃＤＣの数が増加するのを待ってもよい。

【0098】

好ましくは、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベル（即ち、数）を増加する薬剤は、対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞のレベルを増加するのに十分である量で投与される。増加は、前記薬剤が投与されない対象と比較して、ｃＤＣの数により測定される。

【0099】

同様に、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐λ産生を誘導するのに十分である量で投与することが好ましい。

【0100】

上記のように、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベル（即ち、数）を増加する前記薬剤は、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンド又はその両方である。

【0101】

同様に、本発明は、それを必要としている対象において、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患の予防及び／又は治療のための方法であって、
（ａ）対象に、前記ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞（ｃＤＣ）のレベルを増加する薬剤を投与する工程；及び
（ｂ）対象に二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体を投与して、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞においてＩＦＮ‐λ産生を誘導する工程を含む方法を提供する。

【0102】

別の方法では、工程（ａ）及び（ｂ）は生体外において実施されることができ、即ち、ｃＤＣは対象から単離され、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加する薬剤が投与され、続いて、ｄｓ核酸又はその類似体が投与され、前記ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐λ産生を誘導する。

【0103】

上記を所与として、本発明はまた、生体外においてｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させることを含む、ｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐λの産生を誘導する方法を提供する。前述のように、前記ｃＤＣは、ｄｓ核酸又は類似体と接触させる前に、ｃＤＣのレベル（数）を増加する薬剤と接触されることが好ましい。特に、生体外におけるＦＮ‐λの前記産生を誘導するために、ｃＤＣが対象から採取される。本発明によるｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐λの産生を誘導する方法では、ｃＤＣが採取される対象は、好ましくは、誘導されたｃＤＣを使って大量のＩＦＮ‐λを産生する治療を必要としている対象である。よって、対象は、ＩＮＦ‐λ依存性の疾患、好ましくは感染症、好ましくはウイルス感染症又は癌の予防及び／又は治療を必要としている対象でありうる。より好ましくは、ｃＤＣは、好ましくは持続性のウイルス感染症、より好ましくは肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症、更により好ましくは肝炎ウイルス感染症を患う対象から採取されうる。ｃＤＣ及び／若しくはｄｓ核酸又はその類似体のレベル（数）を増加する薬剤との生体外における培養に続いて、ｃＤＣは採集され、治療のため、即ち細胞が採取された対象に再導入されるための適切な媒質に再懸濁される。よって、本発明によるｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐λの産生を誘導する方法では、ｃＤＣは自己ｃＤＣであることが好ましい。それを必要としている対象への再導入は、例えば静注のような多くの一般に公知の方法により実施されうる。更に、ＩＦＮ‐ラムダの産生に誘導されるｃＤＣの集団は、多様な医薬製剤の状態で再導入されうる。

【0104】

述べたように、ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させることによってＩＦＮ‐ラムダを産生するために誘導されるｃＤＣの集団を、それを必要としている対象に投与することができる。したがって、本発明は、ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させること、及び感染症又は癌を患う対象に導入することを含む、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患、好ましくは感染症又は癌に対する反応を生体内において誘導する方法を提供する。好ましくは、前記ｃＤＣは、ｃＤＣの数を増加する薬剤と先に接触させられる。言い換えれば、本発明は、前記対象にｃＤＣの集団におけるＩＦＮ‐λの産生を誘導する生体外における方法によって生成されるＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣを投与することを含む、ＩＦＮ‐λ依存性の疾患、好ましくは感染症又は癌の予防及び／又は治療の方法を提供し、前記方法は、ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させること含む。好ましくは、前記ｃＤＣは、ｃＤＣの数を増加する薬剤と先に接触させられる。

【0105】

１つの実施形態では、本発明は、（ａ）感染症又は癌を患う対象を提供すること；（ｂ）前記対象からｃＤＣを採取すること；（ｃ）生体外において前記ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させ、ＩＦＮ‐λを産生するｃＤＣの集団を生成すること；及び（ｄ）感染症又は癌に対する治療反応を生体内において誘導するように、前記ＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団を前記対象に再導入することを含む、感染症又は癌の予防及び／又は治療のための方法を提供する。

【0106】

好ましくは、工程（ｃ）に、工程（ｂ’）、すなわち前記ｃＤＣをｃＤＣの数を増加する薬剤と接触させることが先行する。

【0107】

好ましくは、ｃＤＣの集団は、対象に再導入する前に洗浄される。別の好ましい実施形態では、ＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団はそれを必要としている対象への投与に適した媒質に再懸濁される。ＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団は、例えば静注のような多くの周知の方法によって対象に再導入されうる。

【0108】

上記のように、ｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐ラムダの産生を誘導するためにｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体内又は生体外において接触させることに関係する及び／又は含む、本発明による全ての実施形態では、好ましくは、ｃＤＣのレベル（数）を増加する薬剤で前処理されるｃＤＣは、生体外又は生体内においてｄｓ核酸又はその類似体と接触させられ、前記薬剤は、好ましくはＦｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドであることが一般に好ましい。例えば、これは、Ｆｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドが、採取されたｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させることによってＩＦＮ‐ラムダの産生を誘導するために、前記対象からｃＤＣを採取する前に、対象に投与されることを意味する。あるいは、Ｆｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドは、対象から採取されたｃＤＣに投与される。

【0109】

例えば、このＦｌｔ３‐リガンド及び／又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドでの前処理は、前記前処理されたｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させるために、そのような前処理されたｃＤＣを前記対象から採取する前に前記対象においてｃＣＤの形成／レベルを増加させることを提供する。

【0110】

ｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐λの産生を誘導するために、ｃＤＣを、ｃＤＣの数を増加する薬剤及び／若しくはｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させるために対象からｃＤＣを採取することにおいて、対象からｃＤＣを採取／単離する方法は当業者に周知である。本発明において、「対象からｃＤＣを採取する」及び「対象からｃＤＣを単離する」という用語は、同じ意味を有する。

【0111】

ｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐λの産生を誘導するために、ｃＤＣを、ｃＤＣの数を増加する薬剤及び／若しくはｄｓ核酸又はその類似体と生体外において接触させることに関係する及び／又は含む、本発明によるさまざまな実施形態では、対象から採取／単離されたｃＤＣは、ＴＬＲ２‐、ＴＬＲ４‐、ＴＬＲ９‐、ＴＬＲ１０‐、ＴＬＲ１１‐又はＣＤ４０‐リガンドと更に培養されることができる。この培養はＩＦＮ‐λの発現を増加する。さまざまな実施形態において、リガンドはＰａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ‐ＯＤＮ、プロフィリン又はＣＤ４０‐リガンドである。さまざまな実施形態において、対象から採取／単離されたｃＤＣは、サイトカインと更に培養されることができ、そのサイトカインは、好ましくはＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）である。

【0112】

本発明による治療への適用では、感染症は好ましくはウイルス感染症である。より好ましくは、本発明による治療への応用では、ウイルス感染症は持続性のウイルス感染症である。更により好ましくは、持続性のウイルス感染症は、肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症である。特に好ましい実施形態では、前記肝臓のウイルス感染症は肝炎ウイルス感染症である。したがって、感染症又は癌の予防及び／又は治療する方法、並びに感染症又は癌を患う対象においてＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣのレベルを増加する方法では、好ましくは、ウイルス感染症は、持続性のウイルス感染症であり、より好ましくは、肝臓のウイルス感染症又はヘルペスウイルス感染症であり、更により好ましくは、肝炎ウイルス感染症である。本発明において、肝炎ウイルス感染症は、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、Ｄ型肝炎ウイルス感染症及びＥ型肝炎ウイルス感染症を含み、好ましくは、その肝炎ウイルス感染症はＣ型肝炎ウイルス感染症である。別の好ましい実施形態では、本発明における持続性のウイルス感染症はレトロウイルス感染症である。

【0113】

本発明による対象は、動物及びヒトを含む。本発明においては、「対象」は、ヒト、又はイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、サル、ラット、及びマウスなどの脊椎動物を意味するものとする。本発明によるさまざまな実施形態では、対象は、好ましくはヒトであり、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣはヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣである。

【0114】

本発明のさまざまな好ましい実施形態では、癌を患う対象は、腫瘍疾患を患う対象である。好ましくは、腫瘍疾患は、上皮性悪性腫瘍、即ち対象における上皮細胞又は上皮組織の癌又は腫瘍である。好ましくは、上皮性悪性腫瘍は扁平上皮癌又は腺癌である。より好ましくは、上皮性悪性腫瘍は肺扁平上皮癌である。

【0115】

上記組成物、使用及び方法並びに治療への応用では、ｄｓ核酸は単独又は１つ以上のその他の抗癌又は抗腫瘍治療的な使用及び方法と組み合わせて使用されることができ、そのような治療的な使用及び方法は、好ましくは抗腫瘍化学療法及び免疫治療から選択される。よって、本発明によるＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とする、即ちＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐λ産生を刺激又は誘導することができるｄｓ核酸又はその類似体は、化学療法又は免疫治療の投与の前、同時又は後に投与されることができ、次の化学療法又は免疫治療に対する悪性細胞の応答を増加する。

【0116】

また、本発明により提供されるのは、前記対象にＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体を投与することを含む、対象におけるＩＦＮ‐ラムダの産生のための方法である。

【0117】

また、本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを標的とするｄｓ核酸又はその類似体、並びにｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤を含む配合剤を提供する。好ましい実施形態では、ｄｓ核酸に基づいたＩＦＮ‐λ産生を強化する薬剤は、Ｆｌｔ３‐リガンド、Ｍ‐ＣＳＦ受容体リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４又はＩＦＮ‐γである。

【0118】

好ましい実施形態では、治療への応用に使用されるｄｓ核酸又はその類似体はｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡである。より好ましくは、本発明によるｄｓ核酸又はその類似体は、ｄｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡウイルス、又はプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスによって提供される。
よって、１つの実施形態では、ｄｓ核酸の類似体は、ｄｓ核酸にプロセスされる又はプロセスされることができるｓｓ核酸である。

【0119】

ＩＦＮ‐λを産生する、並びに／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取する方法
本発明は、ＩＦＮ‐λを産生する、並びに／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取する方法であって、（ａ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団を提供する工程；（ｂ）ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させる工程を含む方法を提供する。ｃＤＣをｄｓ核酸又はその類似体と接触させることは、ＩＦＮ‐ラムダの産生を刺激する。さまざまな好ましい実施形態では、前記細胞の集団は、ＩＦＮ‐λ産生のエンハンサーと培養される。より好ましくは、前記エンハンサーは、ＴＬＲ‐リガンド又はＴＮＦファミリーの成員である。更により好ましくは、ＴＬＲ‐リガンドは、ＴＬＲ２‐、ＴＬＲ４‐、ＴＬＲ９‐、ＴＬＲ１０‐又はＴＬＲ１１‐リガンドであり、ＴＮＦファミリーの成員はＣＤ４０リガンド又はサイトカインである。なお一層好ましくは、サイトカインはＩＦＮ‐γである。例えばポリＩＣなどのｄｓ核酸又はその類似体と例えばＣｐＧ‐１６６８などの免疫刺激性ＣｐＧ ＤＮＡの組み合わせは、相乗的にＣＤ８＋ ｃＤＣよる更に大量のＩＦＮ‐λを誘導する。

【0120】

上記のＩＦＮ‐λを産生する方法、並びに／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取する方法のさまざまな実施形態では、細胞の集団は、サイトカインと更に培養される。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、及びＩＦＮ‐γからなるグループから選択される。

【0121】

更に別の実施形態では、本発明は、ＩＦＮ‐λを産生する、及び／若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の集団を生成又は採取するインビトロの方法であって、前記ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＣｌｅｃ９ａ及び／又はＮｅｃｌ２を発現し、
（ａ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；（ｂ）前記従来型樹状細胞を、前記従来型樹状細胞のレベルを増加する薬剤、好ましくは、Ｆｌｔ３‐リガンド又はＭ‐ＣＳＦ受容体リガンドと接触させる工程；及び
（ｃ）前記従来型樹状細胞を、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と接触させる工程を含むインビトロの方法を提供する。

【0122】

前記接触は、例えば、前記従来型樹状細胞のレベルを増加する薬剤、及び／又は二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体で被覆された袋（ｂａｇ）に、前記ｃＤＣを採集するによって達成されうる。あるいは、前記接触は、前記ｃＤＣを培養することによって実施されうる。

【0123】

好ましくは、細胞の集団は、ＩＦＮ‐λ産生のエンハンサーと更に培養される。前記エンハンサーは、好ましくはＴＬＲ‐リガンド若しくはＴＮＦファミリーの成員であって、そのＴＬＲ‐リガンドは、好ましくは、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、又はＴＬＲ１１リガンドであって、そのＴＮＦファミリーの成員は、好ましくは、ＣＤ４０‐リガンド、又はサイトカインであって、そのサイトカインは、好ましくは、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、又はＩＦＮ‐γである。

【0124】

さまざまな好ましい実施形態では、上記の方法は、ｄｓ核酸により刺激されたｃＤＣによって産生されたＩＦＮ‐λを同定及び／又検出する工程を更に含む。さまざまな好ましい実施形態では、上記の方法は、ｄｓ核酸によって刺激されたｃＤＣにより産生されたＩＦＮ‐λを単離及び／又分離する工程を更に含む。その他の好ましい実施形態では、上記の方法は、ＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを同定及び／又は単離及び／又は分離する工程を更に含む。

【0125】

ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣによって産生されたＩＦＮ‐λは、実施例中のものなどの当該技術分野において周知の技術によって検出及び定量化されることができる。本発明においてｃＤＣによって産生されたＩＦＮ‐λは、従来の生化学的技術によって収集、単離、及び精製されることもできる。

【0126】

よって、本発明は、本発明によるｃＤＣの集団においてＩＦＮ‐ラムダの産生を誘導する方法によって入手可能なＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団、及び前記ＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団を含む医薬組成物を提供する。前記ｃＤＣは、好ましくはヒトｃＤＣである。

【0127】

好ましくは、前記ＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣの集団は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超えるＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含有する。さまざまな好ましい実施形態では、ｃＤＣは、好ましくはヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣである。１つの実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、５０％を超えるｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む。別の実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、７５％を超えるｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む。更に好ましい実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、８５％を超えるｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む。

【0128】

１つの実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、５０％を超えるヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣを含む。別の実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、７５％を超えるヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣを含む。更に好ましい実施形態では、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを含む細胞の集団は、８５％を超えるヒトＢＤＣＡ３＋ ｃＤＣを含む。

【0129】

上記のように、本発明は、上記のＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取する方法によって入手可能な、ＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団若しくはＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの細胞系を提供する。更に、本発明は、上記のＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋又ｈｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を生成又は採取する方法によって入手可能な、ＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの集団を含む医薬組成物を提供する。さまざまな好ましい実施形態では、前記医薬組成物は、随意に薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を更に含む。

【0130】

ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣを検出又はスクリーニングする方法
例えばポリＩＣなどのｄｓ核酸又はその類似体に応答するＩＦＮ‐λ産生は、異なる細胞の複雑な混合物中であっても、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣの量が非常に少ない場合であっても、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在を検出、診断、スクリーニングするために使用することができる（図３Ａを参照のこと）。ＩＦＮ‐λは、細胞のＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋サブセットを見つけるためのマーカーとして使用することができ、よって、例えばＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの量を増加することが望ましい場合などの特定の状況において標的とすることができる。

【0131】

本発明は、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在を検出又はスクリーニングする方法を包含する。特に、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを検出する又はスクリーニングするインビトロの方法であって、
（ａ）細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）細胞を、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣにおいてＩＦＮ‐ラムダの産生を刺激又は誘導できるｄｓ核酸又はその類似体と接触させる工程；
（ｃ）ＩＦＮ‐λの産生を検出する工程；及び
（ｄ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在とＩＦＮ‐λの産生を関連づける工程を含むインビトロの方法を提供する。さまざまな好ましい実施形態では、前記方法は、生検、好ましくは臓器又は血液の生検において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの存在を検出又はスクリーニングする方法である。よって、臓器又は血液の生検は、ｄｓ核酸又はその類似体に応答するそれらの特有のＩＦＮ‐λ産生を介して、それらの細胞の存在を検査することができる。ＩＦＮ‐λの産生は、誘導後、極めて一定であるので、例えば対象の体又は細胞培養における特有のＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの量を定量することができる。よって、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣの量が増加又は減少する状態を検出／診断及び決定することができる。

【0132】

さまざまな実施形態において、ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを検出又はスクリーニングする方法は、ＩＦＮ‐λ産生ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣを分離及び／又は単離する工程を更に含む。方法は、前記分離及び／又は単離されたＩＦＮ‐λ産生ｃＤＣからのＩＦＮ‐λ産生を測定することを更に含みうる。

【0133】

ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣによって産生されたＩＦＮ‐λは、実施例にあるものなどの当該技術分野において周知の技術によって検出及び定量化されることができる。本発明において樹状細胞によって産生されたＩＦＮ‐λは、従来の生化学的技術によって収集、単離、及び精製することもできる。

【0134】

更なる態様では、本発明は、ヒトＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞を検出又はスクリーニングするインビトロの方法であって、
（ａ）ヒト樹状細胞を含む細胞の集団を提供する工程；
（ｂ）ＢＤＣＡ３＋樹状細胞を選択する工程；
（ｃ）前記ＢＤＣＡ３＋細胞を、二本鎖（ｄｓ）核酸又はその類似体と接触させる工程；（ｄ）ＩＦＮ‐λの産生を検出する工程；及び
（ｅ）ＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在とＩＦＮ‐λの産生を関連づける工程を含むインビトロの方法に関する。

【0135】

好ましい実施形態では、工程（ｃ）に、（ｂ’）、すなわち前記ＢＤＣＡ３＋細胞を前記ＢＤＣＡ３＋細胞の数を増加する薬剤と接触させる工程が先行しうる。より多くのＩＦＮ‐λを産生することができるより多くのＢＤＣＡ３＋細胞が存在すると思われるので、前記工程（ｂ’）は、ＩＦＮ‐λ産生の検出を増幅するのに役立ちうる。

【0136】

好ましくは、前記方法は、生検、好ましくは臓器又は血液の生検において、ヒトＣＤ８＋及び／又はｅＣＤ８＋従来型樹状細胞の存在をスクリーニング又は検出するためのものである。

【図面の簡単な説明】

【0137】

【図1】脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣがポリＩＣに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。高度に精製された脾臓のｃＤＣサブセット、５×１０^５／ｍＬを、例に示されている刺激を使って、ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図2A】ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０の産生が、刺激及びサイトカイン条件に依存することを示す。分取した脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣ、５×１０^５／ｍＬを刺激し、１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。（Ｂ）ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８とサイトカインの組み合わせでの刺激。（Ｃ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図2B】ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０の産生が、刺激及びサイトカイン条件に依存することを示す。分取した脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣ、５×１０^５／ｍＬを刺激し、１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。（Ｂ）ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８とサイトカインの組み合わせでの刺激。（Ｃ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図2C】ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０の産生が、刺激及びサイトカイン条件に依存することを示す。分取した脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣ、５×１０^５／ｍＬを刺激し、１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。（Ｂ）ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８とサイトカインの組み合わせでの刺激。（Ｃ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図3A】ＦＬが生体内においてＩＦＮ‐λの産生に関与することを示す。（Ａ）単離した全ての非実質肝細胞、２．５×１０^６／ｍＬを、ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、示されている刺激で刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。３回の実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）野生型及びＦＬ‐ＫＯマウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、柱はそれらの平均値を表す。

【図3B】ＦＬが生体内においてＩＦＮ‐λの産生に関与することを示す。（Ａ）単離した全ての非実質肝細胞、２．５×１０^６／ｍＬを、ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、示されている刺激で刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。３回の実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。（Ｂ）野生型及びＦＬ‐ＫＯマウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、柱はそれらの平均値を表す。

【図4】生体内において、ＴＬＲ３、ＩＦＮ‐ＡＲ及びＩＦＲ７は、ポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＭｙＤ８８もＣａｒｄｉｆもそれに関与しないことを示す。示されている遺伝子型をもつマウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、柱はそれらの平均値を表す。

【図5】ヒトＢＤＣＡ３＋ｃＤＣがポリＩＣ刺激に際するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。ＰＢＭＣ、ＢＤＣＡ１及び３を枯渇したＰＢＭＣ、若しくはＢＤＣＡ１又はＢＤＣＡ３について選択した細胞を、ＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ、及びＩＦＮ‐γの存在下において、（ドナー１）１００μｇ／ｍＬのポリＩＣ＋１０μｇ／ｍＬのＰａｍ３Ｃｙｓ＋１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ、又は（ドナー２及び３）１００μｇ／ｍＬのポリＩＣで、１８〜２４時間刺激した。上清をＩＦＮ‐λ１及びＩＦＮ‐λ２について分析した。各々のドナーに関して実験を示し、データは二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図6】脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣがＤＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。高度に精製された脾臓のｃＤＣサブセット、５×１０^５／ｍＬを、示されている刺激を使って、ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図7】脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣはｓｓＲＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。高度に精製された脾臓のｃＤＣサブセット、５×１０^５／ｍＬを、示されている刺激を使って、ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下で刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図8】脾臓ｐＤＣがＣｐＧ‐２２１６に対して大量のＩＦＮ‐λを産生することを示す。高度に精製された脾臓のｐＤＣ、５×１０^５／ｍＬを、示されている刺激を使って、ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図9A】分取したＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣが、ポリＩＣに対するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。分取したＦＬＤＣサブセット、２．５×１０^５／ｍＬを１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、示されている刺激で刺激した。（Ｂ）ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８の存在下、サイトカインで刺激した。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図9B】分取したＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣが、ポリＩＣに対するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。分取したＦＬＤＣサブセット、２．５×１０^５／ｍＬを１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、示されている刺激で刺激した。（Ｂ）ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８の存在下、サイトカインで刺激した。２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図10A】ＴＬＲ３及びＩＦＮ‐ＡＲはＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＭｙＤ８８もＣａｒｄｉｆもそれに関与しないことを示す。示されているマウスから分取したＦＬＤＣ ｅＣＤ８＋、５×１０^５／ｍＬを、１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＭｙＤ８８‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｂ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＴＬＲ３‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｃ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８で刺激した野生型及びＣａｒｄｉｆ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｄ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋プロフィリンで刺激した野生型及びＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図10B】ＴＬＲ３及びＩＦＮ‐ＡＲはＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＭｙＤ８８もＣａｒｄｉｆもそれに関与しないことを示す。示されているマウスから分取したＦＬＤＣ ｅＣＤ８＋、５×１０^５／ｍＬを、１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＭｙＤ８８‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｂ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＴＬＲ３‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｃ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８で刺激した野生型及びＣａｒｄｉｆ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｄ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋プロフィリンで刺激した野生型及びＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図10C】ＴＬＲ３及びＩＦＮ‐ＡＲはＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＭｙＤ８８もＣａｒｄｉｆもそれに関与しないことを示す。示されているマウスから分取したＦＬＤＣ ｅＣＤ８＋、５×１０^５／ｍＬを、１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＭｙＤ８８‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｂ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＴＬＲ３‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｃ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８で刺激した野生型及びＣａｒｄｉｆ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｄ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋プロフィリンで刺激した野生型及びＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図10D】ＴＬＲ３及びＩＦＮ‐ＡＲはＦＬＤＣに由来するｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与するが、ＭｙＤ８８もＣａｒｄｉｆもそれに関与しないことを示す。示されているマウスから分取したＦＬＤＣ ｅＣＤ８＋、５×１０^５／ｍＬを、１８時間刺激し、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）ＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＭｙＤ８８‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｂ）ＩＬ‐３＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ＋ＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣで刺激した野生型及びＴＬＲ３‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｃ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８で刺激した野生型及びＣａｒｄｉｆ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。（Ｄ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下において、ポリＩＣ＋プロフィリンで刺激した野生型及びＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯｅＣＤ８＋ ＤＣ。少なくとも２回の独立した実験の代表的な結果を示す。データは、二連のサンプルの平均値±標準偏差を表す。

【図11A】ＦＬ又はＭ‐ＣＳＦの処置で、生体内のＩＦＮ‐λの産生を増加することができることを示す。ＦＬ‐ＫＯマウスを、１日当たり１０μｇの組み換えＦＬ（Ａ）又はＭ‐ＣＳＦ（Ｂ）で、７日連続処置した。成長因子処置の翌日、マウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、柱はそれらの平均値を表す。

【図11B】ＦＬ又はＭ‐ＣＳＦの処置で、生体内のＩＦＮ‐λの産生を増加することができることを示す。ＦＬ‐ＫＯマウスを、１日当たり１０μｇの組み換えＦＬ（Ａ）又はＭ‐ＣＳＦ（Ｂ）で、７日連続処置した。成長因子処置の翌日、マウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、柱はそれらの平均値を表す。

【図12】生体内において、ポリＡＵはＦＮ‐λ産生を誘導するが、ＩＦＮ‐α産生をしないことを示す。マウスにポリＩＣ（１００μｇ）若しくはポリＡＵ（１００又は５００μｇ）を静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、それらの総数（ｎ）をグラフに示す。柱は使用した全てのマウスの平均値を表す。２回の独立した実験を行った。

【図13】生体内ＦＬ増殖ＣＤ８α＋ ｃＤＣ及びｅＣＤ８α ｃＤＣは、インビトロにおいて、ポリＡＵに対してＩＦＮ‐λを選択的に産生することを示す。高度に精製した、ＦＬにより増殖し、生体外において単離した脾臓のｃＤＣ、５×１０^５／ｍＬを、ＩＬ‐３＋ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γの存在下において、ポリＩＣ（１００μｇ／ｍＬ）又はポリＡＵ（１００μｇ／ｍＬ）のいずれかで刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。

【図14】ＣＤ４０共刺激は、生体内においてポリＩＣにより誘導されたＩＦＮ‐λ産生を強化することを示す。マウスにポリＩＣ（１００μｇ）、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（１００μｇ）又はポリ＋抗ＣＤ４０（各１００μｇ）の組み合わせを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、それらの総数（ｎ）をグラフに示す。柱は使用した全てのマウスの平均値を表す。３回（ＩＦＮ‐λ）又は２回（ＩＦＮ‐α）の独立した実験を行った。

【図15】生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生は、ＩＲＦ３及びＩＲＦ７に依存することを示す。示されている遺伝子型をもつマウスに１００μｇのポリＩＣを静注した。３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αについて分析した。丸は個々のマウスの結果を表し、それらの総数（ｎ）をグラフに示す。柱は遺伝子型ごとに全てのマウスの平均値を表す。３回の独立した実験を行った。

【図16】生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生は、造血細胞、ＦＬ及びＩＲＦ８に依存することを示す。示されている遺伝子型をもつマウスに、１００μｇのポリＩＣを静注し、３〜４時間後、血清をＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）示されているＢＭ再構成マウス；（Ｂ）野生型、ＩＬ‐１５Ｒ‐ＫＯ及びＲＡＧ１‐ＫＯ；（Ｃ）野生型及びＦＬ‐ＫＯ；（Ｄ）野生型及びＩＲＦ８‐ＫＯ。丸は個々のマウスの結果を表し、それらの総数（ｎ）をグラフに示す。柱は遺伝子型ごとに全てのマウスの平均値を表す。（Ａ）１回（ＢＭキメラ）、（Ｂ）２回（野生型及びＲＡＧ‐ＫＯ）又は１回（ＩＬ‐１５Ｒ‐ＫＯ）、（Ｃ）３回（野生型及びＦＬ‐ＫＯ）、及び（Ｄ）２回（野生型及びＩＲＦ８‐ＫＯ）の独立した実験を実施してきた。

【図17】生体内におけるポリＩＣ注入に対するＩＦＮ‐λ産生が、ＣＤ４５Ｒ−／ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ８α＋脾細胞で異なることを示す。 ポリＩＣ静注の１．５〜２時間後、脾臓を摘出し処理した。１８時間の生体外培養後、無細胞上清を、ＩＦＮ‐λについて分析した。（Ａ）５×１０^６細胞／ｍＬの全脾臓細胞又は細胞を、密度遠心分離で軽い密度の細胞又は重い密度の細胞に分離した。（Ｂ）野生型又はＣＤ１１ｃ‐ＤＴＲ‐ｔｇマウスの全脾臓細胞２５×１０^６細胞／ｍＬを、２日処理し、その後ジフテリア毒素（ＤＴ）で処理した。（Ｃ）分離前、又は示されている集団に磁気ビーズ分離後の全脾臓細胞。カラムに加えた最初の脾細胞の細胞数は、２０×１０^６個であった。更に数えずに、各画分を２００μＬの培養液／ウェルの入った２つのウェルに分けた。バーは、実験当たり２頭のマウスを使った、２回の独立した実験（Ａ＋Ｃ）又は１回の実験（Ｂ）の平均値±標準偏差を表す。

【図18】ＣＤ８α＋ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０の産生が、刺激及びサイトカイン条件に依存することを示す。分取りされた脾臓のＣＤ８α＋ ｃＤＣ、５×１０^５／ｍＬを刺激し、１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。（Ａ）ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦの存在下における、示されている刺激での刺激。（Ｂ）示されている刺激及びサイトカイン。バーは、実験当たり少なくとも８頭のマウスのプールを使った、２回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。

【図19】生体内及びインビトロにおけるＦＬにより生成したＣＤ８α＋ｃＤＣ及びｅＣＤ８αｃＤＣは、ＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０の主要な産生源であることを示す。高度に精製された（Ａ）ＦＬにより増殖し、生体外で単離した脾臓の又は（Ｂ）ＦＬを使ってＢＭから生体外において生成したｃＤＣサブセット、５×１０^５／ｍＬをＩＬ‐３＋ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γの存在下において示されている刺激で刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０について分析した。バーは、実験当たり少なくとも２頭のマウスのプールをそれぞれ使った、２回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。

【図20】生体内及びインビトロにおけるＦＬにより生成したＣＤ８α＋ｃＤＣ、ｅＣＤ８αｃＤＣ、及びｐＤＣが、ＨＳＶ‐１及びパラポックスウイルスに対するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることを示す。高度に精製された（Ａ）ＦＬ増殖生体外で単離した脾臓の又は（Ｂ）ＦＬでＢＭから生体外で生成したＤＣサブセット、５×１０^５／ｍＬをＩＬ‐３＋ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γの存在下において示されている刺激で刺激した。１８時間後、上清をＩＦＮ‐λについて分析した。バーは、実験当たり少なくとも２頭のマウスのプールをそれぞれ使った、２回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。

【図21】生体内におけるＨＳＶ‐１注入に対するＩＦＮ‐λ産生は、ＣＤ４５Ｒ＋及びＣＤ４５Ｒ−／ＣＤ８α＋脾細胞で異なることを示す。 ＤＩＳＣ ＨＳＶ‐１を生体内で注入した１．５時間後、脾臓細胞を抗ＣＤ４５Ｒ及び磁気ビーズを使って陽性及び陰性画分に分けた。更に、ＣＤ４５Ｒ陰性画分を、ＣＤ８α陽性又はＣＤ８α陰性細胞に分けた。分けた細胞を、それから１８時間インビトロで培養し、無細胞上清をＩＦＮ‐λについて分析した。バーは、実験当たり１頭のマウスを使った、２回の独立した実験の平均値±標準偏差を表す。

【実施例】

【0138】

以下の実施例により本発明を更に説明するが、それらの実施例は、更なる限定として解釈されるべきではない。本願の全体を通して引用されている全ての参考文献の全ての内容は、参照により明細書に明示的に組み込まれる。

【0139】

１．マウス
ＭｙＤ８８‐ＫＯマウスは、Ｓ．審良（Ｓ．Ａｋｉｒａ）（Ａｄａｃｈｉら，１９９８）から、Ｃａｒｄｉｆ‐ＫＯマウスは、Ｊ．Ｔｓｃｈｏｐｐ（Ｍｅｙｌａｎら，２００５）から、ＴＬＲ３‐ＫＯマウスはジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら，２００１）から、ＩＲＦ７‐ＫＯマウスは、谷口維紹（Ｔａｄａｔｓｕｇｕ Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）（Ｈｏｎｄａら，２００５）から、及びＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯマウスは、もともとＭｉｃｈｅｌ Ａｇｕｅｔ（Ｍｕｌｌｅｒら，１９９４）からである。Ｃ５７ＢＬ／６野生型ウスは、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎから購入した。

【0140】

２．細胞及びフローサイトメトリー分取
ＤＣサブセットを、記載の通りにプールしたマウス脾臓から分離した（Ｖｒｅｍｅｃら，２００７）。要約すると、脾臓を細かく切り刻んで、室温にてコラゲナーゼ（ウォージントン バイオケミカル（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））及びデオキシリボヌクレアーゼ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））で消化し、ＥＤＴＡで処理した。低密度細胞を、密度遠心分離により濃縮し、非ＤＣ系細胞を、ｍＡｂ（抗ＣＤ３であるＫＴ３‐１．１；抗Ｔｈｙ‐１であるＴ２４／３１．７；抗Ｇｒ‐１である１Ａ８；抗ＣＤ１９であるＩＤ３；抗赤血球であるＴＥＲ１１９及び抗ＮＫ細胞であるＤＸ５）で被覆し、抗ネズミＩｇ磁気ビーズ（キアゲン）を使って枯渇した。死細胞を、ヨウ化プロピジウム染色によって除き、ｃＤＣ集団を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４、ＣＤ８α、及びＣＤ１７２ａの発現に基づいて分取し、ｐＤＣをＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＤ１７２ａの発現に基づいて精製した（全てＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。細胞分取は、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ装置（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で実施した。

【0141】

樹状細胞由来のＦＬ骨髄培養（ＦＬＤＣ）を、記載の通りに調製した（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００４）。 ｐＤＣ及びｅＣＤ８＋及びｅＣＤ８⁻ｃＤＣサブセットを、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２４、及びＣＤ１７２ａ又はＣＤ１０３の発現に基づいて分取した（全てＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。

【0142】

３．ポリＩＣを使った生体内における抗原投与
マウス尾部側面静脈に、１００μｇのポリＩＣ（Ａｘｘｏｒａ）を静注し、抗原投与の３〜４時間後に血清を採取した。血清を、５倍に予め希釈し、記載の通りにＩＦＮ‐αをＥＬＩＳＡによって分析した（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００４）。ＩＦＮ‐λを、ＩＦＮ‐λ３（ＩＬ‐２８Ｂ）ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によって決定した。このＥＬＩＳＡは、おしなべてＩＦＮ‐λ２（ＩＬ‐２８Ａ）に交差反応し、これら２つのマウスＩＦＮ‐λを識別しない。

【0143】

４．インビトロ刺激及びサイトカイン検出
１０μｇ／ｍＬのＰａｍ３Ｃｙｓ（インビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ））、１００μｇ／ｍＬのポリＩＣ （Ａｘｘｏｒａ）、１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（大腸菌；シグマ‐アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）又はＡｘｘｏｒａ）、１０μｇ／ｍＬのＲ８４８（Ａｘｘｏｒａ）、 １μＭのＣｐＧ‐１６６８又はＣｐＧ‐２２１６（ＴＩＢ‐Ｍｏｌｂｉｏｌ）、１μｇ／ｍＬのトキソプラズマのプロフィリン（Ａｘｘｏｒａ）を含む、ＴＬＲアゴニストを、単一又はそれらの組み合わせで、細胞をインビトロにおいて刺激した。組み換えサイトカインであるマウス‐ＩＬ‐３、マウス‐ＩＬ‐４、ラット‐ＩＦＮ‐γ（ぺプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））及びマウス‐ＧＭ‐ＣＳＦ（Ｔｅｂｕ‐Ｂｉｏ） （各１０ｎｇ／ｍＬ）を、表示通りに添加した。ＩＬ‐３及びＧＭ‐ＣＳＦを添加することは、以前の観察結果（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２０００；Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００４）を基づき、それは、ｐＤＣ及びｃＤＣにおいて、ＧＭ‐ＣＳＦはＩＬ‐１２ｐ７０の産生を強化し、ＩＬ‐３とＧＭ‐ＣＳＦの組み合わせはウイルスによって誘導されるＩＦＮ‐α産生を増加したというものであった。獣医学的な目的に使用するパラポックスウイルスであるＺｙｌｅｘｉｓの調達先として、薬局から購入した。ＨＳＶ‐１を、ｄｉｓｃ ＨＳＶ‐１（ＨＳＶ‐１ｄ）として知られている複製不全の形態で、記載の通りに使用した（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００４）。上清中のＩＦＮ‐λを、ＥＬＩＳＡによって分析し、ＩＬ‐１２ｐ７０を、製造業者のプロトコールに従ってＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘビーズアッセイ（Ｂｅｎｄｅｒ Ｍｅｄｓｙｓｔｅｍｓ）によって決定した。

【0144】

５．ヒトＤＣの単離及び刺激
ＰＢＭＣを、非アトピー献血者の末梢血から密度勾配遠心分離によって調製し、ＢＤＣＡ３＋ ＤＣを、ＢＤＣＡ３／ＣＤ１４１＋樹状細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使って、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（商標）分離装置でＰＢＭＣから精製した。続いて、ＢＤＣＡ１＋ ＤＣをＢＤＣＡ３枯渇ＰＢＭＣからＢＤＣＡ１／ＣＤ１ｃ＋樹状細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使って精製した。ＰＢＭＣ及びＰＢＭＣのＤＣを豊富に含む画分を使った予備実験は、組み換えヒトサイトカインであるＩＬ‐３、ＧＭ‐ＣＳＦ及びＩＦＮ‐γ（全て、ぺプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ））（各１０ｎｇ／ｍＬ）の添加は、ＩＦＮ‐λ１及びＩＦＮ‐λ２産生を強化することを示し、したがって、全ての示されている刺激にこのサイトカインの組み合わせを加えた。刺激の１８〜２４時間後、上清を、製造業者（Ｔｅｂｕ‐ｂｉｏ）の勧めに従って、ＩＦＮ‐λ１及びＩＦＮ‐λ２についてＥＬＩＳＡによって分析した。

【0145】

６．脾臓のＣＤ８＋ ｃＤＣがポリＩＣに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源である
大量のＩＦＮ‐Ｉを誘導するその能力がよく知られているポリＩＣは、ＩＦＮ‐λの強力な誘導因子（Ｋｏｔｅｎｋｏら，２００３；Ｓｈｅｐｐａｒｄら，２００３）であるとも言われている。ｐＤＣは、幾つかのウイルス又はＣｐＧ‐ＯＤＮ刺激に応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源として同定されたが、ポリＩＣにより誘導されたＩＦＮ‐λの細胞源はいまなおとらえどころがないままである（Ｃｏｃｃｉａら，２００４；Ａｎｋら，２００８）。

【0146】

分画した脾臓細胞をＴＬＲリガンドのパネルを使って刺激することにより、Ｔ‐及びＢ‐リンパ球からなる主要なリンパ球画分は、ＩＦＮ‐λを生成することができないことが明らかになり、一方、全てのＩＦＮ‐λ産生は、ＤＣを豊富に含む調製物に限定された。高度に精製した脾臓のＤＣサブセットのなかで、以前に報告されているように、ｐＤＣがＡ型ＯＤＮ ＣｐＧ‐２２１６に対するＩＦＮ‐λの主要な源であった（図８）。しかしながら、ポリＩＣ刺激に応答しては、ＣＤ８＋ ｃＤＣが主要な産生源であり、ｐＤＣ及びＣＤ８⁻ｃＤＣは、おしなべてＩＦＮ‐λ産生に関与することができなかった（図１及び図８）。インビトロにおいて生成したＦＬＤＣサブセットも試験した。生体外において単離したｐＤＣ及びｃＤＣサブセットに関して、ｅＣＤ８＋は、ポリＩＣに対してＩＦＮ‐λを産生したが、ＣＤ８⁻ ｃＤＣもｐＤＣも産生しなかった（図９Ａ）。よって、ＣＤ８＋ ｃＤＣ及びそれらのインビトロ等価物が、ポリＩＣ刺激に応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源である。

【0147】

７．ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０産生は、刺激のタイプ及びサイトカイン条件に依存する
ＣＤ８＋ ｃＤＣは、その非常に優れたＩＬ‐１２ｐ７０産生能が良く知られている。ＣＤ８＋ ｃＤＣも大量のＩＦＮ‐λを産生することが見いだされたため、ＩＦＮ‐λに影響を与えると思われる条件を、ＩＬ‐１２ｐ７０産生に影響を与える条件と比較した。ＴＬＲ刺激のパネルを使って、例えばＣｐＧ‐ＯＤＮ又はトキソプラズマのプロフィリン（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２０００；Ｙａｒｏｖｉｎｓｋｙら，２００５）などの、それらの高度なＩＬ‐１２ｐ７０誘導で知られるＴＬＲ‐リガンドは、予想通り大量のＩＬ‐１２ｐ７０を誘導したが、驚くべきことに、これらの条件下において、ＣＤ８＋ ｃＤＣはＩＦＮ‐λを少しも産生しないことが見いだされた。対照的に、ポリＩＣは、ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ産生を誘導したが、ＩＬ‐１２ｐ７０産生を誘導しなかった（図２Ａ）。それぞれＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０又はＴＬＲ１１のリガンドである、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、ＣｐＧ‐ＯＤＮ又はプロフィリンと、ポリＩＣの組み合わせは、ＩＦＮ‐λ産生を相乗的に増加した（図２Ａ）。ＴＬＲ７の欠如、及びそれ故のＣＤ８＋ ｃＤＣのＴＬＲ７刺激に対する無応答と合致して、Ｒ８４８はポリＩＣにより誘導されるＩＦＮ‐λ産生を支持することができなかった（図２Ａ）。これらのデータは、ミエロイド分化初期応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）依存性の刺激と一体になってポリＩＣにより誘導されるＩＦＮ‐λが相乗的に増加することを示し、ＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＬ‐１２ｐ７０産生における記載された相乗効果を裏付ける（図２Ａ）（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉら，２００５）。

【0148】

刺激中のサイトカイン環境は、ネズミ及びヒトＤＣにおけるＩＬ‐１２ｐ７０産生に大きく影響し、ＩＬ‐４が生理的に活性のあるＩＬ‐１２の産生の主要なエンハンサーであることが以前から示されている（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２０００；Ｋａｌｉｎｓｋｉら，２０００）。ＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０双方を誘導する組み合わせ刺激（ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８）を使って、ＩＦＮ‐γは、ＩＬ‐１２ｐ７０産生にほとんど影響することなくＩＦＮ‐λの産生を強化し、一方、ＩＬ‐４は、ＩＬ‐１２ｐ７０産生を増加するが、ＩＦＮ‐λ産生は増加しないことが見いだされた。（図２Ｂ）。ＩＬ‐１２ｐ７０及びＩＦＮ‐λを強化するサイトカイン（ＩＬ‐３＋ＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４＋ＩＦＮ‐γ）と単一の刺激（ポリＩＣ又はプロフィリン）との組み合わせることで、ＣＤ８＋ ｃＤＣよる、刺激依存的で相互に排他的なＩＦＮ‐λ又はＩＬ‐１２ｐ７０の産生が保持されることを示した（図２Ｃ）。しかしながら、サイトカインと刺激（ポリＩＣ＋ＣｐＧ‐１６６８又はポリＩＣ＋プロフィリン）の組み合わせによって、大量のＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０の同時産生が可能であった（図２Ｂ及び２Ｃ）。

【0149】

生体外で単離した脾臓のＤＣサブセットと比較して、ＦＬＤＣからＦＡＣＳで分取したｐＤＣ、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣ及びｅＣＤ８⁻ ｃＤＣは、ＩＦＮ‐λ産生に関して非常に類似したサブセット特異性、並びに刺激及びサイトカイン依存性を示した（図９）。よって、ＩＬ‐１２ｐ７０産生又は交差提示などのその他の機能的なパラメーターに関して記載されているように、ＦＬ培養からのｅＣＤ８＋ ｃＤＣのＩＦＮ‐λ産生は、生体外で分離したＣＤ８＋ ｃＤＣと高い機能的な類似を示す。

【0150】

８．生体内において、ＦＬはポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与する
ＦＬは、定常状態におけるＤＣの成長に関与する成長因子であり、ＦＬを欠損するマウス（ＦＬ‐ＫＯ）では、例えばｐＤＣ及びＣＤ８＋ ｃＤＣなどのＤＣの量が著しく減少する（ＭｃＫｅｎｎａら，２０００）。脾臓以外の臓器におけるＩＦＮ‐λの源としてのＤＣの役割を定義するために、肝細胞を野生型及びＦＬ‐ＫＯマウスから単離し、それらをサイトカイン条件下において、ＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０誘導の発現のために、ポリＩＣ単独又はプロフィリン単独又はそれらの組み合わせのいずれかを使って刺激した。分取したＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣ（図２及び図８Ｂ）で見いだされたように、野生型マウスからの肝細胞は、ポリＩＣに対してＩＦＮ‐λを、プロフィリンに対してＩＬ‐１２ｐ７０を産生し、一方、両方の刺激の組み合わせは、ＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０の産生を同時に助けた（図３Ａ）。対照的に、ＦＬ‐ＫＯマウスの肝細胞は、この刺激に対してＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０のおしなべて抑止された産生を見せた（図３Ａ）。非造血細胞及び大部分の非ＤＣ集団は、ＦＬ‐ＫＯマウスで正常と考えられているため、このことは、ＤＣが産生されたＩＦＮ‐λの主要な源であったことを示唆している。ＣＤ８＋又はｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、ＴＬＲ１１を選択的に発現するが、ｐＤＣも他のｃＤＣサブセットも発現せず、よって、プロフィリンに選択的に応答し、ＩＬ‐１２ｐ７０を産生することができる（図２及び図９Ａ）（Ｙａｒｏｖｉｎｓｋｙら，２００５）。 ＦＬ‐ＫＯ肝細胞における、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣに選択的な刺激に際して、同時に起こるＩＦＮ‐λ及びＩＬ‐１２ｐ７０の抑止は、このｃＤＣサブセットが産生されたＩＦＮ‐λの源であることを強く示唆し、生体内における、肝臓でのＩＦＮ‐λの主要な源としてのｅＣＤ８＋ ｃＤＣの顕著な役割を提示している。よって、それら選択的な刺激条件下におけるＩＦＮ‐λ産生は、異なる細胞タイプの複雑な混合物中でさえ、ＣＤ８＋ ｃＤＣの指標としての役目を果たすかもしれない。

【0151】

これら観察結果を直接的な生体内抗原投与に広げるために、野生型及びＦＬ‐ＫＯマウスのポリＩＣ注入に対する応答を比較した。野生型マウスにおいて、ポリＩＣに対応するＩＦＮ‐λの血清レベルは、容易に検出可能であり、ＩＦＮ‐αのレベルも同様であった。際立って対照的に、ＦＬ‐ＫＯマウスにおいては、ＩＦＮ‐λのレベルはほとんど抑止され、一方、ＩＦＮ‐αは容易に検出可能なままであった（図３Ｂ）。 組み換えＦＬのＦＬ‐ＫＯマウスへの適用は、それらのＩＦＮ‐λ産生能を回復しただけでなく、野生型のレベルを超える増加さえした（図１１Ａ）。また、Ｍ‐ＣＳＦのＦＬ‐ＫＯマウスへの適用も、ポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生を増加することができ、Ｍ‐ＣＳＦが、ポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生源の数を増加できることを示している（図１１Ｂ）。それらに沿って、例えばＣＤ８＋ ｃＤＣなどのＤＣの数の上昇を見せたＦＬで治療した野生型マウスは、ポリＩＣ抗原投与に対して全身ＩＦＮ‐λ応答が大きく増加した。ＦＬ依存性は、生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生がおしなべてＤＣにより媒介されていることを強く示唆している。そのうえ、これらデータは、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣサブセットが関与していることを示している。

【0152】

９．生体内において、ＴＬＲ３、ＩＦＮ‐ＡＲ及びＩＲＦ７はポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生に関与する
ポリＩＣは、多数の方法によって免疫系により検出され、ＲＬＨ及びＴＬＲ３の役割が記載されている（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら，２００１；Ｇｉｔｌｉｎら，２００６）。生体内においてポリＩＣにより誘導されるＩＦＮ‐λ産生に関与するパターン認識受容体を決定するために、さまざまなパターン認識受容体又はそれらのアダプター分子、特にＴＬＲ３、ＭｙＤ８８又はＣａｒｄｉｆを欠損するマウスに、ポリＩＣを注射し、対応する血清中でＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αを測定した（図４）。野生型マウス及びＭｙＤ８８‐ＫＯマウスでは、大量のＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αが産生され、ＭｙＤ８８依存性のＴＬＲは関与しないことを示し、ＩＦＮ産生に関しておしなべてＭｙＤ８８に依存するｐＤＣは、それらの条件下において、両サイトカインの産生におそらく寄与しないことを示唆している。しかしながら、ＴＬＲ３の欠損は、ＩＦＮ‐α産生に影響することなく、抑止されたＩＦＮ‐λ産生をもたらした。生体内におけるＴＬＲ３の関与は、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋ ｃＤＣがＩＦＮ‐λの源であることを支持し、なぜなら、このサブセットは、特にそのＴＬＲ３の高い発現が知られており、ＴＬＲ３依存的な方法でポリＩＣを認識することが知られているからである（Ｅｄｗａｒｄｓら，２００３；Ｓｃｈｕｌｚら，２００５）。対照的に、Ｃａｒｄｉｆ‐欠損は、ＩＦＮ‐λ産生に影響は無く、以前の報告に一致して、血清ＩＦＮ‐αが完全に抑止されることを明らかにした（図４；Ｇｉｔｌｉｎら，２００６）。よって、野生型マウスにおいて、ポリＩＣは、全身レベルのＩＦＮ‐λとＩＦＮ‐αの両方を大きく誘導した一方で、ＴＬＲ３又はＣａｒｄｉｆの関与は、互いに排他的のようである。対応するＫＯマウスからインビトロで生成されたｅＣＤ８＋ ｃＤＣを使って、ＴＬＲ３のＩＦＮ‐λ産生への類似した関与を検出することはできたが、Ｃａｒｄｉｆの関与もＭｙＤ８８の関与も検出することはできなかった（図１０Ａ〜Ｃ）。これらの結果は、観察されたＦＬの関与とともに、生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生は、ＣＤ８＋及びｅＣＤ８＋サブセットのＤＣにおしなべて依存することを強く示唆している。

【0153】

生体内における最適なＩＦＮ‐Ｉ産生は、機能的なＩＦＮ‐Ｉ受容体（ＩＦＮ‐ＡＲ）の発現を必要とすることが記載されている。また、ＩＦＮ‐ＡＲの役割は、センダイウイルス又は単純ヘルペスウイルスのいずれかに応答するＩＦＮ‐λの産生であると提案されている（Ａｎｋら，２００８）。ここで、Ａｎｋと同僚によるデータと合致して、ポリＩＣに応答するＩＦＮ‐λ及びＩＦＮ‐αの全身産生は、ＩＦＮ‐ＡＲの存在におしなべて依存していることが見いだされた（Ａｎｋら，２００８）。野生型又はＩＦＮ‐ＡＲ‐ＫＯマウスのいずれかからインビトロで生成したｅＣＤ８＋を使って、ＩＦＮ‐ＡＲへの類似した依存性を検出した（図１０Ｄ）。

【0154】

生体内におけるポリＩＣに対するＩＦＮ‐λ産生の調節を更に明らかにするために、ＩＦＮ調節因子７（ＩＲＦ７）欠損マウスを分析した。ＩＲＦ７‐ＫＯマウスでは、ＩＦＮ‐α産生はほとんど抑止されていた（図４）。ｐＤＣによるＭｙＤ８８依存性のＩＦＮ‐α産生のためのＩＲＦ７の本質的な役割は以前に示されており、ＩＲＦ７のＤＣによるＴＲＩＦ依存性のＩＦＮ‐Ｉ産生への関与が提案されている（Ｈｏｎｄａら，２００５；Ｔａｍｕｒａら，２００８）。血清中のＩＦＮ‐λの産生は、ＩＲＦ７の不在下において、おしなべて減少することが見いだされ、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λの産生に対するＩＲＦ７の顕著な役割を示唆している（図４）。ポリＩＣに応答するＩＦＮ‐λの産生に対するＩＲＦ７の顕著な役割に関する生体内における結果は、ＩＦＮ‐α及びＩＦＮ‐λの誘導におけるＩＲＦ７の役割を提案している以前のプロモーターに基づいた研究と合致している（Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄら，２００７年）。

【0155】

１０．ヒトＢＤＣＡ３＋ＤＣがポリＩＣ刺激に際するＩＦＮ‐λの主要な産生源である マウスでは幾つかのｃＤＣサブセットへの分類は十分に確立され、例えばＣＤ８＋ ｃＤＣの大量にＩＬ‐１２ｐ７０を産生する能力、又は抗原を交差提示する能力などのサブセットに特有な表現型や機能と関連づけられている。ヒトにおける類似したｃＤＣサブセット識別のための証拠は近年増加てきたが、これは、主として表現型の類似に基づき、機能的な類似にはほんの少ししか基づいていない。マウスにおけるポリＩＣに応答するＩＦＮ‐λ産生は、ＣＤ８＋ ｃＤＣサブセットに特有の特徴であることが見いだされた。この特徴が、ヒトＤＣサブセットに関連しているかどうかを確立することが望まれていた。Ｃｌｅｃ９ａ及びＮｅｃｌ２発現などの表現型の類似に基づいて、ＢＤＣＡ３陽性ヒトＤＣは有力な候補ヒトｅＣＤ８＋ ｃＤＣとして提案されてきた。ＰＢＭＣ及びＤＣを豊富に含むＰＢＭＣ画分において、ポリＩＣがＩＦＮ‐λ１（ＩＬ‐２９）及びＩＦＮ‐λ２（ＩＬ‐２８Ａ）を誘導することが見いだされた。マーカーであるＢＤＣＡ１又はＢＤＣＡ３を使ったｃＤＣサブセットの分離は、検証された全てのドナーで、ＢＤＣＡ３陽性の細胞は、ＩＦＮ‐ラムダ１及びＩＦＮ‐ラムダ２の主要な産生源であることを明らかにした（図５）。よって、ポリＩＣ刺激に際してＩＦＮ‐λを産生する点で、ヒトＢＤＣＡ３ｃＤＣは、機能的にネズミｅＣＤ８＋ ｃＤＣに類似する。

【0156】

１１．脾臓のｅＣＤ８＋ ｃＤＣが、ＤＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源である
ヘルペスウイルス科は、持続性で再発性の感染症を引き起こす、ヘルペスウイルスとも呼ばれる、二本鎖ＤＮＡウイルスのファミリーであり、ヒトでは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）及びエプスタイン‐バールウイルス（ＥＢＶ）などの重要な病原体を含む。ＨＳＶ‐１はＴＬＲ９を介するＭｙＤ８８に依存的な方法を介して、ｐＤＣによって認識されることが以前に見いだされていたが、ＨＳＶ‐１は、ＭｙＤ８８に独立な今まで未知の認識経路を介してｃＤＣによって見て取られることが見いだされた（Ｈｏｃｈｒｅｉｎら，２００４）。ＩＦＮ‐λは、ＨＳＶの粘膜感染に対して防御することができ、ＴＬＲ依存性の防御はおしなべてＩＦＮ‐λに依存していた（Ａｎｋら，２００８）。

【0157】

ポックスウイルスとも呼ばれるポックスウイルス科のファミリーは、オルソポックスウイルス、パラポックスウイルスなどの幾つかの亜科に分けることができる二本鎖ＤＮＡウイルスである。ポックスウイルスのなかでは、天然痘、牛痘ウイルス、ラクダ痘の病原体である痘瘡ウイルス及びワクシニアウイルスなどはヒト及び動物にとって重要な病原体である。パラポックスウイルスは、牛及びその他の動物にとって重要な病原体である。オルソポックスウイルス及びパラポックスウイルスは、ＴＬＲ９に依存的及びＴＬＲ９に独立した経路を介してＤＣによって認識される（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎら，２００８；Ｓｉｅｇｅｍｕｎｄら，２００９）。幾つかのポックスウイルスは、ＩＦＮ‐λ結合タンパク質をコードし、組み換えＩＦＮ‐λをコードするポックスウイルスは、高度に減弱され、ポックスウイルス感染に対する防御におけるＩＦＮ‐ラムダの役割を提案している（Ｂａｒｔｌｅｔｔら，２００５；Ｂａｒｔｌｅｔｔら，２００４）。

【0158】

ｅＣＤ８＋ ｃＤＣもＤＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの産生源であるかどうかを決定するために、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスのファミリーを代表するＨＳＶ‐１及びパラポックスウイルスに対するｃＤＣサブセットの応答を検証した。

【0159】

脾臓から生体外で単離されたｃＤＣのなかで、ＣＤ８＋ ｃＤＣが、ＨＳＶ‐１又はパラポックスウイルスいずれかに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることが見いだされた（図６）。インビトロにおいて生成したｃＤＣサブセットを使って、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣがやはりＨＳＶ‐１及びパラポックスウイルスに対するＩＦＮ‐λの主要な産生源であることが見いだされた。Ｃａｒｄｉｆ、ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３のいずれかを欠いている変異マウスから生成したｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、ＲＬＨもＴＬＲもＨＳＶ‐１又はパラポックスウイルスに応答するｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λの生成に重要ではないことを明らかにした。

【0160】

ＩＦＮ‐λは、ヘルペスウイルス及びポックスウイルスに対する抗ウイルス活性を誘導すると思われ、ＩＦＮ‐λの主要な源としてのｅＣＤ８＋に関する新規の知識に基づいて、これは、ＦＬ又はＭ‐ＣＳＦ‐Ｒリガンド（Ｍ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐３４）などの成長因子を使って多数のｅＣＤ８＋ ｃＤＣを誘導することなど、新しい治療のアプローチにつながることができる。ウイルス自身が、抗ウイルスＩＦＮ‐λを誘導できるｅＣＤ８＋ ｃＤＣの数の上昇によって認識されることができ、よって、病原性ウイルスの増殖を制限している。あるいは、例えばポリＩＣなどのＤＮＡ又はＲＮＡの模倣物などの外部の刺激が、生体内におけるｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λ産生を誘導するために使用され得る。

【0161】

１２．脾臓のｅＣＤ８＋ ｃＤＣが、ＲＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの主要な産生源である
例えばポリＩＣなどの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡは、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣによるＩＦＮ‐λを誘導していることが見いだされたので、次に、ＲＮＡウイルスもＩＦＮ‐ラムダを誘導するであろうかどうかを決定した。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡウイルス感染の際に存在するだけでなく、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルス、特にプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスの感染の際にｄｓＲＮＡ中間体が産生されることも知られている。ピコルナウイルス、フラビウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科などのプラス鎖ｓｓＲＮＡファミリーとしては、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＳＡＲＳ、風疹ウイルスなどのヒト及び動物の病原体が挙げられる。２つの異なるｓｓＲＮＡウイルスファミリーを代表する異なるプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスを検証するために、トガウイルス科及びコロナウイルス科をそれぞれ代表するセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びマウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）を使用した。

【0162】

生体外で単離されたｃＤＣのなかで、ＳＦＶ及びＭＨＶに対するＩＦＮ‐λ応答は、ＣＤ８＋ ｃＤＣサブセットに限られ、ＣＤ８⁻ ｃＤＣ サブセットによるＩＦＮ‐ラムダの産生はなかった（図７Ａ）。類似した結果がインビトロで生成したｅＣＤ８＋ ｃＤＣで見いだされた。ｅＣＤ８＋ ｃＤＣを使って、ＳＦＶ及びＭＨＶに対するＩＦＮ‐λの産生は、ＭｙＤ８８の不在下においてもなお強いが、それらのウイルスに対するＩＦＮ‐λ産生は、ＴＬＲ３の不在で消滅することが見いだされた。よって、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、ｓｓＲＮＡウイルスに応答するＩＦＮ‐λの産生に、おそらくｄｓＲＮＡ中間体を介してＴＬＲ３を使用する。

【0163】

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する感受性及び治療におけるＩＦＮ‐λの重要な役割が、最近になってゲノム分析によって示されている（Ｇｅら，２００９；Ｓｕｐｐｉａｈら，２００９；Ｔａｎａｋａら，２００９；Ｔｈｏｍａｓら，２００９）。

【0164】

ｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、プラス鎖ｓｓＲＮＡ ウイルスに応答してＩＦＮ‐λを産生することが見いだされた（図７）。更に、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、肝臓で同定され得ることが見いだされた（図３Ａ）。重要なことに、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣは、ＩＦＮ‐λの産生に関して、ＭｙＤ８８にもＲＬＨにも依存しない。ＨＣＶは、ＲＬＨのシグナル伝達を抑制し、よって、ＨＣＶを認識するのにＲＬＨに依存するＣＤ８⁻ｃＤＣなどの体細胞のＩＦＮ‐α産生を抑制することが知られている（Ｍｅｙｌａｎら，２００５）。ｅＣＤ８＋ ｃＤＣはポリＩＣ及びプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスの検出にＲＬＨを使用せず、ＴＬＲ３を使用することが見いだされたので、これは、それでもＨＣＶに対する抗ウイルスサイトカインＩＦＮ‐λを産生できるｅＣＤ８＋ ｃＤＣをもたらすことができる一方で、ＲＬＨに依存するその他の細胞は抑制される。ｅＣＤ８＋ ｃＤＣの量を増加することは、例えばｓｓＲＮＡウイルスなどのウイルスに応答して産生されたＩＦＮ‐λの量を劇的に増加することができ、ポリＩＣ又は複製不全ＤＮＡウイルス（例えばＨＳＶ‐１ｄ）などの外部の刺激の適用によって更に強化されることができる。ｅＣＤ８＋ ｃＤＣの適用又は成長因子を介する生体内における強化は、ＩＦＮ‐Ｉ治療などの標準的な治療と組み合わせる又は組み合わせずに、ＨＣＶ又はヘルペスウイルスなどの持続的なウイルスに対する抗ウイルス応答を増加することができる。

【0165】

ポリＩＣに際するＩＦＮ‐λの産生は、ｅＣＤ８＋ ｃＤＣの新規の顕著な機能であり、進化的に遠い種のなかで保存されている。ＩＦＮ‐λの産生は、ポリＩＣ投与の優れたアジュバント効果に寄与するようである。そのうえ、ＣＤ８＋ ｃＤＣ及びそれらの等価物は、それらの交差提示及びＩＬ‐１２ｐ７０の能力がよく知られており、それらのＩＦＮ‐λの高産生を通して、ＴＬＲ３により媒介される抗ウイルス性の応答に対する貢献者であると思われる。これらの新しい発見は、Ｃ型肝炎ウイルス感染症などの持続性の感染症の治療に対して強く影響を与えることができる新規の治療方法に移されることができる。

【0166】

１３．ポリＡＵによるＩＦＮ‐λの誘導
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＴＬＲ３を介して、又はＲｉｇ様ヘリカーゼ（ＲＬＨ）を介して認識される。しかしながら、ＲＮＡの長さ、構成又は修飾は、異なるＲＮＡ受容体を介する検出に影響を与え得る。ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩＣ）に応答して、ＩＦＮ‐λの初期の産生は、ＴＬＲ３及び特定のＤＣサブセット（ＣＤ８α＋及びｅＣＤ８α ｃＤＣ）の存在に完全に依存することが見られた一方で、ＩＦＮ‐αの全身産生は、ＴＬＲ３から独立しており、ＣＤ８α＋ ｃＤＣから独立していたが、ＲＬＨに完全に依存した（ＲＬＨに対する本質的アダプター分子を欠いているＣａｒｄｉｆ‐ＫＯマウスで見られるように）。ｄｓＲＮＡポリアデニル酸：ポリウリジル酸（ポリＡＵ）は、ｄｓＲＮＡの別の形態であり、我々は、ポリＡＵが生体内においてＩＦＮ‐λの誘導に使用できるかどうかを検証した。興味深いことに、ポリＡＵ注入は、マウスの血清においてＩＦＮ‐λを誘導したが、全身性のＩＦＮ‐λは検出可能ではなかった。よって、刺激の特定の形態を使って、全身性のＩＦＮ‐λを誘導することなく、全身性のＩＦＮ‐λを誘導することが可能である（図１２を参照のこと）。

【0167】

生体内において見られたポリＡＵに対するＩＦＮ‐λ産生が、ポリＩＣに応答する同じ細胞に対応するであろうかどうか見るために、我々はマウスにおいてＤＣの量をＦＬ処理で強化し、ＣＤ８α＋ ｃＤＣ、ｅＣＤ８α ｃＤＣ及びＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１７２ａ＋ ｃＤＣを分取した。それらの細胞をポリＩＣ又はポリＡＵで刺激した。実際に、ＣＤ８α＋ ｃＤＣ及びｅＣＤ８α ｃＤＣのみが、ポリＩＣに対してもポリＡＵに対しても同様にＩＦＮ‐λを産生することができたが、その他のｃＤＣ（ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１７２ａ＋ ｃＤＣ）は産生できなかった。その結果を図１３に示す。

【0168】

１４．ポリＩＣ及びＣＤ４０刺激を使ったＩＦＮ‐λの誘導
樹状細胞（ＤＣ）は、ＴＬＲ‐リガンドなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）で刺激されることができ、成熟及びサイトカイン産生で応答することができる。ＰＡＭＰＳとは別に、内因性刺激が存在し、最も記載された賦活因子機構の１つはＣＤ４０とそのリガンドであるＣＤ４０‐リガンドとの相互作用である。ＤＣはＣＤ４０を発現し、活性化されたＴ細胞はＣＤ４０‐リガンドを発現し、Ｔ‐細胞のＤＣとの相互作用は、ＤＣを活性化する。この活性化の結果の１つは、例えばＩＬ‐１２ｐ７０などのサイトカインの産生である。我々は、ポリＩＣとプロフィリン又はＣｐＧ‐ＯＤＮなどのＩＬ‐１２誘導因子の組み合わせは、インビトロにおいてＩＦＮ‐λ産生の相乗的増加を誘導することを見いだしたので、ポリＩＣとＣＤ４０‐刺激との組み合わせは、生体内においてＩＦＮ‐λ産生をもたらであろうかどうかを検証した。ＣＤ４０の刺激として、生体内において刺激性であると知られている、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。その結果を図１４に示す。

【0169】

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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】