特許 6265912 分離剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6265912

(24)【登録日】2018年1月5日

(45)【発行日】2018年1月24日

(54)【発明の名称】分離剤

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20180115BHJP

   B01J 20/28 20060101ALI20180115BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20180115BHJP

   B01J 20/24 20060101ALI20180115BHJP

   B01J 20/26 20060101ALI20180115BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20180115BHJP

   C08G 77/42 20060101ALN20180115BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/88 201X

   G01N30/88 201G

   G01N30/88 201W

   G01N30/88 201R

   G01N30/88 101L

   B01J20/28 Z

   B01J20/22 D

   B01J20/24 C

   B01J20/26 G

   B01J20/26 L

   C12M1/26

   !C08G77/42

【請求項の数】3

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2014-551075(P2014-551075)

(86)(22)【出願日】2013年11月29日

(86)【国際出願番号】JP2013082215

(87)【国際公開番号】WO2014087937

(87)【国際公開日】20140612

【審査請求日】2016年9月12日

(31)【優先権主張番号】特願2012-267017(P2012-267017)

(32)【優先日】2012年12月6日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000002901

【氏名又は名称】株式会社ダイセル

(74)【代理人】

【識別番号】100100549

【弁理士】

【氏名又は名称】川口 嘉之

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(74)【代理人】

【識別番号】100160945

【弁理士】

【氏名又は名称】菅家 博英

(72)【発明者】

【氏名】大西 崇文

(72)【発明者】

【氏名】森下 康人

(72)【発明者】

【氏名】宮本 正裕

【審査官】 黒田 浩一

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５０９９７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１１／１３６７２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０５０１２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００２−１４８２４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／０１８９９４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／５１６８４８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Ketevan Lomsadze et al.，Comparative high-performance liquid chromatography enantioseparations on polysaccharide based chiral stationary phase prepared by coating totally porous and core-shell sillica particles，Journal of Cheromatography A，２０１２年 ２月 ３日，Vol.1234，p.50-55

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／８８

Ｂ０１Ｊ ２０／２２

Ｂ０１Ｊ ２０／２４

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１

Ｃ０７Ｋ １／２２

Ｃ０７Ｋ １７／０４

Ｃ０８Ｇ ７７／４２

Ｇ０８Ｇ １／００

Ｃ１２Ｑ １５／０９

Ｃ０７Ｂ ５７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

担体と、担体の表面に化学結合により担持されたリガンドとを有する分離剤において、
前記担体が、無孔性のコアと、多孔性のシェルからなるコア−シェル型粒子であって、該シェルの細孔直径が９ｎｍ以上であり、該シェルはポリアルコキシシロキサンの加水分解物からなり、
前記リガンドが、光学活性ポリマー、光学不活性なポリエステル、タンパク質、又は分子量５０〜１０００の光学活性な有機化合物であり、
前記光学活性ポリマーが、多糖若しくはその誘導体であり、
前記光学不活性なポリエステルが、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、及びポリ乳酸から選ばれるものであり、
前記タンパク質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アルブミン及びこれらの機能性変異体から選ばれるものであり、
前記分子量５０〜１０００の光学活性な有機化合物が、ビナフチル構造及びクラウンエーテル様環状構造を有する化合物である、
ことを特徴とする、分離剤。

【請求項2】

前記コア−シェル型粒子が、コアが無機材料からなり、コアとシェルの厚さの比が４：１〜２：１である、請求項１に記載の分離剤。

【請求項3】

前記分離剤が、クロマトグラフィー用分離剤である、請求項１または２に記載の分離剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特定の担体と、該担体の表面に化学的結合により担持された特定のリガンドとを有する分離剤に関する。

【背景技術】

【0002】

医薬、農薬、生化学関連の産業分野においては、生産対象とする目的物質を分離・精製することは極めて重要な課題であり、そのような分離技術として、分離剤を用いる方法は古くから行われていることである。そのような分離剤が分離対象とする物質を分離する原理としては、分離剤と目的物質の親和性を利用するものや、分離剤と目的物質の光学活性を利用するものがある。
前記分離剤としては、従来から全多孔性のシリカゲルを担体とし、その担体上に分離対象とする目的物質に応じて種々のリガンドを担持させたものが知られている。

【0003】

全多孔性のシリカゲルを担体として用いて得られる分離剤としては、例えば、光学活性ポリマーを担持したものが知られている。このような光学活性ポリマーが担持に担持された分離剤を用いた場合には、光学分割を行うことが可能になる。
前記光学活性ポリマーとしては、セルロース等の多糖を誘導体化した多糖誘導体（例えば、特許文献１参照）、光学活性なポリ（メタ）アクリル酸アミド（例えば、特許文献２参照）、光学活性なポリアミノ酸（例えば、特許文献３参照）、光学活性なポリアミド（例えば、特許文献４及び５参照）が報告されている。
一方、光学活性な低分子化合物（例えばビナフチル構造やクラウンエーテル構造を有する化合物）が担体に化学的結合により結合した光学異性体の分離剤も知られている（例えば、特許文献６参照）。

【0004】

また、架橋構造を有する合成高分子からなる粒子を担体として、その担体上にリガンドとしてタンパク質や糖鎖を有する糖タンパク質を担持する分離剤も報告されている（例えば、特許文献７参照）。
また、担体に核酸を担持させたものについては、例えば、ガラス基板上に、キトサンを介してＤＮＡを固定化する技術が知られている（例えば、特許文献８参照）。
さらには、イオン性高分子を同定するために用いるチップとして、ガラスのような担体にＤＮＡやＲＮＡ等を担持する技術も知られている（例えば、特許文献９参照）。

【0005】

リガンドを担持するために用いられる担体としては、従来から全孔性のシリカゲルが用いられている。このことについて、全孔性の粒子だけではなく、無孔性のコアを有し、その外面に多孔性のシェルを有するコアシェル型の粒子も知られている（例えば、特許文献１０参照）。このようなコアシェル型粒子のうち、細孔径が１０ｎｍのものにセルロース トリス（４−クロロ−３−メチルフェニルカルバメート）を物理的吸着により担持させてなる光学異性体用分離剤も知られている（例えば、非特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】国際公開第２００８／１０２９２０号

【特許文献2】国際公開第０２／０８８２０４号

【特許文献3】特開平１０−１２８０８９号公報

【特許文献4】特開平１１−３３５３０６号公報

【特許文献5】特開２００９−９１５３５号公報

【特許文献6】特開２００３−３２７６７５号公報

【特許文献7】特開２０１２−１８１３５号公報

【特許文献8】特開２０１０−７７０２２号公報

【特許文献9】特開２００３−２８４５５２号公報

【特許文献10】特開昭４９−３６３９６号公報

【特許文献11】特開平０７−１３８３０１号公報

【特許文献12】国際公開第２０１２／０５０１２４号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】J. Chromatogr. A 1234, 50-55 (2012)

【非特許文献2】J. Chromatogr. 363, 173 (1986)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、担体としてコア−シェル型の粒子を用い、この上に化学結合により様々なリガンドを担持させて得られる新規な分離剤を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、分離剤に用いる担体として、従来から用いられているシリカゲルのような全孔性の粒子ではなく、無孔性のコアと多孔性のシェルからなるコアシェル型の粒子を用い、これに種々のリガンドを担持させて得られる分離剤が、様々な目的物質の分離に有用であることを見出した。

【0010】

すなわち本発明は、担体と、担体の表面に化学結合により担持されたリガンドとを有する分離剤において、前記担体が、無孔性のコアと、多孔性のシェルからなるコア−シェル型粒子であって、該シェルの細孔直径が９ｎｍ以上であり、該シェルはポリアルコキシシロキサンの加水分解物からなり、前記リガンドが、光学活性ポリマー、光学不活性なポリエステル、タンパク質または核酸であることを特徴とする分離剤を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0011】

＜コアシェル型粒子＞
本発明の分離剤には、無孔性のコアとその外面に多孔性のシェルを有するコアシェル型粒子を用いる。また、そのコアシェル型粒子の表面の細孔直径は９ｎｍ以上である。
コアシェル型粒子の細孔直径が９ｎｍ以上であることで、比表面積が大きく、リガンドを多く導入することができることから、目的物質の良好な分離に寄与することが期待される。細孔直径は通常１００ｎｍ以下である。
コアシェル粒子の細孔直径は水銀圧入法により測定できる。
水銀圧入法は、圧力をかけて水銀を開孔部に侵入させ、圧力値と対応する侵入水銀体積とを用いて、円柱状と仮定した細孔の径をＷａｓｈｂｕｒｎの式から算出する方法であり、セラミックス成形体について規定されたＪＩＳ Ｒ１６５５を準用することができる。

【0012】

ここで本発明でいう無孔性とは、ＢＥＴ法により測定されるコア粒子の表面の比表面積（ｍ²／ｇ）をＡとし、コア粒子の粒子径から求められる表面積（粒子半径ｒから算出される、４πｒ²）から算出できる単位重量あたりの表面積（ｍ²／ｇ）をＢとしたとき、（Ａ−Ｂ）／Ｂ×１００が２０未満であるものをいう。
一方、本発明でいう多孔性とは、ＢＥＴ法により測定されるその表面の比表面積が１０ｍｍ²／ｇ以上であるものをいう。
コアシェル型粒子のコアとシェルの厚さの比は通常、１：９〜９：１である。この比は、目的物質の良好な分離特性を確保する観点から、４：１〜２：１であることが好ましい。この比については、後述するようにコアシェル粒子のシェルの層の厚さを調整することで、調製可能である。
ここで、コアの厚さとは、コアの直径をいう。

【0013】

コアシェル型粒子を構成するコアの材料は無機物質であり、その具体例としては、ガラス、チタン及びジルコニウムのような金属またはその金属酸化物及びベントナイトや雲母などの粘土鉱物に代表されるものから選ばれるもので無孔性の粒子を好ましく挙げることができる。

【0014】

上記コアの材料となる粒子は、その粒子径が０．１μｍ以上であるものが好ましく、０．５μｍ以上であるものがより好ましく、１μｍ以上であるものが特に好ましい。一方、上記コアの材料となる粒子の粒子径は２００μｍ以下であるものを用いることが好ましく、１００μｍ以下であるものがより好ましく、５０μｍ以下であるものを用いることが特に好ましい。
コアシェル型粒子の粒子径は、通常０．２μｍ以上、１０００μｍ以下であるものを用いる。なお、本発明で言うコアシェル型粒子の粒子径は、遠心沈降法による平均粒子径の測定方法により測定される粒子径をいう。

【0015】

コアシェル型粒子を構成するシェルの材料としては、アルコキシシランの部分加水分解により得られるポリアルコキシシロキサンをさらに加水分解させたものである。このような材料であることが、コアシェル型粒子を容易に製造できる観点から好ましい。
上記アルコキシシランとしては、テトラアルコキシシランであることが好ましく、その中でも、テトラメトキシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、テトラブトキシシランを用いることが好ましく、テトラエトキシシランを用いることがより好ましい。
上記コアシェル型粒子の作製に当たっては、特開昭４９−３６３９６号公報を参照することができる。具体的には、まず、アルコキシシランについて部分加水分解を行ってポリアルコキシシロキサンを生成させる。そして、それにより得られたポリアルコキシシロキサンをエーテル、アセトン、ジクロロメタンのような溶媒に溶解させてポリアルコキシシロキサンの溶液を調製する。この溶液を上記コアとなる粒子に塗布あるいは上記コア粒子をこの溶液に浸漬させ、その後に溶媒を除去することで、コア粒子の表面にポリアルコキシロキサンをシェルとして積層させる。そしてその後、積層させたポリアルコキシシロキサンについて、水の存在下で重縮合（加水分解）を行わせる。これにより、コアシェル型粒子を得ることができる。

【0016】

コアシェル型粒子を構成するシェルの厚さは、０．１〜１００μｍの範囲で適宜調整することが可能であり、その方法として、シェルとなるアルコキシシランの粘度を調整することが挙げられ、例えば、シェルの厚さを厚くする場合には、アルコキシシランの粘度を低くすることが挙げられる。
また、シェルの比表面積及び細孔直径の調整方法としては、シェルを積層し、重縮合を行わせる際に用いる水溶液のｐＨを調整することが挙げられ、例えば、比表面積及び細孔直径を大きくする場合には、ｐＨを増加させることが考えられる。
ここで、シェルの厚さとは、コアシェル型粒子の直径から、コアの直径を引き、その値を２で割った値をいう。

【0017】

上記コアシェル型粒子は、市販品として販売されている「コアシェル型シリカゲル」を用いてもよい。そのような市販品では、カタログ値として上記範囲の細孔直径や比表面積、粒子径を有するものである。また、そのような市販されているコアシェル型シリカゲルでは、コアがガラスからなり、シェルがシリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）からなるものを用いることができる。

【0018】

本発明の分離剤の担体として用いるコアシェル型粒子は、表面処理を行ってもよい。表面処理の方法としては、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどのアミノ基を有するシランカップリング剤を用いる方法が挙げられる。
このような表面処理により導入されるアミノ基は、後述するリガンドとの化学結合を行う際の反応基として利用することもできる。

【0019】

＜リガンド＞
本発明でいう「リガンド」とは、担体となるコアシェル型粒子に担持されるものであって、分離対象とする目的物質に対して、物理的な親和性を示すかまたは不斉認識が可能であるものをいう。
１．光学活性ポリマー
本発明の分離剤に用いることのできるリガンドとして、光学活性ポリマーが挙げられる。本発明でいう光学活性ポリマーは、当該ポリマーを溶解した溶液について、平面偏光を透過させた際、偏光面を回転させる旋光性、すなわちキラリティをもつポリマーのことを言う。
より具体的には、光学活性ポリマーを構成するためのモノマーが光学活性を有するか、光学不活性なモノマーを光学活性な重合触媒を用いて重合させ、分子量が、１，０００〜１，０００，０００である。

【0020】

１−（１）多糖またはその誘導体
本発明で用いるリガンドとなる光学活性ポリマーとして、多糖またはその誘導体が挙げられる。そのような多糖としては、例えばβ−１，４−グルカン（セルロース）、α−１，４−グルカン（アミロース、アミロペクチン）、α−１，６−グルカン（デキストラン）、β−１，６−グルカン（プスツラン）、β−１，３−グルカン（カードラン、シゾフィラン）、α−１，３−グルカン、β−１，２−グルカン（Ｃｒｏｗｎ Ｇａｌｌ多糖）、β−１，４−ガラクタン、β−１，４−マンナン、α−１，６−マンナン、β−１，２−フラクタン（イヌリン）、β−２，６−フラクタン（レバン）、β−１，４−キシラン、β−１，３−キシラン、β−１，４−キトサン、β−１，４−Ｎ−アセチルキトサン（キチン）、プルラン、アガロース、アルギン酸、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ニゲラン、及びアミロースを含有する澱粉等が挙げられる。

【0021】

この中で、好ましくは、高純度の多糖を容易に得ることのできるセルロース、アミロース、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、β−１，４−キシラン、イヌリン、カードラン、プルラン、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ニゲランなどであり、さらに好ましくは、セルロース、アミロース、プルラン、ニゲランである。
多糖の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノース又はフラノース環の平均数）は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上であり、特に上限はないが、１０００以下であることが取り扱いの容易さの点で好ましく、より好ましくは５〜１０００、更に好ましくは１０〜１０００、特に好ましくは１０〜５００である。

【0022】

これらの多糖について、例えばセルロースやアミロースを化学的に修飾したエステル誘導体やカルバメート誘導体等を本発明のリガンドとして用いることができる。
このような多糖誘導体は、キラル固定相として高い光学分割能を有することが知られている。
エステル誘導体やカルバメート誘導体の具体例として、例えば、特公平４−４２３７１号公報には、フェニルカルバメートの芳香族環の水素の一部がハロゲン（フッ素または塩素）で置換された置換基により、セルロースの水酸基が修飾されてなるセルロース誘導体や、特開２００５−３１５６６８号公報に記載されている、フェニルカルバメートの芳香族環の水素の一部が、フッ素、アルキル基、またはアルコキシ基で置換された置換基により、セルロースまたはアミロースの水酸基が修飾されたセルロース誘導体及びアミロース誘導体についても本発明のリガンドとして使用可能である。

【0023】

上記の多糖又はその誘導体のうち、分離対象とする光学異性体の分離性能の観点やコアシェル型粒子へ担持させる際の容易さから、上記多糖誘導体を用いることが特に好ましい。
多糖誘導体については、上記のものに限らず、適宜用いることが可能である。
前記多糖又はその誘導体をコアシェル型粒子に化学結合により担持させるには、コアシェル型粒子と多糖誘導体の間での化学結合、第三成分を使用した化学結合、担体上の多糖誘導体への光照射、γ線などの放射線照射、マイクロ波などの電磁波照射などによって引き起こされる反応、ラジカル開始剤などを用いるラジカル反応による化学結合が挙げられる。

【0024】

コアシェル型粒子と多糖誘導体の間での化学結合は、例えば、特開平０７−１３８３０１号公報に記載されているように、還元末端を有する多糖の還元末端を、表面処理した担体と、例えばアルデヒド基とアミノ基とでシッフ塩基を形成後、還元剤存在下で還元し、２級アミンにする方法（Glycoconjugate J (1986) 3, 311-319 ELISABETH KALLIN ら参照）（以後、還元アミノ化法と略す）により化学結合させた後、多糖を誘導体化して目的の光学異性体分離用充填剤を得る、という方法を用いることができる。

【0025】

コアシェル型粒子上の多糖誘導体を、第三成分を使用して化学結合させる方法としては、例えば、特開２００２−１４８２４７号公報の実施例に記載されているように、ビニル基等の重合性基を導入した重合性多糖誘導体と、やはりビニル基等の重合性基を導入したコアシェル型粒子とを、ビニル基等を有する第三成分（重合性モノマー）の存在下、共重合させる方法を用いることができる。

【0026】

コアシェル型粒子と多糖誘導体とを光照射によって化学結合させる方法としては、例えば、特表平１１−５１０１９３号公報の実施例に記載されているように、多糖誘導体をコアシェル型粒子上に塗布して担持させた後、これに浸漬性水銀灯により光を照射して多糖誘導体を光化学的に架橋する方法を用いることができる。

【0027】

コアシェル型粒子上に塗布した多糖誘導体をγ線などの放射線照射、マイクロ波などの電磁波照射によって化学結合させる方法としては、例えば特開２００４−１６７３４３号公報に記載されているように、多糖誘導体を、表面処理したコアシェル型粒子上に塗布した後、これにγ線を照射して多糖誘導体を化学結合させる方法を用いることができる。

【0028】

その他、コアシェル型粒子と多糖誘導体を化学的に結合させる方法として、例えば、多糖誘導体の水酸基またはアミノ基の一部にアルコキシシリル基を導入した多糖誘導体をコアシェル型粒子上に塗布し、適当な溶媒中でアルコキシシリル基による架橋を形成させることにより、多糖誘導体を化学的に結合させる方法を用いることもできる。

【0029】

上記コアシェル型粒子に対する多糖またはその誘導体の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0030】

１−（２）ポリ（メタ）アクリル酸アミド
本発明では、リガンドとなる光学活性ポリマーとして、ポリ（メタ）アクリル酸アミドが挙げられる。このようなポリ（メタ）アクリル酸アミドは、下記式（Ｉ）で示される（メタ）アクリル酸アミドのうち、光学活性なものを重合させて得られるものが好ましく用いられる。
そのような重合反応として、例えば、ルイス酸触媒存在下、ＡＩＢＮ（アゾビスイソブチロニトリル）等のラジカル重合開始剤を用いるラジカル重合が挙げられる。
ここで用いられるルイス酸は金属塩（ＭＸ）である金属ルイス酸が望ましく、例えば、スカンジウムトリフラート、イットリウムトリフラート、臭化マグネシウム、塩化ハフニウム、イッテルビウムトリフラート、ルテチウムトリフラート等が挙げられる。
重合反応において、（メタ）アクリル酸アミドが常温、常圧で液体の場合、無溶剤条件でも重合反応を行うことができるが、固体である場合に使用する反応溶媒としてはラジカル補捉効果のない通常のいかなる有機溶剤でも使用することができる。より望ましくはテトラヒドロフラン、クロロホルム、メタノールなどである。
その他の重合条件は国際公開第０２／０８８２０４号を参照して適宜調整することができる。

【0031】

【化1】

（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、それぞれ異なって、水素原子、炭素数１〜３０の１価炭化水素基あるいはヘテロ原子を含有する１価の原子団を示し、Ｒ⁴は水素原子あるいは炭素数１〜３０の１価炭化水素基を示し、Ｒ⁵は水素原子あるいはメチル基を示す。）

【0032】

上記Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は、それぞれ異なって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、アリール基、アラルキル基、カルボアルコキシ基、カルバモイル基、アミノ置換アルキル基、アミノ基、アルコキシ置換アルキル基、アルコキシ基又はシリル基であり、Ｒ⁴が水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、アリール基又はアラルキル基であることが好ましい。Ｒ⁴が水素原子であることが特に好ましい。
上記コアシェル型粒子に対するポリ（メタ）アクリル酸アミドの担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0033】

上記コアシェル型粒子に上記ポリ（メタ）アクリル酸アミドを化学的結合により担持させるには、コアシェル型粒子に反応性官能基を結合させるとともに、この反応性官能基とポリ（メタ）アクリル酸アミドが有するアミド基と反応させるか、上記反応性官能基と反応しうる官能基を上記ポリ（メタ）アクリル酸アミドに導入し、これを反応させて結合させる方法が挙げられる。
具体的には、エポキシ基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理によりコアシェル型粒子にエポキシ基を含有させておき、このエポキシ基とポリ（メタ）アクリル酸アミドが有するアミド基を反応させる方法が挙げられる。
また、ビニル基、（メタ）アクリロイル基のような重合性官能基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理によりコアシェル型粒子に重合性官能基を導入させておき、他方で特開2006-177795号公報に記載のように、上記ポリ（メタ）アクリル酸アミドにイソシアン酸エスエルを用いることで、ポリ（メタ）アクリル酸アミドにも（メタ）アクリロイル基のような重合性官能基を導入させ、両者の重合性官能基を反応させて共重合して化学結合を起こさせる方法が挙げられる。

【0034】

１−（３）ポリアミノ酸
本発明に用いられる光学活性ポリマーとして、ポリアミノ酸が挙げられる。本発明で言うポリアミノ酸には、後述するタンパク質は含まない。そのようなポリアミノ酸としては、下記式（ＩＩ）で表されるものが挙げられる。このようなポリアミノ酸は例えば特開昭６０−１９３５３８号公報に記載の方法で合成することができる。

【化2】

上記式（ＩＩ）において、ｎは５以上であり、Ｒ₆は炭素数１〜５のアルキル基、フェニル基及び炭素数７〜１２のアラルキル基及び複素環基から選ばれる基である。これら基には、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基、アミノ基及びメチルチオ基のような置換基を有していてもよい。Ｒ₇は炭素数１〜５のアルキル基であり、メチル基またはエチル基であることが好ましい。
複素環基を構成する複素環としては、５−ピラゾロン、ピラゾール、トリアゾール、オキサゾロン、イソオキサゾロン、バルビツール酸、ピリドン、ピリジン、ロダニン、ピラゾリジンジオン、ピラゾロピリドン、メルドラム酸およびこれらの複素環にさらに炭化水素芳香環や複素環が縮環した縮合複素環が挙げられる。
上記のようなポリアミノ酸を構成するためのα−アミノカルボン酸を例示すると、アラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸が挙げられる。また、アスパラギン酸ベンジル、グルタミン酸メチル、グルタミン酸ベンジル、カルボベンゾキシリシン、カルボベンゾキシオルニチン、アセチルチロシン、ベンジルセリンのようなアミノ酸誘導体もポリアミノ酸の構成材料として挙げることができる。
上記式（ＩＩ）において、ｎは１００以下であることが好ましく、１０〜４０がより好ましい。
上記コアシェル型粒子に対するポリアミノ酸の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0035】

上記コアシェル型粒子に上記ポリアミノ酸を化学的結合により担持させるには、コアシェル型粒子に反応性官能基を結合させるとともに、この反応性官能基とポリアミノ酸が有するアミノ基と反応させるか、上記反応性官能基と反応しうる官能基を上記ポリアミノ酸に導入し、これを反応させて結合させる方法が挙げられる。
コアシェル型粒子に導入させる反応性官能基としては、ポリアミノ酸が有するアミノ基と反応するエポキシ基を導入する方法がある。その具体的方法としては、エポキシ基を含有するシランカップリング剤により、コアシェル型粒子を表面処理することが挙げられる。
また、ビニル基、（メタ）アクリロイル基のような重合性官能基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理によりコアシェル型粒子に重合性官能基を導入させておき、他方でポリアミノ酸のアミノ基と反応しうる重合性官能基を有するモノマー、例えばアクリル酸クロリド、グリシジルメタクリレート、クロロメチルスチレンをポリアミノ酸と反応させて、末端にビニル基のような重合性官能基を導入したポリアミノ酸を合成して、コアシェル粒子状の重合性官能基とポリアミノ酸の重合性官能基とを反応させて共重合により化学結合を形成する方法も挙げられる。

【0036】

１−（４）ポリアミド
本発明の分離剤に用いられる光学活性ポリマーとして、ポリアミドが挙げられる。このポリアミドでは、繰り返し単位の主鎖に１の光学活性アミノ酸残基を有するものである。
この光学活性ポリアミドの合成にかかるモノマー成分として、光学活性なジカルボン酸であるＮ−置換アミノ酸とジアミンと採用したものである。Ｎ−置換アミノ酸としては、例えばＮ−置換グルタミン酸やＮ−置換アスパラギン酸を用いることができ、ジアミンとしては４，４’−ジアミノジフェニルメタンや１，３−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミンを用いることができる。
上記ポリアミドの合成方法の一例を説明する。上記ポリアミドは上記のように、光学活性なジカルボン酸であるＮ−置換アミノ酸と、ジアミンとを重合させることにより合成することができる。具体的には、Ｎ−メチルピロリドン（以下、「ＮＭＰ」と記載する。）とピリジン（以下、「Ｐｙ」と記載する。）とを例えば容量比４：１で混合した液に、塩化リチウム（以下、「ＬｉＣｌ」と記載する。）を例えば４重量％加えた液（以下、「ＮＭＰ−Ｐｙ混合溶液」と記載する。）、例えば７．５ｃｍ³に、所定量の、例えば３ｍｍｏｌのベンゾイル−Ｌ−グルタミン酸（光学活性なジカルボン酸であるＮ−置換アミノ酸）と、これと等モル量、例えば３ｍｍｏｌの４，４’−ジアミノジフェニルメタン（ジアミン）と、これらの２倍のモル量、例えば６ｍｍｏｌの亜リン酸トリフェニルとを、所定温度、例えば８０℃で撹拌しながら所定時間、例えば３時間加熱する。反応終了後、生成物をメタノール中に滴下した後、これをろ過してポリマーを得、減圧乾燥させる。

【0037】

本発明に係るポリアミドの合成方法は上記の方法に限定されるものではなく、上記以外の方法で合成してもかまわない。また、反応に用いる各試薬及びその量によって適する反応温度及び反応時間は異なる。上記に示した反応時間、反応温度、及び試薬の量は本発明に係る光学活性ポリマーを得ることのできる条件の一例であり、適宜変更が可能である。

【0038】

本発明に係るポリアミドは、光学活性なジカルボン酸であるＮ−置換アミノ酸を用いて合成されているため、そのポリマー内部にＤ−又はＬ−光学活性体認識部位を有し、この光学活性体認識部位を利用して光学分割を行うことができる。
上記コアシェル型粒子に対するポリアミドの担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0039】

上記コアシェル型粒子に上記ポリアミドを化学的結合により担持させるには、コアシェル型粒子に反応性官能基を結合させるとともに、この反応性官能基とポリアミドが有するアミド基と反応させるか、上記反応性官能基と反応しうる官能基を上記ポリアミドに導入し、これを反応させて結合させる方法が挙げられる。
具体的には、エポキシ基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理によりコアシェル型粒子にエポキシ基を含有させておき、このエポキシ基とポリアミドが有するアミド基を反応させる方法が挙げられる。
また、ビニル基、（メタ）アクリロイル基のような重合性官能基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理によりコアシェル型粒子に重合性官能基を導入させておき、他方で特開2006-177795号公報に記載のように、上記ポリアミドにイソシアン酸エスエルを用いることで、ポリアミドにも（メタ）アクリロイル基のような重合性官能基を導入させ、両者の重合性官能基を反応させて共重合して化学結合を起こさせる方法も挙げられる。

【0040】

２．光学不活性なポリエステル
本発明で用いるリガンドとして、光学不活性なポリエステルが挙げられる。そのようなポリエステルの具体例として、ポリエステルとしては、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレン・ポリブチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリεカプロラクトン及びポリ（オキシカルボニルオキシ−１，４−フェニレン−２，２−イソプロピリデン−１，４−フェニレン)｛ビスフェノールＡのポリカーボネート）等が挙げられる。これらの中でも、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリ乳酸またはポリグリコール酸を用いることが好ましい。
上記ポリエステルの重量平均分子量は、ポリマー溶解溶媒粘性増による取扱い易さの観点から１万〜１００万が好ましく、２万〜２０万であることがより好ましい。

【0041】

上記コアシェル型粒子に上記ポリエステルを化学的結合により担持させるには、コアシェル型粒子に反応性官能基を結合させるとともに、この反応性官能基と反応しうる官能基を上記ポリエステルに導入し、これを反応させて結合させる方法が挙げられる。
具体的には、コアシェル型粒子にエポキシ基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基を、エポキシ基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理により導入させておき、一方、ポリエステルについては、ポリアミンを用いて化学処理を行い、上記ポリエステルにアミノ基を導入させる。
ポリアミンとしては、炭素数２〜８の（ポリ）アルキレンポリアミンが含まれ、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン及びテトラエチレンペンタミン等が挙げられる。

【0042】

これらのポリアミンのうち、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン及びテトラエチレンペンタミン、特に好ましくはジエチレントリアミンを用いることが好ましい。特に、アミノ基を少なくとも３個含むポリアミンを用いると、上記ポリエステルへのアミノ基の導入が良好になる。また、アミンは低分子量であると、化学処理の後除去が容易であるため好ましい。

【0043】

アミンによる化学処理としては、有機溶媒とアミンとからなる溶液中で、または水及び有機溶媒の混合溶媒とアミンとからなる溶液中で、上記ポリエステルを加熱処理する方法が挙げられる。

【0044】

上記の化学処理を経たポリエステルと表面処理を施されたコアシェル型粒子を真空または空気中で反応を起こさせて、コアシェル型粒子にポリエステルが化学結合した分離剤を得ることができる。

【0045】

３．タンパク質
本発明の分離剤のリガンドとして、タンパク質を用いることができる。本発明で用いることのできるタンパク質は、分子量３〜３００ｋＤａ、好ましくは３０〜１５０ｋＤａであって、分離対象とする例えば抗体のようなタンパク質に対して親和性のある物質が挙げられる。
これらの中でも、リガンドとしてプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アルブミン及びこれらの機能性変異体が抗体のタンパク質の分離に用いる際の選択率が高く好ましい。
抗体の分離を主目的とする場合、リガンドとしては免疫グロブリンの一部と特異的に結合可能なものが好ましい。
上記機能性変異体は、天然アミノ酸配列において少なくとも１つの変性を有し、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持しているタンパク質を指す。天然配列には、本来自然に発生するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸の変化としては、１つ以上のアミノ酸の別のアミノ酸への置換、１つ以上のアミノ酸の削除および／または１つ以上のアミノ酸の追加またはこれらのいずれかの組合せを挙げることができる。天然配列に対して行われる追加、削除および置換の組合せのような態様も挙げられる。機能性変異体は、タンパク質の断片またはドメインを含むこともできる。機能性変異体のアミノ酸配列は、天然アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一であってもよく、天然配列に伴われている少なくとも１つの機能をなお維持している。
アルブミンとしては、卵アルブミンやヒト血清アルブミン（分子量約６６ｋＤａ）を挙げることができる。

【0046】

また、本発明で用いることができるタンパク質として、以下に示すセロビオヒドロラーゼＩ及びＩＩとして知られるセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）を挙げることができる。セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ Ｉ）とセロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ II）はセルラーゼの大部分（両者で８０％以上、この他にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが少量含まれる）を占める主要酵素であることが知られている。その製造方法としては、遺伝子組換えの技術を用いて、目的のセロビオヒドロラーゼを宿主細胞において大量に発現させる方法を挙げることができる。

【0047】

本発明ではタンパク質としてα₁−酸性糖タンパク質を用いることができる。α₁−酸性糖タンパク質の由来としては、ヒト、ウシ、家兎等の哺乳類、ニワトリ、ハクチョウ、七面鳥等の鳥類を挙げることができる。それらのうち、好ましいα₁−酸性糖タンパク質の具体例としては、ヒトα₁−酸性糖タンパク質（以下、単にｈ−ＡＧＰともいう）やニワトリＡＧＰ（以下、単にｃ−ＡＧＰともいう）を挙げることができる。
ヒトα₁−酸性糖タンパク質（ｈ−ＡＧＰ）は市販品（例えばＳｉｇｍａ−Ａlｄｒｉｃｈ社）を用いることができ、必要に応じて高速液体クロマトグラフィーにより精製してもよい。

【0048】

本発明で用いることができるニワトリα₁−酸性糖タンパク質（ｃ−ＡＧＰ）は、ニワトリ粗オボムコイドをカチオン交換担体（例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を用いた液体クロマトグラフィーにより、酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．６）によるステップワイズ溶出法を用い、オボムコイドとニワトリα₁−酸性糖タンパク質（ｃ−ＡＧＰ）とを分離することにより得られる。
さらに、ｃ−ＡＧＰを含む画分を分取して、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのようなイオン交換クロマトグラフィー用担体により精製を行ってもよい。

【0049】

上記のヒトα₁−酸性糖タンパク質は、１８３個のアミノ酸残基と５本の糖鎖からなる分子量４１０００〜４３０００程度の糖タンパク質である。ニワトリα₁−酸性糖タンパク質は、アミノ酸残基および糖鎖はヒトα₁−酸性糖タンパク質と同じであるが、分子量は約３００００である。

【0050】

上記コアシェル型粒子に対するタンパク質の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0051】

上記コアシェル型粒子に上記タンパク質を化学的結合により担持させるには、通常以下のような方法が用いられるが、これに限定されるものではない。
固定化は、コアシェル型粒子に反応性官能基を結合させた上で、この反応性官能基と、タンパク質の有する官能基とを直接反応させる方法や、あるいはコアシェル型粒子に結合させた官能基及び前記タンパク質の有する官能基とそれぞれ反応可能な官能基を分子内にそれぞれ１個以上有する低分子又は高分子化合物（以下このような化合物をまとめて「スペーサー」と記す）を介して結合させる方法が用いられる。

【0052】

例えばプロテインＡのようなアミノ基を有するリガンドを固定化する場合、前者の方法としては、コアシェル型粒子にエポキシ基などのアミノ基と共有結合を形成する官能基を、エポキシ基を含有するシランカップリング剤などによる表面処理により含有させておき、これとプロテインＡを直接反応させて固定化する方法が例示できる。
また、後者の方法としては、スペーサーとしてアミノ酸（アミンカルボン酸）類を用い、そのアミノ基部位とコアシェル型粒子に導入したエポキシ基とを反応させた上で、他の末端のカルボキシル基によってプロテインＡのアミノ基と反応させる方法や、スペーサーとしてジアミンやジオールと（ポリ）エチレングリコールジグリシジルエーテル等のジグリシジル化合物を逐次的に用いて、コアシェル型粒子に導入したエポキシ基とジアミン又はジオールの一方の末端を結合させ、他の末端にジグリシジル化合物の一方のエポキシ基を結合させて、残る末端のエポキシ基をプロテインＡと結合させる方法などが挙げられる。

【0053】

なお、上記方法でスペーサーの一部の成分として用いられるジアミンとしては、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン等の脂肪族ジアミン類が挙げられ、ジオールとしては、プロピレングリコール、ブタンジオール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール等の脂肪族ジオールやポリエチレングリコール類が挙げられる。
スペーサーとしてはリガンドとの反応性や固定化時のコアシェル型粒子との立体障害の関係を考慮すると、直鎖状の構造を有していることが好ましい。分岐鎖状の構造のスペーサーを用いると、立体障害が大きくなって、リガンドであるタンパク質と分離対象としての抗体とのアフィニティ結合の形成を抑制することがあり、分離性能が悪くなることがある。

【0054】

また、コアシェル型粒子に導入する官能基としては、３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いた３−アミノプロピル基も挙げられ、この場合には、コアシェル型粒子を予め炭酸ジコハク酸ジイミド（Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート：ＤＳＣ）とを反応させておき、これにタンパク質のアミノ酸残基のアミノ基とを反応させることもできる。

【0055】

４．核酸
本発明の分離剤のリガンドとして、核酸を用いることができる。そのような核酸としては特に制限はないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドなどが挙げられる。また、ＤＮＡ及びＲＮＡの誘導体も用いることができ、ＤＮＡやＲＮＡは天然型でも人工型でもよいが、分離剤としての安定性を考慮すると、構造的に安定な人工型を使用することが好ましい。人工型においては天然型には存在しない配列を形成することができる。
人工型の核酸の塩基数は５０〜２００程度であるものが好ましく、効率的な合成を可能にする観点から、１００塩基程度のものを用いることが好ましい。人工型の核酸ではチミンの二量体化を防ぐ観点から、チミン同士が隣接しないことが好ましい。
さらに、分離剤としての耐久性を考慮して、上記核酸は保護基により誘導体化されていてもよい。具体的には、５’位、３’位のいずれか一方又は双方にある水酸基をリン酸エステル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリル基などを用いて誘導化することができる。

【0056】

上記コアシェル型粒子に対する上記核酸の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。上記核酸の担持量がコアシェル型粒子１００重量部に対して１．０重量部に満たない場合は、上記核酸を分離剤中に安定に存在させることができなくなり十分な分離性能が得られなくなる一方、上記核酸の担持量がコアシェル型粒子１００重量部に対して２５重量部を超える場合には、上記核酸をコアシェル型粒子に担持させきることができなくなって、フリーの核酸が生じ、分離性能に悪影響を及ぼす可能性がある。

【0057】

上記コアシェル型粒子に上記核酸を担持させるには、例えば、特開２０１０−２５９４０５号公報に記載のようにキトサン及び該キトサンのアミノ基を介して結合させる方法が挙げられる。この方法ではまず、コアシェル型粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシランのようなアミノシラン、グルタルアルデヒド、キトサン、グルタルアルデヒド、アビジンの順で以下のように修飾する。
コアシェル型粒子に３−アミノプロピルトリエトキシシランを蒸着反応させた後、加熱処理する。
３−アミノプロピルトリエトキシシラン処理されたコアシェル型粒子をグルタルアルデヒド溶液に浸漬した後、洗浄し風乾する。
グルタルアルデヒドで処理されたコアシェル型粒子をキトサン溶液に浸漬処理した後、超純水で洗浄する。これにより、グルタルアルデヒドのアルデヒド基にキトサンのアミノ基が共有結合し、コアシェル型粒子の表面上に多数のアミノ基が得られ、核酸を結合させるための表面積が増大する。
次に、キトサンが導入されたコアシェル型粒子をグルタルアルデヒド溶液に浸漬した後、洗浄し風乾する。
得られたコアシェル型粒子にアビジン溶液を滴下し、静置することで、アルデヒド基とアビジンのアミノ基が結合し、アビジンがキトサンを介してコアシェル粒子上に固定される。
そして、アビジンが固定化されたコアシェル粒子上にビオチン標識された核酸溶液を滴下して反応させることにより、キトサンを介して核酸が固定化されたコアシェル型粒子が得られる。

【0058】

５．分子量５０〜１０００の光学活性な化合物
本発明の分離剤のリガンドとして、分子量５０〜１０００の光学活性な有機化合物を用いることができる。そのような有機化合物としては、不斉中心を有し、分子量が上記５０〜１０００であって、コアシェル型粒子と化学結合により結合可能なものであれば特に限定されない。

【0059】

５−（１）ビナフチル構造及びクラウンエーテル様環状構造を有する化合物
分子中にビナフチル構造及びクラウンエーテル様環状構造を有する化合物としては、例えば、特開２００３−３２７６７５号公報に記載のものが挙げられる。
それ以外にも例えば下記式（ＩＩＩ）で表されるものが好ましく例示できる。

【0060】

【化3】

【0061】

式（ＩＩＩ）中、Ｒ₈及びＲ₉はそれぞれ水素、置換基を有していてもよいフェニル基、置換基を有していてもよいナフチル基、置換基を有していてもよく任意の非連続のメチレン基が酸素であってもよい炭素数１〜８のアルキル基、又は各アルキル基の炭素数が１又は２のトリアルキルシリル基を表す。また、Ｒ₈及びＲ₉におけるフェニル基等が有していてもよい前記置換基は、クラウンエーテル様環状構造の酸素原子と相互作用しない基であり、このような置換基としては、例えばメチル基及びクロロ基が挙げられる。Ｒ₈及びＲ₉は、分離性能の向上の観点から、フェニル基であることが好ましい。

【0062】

式（ＩＩＩ）中、Ａ₁及びＡ₂はそれぞれ、ビナフチル環の水素に置き換えられた、担体の表面に結合している基を表す。Ａ₁及びＡ₂の大きさは特に限定されないが、合成の容易さと分離性能の向上との観点から、それぞれの分子量が１００〜６００であることが好ましい。Ａ₁及びＡ₂は、炭素数１〜３０のアルキレン基、炭素数６〜３０のアリーレン基、エーテル基、カルボニル基、イミノ基、及びアミド基等の種々の基から構成することができる。
Ａ₁及びＡ₂は、それぞれ式（ＩＩＩ）のビナフチルの水素に置き換えられた下記式（ＩＶ）で表される構造を含むことが、前記ビナフチル化合物の合成の容易さの観点から好ましい。

【0063】

【化4】

【0064】

式（ＩＶ）中、ｏは１〜３０の整数を表す。ｏは、合成の容易さと分離性能の向上との観点から、４〜１０であることが好ましい。
式（ＩＩＩ）中、ｌは４〜６の整数を表す。このようなｌはアンモニウムイオンの包接の観点から好ましく、４であることがより好ましい。
式（ＩＩＩ）中、ｍ及びｎはそれぞれ０〜５の整数を表す。ただしｍ＋ｎは１〜１０である。ｍ及びｎの両方がそれぞれ１以上であることが、前記ビナフチル化合物の合成の容易さの観点から好ましく、ｍ及びｎの一方が１であり他方が０であることがより好ましい。なお、ｍ又はｎが０である場合は、担体との結合がないことを意味する。

【0065】

上記式（ＩＩＩ）で表される化合物を上記コアシェル型粒子に化学結合させる方法としては、以下のＡ〜Ｄ工程を経て行うことができる。

【0066】

本発明のクロマトグラフィー用分離剤は、下記式（ＩＩＩ）で表されるビナフチル誘導体Ａのビナフチル環に担体連結基を導入してビナフチル誘導体Ｂを得るＡ工程と、ビナフチル誘導体Ｂの２，２’位のメトキシ基を加水分解して前記メトキシ基が水酸基になったビナフチル誘導体Ｃを得るＢ工程と、ビナフチル誘導体Ｃの前記水酸基のそれぞれをポリエチレングリコール誘導体で架橋してクラウンエーテル様環状構造を有するビナフチル誘導体Ｄを得るＣ工程と、ビナフチル誘導体Ｄの担体連結基を介してビナフチル誘導体Ｄをコアシェル型粒子の表面に化学結合によって結合するＤ工程と、を含む方法によって製造することができる。

【0067】

【化5】

【0068】

式（Ｖ）において、Ｒ₈及びＲ₉は式（ＩＩＩ）のＲ₈及びＲ₉と同じである。ビナフチル誘導体Ａは、市販品として得ることができる。このような市販品としては、例えば２，２’−ジメトキシ−１，１’−ビナフチル及び３，３’−ジブロモ−２，２’−ジメトキシ−１，１’−ビナフチル（共に東京化成工業株式会社の製品）が挙げられる。このような市販品の使用は、前記ビナフチル化合物の合成の容易さの観点から好ましい。

【0069】

またビナフチル誘導体Ａは、合成によって得ることができる。例えば、ビナフチル誘導体Ａは、３，３’−ジブロモ−２，２’−ジメトキシ−１，１’−ビナフチルから合成することによって得ることができる。このように本発明の方法が、３，３’−ジブロモ−２，２’−ジメトキシ−１，１’−ビナフチルのブロモ基をそれぞれＲ₈及びＲ₉に置き換えてビナフチル誘導体Ａを得るための工程をさらに含むことは、前記ビナフチル化合物のＲ₈及びＲ₉の多様性を得る観点から好ましい。

【0070】

Ａ工程では、担体連結基は、コアシェル型粒子上の表面の官能基と結合する基であってもよいし、コアシェル型粒子の表面に直接結合する基であってもよい。担体連結基は一種でも二種以上でもよい。また担体連結基は、少なくとも一つあればよく、二以上あってもよい。さらに担体連結基が二以上ある場合では、担体連結基はビナフチルの二つのナフチル環の一方のみに結合していてもよいし、両方にそれぞれ結合していてもよい。担体連結基は、前記ビナフチル誘導体Ｄとコアシェル型粒子との結合の容易さの観点から、コアシェル型粒子の表面処理による官能基と結合する基であることが好ましい。

【0071】

このような好ましいＡ工程としては、例えば、ビナフチル誘導体Ａと炭素数４〜３３の脂肪族ジカルボン酸モノメチルエステルモノクロライドとを塩化鉄の存在下で反応させてビナフチル誘導体Ｂを得る工程が挙げられる。

【0072】

前記Ｂ工程は、ビナフチルの２，２’位がビナフチル誘導体Ｂの中でも反応性が高いことから、温和な条件での反応によって行うことができる。このような反応の条件としては、例えば氷冷下から室温中での三臭化ホウ素による脱アルキル反応が挙げられる。このような条件でＢ工程を行うことは、ビナフチル誘導体Ｂの他の構造への影響を抑え、より収率よくビナフチル誘導体Ｃを得る観点から好ましい。

【0073】

前記Ｃ工程は、ビナフチル誘導体Ｃの２，２’位の水酸基にポリオキシエチレンを架橋させられる条件によって行うことができる。このような架橋は、加水分解を利用して行うことができ、例えば、オキシエチレン基の繰り返し数が５〜７のポリオキシエチレングリコールジトシラートをアルカリ条件下で反応させることによって行うことができる。

【0074】

前記Ｄ工程は、担体連結基やコアシェル型粒子の表面処理の種類に応じて公知の技術の範疇で適宜に行うことができる。例えば、Ｄ工程は、表面処理されたコアシェル型粒子を用いる場合では、ビナフチル誘導体Ｄの担体連結基とコアシェル型粒子の表面処理による官能基とを化学結合させることによって行うことができる。

【0075】

上記コアシェル型粒子の表面処理剤として、シランカップリング剤を用いることができる。このようなシランカップリング剤としては、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、及び３−（２−アミノエチルアミノプロピル）トリメトキシシランが挙げられる。

【0076】

上記コアシェル型粒子に対する上記式（ＩＩＩ）で表される化合物の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0077】

５−（２）Ｎ−アシル化アミノ酸、Ｎ−カルバモイルアミノ酸、Ｎ−カルバモイル−α−芳香族アミノ酸
本発明の分離剤では、リガンドとしてＮ−アシル化アミノ酸、Ｎ−カルバモイルアミノ酸、Ｎ−カルバモイル−α−芳香族アミノ酸（以下、本発明にかかるアミノ酸類という）を化学結合により上記コアシェル型粒子に担持させて、光学異性体用の分離剤とすることができる。
Ｎ−アシル化アミノ酸としては、例えばＮ−ピバロイルーＬ−バリン、Ｎ−３,５−ジニトロベンゾイル−Ｄ−フェニルグリシンなどが挙げられる。Ｎ−カルバモイルアミノ酸としては、例えばＮ−カルバモイル−ロイシン、Ｎ−カルバモイル−バリンなどが挙げられる。また、Ｎ−カルバモイル−α−芳香族アルキルアミンとしては、例えばＮ−カルバモイル−α−（ノーナフチル）エチルアミンなどが挙げられる。

【0078】

上記本発明にかかるアミノ酸類は、本発明の分離剤においてキラル部位として機能する。
上記本発明にかかるアミノ酸類を上記コアシェル型粒子に化学的に結合させる方法として、以下の方法が挙げられる。具体的な操作としては、特開平５−４０４５号公報に記載されている。
まず、上記コアシェル型粒子を、３−アミノプロピルトリエトキシシランのようなアミノ基を有するシランカップリング剤を用いて表面処理し、アミノプロピル基をコアシェル型粒子に導入する。導入されたアミノプロピル基はアンカー部位として機能する。３−アミノプロピルトリエトキシシラン以外のシランカップリング剤としては、６−アミノヘキシルアルコキシシラン、６−アミノヘキシルハロゲノシラン、３−アミノプロピルトリハロゲノシランなどが挙げられる。３−アミノプロピルハロゲノシランの好ましい例としては、３−アミノプロピルトリクロロシランが挙げられる。
上記のキラル部位とアンカー部位との間にさらにサブアンカー部位として−ＮＨ−（ＣＨ₂）n−ＣＯ−を導入する。ここで、ｎは５以上、好ましくは５〜１０である。ｎが５未満であると充填剤の分離能が低下する。一方、ｎが１０を越えると分子識別に不要な疎水基間の相互作用およびキラル部位間の相互作用が増大し分離能が低下する。
上記サブアンカー部位を構成するために用いる化合物として、アミノアルカン酸が挙げられる。このアミノアルカン酸をメチルエステルのようなエステルで保護する操作を行う。
次に上記本発明にかかるアミノ酸類とＮ−ヒドロキシコハク酸イミドのようなカルボン酸の活性化試薬とを反応させてエステル化を行う。これと、上記でエステル化を行ったアミノアルカン酸のメチルエステルとを反応させ、キラル部位とサブアンカー部位とを結合させる。そして、サブアンカー部位のカルボキシル基とアンカー部位のアミノ基とを反応させることで、上記本発明にかかるアミノ酸類をコアシェル型粒子に化学結合により担持させることができる。

【0079】

上記コアシェル型粒子に対する上記本発明にかかるアミノ酸類の担持量は、コアシェル型粒子１００重量部に対して１．０〜２５重量部であることが好ましい。

【0080】

本発明の分離剤は、リガンドとして光学活性なものを用いる場合には、光学異性体用の分離剤として用いることができ、リガンドとして光学活性のないものを用いる場合には、アフィニティークロマトグラフィー用の分離剤として用いることができる。これらの分離剤は、ガスクロマトグラフィー用、電気泳動用、特にキャピラリーエレクトロクロマトグラフィー用（ＣＥＣ用）、ＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）法、ＭＥＫＣ（ミセル動電クロマト）法のキャピラリーカラムの充填剤としても使用することができる。

【実施例】

【0081】

本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものはない。なお以下の例における理論段数（Ｎ）、保持係数（ｋ’）、分離係数（α）は下式で定義される。

【0082】

＜理論段数＞
Ｎ＝１６×[（保持時間）／（ピーク幅）]²
＜保持係数＞
ｋ'＝[（対掌体の保持時間）−（デッドタイム）]／（デッドタイム）
＜分離係数＞
α=（より強く保持される対掌体の保持係数）／（より弱く保持される対掌体の保持係数）
この時、デッドタイムはTri-tert-butylbenzeneの溶出時間をデッドタイムとした。

【0083】

＜実施例１＞
Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)を光架橋固定化により、２重量％担持させた充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0084】

（１）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）の合成
市販品の3,5-dichlorophenylisocyanateとセルロースをピリジン溶媒中で反応させ、白色固体（１）を得た。反応条件は非特許文献２を参考とした。

【0085】

【化6】

【0086】

（２）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（1）が物理的吸着により２重量%担持された充填剤の作製
（１）で得られたセルロース誘導体（1）０．０８１ｇを３０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液に、コアシェル型シリカゲル（株式会社クロマニックテクノロジース社製特殊カラム φ４．６cm×Ｌ１５cm（粒子径２．６μｍ、細孔直径９ｎｍ、Ｃ４コアシェル）から充填剤を抜き取り、電気炉にて６００度まで１時間で昇温、その後５時間維持し放冷後、４Ｎ塩酸に分散させ、一晩、攪拌させ、純水で洗浄、乾燥させたもの、粒子径：２．６μｍ、細孔直径9nm（カタログ値）、コアの直径１．６μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ0.5μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物））3.9gを加え、数分間の振騰攪拌を行った後に、溶剤を減圧留去させることで、Cellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（1）が２重量％担持された充填剤を作製した。

【0087】

（３）Cellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（１）が固定化により、２重量％担持させた充填剤の作製
Cellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（１）が２重量%担持された充填剤２．７６ｇをアセトニトリル/水=６０／４０ （ｖｏｌ.／ｖｏｌ.） ５００ｍＬに懸濁し、撹拌した。懸濁液を浸漬性水銀灯（Philips、HPK-125ワット、石英被包）で１０分間照射した。沈澱を濾取し、テトラヒドロフランで洗浄し、乾燥させた。

【0088】

（４）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）が固定化により、２重量％担持させた充填剤を用いた充填カラムの作製
（３）で作製された担持型充填剤をφ0.21cm×L15cmのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0089】

＜応用例１＞
＜実施例１＞で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、下記構造を有する化合物（trans-Stylbene oxide）を用いて光学異性体分離カラムのカラム性能（Ｎ値）および分離係数の評価を行った。

【0090】

【化7】

【0091】

比較例として、実施例１に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径５μm、細孔直径１２ｎｍ）にCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）を２．０重量％担持させた充填剤を用いた光学異性体分離カラムのカラム性能（ｋ'値、α値、Ｎ値）を示した。なお、評価条件は実施例1及び比較例のいずれにおいても移動相としてｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０を用い、流速を0.15mL/min.、温度を25℃に設定した。

【0092】

【表1】

【0093】

＜実施例２＞
Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)を光架橋固定化により、１０重量％担持させた充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0094】

（１）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）が物理的吸着により10重量％担持された充填剤の作製
実施例１の（１）で得られたセルロース誘導体（１）０．４ｇを４ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液を、コアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）を電気炉にて６００℃まで１時間で昇温、その後５時間維持し放冷後、４Ｎ 塩酸に分散させ、一晩、攪拌させ、純水で洗浄、乾燥させたもの）３．５ｇに均一に塗布した後に、テトラヒドロフランを減圧留去しCellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（1）が１０重量％担持された充填剤を作製した。

【0095】

（２）Cellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（１）が固定化により、１０重量％担持させた充填剤の作製
Cellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（１）が１０重量％担持された充填剤３.６ｇをアセトニトリル／水＝６０／４０ （ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）５００ｍLに懸濁し、撹拌する。懸濁液を浸漬性水銀灯（Philips、HPK-125ワット、石英被包）で１０分間照射する。沈澱を濾取し、テトラヒドロフランで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は９．５％であった。

【0096】

（３）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）が固定化により、１０重量％担持させた充填剤を用いた充填カラムの作製
（２）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0097】

＜実施例３＞
アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate) （２）を固定化させた充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0098】

（１）アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate) （２）の合成
セルロースと3,5-dichlorophenylisocyanateおよび3,5-（triethoxysilyl）propyl isocyanateを反応させて、アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（２）を得た。反応条件は、特許文献１の実施例２に記載された方法を参考に合成した。１Ｈ−ＮＭＲの結果から3,5-dichlorophenylisocyanateとアルコキシシリル基（エトキシシリル基）の導入率はそれぞれ９７．４％、２．６％であった。

【0099】

【化8】

【0100】

（２）アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（２）が物理的吸着により10重量%担持された充填剤の作製
（１）で得られたアルコキシシリル基を有するセルロース誘導体（２）0.4gを３.２ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた。その溶液を、表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）から既知の方法に従い製造）３.６ｇに均一に塗布した後に、テトラヒドロフランを減圧留去し、アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichloro phenylcarbamate)（２）が１０重量％担持された充填剤を作製した。

【0101】

（３）アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（２）を固定化させた充填剤の作製
（２）で得られた充填剤３ｇをエタノール／水／クロロトリメチルシラン（２７．５ｍL／７ｍL／０．４５ｍL）に分散し、１１０℃のオイルバスで沸騰させながら１０分間反応を行い、シリカゲル上への固定化を行った。メタノールで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は５．６％であった。

【0102】

（４）アルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（２）を固定化させた充填剤を用いた充填カラムの作製
（３）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0103】

＜実施例４＞
Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）を化学結合した充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0104】

（１）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）を化学結合した充填剤の作製
表面をアミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）を電気炉にて６００℃まで１時間で昇温、その後５時間維持し放冷後、４Ｎ 塩酸に分散させ、一晩、攪拌させ、純水で洗浄、乾燥させたものから既知の方法に従い製造）にセルロースを化学結合させた物質５ｇを、特許文献１１の実施例１に記載された方法を参考に合成した。但し、このときのセルロース仕込量を、特許文献記載量よりも５倍多くし、セルロースがコアシェル型シリカゲルに化学結合した物質を得た。得られたセルロース結合コアシェル型シリカゲル４ｇをN，N−ジメチルアセトアミド、ピリジン混合溶剤中に懸濁させ、これに３，５−ジクロロフェニルイソシアネート３．１ｇを添加し、８０℃で４８時間の反応を行った。懸濁液をろ過し、メタノールで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は０．９％であった。

【0105】

（２）Cellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）を化学結合した充填剤を用いた充填カラムの作製
（１）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0106】

＜実施例５＞
Polybutylene terephthalateを化学結合した充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0107】

（１）Polybutylene terephthalate（３）が物理的吸着により１０重量%担持された充填剤の作製
Polybutylene terephthalate（Duranex300FP）（３）０．４ｇを４ｍＬの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰＡ）に溶解させた。その溶液を、表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）から既知の方法に従い製造）３．６ｇに均一に塗布した後に、HFIPAを減圧留去し、Polybutylene terephthalate（３）が１０重量％担持された充填剤を作製した。

【0108】

（２）Polybutylene terephthalate（３）を化学結合した充填剤の作製
（１）で得られた充填剤２．５ｇを、２００℃のオーブンにて３時間反応を行い、シリカゲル上への固定化を行った。ＨＦＩＰＡで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は７．７％であった。

【0109】

（３）Polybutylene terephthalate（３）を化学結合した充填剤用いた充填カラムの作製
（２）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0110】

＜実施例６＞
Polyethylene terephthalateを化学結合した充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0111】

（１）Polyethylene terephthalate（帝人化成社製 TR8550FF）（４）が物理的吸着により10重量%担持された充填剤の作製
Polyethylene terephthalate（４）０．４ｇを１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰＡ）２．０ｍLとジクロロメタン２．０ｍLの混合溶液に溶解させた。その溶液を、表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）から既知の方法に従い製）３．６ｇに均一に塗布した後に、ＨＦＩＰＡとジクロロメタンを減圧留去し、Polyethylene terephthalate（４）が１０重量％担持された充填剤を作製した。

【0112】

（２）Polyethylene terephthalate（４）を化学結合した充填剤の作製
（１）で得られた充填剤２．５ｇを、２００℃のオーブンにて３時間反応を行い、シリカゲル上への固定化を行った。ＨＦＩＰＡで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は７．１％であった。

【0113】

（３）Polyethylene terephthalate（４）を化学結合した充填剤用いた充填カラムの作製
（２）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0114】

＜実施例７＞
(S)-[1,2-[6-(5-Carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1',2'-(3'-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-dieneを化学結合した充填剤の製造法及び充填カラムの作製法

【0115】

（１）(S)-[1,2-[6-(5-Carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1',2'-(3'-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-diene（５）の合成
キラルクラウンエーテル（５）は、特許文献１２の実施例の［００５７］〜［００６４］に記載された方法で合成した。

【0116】

【化9】

【0117】

（２）(S)-[1,2-[6-(5-Carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1',2'-(3'-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-diene（５）を化学結合した充填剤の作製
表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）から既知の方法に従い製造）１．９７ｇにキラルクラウンエーテル（５）０．２１ｇ、O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate０．１６ｇ及び Ｎ−メチルモルホリン４２μLをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍLに溶解させて加え、室温で4時間反応を行った。希塩酸／メタノール溶液、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄する。得られた充填剤をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍLに分散し、ピリジン３．２ｇ、無水酢酸１．８７ｇを加え、室温で３時間反応を行った。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノールで洗浄し、乾燥させる。元素分析の結果から担持率は７．１％であった。

【0118】

（３）(S)-[1,2-[6-(5-Carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1',2'-(3'-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-diene（５）を化学結合した充填剤を用いた充填カラムの作製
（２）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0119】

＜実施例８＞
Human serum albumin（HSA）を化学結合した充填剤の製造方法及び充填カラムの作製方法
（１）Human serum albumin（HSA）を化学結合した充填剤の作製
表面を３−アミノプロピルトリエトキシシランで処理したコアシェル型シリカゲル（Advanced Materials Technology （AMT）社製、粒子径：２．７μｍ、細孔直径：１６ｎｍ（カタログ値）、コアの直径：１．７μｍ、コアの材質：ガラス；シェルの厚さ：０．５μｍ、シェルの材質：シリカゲル（ポリアルコキシシロキサンの加水分解物）から既知の方法に従い製造）１．０ｇおよびＮ，Ｎ‘−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）１．０ｇをアセトニトリル５０ｍLに溶解させた溶液に懸濁し、３０℃で１７時間攪拌した。その溶液をろ過して、アセトニトリル、水、メタノール、アセトニトリルの順に洗浄した。ろさいを乾燥してＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性化シリカゲルを得た。
得られたＮＨＳ活性化シリカゲル０．５ｇを２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８） ２０ｍＬに入れ、ＨＳＡ（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH、 純度≧９９％）３０ｍｇを２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに溶解した溶液をｐＨ６．８に維持しながら３０分かけて掛けて加え、４℃で１７時間攪拌した。その溶液をろ過をして、水１００ｍＬで洗浄した。ろさいに塩酸グルコサミン １．４ｇを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに溶解した溶液を加え、室温で１時間攪拌した。その溶液をろ過して、水、１０％エタノール水の順に洗浄することによりＨＳＡを固定化させた充填剤を得た。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により反応ろ液中のＨＳＡを定量した結果から担持率は３．５％であった。

【0120】

（２）Human serum albumin（HSA）を化学結合した充填剤を用いた充填カラムの作製
（１）で作製された担持型充填剤をφ０．２１ｃｍ×Ｌ１５ｃｍのステンレス製カラムにスラリー充填法により、加圧、充填を行いカラムの作製を行った。

【0121】

＜応用例２＞
実施例２で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、上記で構造を示したtrans-Stylbene oxideを用いて光学異性体分離カラムのカラム性能の評価を行った。比較例１として、実施例２に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径：３μｍ、細孔直径：３０ｎｍ）にCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（１）を１０重量％担持させた充填剤（元素分析の結果から担持率は８．６％であった。）を用いた光学異性体分離カラムのカラム性能（k'値、α値、Ｎ値）を示した。なお、評価条件は実施例２及び比較例１のいずれにおいても移動相としてｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０を用い、流速を０．１５ｍＬ/ｍｉｎ．、温度を２５℃に設定した。

【0122】

＜応用例３＞
実施例３で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、trans-Stylbene oxideを用いて光学異性体分離カラムのカラム性能の評価を行った。比較例２として、実施例３に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径：３μm、細孔直径：３０ｎｍ）にアルコキシシリル基を有するCellulose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)（２）を固定化させた充填剤（元素分析の結果から担持率は４．６％であった。）を用いた光学異性体分離カラムのカラム性能（t値、α値）を示した。なお、評価条件は実施例３及び比較例２のいずれにおいても移動相としてｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝９０／１０を用い、流速を０．１５ｍＬ/ｍｉｎ．、温度を２５℃に設定した。

【0123】

【表2】

【0124】

＜応用例４＞
実施例５、６で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、以下のo-terphenyl、m-terphenyl及びp-terphenylを用いてカラム性能（t値、α１値（o-terphenylとm-terphenylの分離係数）、α２値（m-terphenylとp-terphenylの分離係数））の評価を行った。比較例３として、実施例５に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径：３μm、細孔直径：１２ｎｍ）にPolybutylene terephthalate（３）を固定化させた充填剤（元素分析の結果から担持率は８．５％であった。）を用いたカラムのカラム性能（t値、α１値、α２値）を示した。なお、評価条件は実施例５、実施例６及び比較例３のいずれにおいても移動相としてｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝１００／１を用い、流速を０．１５ｍＬ/ｍｉｎ．、温度を２５℃に設定した。

【0125】

【化10】

【0126】

【表3】

【0127】

＜応用例５＞
実施例７で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、以下の化合物（Tyrosine、Alanine、Glutamic acid、α-amino-ε-caprolactam）を用いて光学異性体分離カラムのカラム性能の評価を行った。比較例４として、実施例７に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径：３μm、細孔直径：３０ｎｍ）に(S)-[1,2-[6-(5-Carboxypentanoyl)]-(3-phenylnaphtho)]-[1',2'-(3'-phenylnaphtho)]-1,6,9,12,15,18-hexaoxa-cycloeicosa-2,4-diene（５）を化学結合した充填剤（元素分析の結果から担持率は９．１％であった。）を用いた光学異性体分離カラムのカラム性能（t値、α値）を示した。なお、評価条件は実施例７及び比較例４のいずれにおいても移動相として過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／アセトニトリル＝８０／２０を用い、流速を０．１０ｍＬ/ｍｉｎ．、温度を２５℃に設定した。

【0128】

【化11】

【0129】

【表4】

【0130】

＜応用例６＞
実施例８で作製された光学異性体分離カラムを用い、液体クロマトグラフィー法により、以下に示した化合物（Hexobarbital）を用いて光学異性体分離カラムのカラム性能の評価を行った。比較例５として、実施例８に記載の方法で全多孔型シリカゲル（粒子径：５μｍ、細孔直径：１２ｎｍ）にHuman serum albumin（HSA）を化学結合した充填剤（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により反応ろ液中のＨＳＡを定量した結果から担持率は８．０％であった。）を用いた光学異性体分離カラムのカラム性能（t値、Ｒｓ値、Ｎ値）を示した。なお、評価条件は実施例８及び比較例５のいずれにおいても移動相として１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）／２−プロパノール＝９５／５を用い、流速を０．１０ｍＬ/ｍｉｎ．、温度を２５℃に設定した。

【0131】

【化12】

【0132】

【表5】