特許 6267557 筋萎縮抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6267557

(24)【登録日】2018年1月5日

(45)【発行日】2018年1月24日

(54)【発明の名称】筋萎縮抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/18 20060101AFI20180115BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20180115BHJP

   A61K 36/23 20060101ALI20180115BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180115BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20180115BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/18

   A61P21/00

   A61K36/23

   C12N15/00 A

   A23L5/00

【請求項の数】4

【全頁数】11

(21)【出願番号】特願2014-60554(P2014-60554)

(22)【出願日】2014年3月24日

(65)【公開番号】特開2015-71585(P2015-71585A)

(43)【公開日】2015年4月16日

【審査請求日】2017年1月12日

(31)【優先権主張番号】特願2013-186461(P2013-186461)

(32)【優先日】2013年9月9日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100077562

【弁理士】

【氏名又は名称】高野 登志雄

(74)【代理人】

【識別番号】100096736

【弁理士】

【氏名又は名称】中嶋 俊夫

(74)【代理人】

【識別番号】100117156

【弁理士】

【氏名又は名称】村田 正樹

(74)【代理人】

【識別番号】100111028

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 博人

(72)【発明者】

【氏名】杉田 聡

(72)【発明者】

【氏名】原水 聡史

(72)【発明者】

【氏名】太田 宣康

(72)【発明者】

【氏名】橋爪 浩二郎

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 特開平０６−００７０７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５８−１７５４１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１０−２２６７８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１９７４０２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−１発現抑制剤。

【請求項2】

クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。

【請求項3】

クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−１発現抑制用食品組成物。

【請求項4】

クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制用食品組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、筋萎縮を抑制する筋萎縮抑制に関する。

【背景技術】

【0002】

骨格筋は人体で最大の器官であり、エネルギー代謝や糖取り込み、運動において重要な役割を果たす。ところが、一般的に、骨格筋は加齢に伴い量が減少することが知られており、超高齢化社会を迎える日本において、骨格筋量の減少を抑制することは重要な課題であると考えられる。

【0003】

これに対して、近年、医薬用の筋肉増強剤（特許文献１）や、補助食品として摂取可能な筋肉増強剤（特許文献２）が提供され始めている。

【0004】

しかしながら、特許文献１に開示の医薬用筋肉増強剤は、医薬品であるＩＧＦ−１を有効成分としており、医師の適切な指導を必要とするため、生活の質を向上するなどの医療対象とならない筋肉増強手段には用いることができない。また、この医薬品である筋肉増強剤は、高価であるため、対象者であっても、経済的な観点から、継続的に使用するには、困難がある。特許文献２に開示の筋肉増強用サプリメントは、食品成分であるアミノ酸やミネラルを有効成分としているが、レジスタンス運動と呼ばれる高負荷の運動を併用することが不可欠であり、臥床や運動不足、老化により筋肉の萎縮が生じてしまった者の筋肉を十分に回復させるのは難しい。したがって、より顕著な効果を発揮する筋肉増強技術の開発が待たれている。

【0005】

アトロジン（ａｔｒｏｇｉｎ）−１は、加齢に伴う筋量の減少をはじめとして、さまざまな筋萎縮時に発現が増加する遺伝子で（非特許文献１）、ノックアウトマウスでは筋萎縮に抵抗性を示すことから（非特許文献２）、筋萎縮において重要な役割を果たすと考えられている。したがって、アトロジン−１の発現を抑制する素材は、筋萎縮の抑制に効果的であると考えられる。

【0006】

クミン（Cuminum cyminum）は、エジプトなどを原産とするセリ科の一年草で、種子（クミンシード）は香辛料としてカレー粉等に配合され用いられている。また、漢方では胃薬として用いられる。
セイヨウワサビ（Armoracia rusticana）は、アブラナ科の耐寒性の多年草であり、古くから薬味として広く用いられ、また、本種由来の酵素ペルオキシダーゼは生化学実験で汎用されている。
しかしながら、斯かるクミンやセイヨウワサビに、アトロジン−１の発現抑制作用があること、筋萎縮抑制作用があることはこれまで全く知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特表２００５−５３４６５１号公報

【特許文献2】特開２００４−２５６５１３号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】ＦＡＳＥＢ Ｊ． １８：３９−５１， ２００４

【非特許文献2】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４： １７０４−１７０８， ２００１

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明は、アトロジン−１発現抑制作用を有し、筋萎縮抑制効果を発揮する医薬品、医薬部外品、食品、飼料、及び医薬品や食品等に配合した場合に当該効果を発揮する素材を提供することに関する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、筋萎縮の抑制に有効な成分の探索を行った結果、クミン抽出及びセイヨウワサビ抽出物に筋萎縮原因遺伝子であるアトロジン−１の遺伝子発現抑制作用があり、これが筋萎縮抑制効果を発揮し得る素材として有用であることを見出した。

【0011】

すなわち、本発明は下記（１）〜（２）に関するものである。
（１）クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−１発現抑制剤。
（２）クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。

【発明の効果】

【0012】

本発明のアトロジン−１発現抑制剤及び筋萎縮抑制剤を含む組成物は、幅広い年齢層に対して、医師の指導や高負荷の運動を必要とせず、日常の活動時における筋萎縮を抑制するための食品、医薬品、医薬部外品、飼料として有用である。特に、食品又はサプリメントによる筋萎縮抑制が可能であることから、高齢者のＱＯＬ改善に資する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】Ｆｏｘｏ１誘導性アトロジン−１プロモーター活性化に対する作用を示すグラフ。

【図2】デキサメタゾン誘導性アトロジン−１発現に及ぼす作用を示すグラフ。

【図3】尾懸垂処置による筋萎縮に対する作用を示すグラフ。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の植物である、クミンとは、別名、馬芹（ばきん、まきん、うまぜり）とも称され、セリ科のクミン（学名：Cuminum cyminum）を意味する。
セイヨウワサビとは、アブラナ科のホースラディッシュ（horseradish、学名：Armoracia rusticana）を意味する。

【0015】

本発明の植物は、全草、葉、茎、芽、花、蕾、根、根茎、種子等、又はこれらを組み合わせて使用することが可能であるが、クミンについては種子を粉砕して用いるのが好ましく、セイヨウワサビについては、根を粉砕して用いるのが好ましい。
斯かる植物は、それを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。

【0016】

抽出物としては、植物体を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出すること等公知の抽出方法により得られる各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末が挙げられる。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。

【0017】

当該抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類等が挙げられ、これらは単独又は混合物として用いることができる。このうち、水、アルコール系（アルコール類及び／又は多価アルコール類）溶剤、及び水−アルコール系混合溶剤を用いるのが好ましく、水−アルコール系混合溶剤が好ましい。さらに、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールがより好ましく、エタノールがさらに好ましい。また、多価アルコール類としてはブチレングリコールがより好ましい。
より好適な水−アルコール系混合溶剤としては、２０％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは５０％（ｖ／ｖ）以上、そして９５％（ｖ／ｖ）以下、９０％（ｖ／ｖ）以下のエタノール水溶液が挙げられる。例えば、２０〜９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液、好ましくは５０〜９５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液が挙げられる。

【0018】

本発明の植物抽出物は、例えば、植物体１質量部に対して５〜６０質量部、好ましくは５〜３０質量部の抽出溶剤を用い、４〜１００℃にて１時間〜３０日間、好ましくは７〜２１日抽出することにより行うことができる。

【0019】

上記の抽出物は、そのまま用いることもできるが、当該抽出物を希釈、濃縮若しくは凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製して用いることもできる。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。

【0020】

本発明の植物抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。

【0021】

後記実施例に示すように、本発明の植物抽出物は、アトロジン−１の発現を抑制（Ｆｏｘｏを介したアトロジン−１のプロモーター活性を抑制、及びデキサメタゾン誘導性のアトロジン−１発現を抑制）し、筋萎縮抑制作用を有する。アトロジン−１は筋肉タンパク質分解系の一つであるユビキチン・プロテアソーム分解系の律速酵素であるため、アトロジン−１の発現を抑制することは、筋肉のタンパク質分解を阻害し、筋萎縮抑制に寄与する（前記非特許文献２参照）。

【0022】

したがって、本発明の植物又はその抽出物は、アトロジン−１発現抑制剤及び筋萎縮抑制剤（以下、「アトロジン−１発現抑制剤等」という）となり得、アトロジン−１発現抑制及び筋萎縮抑制のために使用できる。例えば加齢に伴って生ずる筋萎縮を抑制するために使用できる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
また、本発明の植物又はその抽出物は、アトロジン−１発現抑制剤等を製造するために使用することができる。

【0023】

本発明において、アトロジン−１の発現抑制とは、典型的には、ｉ）アトロジン−１ ｍＲＮＡへのアトロジン−１遺伝子の転写を阻害又は抑制する、ｉｉ）アトロジン−１タンパク質へのアトロジン−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害又は抑制することが挙げられる。
より具体的には、フォークヘッド型転写因子であるＦｏｘｏを介したアトロジン−１のプロモーター活性の抑制（試験例１）、デキサメタゾン処理培養筋管細胞におけるアトロジン−１の発現抑制（試験例２）が挙げられる。
アトロジン−１プロモーターの上流にはＦｏｘｏ結合配列が存在し、Ｆｏｘｏがアトロジン−１プロモーターに直接結合することで、アトロジン−１の転写を正に調節することが知られている（Cell 117: 399-412, 2004）。また、種々の筋萎縮においてＦｏｘｏの遺伝子発現が増加すること（FEBS Lett. 536: 232-236, 2003）、さらには、筋特異的にＦｏｘｏ１を過剰発現させたＦｏｘｏ１トランスジェニックマウスの骨格筋では、筋萎縮が生じるとともに、アトロジン−１遺伝子発現の増加が認められていることから（J Biol
Chem. 279: 41114-41123, 2004）、Ｆｏｘｏを介したアトロジン−１の発現を抑制することが、筋萎縮の抑制に繋がると考えられる。また、デキサメタゾンが、骨格筋においてアトロジン−１の発現を上昇させ、筋萎縮を誘導し（Crit. Care. Med. 35: S602-S608, 2007、J. Cell Biochem. 105: 353-364, 2008）、培養筋管細胞においてもデキサメタゾン処理により、アトロジン−１の発現が上昇することから、デキサメタゾン処理培養筋管細胞におけるアトロジン−１の発現抑制は、筋萎縮抑制の指標となる。

【0024】

本発明において、「筋萎縮」とは、筋蛋白質の分解速度が合成速度を上回ることにより、筋蛋白質が減少する、もしくは筋細胞が減少し、結果的に筋量が低下することを意味する。具体的には、長期間の安静臥床や骨折等によるギプス固定、或いは微小重力暴露による筋萎縮（廃用性筋萎縮という）、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）等の疾病による進行性筋萎縮の他、加齢に伴って筋萎縮と同様の症状を呈する加齢性筋減弱症（サルコペニア）や、ガン（悪液質）、敗血症、１型糖尿病等に伴って生じる筋萎縮が包含される。したがって「筋萎縮の抑制」とは、不活動や加齢、疾病等による筋量の低下を抑制することをいう。

【0025】

本発明のアトロジン−１発現抑制剤等を含む組成物は、ヒトを含む動物に摂取又は投与した場合に筋萎縮抑制効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品、又は飼料となり、またアトロジン−１発現抑制剤等は、当該医薬品、医薬部外品、食品又は飼料に配合して使用される素材又は製剤となり得る。

【0026】

また、当該食品には、運動不足者や中高年者、ベッドレスト者等におけるアトロジン−１発現抑制剤及び筋萎縮抑制剤をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品、機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、サプリメントが包含される。

【0027】

上記医薬品の投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の製剤は、本発明の植物又はその抽出物と、他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤、本発明の植物又はその抽出物以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。また、これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与であり、経口用液体製剤は、嬌味剤、緩衝剤、安定化剤等を加えて常法により調製することができる。

【0028】

経口投与用製剤中の本発明の植物又はその抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に製剤全質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上であり、更に好ましくは１質量％以上であり、且つ１００質量％以下、好ましくは９０質量％以下である。また０．０１〜１００質量％、好ましくは０．１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。

【0029】

上記食品の形態としては、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ジュース、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）の栄養補給用組成物が挙げられる。

【0030】

種々の形態の食品は、本発明の植物又はその抽出物と、他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、本発明以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。

【0031】

また、病者用食品、例えば適当量の栄養補給が困難な高齢者やベッドレスト状態の病者に対する食品としては、経腸栄養剤等の栄養組成物の形態とすることが可能である。

【0032】

また、飼料としては、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、犬、猫等に用いるペットフード等の飼料等が挙げられ、上記食品と同様の形態に調製できる。

【0033】

当該食品又は飼料中の本発明の植物又はその抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に製剤全質量の０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上であり、更に好ましくは１質量％以上であり、且つ１００質量％以下、好ましくは９０質量％以下である。また０．０１〜１００質量％、好ましくは０．１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。

【0034】

上記医薬品又は食品の成人１人当たりの１日の投与又は摂取量は、通常、本発明の植物又はその抽出物（抽出物の乾燥物換算）として０．０１ｍｇ以上、好ましくは０．１ｍｇ以上であり、且つ１００ｍｇ以下、好ましくは１０ｍｇ以下である。また、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１〜１０ｍｇである。また、上記製剤の摂取頻度は任意であるが、１日１回〜数回に分けて摂取することが好ましい。

【0035】

投与又は摂取対象としては、筋萎縮抑制を必要とする若しくは希望する動物又はヒトであれば特に限定されないが、特に、運動不足者、ロコモティブシンドローム発症者、加齢性筋減弱症（サルコペニア）者における摂取が有効である。

【0036】

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−１発現抑制剤。
＜２＞クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
＜３＞アトロジン−１発現抑制剤を製造するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜４＞筋萎縮抑制剤を製造するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
＜５＞アトロジン−１抑制に使用するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜６＞筋萎縮抑制に使用するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
＜７＞クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによるアトロジン−１抑制方法。
＜８＞クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによる筋萎縮抑制方法。
＜９＞上記＜５＞〜＜６＞において、使用は非治療的使用である。
＜１０＞上記＜７＞〜＜８＞において、方法は非治療的方法である。
＜１１＞上記＜７＞〜＜８＞において、投与又は摂取の対象は、それぞれ筋萎縮抑制を必要とする若しくは希望する動物又はヒトである。

【実施例】

【0037】

製造例１ クミン抽出物の調製
セリ科クミン〔Ｃｕｍｉｎｕｍ ｃｙｍｉｎｕｍ〕の種子（新和物産より入手）４０ｇに、５０％エタノール水４００ｍＬを加え、室温、静置条件にて、１４日間抽出した。その後、ろ過により非抽出部と分離し、クミン５０％エタノール抽出液３２３ｍＬを得た。本抽出液の蒸発残分を測定したところ、１．６４％（ｗ／ｖ）であった。

【0038】

製造例２ セイヨウワサビ抽出物の調製
ホースラディッシュパウダー（商品名、ヤスマより入手）１０ｇに、５０％ＥｔＯＨ水溶液１００ｍＬを加え、室温、静置条件下で１週間抽出した後にろ過することで、抽出液を得た。抽出液の固形分濃度は３．７４％（ｗ／ｖ）であった。

【0039】

試験例１ Ｆｏｘｏ１誘導性アトロジン−１プロモーター活性化に対する作用
（１）マウスアトロジン−１プロモーター領域のクローニング及びレポータープラスミド構築
マウスアトロジン−１プロモーター領域としてエキソン１上流の約３．５ｋｂの長さの領域をクローニングするために、フォワードプライマー（attggtacctcggtggaaggtctctgta［配列番号１］）、リバースプライマー（attctcgagacggattgacagccaggaa［配列番号２］）を利用し、マウスＢＡＣクローン（ＲＰ２３−３９１Ｄ２；Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏａｋｌａｎｄ）を鋳型にし、ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ ＬＡ−ｔａｑ^ＴＭ；宝酒造社）を用い、９４℃１分間の後、９４℃３０秒、６０℃３０秒、及び７２℃４分のサイクルを２５回、続いて７２℃５分間の条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をクローニングベクター（ｐＧＥＭＲ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ；プロメガ社）にサブクローニングし、制限酵素（Ｋｐｎ１、Ｘｈｏ１：宝酒造社）処理によりＤＮＡ断片を調整した。調整したＤＮＡ断片をｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイト（Ｋｐｎ１／Ｘｈｏ１）に挿入し、ｐＧＬ３−アトロジン−１を得た。

【0040】

（２）マウスＦｏｘｏ１のＣＤＳのクローニング
マウスＦｏｘｏ１は、ｐＥＮＴＲ２２３．１ベクターに挿入されたＦｏｘｏ１のＣＤＳ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＬＲクロナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により挿入した。

【0041】

（３）プロモーター活性化の測定
マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）を２４穴プレートに播種し、ＤＭＥＭ培地（１０％
ウシ胎児血清）中で１日培養した。ｐＧＬ３−アトロジン−１プラスミドとウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）由来ルシフェラーゼ発現ベクターであるｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−Ｆｏｘｏ１を同時に各々トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて導入した。トランスフェクション４時間後にＤＭＥＭ（５％チャコール処理ウシ胎児血清）に交換した。さらに４時間後に無血清培地（ＤＭＥＭ）に交換し、同時に被験物質として製造例１及び２で調製した植物抽出物（クミン抽出物：終濃度０．０３２８％（ｗ／ｖ）、セイヨウワサビ抽出物：終濃度０．０７４８％（ｗ／ｖ））を添加し、２２時間培養した。
ＰＢＳにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性とし、Ｆｏｘｏ１刺激を行っていない群を１００とした際の相対値を計算した。統計は、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、有意水準はＰ＜０．０５とした。結果を図１に示す。
Ｆｏｘｏ１により、アトロジン−１のプロモーター活性は有意に増加した。クミン抽出物及びセイヨウワサビ抽出物は、Ｆｏｘｏ１による活性化を有意に抑制した。

【0042】

試験例２ デキサメタゾン誘導性アトロジン−１発現に及ぼす作用
マウス骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）をＤＭＥＭ培地（１０％ ウシ胎児血清）にて培養し、ＤＭＥＭ培地（２％ 馬血清）で分化誘導を行った。２日ごとに培地を交換し、分化誘導５日目にデキサメタゾン（Ｄｅｘ）終濃度１μＭを含む分化培地に交換し、２４時間培養した。製造例１及び２で調製した植物抽出物はデキサメタゾン添加時に、クミン抽出物については終濃度０．０３２８％（ｗ／ｖ）、セイヨウワサビ抽出物については終濃度０．０７４８％（ｗ／ｖ）で同時に添加した。デキサメタゾン処理後２４時間後にＲＮＡを回収した。
細胞のＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付のプロトコール通りに行った。
各ＲＮＡは濃度を揃えた後、６５℃で１０分間の熱処理を行い、急冷後に１μｇのＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応はＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステム社）を用いて、添付のプロトコールどおりに行った。反応後は４℃で急冷した。サンプルは使用まで−２０℃で保存した。
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社）によりリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲの反応液組成は、１０μＬ Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）、０．１μＬの１００μＭ ５’−プライマー及び３’−プライマー、４．８μＬ ｄＨ₂Ｏとして、これに５μＬのｃＤＮＡを加えて２０μＬの反応系で行い、得られた解析結果は３６Ｂ４ ｍＲＮＡの発現量を基準として補正し、相対的ｍＲＮＡ発現量として示した。用いたプライマーは表１に示した。統計は、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、有意水準はＰ＜０．０５とした。結果を図２に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

デキサメタゾン処理により、アトロジン−１の遺伝子発現は有意に増加した。クミン抽出物及びセイヨウワサビ抽出物は、デキサメタゾンによるアトロジン−１の発現増加を有意に抑制した。

【0045】

試験例３ 尾懸垂処置による筋萎縮に対する作用の評価
１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを２週間予備飼育した後、体重（約２７ｇ）が等しくなるように、コントロール−対照食群（ｎ＝８）、尾懸垂−対照食群（ｎ＝９）、尾懸垂−クミン食群（ｎ＝７）、尾懸垂-セイヨウワサビ食群（ｎ＝７）の４群に群わけした。
製造例１及び２で調製した植物抽出物を用いて、表２に示す組成（単位は質量％）の各食餌を作製し、各食餌で７日間飼育した後に、尾懸垂処置を施した。尾懸垂処置は、マウスの尾に両面テープなどにより針金を固定し、この針金をケージの金網に固定することにより、マウス後肢が宙に浮いた状態にさせ、７日間放置した。尾懸垂処置終了後、マウス後肢のヒラメ筋重量を測定した。なお、尾懸垂処置期間中も各食餌を自由摂餌させた。統計は、ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用い、有意水準はＰ＜０．０５とした。結果を、図３に示す。

【0046】

【表2】

【0047】

図３より、尾懸垂処置により、マウス後肢のヒラメ筋重量は減少した。クミン食摂取群では、当該尾懸垂処置によるヒラメ筋重量の減少は有意に抑制された。また、セイヨウワサビ食においても、当該尾懸垂処置によるヒラメ筋重量の減少は有意に抑制された。すなわち、クミン抽出物及びセイヨウワサビ抽出物は筋萎縮抑制作用があることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]