特許 6268181 分岐鎖状アミノ酸のＮＭＲ定量

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6268181

(24)【登録日】2018年1月5日

(45)【発行日】2018年1月24日

(54)【発明の名称】分岐鎖状アミノ酸のＮＭＲ定量

(51)【国際特許分類】

   G01N 24/08 20060101AFI20180115BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20180115BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20180115BHJP

【ＦＩ】

   G01N24/08 510Q

   G01N33/68

   G01N33/483 C

【請求項の数】36

【全頁数】36

(21)【出願番号】特願2015-536865(P2015-536865)

(86)(22)【出願日】2013年10月9日

(65)【公表番号】特表2015-537197(P2015-537197A)

(43)【公表日】2015年12月24日

(86)【国際出願番号】US2013064142

(87)【国際公開番号】WO2014059025

(87)【国際公開日】20140417

【審査請求日】2016年9月29日

(31)【優先権主張番号】61/711,471

(32)【優先日】2012年10月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/801,604

(32)【優先日】2013年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/830,784

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】13/830,199

(32)【優先日】2013年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】PCT/US2013/041274

(32)【優先日】2013年5月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】PCT/US2013/043343

(32)【優先日】2013年5月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/831,353

(32)【優先日】2013年6月5日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】PCT/US2013/044679

(32)【優先日】2013年6月7日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506140561

【氏名又は名称】リポサイエンス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107364

【弁理士】

【氏名又は名称】斉藤 達也

(72)【発明者】

【氏名】オコネル，トーマス エム．

(72)【発明者】

【氏名】メルシエ，ケリー エー．

(72)【発明者】

【氏名】シャラウロヴァ，イリナ ワイ．

(72)【発明者】

【氏名】オトボス，ジェームス ディー．

【審査官】 立澤 正樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１４３７７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３４３２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３１７３１１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１３２７５２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ２４／０８

Ｇ０１Ｎ ３３／４８３

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

静磁場Ｂ_０を有するＮＭＲ分光計内に少なくとも１つの未濾過ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清又は血漿サンプルを配置することと、
複数のＢＣＡＡに関連付けられるピークを含む前記サンプルのＮＭＲスペクトルを電子的に取得することと、
前記取得されたＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークにスカラー結合情報を適用することにより当てはめを容易にすることと、
定義された曲線当てはめ関数を用いて前記ＮＭＲスペクトルをデコンボリューションすることと、
其々のＢＣＡＡに関連付けられる前記デコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算することと、次いで、
前記計算された強度シグナルの値と、対応するＢＣＡＡの既知濃度との其々の相関を用いて、複数のＢＣＡＡの濃度を電子的に計算することと、
を含む、ＢＣＡＡ濃度の決定方法。

【請求項2】

前記濃度を電子的に計算することが、少なくとも正常生物学的範囲に渡り濃度に関連付けられる其々の定義された線形式を用いて複数のＢＣＡＡの其々に対して実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

各サンプル其々の各ＮＭＲスペクトルに対して、前記デコンボリューションする前に、前記ＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つの参照ピークを電子的に評価して、磁場不均一性の評価及び／又は適切な当てはめ関数若しくはその線幅の選択を行うことを更に含み、前記少なくとも１つの参照ピークの線幅及び／又は線形状が、磁場Ｂ_０の不均一性及び／又は均一性に関連付けられる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記デコンボリューションする前に、各サンプルに対して、Ｂ_０の均一性に依存する形状特性を有する其々のサンプル中に存在する少なくとも１つの内因性又は外因性の参照ピークの位置、線形状、及び／又は線幅を電子的に決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記デコンボリューションする工程の前に、其々のサンプルに対して、少なくとも１つの参照ピークを用いて、各ＮＭＲスペクトルの線形状及び／又は線幅の特性を計算により決定して、其々の個別のＮＭＲスペクトルに関連付けられる磁場均一性特性の差を補正することと、次いで、（ａ）異なる当てはめ関数及び／又は（ｂ）異なる線幅を用いて異なるサンプルを異なる形で評価できるように、前記少なくとも１つの参照ピークに対応する線幅及び／又は線形状の当てはめ関数を有する定義されたデコンボリューションモデルを選択することとを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記スカラー結合情報が、磁場強度に関係なく、ヘルツ単位で測定したときに一定の距離だけ分離される多重ピークを同定し、且つ前記デコンボリューションすることが、前記距離又はその近傍に分離距離を拘束することにより前記当てはめを拘束可能な当てはめ関数を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記濃度を電子的に計算することが、各ＢＣＡＡに対して、濃度対無単位強度シグナル相関の線形関数として定義されたスカラー濃度値を適用することを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項8】

前記ＢＣＡＡが、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み、且つ前記デコンボリューションすることが、タンパク質成分及びリポタンパク質成分を用いて当てはめられたベースラインを用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記デコンボリューションする前に、前記サンプルの内因性又は外因性のアナライト又は成分に関連付けられる得られたＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つのｐＨ化学シフト不変参照ピークを電子的に評価することと、次いで、前記ＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークの位置を決定することとを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記電子的に取得することが、単一ＮＭＲスペクトル／サンプルに対して約１０秒間〜５分間のＮＭＲ取得時間（ＡＴ）を用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記電子的に取得することが、其々のサンプルＮＭＲスペクトルに対して約１６〜９６スキャンで実施され、且つ前記ＢＣＡＡ濃度を電子的に計算することが、単一ＮＭＲスペクトル／サンプルを用いて実施される、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記サンプル中のリポタンパク質及びタンパク質のシグナルを低分子ＢＣＡＡのシグナルよりも大幅に減衰するパルスシーケンスを送信することを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記パルスシーケンスが、前記リポタンパク質及びタンパク質のシグナルを減衰する定義された遅延を有するカー・パーセル・メイブーム・ギル（ＣＰＭＧ）パルスシーケンスを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＰＭＧパルスシーケンスが約６０ｍｓ〜約４００ｍｓの遅延を有する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＣＰＭＧパルスシーケンスが約１００ｍｓの遅延を有する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＣＰＭＧパルスシーケンスが約２００ｍｓの遅延を有し、前記方法が、前記ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられる前記ＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる前記計算された濃度の定量誤差を電子的に補正することを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記ＣＰＭＧパルスシーケンスが約３００ｍｓの遅延を有し、前記方法が、前記ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられる前記ＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる前記計算された濃度の定量誤差を電子的に補正することを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

前記ＣＰＭＧパルスシーケンスが約４００ｍｓの遅延を有し、前記方法が、前記ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられる前記ＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる前記計算された濃度の定量誤差を電子的に補正することを更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

前記方法が、第１のリポタンパク質パルスシーケンスを送信して、前記サンプルが前記ＮＭＲ分光計内に存在する間に前記サンプル中のリポタンパク質及びタンパク質に関連付けられる第１のＮＭＲスペクトルを取得することと、前記ＢＣＡＡのＮＭＲスペクトルを取得すべく前記第１のパルスシーケンスの前又は後でタンパク質及びリポタンパク質のシグナルを減衰するように構成された第２のパルスシーケンスを送信して、前記ＢＣＡＡに関連付けられるＮＭＲスペクトルを取得することとを含み、パルスシーケンス及び後続のＮＭＲスペクトルが両方共、１サンプル当たり約２分間〜約６分間のＮＭＲシグナル取得時間内で達成される、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記取得する工程の前に、其々のサンプルを前記ＮＭＲ分光計内に流入することを更に含み、且つ前記取得することが、８時間当たり約５０〜２５０個の未濾過サンプルの速度で其々のＮＭＲスペクトルを逐次取得することにより実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

前記複数のＢＣＡＡが、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み、且つバリン及びロイシンが、取得されたＮＭＲスペクトルにイソロイシンよりも少ないスキャンで関連付けられて定量される、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

バリン及びロイシンを計算する為に用いられるＮＭＲスペクトルが１６〜９６スキャンで生成され、且つイソロイシンを計算する為に用いられるＮＭＲスペクトルが９６スキャンで生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記電子的に計算することが、少なくとも正常生物学的濃度範囲の臨床関連濃度測定値を提供すべく各ＢＣＡＡに対して其々の定義された線形濃度式を用いて実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項24】

臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比又は加重指数を電子的に計算することを更に含み、前記比又は加重指数が、次のもの、即ち、（ａ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む被除数、（ｂ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む除数、又は（ｃ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む被除数及び除数の少なくとも１つを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を電子的に計算することを更に含み、前記比及び／又は加重指数が、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に、１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を電子的に計算することを更に含み、前記比及び／又は加重指数が、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に、１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つ及びアミノ酸の無単位シグナル又は濃度測定値を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

請求項１〜２６のいずれか一項に記載の工程を実施するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含む、ＢＣＡＡの測定値を提供するように構成された回路。

【請求項28】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ患者生体サンプルを評価する為のコンピュータプログラム製品であって、前記コンピュータプログラム製品が、
媒体内に組み込まれたコンピュータ可読プログラムコードを有する非一時コンピュータ可読記憶媒体
を含み、前記コンピューター可読プログラムコードが、
定義された当てはめ関数を用いて其々の未濾過患者サンプルの分岐鎖状アミノ酸（ＢＣＡＡ）ピークを有するＮＭＲスペクトルをデコンボリューションするように構成されたコンピュータ可読プログラムコードと、
其々のＢＣＡＡに関連付けられるデコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算するコンピュータ可読プログラムコードと、
無単位強度シグナルに対するＢＣＡＡの濃度を提供するように構成されたコンピュータ可読プログラムコードと、を含み、
前記ＢＣＡＡが、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み、且つ前記デコンボリューションすることが、タンパク質成分及びリポタンパク質成分を用いて当てはめられたベースラインを用いて実施される、
コンピュータプログラム製品。

【請求項29】

方法請求項２〜２６のいずれか一項を実施するように構成された、請求項２８に記載のコンピュータプログラム製品。

【請求項30】

其々のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体サンプルの少なくとも１つのＮＭＲスペクトルを取得する為のＮＭＲ分光計であって、前記ＮＭＲ分光計が静磁場Ｂ_０を有する、ＮＭＲ分光計と、
前記ＮＭＲ分光計と通信状態の少なくとも１つのプロセッサであって、前記少なくとも１つのプロセッサが、其々の生体サンプルに対して、前記取得された少なくとも１つのＮＭＲスペクトルを用いて、
定義された当てはめ関数により前記ＮＭＲスペクトルをデコンボリューションし、
其々のＢＣＡＡに関連付けられる前記デコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算し、次いで、
前記計算された強度シグナルの値と、対応するＢＣＡＡの既知濃度との其々の相関を用いて、複数のＢＣＡＡの濃度を計算するように構成される、少なくとも１つのプロセッサと、を含み、
前記ＢＣＡＡが、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み、且つ前記デコンボリューションすることが、タンパク質成分及びリポタンパク質成分を用いて当てはめられたベースラインを用いて実施される、
システム。

【請求項31】

前記少なくとも１つのプロセッサが、前記デコンボリューションする工程の前に、其々のサンプルに対して、少なくとも１つの参照ピークを用いて、各ＮＭＲスペクトルの線形状及び／又は線幅の特性を計算により決定して、其々の個別のＮＭＲスペクトルに関連付けられる磁場均一性特性の差を補正し、次いで、（ａ）異なる当てはめ関数及び／又は（ｂ）異なる線幅を用いて異なるサンプルを異なる形で評価できるように、前記少なくとも１つの参照ピークに対応する線幅及び／又は線形状の当てはめ関数を有する定義されたデコンボリューションモデルを選択するように構成される、請求項３０に記載のシステム。

【請求項32】

前記少なくとも１つのプロセッサが、ＢＣＡＡシグナルを定量すべく其々のＮＭＲスペクトルをデコンボリューションする前に、前記サンプルの内因性又は外因性のアナライト又は成分に関連付けられる其々の取得されたＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つのｐＨ化学シフト不変参照ピークを評価し、次いで、前記ＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークの位置を決定するように構成される、請求項３０に記載のシステム。

【請求項33】

前記少なくとも１つのプロセッサが、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を計算するように構成され、前記比及び／又は加重指数が、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に、１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つを含む、請求項３２に記載のシステム。

【請求項34】

前記少なくとも１つのプロセッサが、各ＢＣＡＡに対して、濃度対無単位強度シグナル相関の線形関数として定義されたスカラー濃度値を適用することにより、其々の濃度を計算する、請求項３２に記載のシステム。

【請求項35】

前記システムが、第１のリポタンパク質パルスシーケンスを送信して、前記サンプルが前記ＮＭＲ分光計内に存在する間に前記サンプル中のリポタンパク質及びタンパク質に関連付けられる第１のＮＭＲスペクトルを取得し、そして前記ＢＣＡＡのＮＭＲスペクトルを取得すべく前記第１のパルスシーケンスの前又は後でタンパク質及びリポタンパク質のシグナルを減衰するように構成された第２のパルスシーケンスを送信して、前記ＢＣＡＡに関連付けられるＮＭＲスペクトルを取得するように構成され、パルスシーケンス及び後続のＮＭＲスペクトルが両方共、１サンプル当たり約２分間〜約６分間のＮＭＲシグナル取得時間内で達成される、請求項３２に記載のシステム。

【請求項36】

前記少なくとも１つのプロセッサが、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成される、請求項３２に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１２年１０月９日出願の米国仮出願第６１／７１１，４７１号明細書及び２０１３年６月５日出願の米国仮出願第６１／８３１，３５３号明細書（それらの内容はあたかも全体が本明細書に述べられたが如く参照により本明細書に組み込まれる）に基づく特典及び優先権を主張する。本出願はまた、２０１３年３月１３日出願の米国特許出願第１３／８０１，６０４号明細書、２０１３年３月１４日出願の米国特許出願第１３／８３０，１９９号明細書、２０１３年３月１４日出願の米国特許出願第１３／８３０，７８４号明細書、２０１３年５月１６日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４１２７４号明細書、２０１３年５月３０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４３３４３号明細書、及び２０１３年６月７日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４４６７９号明細書（それらの内容はあたかも全体が本明細書に述べられたが如く参照により本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張し、且つそれらの一部継続である。

【0002】

本発明は、一般的には、ＮＭＲを用いた分岐鎖状アミノ酸の定量に関する。本発明は、ヒトの血漿又は血清のＮＭＲ分析に特に好適であり得る。

【背景技術】

【0003】

バリン、イソロイシン、及びロイシンを含む分岐鎖状アミノ酸（ＢＣＡＡ）は、代謝性疾患などの種々の疾患との関連を有し得る。また、それらは、治療的介入で及び食事サプリメントとして使用され得る。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第４，９３３，８４４号明細書

【特許文献2】米国特許第６，６１７，１６７号明細書

【特許文献3】米国特許第７，２４３，０３０号明細書

【特許文献4】米国特許第８，０１３，６０２号明細書

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】サイコギオス（Ｐｓｙｃｈｏｇｉｏｓ）ら著、２０１１年、ヒト血清メタボローム（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ）、プロス・ワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）、第６巻、第２号、ｅ１６９５７、表３、ＮＭＲにより決定された血清中代謝物の濃度（平均値±標準偏差）（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ｍｅａｎ ＋／− ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ） ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＮＭＲ）

【非特許文献2】ローソン，ＣＬ（Ｌａｗｓｏｎ，ＣＬ）、ハンソン ＲＪ（Ｈａｎｓｏｎ ＲＪ）著、最小二乗問題の解法（Ｓｏｌｖｉｎｇ Ｌｅａｓｔ Ｓｑｕａｒｅｓ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ）、エングルウッド・クリフス、ニュージャージー州（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ）、プレンティス−ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）、１９７４年

【非特許文献3】オトボス，ＪＤ（Ｏｔｖｏｓ，ＪＤ）、ジェヤラジャ，ＥＪ（Ｊｅｙａｒａｊａｈ，ＥＪ）及びベンネット，ＤＷ（Ｂｅｎｎｅｔｔ，ＤＷ）著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ）、第３７号、ｐ．３７７、１９９１年

【非特許文献4】ベッコナート，Ｏ．（Ｂｅｃｋｏｎｅｒｔ，Ｏ．）、コイン，Ｈ．Ｃ．（Ｋｅｕｎ，Ｈ．Ｃ．）、エベルス，Ｔ．Ｍ．（Ｅｂｂｅｌｓ，Ｔ．Ｍ．）ら著、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．）、２００７年、第２巻、ｐ．２６９２−２７０３

【非特許文献5】シンプソン，Ａ．Ｊ．（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ａ．Ｊ．）、ブラウン，Ｓ．Ａ．（Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ａ．）著、ジャーナル・オブ・マグネティック・レゾナンス（Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．）、２００５年、第１７５巻、ｐ．３４０−３４６

【非特許文献6】スモールコム，Ｓ．Ｈ．（Ｓｍａｌｌｃｏｍｂｅ，Ｓ．Ｈ．）、パット，Ｓ．Ｌ．（Ｐａｔｔ，Ｓ．Ｌ．）、ケイファー，Ｐ．Ａ．（Ｋｅｉｆｅｒ，Ｐ．Ａ．）著、ジャーナル・オブ・マグネティック・レゾナンス（Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．）、シリーズＡ、１９９５年、第１１７巻、ｐ．２９５−３０３

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の実施形態は、少なくとも１種の分岐状アミノ酸のＮＭＲ定量の為の方法、システム、回路、アナライザー、及びコンピュータプログラム製品を提供する。

【0007】

本発明の実施形態は、患者のｉｎ ｖｉｔｒｏ未濾過生体サンプル中の分岐鎖状アミノ酸（ＢＣＡＡ）の定量方法に関する。本方法は、生体サンプルの標的当てはめ領域を含む複合ＮＭＲスペクトルを電子的に取得することと、少なくとも１つのＢＣＡＡ当てはめ領域を有する定義されたデコンボリューションモデルを用いて複合ＮＭＲスペクトルを電子的にデコンボリューションすることと、計算当てはめ関数を用いて少なくとも１つのＢＣＣＡの尺度を電子的に生成することとを含み得る。

【0008】

本発明の実施形態は、ＢＣＡＡの濃度の決定方法を提供する。本方法は、静磁場Ｂ_０を有するＮＭＲ分光計内に少なくとも１つの未濾過ｉｎ ｖｉｔｒｏ血清又は血漿サンプルを配置することと、複数のＢＣＡＡに関連付けられるピークを含むサンプルのＮＭＲスペクトルを電子的に取得することと、定義された曲線当てはめ関数を用いてＮＭＲスペクトルをデコンボリューションすることと、其々のＢＣＡＡに関連付けられるデコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算することと、次いで、計算された強度シグナルの値と、対応するＢＣＡＡの既知濃度との其々の相関を用いて、複数のＢＣＡＡの濃度を電子的に計算することとを含む。

【0009】

濃度の電子的計算は、少なくとも正常生物学的範囲に渡り濃度に関連付けられる其々の定義された線形式を用いて複数のＢＣＡＡの其々に対して実施可能である。

【0010】

線形式はまた、任意選択で高値及び／又は低値の外れ値を含み得る。

【0011】

本方法は、デコンボリューション前に、各サンプル其々の各ＮＭＲスペクトルに対して、ＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つの参照ピークを電子的に評価して、磁場不均一性の評価及び／又はそれらの適切な当てはめ関数若しくは線幅の選択を行うことを含む。少なくとも１つの参照ピークの線幅及び／又は線形状は、磁場Ｂ_０の不均一性及び／又は均一性に関連付け可能である。

【0012】

本方法は、得られたＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークにスカラー結合情報を適用することによりデコンボリューション時に当てはめを容易にすることを含み得る。

【0013】

スカラー結合情報を用いれば、磁場強度に関係なく、ヘルツ単位で測定したときに一定の距離だけ分離される多重ピークを同定することが可能であり、デコンボリューションには、その距離又はその近傍に分離距離を拘束することにより当てはめを拘束可能な当てはめ関数を含めることが可能である。

【0014】

本方法は、デコンボリューション前に、各サンプルに対して、Ｂ_０の均一性に依存する形状特性を有する其々のサンプル中に存在する少なくとも１つの内因性又は外因性の参照ピークの位置、線形状、及び／又は線幅を電子的に決定することを含み得る。

【0015】

本方法は、デコンボリューション工程前に、其々のサンプルに対して、少なくとも１つの参照ピークを用いて、各ＮＭＲスペクトルの線形状及び／又は線幅の特性を計算により決定して、其々の個別のＮＭＲスペクトルに関連付けられる磁場均一性特性の差を補正することと、次いで、（ａ）異なる当てはめ関数及び／又は（ｂ）異なる線幅を用いて異なるサンプルを異なる形で評価できるように、少なくとも１つの参照ピークに対応する線幅及び／又は線形状の当てはめ関数を有する定義されたデコンボリューションモデルを選択することとを含み得る。

【0016】

幾つかの実施形態では、濃度の電子的計算は、各ＢＣＡＡに対して、濃度対無単位強度シグナル相関の線形関数として定義されたスカラー濃度値を適用することを含み得る。

【0017】

幾つかの実施形態では、複数のＢＣＡＡは、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み得ると共に、デコンボリューションは、タンパク質成分及びリポタンパク質成分を用いて当てはめられたベースラインを用いて実施され得る。

【0018】

本方法は、デコンボリューション前に、サンプルの内因性又は外因性のアナライト又は成分に関連付けられる得られたＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つのｐＨ化学シフト不変参照ピークを電子的に評価することと、次いで、ＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークの位置を決定することとを含み得る。

【0019】

幾つかの実施形態では、電子的取得は、単一ＮＭＲスペクトル／サンプルに対して約１０秒間〜５分間のＮＭＲ取得時間を用いて実施可能である。

【0020】

幾つかの実施形態では、電子的取得は、其々のサンプルＮＭＲスペクトルに対して約１６〜９６スキャンで実施可能であり、且つＢＣＡＡ濃度の電子的計算は、単一ＮＭＲスペクトル／サンプルを用いて実施可能である。

【0021】

本方法は、サンプル中のリポタンパク質及びタンパク質のシグナルを低分子ＢＣＡＡのシグナルよりも大幅に減衰するパルスシーケンスを送信することを含み得る。

【0022】

幾つかの実施形態では、パルスシーケンスは、リポタンパク質及びタンパク質のシグナルを減衰する定義された遅延を有するカー・パーセル・メイブーム・ギル（ＣＰＭＧ）パルスシーケンスを含み得る。

【0023】

ＣＰＭＧパルスシーケンスは、約６０ｍｓ〜約４００ｍｓの遅延を有し得る。幾つかの実施形態では、ＣＰＭＧパルスシーケンスは、約１００ｍｓの遅延を有し得る。

【0024】

幾つかの実施形態によれば、ＣＰＭＧパルスシーケンスは、約２００ｍｓの遅延を有し得ると共に、本方法は、ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられるＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる計算濃度の定量誤差を電子的に補正することを含み得る。

【0025】

幾つかの実施形態では、ＣＰＭＧパルスシーケンスは、約３００ｍｓの遅延を有し得ると共に、本方法は、ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられるＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる計算濃度の定量誤差を電子的に補正することを含み得る。

【0026】

さらなる実施形態では、ＣＰＭＧパルスシーケンスは、約４００ｍｓの遅延を有し得ると共に、本方法は、ＣＰＭＧパルスシーケンスに関連付けられるＢＣＡＡのシグナル強度の減衰に関連付けられる計算濃度の定量誤差を電子的に補正することを含み得る。

【0027】

特定の実施形態では、本方法は、第１のリポタンパク質パルスシーケンスを送信して、サンプルがＮＭＲ分光計内に存在する間にサンプル中のリポタンパク質及びタンパク質に関連付けられる第１のＮＭＲスペクトルを取得することと、ＢＣＡＡのＮＭＲスペクトルを取得すべく第１のパルスシーケンスの前又は後でタンパク質及びリポタンパク質のシグナルを減衰するように構成された第２のパルスシーケンスを送信して、ＢＣＡＡに関連付けられるＮＭＲスペクトルを取得することとを含み得る。パルスシーケンス及び後続のＮＭＲスペクトルは両方共、１サンプル当たり約２分間〜約６分間のＮＭＲシグナル取得時間内で達成可能である。

【0028】

幾つかの実施形態では、本方法は、取得工程前に其々のサンプルをＮＭＲ分光計内に流入することを含み得る。取得は、８時間当たり約５０〜２５０個の未濾過サンプルの速度で其々のＮＭＲスペクトルを逐次取得することにより実施可能である。

【0029】

幾つかの実施形態では、複数のＢＣＡＡは、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み、且つバリン及びロイシンは、取得されたＮＭＲスペクトルにイソロイシンよりも少ないスキャンで関連付けられて定量可能である。

【0030】

幾つかの実施形態では、バリン及びロイシンを計算する為に用いられるＮＭＲスペクトルは、１６〜９６スキャンで生成可能である。イソロイシンを計算する為に用いられるＮＭＲスペクトルは、９６スキャンで生成可能である。

【0031】

幾つかの実施形態では、電子的計算は、少なくとも正常生物学的濃度範囲の臨床関連濃度測定値を提供すべく各ＢＣＡＡに対して其々の定義された線形濃度式を用いて実施可能である。

【0032】

幾つかの実施形態では、第１のパルスシーケンスは、図６に示されるパルスシーケンスを含み得る。

【0033】

本方法は、幾つかの実施形態では、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比又は加重指数を電子的に計算することを含み得る。比又は加重指数は、次のもの、即ち、（ａ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む被除数、（ｂ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む除数、又は（ｃ）１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは計算濃度の少なくとも１つを含む被除数及び除数の少なくとも１つを有し得る。

【0034】

幾つかの実施形態では、本方法は、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を電子的に計算することを含み得る。比又は加重指数は、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つを含む。

【0035】

本方法は、幾つかの実施形態では、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を電子的に計算することを含み得る。但し、比及び／又は加重指数は、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に、１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つ及びアミノ酸の無単位シグナル又は濃度測定値を含む。

【0036】

本発明の特定の実施形態は、ＢＣＡＡの測定値を提供するように構成された回路に関する。回路は、本発明に係るいずれかの方法の工程を実施するように構成された少なくとも１つのプロセッサを含む。

【0037】

本発明のさらなる実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ患者生体サンプルを評価する為のコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータプログラム製品は、媒体内に組み込まれたコンピュータ可読プログラムコードを有する非一時コンピュータ可読記憶媒体を含む。コンピュータ可読プログラムコードは、定義された当てはめ関数を用いて其々の未濾過患者サンプルの分岐鎖状アミノ酸（ＢＣＡＡ）ピークを有するＮＭＲスペクトルをデコンボリューションするように構成されたコンピュータ可読プログラムコードと、其々のＢＣＡＡに関連付けられるデコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算するコンピュータ可読プログラムコードと、無単位強度シグナルに対するＢＣＡＡの濃度を提供するように構成されたコンピュータ可読プログラムコードとを含む。

【0038】

コンピュータプログラム製品は、本発明に係る１つ以上の方法を実施するように構成可能である。

【0039】

更に他の実施形態は、システムに関する。本システムは、其々のｉｎ ｖｉｔｒｏ生体サンプルの少なくとも１つのＮＭＲスペクトルを取得する為のＮＭＲ分光計であって、ＮＭＲ分光計が静磁場Ｂ_０を有する、ＮＭＲ分光計と、ＮＭＲ分光計と通信状態の少なくとも１つのプロセッサとを含む。少なくとも１つのプロセッサは、其々の生体サンプルに対して、取得された少なくとも１つのＮＭＲスペクトルを用いて、定義された当てはめ関数によりＮＭＲスペクトルをデコンボリューションし、其々のＢＣＡＡに関連付けられるデコンボリューションされたスペクトルから無単位強度シグナルを計算し、次いで、計算された強度シグナルの値と、対応するＢＣＡＡの既知濃度との其々の相関を用いて、複数のＢＣＡＡの濃度を計算するように構成される。

【0040】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つのプロセッサは、デコンボリューション工程前に、其々のサンプルに対して、少なくとも１つの参照ピークを用いて、各ＮＭＲスペクトルの線形状及び／又は線幅の特性を計算により決定して、其々の個別のＮＭＲスペクトルに関連付けられる磁場均一性特性の差を補正し、次いで、（ａ）異なる当てはめ関数及び／又は（ｂ）異なる線幅を用いて異なるサンプルを異なる形で評価できるように、少なくとも１つの参照ピークに対応する線幅及び／又は線形状の当てはめ関数を有する定義されたデコンボリューションモデルを選択するように構成可能である。

【0041】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つのプロセッサは、ＢＣＡＡシグナルを定量すべく其々のＮＭＲスペクトルをデコンボリューションする前に、サンプルの内因性又は外因性のアナライト又は成分に関連付けられる其々の取得されたＮＭＲスペクトル中の少なくとも１つのｐＨ化学シフト不変参照ピークを評価し、次いで、ＮＭＲスペクトル中のＢＣＡＡピークの位置を決定するように構成可能である。

【0042】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つのプロセッサは、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する比及び／又は加重指数を電子的に計算するように構成可能である。比及び／又は加重指数は、除数若しくは被除数又は除数及び被除数の両方に１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル又は計算濃度の少なくとも１つを含み得る。

【0043】

少なくとも１つのプロセッサは、幾つかの実施形態では、各ＢＣＡＡに対して濃度対無単位強度シグナル相関の線形関数として定義されるスカラー濃度値を適用することにより、其々の濃度を計算可能である。

【0044】

幾つかの実施形態では、ＢＣＡＡは、バリン、イソロイシン、及びロイシンを含み得ると共に、デコンボリューションは、タンパク質成分及びリポタンパク質成分を用いて当てはめられたベースラインを用いて実施され得る。

【0045】

幾つかの実施形態では、システムは、第１のリポタンパク質パルスシーケンスを送信して、サンプルがＮＭＲ分光計内に存在する間にサンプル中のリポタンパク質及びタンパク質に関連付けられる第１のＮＭＲスペクトルを取得し、そしてＢＣＡＡのＮＭＲスペクトルを取得すべく第１のパルスシーケンスの前又は後でタンパク質及びリポタンパク質のシグナルを減衰するように構成された第２のパルスシーケンスを送信して、ＢＣＡＡに関連付けられるＮＭＲスペクトルを取得するように構成可能である。パルスシーケンス及び後続のＮＭＲスペクトルは両方共、１サンプル当たり約２分間〜約６分間のＮＭＲシグナル取得時間内で達成可能である。

【0046】

幾つかの実施形態では、少なくとも１つのプロセッサは、本発明に係るいずれかの方法を実施するように構成可能である。

【0047】

本発明のさらなる特徴、利点、及び詳細は、図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明を解読することにより、当業者であれば分かるであろう。そのような説明は、単に本発明を例示したものに過ぎない。一実施形態に対して説明された特徴は、特定的に考察されたものではない他の実施形態で組込み可能である。即ち、一実施形態に対して説明された本発明の態様は、特定的に説明されたものではない異なる実施形態に組み込まれ得ることが、留意すべき点である。即ち、すべての実施形態及び／又は任意の実施形態の特徴は、任意の方法及び／又は組合せで組合せ可能である。出願人は、最初に申請されたものではない任意の他の請求項に従属するように及び／又はその任意の特徴を組み込むように任意の最初に出願された請求項を補正できる権利を含めて、任意の最初に出願された請求項を変更する権利及び／又は任意の新しい請求項を適宜出願する権利を留保する。本発明の上記及び他の態様は、以下に示される本明細書で詳細に説明される。

【0048】

本開示に照らして当業者であれば分かるであろうが、本発明の実施形態は、方法、システム、装置、及び／又はコンピュータプログラム製品、或いはそれらの組合せを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】本発明の実施形態に係る少なくとも１種のＢＣＡＡのＮＭＲ尺度を計算する為に使用可能な例示的操作のフロー図である。

【図2】本発明の実施形態に係るバリン、イソロイシン、及びロイシンの定量当てはめの実施例を示すＮＭＲスペクトルである。

【図3A】乃至

【図3I】本発明の実施形態に係るＢＣＡＡに対する例示的線形濃度変換モデルのグラフである。

【図4】本発明の実施形態に係る標的分岐鎖状アミノ酸のメチル領域近傍の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの拡大図である。

【図5】本発明の実施形態に係る３種のＢＣＡＡに対する例示的当てはめを同一のＮＭＲスペクトル中の其々の定義されたピーク領域の拡大図として示している。

【図6】本発明の実施形態に係るＷＥＴ溶媒抑制を有する標準的「１パルス」プロトコルを用いた例示的パルスシーケンスである。

【図7】本発明の特定の実施形態に係るタンパク質やリポタンパク質などの高分子及び大アグリゲートに関連付けられるシグナルを減衰すべくＣＰＭＧ配列を含むように改変された図６の第１のパルスシーケンスを示している。

【図8】本発明の実施形態に係る其々の異なる持続遅延時間を有する一連のＣＰＭＧ取得^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。

【図9】本発明の実施形態に係る図８の一連のスペクトルの拡大図である。

【図10】本発明の実施形態に従って使用されるＢＣＡＡ評価モジュール及び／又は回路を有するシステムの概略図である。

【図11】本発明の実施形態に係るＮＭＲ分光装置の概略図である。

【図12】本発明の実施形態に係るデータ処理システムの概略図である。

【図13】本発明の実施形態に係るＢＣＡＡのＮＭＲ尺度を計算する為に使用可能な例示的操作のフロー図である。

【図14A】本発明の実施形態に係るＮＭＲバリン試験プロトコルのフロー図である。

【図14B】本発明の実施形態に従って生体サンプルのＮＭＲシグナルの取得前に使用可能な例示的前解析処理のフロー図である。

【図14C】本発明の実施形態に従ってＮＭＲを用いてバリンを評価する為に使用可能な操作のフロー図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本発明の上記及び他の目的及び態様は、以下に示される本明細書で詳細に説明される。

【0051】

次に、本発明の実施形態が示される添付の図面を参照しながら、本発明をこれ以降でより十分に説明する。然しながら、本発明は、多くの異なる形態で具現化され得るので、本明細書に示される実施形態に限定されるものとみなされるべきではない。そうではなく、これらの実施形態は、本開示が十分且つ完全になるように、而も本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように、提供されている。

【0052】

同じ数は、全体を通じて同じ要素を参照する。図中、特定の線、層、成分、要素、又は特徴部の厚さは、明確さを期して誇張されていることもある。破線は、特に明記されていない限り、任意選択の特徴又は操作を示す。

【0053】

本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、本発明を限定することを意図したものではない。本明細書で用いられる場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明確に示されてない限り、複数形をも包含ことが意図される。「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で用いられる場合、明記された特徴、整数、工程、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、成分、及び／又はそれらのグループの存在又は追加を除外しないことが、更に理解されよう。本明細書で用いられる場合、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、関連する列挙されたアイテムの１つ以上のありとあらゆる組合せを包含する。本明細書で用いられる場合、「Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」や「約Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」などの語句は、Ｘ及びＹを包含するものと解釈されるべきである。本明細書で用いられる場合、「約Ｘ〜Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」などの語句は、「約Ｘ〜約Ｙ（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｂｏｕｔ Ｘ ａｎｄ Ｙ）」を意味する。本明細書で用いられる場合、「約Ｘ〜Ｙ（ｆｒｏｍ ａｂｏｕｔ Ｘ ｔｏ Ｙ）」などの語句は、「約Ｘ〜約Ｙ（ｆｒｏｍ ａｂｏｕｔ Ｘ ｔｏ ａｂｏｕｔ Ｙ）」を意味する。

【0054】

特に定義されていない限り、本明細書で用いられる用語（科学技術用語を含む）はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。一般に使用される辞書で定義されるような用語は、本明細書の本文及び関連技術におけるそれらの意味に一致する意味を有するものと解釈されるべきであり、特に本明細書に明示的に定義されていない限り、理想化された又は過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことが、更に理解されよう。周知の機能又は構成は、簡潔さ及び／又は明確さを期して、詳細に記載されていないこともある。用語に矛盾がある場合、本明細書が優先する。

【0055】

第１、第２などの用語は、種々の要素、成分、領域、層、及び／又はセクションを記述する為に本明細書で用いられ得るが、これらの要素、成分、領域、層、及び／又はセクションは、これらの用語により限定されるべきではないことが、理解されよう。これらの用語は、１つの要素、成分、領域、層、又はセクションと、他の領域、層、又はセクションとを区別する為にのみ使用される。従って、以下で考察される第１の要素、成分、領域、層、又はセクションは、本発明の教示から逸脱することなく、第２の要素、成分、領域、層、又はセクションと称することが可能である。操作（又は工程）の順序は、特に別段の指示がない限り、請求項又は図面に提示された順序に限定されるものではない。

【0056】

「プログラムで」という用語は、コンピュータプログラム及び／又はソフトウェア、プロセッサ、又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）命令演算を用いて実施されることを意味する。「電子的」という用語及びその派生語は、精神的工程によるのではなく、電気回路及び／又は電気モジュールを備えたデバイスを用いて行われる自動操作又は半自動操作を意味し、典型的には、プログラムで実施される操作を意味する。「自動」及び「自動的」という用語は、操作が最小限の手作業若しくは手入力で又は手作業若しくは手入力なしで実施可能であることを意味する。「半自動」という用語は、オペレーターにいくらかの入力又は起動を許容するが、計算及びシグナル取得更にはイオン化成分の濃度の計算は、手入力を必要とすることなく電子的に、典型的にはプログラムで実施されることを意味する。

【0057】

本明細書で用いられる「約」という用語は、特定の値又は数±１０％（平均値）を意味する。

【0058】

本明細書で用いられる「分岐鎖状アミノ酸」及び「ＢＣＡＡ」は、次のアミノ酸：バリン、ロイシン、及びイソロイシンの少なくとも１つを意味する。当業者には公知のように、分岐鎖状アミノ酸は、分岐状アルキル基側鎖を有するアミノ酸である。バリンは、化学式：ＨＯ_２ＣＣＨ（ＮＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）_２を有する。ロイシンは、化学式：ＨＯ_２ＣＣＨ（ＮＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２を有する。イソロイシンは、化学式：ＨＯ_２ＣＣＨ（ＮＨ_２）ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３を有する。

【0059】

ＢＣＡＡをＮＭＲにより測定する場合、値は、無単位尺度の強度であり得る。同一条件下で取得された異なるサンプルのシグナル強度を直接比較できるように、強度スケールは一定である。強度は、濃度に関連付け可能である。校正データを用いて定義された換算係数をＢＣＡＡ無単位測定値に掛け算して、無単位値をμｍｏｌ／Ｌ濃度単位などの濃度単位に換算又は変換し得る。

【0060】

当てはめプロセス前に、ＢＣＡＡ測定値を実験条件に基づいて調整することが必要なこともあり得る。即ち、１種以上のＢＣＡＡの実際の濃度の評価は、標準又はベースラインの実験条件からのＮＭＲスペクトルの変動又は逸脱を引き起こす恐れのある異なる実験条件下で評価され得る其々のサンプルの強度、線幅、及び／又は線形状に基づくこともあり得る。サンプルごとに１つ以上の実際の実験条件を評価して使用するデコンボリューションモデルをカスタマイズできるように、ｉｎ ｓｉｔｕで及び／又は其々のサンプルのＮＭＲデータの取得時近傍で、１つ以上の実験条件を自動的又は電子的に決定することが可能である。

【0061】

本明細書で用いられる「実験条件」という用語は、限定されるものではないが、サンプルのｐＨ、水抑制の程度、パルスシーケンス（例えば、ＣＰＭＧ遅延）に関連付けられるＢＣＡＡピーク減衰、磁場の均一性、サンプルの調製（例えば、サンプルの適正混合及び／又はフローセルを完全に満たすようなフローセル内へのサンプルの添加）、装置のシム状態、並びにそれらの任意の組合せを含み得る。

【0062】

「ＣＡＤ」及び「ＣＨＤ」という用語は、同義的に用いられ、其々、患者又は被験者が冠動脈疾患及び／又は冠動脈心疾患を発症する又は有するリスクに対応する。心血管疾患（ＣＶＤ）という用語は、典型的にはＣＨＤ＋発作である組み合わされた転帰を意味する。

【0063】

本明細書で用いられる場合、化学シフト位置（ｐｐｍ）は、２．５１９ｐｐｍのＣａＥＤＴＡシグナルを内部参照とするＮＭＲスペクトルを意味する。従って、本明細書で考察及び／又は特許請求された記載のピーク位置は、当業者には周知のように、化学シフトをどのように生成又は参照するかに依存して変化し得る。従って、明確には、記載及び／又は特許請求されたピーク位置の幾つかは、当業者には周知のように、他の対応する化学シフトで等価な異なるピーク位置を有する。

【0064】

「生体サンプル」という用語は、ヒト又は動物のｉｎ ｖｉｔｒｏの血液、血漿、血清、ＣＳＦ、唾液、洗浄液、痰、尿、又は組織サンプルを意味する。本発明の実施形態は、ヒトの血漿、血清、又は尿の生体サンプルの評価に特に好適であり得る。血漿、血清、又は尿のサンプルは、空腹時又は非空腹時のものであり得る。本発明の特定の実施形態では、生体サンプルは、未濾過のヒト血漿又はヒト血清であり得る。

【0065】

生体サンプルは、未処理であり得る。本明細書で用いられる「未処理生体サンプル」とは、質量分析の為のサンプル調製とは異なり、取得後に生体サンプル中の成分を除去する処理に付されていない生体サンプルを意味する。従って、生体サンプルをヒト又は動物から取得した後、生体サンプルの成分は、除去されない。例えば、血清生体サンプルを取得した後、血清は、血清から成分を除去する処理に付されない。幾つかの実施形態では、未処理生体サンプルは、濾過及び／又は限外濾過プロセスに付されない。未処理生体サンプルの例は、リポタンパク質成分及びタンパク質成分及び全低分子代謝物を含有する未濾過生体サンプルである。

【0066】

当業者であれば分かるであろうが、生体サンプル中のＢＣＡＡなどの成分の同定及び／又は定量を支援する為に、及び／又は実験対照を提供する為に、当業者に公知の種々の添加剤、標準物質、及び／又は希釈剤を生体サンプルに添加し得る。然しながら、生体サンプルへの添加剤、標準物質、及び／又は希釈剤の添加は、生体サンプルを取得した後に生体サンプル中の成分の除去を引き起こす処理を意味するものでもなければ、そうした処理を含むものでもない。特定の実施形態では、生体サンプルは、未濾過生体サンプルであり、且つ希釈剤で希釈される。

【0067】

希釈剤を生体サンプルに添加してサンプル混合物を形成し得る。好適な希釈剤は、限定されるものではないが、緩衝溶液及び／又は参照若しくは校正アナライト、例えば、当業者に公知のものを含む。例示的緩衝溶液は、限定されるものではないが、酸性緩衝剤、例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、及び／又は酢酸緩衝剤を含む。幾つかの実施形態では、希釈剤は、ｐＨ緩衝剤を含み得る。「ｐＨ緩衝剤」という用語は、生体サンプルに添加されてＮＭＲスペクトル中に定義されたｐＨ誘導ＮＭＲピークシフトを形成する１種又は一群の化学物質を意味する。例示的ｐＨ緩衝剤は、限定されるものではないが、クエン酸リン酸緩衝剤（例えば、クエン酸及び第二リン酸ナトリウム、例えば、Ｃ_６Η_８Ｏ_７・Ｈ_２Ｏ及びＮａ_２ＨＰＯ_４・７Ｈ_２Ｏ）を含む。例えば、生体サンプルは、クエン酸、クエン酸ナトリウム、及び／又はリン酸ナトリウムを含むｐＨ約２．６〜約５．５のクエン酸緩衝剤及び／又はクエン酸リン酸緩衝剤を含み得る。他の例示的緩衝剤は、限定されるものではないが、酢酸、酢酸ナトリウム、及び／又はリン酸ナトリウムを含むｐＨ約３．７〜約５．５の酢酸緩衝剤及び／又は酢酸リン酸緩衝剤を含む。幾つかの実施形態では、生体サンプルは、クエン酸及び第二リン酸ナトリウムを含むクエン酸リン酸緩衝剤を含む。典型的には、ｐＨ緩衝剤は、脱イオン水と混合され、定義量でサンプルを希釈するように生体サンプルに添加される。然しながら、ｐＨ緩衝剤はまた、使用する場合、液体又は組織の生体サンプル中に直接添加され得る。幾つかの実施形態では、ＮＭＲアッセイは、４〜１０のｐＨ、例えば、限定されるものではないが、約７〜８のｐＨ又は約７．２〜７．６のｐＨを有し得るサンプル混合物（例えば、生体サンプル及び希釈剤又は希釈生体サンプル）で行われる。

【0068】

生体サンプル、希釈剤、及び／又は緩衝剤は、限定されるものではないが、アルブミン、グルコース、シトレート、アセテート、又は他の酸性化合物、更には十分に確立された化学シフト又は定量の参照アナライトのいずれか、例えば、ホルメート、トリメチルシリルプロピオネート（及び同位体標識異性体）、４，４−ジメチル−４−シラペンタン−１−スルホン酸（ＤＳＳ）、ＣａＥＤＴＡ、ＥＤＴＡなどの１つ以上を含めて、１種以上の内因性及び／又は外因性の参照アナライトを含有し得る。

【0069】

幾つかの実施形態では、生体サンプルは、少なくとも１種の内因性又は外因性の参照アナライトを含有する。例えば、参照アナライトは、内因性又は外因性のアナライトに関連付けられる１つ又は複数の参照ピークを生成可能である。内因性参照アナライトの例は、限定されるものではないが、一例として、生体サンプル中に存在するグルコースである。幾つかの実施形態では、参照アナライトは、ｐＨ安定な化学シフト又は定量のピークを有する。このことは、参照ピークのピーク領域及び／又は線幅が、４〜１０のｐＨ範囲に渡り実質的にｐＨにより変化しないこと（例えば、ピーク領域の変化が約±０．１ｐｐｍ未満であること）、又はｐＨ変化に応答して公知の又は予測可能な方式で化学シフト位置及び／又はサイズの点で変化することを意味する。

【0070】

幾つかの実施形態では、希釈剤は、参照又は校正のアナライト、例えば、限定されるものではないが、ＣａＥＤＴＡ及び／又はシトレートを含み得るか、又はそれらであり得る。

【0071】

サンプル混合物は、１０：９０〜９０：１０の範囲内の生体サンプル対希釈剤比を含み得る。特定の実施形態では、生体サンプル対希釈剤比は、５０：５０である。緩衝剤及び／又は他の添加剤、例えば、参照又は校正のアナライトが、サンプル混合物に添加され得る。特定の実施形態では、緩衝剤は、混合物中の生体サンプルの量を最大化し得る（例えば、５５：４５以上の生体サンプル対希釈緩衝剤比を提供する）。幾つかの実施形態では、少量、例えば、≦５０μＬ又は約１０μＬ〜約５０μＬの生体サンプルが分析され得ると考えられる。

【0072】

「患者」という用語は、広義に用いられ、試験又は分析の為の生体サンプルを提供する個別のヒト又は動物を意味する。

【0073】

「臨床疾患状態」という用語は、医学的介入、療法、療法の調節若しくは特定の療法（例えば、医薬剤）の除外、及び／又はモニタリングが適切であることを示唆し得る医学的リスク状態を意味する。臨床疾患状態の可能性を同定することにより、臨床医は、それに従って、病態の発生を処置、遅延、又は阻害することが可能である。臨床疾患状態の例は、限定されるものではないが、糖尿病、ＣＨＤ、ＣＶＤ、発作、２型糖尿病、前糖尿病、肝疾患、癌、癌悪液質などの代謝障害を含む。

【0074】

「ＣＰＭＧ」という用語は、カー・パーセル・メイブーム・ギルのパルスシーケンスを意味する。これは、タンパク質やリポタンパク質の粒子などの大きな急速緩和分子のシグナルを減衰する手段を提供する一連の位相定義高周波パルスである。

【0075】

単一ＮＭＲスペクトルは、定義されたパルスシーケンスに応答して生成される。例えば、１つのＮＭＲスペクトルは、１パルスシーケンスを用いて取得され、且つ／又は１つのＮＭＲスペクトルは、ＣＰＭＧパルスシーケンスを用いて取得される。典型的には、約１６〜９６スキャンなどの複数スキャン／ＮＭＲスペクトルを用いてシグナルを取得し、シグナルが改良されたシグナル対ノイズ（ＳＮＲ）を有するようにシグナル平均化プロセスを用いて関連ＮＭＲスペクトルを生成する。

【0076】

本発明の実施形態は、ＮＭＲを用いて生体サンプル中の１種以上の分岐鎖状アミノ酸（ＢＣＡＡ）を定量する為の単純で高速で便利なアッセイを提供し得る。アッセイでは、未濾過サンプルのＮＭＲスペクトルを用いて、任意選択で、参照ピークを生成すべく参照アナライトを用いて、３種すべてのＢＣＡＡの個別の定量を達成し得る。サンプルは、ＮＭＲ分光計のＢ_０静磁場の不均一性に関連付けられる線幅及び／又は線形状を評価可能な少なくとも１つの参照ピークを提供する外因性及び／又は内因性の参照アナライトを有し得る。シム状態又はＢ_０均一性／不均一性は、参照ピークを用いて、各サンプルに対して、又は其々のサンプル若しくは一群のサンプルのＮＭＲ取得時間近傍で、自動評価可能である。

【0077】

デコンボリューションモデルは、ＢＣＡＡ定量の為に各サンプルＮＭＲスペクトル其々に対して決定される参照ピークの線幅及び／又は線形状に基づいて、適切な線幅及び／又は線形状を有する計算当てはめ関数（ＣＦＦ）（例えば、曲線当てはめ関数）を選択するように構成可能である。

【0078】

生体サンプル中の２又は３種のＢＣＡＡを個別に定量し得る。

【0079】

特定の実施形態では、本発明の実施形態に係るＮＭＲアッセイは、生体サンプル中に存在する３種のＢＣＡＡの複合尺度を提供して、独立した個別のスコア又は濃度に対するバリン、イソロイシン、及びロイシンの複合無単位スコア尺度又は濃度尺度を生成し得る。

【0080】

以下の表１に示されるように、スパイク透析標準を用いて、１種以上のＢＣＡＡ、例えば、少なくともバリン及びロイシンの定量濃度測定を実施して、測定値を提供することが可能である。この校正データから、健常集団の平均濃度で１５％未満の測定パーセント変動係数（ＣＶ）（％ＣＶ）を有する濃度測定値を提供可能であると考えられる。

【0081】

【表1】

【0082】

ＢＣＡＡは、エネルギー代謝の中心成分であり得る。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態に係るＮＭＲアッセイは、少なくとも１種のＢＣＡＡと少なくとも１種のＢＣＡＡ又は一群のＢＣＡＡとの比を提供し得る。比は、定義されたＢＣＡＡの様々な組合せに基づいて生成可能であり、従って、組合せは、サンプル中に存在する１種以上のＢＣＡＡを含み得る。他の選択肢として又は追加として、本発明の実施形態に係るＮＭＲアッセイは、１種以上のＢＣＡＡと他の代謝物との比を提供し得る。比は、診断値を有し得ると共に、患者の臨床疾患状態の評価での使用及び／或いは代謝状態又は他の治療若しくは診断の情報の提供を行い得る。例えば、本発明に係る実施形態に従って、少なくとも１種のＢＣＡＡと少なくとも１種の芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及びヒスチジン）との比を取得し得ると共に、肝疾患の予測及び／若しくは診断並びに／又は肝疾患と診断された患者の治療情報の提供を行い得る。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態に従って、フィッシャー比（即ち、生体サンプル中のフェニルアラニン及びチロシンの和に対する３種すべてのＢＣＡＡの和）を計算し得る。少なくとも１種のＢＣＡＡと他の例示的代謝物との比は、限定されるものではないが、解糖及び／又はβ酸化の経路に関与するような代謝物を含む。幾つかの実施形態では、ＢＣＡＡ成分の比は、電子的に計算又は取得され得る。

【0083】

生体サンプル中の特定のＢＣＡＡの同定及び定量は、本発明の実施形態に従って達成され得る。幾つかの実施形態では、少なくとも３種のＢＣＡＡ（即ち、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）が其々の生体サンプルで同定され、生体サンプル中の３種の各ＢＣＡＡは、単一ＮＭＲスペクトルを用いて個別に定量可能である。

【0084】

他の選択肢として又は追加として、ＢＣＡＡの複合スコア又は複合濃度を生成可能である。

【0085】

幾つかの実施形態では、ＢＣＡＡの無単位のシグナル又は濃度の少なくとも１つを有する加重指数、比、又は加重指数の比を計算可能である。比及び／又は加重指数は、臨床転帰若しくは疾患リスクを予測するか又は薬剤若しくは薬剤候補物質の有効性を同定する其々の疾患の転帰の回帰分析に基づいて生成可能である。加重指数は、１種以上のＢＣＡＡの無単位シグナル若しくは測定値に他のＢＣＡＡ成分よりも多く加重することが可能であるか、又は特定の他のリスク成分と一緒に掛け算して患者の健康又はリスクのインジケータースコア又は指数を生成し得る。以下の例では、「Ｖ」はバリンを意味し、「ＩＬ」はイソロイシンを意味し、「Ｌ」はロイシンを意味する。比は、限定されるものではないが、Ｖ／（Ｌ＋ＩＬ）、Ｉ／ＩＬ、Ｖ／Ｌ、ＩＬ／Ｖ、Ｖ／（ＩＬ）、（ＶＬ）／ＩＬなどを含む。加重指数は、限定されるものではないが、例えば、Ｖ＊ＧｌｙｃＡ／Ｖ（ＩＬ）（Ｌ）、ＩＬ／Ｌ（１０）＋Ｖ、Ｖ（Ｌ）（ＩＬ）／Ｌ×１０、及びＶ／（ＩＬ×１０）を含む。

【0086】

本発明の幾つかの実施形態によれば、方法は、パルスシーケンスを用いて未濾過サンプルのＮＭＲスペクトルを取得することを含み得る（図１、ブロック１００）。パルスシーケンスにより、スペクトル中の高分子シグナル（例えば、リポタンパク質及びタンパク質のシグナル）を抑制又は減衰し得ると共に、任意選択で、パルスシーケンスを最適化し得る。本明細書で用いられる場合、「最適化」という用語は、ＮＭＲスペクトル中の高分子シグナルを減衰させて、１種以上のＢＣＡＡの定量を可能にするのに十分な程度まで、低分子ＢＣＡＡとの干渉を除去又は低減するように、パルスシーケンスが構成されることを意味する。

【0087】

高分子シグナルの抑制は、低分子（即ち、約５００ダルトン以下の分子量を有する化合物又は分子）シグナルを最大４０％（例えば、典型的には約２％〜約３０％）抑制する方式で実施され得る。少なくともより大きい減衰を得る為に、任意選択で１つ以上の定量調整因子及び／又はモデルの使用に合わせて調整できる予測可能な減衰を生成するように、抑制を生成可能である。

【0088】

特定の実施形態では、パルスシーケンスを用いたＮＭＲスペクトルは、リポタンパク質及び／又はタンパク質のシグナルを生成可能であり、且つこれらのシグナルは、ＢＣＡＡの定量を可能にするように計算により補正され得る。

【0089】

任意選択で、１つ以上の参照ピーク（例えば、２、３、４、又はそれ以上）を同定及び／又は評価して、其々のＢＣＡＡに対する１つ又は複数の標的ＢＣＡＡピークを同定及び／又は定量し得る（ブロック１１０）。参照ピークは、ｐＨ化学シフト不変参照ピークであり得る内因性及び／又は外因性の参照アナライトに関連付けられ得る。ｐＨ化学シフト「不変」参照ピークとは、約４〜約１０のｐＨに渡りｐＨ非感受性であり且つ±０．１ｐｐｍの範囲内の化学シフト位置を有するピークのことである。

【0090】

１つ以上の参照ピークを電子的に評価して、それらの位置、線形状、及び／又は線幅を決定し得る。１つ以上の参照ピークを用いて、実験条件、例えば、限定されるものではないが、サンプルｐＨ及び／又は磁場不均一性を決定し得る。各サンプルに対して１つ以上の参照ピークは決定し得ると共に、それらを用いて各サンプルＮＭＲスペクトルを評価し得る。従って、定義された計算（例えば、曲線）当てはめ関数、ＣＦＦの線幅を選択する為に、並びに／又は１つ以上のＢＣＡＡピークの位置及び／又は其々のＢＣＡＡの測定値／濃度を決定する為に、１つ以上の参照ピークを使用し得る。

【0091】

計算（例えば、曲線）当てはめモデルを用いて、ＮＭＲスペクトルをデコンボリューションし得る（ブロック１２０）。モデルは、定義された数学デコンボリューション関数を含み得る。モデルは、標的ＢＣＡＡピーク位置に対する決定された線形状及び／又は線幅を有する当てはめ関数を含み得る。モデルは、例えば、図５に示されるように、ベースライン寄与分を有する計算当てはめ関数を含み得る。当てはめ関数は、ローレンツ関数やガウス関数などの任意の好適な関数であり得る。

【0092】

幾つかの実施形態では、当てはめモデルは、ＢＣＡＡのスカラー結合を用いることを含み得る。スカラー結合とは、化学種が磁場強度に関係なくヘルツ単位で測定したときに一定距離だけ分離された多重ピークをもたらす分光学的現象のことである。当てはめ関数の分離距離をこの距離又はそのごく近傍に拘束することにより、当てはめプロセスを拘束することが可能である。

【0093】

次いで、ＢＣＡＡピーク面積に基づいてＢＣＡＡ濃度を決定し得る（ブロック１３０）。線形数式又は関連する校正線若しくはグラフ若しくはルックアップテーブルから濃度変換データを取得し得ると共に、これを用いて其々のＢＣＡＡ濃度を決定し得る。校正スペクトルは、最終アッセイで使用される条件、例えば、図３Ａ〜Ｉに示される条件と同一の分光学的条件下で取得される。図３Ａ〜Ｉに示されるように、ロイシン、バリン、及びイソロイシンの典型的な生物学的範囲は、其々、約９８．７±１１．５μＭ、２１２．３±６２．３μＭ、及び６０．７±１８．６μＭである。幾つかの実施形態では、校正データにより、核緩和の性質の小さい差、典型的には１０％未満を補正し得る。

【0094】

其々の単一ＢＣＡＡの測定値若しくは濃度を単独で或いは他のＢＣＡＡの測定値若しくは濃度又は他の代謝物の測定値又は濃度との組合せで使用して、被験者の臨床疾患状態の評価及び／或いは代謝状態又は他の治療若しくは診断の情報の提供を行い得る。幾つかの実施形態では、回帰モデルを用いて、ＢＣＡＡ成分の複合ＢＣＡＡ数又はスコア、異なるＢＣＡＡ成分の加重指数及び／又はＢＣＡＡ比を、特定の治療又は診断の転帰と相関付け得る。

【0095】

幾つかの実施形態では、パルスシーケンスは、未濾過生体サンプル中のリポタンパク質及びタンパク質を減衰するように構成可能である。一例は、ＣＰＭＧシーケンスである。生体サンプル中の他の成分（例えば、代謝物）、例えば、限定されるものではないが、他のアミノ酸（例えば、芳香族アミノ酸）、有機酸、２−ヒドロキシブチレート、ＧｌｙｃＡ、ＧｌｙｃＢ、及び／又はリポタンパク質の同定及び／又は定量もまた、本発明の実施形態に従って達成され得る。

【0096】

幾つかの実施形態では、ＢＣＡＡ及び芳香族アミノ酸の同定及び／又は定量は、約７又は約７．４のｐＨのサンプル混合物を用いて実施され得る。

【0097】

ＢＣＡＡピーク領域は、約０．８５ｐｐｍ〜１．１０ｐｐｍの範囲内であり得る（約４７℃のサンプル温度で）。約４７℃のサンプル温度でのバリン、ロイシン、及びイソロイシンのピーク位置は、図２の表に列挙され得る。

【0098】

ＮＭＲスペクトルのＢＣＡＡ領域をモデリングする際、ＢＣＡＡに対して実験モデル及び／又は合成モデルを使用し得る。ベースラインは、この領域に寄与することが知られている其々のタンパク質成分及びリポタンパク質成分のＣＰＭＧ処理実験スペクトルによりモデリングされ得る。モデルはまた、ベースライン成分を当てはめる為に、合成関数、例えば、限定されるものではないが、一次関数、二次関数、及び多項式関数を使用し得る。当てはめ法は、ローソン・ハンソン非負線形最小当てはめ法を利用して、実験スペクトルとモデルスペクトルとの最良一致を達成し得る。

【0099】

図３Ａ〜Ｉは、ＢＣＡＡの例示的解析モデルを示している。この例では、１００ｍｓ遅延ＣＰＭＧパルスシーケンスが使用された。図３Ａ〜Ｃに見られるように、ロイシン及びバリンの解析モデルは、１６スキャンに基づき、イソロイシンは、９６スキャンに基づいていた。図３Ｄ〜Ｆは、９６スキャンに基づくバリン、ロイシン、及びイソロイシンの生の面積ＮＭＲ値を示しており、図３Ｇ〜Ｉは、図３Ｄ〜Ｆでの其々のバリン、ロイシン、及びイソロイシンの値に対する変換ＮＭＲ濃度（μＭ）を示している。濃度は、各ＢＣＡＡに対する標準を割り当てた正常生物学的範囲で計算可能である。ロイシン、バリン、及びイソロイシンの典型的な生物学的範囲は、（非特許文献１）に記載されるように、其々、９８．７±１１．５μＭ、２１２．３±６２．３μＭ、及び６０．７±１８．６μＭである。

【0100】

本発明の幾つかの実施形態によれば、未濾過生体サンプル中に存在する少なくとも３種のＢＣＡＡの個別の定量は、内部又は外部の参照アナライトを必要とすることなく達成され得る。

【0101】

未濾過生体サンプル中のＢＣＡＡの正確な定量は、分光計のシミングに関連付けられるＢ_０均一性不均一性により影響され得る。従って、幾つかの実施形態では、定量は、サンプルごとにＣＦＦ又はその線幅を有するデコンボリューションモデルを選択することにより実施され得る。例えば、各サンプルに対して、スペクトル中の定義参照ピークの線幅及び／又は線形状を評価することが可能である。参照ピークは、限定されるものではないが、ＥＤＴＡピーク及び／又はシトレートピークを含み得る。

【0102】

本発明に係る実施形態に従って、少なくとも１種の分岐鎖状アミノ酸のシグネチャーを取得し得る。３種すべての分岐鎖状アミノ酸の例示的シグネチャーは、スペクトルのＢＣＡＡ領域の当てはめを示す図２に示される。図２に示されるシグネチャーは、血清対クエン酸緩衝剤（即ち、希釈剤）の７５：２５混合物から取得された。データは、約９０秒間の取得時間及び１００ｍｓのＣＰＭＧパルストレインで１６スキャンＣＰＭＧ実験を用いて収集された。モデルは、３種の各ＢＣＡＡに対する計算導出基底関数更には実験タンパク質・リポタンパク質関数を含んでいた。アミノ酸及び有機酸を始めとする代謝物のシグナルの同定及び／又は定量もまた、そのような実験から達成され得る。本発明の幾つかの実施形態によれば、本明細書に記載のＢＣＡＡの定量実験は、其々の生体サンプルの高スループット分析の為の標準的リポプロファイル（Ｌｉｐｏｐｒｏｆｉｌｅ）（登録商標）リポタンパク質分析に追加され得る。

【0103】

図４は、分岐鎖状アミノ酸のメチル領域近傍の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルの拡大図を示している。上側スペクトルは、９６スキャンで取得され、下側スペクトルは、１６スキャンで取得された。幾つかの実施形態では、ロイシン及びバリンの濃度は、イソロイシンよりも少ないスキャンで計算可能である。各ＢＣＡＡは、同一のＮＭＲスペクトルを用いて計算可能である。各ＢＣＡＡは、同一のスキャン数又は異なるスキャン数を用いて評価可能である。

【0104】

本発明の実施形態に係る生体サンプル中のＢＣＡＡの定量尺度を用いて、患者が１つ以上の定義された臨床疾患状態を有する又は発症する可能性を決定し得る。ＢＣＡＡは、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、ＣＨＤ、肝疾患する又は癌などの代謝性疾患に関連付けられ得る。従って、本発明に係るアッセイを用いて、患者の臨床疾患状態を決定し得る。幾つかの実施形態では、本発明の実施形態に係るアッセイは、患者が疾患、例えば、限定されるものではないが、代謝性疾患を発症するリスク（例えば、患者の新規発症糖尿病のリスク）を決定し得る。

【0105】

幾つかの実施形態によれば、本発明の実施形態に係るアッセイは、疾患予測及び／又は介入転帰に使用され得る。特定の実施形態では、アッセイは、患者において改良されたインスリン感受性の予測因子として及び／又は患者において血糖コントロールの改善が存在するかを決定する為に、使用され得る。他の実施形態では、アッセイは、癌患者などの患者において肝再生の向上又は患者において筋消耗の減衰が存在するかを決定する為に、使用され得る。幾つかの実施形態では、アッセイは、消耗症候群及び／又は重症炎症性疾患（例えば、敗血症、外傷、熱傷など）と診断された患者においてＢＣＡＡ補給の潜在的な利点及び／又は必要性を決定する為に、使用され得る。さらなる実施形態では、アッセイは、栄養補給でのＢＣＡＡの使用並びに／又は健康、ウェルネス、及び／若しくは運動能力の改善を指導並びに／又はモニターする為に、使用され得る。

【0106】

定義された数学デコンボリューションモデルは、ＢＣＡを定量する為に使用可能である。「複合」又は測定シグナルエンベロープＣｍは、ＢＣＡＡやリポタンパク質サブクラス成分などの他の寄与成分のシグナル寄与分を定量する為にデコンボリューション可能である。デコンボリューションは、測定シグナル形状に寄与する成分のシグナル強度を計算し、成分の和を計算する。計算シグナルＣと測定シグナルＣｍとの一致が良ければ、ＮＭＲシグナルを構成する成分がデコンボリューションによりうまくモデリングされたことが示唆される。

【0107】

曲線当てはめ関数又は技術は、本発明の実施形態に従って使用可能である。曲線当てはめでは、生体サンプルごとに異なり得る様々な基底関数セットを使用し得ると共に、それらのセットは、標的ＢＣＡＡピークに近接して存在する近接ＢＣＡＡピークを含まないか又は１つ以上含むことが可能である。

【0108】

線形状デコンボリューションは、非負最小二乗当てはめプログラム（非特許文献２）を用いて達成可能である。これは、特に低いシグナル対ノイズのスペクトルによる誤差を引き起こす負の濃度の使用を回避する。数学的には、線形状解析は、（非特許文献３）の論文にリポタンパク質に対して詳細に記載されている。また、合成ベースライン補正機能は、残留タンパク質成分からのベースラインオフセットを補正するめに使用され得る。これは、二次関数又は他の多項式関数の形態をとり得る。重み係数を決定し、実験スペクトルと計算スペクトルとの平均二乗偏差を最小限に抑えることにより、当てはめを最適化することが可能である。例えば、リポタンパク質のサブクラスを測定する為に複合ＮＭＲスペクトルをデコンボリューションすることの説明に関しては、（特許文献１）及び（特許文献２）（それらの内容はあたかも全体が本明細書に述べられたが如く参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。オーバーラップシグナル寄与分で化学成分をデコンボリューションするプロトコルの説明に関しては、（特許文献３）（その内容はあたかも全体が本明細書に述べられたが如く参照により本明細書に組み込まれる））も参照されたい。

【0109】

図５は、３種のＢＣＡＡに対する例示的計算当てはめを示している。左側のパネルは、右側のＮＭＲスペクトルの分岐状アミノ酸のメチルシグナル近傍の^１Ｈ ＮＭＲスペクトル領域の拡大図の其々のＢＣＡＡ領域を示している。各アミノ酸に対して、定量の為の１つ又は複数の標的ピークを四角で囲んだ。左側のパネルは、「実際」のスペクトル（黒色）、関連する当てはめ成分（下側）を有する「当てはめ」スペクトル（薄灰色）を示している。当てはめ成分（例えば、ガウス関数又はローレンツ関数又はその両方）は、標的アナライトの寄与分更にはタンパク質、リポタンパク質などの供給源及び公知の分光計誘導オフセットの寄与分をモデリングする実験及び／又は計算導出のピーク及び／又は関数を含有し得る。幾つかの実施形態では、当てはめ成分は、標的アナライトの寄与分更にはタンパク質やリポタンパク質などの供給源の寄与分をモデリングする実験及び計算導出のピーク及び関数を含有し得る。因子及びモデルはまた、ＤＣオフセットなどの当業者に公知の分光計誘導オフセットを提供し得る。

【0110】

パルスシーケンスパラメーターは、溶媒抑制スキーム、パルス角、及び取得時間を始めとする任意の適切なパラメーターを含み得る。然しながら、一般的に述べると、幾つかの特定の実施形態では、任意の１つの生体サンプルに対するＮＭＲシグナル取得時間／スキャンは、約２〜７秒間（平均で）、典型的には約５〜６秒間（平均で）、例えば約５．６秒間（平均で）であり得る。幾つかの実施形態では、全取得時間は、約９０秒間（平均で）又は最大約５若しくは１０分間（平均で）である。ＮＭＲ分析器は、サンプル１つ当たり４４００Ｈｚの掃引幅に渡り収集される少なくとも約１６Ｋデータ点で、生体サンプル１つ当たり少なくとも１０スキャン、典型的には１０〜２５６スキャン、例えば、１６スキャン、場合により≧９６スキャン、例えば、９６スキャン又は１２８スキャンを行って、ＢＣＡＡを測定する為に使用されるＮＭＲデータを取得するように構成され得る。ＢＣＡＡスキャンは、リポタンパク質スキャンシーケンスの前又は後で実施可能であり、典型的には、リポタンパク質の定量を可能にするように異なるパルスシーケンスを利用する。

【0111】

幾つかの実施形態では、パルスシーケンスの１つの要素は、溶媒抑制スキームであり得る。ＷＥＴ溶媒抑制スキームは、例えば約８０ｍｓに渡り、一連の形状パルス及びパルス磁場勾配を使用する。１Ｄ ＮＯＥＳＹ−ｐｒｅｓａｔスキームは、２Ｄ核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ）実験の第１の増分を使用する（非特許文献４）。このスキームでは、Ｄ１及び「混合」時間の間、水共鳴の連続低パワー周波数選択パルスが適用される。ＰＵＲＧＥ溶媒抑制スキーム（非特許文献５）では、水シグナルを減衰させる為に、水共鳴の連続低パワー周波数選択パルス、緩和勾配、及びエコーが使用される。

【0112】

３つすべてのシーケンス（及び恐らく当業者に公知の他のシーケンス）の性能は、スペクトルで一貫性のある溶媒抑制を達成するのに十分である。別の言い方をすれば、ＢＣＡＡ ＮＭＲシグナルは、ＣＰＭＧを用いて取得され得ると共に、ＷＥＴ、ＰＲＥＳＡＴ、及び／又はＰＵＲＧＥプロトコルは、パルスシーケンスの一部として組み込まれ得る。ＷＥＴシーケンスの利点の１つは、スピン拡散によりタンパク質ベースラインを撹乱する可能性のある低パワー飽和時間をなんら含まないことである。また、緩和によりシグナル減衰をもたらす可能性のある有意な遅延をなんら有していない。

【0113】

周知のように、標準的プレサチュレーション（「Ｐｒｅｓａｔ」）パルスシーケンスをパルスシーケンスで使用して、ＢＣＡＡシグナルを分析する為のＮＭＲスペクトルを取得することが可能である。このパルスシーケンスは、水共鳴を標的として数秒間持続する選択的低パワーパルスを含む。これは、ＮＭＲ規範で十分に確立されており、水シグナルを減衰させるロバストで信頼性のある方法である。

【0114】

幾つかの実施形態では、ＷＥＴ水抑制スキームを使用することが可能である。ＷＥＴシーケンスは、水共鳴を標的とする一連の短い選択的パルスを含む。全スキームは、Ｐｒｅｓａｔの場合と同様に、パルスシーケンスの前に置かれるが、例えば、約８０ｍｓを要するに過ぎない。ＷＥＴシーケンスの他の利点は、このシーケンスがタンパク質シグナルに最小限の撹乱を加えるに過ぎないという事実である。典型的なＰｒｅｓａｔシーケンスの長さに起因して、溶媒飽和の一部は、タンパク質に移行する可能性があるので、ベースラインへのタンパク質の一貫性のない寄与分をもたらす可能性がある。他の溶媒プレサチュレーションスキーム、例えば、ＰＵＲＧＥシーケンスを使用することが可能である。

【0115】

本明細書の図面の幾つかのフロー図及びブロック図は、本発明に係る解析モデル及び評価システム及び／又はプログラムの実現が可能なアーキテクチャー、機能、及び操作を例示している。これに関連して、フロー図又はブロック図の各ブロックは、特定の論理機能を実現する為の１つ以上の実行可能命令を含むモジュール、セグメント、オペレーション、又はコード部分を表している。幾つかの他の選択肢の実現形態では、ブロックに記載の機能は、図に記載の順序から外れて行われ得ることもまた留意すべきである。例えば、連続して示される２つのブロックは、事実上、実質的に同時に実施され得るか、又はブロックは、関与する機能に依存して、ときには逆の順序で実施され得る。

【0116】

図６は、ＷＥＴ溶媒抑制を有する標準的「１パルス」シーケンスを例示している。これは、高濃度のタンパク質及び高分子のアグリゲート（例えば、リポタンパク質粒子）のシグナルがスペクトルを支配するスペクトルをもたらす。より低濃度の低分子代謝物は、これらのスペクトル中ではかなり不明瞭でなる。図６に示されるように、ＷＥＴ溶媒抑制スキーム（非特許文献６）は、一連の溶媒指向選択的パルス及びパルス磁場勾配並びに続いてリードパルス及び一定の時間に渡りシグナルがデジタル化される取得時間を含む。

【0117】

図７に示される第２のシーケンスには、ＣＰＭＧパルストレイン又はシーケンスが組み込まれている。このパルストレインは、大きい急速緩和分子のシグナルが減衰する間、一連のリフォーカシングπパルス（１８０度）を含む。このパルストレインの持続時間は、ＢＣＡＡなどの低分子のシグナル強度のほとんどを維持しつつ、高分子、例えば、タンパク質及びリポタンパク質の粒子のバックグラウンドシグナルを最小限に抑えるように、最適化可能である。この値は、１００ｍｓに設定されるが、他の遅延を使用することが可能である。例えば、ＣＰＭＧパルスシーケンス遅延は、６０ｍｓ、１００ｍｓ、２００ｍｓ、３００ｍｓ、又は４００ｍｓに設定され得る。従って、図７に示されるＣＰＭＧパルストレインは、高分子のシグナルを減衰させて、多数のより多くの低分子代謝物の検出を容易にするように設計される。このパルスシーケンスは、高分子のシグナルが低分子よりもかなり速く緩和するという事実に依拠する。スピンエコートレインは、リードパルス後に発生可能であり、高分子のシグナルが緩和して平衡に戻る間、低分子磁化を維持するように設計される。このスピンエコートレインの持続時間は、高分子シグナルの減衰の程度に関係する。この遅延は、典型的には、約６０ｍｓ〜約４００ｍｓに設定される（図８）。約６０ｍｓ〜約１５０ｍｓの範囲に渡り性能の知覚可能な変化はほとんど起こらないと予想される。幾つかの場合、タンパク質及びリポタンパク質の減衰増加の利点によりシグナル対ノイズの低減が相殺されるのであれば、この遅延は、４００ｍｓ程度に長く設定することが可能である。幾つかの実施形態では、パルスシーケンスにより引き起こされるＢＣＡＡ ＮＭＲシグナルの減衰は、調整因子を用いて補正され得る。

【0118】

分子の増加（例えば、最大）シグナルを取得する為に、９０度パルスを使用することが可能であり、これらのパルス間の時間は、シグナルの縦緩和時間（Ｔ１）の１０倍超にすべきである。４００ＭＨｚでのＢＣＡＡのＴ１は、約１．５〜約３秒間の範囲内であり得る。これは、パルス長とパルス間遅延との間の妥協点が得られるように、シグナル強度を最大化する時間効率の良い手段でなくてもよい。シグナル強度とＴ１とパルス長との関係は、エルンスト角の式により与えられる。この式を使用する際の第１の工程は、全パルスシーケンスの長さを定義することである。この長さは、所要の溶媒抑制時間と、ＣＰＭＧ遅延と、ＦＩＤの所要のデジタル化を提供するのに必要とされるデータ取得時間の長さと、により定義される。エルンスト角の式は、以下の通りである。
Ｃｏｓ（θ）＝ｅｘｐ−（全遅延）／Ｔ１ 式（１）

【0119】

式（１）では、全遅延は、ｄ１遅延（溶媒抑制を含む）＋ＣＰＭＧ時間＋取得時間に等しい。Ｔ１は、対象のアナライトシグナルの縦緩和時間を表す。「全遅延」を含有する括弧の前は負符号であることが、留意すべき点である。θについて解くと最適フリップ角が得られるであろう。

【0120】

実験条件の標準セット、例えば、１秒間の溶媒抑制、１００ｍｓのＣＰＭＧ、及び約３秒間の取得時間を用いると、エルンスト角は、９０度から６０〜８０度まで低減されたチップ角（マイクロ秒単位で記載したときのパルス長としても知られる）を指定し得る。この式は、この領域内では比較的非感受性であるので、校正の小さい誤差又は特定のサンプル組成に起因するＴ１の小さい差異が有意な非効率をもたらす可能性は低い。

【0121】

取得時間（ＡＴ）は、ＦＩＤがデジタル化される時間である。ＡＴの持続時間は、定量されるシグナルの緩和時間及び所要のデジタル化の両方により決定される。検査されるシグナルの緩和時間がＡＴよりも長ければ、ＦＩＤは、トランケートされて不十分な形状を有するシグナルをもたらすであろう。上述したように、ＢＣＡＡのＴ１緩和時間は、血清中では約３秒間未満であり得るので、１スキャンの取得時間は、少なくともその長さにすべきである。分光計のデジタル化速度、即ち、１秒間の取得時間当たり取り込まれる点の数は、スペクトルの掃引幅により決定される。幾つかの実施形態では、所望のデジタル分解能では、４４００Ｈｚの掃引幅に渡り収集される少なくとも１６Ｋデータ点が使用される。

【0122】

検出感度を増加させる最も直接的な方法は、スキャン数を増加させることである。幾つかの実施形態では、ＢＣＡＡアッセイは、このアッセイをリポサイエンス社（ＬｉｐｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）（ノースカロライナ州ローリー（Ｒａｌｅｇｈ，ＮＣ））製の現在のリポプロファイル（ＬｉｐｏＰｒｏｆｉｌｅ）（登録商標）アッセイと容易にインタリーブ又は併用できるように、約４７℃のサンプルで実施可能である。然しながら、スキャン数が増加するにつれて、４７℃でのプローブ中のサンプルの滞留時間が増加して、サンプルが変性状態になる恐れがある。課題は、ＢＣＡＡピークに対して所要のシグナル対ノイズ比を達成して、所望の生物学的範囲（少なくとも有害臨床相関を有する範囲）に渡り正確且つ精密な定量を可能にすることである。

【0123】

幾つかの実施形態では、ＮＭＲアッセイは、生体サンプル中に存在する各ＢＣＡＡの個別定量及び／又は少なくとも３種のＢＣＡＡの全定量（即ち、ＢＣＡＡの定量和）を含み得ると共に、臨床的検討の為に、定量された各測定値を患者レポートで提供し得る。単一ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体サンプルでのＢＣＡＡの個別定量又は全定量により、重要な臨床情報の提供、及び／又は臨床疾患状態を有するか若しくは臨床疾患状態のリスクが増加している患者のリスクの予測若しくは評価のさらなる改良、を行い得ると考えられる。

【0124】

図８は、本発明の実施形態に係る一連のＣＰＭＧ取得^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示している。スペクトルは、タンパク質などの高分子及びリポタンパク質などの高分子アグリゲートのスペクトル寄与分を抑制するＣＰＭＧシーケンスを用いて取得され得る。図７に示されるように、ＣＭＰＧパルスシーケンスは、様々な遅延のパルストレインを含み得ると共に、その間、大分子のシグナルが減衰除去されることにより、より多くの低分子代謝物の検出が可能になる。ＣＰＭＧ遅延時間が長くなるほど、これらのシグナルの減衰が大きくなり得る。この遅延はまた、低分子シグナルを減衰し得るが、それほど有意にはならない。図９は、異なる全遅延時間を用いて取得した一連のＣＰＭＧスペクトルの拡大図を示している。拡大図は、以上の図４に示されたようにＢＣＡＡのメチル領域に重点が置かれている。ＢＣＡＡピークの全強度がそれほど影響を受けない間に、リポタンパク質領域のシグナルが有意に減衰されることに留意されたい。

【0125】

次に、図１０を参照すると、例えば、以下の図１１に対する説明及び／又は（特許文献４）（それらの内容はあたかも全体が本明細書に述べられたが如く参照により本明細書に組み込まれる）の記載のように、ＢＣＡＡの定量は、ＮＭＲ臨床アナライザー２２を備えたシステム１０を用いて実施可能であると考えられる。アナライザー２２は、分光計２２ｓ及びサンプルハンドラーシステムを含む。

【0126】

システム１０は、アナライザー２２に実装されているもの又はアナライザー２２から少なくとも部分的に離れているものであり得るＢＣＡＡ分析モジュール及び／又は回路２０を含み得る。後者の場合、分析モジュール又は回路２０は、完全に又は部分的にサーバー１５０上に存在可能である。サーバー１５０は、コンピュータネットワークを介する要求に応じたコンピュータ資源の提供を含むクラウドコンピューティングを用いて提供可能である。資源は、種々のインフラサービス（例えば、コンピュータ、記憶装置など）、更にはアプリケーション、データベース、ファイルサービス、電子メールなどとして具現化可能である。伝統的な計算モデルでは、データ及びソフトウェアは両方共、典型的には、ユーザーのコンピュータ上に完全に内蔵されるが、クラウドコンピューティングでは、ユーザーのコンピュータは、ソフトウェア又はデータをほとんど内蔵しておらず（恐らく、オペレーティングシステム及び／又はウェブブラウザー）、外部コンピュータのネットワーク上で行われるプロセスに対する単なるディスプレイ端末として機能し得る。クラウドコンピューティングサービス（又は複数のクラウド資源の集合）は、一般的には「クラウド」として参照され得る。クラウド記憶装置は、ネットワーク接続されたコンピュータデータ記憶装置のモデルを含み得る。この場合、データは、１つ以上の専用サーバー上にホストされるのではなく、複数の仮想サーバー上に記憶される。データ転送は、暗号化可能であり、ＨＩＰＡＡなどの工業規格又は規制規格に準拠した任意の適切なファイアウォールを用いてインターネットを介して実施可能である。「ＨＩＰＡＡ」という用語は、医療保険の携行性と責任に関する法律（Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｓｕｒａｎｃｅ Ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ａｃｃｏｕｎｔａｂｉｌｉｔｙ Ａｃｔ）により規定された米国の法律を意味する。患者データは、受託番号又は識別子、性別、年齢、及び試験データを含み得る。

【0127】

分析結果は、インターネットなどのコンピュータネットワークを介して、電子メールなどを介して、患者に、臨床医サイト５０に、医療保険機関５２又は薬局５１に伝送可能である。結果は、分析サイトから直接送ることが可能であるか、又は間接的に送られ得る。結果は、プリントアウトされ、従来の郵便物を介して送られ得る。この情報はまた、薬局及び／又は医療保険会社更には患者に伝送可能であり、処方箋を調べたり、又は有害イベントのリスク増加を生じる恐れのある薬剤使用を調べたりする為に、又は矛盾した医薬剤の処方箋を防止すべく医学的注意を行う為に、モニターされる。結果は、電子メールを介して患者に、「ホーム」コンピュータに、又はスマートフォンやノートパッドなどの普及したコンピュータデバイスに、送ることが可能である。結果は、例えば、全レポートのメール添付として又はテキストメッセージによる注意として存在し得る。

【0128】

次に、図１１を参照すると、選択されたサンプルの線形状の取得及び計算の為のシステム２０７が例示されている。システム２０７は、サンプルのＮＭＲ測定値を取得する為のＮＭＲ分光計２２ｓを含む。一実施形態では、分光計２２ｓは、ＮＭＲ測定がプロトンシグナルに対して約４００ＭＨｚで行われるように構成され、他の実施形態では、測定は、２００ＭＨｚ〜約９００ＭＨｚ又は他の好適な周波数で行われ得る。所望の操作磁場強度に対応する他の周波数を利用することも可能である。典型的には、プロトンフロープローブは、温度コントローラーの場合と同様に、サンプル温度を４７±０．５℃に維持するように設置される。然しながら、他のサンプル温度を取得時間時に使用してもよい。分光計２２は、デジタルコンピュータ２１４又は他のシグナル処理ユニットにより制御される。コンピュータ２１１は、高速フーリエ変換を行えることが望ましい。それはまた、他のプロセッサ又はコンピュータ２１３へのデータリンク２１２、並びにハード記憶装置ユニット２１５に接続可能なダイレクトメモリアクセスチャネル２１４を含み得る。

【0129】

デジタルコンピュータ２１１はまた、パルス制御回路及びインターフェース回路２１６を介して分光計２２ｓの操作要素に接続された一群のアナログ−デジタル変換器、デジタル−アナログ変換器、及びスローデバイスＩ／Ｏポートを含み得る。これらの要素は、デジタルコンピュータ２１１に実装可能な又はそれと通信可能な少なくとも１つのデジタルシグナルプロセッサにより指示される持続時間、周波数、及び振幅のＲＦ励起パルスを生成するＲＦトランスミッター２１７、並びにパルスを増幅してそれをサンプルセル２２０及び／又はフロープローブ２２０ｐを取り囲むＲＦ送信コイル２１９に結合するＲＦパワーアンプリファイア２１８を含む。超伝導磁石２２１により生成される９．４テスラの分極磁場の存在下で励起サンプルにより生成されるＮＭＲシグナルは、コイル２２２により受信され、ＲＦレシーバ２２３に適用される。増幅及び濾波されたＮＭＲシグナルは、２２４で復調され、得られた直交シグナルは、インターフェース回路２１６に適用され、そこでデジタル化され、デジタルコンピュータ２１１を介して入力される。リポタンパク質測定及び／又はＢＣＡＡアナライザー回路２０及び／又はモジュール３５０（図１１〜１２）は、デジタルコンピュータ２１１に関連付けられる１つ以上のプロセッサ内、及び／又はインターネット２２７などの世界的ネットワークを介してアクセス可能なサイト上若しくはリモートであり得る二次コンピュータ２１３内若しくは他のコンピュータ内に位置し得る。

【0130】

ＮＭＲデータを測定セル２２０中でサンプルから取得した後、コンピュータ２１１による処理は、所望により記憶装置２１５に記憶可能な他のファイルを生成する。この第２のファイルは、化学シフトスペクトルのデジタル表現であり、それは、後でコンピュータ２１３に読み取られ、その記憶装置２２５又は１つ以上のサーバーに関連付けられるデータベースに記憶される。メモリ中に記憶された又はコンピュータ２１３によりアクセス可能なプログラムの指示の下で、ラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ワークステーションコンピュータ、電子ノートパッド、電子タブレット、スマートフォン、又は少なくとも１つのプロセッサ若しくは他のコンピュータを備えた他のデバイスであり得るコンピュータ２１３は、本発明の教示に従って化学シフトスペクトルを処理してレポートを作成する。このレポートは、プリンタ２２６に出力され得るか、又は電子的に記憶されて所望の電子メールアドレス若しくはＵＲＬにリレーされ得る。コンピュータディスプレイスクリーン、電子ノートパッド、スマートフォンなどの他の出力デバイスもまた、結果の表示に利用され得ることは、当業者であれば分かるであろう。

【0131】

コンピュータ２１３及びその個別の記憶装置２２５により行われる機能はまた、分光計のデジタルコンピュータ２１１により行われる機能に組み込まれ得ることは、当業者には自明なはずである。そのような場合、プリンタ２２６は、デジタルコンピュータ２１１に直接接続され得る。当業者に周知のように、他のインターフェース及び出力デバイスもまた、利用され得る。

【0132】

本発明の特定の実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生体サンプルのスクリーニングの為の臨床疾患状態の自動スクリーニング試験及び／又はリスクアセスメント評価に特に有用であり得るＢＣＡＡ評価を使用する方法、システム、及び／又はコンピュータプログラム製品を提供することに関する。

【0133】

本発明の実施形態は、全ソフトウェアの実施形態又はソフトウェアの態様とハードウェアの態様とを組み合わせた実施形態の形態をとり得る。これらはすべて、本明細書では一般に「回路」又は「モジュール」として参照される。

【0134】

当業者であれば分かるであろうが、本発明は、装置、方法、データ若しくはシグナル処理システム、又はコンピュータプログラム製品として具現化され得る。従って、本発明は、全ソフトウェアの実施形態又はソフトウェアの態様とハードウェアの態様とを組み合わせた実施形態の形態をとり得る。更に、本発明の特定の実施形態は、媒体中に具現化されたコンピュータ使用可能プログラムコード手段を有するコンピュータ使用可能記憶媒体上のコンピュータプログラム製品の形態をとり得る。ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、光記憶デバイス、又は磁気記憶デバイスを含めて、任意の好適なコンピュータ可読媒体を利用し得る。

【0135】

コンピュータ使用可能又はコンピュータ可読の媒体は、限定されるものではないが、電子、磁気、光学、電磁、赤外、又は半導体のシステム、装置、デバイス、又は伝播媒体であり得る。コンピュータ可読媒体のより具体的な例（網羅的リストではないが）としては、次のもの、即ち、１つ以上のワイヤーを有する電気接続体、ポータブルコンピュータディスケット、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラマブルリードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ又はフラッシュメモリ）、光ファイバ、及びポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）が挙げられよう。プログラムは、例えば、紙又は他の媒体のオプティカルスキャニングを介して電子的に取り込まれ、次いで、必要であれば、好適な形で編集、解釈、又は他の形で処理され、次いで、コンピュータメモリに記憶可能であるので、コンピュータ使用可能又はコンピュータ可読の媒体は、更には、プログラムがプリントされた紙又は他の好適な媒体であり得ることに留意されたい。

【0136】

本発明に係る操作を行うコンピュータプログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）７、スモールトーク（Ｓｍａｌｌｔａｌｋ）、パイソン（Ｐｙｔｈｏｎ）、ラボビュー（Ｌａｂｖｉｅｗ）、Ｃ＋＋、ビジュアルベーシック（ＶｉｓｕａｌＢａｓｉｃ）などのオブジェクト指向プログラミング言語で書くことが可能である。然しながら、本発明に係る操作を行うコンピュータプログラムコードはまた、従来の手続き型プログラミング言語、例えば、「Ｃ」プログラミング言語更にはアセンブリー言語で書くことも可能である。プログラムコードは、ユーザーのコンピュータ上で完全に、ユーザーのコンピュータ上で部分的に、スタンドアロンソフトウェアパッケージとして、ユーザーのコンピュータ上で部分的に且つリモートコンピュータ上で部分的に、又はリモートコンピュータ上で完全に実施され得る。後者のシナリオでは、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）若しくは広域ネットワーク（ＷＡＮ）を介してユーザーのコンピュータに接続され得るか、又は接続は、外部コンピュータに行われ得る（例えば、インターネットサービスプロバイダーを用いたインターネットを介して）。

【0137】

図１２は、本発明の実施形態に係るシステム、方法、及びコンピュータプログラム製品を例示するデータ処理システム３０５の例示的実施形態のブロック図である。プロセッサ３１０は、アドレス／データバス３４８を介してメモリ３１４と通信する。プロセッサ３１０は、任意の市販又はカスタムのマイクロプロセッサであり得る。メモリ３１４は、データ処理システム３０５の機能を実現する為に使用されるソフトウェア及びデータを含有するメモリデバイスの全階層を表している。メモリ３１４は、限定されるものではないが、次のタイプのデバイス、即ち、キャッシュ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、ＳＲＡＭ、及びＤＲＡＭを含み得る。

【0138】

図１２に示されるように、メモリ３１４は、データ処理システム３０５で使用される複数のカテゴリーのソフトウェア及びデータ、即ち、オペレーティングシステム３５２、アプリケーションプログラム３５４、入出力（Ｉ／Ｏ）デバイスドライバ３５８、ＢＣＡＡ評価モジュール３５０、及びデータ３５６を含み得る。ＢＣＡＡ評価モジュール３５０は、ＮＭＲシグナルをデコンボリューションして、其々の生体サンプルのプロトンＮＭＲスペクトル中の定義されたＮＭＲシグナルピーク領域を明らかにし、ＢＣＡＡのレベルを同定することが可能である。システム３０５はまた、測定されたＢＣＡＡのレベルを考慮して、比、複合リスク数、又はマルチパラメーターリスクモデルを生成する臨床疾患状態評価モジュール又はリスク予測モジュールの１つ以上を含み得る。

【0139】

データ３５６は、データ取得又はシグナル取得システム３２０（例えば、ＮＭＲ分光計２２ｓ及び／又はアナライザー２２）から取得され得るシグナル（成分及び／又は複合スペクトル線形状）データ３６２を含み得る。当業者であれば分かるであろうが、オペレーティングシステム３５２は、データ処理システムと共に使用するのに好適な任意のオペレーティングシステムであり得る。例えば、インターナショナルビジネスマシーンコーポレーション（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ニューヨーク州アーモンク（Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ））製のＯＳ／２、ＡＩＸ、又はＯＳ／３９０、マイクロソフトコーポレーション（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ワシントン州レッドモンド（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ））製のＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＣＥ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴ、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００、又はＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰ、パームインコーポレーテッド（Ｐａｌｍ Ｉｎｃ．）製のＰａｌｍＯＳ、アップルコンピュータ（Ａｐｐｌｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）製のＭａｃＯＳ、ＵＮＩＸ（登録商標）、ＦｒｅｅＢＳＤ、又はＬｉｎｕｘ（登録商標）、自社開発オペレーティングシステム、又は専用オペレーティングシステム、例えば、埋込みデータ処理システムである。

【0140】

Ｉ／Ｏデバイスドライバ３５８は、典型的には、アプリケーションプログラム３５４によりオペレーティングシステム３５２を介してアクセスされるソフトウェアルーチンを含み、Ｉ／Ｏデータポート、データ記憶装置３５６、及び特定のメモリ３１４素子、及び／又は画像取得システム３２０などのデバイスと通信する。アプリケーションプログラム３５４は、データ処理システム３０５の種々の特徴を実現するプログラムの例であり、本発明の実施形態に係る操作を支援する少なくとも１つのアプリケーションを含み得る。最後に、データ３５６は、アプリケーションプログラム３５４、オペレーティングシステム３５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ３５８、及びメモリ３１４に常駐し得る他のソフトウェアプログラムにより使用される静的及び動的データを表している。

【0141】

本発明は、例えば、図１２のアプリケーションプログラムであるモジュール３５０を参照して例示されるが、当業者であれば分かるように、本発明の教示が依然として奏効する他の構成もまた、利用され得る。例えば、ＢＣＡＡモジュール３５０はまた、オペレーティングシステム３５２、Ｉ／Ｏデバイスドライバ３５８、又はデータ処理システム３０５の他のそのような論理部分に組み込まれ得る。従って、本発明は、図１２の構成に限定されるものとみなされるべきではなく、それは、本明細書に記載の操作を行うことのできる任意の構成を包含することが意図される。

【0142】

特定の実施形態では、モジュール３５０は、臨床疾患状態若しくはリスクを評価する為に、及び／又は療法介入が望ましいかを示す為に、及び／又は療法の有効性更には療法の意図されない結果を追跡する為に、マーカーとして使用され得るＢＣＡＡのレベルを提供する為のコンピュータプログラムコードを含む。

【0143】

図１３は、本発明の実施形態を実施可能な例示的操作のフロー図である。生体サンプル（例えば、血漿又は血清）の当てはめ領域のＮＭＲスペクトルの（測定）複合エンベロープＮＭＲスペクトルを取得可能である（ブロック４００）。ＮＭＲ複合シグナルエンベロープは、定義された化学シフト位置を中心とする少なくとも１つのＢＣＡＡピーク領域（例えば、約０．８５ｐｐｍと約１．１０ｐｐｍとの間）を有する定義されたモデルを用いて電子的にデコンボリューションされる（ブロック４０２）。

【0144】

其々のＢＣＡＡに関連付けられるピーク領域に対する定義された数の（例えば、ローレンツ及び／又はガウス）曲線当てはめ関数の和をとることが可能である（ブロック４１５）。和をとった関数に換算係数を適用して、ＢＣＡＡの計算測定値を生成することが可能である（ブロック４２０）。

【0145】

ＣＦＦ又はＣＦＦの線幅は、複合ＮＭＲスペクトルを取得する為に使用される分光計のシム状態の尺度に関連付けられる少なくとも１つの参照ピークの線幅に基づいて選択可能である（ブロック４１４）。

【0146】

ＢＣＡＡ測定値は、患者レポート及び／又は臨床試験レポートで提供可能である（ブロック４２２）。レポートは、臨床疾患状態を有する若しくは発症するリスクがあるか、及び／又は少なくとも部分的にＢＣＡＡ測定値に基づいて追加のスクリーニングが適切であり得るか、を同定又は警告することが可能である（ブロック４２４）。

【0147】

図１４Ａ〜１４Ｃは、本発明の実施形態に従ってバリンに関連付けられたＮＭＲシグナルを取得する為に使用可能な操作の例示的フロー図である。

【0148】

図１４Ａは、分析前評価（ブロック６１０）を行ってから、ＮＭＲシグナルのＢＣＡＡ領域、例えば、バリン領域などを決定し（ブロック６２５）、次いで、デコンボリューション（ブロック６５０）を行うことが可能であることを例示している。図１４Ｂは、完全障害（ブロック６１２）又は部分注入障害（ブロック６１３）のいずれかとしてフローセル内へのサンプルの送達検証、シミング検証（ブロック６１５）、温度検証（ブロック６１７）、及びシトレートチューブ検出（障害）（ブロック６１９）を含む例示的分析前評価６１０を示しており、すべて、サンプルに添加される定義された希釈剤に関連付けられるシグナルの定義された特性が用いられる。シミング検証は、定量シミング調整因子を適用することを含む。任意の好適な参照アナライトを用いて、分析前評価に使用する為の参照ピークを生成し得る。評価に使用される変数は、選択される参照ピークに基づいて決定されるであろう。

【0149】

再度、図１４Ａを参照すると、定義されたパラメーターが限度内にあることが確認されたら、分析前品質管理解析を終了し（ブロック６２０）、バリン領域の決定を確認し（ブロック６２５）、スペクトルをデコンボリューションし、そしてバリンレベルを計算することが可能である（ブロック６５０）。任意選択で、分析後品質管理を電子的に行って（ブロック６５５）、結果を出力することが可能である（ブロック６６０）。結果は、コメント、高又は低の視覚的表示などと共に試験レポートに組込み可能である（ブロック６６５）。

【0150】

図１４Ｃを参照すると、バリンの定量に使用可能な操作の例示的方法／分析７００が示されている。定義された添加希釈剤を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ生体サンプルのＮＭＲシグナルを電子的に取得可能である（ブロック７０２）。ＱＣ評価を実施可能である（ブロック７１０）。バリン領域を決定する（ブロック７２５）。バリン領域をデコンボリューションし（ブロック７５０ｄ）、バリンのＮＭＲ導出値を計算する（７５０ｃ）。

【0151】

希釈剤は、参照アナライト、例えば、カルシウムエチレンジアミン四酢酸（ＣａＥＤｔａ）（ブロック７０３）又は信頼性のあるピークを形成し且つ予測可能に挙動する他の好適な希釈剤などを含み得る。十分に確立された化学シフト又は定量の参照アナライトとしては、例えば、ホルメート、トリメチルシリルプロピオネート（及び同位体標識異性体）、及びＥＤＴＡが挙げられる。

【0152】

分析前品質管理評価７１０は、参照ピーク、例えば、ＣａＥＤＴＡ参照ピークなどの特性の検査に基づき得る。また、システム又はプロセッサは、図１４Ｂに示されるような指定条件下でＮＭＲスペクトルが得られない限り、バリン試験を行わないように構成可能である。サンプル温度は、ＮＭＲスキャン／シグナル取得の為のフローセル内では４７±０．５℃であり得る。サンプルは、１：１の比又は他の定義された比（例えば、より多くのサンプル、より少ない希釈剤、又はより多くの希釈剤、より少ないサンプル、例えば、２：１、又はより多くのサンプル、より少ない希釈剤、例えば、１：２）で希釈剤を含み得る（ブロック７０５）。

【0153】

いずれの取得スペクトルに対しても、ＣａＥＤＴＡ高さ＞１４０の場合、定義されたエラーコードを付けて試験サンプルを排除可能である（ブロック７１９）。この高い値は、ＣａＥＤＴＡピークと一緒にシトレートピークが検出されたことを示唆する。シトレートピークは、不適切なシトレートチューブ中への試料採取により導入される。ＣａＥＤＴＡピークの正確な位置を決める能力を撹乱することにより、シトレートピークは、バリン領域を決定するプロセスを撹乱し得る。

【0154】

バリン領域は、ＣａＥＤＴＡピークの位置に対して高磁場側に位置する。バリン下の広幅ピークは、リポタンパク質の種々のメチル（−ＣＨ_３−）プロトンである。ＣａＥＤＴＡ位置は、約２２２５８±３９８データ点で決定可能である（ブロック７２１）。バリン領域は、各取得スペクトルに対して独立して決定可能である。バリンシグナルは、好適なデータ点を用いて、例えば、四重線の各ピークに対して２５データ点（中心±１２データ点）又は両方の二重線のバリン領域に対して３００データ点を用いて、モデリング可能であるが、他の数のデータ点を使用してもよい。バリンの測定は、バリンピーク四重線の１、２、３、又は４つすべてのピークを用いて行うことが可能である。

【0155】

非負最小二乗アルゴリズムにより利用する前に、すべての基底セットスペクトルを線形補間することが可能である。非負最小二乗アルゴリズムにより利用する前に、分析対象スペクトル及び基底セットスペクトルは、ゼロベースラインオフセット補正を有し得る。

【0156】

バリン領域の開始位置は、ＣａＥＤＴＡピークの位置から約２１９６〜４３５５データ点（典型的には、両方の二重線を組み込む場合は後者）（「バリン領域オフセット」）だけ高磁場側にあり得る（ブロック７２２）。幾つかの実施形態では、バリン領域の開始位置は、ＣａＥＤＴＡピークの位置から４３５５データ点だけ高磁場側にある。幾つかの実施形態では、バリン定量は、０．０〜１．０１ｐｐｍのバリン共鳴を２つの二重線として特性付けることにより行われる。バリンシグナルをモデリングする為の基底セットとして、２データ点のステップ間隔の３つ以上のバリン実験スペクトルを使用することが可能である。中心バリンピークは、３つのバリン成分を±１５データ点スライドさせることにより位置決めし、最小二乗和最小化により決定可能である。バリンシグナルは、合計約３００データ点を用いてモデリング可能である。当てはめアルゴリズムは、実験関数又は計算導出関数の定義されたスカラー結合パターンを用いて、当てはめの拘束及び最適化を支援し得る。

【0157】

各基底セットは、ベースラインに使用されるものを含めて、但し、ＤＣオフセットを除いて、関数から最低値を引き算することにより（最小点を０に等しくなるようする）、オフセット処理される。これにより、それらが呈する形状中にＤＣオフセットが混入するのを防止する。

【0158】

一連のアナライト関数及び取得スペクトルと同一タイプの前処理が施されたベースライン関数を用いて、各取得スペクトルのバリン領域をデコンボリューションする。各成分に対するデコンボリューション係数に関連換算係数を掛け算することが可能である。得られた値の和とる。各取得スペクトルに対して独立して生成された結果値を平均して、測定に使用される最終値を生成することが可能である。

【0159】

データは、プリサチュレーンョン水抑制を用いて１：１希釈サンプルから取得可能であり、約１６スキャン、典型的には、２スキャンの８つのブロック（其々２スキャンからなる８つのＦＩＤ）として記憶された約１６スキャンを含み得る（ブロック７２６）。

【0160】

プリサチュレーンョン水抑制と併用されるパルスシーケンスは、任意選択で、プリサチュレーンョン（水抑制）パルス及び好適な励起パルスを含み得る。例えば、ＦＩＤは、４４９６．４Ｈｚの掃引幅で９０２４データ点を用いて取得可能であるが、当業者には公知のように、他のデータ点及び掃引幅を使用してもよい。各ＦＩＤに以下のシフトガウス関数を掛け算することが可能である。

【数1】

又はコンピュータ用語で、ｅｘｐ（−（（ｔ−ｇｆｓ）／ｇｆ）＾２）、但し、ｇｆｓ＝０．２秒間及びｇｆ＝０．２秒間。

【0161】

これは、１６，３８４データ点からなる各ＦＩＤに対して周波数領域ＧＭスペクトルを生成するゼロ充填フーリエ変換前に実施可能である（ブロック７２７）。各ＦＩＤに数学関数を掛け算してシグナル対ノイズ（例えば、減衰指数関数）及び／又は分解能（例えば、ガウス型関数及び／又はその任意のシフト型関数）を増加させることが可能である。スペクトルは、校正により特定された位相値を用いて位相調整可能である。スペクトルは、校正により特定されたスケーリング係数によりスケール調整可能である（掛け算）。非負最小二乗アルゴリズムにより利用する前に、すべての基底セットスペクトルを線形補間することが可能である。非負最小二乗アルゴリズムにより利用する前に、分析対象スペクトル及び基底セットスペクトルは、ゼロベースラインオフセット補正を有し得る（例えば、解析されるモデル及びスペクトルに使用される成分はすべて、線形補間可能である）（ブロック７２８）。バリン当てはめ領域の中心を決定する為に、０．９〜１．０のバリン共鳴を２つの二重線として特徴付けることが可能であり、３つのバリン成分を±１５データ点スライドさせることにより中心ピークを同定することが可能である（ブロック７２９）。

【0162】

上記は、本発明を例示したものであり、それらに限定されるとみなされるべきではない。本発明の少数の例示的実施形態を説明してきたが、本発明の新規な教示及び利点から実質的に逸脱することなく、例示的実施形態で多くの変更が可能であることは、当業者であれば分かるであろう。従って、すべてのそのような変更は、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内に包含されることが意図される。特許請求の範囲では、ミーンズプラスファンクションクレームは、使用された場合、構造的均等物だけでなく等価構造物もまた、挙げられた機能を発揮するものとして、本明細書に記載の構造物に包含されることが意図される。従って、上記は、本発明を例示したものであり、開示された特定の実施形態に限定されるとみなされるべきではなく、開示された実施形態、更には他の実施形態に対する変更は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されることを理解すべきである。本発明は、以下の請求項により規定され、請求項の均等物は、それに包含される。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】