特許 6271504 ＰＣＶ／マイコプラズマ・ハイオニューモニエ／ＰＲＲＳ混合ワクチン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6271504

(24)【登録日】2018年1月12日

(45)【発行日】2018年1月31日

(54)【発明の名称】ＰＣＶ／マイコプラズマ・ハイオニューモニエ／ＰＲＲＳ混合ワクチン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20180122BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20180122BHJP

   A61K 39/295 20060101ALI20180122BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20180122BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20180122BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20180122BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20180122BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/00 J

   A61K39/00 D

   A61K39/12

   A61K39/295

   A61K39/39

   A61P31/04 171

   A61P31/12 171

   A61P11/00

【請求項の数】18

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2015-504701(P2015-504701)

(86)(22)【出願日】2013年4月3日

(65)【公表番号】特表2015-512450(P2015-512450A)

(43)【公表日】2015年4月27日

(86)【国際出願番号】US2013035091

(87)【国際公開番号】WO2013152086

(87)【国際公開日】20131010

【審査請求日】2016年4月4日

(31)【優先権主張番号】61/620,189

(32)【優先日】2012年4月4日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】515230154

【氏名又は名称】ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100075270

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 泰

(74)【代理人】

【識別番号】100101373

【弁理士】

【氏名又は名称】竹内 茂雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】ニッツェル，グレゴリー・ピー

(72)【発明者】

【氏名】ガルビン，ジェフリー・イー

(72)【発明者】

【氏名】ギャレット，ジョン・キース

(72)【発明者】

【氏名】クラウィク，ザ・セカンド，ジェームズ・アール

(72)【発明者】

【氏名】リッカー，トレーシー・エル

(72)【発明者】

【氏名】スマッツァー，ミーガン・マリー

【審査官】 春田 由香

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２０７７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０２５６１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５１２４４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５１２４４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Okada M, et al.，Protective effect of vaccination with culture supernate of M. hyopneumoniae against experimental infection in pigs，Journal of veterinary medicine. B, Infectious diseases and veterinary public health，２０００年，Vol.47, No.7，p.527-533

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＰｕｂＭｅｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

ＣｉＮｉｉ

医中誌ＷＥＢ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の全細胞調製物の可溶性部分；ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原；ならびにブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物であって、該Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が、Ｍ．ｈｙｏ特異的可溶性タンパク質抗原を含み、そして、不溶性細胞物質から分離されており、そして、ＩｇＧ、及び、抗原／免疫グロブリンの免疫複合体の両方を実質的に含まない、前記組成物。

【請求項2】

Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が免疫原性組成物に添加される前にプロテインＡまたはプロテインＧで処理されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ＰＲＲＳウイルス抗原が遺伝子改変生ウイルスである、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が免疫原性組成物に添加される前にプロテインＡで処理されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

ＰＣＶ２抗原がキメラ１型−２型サーコウイルスの形態であり、前記のキメラウイルスがブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を発現する不活化組み換えブタサーコウイルス１型を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

ＰＣＶ２抗原が組み替えＯＲＦ２タンパク質の形態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

組み換えＯＲＦ２タンパク質がバキュロウイルスベクターから発現される、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

組成物がさらにアジュバントを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項9】

アジュバントが水中油型アジュバント、ポリマーおよび水のアジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバントおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

組成物が１回量投与として投与された際にＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

ブタをＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対して免疫化するための組成物の製造における、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物の使用。

【請求項12】

組成物を１回量で投与する、請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

組成物がＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスの少なくとも１つに対する母系由来抗体を有するブタに投与される、請求項１１又は１２に記載の使用。

【請求項14】

組成物が３週齢以上のブタに投与される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項15】

請求項１〜１０のいずれか１項の免疫原性組成物を含むワクチン組成物であって、当該組成物はさらに、薬学的に許容可能なキャリアーを含む、前記組成物。

【請求項16】

家畜地方病性肺炎、離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）、豚サーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）及びブタ生殖および呼吸症候群に対するブタの防御における使用のための、請求項１５に記載のワクチン組成物。

【請求項17】

請求項１〜１６のいずれか１項の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物を含むキットであって、
ＰＣＶ２抗原およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）全細胞調製物の可溶性部分の両方が含まれる組成物を含む第１ボトル、ここにおいて、該Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が、Ｍ．ｈｙｏ特異的可溶性タンパク質抗原を含み、そして、不溶性細胞物質から分離されており、そして、ＩｇＧ、及び、抗原／免疫グロブリンの免疫複合体の両方を実質的に含まない、
ならびに、ＰＲＲＳウイルス抗原を含む第２ボトルを含み、
そして、所望により、さらに第１ボトルの内容物を第２ボトルの内容物と組み合わせるための指示、及び、第１および第２ボトルの組み合わせた内容物をブタに投与するための指示を含有する取扱い説明書が含まれる、
前記キット。

【請求項18】

請求項１〜１６のいずれか１項の免疫原性組成物若しくはワクチン組成を調製するための方法であって、該方法が以下の工程：
ｉ）Ｍ．ｈｙｏを適切な培地中で１８〜１４４時間の範囲の期間にわたって培養し；
ｉｉ）続いて該Ｍ．ｈｙｏ培養物を不活化し；
ｉｉｉ）該不活化された培養液を回収し、ここで該不活化された培養液は可溶性液体画分および不溶性細胞性物質の両方を含むＭ．ｈｙｏ全細胞調製物を含み、ここで、該可溶性液体画分がＭ．ｈｙｏ特異的可溶性タンパク質抗原を含む；
ｉｖ）該可溶性液体画分を該不溶性細胞性物質から分離し；
ｖ）ＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を該分離された可溶性液体画分から実質的に除去して該Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分を形成し；そして
ｖｉ）続いて該Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分をＰＣＶ２抗原およびＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせる；
を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ブタサーコウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ハイオニューモニエまたはＭ．ｈｙｏ）、およびブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスに関する。より詳細には、本発明はＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分、ＰＣＶ２抗原、およびＰＲＲＳウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物ならびにブタを少なくとも家畜地方病性肺炎および離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）に対して保護するためのワクチンにおけるその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

マイコプラズマ肺炎とも呼ばれるブタにおける家畜地方病性肺炎は、Ｍ．ｈｙｏにより引き起こされる。その疾患は全ての年齢のブタを冒す慢性の非致死性疾患である。感染したブタは咳および発熱の穏やかな症状しか示さないが、その疾患は飼料効率の低減および体重増加の低減により重大な経済的影響を有する。家畜地方病性肺炎は、感染したブタの肺から吐き出された空気伝染性生物による鼻の通過によりブタからブタへと伝染する。Ｍ．ｈｙｏによる一次感染に続いて他のマイコプラズマ種（マイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）およびマイコプラズマ・フロクラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ））ならびに他の細菌性病原体による二次感染が起こる可能性がある。

【0003】

Ｍ．ｈｙｏは遊離の生存存在（ｆｒｅｅ ｌｉｖｉｎｇ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）が可能な小さい原核微生物であるが、それは外来性のステロール類および脂肪酸に関する絶対的必要性を有するため、それはしばしば真核細胞と関係して見付かる。これらの必要性は一般に血清含有培地中での増殖を必要とする。Ｍ．ｈｙｏは細胞膜に包まれている（ｂｏｕｎｄｅｄ）が細胞壁には包まれていない。

【0004】

マイコプラズマの宿主細胞表面との物理的関係は、家畜地方病性肺炎の発現および持続性に関する基礎である。Ｍ．ｈｙｏはブタの気道に感染し、気管、気管支および細気管支にコロニー形成する。マイコプラズマは線毛運動障害（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ）因子を産生し、それは呼吸路の内側を覆っている線毛に拍動（ｂｅａｔｉｎｇ）を止めさせる。最終的に、線毛が変性し、そのブタを二次病原体による感染が起こりやすくする。特徴的な病変である紫色〜灰色の硬化領域が感染した動物において観察される。屠殺された動物の調査は、ブタの３０〜８０％において病変を明らかにした。１３の州における３７の畜群からの結果は、畜群の９９％が家畜地方病性肺炎に典型的な肺炎病変を有する雄ブタを有していることを示した。従って、有効な予防および処置手段に関する必要性は大きい。

【0005】

抗生物質、例えばチアムリン、トリメトプリム、テトラサイクリン類およびリンコマイシンはいくらかの利益を有するが高価であり、長期の使用を必要とする。加えて、抗生物質はＭ．ｈｙｏの拡散または再感染を有効に排除することは示されていない。病原体を含まない畜群を維持することによる予防は時々可能であるが、Ｍ．ｈｙｏの再導入がしばしば起こる。ブタの肺炎の重大な経済影響のため、Ｍ．ｈｙｏに対するワクチンが捜し求められてきた。血清含有培地中で増殖させたマイコプラズマ生物の調製物を含有するワクチンが市場に出されてきたが、免疫する物質中に存在する血清構成要素（例えば免疫複合体または非免疫原性の特異的なタンパク質）により誘導される有害な反応に関する懸念を生じさせる。Ｍ．ｈｙｏワクチンを提供するための他の試みが成功してきたが、その疾患は広まっているままである。

【0006】

Ｍ．ｈｙｏおよびブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）は、ブタ産業において直面している２つの最も流行している病原体である。ＰＣＶ２に感染したブタは、一般に離乳後多臓器発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と呼ばれる症候群を示す。ＰＭＷＳは臨床的に衰弱、皮膚の蒼白、発育不全（ｕｎｔｈｒｉｆｔｉｎｅｓｓ）、呼吸困難、下痢、黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ）、および黄疸（ｊａｕｎｄｉｃｅ）を特徴とする。ＰＭＷＳに加えて、ＰＣＶ２は偽性狂犬病、ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）、グレーサー病、連鎖球菌性髄膜炎、サルモネラ症、離乳後大腸菌症、食事性肝臓症、および化膿性気管支肺炎が含まれるいくつかの他の感染症と関係してきた。Ｍ．ｈｙｏは家畜地方病性肺炎と関係しており、豚サーコウイルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）の発現に主な共同因子の１つとして関わっていることも示されている。

【0007】

ブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）はアルテリウイルスにより引き起こされ、それはマクロファージ、特に肺中にあるマクロファージ（肺胞マクロファージ）に特別な親和性を有する。これらのマクロファージは侵入している細菌およびウイルスを飲み込んで除去するが、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）の場合にはそうではない。ＰＲＲＳウイルスの場合、それはマクロファージの内部で増殖してより多くのウイルスを産生し、そのマクロファージを殺す。一度ＰＲＲＳＶが畜群に入ると、それは何時までも存在して活性なままである傾向がある。マクロファージの４０％に至るまでが破壊され、それは細菌および他のウイルスが増殖して損傷を与えることを可能にする。この一般的な例は、それらがＰＲＲＳＶに感染した状態になった際の成長期（ｇｒｏｗｅｒ）／仕上期（ｆｉｎｉｓｈｅｒ）単位における家畜地方病性肺炎の重症度の顕著な増大である。離乳期のＰＲＲＳウイルス陰性のブタの半分より多くが市場に出る前に感染状態になる。

【0008】

必要とされているのは、ブタにおけるＰＣＶ２、マイコプラズマ、およびＰＲＲＳＶ感染に対するＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳの３価ワクチンである。１回投与の３価ワクチンを提供することが非常に望ましいであろう。好ましくは、そのワクチンのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ構成要素は、全ての抗原をそのブタに同時に投与することができるようにＰＲＲＳＶ構成要素と容易に組み合わせることができる、１ボトル中で使用準備済の液体構成要素として提供されるであろう。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の全細胞調製物の可溶性部分；ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原；ならびにブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物を提供し、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原からなる免疫複合体の両方を実質的に含まない。１観点において、そのＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分は、その免疫原性組成物に添加される前にプロテインＡまたはプロテインＧで処理されている。さらなる観点において、そのＭ．ｈｙｏ調製物およびＰＣＶ２抗原の可溶性部分は使用準備済の液体組成物の形態である。

【0010】

１態様において、そのＰＲＲＳウイルス抗原は遺伝子改変された生ウイルスである。別の態様において、その遺伝子改変された生ＰＲＲＳウイルスは凍結乾燥された組成物の形態である。

【0011】

１態様において、そのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分には少なくとも１種類のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原が含まれる。別の態様において、そのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分には２種類以上のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原が含まれる。

【0012】

１態様において、そのＰＣＶ２抗原はキメラ１型−２型サーコウイルスの形態であり、そのキメラウイルスにはブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を発現する不活化組み換えブタサーコウイルス１型が含まれる。別の態様において、そのＰＣＶ２抗原は組み替えＯＲＦ２タンパク質の形態である。さらに別の態様において、その組み換えＯＲＦ２タンパク質はバキュロウイルスベクターから発現される。

【0013】

一部の態様において、本発明の３価組成物はＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２、およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す。他の態様において、本発明の免疫原性組成物にはさらに少なくとも１種類の追加の抗原が含まれる。１態様において、その少なくとも１種類の追加の抗原は、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物に対して防御的である。

【0014】

１態様において、その微生物には細菌、ウイルス、または原生動物が含まれる。別の態様において、その微生物は以下の微生物から選択されるが、それらに限定されない：ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ヒカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオシノヴィエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）、レプトスピラ属（ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）の細菌、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、ロタウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ブタコレラ（ＣＳＦ）を引き起こす病原体、およびブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはそれらの組み合わせ。

【0015】

一部の態様において、本発明の組成物にはさらにアジュバントが含まれる。１態様において、そのアジュバントは以下のものから選択されるが、それらに限定されない：水中油型アジュバント、ポリマーおよび水のアジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバントおよびそれらの組み合わせ。別の態様において、本発明の組成物にはさらに薬学的に許容可能なキャリヤーが含まれる。

【0016】

特定の態様において、本発明の組成物は１回量投与として投与された際にＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す。

【0017】

本発明は、ブタをＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対して免疫する方法も提供する。この方法にはそのブタにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）全細胞調製物の可溶性部分；ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原；およびＰＲＲＳウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物を投与することが含まれ、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原からなる免疫複合体の両方を実質的に含まない。

【0018】

本発明の方法の１態様において、その３価組成物は筋内、皮内、経皮、または皮下投与される。この発明の方法の別の態様において、その３価組成物は１回量で投与される。

【0019】

さらなる態様において、その組成物はＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２、およびＰＲＲＳウイルスの少なくとも１つに対する母系由来抗体を有するブタに投与される。さらに別の態様において、その組成物は、Ｍ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２、およびＰＲＲＳウイルスに対する母系由来抗体を有するブタに投与される。

【0020】

１態様において、その組成物は３週齢以上のブタに投与される。

【0021】

本発明は、本発明に従う免疫原性組成物を調製するための方法も提供する。この方法には以下の工程が含まれる：ｉ）Ｍ．ｈｙｏを適切な培地中で１８〜１４４時間の範囲の期間にわたって培養し；ｉｉ）続いてそのＭ．ｈｙｏ培養物を不活化し；ｉｉｉ）その不活化された培養液を回収し、ここでその不活化された培養液は可溶性液体画分および不溶性細胞性物質の両方を含むＭ．ｈｙｏ全細胞調製物を含み；ｉｖ）その可溶性液体画分を不溶性細胞性物質から分離し；ｖ）ＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方をその分離された可溶性液体画分から実質的に除去してＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分を形成し；そしてｖｉ）続いてそのＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分をＰＣＶ２抗原およびＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせる。１態様において、工程ｖｉ）には、ＰＣＶ２抗原およびＭ．ｈｙｏ可溶性部分の両方を含む使用準備済の液体組成物を凍結乾燥されたＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせることが含まれる。

【0022】

１態様において、本発明に従うキットには、ＰＣＶ２抗原およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）全細胞抽出物の可溶性部分の両方が含まれる組成物を含む第１ボトル（または他の適切な容器（ｒｅｃｅｐｔａｂｌｅ））ならびにＰＲＲＳウイルス抗原を含む第２ボトルが含まれ、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を実質的に含まない。１態様において、その第１ボトル中の組成物は使用準備済の液体組成物として提供される。さらなる態様において、そのキットのＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は凍結乾燥された組成物の形態である。別の態様において、そのキットには第１ボトルからの内容物を第２ボトルの内容物と組み合わせるための指示を含む取扱い説明書が含まれる。さらに別の態様において、その取扱い説明書にはさらに、組み合わせた第１および第２ボトルの内容物をブタに投与するための指示が含まれる。 非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］ マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の全細胞調製物の可溶性部分；ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原；ならびにブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物であって、該Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原からなる免疫複合体の両方を実質的に含まない、前記組成物。
［態様２］ Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が免疫原性組成物に添加される前にプロテインＡまたはプロテインＧで処理されている、態様１に記載の組成物。
［態様３］ Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分およびＰＣＶ２抗原が使用準備済の液体組成物の形態である、態様１または態様２に記載の組成物。
［態様４］ ＰＲＲＳウイルス抗原が遺伝子改変生ウイルスである、態様１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
［態様５］ 遺伝子改変生ＰＲＲＳウイルスが凍結乾燥された組成物の形態である、態様４に記載の組成物。
［態様６］ Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が少なくとも１種類のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原を含む、態様１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
［態様７］ Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が２種類以上のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原を含む、態様６に記載の組成物。
［態様８］ 組成物がブタにおいてＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す、態様１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
［態様９］ ＰＣＶ２抗原がキメラ１型−２型サーコウイルスの形態であり、前記のキメラウイルスがブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を発現する不活化組み換えブタサーコウイルス１型を含む、態様１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
［態様１０］ ＰＣＶ２抗原が組み替えＯＲＦ２タンパク質の形態である、態様１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
［態様１１］ 組み換えＯＲＦ２タンパク質がバキュロウイルスベクターから発現される、態様１０に記載の組成物。
［態様１２］ 組成物がさらにアジュバントを含む、態様１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
［態様１３］ アジュバントが水中油型アジュバント、ポリマーおよび水のアジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバントおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、態様１２に記載の組成物。
［態様１４］ 組成物がさらに薬学的に許容可能なキャリヤーを含む、態様１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
［態様１５］ 組成物が１回量投与として投与された際にＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す、態様１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
［態様１６］ 態様１に記載の組成物をブタに投与することを含む、ブタをＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対して免疫化する方法。
［態様１７］ 組成物を筋内、皮内、経皮、または皮下投与する、態様１６に記載の方法。
［態様１８］ 組成物を１回量で投与する、態様１６または態様１７に記載の方法。
［態様１９］ 組成物がＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスの少なくとも１つに対する母系由来抗体を有するブタに投与される、態様１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
［態様２０］ 組成物が３週齢以上のブタに投与される、態様１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
［態様２１］ ＰＣＶ２抗原およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）全細胞調製物の可溶性部分の両方が含まれる組成物を含む第１ボトルならびにＰＲＲＳウイルス抗原を含む第２ボトルを含むキットであって、該Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分が（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を実質的に含まない、前記キット。
［態様２２］ 第１ボトル中の組成物が使用準備済の液体組成物として提供される、態様２１に記載のキット。
［態様２３］ 第２ボトル中のＰＲＲＳウイルス抗原が凍結乾燥された組成物の形態である、態様２１または態様２２に記載のキット。
［態様２４］ キットにさらに第１ボトルの内容物を第２ボトルの内容物と組み合わせるための指示を有する取扱い説明書が含まれる、態様２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
［態様２５］ 取扱い説明書にさらに第１および第２ボトルの組み合わせた内容物をブタに投与するための指示が含まれる、態様２４に記載のキット。
［態様２６］ 免疫原性組成物を調製するための方法であって、該方法が以下の工程：
ｉ）Ｍ．ｈｙｏを適切な培地中で１８〜１４４時間の範囲の期間にわたって培養し；
ｉｉ）続いて該Ｍ．ｈｙｏ培養物を不活化し；
ｉｉｉ）該不活化された培養液を回収し、ここで該不活化された培養液は可溶性液体画分および不溶性細胞性物質の両方を含むＭ．ｈｙｏ全細胞調製物を含み；
ｉｖ）該可溶性液体画分を該不溶性細胞性物質から分離し；
ｖ）ＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を該分離された可溶性液体画分から実質的に除去して該Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分を形成し；そして
ｖｉ）続いて該Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分をＰＣＶ２抗原およびＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせる；
を含む、前記方法。
［態様２７］ ｖｉ）がＰＣＶ２抗原およびＭ．ｈｙｏ可溶性部分の両方を含む使用準備済の液体組成物を凍結乾燥されたＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせることを含む、態様２６に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１は、異なる処理（実施例３において記載されるＴ０２〜Ｔ１０）からのＭ．ｈｙｏ抗原を用いて調製したＭ．ｈｙｏ単価ワクチン対プラセボ（Ｔ０１）の有効性を示すグラフである。結果は％肺病変最小二乗平均値として示されている。

【図2】図２は、死菌ＰＣＶ１型−２型キメラウイルスとの組み合わせでのＭ．ｈｙｏワクチンのＰＣＶ２抗原力価の結果（ＰＣＶ２抗原ＥＬＩＳＡ）を示すグラフである。そのキメラウイルスはその組成物中に約１．６≦ＰＲの初期レベルで含まれていた。それぞれの試料の状態を相対強度（ＲＰ）として表す。

【図3】図３は、異なるアジュバントプラットフォームを用いたＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏワクチン配合物を用いて観察されたＰＣＶ２ウイルス血症の結果（ＰＣＶ２定量的ＰＣＲ）を示すグラフである。

【図4】図４は、異なるアジュバントプラットフォームを用いたＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏワクチン配合物を用いて負荷の１、２０、および４２日目に観察されたＰＣＶ２抗体ＥＬＩＳＡ（Ｓ／Ｐ）の血清学的結果を示すグラフである。

【図5】図５は、実施例７において記載されるＴ０２〜Ｔ０４処理対プラセボ（Ｔ０１）により得られたＰＣＶ２の糞便への排出（ｆｅｃａｌ ｓｈｅｄ）を示すグラフである。その結果はＰＣＶ２のＤＮＡのコピー数／ｍｌとして表されている。

【図6】図６は、実施例７において記載されるＴ０２〜Ｔ０４処理対プラセボ（Ｔ０１）により得られたＰＣＶ２の鼻への排出（ｎａｓａｌ ｓｈｅｄ）を示すグラフである。その結果はＰＣＶ２のＤＮＡのコピー数／ｍｌとして表されている。

【図7】図７（ＡおよびＢ）は、ＰＣＶ２特異的な細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答を測定するインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示すグラフである。ワクチン接種後（ｐｏｓ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）／負荷前の結果を図７Ａにおいて示し、ワクチン接種後／負荷後の結果を図７Ｂにおいて示す。５×１０^６細胞の刺激を有意であるとみなした。

【図8】図８は、ＳＰオイル中のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチン配合物のＭ．ｈｙｏ有効性を示す。Ｍ．ｈｙｏ処理Ｔ０２〜Ｔ０８を用いた配合物対プラセボ（Ｔ０１）に関する肺の点数を図８Ａにおいてグラフで示す。図８Ｂ中の表は、処理Ｔ０２〜Ｔ０８のプラセボとの対比を示す。

【図9】図９は、ＰＣＶ２と適合性のプロテインＡ処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を調製するために用いられた製造プロセスの１態様を示す流れ図である。

【図10】図１０は、ＰＲＲＳウイルスに対する殺ウイルス活性に関するアジュバントの評価を示す表である。

【図11】図１１は、ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ実験ワクチン配合物を用いて観察されたＰＣＶ２ウイルス血症の結果（ＰＣＶ２定量ＰＣＲ）を示すグラフである。

【図12】図１２は、ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ実験ワクチン配合物を用いて試験の−１、７、１３、２０、２８、３５および４２日目（負荷は２１日目である）に観察されたＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。

【図13】図１３は、実施例１４において記載されるＴ０２およびＴ０３処理（ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ実験ワクチン配合物）対プラセボ（Ｔ０１）を用いて得られたＰＣＶ２の糞便への排出を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

配列の簡潔な記載
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、Ｍ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのｐ４６をコードするヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、Ｍ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのｐ４６に対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、Ｍ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのｐ９７をコードするヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、Ｍ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのｐ９７に対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、キメラＰＣＶ１−２ウイルスをコードするゲノム配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２に対応するヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、キメラＰＣＶ１−２ウイルスをコードするゲノム配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２に対応するヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５は、ブタサーコウイルスのＯＲＦ２ポリペプチドに対応するアミノ酸配列の１態様であり；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６は、Ｐ１２９と名付けられた北米型ＰＲＲＳウイルス分離株の非病毒性形態のゲノム配列の１態様であり；そして
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７は、ＩＳＵ−５５と名付けられたＰＲＲＳＶ分離株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ５に対応するヌクレオチド配列の１態様である。

【0025】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８は、ＩＳＵ−５５と名付けられたＰＲＲＳＶ分離株のＯＲＦ６〜ＯＲＦ７に対応するヌクレオチド配列の１態様である。

【0026】

本発明はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の全細胞調製物の可溶性部分、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原、およびブタ生殖および呼吸症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原が含まれる３価免疫原性組成物を提供し、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原からなる免疫複合体の両方を実質的に含まない。１態様において、その３価組成物はブタにおいてＰＣＶ２、Ｍ．ｈｙｏ、およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す。

【0027】

出願者らは、驚くべきことに、Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の不溶性部分は非免疫原性であることを発見した。対照的に、ＩｇＧを含まないＭ．ｈｙｏ可溶性調製物は免疫原性であり、他の病原体、例えばＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶからの抗原と、抗原間の分析的または免疫学的干渉なしで有効に組み合わせることができる。これはＭ．ｈｙｏ可溶性調製物をこの発明の多価ワクチンのための有効なプラットフォームにする。出願者らは、驚くべきことに、そのＭ．ｈｙｏ調製物からの免疫グロブリンおよび不溶性細胞破壊片の除去はその免疫原性組成物の安全性を高めることも発見した。

【0028】

本明細書および特許請求の範囲において用いられる際、単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”には、内容が明確に別途指示しない限り、複数への言及が含まれる。例えば、用語“タンパク質抗原（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ）”には、複数のタンパク質抗原が、それらの混合物を含めて含まれる。

【0029】

本明細書で用いられる際、用語“含んでいる”は、その組成物および方法に列挙された要素が含まれるが他の要素を除外しないことを意味することを意図している。

【0030】

本明細書で定義されるように、Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分は、不溶性物質の分離ならびにＩｇＧおよび抗原結合免疫複合体の実質的な除去後のＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性液体画分を指す。そのＭ．ｈｙｏ可溶性部分は、あるいは本明細書において上清画分、培養上清等と呼ばれ得る。それには、不溶性タンパク質、細菌全体、および他の不溶性Ｍ．ｈｙｏ細胞性物質から一般に用いられる手段、例えば遠心分離、濾過、または沈殿により分離または単離されている、Ｍ．ｈｙｏが発現した可溶性タンパク質（Ｍ．ｈｙｏタンパク質抗原）が含まれる。Ｍ．ｈｙｏ特異的可溶性タンパク質が含まれるのに加えて、Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分には異種タンパク質、例えばＭ．ｈｙｏの発酵に用いられた培地中に含有される異種タンパク質も含まれる。

【0031】

用語“抗原”は、動物において抗体の産生もしくはＴ細胞応答、または両方を刺激することができる化合物、組成物、または免疫原性物質を指し、動物中に注射する、または吸収させる組成物が含まれる。その免疫応答は分子全体に対して、またはその分子の一部（例えばエピトープまたはハプテン）に対して生成され得る。

【0032】

本明細書で定義されるように、“免疫原性または免疫学的組成物”は、宿主において対象の組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体に媒介される免疫応答の免疫学的応答を引き出す少なくとも１種類の抗原を含む物質の組成物を指す。

【0033】

用語“免疫応答”は、本明細書で用いられる際、動物において引き出される応答を指す。免疫応答は細胞性免疫（ＣＭＩ）；体液性免疫を指してよく、または両方を含んでよい。本発明は、免疫系の一部に限定された応答も意図している。通常、“免疫学的応答”には以下の作用の１つ以上が含まれるが、それらに限定されない：対象の組成物またはワクチン中に含まれる抗原（単数または複数）に特異的に方向付けられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはｙｄ Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は療法的または防御的免疫学的応答のどちらかを、新しい感染に対する抵抗性が高められ、および／またはその疾患の臨床的重症度が低減するであろうように示すであろう。そのような防御は、感染した宿主が通常示す症状の低減もしくは欠如のどちらか、感染した宿主におけるより迅速な回復時間および／または低下したウイルス力価により示されるであろう。

【0034】

本明細書で用いられる際、用語“免疫原性”は、宿主動物において抗原（単数または複数）に対する免疫応答を生じさせることができることを意味する。この免疫応答は、ある特定の感染性生物に対するワクチンにより引き出される防御免疫の基礎を形成する。

【0035】

“アジュバント”は、本明細書で用いられる際、抗原（単数または複数）に対する免疫応答を高める１種類以上の物質からなる組成物を意味する。どのようにアジュバントが作用するのかの機序は完全には知られていない。一部のアジュバントは抗原をゆっくりと放出することにより免疫応答を高めると信じられており、一方で他のアジュバントは単独でも強力に免疫原性であり、相乗的に機能すると信じられている。

【0036】

本明細書で用いられる際、用語“多価”は、同じ種（すなわちマイコプラズマ・ハイオニューモニエの異なる分離株）からのものであれ、異なる種（すなわちパスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）およびパスツレラ・マルトシダ両方からの分離株）からのものであれ、または異なる属からの抗原の組み合わせを含有するワクチン（例えばパスツレラ・マルトシダ、サルモネラ属、大腸菌、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）およびクロストリジウム属からの抗原を含むワクチン）であれ、１種類より多くの抗原を含有するワクチンを意味する。

【0037】

用語“ブタ”または“子ブタ”は、本明細書で用いられる際、ブタ由来の動物を意味し、一方で“雌ブタ（ｓｏｗ）”は生殖可能年齢および能力のメスを指す。“若雌ブタ（ｇｉｌｔ）”は、妊娠したことがない雌のブタである。

【0038】

本明細書で用いられる際、用語“病毒性”は、動物宿主において感染性であるその能力を保持している分離株を意味する。

【0039】

“不活化ワクチン”は、もはや複製または増殖することができない感染性生物または病原体を含有するワクチン組成物を意味する。その病原体は、細菌、ウイルス、原生動物または真菌由来であってよい。不活化は、凍結融解、化学的処理（例えばチメロサールまたはホルマリンによる処理）、超音波処理、放射線、熱またはその生物の複製もしくは増殖を防ぐ一方でその免疫原性を維持するのに十分なあらゆる他の一般に用いられる（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）手段が含まれる様々な方法により成し遂げることができる。

【0040】

用語“変異体”は、本明細書で用いられる際、対応するポリペプチドが野生型ポリペプチドと比較した際に実質的に同等の機能を有するような１個以上の保存的アミノ酸変異または他の重要でない変更を有するポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸配列を指す。

【0041】

“保存的変異”は、アミノ酸残基の別の生物学的に類似の残基による置き換え、または核酸配列中のヌクレオチドの、コードされるアミノ酸残基が変化しない、もしくは別の生物学的に類似の残基であるような置き換えを意味する。保存的変異の例には、ある疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの別の疎水性残基に関する置換、またはある極性残基の置換、例えばアルギニンのリジンに関する置換、グルタミン酸のアスパラギン酸に関する置換、もしくはグルタミンのアスパラギンに関する置換等が含まれる。用語“保存的変異”には、非置換の親アミノ酸の位置における置換されたアミノ酸の使用も、その置換されたポリペプチドに対して産生された抗体が非置換のポリペプチドとも免疫反応するという条件の下で含まれる。

【0042】

本明細書で用いられる際、用語“薬学的に許容可能なキャリヤー”および“薬学的に許容可能なビヒクル”は互換的であり、有害な作用なしで宿主中に注射することができるワクチン抗原を含有するための流体ビヒクルを指す。当該技術で既知の適切な薬学的に許容可能なキャリヤーには、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース、または緩衝溶液が含まれるが、それらに限定されない。キャリヤーには、希釈剤、安定剤（すなわち糖類およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増進添加剤、顔料等が含まれるがそれらに限定されない補助剤が含まれ得る。

【0043】

本明細書で用いられる際、用語“ワクチン組成物”には、宿主において免疫応答を誘導するために有用な薬学的に許容可能なビヒクル中の少なくとも１種類の抗原または免疫原が含まれる。ワクチン組成物は、医学または獣医学の技術分野の当業者に周知の投与量で、および技法により、受容動物の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路のような要因を考慮して投与することができる。その投与経路は、経皮的であるか、粘膜投与（例えば経口、経鼻、肛門、膣）によるか、または非経口経路（皮内、経皮、筋内、皮下、静脈内、または腹腔内）によることができる。ワクチン組成物は単独で投与することができ、または他の処置もしくは療法と同時投与もしくは連続投与することができる。投与の形態には、懸濁液、シロップまたはエリキシル剤、および非経口、皮下、皮内、筋内または静脈内投与（例えば注射可能な投与）のための製剤、例えば無菌の懸濁液もしくはエマルジョンが含まれ得る。ワクチン組成物は噴霧剤として投与されてよく、または食物および／または水中に混合されてよく、または適切なキャリヤー、希釈剤、もしくは賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース等との混合状態で送達されてよい。その組成物は、所望の投与経路および製剤に応じて、補助物質、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度増進添加剤、保存剤、香味料、顔料等を含有することができる。標準的な薬学の教科書、例えば“Remington's Pharmaceutical Sciences”1990を調べて、過度の実験を行わずに適切な製剤を調製することができる。

【0044】

“北米型ＰＲＲＳウイルス”は、北米型ＰＲＲＳウイルス分離株、例えば（それらに限定されないが）以下の分離株と関係する遺伝子特性を有するあらゆるＰＲＲＳウイルスを意味する：米国で１９９０年代初期ごろに最初に分離されたＰＲＲＳウイルス（例えばCollins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4:117-126を参照）；北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ−１ｂ（Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6:293-296）；ＰＲＲＳＶのケベックＬＡＦ−ｅｘｐ９１分離株（Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418）；および北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＶＲ ２３８５（Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801）。北米型ＰＲＲＳウイルス株の追加の例が本明細書において記載されている。遺伝子特性は、北米型ＰＲＲＳウイルス株により共有されるゲノムのヌクレオチド配列の類似性およびアミノ酸配列の類似性を指す。中国型ＰＲＲＳウイルス株は一般に北米株との約８０〜９３％のヌクレオチド配列の類似性を明示する。

【0045】

“欧州型ＰＲＲＳウイルス”は、欧州で１９９１年ごろに最初に分離されたＰＲＲＳウイルスと関係する遺伝子特性を有するＰＲＲＳウイルスのあらゆる株を指す（例えば、Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13:121-130を参照）。“欧州型ＰＲＲＳウイルス”は当該技術において時々“レリスタッドウイルス”とも呼ばれる。欧州型ＰＲＲＳウイルス株のさらなる例が本明細書において記載されている。

【0046】

遺伝子改変されたウイルスは、それがその未改変の親株よりも病毒性が低い場合、“弱毒化されている”。ある株は、それが疾患の重症度を決定する１種類以上のパラメーターにおいて統計的に有意な低下を示す場合、“より病毒性が低い”。そのようなパラメーターには、ウイルス血症のレベル、発熱、呼吸困難の重症度、生殖系症状の重症度、または肺の病変の数もしくは重症度等が含まれ得る。

【0047】

“感染性クローン”は、実験室において特異的および意図的に改変して、次いでそれを用いて生きた遺伝子改変された生物を再形成することができる、疾患因子（例えばウイルス）の単離もしくはクローニングされたゲノムである。感染性クローンから産生された生きた遺伝子改変されたウイルスを、生ウイルスワクチンにおいて用いることができる。あるいは、その感染性クローンに由来する生ウイルスを、不活化剤、例えばホルマリンまたは疎水性溶媒、酸等により、紫外線もしくはＸ線の照射により、加熱により、等で処理することにより、不活化ウイルスワクチンを調製することができる。

【0048】

全ての現在利用可能なＭ．ｈｙｏおよびＭ．ｈｙｏ混合ワクチンは、死菌全細胞マイコプラズマ調製物から作られる（バクテリン）。対照的に、本発明はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）の全細胞調製物の可溶性部分をＰＣＶ２およびＰＲＲＳＶ抗原との組み合わせのために用いており、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原からなる免疫複合体の両方を実質的に含まない。

【0049】

Ｍ．ｈｙｏは外来性のステロール類および脂肪酸に関する絶対的必要性を有する。これらの必要性は一般にＭ．ｈｙｏのブタ血清のような血清含有培地中での増殖を必要とする。Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分からの（例えば遠心分離、濾過、または沈殿による）不溶性物質の分離は、ブタＩｇＧまたは免疫複合体を除去しない。本発明の１態様において、培養上清中に含有されるＩｇＧおよび免疫複合体を実質的に除去するために、Ｍ．ｈｙｏ可溶性部分をプロテインＡまたはプロテインＧで処理する。この態様において、プロテインＡ処理はＭ．ｈｙｏの発酵後に行われることが理解されている。これはあるいは本明細書において下流プロテインＡ処理と呼ばれる。別の態様において、上流の（すなわちＭ．ｈｙｏの発酵の前の）増殖培地のプロテインＡ処理を用いることができる。プロテインＡはＩｇＧのＦｃ部分に結合する。プロテインＧはＩｇＧのＦｃ部分に優先的に結合するが、Ｆａｂ領域にも結合することができる。粗製のタンパク質混合物、例えば組織培養上清、血清および腹水から総ＩｇＧを精製／除去するための方法は、当該技術で既知である。

【0050】

一部の態様において、Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分には、少なくとも１種類のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原が含まれる。他の態様において、Ｍ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分には、２種類以上のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原が含まれる。

【0051】

１態様において、Ｍ．ｈｙｏ上清画分には、以下のＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原の１種類以上が含まれる：おおよそ４６ｋＤ（ｐ４６）、６４ｋＤ（ｐ６４）および９７ｋＤ（ｐ９７）の分子量のＭ．ｈｙｏタンパク質。別の態様において、その上清画分には少なくともｐ４６、ｐ６４およびｐ９７のＭ．ｈｙｏタンパク質抗原が含まれる。おおよそ６４ｋＤのＭ．ｈｙｏタンパク質（ｐ６４）は、あるいは本明細書においてＫｉｍら[Infect. Immun. 58(8):2637-2643 (1990)]により、ならびに米国特許第５，７８８，９６２号において記載されたＭ．ｈｙｏからのｐ６５表面抗原と呼ばれ得る。

【0052】

Ｆｕｔｏらは、この発明の組成物において用いることができるＭ．ｈｙｏからの４６ｋＤの表面タンパク質のクローニングおよび特性付けを記載した[J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]。１態様において、そのＭ．ｈｙｏ培養上清にはｐ４６が含まれ、Ｐ−５７２２株からのその対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２において示されている。さらに、下記で記載されるようにそのようなｐ４６配列の変異体を本発明の組成物において用いることができることが意図されている。

【0053】

Ｚｈａｎｇらは、Ｍ．ｈｙｏのｐ９７アドヘシンタンパク質を記載し、特性付けた[Infect. Immun. 63: 1013-1019, 1995]。加えて、ＫｉｎｇらはＭ．ｈｙｏのＰ−５７２２株からのＭｈｐ１と名付けられた１２４ｋＤのタンパク質を記載し、Ｍｈｐ１およびｐ９７が同じタンパク質であることを示唆するデータを示した[Vaccine 15:25-35 (1997)]。そのようなｐ９７タンパク質をこの発明の組成物において用いることができる。１態様において、そのＭ．ｈｙｏ培養上清にはｐ９７が含まれ、Ｐ−５７２２株からのその対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列がそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および４において示されている。さらに、下記で記載されるようにそのようなｐ９７配列の変異体を本発明の組成物において用いることができることが意図されている。

【0054】

そのＭ．ｈｙｏ培養上清には、さらにＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原、例えば（それらに限定されないが）おおよそ４１ｋＤ（ｐ４１）、４２ｋＤ（ｐ４２）、８９ｋＤ（ｐ８９）、および６５ｋＤ（ｐ６５）のタンパク質が含まれている可能性がある。Okada et al., 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533およびKim et al., 1990, Infect. Immun. 58(8):2637-2643を参照。加えて、そのＭ．ｈｙｏ培養上清にはおおよそ１０２ｋＤ（ｐ１０２）および２１６ｋＤ（ｐ２１６）のＭ．ｈｙｏ特異的タンパク質抗原が含まれている可能性がある。Ｍｉｎｎｉｏｎらへの米国特許第６，１６２，４３５号および第７，４１９，８０６号を参照。

【0055】

あらゆるＭ．ｈｙｏ株を、本発明の組成物のＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分を生成するための出発物質として用いることができる。Ｍ．ｈｙｏの適切な株は商業的または学術的な源から得ることができ、それにはアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）およびＮＲＲＬ微生物株保存機関（米国農務省農業研究サービス、イリノイ州ピオリア）のような保管所が含まれる。ＡＴＣＣは単独で以下の６種類のＭ．ｈｙｏの株を販売のためにリストに載せている：Ｍ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２５０９５、Ｍ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２５６１７、Ｍ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２５９３４、Ｍ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２７７１４、Ｍ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２７７１５、およびＭ．ｈｙｏ ＡＴＣＣ ２５９３４Ｄ。この発明の態様における使用のための好ましいＭ．ｈｙｏの株は、米国特許商標庁により要求されるアクセシビリティルール（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｒｕｌｅｓ）に従って１９９０年５月３０日に寄託された株Ｐ−５７２２−３、ＡＴＣＣ ＃５５０５２として同定される。その疾患の広範囲にわたる伝播（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ）を考慮すると、ブタにおいてマイコプラズマ肺炎を引き起こす既知の株に感染したブタからの肺分泌物または組織からＭ．ｈｙｏを回収することによっても株を得ることができる。

【0056】

当業者には、Ｍ．ｈｙｏ配列の変異体を本発明の組成物において用いることができることは理解されている。そのような変異体は、配列の同一性において１０〜２０％も異なり、なおそれを免疫原性組成物において有用にする抗原性特性を保持している可能性がある。好ましくは、そのＭ．ｈｙｏ変異体は野生型Ｍ．ｈｙｏ株の完全長ゲノム配列との少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９５％の配列の同一性を有する。免疫学的組成物の抗原性特性は、例えば実施例において提供されるような負荷実験により推定することができる。さらに、改変されたＭ．ｈｙｏ抗原の抗原性特徴は、その改変された抗原が野生型Ｍ．ｈｙｏタンパク質と比較した場合にその防御免疫の少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％を与える場合、まだ保持されている。

【0057】

１態様において、Ｍ．ｈｙｏの可溶性ｐ４６抗原は本発明の組成物中に約１．５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの終濃度で、好ましくは約２μｇ／ｍｌ〜約６μｇ／ｍｌで含まれる。ｐ４６はＭ．ｈｙｏ力価試験（下記の実施例の節を参照）のために用いられるタンパク質であることを特筆する。別の態様において、そのＭ．ｈｙｏ抗原はその組成物中に、Ｍ．ｈｙｏの全培養物のプロテインＡ処理された上清の約５．５％〜約３５％の最終的な量で含まれ得る。

【0058】

そのＭ．ｈｙｏ可溶性調製物は安全かつＭ．ｈｙｏに対して有効の両方であり、１回量投与に適している。加えて、出願者らは驚くべきことにそのＭ．ｈｙｏ可溶性調製物は抗原間の免疫学的干渉なしでＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスが含まれる他の病原体からの抗原と有効に組み合わせることができることを発見している。これはそのＭ．ｈｙｏ可溶性調製物をこの発明のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンが含まれる多価ワクチンのための有効なプラットフォームにする。そのＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルス抗原は、Ｍ．ｈｙｏ組成物と同時に（すなわち３つの別々の単独のワクチンとして）与えることができるが、好ましくはそのＭ．ｈｙｏ可溶性調製物およびＰＣＶ２抗原は使用準備済の液体組成物の形態で一緒に組み合わせられる。次いでこの使用準備済のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ液体組成物を、全ての抗原をそのブタに同時に投与することができるように、ＰＲＲＳ抗原と組み合わせることができる。一部の態様において、そのＰＲＲＳウイルス抗原は凍結乾燥された状態であり、そのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ液体組成物を用いてその凍結乾燥されたＰＲＲＳウイルス抗原を再水和させ、それにより３価組成物を形成することができる。

【0059】

１態様において、本発明の免疫原性ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物には少なくとも１種類の追加の抗原が含まれる。１態様において、その少なくとも１種類の追加の抗原は、ブタにおいて疾患を引き起こし得る微生物に対して防御的である。

【0060】

一部の態様において、その少なくとも１種類の追加の抗原構成要素は、ブタに感染することが知られている細菌、ウイルス、または原生動物に対して防御的である。そのような微生物の例には以下のものが含まれるが、それらに限定されない：ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・マルトシダ、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｍ ｓｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ヒカス、アクチノバチルス・プルロニューモニエ、ボルデテラ・ブロンキセプティカ、サルモネラ・コレラエスイス、サルモネラ・エンテリティディス、エリジペロスリックス・ルジオパシエ、マイコプラズマ・ハイオリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオシノヴィエ、レプトスピラ属の細菌、ローソニア・イントラセルラリス、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、大腸菌抗原、ブラキスピラ・ヒオディセンテリア、ブタ呼吸器コロナウイルス、ブタ流行性下痢（ＰＥＤ）ウイルス、ロタウイルス、トルクテノウイルス（ＴＴＶ）、ブタサイトメガロウイルス、ブタエンテロウイルス、脳心筋炎ウイルス、オーエスキー病（Ａｕｊｅｓｋｙ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ブタコレラ（ＣＳＦ）を引き起こす病原体、およびブタ伝染性胃腸炎を引き起こす病原体、またはそれらの組み合わせ。

【0061】

１態様において、本発明に従う３価ワクチンのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ構成要素は、使用準備済の１ボトルの液体組成物として提供される。そのような使用準備済の組成物は別々のＰＣＶ２およびＭ．ｈｙｏ単価ワクチンの混合を必要とせず、従って混合と関係する汚染の危険性または追加の労力がなく、そしてその混合物を数時間以内に使用する必要がない。また、１ボトルのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ構成要素は廃棄物および冷凍機の保管スペースを半分に削減する。

【0062】

一部の態様において、ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＣＶ２抗原構成要素は、キメラ１型−２型サーコウイルスの形態である。そのキメラウイルスには、ブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を発現する不活化組み換えブタサーコウイルス１型が含まれる。キメラブタサーコウイルスおよびそれらの調製のための方法は、国際公開第０３／０４９７０３ Ａ２号において、そして米国特許第７，２７９，１６６号および第７，５７５，７５２号においても記載されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0063】

１態様において、下記に記載するように、キメラＰＣＶ１−２ウイルスのゲノムの完全長ＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５またはその変異体に対応する。別の態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスの免疫原性ＯＲＦ２カプシド遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対応する。さらなる態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスにより発現される免疫原性ＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対応する。

【0064】

さらに別の態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスのゲノムの完全長ＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対応する。１態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスの免疫原性ＯＲＦ２カプシド遺伝子はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対応する。さらなる態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスにより発現される免疫原性ＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する。

【0065】

しかし、キメラＰＣＶ１−２ウイルスのＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質は、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質はＰＣＶ２分離株内で高度に保存されたドメインであるため、上記で記載した配列に限定されない。

【0066】

一部の態様において、Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＣＶ２抗原構成要素は組み替えＯＲＦ２タンパク質の形態である。１態様において、その組み換えＯＲＦ２タンパク質はバキュロウイルスベクターから発現される。あるいは、他の既知の発現ベクターを用いることができ、それには例えばパラポックスベクターが含まれるが、それに限定されない。

【0067】

１態様において、その組み換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のタンパク質であり、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ０８６８３４）によりコードされている。別の態様において、その組み換えＯＲＦ２タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のタンパク質であり、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４によりコードされている。さらに別の態様において、その組み換えＯＲＦ２タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に対応する。さらに別の態様において、その組み換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対応する。さらに別の態様において、その組み換えＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対応する。

【0068】

しかし、本発明は、上記で記載した特定のＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質配列に限定されない。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質はＰＣＶ２分離株内で高度に保存されたドメインであるため、あらゆるＰＣＶ２ ＯＲＦ２がそのキメラＰＣＶ１−２ウイルスにおいて、または組み換えＰＣＶ２タンパク質において用いられるようなＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよび／またはポリペプチドの源として有効である可能性が非常に高い。

【0069】

そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質配列が由来し得る適切なＰＣＶ２分離株の１つの例は、ＰＣＶ２分離株番号４０８９５（２００１年１２月７日にＡＴＣＣにおいて寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託名称ＰＴＡ−３９１４を割り当てられた）である。ＰＣＶ２分離株番号４０８９５のゲノム（ヌクレオチド）配列はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＦ２６４０４２の下で入手可能である。ＰＣＶ２ ＯＲＦ２ ＤＮＡおよびタンパク質配列が由来し得る適切なＰＣＶ２分離株の他の例には以下の分離株が含まれるが、それらに限定されない：Ｉｍｐ．９９９、Ｉｍｐ．１０１０−Ｓｔｏｏｎ、Ｉｍｐ．１０１１−４８１２１、およびＩｍｐ．１０１１−４８２８５。これらのＰＣＶ２分離株に対応するゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号は、それぞれＡＦ０５５３９１、ＡＦ０５５３９２、ＡＦ０５５３９３およびＡＦ０５５３９４である。

【0070】

一部の形態において、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の免疫原性部分がその組成物中の抗原性構成要素として用いられる。例えば、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の切り詰められた、および／または置換された形態または断片を本発明の組成物において用いることができる。

【0071】

当業者には、そのＰＣＶ２配列の変異体を本発明の組成物において用いることができることは理解されている。そのような変異体は、配列の同一性において１０〜２０％も異なり、なおそれを免疫原性組成物において有用にする抗原性特性を保持している可能性がある。好ましくは、そのＰＣＶ２変異体は野生型ＰＣＶ２分離株の完全長ゲノム配列との少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９５％の配列の同一性を有する。免疫学的組成物の抗原性特性は、例えば実施例において提供されるような負荷実験により推定することができる。さらに、改変されたＰＣＶ２抗原の抗原性特徴は、その改変された抗原が野生型ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と比較した場合にその防御免疫の少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％を与える場合、まだ保持されている。

【0072】

そのＰＣＶ２抗原構成要素は、その免疫原性組成物中に、所望の免疫応答を誘導する、すなわちＰＣＶ２感染の結果として生じる臨床徴候の発生率を低減する、または重症度を低下させるために有効な抗原含有レベルで提供される。

【0073】

１態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスは本発明の３価組成物中に少なくとも１．０≦ＲＰ≦５．０のレベルで含まれ、ここでＲＰはＥＬＩＳＡ抗原定量化（インビトロ力価試験）により決定される参照ワクチンと比較した相対力価単位である。別の態様において、キメラＰＣＶ１−２ウイルスは本発明の組成物中に約０．５％〜約５％の２０倍（２０×）濃縮されたバルクＰＣＶ１−２抗原の終濃度で含まれる。

【0074】

別の態様において、そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２組み換えタンパク質は本発明の３価組成物中に少なくとも０．２μｇの抗原／最終的な免疫原性組成物１ｍｌ（μｇ／ｍｌ）のレベルで含まれる。さらなる態様において、そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２組み換えタンパク質の含有レベルは約０．２から約４００μｇ／ｍｌまでである。さらに別の態様において、そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２組み換えタンパク質の含有レベルは約０．３から約２００μｇ／ｍｌまでである。さらに別の態様において、そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２組み換えタンパク質の含有レベルは約０．３５から約１００μｇ／ｍｌまでである。さらに別の態様において、そのＰＣＶ２ ＯＲＦ２組み換えタンパク質の含有レベルは約０．４から約５０μｇ／ｍｌまでである。

【0075】

１態様において、本発明の３価免疫原性組成物には、少なくとも１種類のＭ．ｈｙｏ可溶性抗原（例えば２種類以上）、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）抗原、およびＰＲＲＳウイルス抗原の発明的組み合わせが含まれる。別の態様において、その組成物はブタにおいてＭ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する防御免疫応答を引き出す。

【0076】

１態様において、ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンは１回量、２ボトルワクチンとして提供される。例えば、一部の態様において、ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせが第１ボトル中で安定な液体配合物として提供され、ＰＲＲＳウイルスは第２ボトル中で凍結乾燥された状態で提供される。一部の態様において、追加のブタ抗原をその第１または第２ボトルのどちらかに添加することができる。

【0077】

１態様において、そのＰＲＲＳウイルス構成要素は凍結乾燥された、遺伝子改変された生ウイルスとして提供される。投与の前に、全ての３種類の抗原を動物に１回量中で投与することができるように、第１ボトルからのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの液体を用いて第２ボトル中のＰＲＲＳウイルスを再水和させることができる。ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンは現在存在するが、それらは３つに分かれたワクチンの同時投与を必要とする１回量の３ボトルワクチンとして提供されている（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）およびＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ）ことを特筆する。

【0078】

ＰＲＲＳの病因因子はオランダで最初に分離され、レリスタッドウイルスと名付けられた。このウイルスは国際公開第９２／２１３７５号（Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｄｉｅｇｅｎｅｅｓｋｕｎｄｉｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ）において記載された。欧州型ＰＲＲＳウイルスの分離株はパリのパスツール研究所に番号Ｉ−１１０２で寄託された。北米型は欧州型ウイルスの分離とほぼ同時に分離され、国際公開第９３／０３７６０号（Collins et al.）において記載されている。北米型ウイルスの分離株はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に番号ＶＲ−２３３２で寄託された。

【0079】

異なる株が欧州および北米ウイルス型の両方から分離されている。国際公開第９３／０７８９８号（Ａｋｚｏ）は、ＣＮＣＭ（パスツール研究所）に番号Ｉ−１１４０で寄託された欧州株およびそれに由来するワクチンを記載している。また、国際公開第９３／１４１９６号（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘ）は、フランスで分離され、ＣＮＣＭ（パスツール研究所）に番号Ｉ−１１５３で寄託された新しい株を記載している。さらに、欧州特許第０５９５４３６ Ｂ１号（Ｓｏｌｖａｙ）は、最初に記載された株よりも病毒性の高い新しい北米型株およびそのワクチンを記載している。この株はＡＴＣＣに寄託されているが、その寄託番号はその特許出願において詳細に記載されていない。加えて、スペイン特許第２０７４９５０ ＢＡ号（Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｉｂｅｒｉｃａ）およびその対応特許である英国特許第２２８２８１１ Ｂ２号は、いわゆる“スペイン株”を記載しており、それは他の欧州および北米株とは異なっている。この“スペイン株”は欧州動物細胞系統保存機関（ＥＡＣＣＣ）に番号Ｖ９３０７０１０８で寄託されている。

【0080】

本発明のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物における使用のための適切なＰＲＲＳウイルス抗原には、北米型ＰＲＲＳウイルス分離株、中国型ＰＲＲＳウイルス株、および欧州型ＰＲＲＳウイルス株、ならびにそのような分離株／株の遺伝子改変版が含まれる。１態様において、本発明に従う組成物中で用いられるＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は北米型ＰＲＲＳウイルスである。

【0081】

一部の態様において、この発明の組成物において用いられるＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は、Ｐ１２９と名付けられた北米型ＰＲＲＳウイルス分離株またはその生きた遺伝子改変版である。好ましくは、その遺伝子改変されたＰＲＲＳウイルスは病原性感染をもたらすことができないが、野生型ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する有効な免疫防御応答を引き出すことができる。

【0082】

本発明の組成物における使用のための遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスは、感染性クローンから産生することができる。Ｐ１２９と名付けられた北米型ＰＲＲＳウイルス分離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は米国特許第６，５００，６６２号において記載されており、それは参照により本明細書に完全に援用される。Ｐ１２９のｃＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＡＦ４９４０４２において、および米国特許第６，５００，６６２号において開示されている。

【0083】

１態様において、本発明の組成物における使用のためのＰ１２９の非病毒性形態のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６により表される。しかし、本発明はこの配列に限定されない。この配列およびＰ１２９の他の非病毒性形態の配列は２０１１年１１月９日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５５００３号において記載されており、その内容（この国際出願に基づくあらゆる米国国内段階出願が含まれる）は参照により本明細書にそのまま援用される。好ましくは、そのＰＲＲＳウイルスはインターフェロンに媒介される機能の下方制御を妨げるように改変されている。

【0084】

他の態様において、本発明の組成物において用いられるＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は、ＩＳＵ−５５と名付けられたＰＲＲＳウイルス分離株である。そのＩＳＵ−５５分離株はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に受け入れ番号ＶＲ２４３０の下で寄託された。ＩＳＵ−５５分離株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ５遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７により表される。ＩＳＵ−５５分離株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８により表される。

【0085】

本組成物中で用いることができる別の適切な北米型ＰＲＲＳウイルス分離株はＩＳＵ−１２であり、それはＡＴＣＣに受け入れ番号ＶＲ２３８５［３回プラーク純化されたもの］およびＶＲ２３８６［プラーク純化されていないもの］の下で寄託された。この発明の組成物において用いることができるさらに他の適切な北米型ＰＲＲＳウイルス分離株は、以下の分離株：ＩＳＵ−５１、ＩＳＵ−３９２７、ＩＳＵ−１８９４、ＩＳＵ−２２およびＩＳＵ−７９であり、それはそれぞれＡＴＣＣに受け入れ番号ＶＲ２４９８、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７５、ＶＲ２４２９およびＶＲ２４７４の下で寄託された。これらのＩＳＵ分離株のいずれかの遺伝子改変版をこの発明の組成物において用いることができる。これらのＩＳＵ分離株およびＩＳＵ−５５分離株は、Ｐａｕｌらへの以下の米国特許において詳細に記載されており：米国特許第５，６９５，７６６号、第６，１１０，４６７号、第６，２５１，３９７号、第６，２５１，４０４号、第６，３８０，３７６号、第６，５９２，８７３号、第６，７７３，９０８号、第６，９７７，０７８号、第７，２２３，８５４号、第７，２６４，８０２号、第７，２６４，９５７号、および第７，５１７，９７６号、その全ては参照により本明細書にそのまま援用される。

【0086】

さらに他の態様において、本発明に従う組成物において用いられるＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に番号ＶＲ−２３３２で寄託された北米型またはその遺伝子改変版である。例えば、そのＰＲＲＳウイルスはＡＴＣＣ ＶＲ２３３２として同定される分離株に基づく改変された生ウイルスであることができ、それはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ， Ｉｎｃ．からのＩＮＧＥＬＶＡＣ（登録商標）ＰＲＲＳ ＡＴＰおよびＩＮＧＥＬＶＡＣ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶにおいて用いられている。

【0087】

さらに他の態様において、本発明の組成物において用いられるＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は欧州型ＰＲＲＳウイルス分離株またはレリスタッドウイルスまたはそれらの遺伝子改変版である。適切なＰＲＲＳウイルス株の例は、上記で記載した寄託番号Ｉ−１１０２として同定される。Ｉ−１１０２寄託株（ｄｅｐｏｓｉｔ）に対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列はＷｅｎｓｖｏｏｒｔらへの米国特許第５，６２０，６９１号において記載されており、それは参照により本明細書に完全に援用される。欧州型ＰＲＲＳウイルス分離株またはレリスタッドウイルスの感染性クローンの調製が米国特許第６，２６８，１９９号において記載されており、それは参照により本明細書に完全に援用される。

【0088】

適切なＰＲＲＳウイルス分離株の他の例には、上記で記載された分離株が含まれるが、それらに限定されない。また、そのＰＲＲＳウイルス分離株の生きた遺伝子改変版を本発明の組成物において用いることができる。感染性クローンを用いてそのような生きた遺伝子改変生物を再形成することができる。

【0089】

当業者には、ＰＲＲＳウイルス配列の変異体を本発明の組成物において用いることができることは理解されている。そのような変異体は、配列の同一性において１０〜２０％も異なり、なおそれを免疫原性組成物において有用にする抗原性特性を保持している可能性がある。好ましくは、そのＰＲＲＳウイルス変異体は野生型ＰＲＲＳウイルス分離株の完全長ゲノム配列との少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにもっと好ましくは少なくとも９５％の配列の同一性を有する。免疫学的組成物の抗原性特性は、例えば負荷実験により推定することができる。さらに、改変されたＰＲＲＳウイルス抗原の抗原性特徴は、その改変された抗原が野生型ＰＲＲＳウイルス抗原と比較した場合にその防御免疫の少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％を与える場合、まだ保持されている。

【0090】

１態様において、そのＰＲＲＳウイルス抗原構成要素は遺伝子改変された生ウイルスであり、それは本発明の組成物中に少なくとも２．１≦ＴＣＩＤ_５０≦５．２のレベルで含まれ、ここでＴＣＩＤ_５０は抗原定量化（インビトロ力価試験）により決定される５０％組織培養感染量である。

【0091】

本発明のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物のＰＣＶ２抗原構成要素はキメラ１型−２型サーコウイルスの形態であることができ、そのキメラウイルスにはブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を発現する不活化組み換えブタサーコウイルス１型が含まれる。別の態様において、本発明のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物のＰＣＶ２抗原構成要素は組み替えＯＲＦ２タンパク質の形態である。

【0092】

ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ組成物における使用のための適切なＰＣＶ２抗原は、上記で記載したＰＣＶ２分離株のいずれかならびに他のＰＣＶ２分離株に由来することができる。本発明の組成物において用いられるべき適切なＰＣＶ２抗原には、上記で記載したＰＣＶ２配列およびその変異体が含まれるが、それらに限定されない。

【0093】

本発明のワクチンは、受け入れられている慣習に従って、（適用可能ならば）ヒトが含まれる動物のための許容可能なキャリヤー、例えば標準的な緩衝剤、安定剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤が含まれるように配合することができ、持続放出を促進するように配合することもできる。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等が含まれる。等張性のための添加剤には、とりわけ塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定剤にはとりわけアルブミンが含まれる。他の適切なワクチンビヒクルおよび添加剤は、改変生ワクチンの配合において特に有用であるワクチンビヒクルおよび添加剤を含め、当業者に既知であり、または明らかになるであろう。例えば、参照により本明細書に援用されるRemington's Pharmaceutical Science, 第１８版, 1990, Mack Publishingを参照。

【0094】

本発明のワクチンは、例えばとりわけアジュバントまたはサイトカインのような、さらに１種類以上の追加の免疫調節構成要素を含むことができる。本発明の組成物における使用に関する適切なアジュバントのタイプには、以下のアジュバントが含まれる：水中油型アジュバント、ポリマーおよび水のアジュバント、油中水型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、ビタミンＥアジュバントおよびそれらの組み合わせ。アジュバントの一部の具体的な例には以下のものが含まれるが、それらに限定されない：完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、バシラス・カルメット・ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）、水酸化アルミニウムゲル、グルカン、デキストラン硫酸、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、Ｂａｃｔｏアジュバント、特定の合成ポリマー、例えばポリアミノ酸およびアミノ酸のコポリマー、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州アトランタ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州エメリービル）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、およびＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、“ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ”（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ、ジョージア州アセンズ）、パラフィン油、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、モンタナ州ハミルトン）、ムラミルジペプチド等。

【0095】

本発明のワクチンにおいて有用な水中油型エマルジョンの限定的でない例には、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ １／２配合物が含まれる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０界面活性剤（ＩＣＩ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００μｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型エマルジョンである。改変ＳＥＡＭ １／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌ Ｑｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型エマルジョンである。

【0096】

本発明の組成物において有用なアジュバントの別の例は、ＳＰオイルである。明細書および特許請求の範囲において用いられる際、用語“ＳＰオイル”は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、スクアレン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよび緩衝塩溶液を含む油エマルジョンを示す。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、固体および液体構成要素の懸濁を助ける界面活性剤である。これらの界面活性剤は、商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の下でポリマーとして商業的に入手可能である。好ましい界面活性剤はポロキサマー４０１であり、それは商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ−１２１の下で商業的に入手可能である。一般に、ＳＰ油エマルジョンは、約１〜３％体積／体積のブロックコポリマー、約２〜６％体積／体積のスクアレン、より詳細には約３〜６％のスクアレン、および約０．１〜０．５％体積／体積のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを含み、残りの部分は緩衝塩溶液であろう免疫刺激アジュバント混合物である。１態様において、そのＳＰオイルエマルジョンは最終組成物中に約１％〜２５％、好ましくは約２％〜１５％、より好ましくは約５％〜１２％ｖ／ｖのｖ／ｖ量で存在する。

【0097】

本発明の組成物における使用に関する適切なアジュバントのさらに別の例は、油、通常は軽質流動パラフィン中に溶解した脱油レシチンからなるＡＭＰＨＩＧＥＮ（商標）アジュバントである。

【0098】

本発明の組成物において有用なアジュバントの他の例は、以下の専売のアジュバントである：Ｍｉｃｒｏｓｏｌ Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）二重（ｄｕｅｌ）エマルジョンアジュバントシステム、Ｅｍｕｎａｄｅアジュバント、およびＸｓｏｌｖｅアジュバント。ＥｍｕｎａｄｅおよびＸｓｏｌｖｅアジュバントは両方とも水中軽鉱油のエマルジョンであるが、Ｅｍｕｎａｄｅはａｌｈｙｄｒｏｇｅｌも含有し、ｄ，ｌ−α−トコフェリルアセテートはＸｓｏｌｖｅアジュバントの一部である。本発明の組成物における使用に関する適切なアジュバントのさらに別の例は、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（商標）アジュバント（油中水型アジュバント）である。適切なアジュバントのさらに別の例は、カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））に基づくアジュバントである。好ましいＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）アジュバントには、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４ポリマーおよびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９４１ポリマーが含まれる。

【0099】

１態様において、そのアジュバントまたはアジュバント混合物は用量あたり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で添加される。別の態様において、そのアジュバント／アジュバント混合物は用量あたり約２００μｇ〜約５ｍｇの量で添加される。さらに別の態様において、そのアジュバント／アジュバント混合物は用量あたり約３００μｇ〜約１ｍｇの量で添加される。

【0100】

そのアジュバントまたはアジュバント混合物は典型的には本発明のワクチン組成物中に約１％〜２５％、好ましくは約２％〜１５％、より好ましくは約５％〜１２％ｖ／ｖのｖ／ｖ量で存在する。

【0101】

そのワクチン中に含ませることができる他の“免疫調節剤”には、例えば１種類以上のインターロイキン類、インターフェロン類、または他の既知のサイトカイン類が含まれる。１態様において、そのアジュバントはシクロデキストリン誘導体またはポリ陰イオン性ポリマー、例えばそれぞれ米国特許第６，１６５，９９５号および第６，６１０，３１０号において記載されているシクロデキストリン誘導体またはポリ陰イオン性ポリマーであることができる。

【0102】

さらなる観点は、本発明に従う免疫原性組成物を調製するための方法に関する。この方法には以下の工程が含まれる：ｉ）Ｍ．ｈｙｏを適切な培地中で１８〜１４４時間の範囲の期間にわたって培養し；ｉｉ）続いてそのＭ．ｈｙｏ培養物を不活化し；ｉｉｉ）その不活化された培養液を回収し、ここでその不活化された培養液は可溶性液体画分および不溶性細胞性物質の両方を含むＭ．ｈｙｏ全細胞調製物を含み；ｉｖ）その可溶性液体画分を不溶性細胞性物質から分離し；ｖ）ＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方をその分離された可溶性液体画分から実質的に除去してＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分を形成し；そしてｖｉ）続いてそのＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性部分をＰＣＶ２抗原およびＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせる。一部の態様において、工程ｖｉ）には、ＰＣＶ２抗原およびＭ．ｈｙｏ可溶性部分の両方が含まれる使用準備済の液体組成物を凍結乾燥されたＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせることが含まれる。

【0103】

Ｍ．ｈｙｏを培養するための適切な培地の例は、ＰＰＬＯブロス（マイコプラズマブロス基礎培地）であり、それは栄養強化物質を補った場合マイコプラズマを分離および培養するために用いられる。

【0104】

一部の態様において、Ｍ．ｈｙｏの培養物を後期対数増殖期まで増殖させ、その後その培養物を不活化する。一部の他の態様において、その培養物をｐＨを（例えば約７．８まで）上げることにより不活化する。これはその生産培養物（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）を不活化剤、例えばバイナリーエチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）（ＢＥＩ）に曝露することにより行われる。ＢＥＩはＬ−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）の生産培養物中での保温の間にその場で生成される。続いて、その不活化された培養物のｐＨを、例えば１当量のその溶液内の不活化剤を中和する薬剤を添加することにより中和する。一部の態様において、その不活化剤はＢＥＩであり、その中和剤はチオ流酸ナトリウムである。１態様において、その不活化された培養物のｐＨをチオ流酸ナトリウムを添加することにより約７．４に調節する。

【0105】

一部の態様において、Ｍ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性液体画分を一般に用いられる方法を用いて不溶性細胞性物質から分離する。１態様において、この分離は濾過工程による。別の態様において、この分離は遠心分離工程による。さらに別の態様において、その分離は沈殿工程による。

【0106】

１態様において、不活化され中和されたＭ．ｈｙｏ全細胞調製物の可溶性液体画分をプロテインＡ樹脂で処理してその中のＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を実質的に除去する。他の態様において、プロテインＧ樹脂を用いてその可溶性液体画分中に含有されるＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を実質的に除去することができる。ＩｇＧおよび抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方をプロテインＡまたはプロテインＧ樹脂のどちらかを用いて除去するための方法は、当該技術で周知である。

【0107】

さらなる観点によれば、本発明に従う３価免疫原性組成物を調製するための方法は、上記で記載したような可溶性Ｍ．ｈｙｏ抗原を調製し、これをＰＣＶ２抗原、ＰＲＲＳウイルス抗原、適切なアジュバント、および１種類以上の薬学的に許容可能なキャリヤーと混合することを含む。この方法には場合によりＰＣＶ２抗原および可溶性Ｍ．ｈｙｏ抗原を組み合わせて二価組成物を形成し、続いてこの二価組成物を単価ＰＲＲＳウイルス抗原組成物に添加して３価組成物を形成することが含まれる。

【0108】

本発明のさらなる観点はキットに関する。“キット”は、一緒にまとめられた複数の構成要素を指す。１態様において、本発明に従うキットには、ＰＣＶ２抗原およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）全細胞調製物の可溶性部分の両方が含まれる組成物を含む第１ボトル（または他の適切な容器（ｒｅｃｅｐｔａｂｌｅ））ならびにＰＲＲＳウイルス抗原を含む第２ボトルが含まれ、ここでそのＭ．ｈｙｏ調製物の可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧおよび（ｉｉ）抗原／免疫グロブリン免疫複合体の両方を実質的に含まない。１態様において、そのキットにはさらに取扱い説明書が含まれる。

【0109】

一部の態様において、そのキットの第１ボトル中のＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせは使用準備済の液体組成物として提供される。さらなる態様において、そのＰＲＲＳウイルス抗原は遺伝子改変された生ウイルスの形態であり、それは凍結乾燥状態で提供される。そのような場合では、その取扱い説明書には、その第２ボトル中のＰＲＲＳウイルス構成要素をＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせを含有する第１ボトルからの液体内容物を用いて再水和させるための指示が含まれるであろう。その取扱い説明書には、好ましくはその第１および第２ボトルからの組み合わせた内容物をブタに投与するための指示も含まれる。

【0110】

一部の態様において、この発明に従う免疫原性組成物は、Ｍ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２およびＰＲＲＳウイルスに対する母系由来抗体を有するブタに投与される。他の態様において、本発明の免疫原性組成物は、Ｍ．ｈｙｏ、ＰＣＶ２、およびＰＲＲＳウイルスに対する母系由来抗体を有するブタに投与される。

【0111】

一部の態様において、本発明に従う３価免疫原性組成物は３週齢以上の子ブタに投与される。しかし、本発明に従う３価ワクチン組成物は若雌ブタを繁殖前に再ワクチン接種するために用いることもできることが意図されている。当該技術で既知であるように、若雌ブタは妊娠したことがない雌のブタである。ワクチン接種された若雌ブタは、母系由来抗体をそれらの授乳している新生仔に初乳を介して渡すであろう。

【0112】

さらに、本発明に従う３価ワクチンは繁殖している畜群を年１回再ワクチン接種するために用いることができることが意図されている。好ましくは、本発明に従う３価ワクチンは１回量でブタ（例えば子ブタまたは若雌ブタ）に投与される。１態様において、本発明に従う多価ワクチンは別々のＰＣＶ２およびＭ．ｈｙｏ単価ワクチンを投与前に混合する必要がなく、すなわち、そのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ構成要素は１つのボトル中に収容された使用準備済の配合物として提供される。別の態様において、多価配合物は、第１ボトル中に収容された二価ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏワクチンを第２ボトル中に収容された単価ＰＲＲＳワクチンと混合することを必要とする。場合により、追加の抗原をこれらのボトルのどちらかに添加することができる。

【0113】

一部の態様において、免疫の開始は本発明に従う３価ワクチン組成物によるワクチン接種の２〜３週間後からである。他の態様において、免疫の期間は本発明に従う３価ワクチン組成物によるワクチン接種後約１７〜２３週間である。

【0114】

以下の実施例は、本発明に従う好ましい材料および手順を述べる。しかし、これらの実施例は説明としてのみ提供されているのであって、その中のいずれも本発明の範囲全体に対する限定とみなされるべきではない。

【実施例】

【0115】

実施例１：ＰＣＶ２と組み合わせ可能なＭ．ｈｙｏ抗原に関するマイコプラズマ・ハイオニューモニエの産生法
Ｍ．ｈｙｏの発酵および不活化
シードスケール（ｓｅｅｄ ｓｃａｌｅ）および抗原生成のための培地は以下のように調製された。ブタ心臓由来胸膜肺炎（Ｐｌｅｕｒｏｐｅｎｕｍｏｎｉａ）様生物（ＰＰＬＯ）ブロス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号２１４９８）を製造業者の指示通りに作製し（すなわち２１ｇ／Ｌ）、酵母抽出物溶液をＵＳＰ中で２１ｇ／Ｌで作製した。次いで酵母抽出物溶液をＰＰＬＯに６．２５％で添加し、その混合物を１２１℃で３０分以上加熱することにより滅菌した。システイン塩酸塩を９０ｇ／Ｌで調製し、濾過滅菌した。デキストロース溶液を、ＵＳＰ水１リットルあたり４５０ｇのデキストロースを添加し、続いて加熱滅菌することにより作製した。最終的な培地を調製するため、ブタ血清をその基礎培地に１０％で添加し、続いてシステインを０．０１％で、デキストロースを１．０％で添加した。その培地に１０％ｖ：ｖのＭ．ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｅｕｍｏｎｉａｅ）（株Ｐ−５７２２−３）の対数期培養物を植え付けた。その培養物を３７℃に保ち、ｐＨおよびｄＯをそれぞれ７．０および２５％で維持した。後期対数増殖期において、その培養物を２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）から生成されるアジリジン化合物であるバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）により不活化した。具体的には、不活化は２−ブロモエチルアミン臭化水素酸塩（ＢＥＡ）を４ｍＭの終濃度まで添加することによりｐＨを７．８に上げ、２４時間保温することにより行われた。ＢＥＩを、チオ流酸ナトリウムを１：１のモル比で添加し、続いてさらに２４時間保温することにより中和した。その不活化された培養液を、さらなる処理まで２〜８℃で保った。

【0116】

実施例２：キメラブタサーコウイルス（ｃＰＣＶ）１−２の生成法
ｃＰＣＶ１−２を、病原性ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の免疫原性カプシド遺伝子を非病原性ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のゲノムバックボーン中にクローニングすることにより構築した。そのキメラＤＮＡクローンの構築に関する手順は、例えば米国特許第７，２７９，１６６号において記載されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。そのキメラウイルスの感染性ストックをＤｒ．Ｘ．Ｊ．Ｍｅｎｇ（バージニア工科大学、バージニア州ブラックスバーグ）から得て、それを用いて０．０５％ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ）、３０μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫酸塩、および５％ウシ胎児血清を補った最少必須培地（ＭＥＭ）中で増殖させたブタ腎臓（ＰＫ）−１５細胞を感染させた。結果として得られたｃＰＣＶ１−２に感染したＰＫ−１５細胞を、２〜３％のウシ胎児血清を含むことを除いて同じ増殖培地を用いてさらに４回連続して継代することにより、さらに増やした。５回目の継代培養物を凍結し、融解させ、濾過し、得られた溶解物を用いてプレマスターシード（ｐｒｅ−ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ）を調製し、続いてマスターシードを調製した。

【0117】

ウイルスシードを生成するために用いた培地は、ウイルスストックの生成において用いた培地と同じであった。その増殖培地に関して、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または均等物がＰＫ−１５細胞株を増殖のために蒔く（ｐｌａｎｔｉｎｇ）ために用いることができる基礎培地である。その増殖培地に、１０％までのウシ血清、０．５％までのラクトアルブミン加水分解物、０．５％までのウシ血清アルブミン、および３０μｇ／ｍＬまでのゲンタマイシンを補うことができる。ウイルス繁殖培地に関して、ＭＥＭ、ＯｐｔｉＭＥＭ、または均等物が用いられる。そのウイルス繁殖培地に、０．５％までのラクトアルブミン加水分解物、２％までのウシ血清、０．５％までのウシ血清アルブミン、および３０μｇ／ｍＬまでのゲンタマイシンを補うことができる。必要に応じて、細胞を維持するために５ｇ／Ｌまでのグルコースおよび５ｍｍｏｌ／ＬまでのＬ−グルタミンをその増殖培地および／またはそのウイルス繁殖培地に添加することができる。

【0118】

そのｃＰＣＶ１−２マスターシードウイルスをＰＫ−１５細胞の細胞懸濁液に添加し、３時間までの間吸着させる。シードウイルスを０．１〜０．０００１の感染多重度（ＭＯＩ）を与えるように増殖基礎培地中で希釈する。

【0119】

ＰＫ−１５細胞の培養物に、最初にワーキングシードウイルスを細胞を蒔く時点で、または細胞がおおよそ２０％〜５０％培養密度に達した際に植え付ける。この最初の継代は、抗原ストックの生成のための“１工程感染法”と呼ぶことができ、またはさらに連続継代のために用いることができる。連続継代に関して、ｃＰＣＶ１−２に感染したＰＫ−１５細胞を、ウイルス繁殖のために、１：５〜２０の比率での連続分割によりさらに７継代まで拡張する。前の継代からの感染した細胞懸濁液を含有する培地は、次の継代のためのシード物質の役目を果たす。そのｃＰＣＶ１−２に感染した細胞を、細胞が９０％以上の培養密度に達した際に、それぞれの継代に関して３（３）〜１４日間３６±２℃で培養する。そのｃＰＣＶ１−２ウイルスはウイルス複製の間に観察可能な細胞変性変化を引き起こす。回収時に、細胞の丸まりおよびかなりの浮遊している破壊片が観察される。培養物を細菌または真菌の汚染の視覚的な証拠に関しても観察する。ｃＰＣＶ抗原に関する回収間の培養時間を下記の表１において提供する：

【0120】

【表1】

【0121】

ｃＰＣＶ１−２培養液を無菌の容器中に回収し、既知の方法を用いたマイコプラズマ試験のために試料採取する。複数回の回収をローラーボトル、バイオリアクターおよび灌流容器から行うことができる。

【0122】

回収したｃＰＣＶ１−２ウイルスの不活化の前に、１以上の抗原ロットを限外濾過により（例えば６０倍まで）濃縮することができる。その濃縮物を平衡塩類溶液で洗浄して血清タンパク質を低減することができる。

【0123】

ｃＰＣＶ１−２ウイルスの不活化、弱毒化、または解毒の方法がここで記載されるであろう。ｃＰＣＶ抗原の濃縮後、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）をプールしたｃＰＣＶ１−２ウイルス物質に添加して、０．２％ｖ／ｖのおおよその濃度を得る。次いでそのプールしたウイルス液を最低１５分間攪拌し、次いでその不活化バルク抗原液を第２の無菌容器に移す。移した抗原液を２〜７℃で一定して攪拌しながら最低２４時間維持する。最低２４時間後、０．２％ｖ／ｖのＢＰＬの２回目の添加分をそのプールした懸濁液に添加する。その内容物を続いて攪拌し、第３の容器に移し、２〜７℃で一定して攪拌しながら８４時間より短くない追加の時間の間維持する。一般に、その総不活化時間は１０８時間より短くなく、１２０時間より長くない。その不活化法を下記の表２において要約する。

【0124】

【表2】

【0125】

不活化を０．１Ｍより高くない終濃度のチオ硫酸ナトリウムの溶液の添加により終了する。不活化抗原ストックのｐＨを、ＮａＯＨまたはＨＣｌを用いて約６．８に調節する。不活化後、代表試料をそのプールから採取して不活化の完了に関して試験する。その不活化ｃＰＣＶ１−２抗原製品を、力価ＥＬＩＳＡにより測定した際に１．０ＲＰより大きい目標値を満たすように標準化する。

【0126】

実施例３：Ｍ．ｈｙｏ抗原の下流の処理およびこれらの処理された抗原の分析試験
Ｍ．ｈｙｏ抗原の下流の処理：
（上記で実施例１において記述したように調製された）不活化された発酵液を、以下のようなそれぞれの示された群に関して処理した。これらの処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を、下記の実施例４において用いた。

【0127】

Ｔ０２：（バルク全体） 未処理。

【0128】

Ｔ０３：（１０倍ＵＦ濃縮） １００ＫＤａ分子量カットオフ膜（中空繊維）によるタンジェント流濾過により濃縮した。最終的な体積の低減は１０倍に等しかった。

【0129】

Ｔ０４およびＴ０５：（１０倍ＵＦ濃縮および遠心分離） （Ｔ０３からの）濃縮したマイコプラズマ細胞を約２０，０００ｇでの遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ｍｏｄｅｌ ＲＣ５Ｂ）により集め、ＰＢＳで１回洗浄した。

【0130】

Ｔ０６およびＴ０７：（１０倍遠心分離） 不活化した発酵液を約２０，０００ｇで遠心分離し（Ｓｏｒｖａｌｌ ｍｏｄｅｌ ＲＣ５Ｂ）、細胞をＰＢＳ中で再懸濁し、続いて追加の遠心分離を行うことにより１回洗浄した。最終的な体積の低減は１０倍に等しかった。

【0131】

Ｔ０８：（１０倍遠心分離および加熱） マイコプラズマ細胞を濃縮し、Ｔ０６に従って濃縮および洗浄し、６５℃で１０分間加熱した。

【0132】

Ｔ０９：（無細胞上清） Ｔ０６に関して記載したような最初の遠心分離から集めた上清を、０．２ミクロンフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過滅菌した。

【0133】

Ｔ１０：（無細胞上清−プロテインＡ処理） （Ｔ０９に従って調製された）無菌の上清をプロテインＡ樹脂（プロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ）と１０：１の体積比で４時間混合した。樹脂を滅菌濾過により除去し、濾過された流体を２〜８℃で保管した。このプロセスは、抗体および免疫複合体を除去するために発酵後の“下流の”プロテインＡ処理を用いる。本発明は上流のタンパク質Ａ処理を除外しないが、本発明者らは、Ｍ．ｈｙｏの場合、増殖培地の上流のプロテインＡ処理は未処理の培地と比較してより低く一貫しないｐ４６の結果をもたらすことを見出している（データは示していない）。

【0134】

Ｍ．ｈｙｏの下流処理された抗原の分析試験
（上記で記載したように調製された）下流処理されたＭ．ｈｙｏ抗原調製物を、Ｍ．ｈｙｏ特異的ｐ４６抗原の回収およびＰＣＶ２抗体の存在に関して試験した。加えて、これらのＭ．ｈｙｏ抗原調製物を、遺伝子型１（ｇ１ＴＴＶ）および遺伝子型２（ｇ２ＴＴＶ）が含まれるトルクテノウイルス（ＴＴＶ）の存在に関して試験した。その結果を下記で表３において示す。

【0135】

【表3】

【0136】

上記の表３に関して、Ｍ．ｈｙｏ特異的ｐ４６抗原の回収がＭ．ｈｙｏの下流処理された抗原の調製のそれぞれに関して実証された。加えて、以下の処理はＰＣＶ２抗体をうまく除去した：１０倍ＵＦ濃縮および遠心分離、１０倍遠心分離、１０倍遠心分離および加熱、ならびに無細胞上清（プロテインＡ処理）。ＴＴＶに関して、以下の処理はｇ１ＴＴＶをうまく除去した：１０倍ＵＦ濃縮および遠心分離、１０倍遠心分離および加熱、ならびに無細胞上清（プロテインＡ処理）。１０倍ＵＦ濃縮および遠心分離と名付けられた処理のみがｇ２ＴＴＶを除去した。遺伝子型１および２が含まれるトルクテノウイルス分離株は米国特許出願公開第２０１１０１５０９１３号において記載されており、それは参照により本明細書にそのまま援用される。

【0137】

当該技術においてプロテインＡはＩｇＧに結合することが知られているため、当業者にはＰＣＶ２抗体だけでなくＰＲＲＳ抗体、ＨＰＳ抗体、およびＳＩＶ抗体が含まれる他のブタ抗体もプロテインＡ処理により有効に除去されるであろうことは理解されている。これは、この発明の無細胞のプロテインＡ処理されたＭ．ｈｙｏ上清を、抗原間の免疫学的干渉がないことにより、ＰＣＶ２抗原とだけではなく他のブタ抗原とも適合性にする。加えて、非防御的細胞破壊片の除去ならびに免疫グロブリンおよび抗原／免疫グロブリン複合体の除去はより安全なワクチンを作製することが当然予想される。

【0138】

実施例４：Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチン配合物の調製
全ての実験的なＭ．ｈｙｏワクチンは５％の終濃度のＡｍｐｈｉｇｅｎアジュバントを用いて配合された。加えて、全てのワクチンをｐ４６ ＥＬＩＳＡで標準化し、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）で保存した。その実験ワクチン配合物を、上記の処理Ｔ０２〜Ｔ１０に従って処理したＭ．ｈｙｏ抗原を用いて調製した。加えて、処理Ｔ０１はプラセボ（Ｍ．ｈｙｏ抗原なし、５％Ａｍｐｈｉｇｅｎアジュバントのみ）に対応しており、一方で処理Ｔ１１は有効期限が切れたバクテリンに基づくＭ．ｈｙｏワクチン（ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ−ＯＮＥ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）に対応する陽性対照である。これらの配合物を下記の表４において記載する。

【0139】

【表4】

【0140】

実施例５：異なる下流のプロセスからのＭ．ｈｙｏ抗原を用いたＭ．ｈｙｏワクチンのインビボ有効性の評価
この研究は、異なる下流のプロセス（ＤＳＰ）からのＭ．ｈｙｏ抗原を用いたマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンのインビボ有効性を評価するために実施された。３週齢のブタに、上記の表４において記載された１回量の異なるワクチン配合物を筋内接種した。１６匹の動物がその処置群のそれぞれに含まれていた。動物にワクチン接種の２１日後に病毒性Ｍ．ｈｙｏ野生分離株（ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅ）を用いて負荷をかけた。動物を負荷の２８日後に検死し、肺を取り出してＭ．ｈｙｏ感染と一致する硬化に関して採点した。Ｍ．ｈｙｏ負荷に対する防御に関する主な基準は肺硬化スコアであった。一般に、家畜地方病性肺炎により引き起こされる肺病変の大きさおよび増殖速度への有害な作用の間には関連があることが受け入れられている。下記の表５は、それぞれの処置群に関する肺病変スコアを含有する。統計的有意性はそれぞれの群に関する肺スコアの混合モデル分析により決定された。

【0141】

【表5】

【0142】

上記の表５に関して、異なる下流の処理からのＭ．ｈｙｏ抗原を用いた結果は、Ｔ０４以外の全ての実験ワクチンはプラセボと有意に異なることを示した。これらのＭ．ｈｙｏ病変の結果を図１においてグラフにより示す。図１において示されるように、Ｔ０４は許容できない結果を与えた。全ての他の処置はプラセボ（Ｔ０１）と有意に異なっていた。肺硬化スコアは、Ｔ０２、Ｔ０３およびＴ０９〜Ｔ１１はＭ．ｈｙｏ負荷に対する最も有効な防御を与えることを示した。

【0143】

実験ワクチンのｐ４６相対力価を、二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＤＡＳ ＥＬＩＳＡ）を用いることにより評価した。上記の表５において示したｐ４６ ＤＡＳ ＥＬＩＳＡの結果は、全ての実験ワクチンが目標力価を超えたことを示している。加えて、そのｐ４６相対強度は、１ヶ月の期間にわたるワクチンの貯蔵の間維持されるか、または増大するかのどちらかであった（データは示していない）。時間の経過にわたる力価の認知される増大が、熱処理した抗原を除いて、遠心分離した抗原において観察された。いずれか１つの理論により束縛されることを望むわけではないが、時間の経過に伴い細胞の“死骸（ｃａｒｃａｓｓｅｓ）”が壊れ、遠心分離した抗原の場合においてより多くの膜に結合したｐ４６抗原を放出したと思われる。

【0144】

実施例６：ＰＣＶ２抗原を用いた実験Ｍ．ｈｙｏワクチンの適合性の評価
この試験は、異なる下流のプロセスからのＭ．ｈｙｏ抗原を用いたＭ．ｈｙｏ実験ワクチンのＰＣＶ２抗原との適合性を評価するために実施された。そのＭ．ｈｙｏ実験ワクチン配合物は上記の表４および５において記載されている。これらのワクチンに関する観察されたｐ４６相対力価は上記の表５において記載されている。これらのＭ．ｈｙｏ実験ワクチンをそれぞれＰＣＶ２抗原と組み合わせた。この実施例において、そのＰＣＶ２抗原は、上記で実施例２において記載した通りに調製した死菌ＰＣＶ１型−２型キメラウイルス（Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＣＶ）であった。そのキメラウイルスを組成物中に約１．６≦ＲＰの初期レベルで含ませ、ここでそのＲＰは、有効参照ワクチンと比較したＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡ抗原定量化（インビトロ力価試験）により決定された相対力価単位である。

【0145】

実験Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２組み合わせ配合物をＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡにより評価した。その結果を図２において示す。図２において示されるように、以下の下流プロセスからのＭ．ｈｙｏ抗原調製物のみがＰＣＶ２抗原と適合性であった：限外濾過および遠心分離（Ｔ０４およびＴ０５）、遠心分離（Ｔ０６およびＴ０７）、遠心分離＋熱（Ｔ０８）およびプロテインＡ処理した上清（Ｔ１０）。これらの内で、Ｍ．ｈｙｏのプロテインＡ処理した上清は、キメラウイルスおよびＡｍｐｈｉｇｅｎアジュバントが含まれるがＭ．ｈｙｏ抗原は含まれないプラセボ対照と比較した場合に最もＰＣＶ２抗原と適合性であった。プロテインＡ処理した上清中のキメラＰＣＶウイルスのレベルは、プラセボに関する１．６９ＲＰと比較して１．５ＲＰであった。従って、プロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ可溶性抗原調製物およびキメラウイルスのＰＣＶ２抗原の間には免疫学的干渉はない、または最小限であると結論付けられた。

【0146】

上記の実施例５において実証されたプロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ上清のインビボ有効性は、本実施例において記載した結果と合わせて、プロテインＡ処理した上清はＭ．ｈｙｏ−ＰＣＶ２の組み合わせに関する有効なプラットフォームである可能性があることを示した。

【0147】

実施例７：異なるアジュバント配合物における１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンのＰＣＶ２有効性の評価
この研究は、異なるアジュバント配合物における１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンにおけるＰＣＶ２有効性を評価するために設計された。この実施例において、そのＰＣＶ２抗原は死菌ＰＣＶ１型−２型キメラウイルス（Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＣＶ）であった。そのキメラウイルスを、実質的にＩｇＧを含まないＭ．ｈｙｏ可溶性抗原調製物（すなわち、プロテインＡ処理した上清）と組み合わせた。

【0148】

液体の処理：
（上記で実施例１において記載した）不活化Ｍ．ｈｙｏ発酵液を、以下のような示した群のそれぞれに関して処理した。

【0149】

Ｔ０２〜Ｔ０４：（上記で記載した）生Ｍ．ハイオニューモニエ細胞を含有する発酵液を約２０，０００×ｇで遠心分離し（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ）、上清を集め、０．２μＭフィルターを通して滅菌した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（製品番号１７−５１９９−０３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１Ｌのクロマトグラフィーカラム中に充填した。貯蔵用緩衝液を除去し、２カラム体積の１Ｍ酢酸で処理した後、その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭ ＮａＰＯ４／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．０４で平衡化した。おおよそ２リットルの澄ませた／濾過したＭ．ハイオニューモニエ抗原含有液を、プロテインＡ樹脂に１００ｃｍ／ｈｒの流速で通した。その素通り画分を集め、０．２μＭフィルターにより滅菌した。

【0150】

Ｔ０５：これはＦｏｓｔｅｒａ ＰＣＶ様配合物（Ｍ．ｈｙｏ抗原なし）に対応する陽性対照である。このＦｏｓｔｅｒａ ＰＣＶ様配合物中のキメラウイルスのレベルは、おおよそ最小免疫用量（ＭＩＤ）配合レベルであった。そのキメラウイルスはそのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチン中に類似の配合レベルで含まれていた。

【0151】

全ての実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏワクチンは異なるアジュバント配合物を用いて配合された。その実験ワクチン配合物は、上記の処理Ｔ０２〜Ｔ０４に従って処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を用いて調製された。加えて、処理Ｔ０１はプラセボ（滅菌生理食塩水）に対応していた。

【0152】

全てのワクチンをｐ４６ ＥＬＩＳＡにより標準化し、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ）を用いて保存した。これらの実験配合物を下記の表６において記載し、ここで記号^＊はグローバル（ｇｌｏｂａｌ）Ｍ．ｈｙｏシードからのＭ．ｈｙｏ抗原（プロテインＡ処理した上清）を示し、記号^＊＊は治験中の獣医学用製品（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＩＶＰ）一連番号を示す。

【0153】

【表6】

【0154】

３週齢のブタに１回量の上記で表６において記載した異なるワクチン配合物を筋内接種した。１６匹の動物がその処置群のそれぞれに含まれていた。動物にワクチン接種の２１日後に病毒性ＰＣＶ２野生分離株を用いて負荷をかけた。

【0155】

図３は、異なるアジュバントプラットフォームを用いて観察されたＰＣＶ２ウイルス血症の結果（ＰＣＶ２定量的ＰＣＲ）を示すグラフである。ＰＣＶ２ウイルス血症が主要有効性変数として用いられたことを特筆する。そのＰＣＶ２ウイルス血症の結果はＤＮＡコピー数／ｍｌとして示されている。図３において示されるように、全ての処置は２８、３５および４２日目（負荷は２１日目であった）においてプラセボと比較して有意に低いウイルス血症を有していた。１０％ ＳＰオイルアジュバントは２８および３５日目において５％Ａｍｐｈｉｇｅｎと比較して有意に低いウイルス血症を有していた。５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ＋５％ＳＬＣＤアジュバントは、２８および３５日目において５％Ａｍｐｈｉｇｅｎと比較して有意に低いウイルス血症を有していた。２０％ＳＬＣＤアジュバントプラットフォームは、２８、３５および４２日目において５％Ａｍｐｈｉｇｅｎと比較して有意に低いウイルス血症を有していた。

【0156】

ＰＣＶ２の血清学、ＰＣＶ２の糞便への排出、ＰＣＶ２の鼻への排出、細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答、リンパ球枯渇、および免疫組織化学（ＩＨＣ）も二次有効性変数として監視した。これらの結果がここで下記に記載されるであろう。

【0157】

図４は、その試験の１、２０および４２日目（負荷は２１日目であった）におけるＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。それぞれの試料の状態を試料対陽性比（Ｓ／Ｐ）として表した。図４において示されるように、２０％ＳＬＣＤは２０日目および４２日目の両方においてプラセボ（Ｔ０１）と有意に異なる唯一の処置であった。また、５％Ａｍｐｈｉｇｅｎは２０日目においてプラセボと有意に異なっていない唯一の処置であった。

【0158】

図５は、Ｔ０２〜Ｔ０４処理対プラセボ（Ｔ０１）により得られたＰＣＶ２の糞便への排出を示すグラフである。これらの結果は、ＰＣＶ２のＤＮＡのコピー数／ｍｌとして表されている。図５における結果は、全ての処置は４２日目においてプラセボと比較した際に有意により少ない糞便への排出を有していたことを示している。加えて、５％Ａｍｐｈｉｇｅｎおよび５％ＳＬＣＤ（Ｔ０４）は４２日目において５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｔ０３）と比較して有意により少ない糞便への排出を有していた。他には処置による差は認められなかった。

【0159】

図６は、Ｔ０２〜Ｔ０４処理対プラセボ（Ｔ０１）により得られたＰＣＶ２の鼻への排出を示すグラフである。これらの結果は、ＰＣＶ２のＤＮＡのコピー数／ｍｌとして表されている。図６における結果は、全ての処置は４２日目においてプラセボと比較した際に有意により少ない鼻への排出を有していたことを示している。加えて、２０％ＳＬＣＤ（Ｔ０５）は４２日目において５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ（Ｔ０３）と比較して有意により少ない鼻への排出を有していた。他には処置による差は認められなかった。

【0160】

図７（ＡおよびＢ）は、ＰＣＶ２特異的な細胞媒介免疫（ＣＭＩ）応答を測定するインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す２つのグラフである。ワクチン接種後／負荷前（図７Ａ）およびワクチン接種後／負荷後（図７Ｂ）のＣＭＩの結果が示されている。これらのグラフにおいて、５×１０^６細胞の刺激を有意であるとみなした（...）。全てのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチンはワクチン接種後に検出可能なＩＦＮ−γ応答を与えた。１０％ ＳＰオイル（Ｔ０２）はワクチン接種後に最も強いＩＦＮ−γ応答を駆り立てた（ｄｒｏｖｅ）。２０％ＳＬＣＤ（Ｔ０５）はより早い応答を誘導したが、２０日目において最も低い応答であった。大きな負荷後の応答が存在し、特にプラセボ群において見られた。加えて、その負荷後の応答はプラセボ群と比較してワクチン接種したブタの処置群においてより低かった。

【0161】

下記の表７は、プラセボと対比した実験処置により得られたリンパ球枯渇を示す。

【0162】

【表7】

【0163】

上記で表７において示した結果は、全てのワクチンがリンパ球枯渇に対する強い保護を与えたことを示している。また、統計的に有意なワクチン処置による差異は観察されなかった。

【0164】

下記の表８は、プラセボと対比した実験処置により得られた免疫組織化学を示す。

【0165】

【表8】

【0166】

上記で表８において示した結果は、全てのワクチンが免疫組織化学により証明されるようにＰＣＶ２コロニー形成に対する強い防御を与えたことを示している。また、統計的に有意なワクチン処置による差異は観察されなかった。

【0167】

結論として、この実施例において示した結果は、Ｍ．ｈｙｏ可溶性抗原調製物はＰＣＶ２有効性に干渉しないことを実証している。その結果は、全てのＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチン配合物はＰＣＶ２負荷に対する有効性を提供することも示している。加えて、その結果は、異なるアジュバント配合物を用いて得られたいくらかの統計的および数値的な差が存在し、１０％ＳＰオイルが最も強い有効性をもたらすことを示している。

【0168】

実施例８：異なるアジュバント配合物を用いた１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンのＭ．ｈｙｏ有効性の評価
この研究は、異なるアジュバント配合物を用いた１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンのＭ．ｈｙｏ有効性を評価するために設計された。そのＭ．ｈｙｏ抗原を１つのボトル中でブタサーコウイルス（１型−２型キメラ、またはＰＣＶ１−２、死菌ウイルス）と組み合わせた。

【0169】

液体の処理：
（上記で実施例１において記載した）不活化Ｍ．ｈｙｏ発酵液を、以下のようなそれぞれの示した群に関して処理した。

【0170】

Ｔ０２〜Ｔ０４：これらの処理は、上記で実施例７において処理群Ｔ０２〜Ｔ０４に関して記載した処理と同じであった。

【0171】

Ｔ０５：これは上記で実施例１において見出し“発酵および不活化”の下で記載したような不活化Ｍ．ｈｙｏ細胞（Ｍ．ｈｙｏバクテリン）を用いて配合された。

【0172】

全ての実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏワクチンは異なるアジュバント配合物を用いて配合された。その実験ワクチン配合物は、処理Ｔ０２〜Ｔ０４に従って処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を用いて調製された。加えて、処理Ｔ０１はプラセボ（無菌生理食塩水）に対応していた。処理Ｔ０５は有効期限が切れたＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（登録商標）ワクチンに対応する陽性対照であり、それはＭ．ｈｙｏバクテリンに基づくワクチンである（Ｐｆｉｚｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）。

【0173】

これらの実験配合物を下記の表９において記載し、ここで記号^＊はグローバルＭ．ｈｙｏシードからのＭ．ｈｙｏ抗原（プロテインＡ処理した上清）を示し、記号^＊＊は治験中の獣医学用製品（ＩＶＰ）一連番号を示す。

【0174】

【表9】

【0175】

３週齢のブタに１回量の上記で表９において記載した異なるワクチン配合物を筋内接種した。１４匹の動物がプラセボおよび１０％ＳＰオイル群の両方に含まれており、１３匹の動物が陽性対照群に含まれており、１６匹の動物が５％Ａｍｐｈｉｇｅｎおよび５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ＋５％ＳＬＣＤ群の両方に含まれていた。

【0176】

動物にワクチン接種の２１日後に病毒性Ｍ．ｈｙｏ野生分離株を用いて負荷をかけた。動物を負荷の２８日後に検死し、肺を取り出してＭ．ｈｙｏ感染と一致する硬化に関して採点した。下記の表１０は、それぞれの処置群に関する肺病変スコアを含有する。統計的有意性はそれぞれの群に関する肺スコアの混合モデル分析により決定された。

【0177】

【表10】

【0178】

上記で表１０において示したように、それぞれ４．３％および４．７％の平均肺スコアを有していた１０％ＳＰオイルおよび５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ処置群と比較した場合に、プラセボ群は１３．１％の平均肺病変スコアを有していた。１０％ＳＰオイルおよび５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ配合物は両方とも肺病変を低減し、および／または予防した。従って、その１０％ＳＰオイルまたは５％Ａｍｐｈｉｇｅｎを用いて配合した実験ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏワクチンは有効であると考えられた。ＰＣＶ２抗原はこれらの配合物のＭ．ｈｙｏ有効性に干渉しているようには見えなかった。

【0179】

対照的に、５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ＋５％ＳＬＣＤ群は１２．０％の平均肺病変スコアを有しており、それは、それがプラセボと比較した場合に異なっていなかった点で、許容できない結果であった。結果として、５％Ａｍｐｈｉｇｅｎ＋５％ＳＬＣＤを用いて配合した実験ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏワクチンは有効とは考えられなかった。

【0180】

低減した動物の数および肺病変スコアにおける高い変動性のため、統計的な処置の作用をこの研究において確証的に実証することはできなかった。この理由のため、１０％ＳＰオイル中のＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ実験配合物のＭ．ｈｙｏ有効性を試験するために別の研究を設計するであろうことが決められた。この反復研究を下記の実施例９において示す。

【0181】

実施例９：１０％ＳＰオイル中の１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ混合ワクチンのＭ．ｈｙｏ有効性の評価
この研究は、標準的なＭ．ｈｙｏ製造プロセスにより調製された対照ワクチンと比較した、ＩｇＧ除去のためにプロテインＡを利用する異なるＭ．ｈｙｏ製造プロセスにより調製された４種類の実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏワクチン（下記の表１１中の一連番号Ｌ０７１１ＲＫ１１、Ｌ０７１１ＲＫ１２、Ｌ０７１１ＲＫ１３およびＬ０７１１ＲＫ１４）のＭ．ｈｙｏ画分有効性を評価するために設計された概念実証である。これらの４種類の実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏワクチンのそれぞれには１０％ＳＰオイルがアジュバントとして含まれていた。

【0182】

液体の処理：
Ｔ０２：上記で実施例１において“発酵および不活化”の下で記載したような不活化Ｍ．ハイオニューモニエ抗原。

【0183】

Ｔ０３およびＴ０４：上記で実施例１において“発酵および不活化”の下で記載したような不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞を用いて配合した。

【0184】

Ｔ０５：Ｍ．ハイオニューモニエを増殖させるために用いられる培地のプロテインＡ処理。ＰＰＬＯ（ブタ心臓由来）を製造業者の指示通りに作製し（すなわち２１ｇ／Ｌ）、酵母抽出物溶液をＵＳＰ中で２１ｇ／Ｌで作製した。酵母抽出物溶液をＰＰＬＯに６．２５％で添加し、その混合物を１２１℃で３０分以上加熱することにより滅菌した。システイン塩酸塩を９０ｇ／Ｌで調製し、濾過滅菌した。デキストロース溶液を、ＵＳＰ水１リットルあたり４５０ｇのデキストロースを添加し、続いて加熱滅菌することにより作製した。最終的な培地を調製するため、ブタ血清をその基礎培地に１０％で添加し、続いてシステインを０．０１％で、デキストロースを１．０％で添加した。完成したＰＰＬＯ培地中の抗体をプロテインＡを用いた処理により除去した。簡潔には、１リットルのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（製品番号１７−５１９９−０３ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をガラスカラム（１０×１１．５ｃｍ）中に充填した。貯蔵用緩衝液を除去した後、そのカラムを２カラム体積の１Ｍ酢酸で処理した。その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭ ＮａＰＯ４、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）で平衡化した。１５リットルの完成したＰＰＬＯ培地をその樹脂上に１４０ｃｍ／ｈｒの線形流速で装填した。そのカラム素通り画分を集め、０．２ミクロンフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通して濾過滅菌した。その処理した培地を用いて、上記で“発酵および不活化”の下で記載したようにＭ．ハイオニューモニエ細胞を繁殖させた。（細胞が含まれる）不活化培養物全体を最終的なワクチン中に配合した。

【0185】

Ｔ０６：上記で実施例１において“発酵および不活化”の下で記載したように不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞を調製した。その不活化した発酵液を、約２０，０００×ｇで３０分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ）し、上清を０．２ｕＭ濾過により滅菌した。１１５ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（製品番号１７−１２７９−０４、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をクロマトグラフィーカラム（５×６ｃｍ）中に充填した。貯蔵用緩衝液を除去し、２カラム体積の１Ｍ酢酸で処理した後、その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭ ＮａＰＯ４／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．０１で平衡化した。おおよそ１．２リットルの澄ませた／濾過したＭ．ハイオニューモニエ抗原含有液を、その樹脂に１２０ｃｍ／ｈｒの流速で通した。その素通り画分を集め、０．２μＭフィルターにより滅菌した。

【0186】

Ｔ０７：上記で実施例１において“発酵および不活化”の下で記載したように不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞を調製した。その不活化した発酵液を、タンジェント流濾過により澄ませた。簡潔には、０．２μＭの公称孔径を有するポリエーテルスルホンフィルター（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、製品番号５６−４１０２−７１）を０．５Ｎの水酸化ナトリウム溶液で衛生化し、続いて滅菌ＵＳＰ水で大規模に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）すすいだ。不活化マイコプラズマ培養液をその装置に１４．６Ｌ／分を目標とした再循環速度および２〜３．４ＰＳＩの膜間圧で導入した。清澄化は室温で実施された。フィルターの透過液を集め、さらなる処理まで２〜８Ｃで保管した。１１５ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（製品番号１７−１２７９−０４、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をクロマトグラフィーカラム（５×６ｃｍ）中に充填した。貯蔵用緩衝液を除去し、２カラム体積の１Ｍ酢酸で処理した後、その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭ ＮａＰＯ４／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．０１で平衡化した。おおよそ２．３リットルの澄ませた／濾過したＭ．ハイオニューモニエ抗原含有液を、その樹脂に１２０ｃｍ／ｈｒの流速で通した。その素通り画分を集め、０．２μＭフィルターにより滅菌した。

【0187】

Ｔ０８：上記で“発酵および不活化”の下で記載したように不活化Ｍ．ハイオニューモニエ細胞を調製した。その不活化した発酵液を、約２０，０００×ｇで３０分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ）し、上清を０．２ｕＭ濾過により滅菌した。１１５ｍｌのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（製品番号１７−５１９９−０３ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をクロマトグラフィーカラム（５×６ｃｍ）中に充填した。貯蔵用緩衝液を除去し、２カラム体積の１Ｍ酢酸で処理した後、その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭ ＮａＰＯ４／１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ ７．０１で平衡化した。おおよそ１．２リットルの澄ませた／濾過したＭ．ハイオニューモニエ抗原含有液を、その樹脂に１２０ｃｍ／ｈｒの流速で通した。その素通り画分を集め、０．２ｕＭフィルターにより滅菌した。

【0188】

その実験ワクチン配合物は、上記の処理Ｔ０２〜Ｔ０８に従って処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を用いて調製された。Ｔ０２、Ｔ０３およびＴ０４は陽性対照に対応していた。加えて、Ｔ０１はプラセボ（滅菌生理食塩水）に対応していた。

【0189】

これらの実験配合物を下記の表１１において記載する。Ｍ．ｈｙｏ抗原は、グローバルＭ．ｈｙｏシードからのＭ．ｈｙｏ抗原（プロテインＡ処理した上清）に対応する。“プロテインＡ処理”の縦列中の情報は、そのＭ．ｈｙｏ上清が発酵の前または後のどちらでプロテインＡにより処理されたかを示している。

【0190】

【表11】

【0191】

３週齢のブタに１回量の上記で表１１において記載した異なるワクチン配合物を筋内接種した。１８匹のブタがそれぞれの処置群に含まれていた。

【0192】

動物にワクチン接種の２１日後に病毒性Ｍ．ｈｙｏ野生分離株を用いて負荷をかけた。動物を負荷の２８日後に検死し、肺を取り出してＭ．ｈｙｏ感染と一致する硬化に関して採点した。図８（ＡおよびＢ）は、それぞれの処置群に関する肺病変スコアを示す。統計的有意性はそれぞれの群に関する肺スコアの混合モデル分析により決定された。

【0193】

図８Ａおよび８Ｂにおいて示した肺病変の結果は、全ての処置の内で２つ（Ｔ０７およびＴ０８）のみが１００％のブタが＜５％肺病変のカテゴリーに入ったことを示している。強い統計的な差がこの研究において観察されたことを特筆する。

【0194】

本実施例における結果は、プロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ上清を用いて、かつＳＰオイルをアジュバントとして利用した１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ実験配合物における有意なＭ．ｈｙｏ有効性を実証している。加えて、上記の実施例７は、プロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ上清を用いて、かつＳＰオイルをアジュバントとして利用した１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ配合物におけるＰＣＶ２有効性を実証した。まとめると、Ｍ．ｈｙｏおよびＰＣＶ２有効性の両方がプロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ上清を用いた１ボトルのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせにおいて実証されている。

【0195】

実施例１０：実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ実験ワクチンのインビボ安全性
この研究は、最も若い年齢（３週齢）において与えた場合の、宿主動物における様々なアジュバント配合物で最大抗原用量で配合された実験ＰＣＶ２−Ｍ．ｈｙｏワクチンのインビボ安全性を評価するために実施された。異なるアジュバントプラットフォームを、これらのプラットフォームのどれが許容可能な安全性プロフィールを提供するかを決定するために、温度、注射部位反応および臨床的観察に基づいて評価した。２０％ＳＬＣＤ／１０％ＳＰオイル配合物を、本研究グループおよび他のグループにより観察された注射部位反応に関する歴史的問題（ｈｉｓｔｏｒｉｃ ｉｓｓｕｅｓ）のため、陽性（“安全ではない”）対照として用いた。

【0196】

液体の処理：全てのワクチンは、実施例１において“発酵および不活化”の下で記載したような不活化Ｍ．ハイオニューモニエ抗原を用いて調製された。Ｍ．ｈｙｏバルク全体抗原を、それはプロテインＡ処理の際に除去されるであろう免疫グロブリンおよび免疫複合体に加えて可溶性および不溶性Ｍ．ｈｙｏ抗原を含有することが知られているため、用いた。不溶性細胞破壊片および免疫グロブリンおよび免疫複合体の除去だけがそのワクチン配合物の安全性をさらに高めるであろうと結論付けることは理にかなっている。この研究の意図は、ＰＣＶ２抗原およびＭ．ｈｙｏ抗原を含有する様々なアジュバント配合物の安全性を厳密に試験することであった。ＰＣＶ２およびＭ．ｈｙｏ抗原は、安全性をさらに評価するために最大放出レベルで配合された。これらの実験配合物を下記の表１２において記載する。ＩＶＰは治験中の獣医学用製品（ＩＶＰ）を示す。

【0197】

【表12】

【0198】

この研究において用いた安全性パラメーターは、直腸温度プロフィールおよび注射部位反応であった。この研究の結果は、全ての候補アジュバントプラットフォームは直腸温度プロフィールおよび臨床的観察の点で許容可能な安全性プロフィールを提供することを示した（結果は示していない）。２０％ＳＬＣＤ＋１０％ＳＰオイル（すなわち陽性対照）のみがプラセボワクチンと有意に異なっており、いくつかの重症の注射部位反応を有していた（結果は示していない）。

【0199】

実施例１１：中心的な研究のためのプロテインＡ処理されたＭ．ｈｙｏ抗原の調製
図９は、ＰＣＶ２と適合性のプロテインＡ処理されたＭ．ｈｙｏ抗原を調製するために用いられた製造プロセスの１態様を示す流れ図である。不活化したＭ．ｈｙｏの培養物全体を、タンジェント流濾過により細胞を取り除いて澄ませた。簡潔には、０．４５μＭの公称孔径を有するポリエーテルスルホンフィルター（ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、部品番号５６−４１０２−４９）を０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で衛生化し、続いて滅菌ＵＳＰ水で大規模にすすいだ。不活化マイコプラズマ培養液をその装置に１１．０Ｌ／分を目標とした再循環速度および約５ＰＳＩの膜間圧で導入した。清澄化は室温で実施された。フィルターの透過液を集め、さらなる処理まで２〜８℃で保管した。

【0200】

清澄化の後、抗原含有液をプロテインＡ樹脂で処理して抗体レベルを低減した。簡潔には、ＭＡｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１２ｃｍの高さのガラスカラム中に充填した。その樹脂を５カラム体積の５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）で平衡化した。１０カラム体積に相当する抗原含有液を、その樹脂上に１００ｃｍ／ｈｏｕｒの線形流速で装填した。そのカラム素通り画分を集め、０．２ミクロンフィルターを通して濾過滅菌した。カラムの再生は、３カラム体積のｐＨ３．７の２５ｍＭアセテート溶液を流し、続いて４カラム体積の１Ｍ酢酸溶液を流すことにより達成した。抗ＰＣＶ２抗体およびＭ．ハイオニューモニエ抗原レベルを、最終的な抗原液においてそれぞれＰＣＶ２特異的抗体ＥＬＩＳＡおよびｐ４６抗原定量化ＥＬＩＳＡにより測定した。

【0201】

実施例１２：ＰＲＲＳウイルスに対する殺ウイルス活性の評価
この実施例において示される研究は、様々なアジュバントプラットフォームをＰＲＲＳウイルスに対する殺ウイルス活性に関して評価するために設計された。最初の実験はアジュバントのみに焦点を合わせた（すなわち、その配合物はＰＣＶ抗原もＭ．ｈｙｏ抗原も含有していなかった）。ＰＲＲＳ殺ウイルス活性に関するアジュバントの評価を図１０において示す。予備的な殺ウイルス評価は、１０％ＳＰオイル、０．２％ Ｃａｒｂｏｐｏｌおよび２．５％ＡｍｐｈｉｇｅｎはＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であることを示した。対照的に２０％ＳＬＣＤアジュバントはＰＲＲＳウイルスに対して殺ウイルス性であるようであった。

【0202】

異なるアジュバントプラットフォームで抗原性補強したＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ配合物がＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であるかどうかを評価するためにさらなる研究を実施した。これらの結果を下記の表１３において示し、ここで記号^＊はＰＲＲＳウイルスに対して殺ウイルス性であったワクチン一連番号を示す。

【0203】

【表13】

【0204】

上記の表１３において示した結果は、１０％ＳＰオイルはＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であることを示している。さらなるＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏワクチン系列を、１０％ＳＰオイルをアジュバントとして用いて調製した（表１４）。下記の表１４中に示した結果はさらに、１０％ＳＰオイルはＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であることを示している。下記の表１４中の試験試料の値はそれぞれ殺ウイルスアッセイ対照よりも高く（＋記号）、それは約５．９±０．５ｌｏｇ／ｍｌの幾何平均力価（ＧＭＴ）を有していた。

【0205】

【表14】

【0206】

この実施例において示した結果は、１０％ＳＰオイルはＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であることを実証している。この実施例において示した結果はさらに、１０％ＳＰオイルで抗原性補強したＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ配合物は、ＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であると考えられるワクチン系列の中にあったことを実証している（表１３および表１４）。結論として、１０％ＳＰオイルで抗原性補強したＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ配合物は、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ、およびＰＲＲＳウイルスが含まれる３価の組み合わせの基礎とするための有効なプラットフォームであると考えられた。

【0207】

実施例１３：ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンの調製
ＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であるアジュバントプラットフォームで抗原性補強したＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ配合物（上記の表１３および１４参照）は、１ボトル液体組成物中で使用準備済のものとして提供される。この１ボトルＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ配合物は、プロテインＡ処理したＭ．ｈｙｏ上清を用いている。Ｍ．ｈｙｏおよびＰＣＶ２有効性の両方が、Ｍ．ｈｙｏプロテインＡ処理上清を用いるそのようなＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ配合物において実証されている（実施例７〜９参照）。本実施例において、この２価ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ配合物を単価ＰＲＲＳウイルス抗原と組み合わせる。

【0208】

１態様において、上記の表１１中のワクチン系列Ｌ０７１１ＲＫ１１、Ｌ０７１１ＲＫ１２、Ｌ０７１１ＲＫ１３およびＬ０７１１ＲＫ１４の１つに対応する１０％ＳＰオイル中のＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせが１ボトル液体組成物中で使用準備済のものとして提供される。上記の実施例１２において示される結果は、１０％ＳＰオイルはＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であることを実証した。実施例１２は、１０％ＳＰオイルで抗原性補強したＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ配合物はＰＲＲＳウイルスに対して非殺ウイルス性であると考えられるワクチン系列の中にあることも実証した。本実施例において、全ての抗原が適切な年齢の（例えば３週齢以上の）ブタに投与される前に単一のボトル中に収容されるように、そのような１ボトルＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ液体組成物を用いて第２ボトル中に収容された凍結乾燥された遺伝子改変生ＰＲＲＳウイルス組成物を再水和させる。

【0209】

１態様において、そのＰＲＲＳウイルスはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６またはその変異体に対応するゲノム配列を有する。別の態様において、その３価組成物において用いられるＰＲＲＳウイルスはＩＳＵ−５５と名付けられたＰＲＲＳウイルス分離株であり、それはＡＴＣＣに受け入れ番号ＶＲ ２４３０の下で寄託された。それぞれの抗原の適切な量は本明細書に記載されている。望ましくは、全ての抗原は１回量でブタに投与される。

【0210】

実施例１４：後にＰＣＶ２負荷をかけるＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＣＶ２有効性の評価
この試験は実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＣＶ１−２キメラ、死菌ウイルス画分の有効性を評価するために設計され、３週齢のブタに１回筋内投与し、ワクチン接種の３週間後に病毒性ＰＣＶ２分離株で負荷をかけた。これらの３価ワクチンには、ブタサーコウイルス１型−２型キメラ、死菌ウイルス、呼吸および生殖症候群ワクチン、呼吸形態、改変生ウイルス、ならびにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物が含まれていた。

【0211】

この３価の組み合わせは、凍結乾燥された遺伝子改変生ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳ−ＭＬＶ）を、１０％ＳＰオイルを用いて抗原性補強したブタサーコウイルス１型−２型キメラ、死菌ウイルスおよびＭ．ｈｙｏ細菌抽出物（ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ）の組み合わせが含まれる１ボトルの液体配合物を用いて再水和させることにより調製された（上記の実施例１３参照）。本試験の過程全体を通して投与された実験配合物を下記の表１５において記載する。

【0212】

【表15】

【0213】

３週齢のブタに、上記の表１５において記載された１回量の異なるワクチン配合物を筋内接種した。２４匹の動物がその処置群のそれぞれに含まれていた。動物にワクチン接種の２１日後に病毒性ＰＣＶ２ａ分離株を用いて負荷をかけた。

【0214】

この試験において観察されたＰＣＶ２ウイルス血症の結果（ＰＣＶ２定量的ＰＣＲ）を図１１において示す。ＰＣＶ２ウイルス血症が主要有効性変数として用いられたことを特筆する。そのＰＣＶ２ウイルス血症の結果はＤＮＡコピー数／ｍｌとして示されている。図１１において示されるように、全ての処置は２８、３５および４２日目（負荷は２１日目であった）においてプラセボと比較して有意に低いウイルス血症（Ｐ＜０．００１）を有していた。

【0215】

ＰＣＶ２の血清学、ＰＣＶ２の糞便への排出、リンパ球枯渇、および免疫組織化学（ＩＨＣ）もこの試験において二次有効性変数として監視した。これらの結果を下記に記載する。

【0216】

ＰＣＶ２の血清学の結果を図１２において示し、それは試験の−１、７、１３、２０、２８、３５および４２日目（負荷は２１日目であった）のＰＣＶ２ ＥＬＩＳＡの結果を示す。それぞれの試料の状態を試料対陽性比（Ｓ／Ｐ）として表した。これらの結果は、プラセボ群と比較して両方の処置群が有意に高い負荷後のＰＣＶ２抗体力価（Ｐ＜０．０３４５）を有していたことを示している。

【0217】

プラセボ（Ｔ０１）に対してＴ０２およびＴ０３処理を用いて得られたＰＣＶ２の糞便への排出を図１３において示す。これらの結果をＰＣＶ２のＤＮＡコピー数／ｍｌとして表す。図１３における結果は、Ｔ０２およびＴ０３処理の両方が３５および４２日目にプラセボと比較して有意に低い糞便への排出（Ｐ＜．０００１）を有していたことを示している。

【0218】

下記の表１６は、プラセボと対比して実験処理（Ｔ０２）を用いて得られたリンパ球枯渇に対する有意な保護を示す。

【0219】

【表16】

【0220】

下記の表１７において示した結果は、プラセボと対比して実験処理（Ｔ０２）を用いて得られた組織球性置換に対する有意な保護を示す。

【0221】

【表17】

【0222】

下記の表１８は、プラセボと対比して実験処理を用いて得られた免疫組織化学を示す。両方のワクチン（Ｔ０２およびＴ０３）がリンパ組織におけるＰＣＶ２抗原のコロニー形成に対する有意な保護（Ｐ＜０．００５９）を示した。

【0223】

【表18】

【0224】

結論として、この実施例で示した結果は、この試験で用いた実験ワクチンはＰＣＶ２負荷に対する有効性を提供したことを示している。そのワクチンの両方の力価レベルが主要な変数ならびにＰＣＶ２コロニー形成に対する有意な保護を提供した。しかし、Ｔ０２群はＰＣＶ２病変（リンパ球枯渇および組織球性置換）に対する有意な保護も提供した。

【0225】

実施例１５：後にＭ．ｈｙｏ負荷をかけるＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＭ．ｈｙｏ有効性の評価
この試験は実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＭ．ｈｙｏ画分の有効性を評価するために設計され、３週齢の感染しやすいブタに筋内投与し、ワクチン接種の３週間後に病毒性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ分離株で負荷をかけた。これらの３価ワクチンには、ブタサーコウイルス１型−２型キメラ、死菌ウイルス、呼吸および生殖症候群ワクチン、呼吸形態、改変生ウイルス、ならびにマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物が含まれていた。

【0226】

液体の処理：
（上記で実施例１１において記載した）不活化し、澄ませたＭ．ｈｙｏ発酵液を、以下のようなそれぞれの処置群に関して用いた。

【0227】

Ｔ０１：凍結乾燥されたＰＲＲＳＶ改変生ワクチンにおいて希釈液として用いられたＭ．ハイオニューモニエ抗原を含まないＰＣＶ１−２ワクチンからなる陰性対照処置
Ｔ０２：不活化Ｍ．ハイオニューモニエ抗原を１つのボトル中でブタサーコウイルス（１型−２型キメラ、またはＰＣＶ１−２、死菌ウイルス）と組み合わせた。そのＰＣＶ１−２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせを凍結乾燥されたＰＲＲＳＶ改変生ワクチンにおいて希釈液として用いた。

【0228】

Ｔ０３：抗原を分子濾過により２０倍に濃縮するための追加の工程を用いた上記で実施例１１において記載されたような不活化Ｍ．ハイオニューモニエ抗原を、１つのボトル中でブタサーコウイルス（１型−２型キメラ、またはＰＣＶ１−２、死菌ウイルス）と組み合わせた。そのＰＣＶ１−２／Ｍ．ｈｙｏの組み合わせを凍結乾燥されたＰＲＲＳＶ改変生ワクチンにおいて希釈液として用いた。

【0229】

これらの実験配合物を下記の表１９において記載する。表１９において、ＣＰは対照製品であり、ＩＶＰは治験中の獣医学用製品である。そのＭ．ｈｙｏ抗原は、グローバルＭ．ｈｙｏシード、プロテインＡ処理した上清からのＭ．ｈｙｏ抗原に対応する。

【0230】

【表19】

【0231】

３週齢のブタに、上記の表１９において記載された１回量の異なるワクチン配合物を筋内接種した。動物にワクチン接種の２０日後に病毒性Ｍ．ｈｙｏ野生分離株を用いて負荷をかけた。２５匹の動物が群Ｔ０１およびＴ０３においてその試験を完了し、２４匹の動物が群Ｔ０２においてその試験を完了した。動物を負荷の２８日後に検死し、肺を取り出してＭ．ｈｙｏ感染と一致する硬化に関して採点した。下記の表２０は、それぞれの処置群に関する肺病変スコアを含有する。統計的有意性をそれぞれの群に関する肺スコアの混合モデル分析により決定した。

【0232】

【表20】

【0233】

陰性対照群（Ｔ０１）と比較して、処置群Ｔ０３はＴ０１と比較して病変を有する肺のパーセントにおいて有意な低減（Ｐ≦０．０５）を示した。Ｔ０２に関するパーセント肺病変は、Ｔ０１またはＴ０３のどちらとも有意に異なっていなかった。

【0234】

本実施例における結果は、この試験において用いられた実験３価ワクチン配合物（Ｔ０３処置）はＭ．ｈｙｏ負荷に対して有意な有効性を提供したことを実証している。

【0235】

実施例１６：ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＲＲＳＶ有効性の評価
この試験は、実験ＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＲＲＳ混合ワクチンのＰＲＲＳＶ画分の有効性を評価するために設計された。

【0236】

試験の要約：
０日目に、おおよそ１０２匹の臨床的に健康な３週齢のブタ（ＰＲＲＳＶ、ＳＩＶおよびＭ．ハイオニューモニエに対して血清陰性かつＰＣＲによりＰＣＶウイルス血症を有しない）を選択し、４つの処置群（群あたり２４匹）またはセンチネル（ＮＴＸ）群（６匹）の１つに割り当てる（敷き藁（ｌｉｔｔｅｒ）により遮断する）。ブタに１回の２ｍＬの実験ブタサーコウイルス１型−２型キメラ、死菌ウイルスワクチン−マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（Ｔ０１）、または実験ブタサーコウイルス１型−２型キメラ−呼吸および生殖症候群ワクチン、呼吸形態、改変生および死菌ウイルス−マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（Ｔ０２、Ｔ０３およびＴ０４）の筋内（ＩＭ）用量を投与する。ＮＴＸ群の動物は、その試験のワクチン接種段階の間処置群から別々の畜舎（ｐｅｎ）中に収容される。ワクチン接種の４週間後、処置群を再収容する前にＮＴＸブタを安楽死させて検死してＰＲＲＳＶ肺病変の非存在を確認する。全ての処置したブタに病毒性ＰＲＲＳＶ負荷株（ＮＡＤＣ２０）を用いて負荷をかける。全ての残りのブタを負荷の１０（１０）日後に安楽死させて検死する。検死において、それぞれの肺葉（左頭側、左中央、左尾側、右頭側、右中央、右尾側、および付属部分）に関する硬化の百分率を、病変が観察された葉のパーセントとして採点し、記録する。Ｔ０１ブタのＰＲＲＳＶ陰性状態を負荷の前に試験した（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ）。臨床観察を試験の期間の間１日１回記録し、体重を負荷の前および検死の際に測定する。

【0237】

実験配合物を下記および表２１において記載する。Ｍ．ｈｙｏ抗原対照ロットを上記の実施例１１において記載したように調製する。そのＰＣＶ２抗原は上記で実施例２において記載したように調製した死菌ｃＰＣＶ１−２抗原である。そのキメラウイルスの不活化の前に、そのＰＣＶ２抗原ロットを２０倍濃縮し、その濃縮物を平衡塩溶液で洗浄した。そのＰＣＶ２／Ｍ．ｈｙｏの１ボトル配合物（１０％ＳＰオイル中で抗原性補強したもの）を用いて凍結乾燥された改変生ＰＲＲＳＶを再水和させた。

【0238】

Ｔ０１：高継代ブタサーコウイルス１型−２型キメラ、死菌ウイルス（１．６５％の２０倍濃縮した抗原ロット）およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（用量−９．０ＲＰ：１５３ＲＵ／ｍＬ）の実験調製物。Ｔ０１調製物は一連番号Ｌ０９１２ＲＫ１２（ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ）に対応しており、陰性対照（ＰＲＲＳＶ抗原なし）である。

【0239】

Ｔ０２：高継代ブタサーコウイルスワクチン１型−２型キメラ、死菌ウイルス（１．６５％の２０倍濃縮した抗原ロット）およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（用量−９．０ＲＰ：１５３ＲＵ／ｍＬ）の実験調製物ならびにブタ生殖および呼吸症候群ワクチン呼吸形態、改変生ウイルス（ＭＩＤ（≦２．５ｌｏｇ）の高継代の実験調製物。Ｔ０２調製物は一連番号Ｌ０９１２ＲＫ１２（ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ）＋（ＭＩＤ≦２．５ｌｏｇでのＰＲＲＳ ＭＬＶ）に対応する。

【0240】

Ｔ０３：高継代ブタサーコウイルスワクチン１型−２型キメラ、死菌ウイルス（１．６５％の２０倍濃縮した抗原ロット）およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（用量−９．０ＲＰ：１５３ＲＵ／ｍＬ）の実験調製物ならびにブタ生殖および呼吸症候群ワクチン呼吸形態、改変生ウイルス（ＭＩＤ（≦３．０ｌｏｇ）の高継代の実験調製物。Ｔ０３調製物は一連番号Ｌ０９１２ＲＫ１２（ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ）＋（ＭＩＤ≦３．０ｌｏｇでのＰＲＲＳ ＭＬＶ）に対応する。

【0241】

Ｔ０４：高継代ブタサーコウイルスワクチン１型−２型キメラ、死菌ウイルス（１．６５％の２０倍濃縮した抗原ロット）およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌抽出物（用量−９．０ＲＰ：１５３ＲＵ／ｍＬ）の実験調製物ならびにブタ生殖および呼吸症候群ワクチン呼吸形態、改変生ウイルス（ＭＩＤ（≦３．５ｌｏｇ）の高継代の実験調製物。Ｔ０４調製物は一連番号Ｌ０９１２ＲＫ１２（ＰＣＶ／Ｍ．ｈｙｏ）＋（ＭＩＤ≦３．５ｌｏｇでのＰＲＲＳ ＭＬＶ）に対応する。

【0242】

これらの実験配合物を下記の表２１において記載する。そのＭ．ｈｙｏ抗原はグローバルＭ．ｈｙｏシード、プロテイン処理した上清からのＭ．ｈｙｏ抗原に対応する。そのＰＲＲＳＶ調製物に関する一連番号は要決定（ＴＢＤ）である。

【0243】

【表21】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]