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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6274668
(24)【登録日】2018年1月19日
(45)【発行日】2018年2月7日
(54)【発明の名称】アジュバント及びそれを含むワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/39 20060101AFI20180129BHJP
A61K 31/688 20060101ALI20180129BHJP
A61K 31/683 20060101ALI20180129BHJP
A61K 39/02 20060101ALI20180129BHJP
A61K 39/12 20060101ALI20180129BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20180129BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20180129BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20180129BHJP
【ＦＩ】
A61K39/39ZNA
A61K31/688
A61K31/683
A61K39/02
A61K39/12
A61K39/00 K
A61K39/00 H
A61P37/04
A61P43/00 121
【請求項の数】5
【全頁数】36
(21)【出願番号】特願2014-543277(P2014-543277)
(86)(22)【出願日】2013年10月21日
(86)【国際出願番号】JP2013078435
(87)【国際公開番号】WO2014065229
(87)【国際公開日】20140501
【審査請求日】2016年5月19日
(31)【優先権主張番号】特願2012-232990(P2012-232990)
(32)【優先日】2012年10月22日
(33)【優先権主張国】JP
(31)【優先権主張番号】特願2013-156352(P2013-156352)
(32)【優先日】2013年7月29日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504143441
【氏名又は名称】国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】審良 静男
(72)【発明者】
【氏名】河合 太郎
(72)【発明者】
【氏名】川▲崎▼ 拓実
【審査官】
石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】
特表２００２−５３７２７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Biochimica et Biophysica Acta，１９９９年，Vol.1440,No.2-3，pp.275-288
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４
Ａ６１Ｋ ３１／６８３
Ａ６１Ｋ ３１／６８８
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（２）にて示される化合物
を含むアジュバント。
【化1】
【請求項2】
請求項１に記載のアジュバント及び抗原を含むワクチン。
【請求項3】
抗原が、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫、がん細胞、がん細胞特異的タンパク質、がん細胞融解物、プリオン、核酸、レニン、アンジオテンシン、及びアンジオテンシン受容体からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項4】
以下の工程１及び工程２を含むアジュバント候補物質をスクリーニングする方法；
（１）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とを接触させる工程１、及び
（２）該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２。
（１）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とを接触させる工程１、及び
（２）該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２。
【請求項5】
以下の工程１’及び工程２’を含むアジュバント候補物質をスクリーニングする方法；
（Ｉ）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とＴＢＫ１（ＴＡＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）とを接触させる工程１’、及び
（ＩＩ）該ＴＢＫ１と結合し、且つ該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２’。
（Ｉ）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とＴＢＫ１（ＴＡＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）とを接触させる工程１’、及び
（ＩＩ）該ＴＢＫ１と結合し、且つ該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２’。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アジュバント、及びそれを含むワクチンに関する。【背景技術】
【0002】
免疫賦活化とは、樹状細胞を刺激して活性化させることであり、これによって生体内で、抗体の産生（液性免疫）、Ｔ細胞による免疫機能が増強することを意味し、このような機能を発揮させる成分はアジュバント又は免疫賦活化剤、免疫増強剤等と称されている。なお、本明細書では、上記機能を有する成分を「アジュバント」と総称し、その機能を「アジュバンド能」と称する。具体的なアジュバントとしては、例えばリン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム等といった沈降性アジュバント；パラフィンオイル、加熱した結核菌の死菌、及び界面活性剤を含むフロイント完全アジュバント；完全フロイントアジュバントから結核菌の死菌を除いたフロイント不完全アジュバント等が挙げられる。【0003】
従来から、このようなアジュバントとして有用な各種成分が開発されており、中でもワクチンとして抗原と共に用いることのできるアジュバントの精力的な研究が進んでいる。【0004】
例えば、抗ウイルス自然免疫応答に関連するＲＩＧ―Ｉ様受容体に対する顕著な数のリガンドが発見されているが、欧州及び米国の医薬品許可機構はこれらのリガンドを、新規のアジュバントとして非臨床毒性研究で評価することを推奨している。また、このようなリガンドの一部は臨床試験に供されている。【0005】
また、ＲＩＧ−Iと同様に自然免疫応答に関連するＴＯＬＬ様受容体のアゴニストとして働くＣｐＧ−ＤＮＡ、ポリＩ：Ｃ、フラジェリン等が、アジュバントとしての機能を有することも知られている（非特許文献１）。【0006】
現在、具体的に臨床にて使用されるワクチンに含まれているアジュバントとしては、非特許文献２及び非特許文献３に示すワクチンに含まれるアルミニウム塩、ノバルティスファーマ社から販売されているインフルエンザ用ワクチンであるＣｅｌｕｒａ（登録商標）に含まれているＭＦ５９（スクワレンを含むオイルインウオーター型アジュバント）等が挙げられる。【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】日本臨牀 ６９巻９号（２０１１）１５４１−１５４６
【非特許文献2】沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン 医薬品インタビューフォーム、武田薬品工業株式会社、２００９年８月（改定第８版）
【非特許文献3】ビームゲン（登録商標） 医薬品インタビューフォーム、アステラス製薬株式会社、２０１２年４月（改定第１５版）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
上述の通り、市販されているワクチンには、アジュバントとしてアルミニウム塩を含まれているが、これは炎症を引き起こし易い事から、人体に悪影響を及ぼすことが懸念されている。殊に、非特許文献１及び２にも記載されているように、アルミニウム塩がアジュバントとして含まれているワクチンは、重大な副作用としてアナフィラキシーショック様症状、多発性硬化症、急性散在性脳延髄炎、ギランバレー症候群等を引き起こす危険性がある。これらは、アルミニウム塩が、病原体の中和反応に働くＩｇＧではなく、ＩｇＥを産生してしまうことに起因すると考えられる。【0009】
また、アルミニウム塩の使用は、透析療法を受けている患者に対しては禁忌であり、これを長期投与する事により、アルミニウム脳症、アルミニウム骨症、アルミニウム腎症、貧血等を引き起こす事も知られている。さらにアルミニウム塩は、免疫作用を増強させる能力としては、十分に強いものであるとはいえない。【0010】
このように、アジュバントをワクチン成分として接種することによって生命の危険性を脅かす副作用が発生する可能性があるという、使用上の不安があるにも関わらず、アジュバント能を有し、且つ、副作用の危険性の低いアジュバントを提供するための免疫学的知見についてほとんど明らかとなっていないのが現状である。【0011】
即ち、免疫機能を十分に増強する作用を有しつつ、生体に適用しても副作用の可能性が極めて低いアジュバントを開発する事は、安全で、且つ、十分な発揮するワクチン、特にサブユニットワクチン、ペプチドワクチン、粘膜ワクチン等を開発し製造する上で重要な課題である。【課題を解決するための手段】
【0012】
上記課題を解決すべく、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、リン脂質が、免疫賦活化に非常に重要なシグナルカスケードであるＩＲＦ３−ＴＢＫ１シグナルカスケードを作動させる重要な成分であることを見出た。さらに、当該リン脂質は、免疫システムにおいて、特にアジュバントとして使用する際に、副作用を引き起こすと考えられる炎症性サイトカインの過剰な産生には関与していないことを見出した。かかる知見に基づいて、実際に当該リン脂質を、抗原と共にマウスに投与したところ、マウス血清中において抗原に対する抗体が十分に産生される事が確認された。【0013】
本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものであり、以下に示す態様を広く包含するものである。【0014】
項１ リン脂質を含むアジュバント。【0015】
項２ リン脂質（ただし、３−脱アシル化−４’−モノホスホリルリピッドＡを除く）を含む上記項１に記載のアジュバント。【0016】
項３ リン脂質がアニオン性である上記項１又は項２に記載のアジュバント。【0017】
項４ リン脂質が、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、これらのアミノ誘導体、又はこれらの塩である、上記項１〜３の何れか１項に記載のアジュバント。【0018】
項５ リン脂質が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ビスホスファチジン酸、ピロホスファチジン酸、プラズマローゲン、エタノールアミンプラズマローゲン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホコリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホセリン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸、エチルアミンジアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロコリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロコリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロセリンホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロセリンホスホン酸、、セラミドアミノエチルホスホン酸、及びアシルスフィンゴシルアミノエチルホスホン酸、並びにこれらの誘導体及び塩からなる群より選択される上記項１〜４の何れか１項に記載のアジュバント。【0019】
項６ リン脂質が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールエステル誘導体、又はそれら塩である、上記項１〜項５の何れか１項に記載のアジュバント。【0020】
項７ ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３、４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３、５）Ｐ２、及びＰｔｄＩｎｓ（３、４、５）Ｐ３からなる群より選択される少なくとも１つである上記項６に記載のアジュバント。【0021】
項８ ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、下記式（１）にて示される化合物である、上記項６又は項７に記載のアジュバント；【0022】
【化1】
【0023】
（式中、Ｒ１は、アミノ基又は水酸基を有していてもよいアルキル基であり、該アルキル基は、更に炭素数が３個〜２４個のアルカノイルオキシ基又はアミノ酸残基若しくはペプチド残基を１つ以上有していてもよく、
Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又は酸と水酸基との脱水縮合反応により得られる該酸の残基である。）。
【0024】
項９ ホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、ホスファチジルイノシトールリン酸である、上記項６〜８の何れか１項に記載のアジュバント。【0025】
項１０ ホスファチジルイノシトールリン酸が下記式（２）にて示される化合物である上記項９に記載のアジュバント；【0026】
【化2】
【0027】
項１１ 上記項１〜項１０の何れか１項に記載のアジュバント及び抗原を含むワクチン。【0028】
項１２ 抗原が、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫、がん細胞、がん細胞特異的タンパク質、がん細胞融解物、プリオン、核酸、レニン、アンジオテンシン、及びアンジオテンシン受容体からなる群より選択される少なくとも１つである、上記項１１に記載のワクチン。【0029】
項１３ 抗原がウイルスである、上記項１２に記載のワクチン。【0030】
項１４ リン脂質を生体に投与する工程を含む免疫賦活化方法。【0031】
項１５ リン脂質（ただし、３−脱アシル化−４‘−モノホスホリルリピッドＡを除く）を生体に投与する工程を含む上記項１４に記載の免疫賦活化方法。【0032】
項１６ リン脂質がアニオン性である上記項１４又は項１５に記載の免疫賦活化方法。【0033】
項１７ リン脂質が、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、これらのアミノ誘導体、又はこれらの塩である、上記項１４〜１６の何れかに記載の免疫賦活化方法。【0034】
項１８ リン脂質が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ビスホスファチジン酸、ピロホスファチジン酸、プラズマローゲン、エタノールアミンプラズマローゲン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホコリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホセリン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸、エチルアミンジアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロコリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロコリンホスホン酸、、、エチルアミンジアシルグリセロセリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロセリンホスホン酸、セラミドアミノエチルホスホン酸、及びアシルスフィンゴシルアミノエチルホスホン酸、又はこれらの塩からなる群より選択される上記項１４〜１７の何れか１項に記載の免疫賦活化方法。【0035】
項１９ リン脂質が、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールエステル誘導体、又はそれら塩である、請求項１４〜項１８の何れか１項に記載の免疫賦活化方法。【0036】
項２０ ホスファチジルイノシトールが又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、ＰｔｄＩｎｓ、ＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（３、４）Ｐ２、ＰｔｄＩｎｓ（３、５）Ｐ２、及びＰｔｄＩｎｓ（３、４、５）Ｐ３からなる群より選択される少なくとも１つである上記項１９に記載の免疫賦活化方法。【0037】
項２１ ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、下記式（１）にて示される化合物である、上記項１９又は項２０に記載の免疫賦活化方法；【0038】
【化3】
【0039】
（式中、Ｒ１は、炭素数がアミノ基又は水酸基を有していてもよいアルキル基であり、該アルキル基は更に炭素数が３〜２４個のアルカノイルオキシ基又はアミノ酸残基若しくはペプチド残基を一つ以上有していてもよく、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又は酸と水酸基との脱水縮合反応により得られる該酸の残基である。）。
【0040】
項２２ ホスファチジルイノシトールエステル誘導体が、ホスファチジルイノシトールリン酸である、上記項１９〜２１の何れか１項に記載の免疫賦活化方法。【0041】
項２３ ホスファチジルイノシトールリン酸が下記式（２）にて示される化合物である上記項２２に記載の免疫賦活化方法；【0042】
【化4】
【0043】
項２４ リン脂質と共に抗原を投与する事を特徴とする上記項１４〜項２３の何れか１項に記載の免疫賦活化方法。【0044】
項２５ 抗原が、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫、がん細胞、がん細胞特異的タンパク質、がん細胞融解物、プリオン、核酸、レニン、アンジオテンシン、及びアンジオテンシン受容体からなる群より選択される少なくとも１つである上記項２４に記載の免疫賦活化方法。【0045】
項２６ 抗原がウイルスである上記項２５に記載の免疫賦活化方法。【0046】
項２７ 生体が、ヒトである上記項１４〜項２６の何れか１項に記載の免疫賦活化方法。【0047】
項２８ 以下の工程１及び工程２を含むアジュバント候補物質をスクリーニングする方法；（１）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とを接触させる工程１、及び
（２）該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２。
【0048】
項２９ 以下の工程１及び工程２を含むアジュバント候補物質をスクリーニングする方法；（Ｉ）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とＴＢＫ１（ＴＡＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）とを接触させる工程１、及び（ＩＩ）該ＴＢＫ１と結合し、且つ該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２。
【0049】
項３０ 細胞内成分が、不水溶性画分に含まれる成分である、上記項２８又は２９に記載のスクリーニング方法。【発明の効果】
【0050】
以下に、本発明の効果について記載する。ただし、本発明は、以下に示す効果の全てを発揮する発明に限定されず、少なくとも何れか１つの効果を発揮すればよい。【0051】
本発明に係るアジュバントは、樹状細胞に取り込まれやすい作用を有しており、樹状細胞を活性化する効果に優れている。つまり、本発明に係るアジュバントは、このような樹状細胞の活性化を介して、抗体を誘導し、またＴｈ１細胞の応答を増大させる作用を有するものと考えられる。従って、本発明に係るアジュバントは、抗原と共にワクチンを構成する成分として有用である。【0052】
本発明に係るアジュバントは、炎症性のサイトカインの産生に関与せず、また、それを亢進させ無いので、抗原と共にワクチンを構成する成分としても、副作用を引き起こす可能性が非常に低い。【0053】
本発明のアジュバントは、元来、生体に存在する化合物を含むので、外来化合物を含むアジュバントとは異なり、炎症以外のその他の発熱、おう吐といった副作用を引き起こす可能性は非常に低い。【0054】
以上のことから、本発明のアジュバント又はそれを含むワクチンは、人体に安全で、しかも免疫賦活化能に非常に優れている。【0055】
また、当該本発明のアジュバントを単独または抗原とともに人体に投与する事による免疫賦活化方法は、人体に安全であり、しかも生体の免疫賦活化能を向上させる方法として有用である。【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】図１は、インビトロにおいて、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、ＴＢＫ１によりＩＲＦ３のリン酸化を増強する事を示す実験結果である。（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｄ）は、種々の試薬を用いた、組み換えＩＲＦ３及びＴＢＫ１によるインビトロカイネースアッセイ。及び、ｐＳ３９４ＩＲＦ３抗体を用いたＴＢＫ１によるＩＲＦ３のリン酸化の同定した実験結果である。（Ａ）は種々の試薬、タンパク質の単離画分若しくは再構成タンパク質によるインビトロカイネースアッセイを示す。（Ｂ）図中に示すプラスミドで形質転換し、活性化させたＨＥＫ２９３細胞から抽出した脂質分画を用いたインビトロカイネースアッセイを示す。（Ｃ）脂質とＴＢＫ１タンパク質-脂質オーバーレイアッセイ（左）、脂質とＩＲＦ３タンパク質-脂質オーバーレイアッセイ（右）を示す。（Ｄ）ＰＥ／ＰＣをベースとしたリポソームと合成したＣ１６ーＰｔｄＩｎｓのインビトロカイネースアッセイを示す。
【図2】図２は、ＰＩＫｆｙｖｅが、ＩＦＮβプロモーター又はＩＳＲＥプロモーターを活性化することを示す実験結果である。（Ａ）ＰｔｄＩｎ（５）Ｐの合成に関する模式図とそれに関与する候補遺伝子を示す。（Ｂ）陰性対照、ＰＩＫｆｙｖｅ、又はカイネース・ネガティブＰＩＫｆｙｖｅを発現させるプラスミドと、ＩＦＮβルシフェラーゼを発現させるプラスミド（Ｂにおける最上段図）、ＩＳＲＥルシフェラーゼを発現させるプラスミド（Ｂにおける中段図）、又はＮＦκＢルシフェラーゼを発現させるプラスミド（Ｂにおける最下段図）で形質転換したＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター活性を示す。（Ｃ）ＰｔｄＩｎ（５）Ｐの合成に関与すると考えられる遺伝子をコードするプラスミドと、ＩＳＲＥルシフェラーゼを発現させるプラスミドで形質転換したＨＥＫ２９３細胞におけるレポーター活性を示す。
【図3】ＰＩＫｆｙｖｅをノックダウンする事によって、サイトカインの産生が抑制されたことを示す実験結果。（Ａ）〜（Ｆ）は、ｓｉＲＮＡのエレクトロポーレーションする事によって、ＭＥＦにおけるＰＩＫｆｙｖｅのレベルがノックダウンされる事を示している。ＩＦＮβ、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の産生量はＥＬＩＳＡを用いて測定した。（Ａ）抗ＰＩＫｆｙｖｅ抗体によって細胞内のＰＩＫｆｙｖｅが濃縮され、抗ＰＩＫｆｙｖｅを用いたウェスタンブロッティングによってＰＩＫｆｙｖｅが検出された事を示す。（Ｂ）ポリＩ：Ｃによる刺激、及びＮＤＶによる感染によって刺激されたＭＥＦのＥＬＩＳＡによって測定したＩＦＮβ、ＩＰ−１０、及びＩＬ−６の産生量を示す。（Ｃ）ポリＩ：Ｃによる刺激後の、ＱＰＣＲにて測定したＩＦＮβのｍＲＮＡの発現量を示す。（Ｄ）〜（Ｆ）ＭＥＦ内のＰＩＫｆｙｖｅのノックダウン下において、ポリＩ：Ｃによる形質導入により性化するシグナル分子群の解析を示す。（Ｄ）非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＩＲＦ３が二量体を形成することを示す。（Ｅ）ウェスタンブロッティングによるＩＲＦ３及びＪＮＫのリン酸化を示す。（Ｆ）核画分を単離した後のＲｅｌＡの局在（上）、コントロールとしての総ＲｅｌＡを示す。（Ｇ）〜（Ｉ）ｓｉＲＮＡのエレクトロポーレーションによるＧＭ−ＤＣにおけるＰＩＫｆｙｖｅのノックダウン実験結果を示す。（Ｇ）ポリＩ：Ｃを用いた形質導入によって刺激したＧＭ−ＤＣを示す。（Ｈ）ＳｅＶ（Ｃｍ）又はＥＭＣＶによる感染刺激したＧＭ−ＤＣを示す。（Ｉ）ＩＳＤを用いた形質導入によって刺激したＧＭ−ＤＣを示す。
【図4】Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、サイトカインを産生し、アジュバントとして働く事の実験結果を示す。（Ａ）図に示すＣ８脂質で刺激されたＧＭ−ＤＣの、ＥＬＩＳＡによって測定したＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳの産生量を示す。（Ｂ）及び（Ｃ）野生型、ＩＲＦ３−／−／ＩＲＦ７−／−、又はＩＰＳ−１−／−マウス由来のＧＭ−ＤＣを、１０、２５、及び５０μＭのＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐで刺激した後の、ＥＬＩＳＡによって測定したＩＰ−１０、ＲＮＡＴＥＳ、及びＩＦＮβの産生量を示す。（Ｄ）アルムと共に腹腔内にオバルブミン（ＯＶＡ）を免疫付与したものを陽性対象とし、ＰＢＳとＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、若しくはＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２と共にＯＶＡを筋肉内に免疫付与し、５週間後に測定した血清中のＯＶＡに特異的なＩｇＧの力価を示す（左）。右側は、経時的に測定した力価である。（Ｅ）ＯＶＡに特異的なＯＴ−ＩＩトランスジェニックＣＤ４陽性Ｔ細胞を単離し、ＯＶＡの存在下でＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、又はポリＩ：Ｃで処理したＧＭ−ＤＣを共培養した後に測定した、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産生量を示す。
【図5】図に示すＣ８脂質で刺激されたＧＭ−ＤＣの、ＥＬＩＳＡによって測定したＩＬ１βの産生量を示す。
【図6-1】本明細書、特許請求の範囲、及び図面にて用いる略語を説明する図。
【図6-2】本明細書、特許請求の範囲、及び図面にて用いる略語を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【0057】
以下に本発明について詳細に説明する。なお、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。【0058】
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，．ＮＹ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ５Ｅ：Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｂｒｕｃｅ Ａｌｂｅｒｔｓ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｊｕｌｉａｎ Ｌｅｗｉｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｒａｆｆ；Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １２／Ｅ（ＬＡＮＧＥ ＢａｓｉｃＳｃｉｅｎｃｅ）ｂｙ Ｂｅｒｔｒａｍ Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｓｕｓａｎ Ｍａｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ａｎｔｈｏｎｙ Ｔｒｅｖｏｒ（Ｄｅｃ １３，２０１１）等の文献を参照すればよい。
【0059】
ワクチン、アジュバンド等の免疫分野においてはＷｉｌｌｉａｍ Ｅ． Ｐａｕｌ“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２０１２等の文献を適宜参照すればよい。【0061】
＜アジュバント＞本発明に係るアジュバントは、免疫増強剤又は免疫賦活化剤等とも呼ばれる。このような呼称は、全てアジュバンドと同じ用途に用いられる剤を意味するものとして通常は用いられるものである。
【0062】
本発明に係るアジュバントはリン脂質を含む。このようなリン脂質の中でも３−脱アシル化−４’−モノホスホリルリピッドＡ以外のリン脂質を含むアジュバントが好ましい。【0063】
前記リン脂質は、天然、特に生体内に存在するリン脂質であっても、工業的に製造されるリン脂質であってもよく、特に限定されない。また、工業的に製造されるリン脂質とは、生化学的手法、化学的手法など、具体的な手法は特に限定されない。すなわち、細胞内で合成させて得られたリン脂質であっても、インビトロでの化学反応によって合成させたリン脂質であってもよい。【0064】
このような具体的なリン脂質として、例えばグリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、又はこれらの誘導体等が挙げられる。グリセロリン脂質及びグリセロホスホノ脂質は、当該リン脂質分子中にグリセロール由来の構成アルコール部位を含むリン脂質であり、スフィンゴリン脂質、スフィンゴホスホノ脂質は、スフィンゴシン、セラミド等の長鎖アミノアルコール由来の構成アルコール部位を含むリン脂質である。【0065】
また、グリセロリン脂質及びスフィンゴリン脂質は、炭素原子とリン酸原子の間に酸素原子の結合した、Ｃ−Ｏ−Ｐ結合（リン酸エステル結合）を含むリン脂質であり、グリセロホスホノ脂質及びスフィンゴホスホノ脂質は、炭素原子に直接リン原子が結合した、Ｃ−Ｐ結合を含むホスホノ基を含むリン脂質である。【0066】
具体的なグリセロリン脂質としては、例えば、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールリン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ホスファチジン酸、ビスホスファチジン酸、ピロホスファチジン酸、プラズマローゲン、エタノールアミンプラズマローゲン、これらの誘導体等が挙げられる。【0067】
また、これらのグリセロリン脂質は、リゾ体であってもよい。ここで、リゾ体とは、グリセロールが有する３つの水酸基のうち、リン酸とエステル結合して形成される上述のＣ−Ｏ−Ｐ結合以外に残る２つの水酸基のうち、片方のみが脂肪酸とエステル結合している化合物である。【0068】
更に、これらのグリセロリン脂質は、上述の２つの水酸基のうち、少なくとも一方に、アミノ酸又はペプチドとエステル結合した、アミノ誘導体であってもよい。これを本発明にてグリセロリン脂質のアミノ誘導体と呼ぶ。【0069】
上記アミノ酸とは、ｔ−ＲＮＡの遺伝情報に基づく２０種類のアミノ酸のみならず、セレノシステイン、セレノメチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ピロリシン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、β−アラニン、Ｎ−メチルグリシン、オルニチン、スタチン、シトルリン、クレアチン、γーアミノ酪酸等のアミノ基及びカルボキシ基を有する化合物といった広義のアミノ酸を意味する。これらのアミノ酸の中でも、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の電荷を有する側鎖を含むアミノ酸が好ましい。【0070】
上記ペプチドとは、上述の２〜１０個程度のアミノ酸がペプチド結合したものである。中でも、上述のような電荷を有する側鎖を含むアミノ酸の残基を含むペプチドが好ましい。【0071】
具体的なスフィンゴリン脂質として、例えば、スフィンゴミエリン、セラミドホスホコリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホセリン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸、これらの誘導体等が挙げられる。【0072】
また、これらのスフィンゴリン脂質は、リゾ体であってもよい。ここで、リゾ体とは、スフィンゴシンが有する２つの水酸基のうち、リン酸とエステル結合して形成される上述のＣ−Ｏ−Ｐ結合に用いられる他方の水酸基がそのまま残っている化合物である。【0073】
更に、これらのスフィンゴリン脂質は、上述の残った水酸基に、アミノ酸又はペプチドがエステル結合した、アミノ誘導体であってもよい。これを、本発明にてスフィンゴリン脂質のアミノ誘導体と呼ぶ。【0074】
上記アミノ酸及びペプチドとは、上述のグリセロリン脂質のアミノ誘導体に関して詳述した通りである。【0075】
具体的なグリセロホスホノ脂質として、例えば、エチルアミンジアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロアミノエチルホスホン酸、エチルアミンジアシルグリセロコリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロコリンホスホン酸、、、エチルアミンジアシルグリセロセリンホスホン酸、エチルアミンモノアシルグリセロセリンホスホン酸、これらの誘導体等が挙げられる。【0076】
また、これらのグリセロホスホノ脂質は、リゾ体であってもよい。ここで、リゾ体とは、グリセロールが有する３つの水酸基のうち、リン酸と直接結合して形成される上述のＣ−Ｐ結合の他に残る２つの水酸基のうち、片方のみが脂肪酸とエステル結合している化合物である。【0077】
更に、これらのグリセロホスホノ脂質は、上述の２つの水酸基のうち、少なくとも一方に、アミノ酸又はペプチドがエステル結合した、アミノ誘導体であってもよい。これを、本発明にてグリセロホスホノ脂質のアミノ誘導体と呼ぶ。【0078】
上記アミノ酸及びペプチドとは、上述のグリセロリン脂質のアミノ誘導体に関して詳述した通りである。【0079】
具体的なスフィンゴホスホノ脂質として、例えばセラミドアミノエチルホスホン酸、アシルスフィンゴシルアミノエチルホスホン酸、これらの誘導体等が挙げられる。【0080】
また、これらのスフィンゴホスホノ脂質は、リゾ体であってもよい。ここで、リゾ体とは、スフィンゴシンが有する２つの水酸基のうち、リン酸と直接結合して形成される上述のＣ−Ｐ結合に用いられる水酸基の他方がそのまま残っている化合物である。【0081】
更に、これらのスフィンゴホスホノ脂質は、上述の残った水酸基に、アミノ酸又はペプチドがエステル結合した、アミノ誘導体であってもよい。これを、本発明にてスフィンゴホスホノ脂質のアミノ誘導体と呼ぶ。【0082】
上記アミノ酸及びペプチドとは、上述のグリセロリン脂質のアミノ誘導体に関して詳述した通りである。【0083】
上述のリン脂質として例えば、下記の表１に示す構造式にて表される化合物が挙げられる。これらの構造式にて表されるリン脂質は、塩の形態としてＡｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社から購入可能である（左欄の番号は製品番号を示す。）。【0084】
【表1】
【0085】
これらのリン脂質の中でも、ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体が好ましい。【0086】
前記ホスファチジルイノシトールエステル誘導体としては、例えば、ホスファチジルイノシトール（３）モノリン酸、ホスファチジルイノシトール（４）モノリン酸、ホスファチジルイノシトール（５）モノリン酸、ホスファチジルイノシトール（３，４）ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール（３，５）ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリリン酸、これらの誘導体等が挙げられる。【0087】
また、ホスファチジルイノシトール又はホスファチジルイノシトールエステル誘導体として、下記式（１）に示される化合物も挙げられる。【0088】
【化5】
【0089】
上記式中、Ｒ１は、アミノ基又は水酸基を有していてもよいアルキル基である。【0090】
該アルキル基は、更に炭素数が３個〜２４個のアルカノイルオキシ基又はアミノ酸残基若しくはペプチド残基を１つ以上有していてもよい。【0091】
好ましくは２つ以上のアルカノイルオキシ基又はアミノ酸残基若しくはペプチド残基を更に有するアルキル基である。当該アルキル基が有するアルカノイルオキシ基、又はアミノ酸残基又はペプチド残基の個数の上限は、当該アルキル基の炭素数に従って、それを保有できる範囲において特に限定はされない。【0092】
前記アルカノイルオキシ基の炭素数は４個程度以上が好ましく、より好ましくは６個程度以上、更に好ましくは８個程度以上である。また、当該アルカノイルオキシ基の炭素数の上限値は２０個程度が好ましく、より好ましくは１６個程度、更に好ましくは１２個程度、最も好ましくは８個程度である。【0093】
なお、前記アルカノイルオキシ基は、その炭素間結合に二重結合を１つ以上含んでいてもよい。また、二重結合の上限個数はアルカノイルオキシ基の炭素数に従って決定され、好ましくは４個程度の炭素間二重結合を含んでいてもよい。このように炭素間二重結合を含む場合、シス体であってもトランス体であってもよく、何れかに限定はされない。【0094】
前記アルキル基の炭素数は、特に限定はされないが、通常は２個〜８個であればよく、より好ましくは３個以上である。当該炭素数の上限値は、７個が好ましく、より好ましくは６個、更に好ましくは５個である。【0095】
前記アルキル基がアルカノイルオキシ基を有する場合、上述のアルカノイルオキシ基における末端のカルボニル炭素原子と単結合している酸素原子が当該アルキル基中の何れかの炭素原子と単結合していればよい。当該アルキル基がアルカノイルオキシ基を２つ以上有する場合、当該アルキル基中の同一の炭素原子に、上述した２つ以上のアルカノイルオキシ基が結合していてもよく、当該アルキル基の異なる炭素原子に上述したアルカノイルオキシ基が結合していてもよい。なお、上述した２つ以上のアルカノイルオキシ基は同一であっても異なっていてもよい。【0096】
前記アミノ酸残基は、ｔ−ＲＮＡの遺伝情報に基づく２０種類のアミノ酸のみならず、セレノシステイン、セレノメチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニン、ピロリシン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ−ホスホセリン、β−アラニン、Ｎ−メチルグリシン、オルニチン、スタチン、シトルリン、クレアチン、γーアミノ酪酸等のアミノ基及びカルボキシ基を有する化合物といった広義のアミノ酸の少なくとも１つのカルボキシ基から、水素原子を除いたものである。これらのアミノ酸の中でも、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸等の電荷を有する側鎖を含むアミノ酸から水素原子を除いたアミノ酸残基が好ましい。【0097】
また、前記ペプチド残基は、上述の２〜１０のアミノ酸がペプチド結合して得られるペプチドの少なくとも１つのカルボキシ基から水素原子を除いて得られたペプチド残基である。この様なペプチド残基には、上述の好ましいアミノ酸の残基が含まれていることが好ましい。【0098】
また、前記アルキル基には、上述のアミノ酸残基又はペプチド残基におけるカルボニル基と単結合している酸素原子が、当該アルキル基中の何れかの炭素原子と単結合していればよい。当該アルキル基がアミノ酸残基又はペプチド残基を２つ以上有する場合、当該アルキル基中の同一の炭素原子に、上述した２つ以上のアミノ酸残基又はペプチド残基が結合していてもよく、当該アルキル基の異なる炭素原子に上述したアミノ酸残基又はペプチド残基が結合していてもよい。なお、上述した２つ以上のアミノ酸残基又はペプチド残基は同一であっても異なっていてもよい。【0099】
式中、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４は、同一又は異なって水素原子又は酸と水酸基との脱水縮合反応により得られる該酸の残基である。【0100】
前記の酸は、有機酸であっても無機酸であってもよく、特に限定はされないが、好ましくは無機酸である。このような無機酸としては、リン酸、亜リン酸、次亜リン酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、ボロン酸等が挙げられ、特に限定はされないが、好ましくはリン酸である。【0101】
上記の残基として最も好ましいのは、ホスホノ基である。【0102】
このような上記式（１）にて示される具体的な化合物として、例えば、下記の表２〜表４に示す構造式にて表される化合物が挙げられる。これらの構造式にて表される化合物は塩の形態で、表２から表４についてはｅｃｈｅｌｏｎ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から、表５及び表６についてはＡｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄ社から購入可能である（左欄の番号はカタログ番号を示す。）。【0103】
【表2】
【0104】
【表3】
【0105】
【表4】
【0106】
【表5】
【0107】
【表6】
【0108】
なお、上記表２〜６における基Ｈ２Ｏ３Ｐ−の構造は下記式の通りである。【0109】
【化6】
【0110】
このようなホスファチジルイノシトールエステル誘導体として、ホスファチジルイノシトールリン酸が好ましく、最も好ましい態様のホスファチジルイノシトール誘導体は、下記の化学式（２）に示す化合物である。【0111】
【化7】
【0112】
上述のリン脂質は、塩の態様であってもよい。【0113】
このような塩の１つの態様として、具体的には、リン脂質に含まれる、何れか１つ以上のＯＨ基からプロトンを除いたアニオンと、それのカウンターカチオンからなる塩が挙げられる。より好ましくは、リン脂質に含まれるホスホノ基又は１つ以上のアルカノイルオキシ基を有していてもよいアルキルホスホノ基のＯＨ基からプロトンを除いたアニオンと、それのカウンターカチオンからなる塩が挙げられる。【0114】
アニオンの価数は特に限定はされないが、通常は１価〜７価程度とすればよい。【0115】
カウンターカチオンの種類は、特に限定はされず、例えばナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。【0116】
他の態様の塩として、リン脂質に含まれる何れか１つ以上のアミノ基にプロトンが結合したカチオンと、それのカウンターアニオンからなる塩が挙げられる。【0117】
カウンターアニオンの種類は、特に限定はされず、例えばフッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン等が挙げられる。【0118】
上述のリン脂質は、公知の方法を用いて製造する事が可能である。例えば、リン脂質が上述したようなリン酸エステル結合を含むホスホノオキシ基を有するリン脂質である場合、実験化学講座 第５版（１６）「カルボン酸・アミノ酸・ペプチド」を適宜参照して製造することができる。また、市販のものを購入して入手する事も可能である。【0119】
本発明に係るアジュバントに含まれるリン脂質は、アニオン性、カチオン性、ノニオン性のいずれであってもよいが、アニオン性のリン脂質であることが好ましい。【0120】
本発明に係るアジュバントは、上述のリン脂質を含むものであり、その含有量は、当該アジュバント当たり、通常０．０１〜９９．９９重量％程度である。また、当該リン脂質そのものが本発明に係るアジュバントであってもよい。【0121】
本発明に係るアジュバントには、上述のリン脂質以外に、通常、アジュバントに含有される公知の成分が、上述した本発明に係るアジュバントの効果を損なわない範囲に限って含まれていてもよい。【0122】
このような成分として、例えば、防腐剤、緩衝剤、保存剤、不活化剤、等張頂化剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。【0123】
本発明に係るアジュバントは、上述した本発明に係るアジュバントの効果を損なわない範囲に限り、上述のリン脂質以外に、通常アジュバントに含有される免疫賦活化作用を発揮する公知の成分が、含まれていてもよい。【0124】
このような成分として、例えば、水酸化アルミニウム、スクワレン、αトコフェロール、ミネラルオイル、パラフィンオイル、１本鎖ＲＮＡ若しくはそのアナログ、２本鎖ＲＮＡ若しくはそのアナログ、フラジェリン、トレハロース誘導体、ＭＰＬ等が挙げられる。【0125】
本発明に係るアジュバントは、例えば、商業用に抗体を製造する際に、一般的に採用される実験動物に有効に用いられる。即ち、抗体を特異的に認識する抗原を実験動物に投与する際に、本発明に係るアジュバントをそれに混合して同時に、又は抗原とは別に投与して使用する方法が挙げられる。【0126】
このような実験動物としては、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ロバ、ウマ、ダチョウ、ラクダ、ラマ、アルパカ等が挙げられる。【0127】
これらの実験動物に対する本発明に係るアジュバントの使用量は、所望する免疫賦活化の程度によって適宜設定すればよく、特に限定はされないが、当該アジュバントに含まれる上述のリン脂質の量に換算して、動物個体１ｋｇ当たり、通常０．５ｍｇ〜０．５ｇ／回程度とすればよい。【0128】
また、所望する免疫賦活化の程度に従って、同一の動物個体に対して複数回使用してもよく、通常は２回〜４回程度を上限とすればよい。なお、同一固体に対して本発明に係るアジュバントを複数回使用するさいには、その間隔を適宜設けてもよく、通常は１４日〜３０日程度とすればよい。【0129】
本発明に係るアジュバントは、上記動物に使用する際の使用方法は、特に限定される事は無く、例えば、経口投与、経静脈投与、経皮投与、経粘膜投与、経舌下投与、経腹腔投与、経筋肉投与等によって使用すればよい。【0130】
また、本発明に係るアジュバントは、抗原と共に生体に投与する事により、生体内の樹状細胞が活性化し、獲得免疫効果が発揮される。従って、本発明に係るアジュバントは、抗原と共に臨床的に使用することによって、ワクチンとしての機能を発揮する事が期待される。【0131】
＜ワクチン＞本発明に係るワクチンは、上述のアジュバントと抗原を含むものである。
【0132】
当該抗原とは、液性免疫又は細胞免疫システムに感知され、当該抗原に対して特異的に結合する抗体が産生されるか、或いは白血球、マクロファージ、Ｔ細胞等によって捕食されるものである。【0133】
具体的な抗原としては細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫、がん細胞、がん細胞特異的タンパク質、がん細胞融解物、プリオン、核酸、レニン、アンジオテンシン、アンジオテンシン受容体等が挙げられ、特に限定はされない。【0134】
上記の細菌は、ヒト、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる細菌であれば特に限定されない。具体的には、レンサ球菌（溶連菌、肺炎球菌等）、黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ等）、表皮ブドウ球菌、腸球菌、リステリア属に属する菌（リステリア菌、以下同様に表現することがある。）、髄膜炎球菌、淋菌、病原性大腸菌、肺炎桿菌、プロテウス菌、百日咳菌、緑膿菌、セラチア菌、シトロバクター菌、アシネトバクター菌、エンテロバクター菌、マイコプラズマ菌、クロストリジウム菌、結核菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、赤痢菌、炭疽菌、トレポネーマ菌、破傷風菌、らい菌、レジオネラ菌、レプトスピラ菌、ボレリア菌、フランシセラ菌、コクシエラ菌、リケッチア菌、クラミジア菌、鼻疽菌、ピロリ菌等が挙げられる。【0135】
上記のウイルスは、ヒト、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となるウイルスであれば特に限定されない。具体的にはインフルエンザウイルス、パピロマウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、ＴＴ型等）、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、サポウイルス、サッポロウイルス、ムンプスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ロタウイルス、エイズウイルス、狂犬病ウイルス、Ｔリンパ好性ウイルス、黄熱病ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ポリオーマウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ヘルペスウイルス、リンホクリプトウイルス、ロゼオロウイルス、日本脳炎ウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、ラッサウイルス、チクングニアウイルス、ハンターンウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ボルナウイルス、リフトバレー熱ウイルス、トゴトウイルス、ドーリウイルス、口蹄疫ウイルス、ニューキャッスルウイルス、牛丘疹性口炎ウイルス、牛疫ウイルス、豚水胞病ウイルス、カリシウイルス、トロウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アルテリウイルス、羊痘ウイルス、カプリポックスウイルス、羊随伴型悪性カタル熱ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、水胞性口炎ウイルス等が挙げられる。【0136】
上記の真菌は、ヒト、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる真菌であれば特に限定されない。具体的には、アスペルギルス菌、カンジダ菌、クリプトコッカス菌、白癬菌症、ヒストプラズマ菌、ニューモシスチス菌等が挙げられる。【0137】
上記の寄生性原虫は、ヒト、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる寄生性原虫であれば特に限定されない。具体的には、アメーバ赤痢、マラリア、トキソプラズマ、リーシュマニア、クリプトスポリジウム、トリパノソーマ等が挙げられる。【0138】
上記の寄生性蠕虫は、ヒト、愛玩動物、家畜等に対して疾患を引き起こす原因となる寄生性蠕虫であれば特に限定されない。具体的には、エキノコックス、日本住血吸虫、フィラリア、回虫、広節裂頭条虫等が挙げられる。【0139】
上記がん細胞は、ヒト、愛玩動物、家畜等が罹患するがんの病巣部における細胞であれば特に限定はされない。このようながんとして、例えば白血病、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、脳腫瘍、乳癌、子宮体癌、子宮頚癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、虫垂癌、大腸癌、肝癌、肝細胞癌、胆嚢癌、胆管癌、膵臓癌、副腎癌、消化管間質腫瘍、中皮腫、頭頚部癌、喉頭癌、口腔癌、歯肉癌、舌癌、頬粘膜癌、唾液腺癌、副鼻腔癌、上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、肺小細胞癌、骨肉腫、前立腺癌、精巣腫瘍、腎細胞癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、皮膚癌、肛門癌、脳腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、滑膜肉腫等が挙げられる。【0140】
上記の癌細胞特異的タンパク質は、上述のがん細胞において、特異的に発現するタンパク質（腫瘍関連抗原とも呼ばれる。）であれば特に限定されない。このようなタンパク質の中でも、癌細胞の表面にて特異的に発現するタンパク質である事が好ましく、例えば受容体も含まれる。なお、このようなタンパク質は、タンパク質全長であっても、その一部の断片であってもよい。【0141】
このような、がん細胞特異的タンパク質として、例えば、がんが前立腺癌であれば、ＰＳＡが挙げられる。【0142】
上記がん細胞融解物は、上述のがん細胞を融解させて得られるものである。融解させる方法は、上記がん細胞を単に破砕すればよく、例えば界面活性剤を含む緩衝液を用いて破砕する方法、超音波破砕法、ガラスビーズを用いて破砕する方法、フレンチプレスを用いて破砕する方法等が挙げられ、適宜これらを組み合わせてもよい。【0143】
上記のプリオンとは、野生型でないタンパク質からなる伝染性因子であり、これがヒト、愛玩動物、家畜等の体内に蓄積する事によって、疾患を引き起こすものである。【0144】
このような疾患は、特に限定されるものではないが、例えば、海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、アルツハイマー病等が挙げられ、具体的なプリオンとしては、例えば、βアミロイド等が挙げられる。【0145】
上記のレニンとは、血圧上昇などに関連するレニン−アンジオテンシン系にて働くものである。【0146】
上記アンジオテンシンは、Ｉ型であっても、ＩＩ型であってもよく、上述のレニン−アンジオテンシン系にて働くものである。【0147】
上記のアンジオテンシン受容体は、Ｉ型アンジオテンシン及び／又はＩＩ型アンジオテンシンの受容体であり、その全長であっても、一部断片であってもよい。【0148】
なお、上述した細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫、がん細胞、がん細胞特異的タンパク質、がん細胞融解物、プリオン、核酸、レニン、アンジオテンシン、アンジオテンシン受容体等は、適宜２種類以上組み合わせて、本発明の本発明に係るワクチンに含有される抗原としてもよい。【0149】
上述の細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫等は、これらのそのものを抗原としてもよく、これらを不活化したものを抗原としてもよい。【0150】
不活化する具体的な方法として、例えば加熱、紫外線照射、有機溶媒の添加、界面活性剤の添加等といった処理を施す方法が挙げられる。【0151】
また、上述の細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫を抗原とする場合、これらのそのものを抗原とする必要は無く、例えば、これらからＤＮＡ、ＲＮＡ等といった核酸を除去したもの、例えばウイルスであればウイルス外皮（これは、キャプシドとも呼ばれる。）を、抗原としてもよい。【0152】
さらに、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫等が有するタンパク質、糖質、脂質等といった構成成分を抗原としてもよく、これらの一部を抗原としてもよい。このような構成成分は、細菌、ウイルス、真菌、寄生性原虫、寄生性蠕虫等の表面に存在するものが好ましい。【0153】
例えば、インフルエンザウイルスであれば、その表面に存在する各種ＨＡ、ＮＡ等といったタンパク質を抗原としてもよく、これらのタンパク質の一部又はそれに含まれる糖鎖若しくはその一部を抗原としてもよい。【0154】
上記の核酸とは、リボヌクレオチドであっても、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、このような核酸は、一本鎖の形態に限定されず、二本鎖以上の形態であってもよい。そして、上記の核酸は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルを塩基として含むものに限定されず、これらの誘導体又は修飾化された塩基を含む核酸であってもよい。【0155】
本発明に係るワクチンは、感染症や癌等といった疾患を予防するために、通常はヒトに好適に用いられるものではあるが、その他に上述のような愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ、フェレット、トリ等）や、上述の様な家畜（ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ダチョウ、ヒツジ、ウマ等）に対しても好適に用いられる。【0156】
本発明に係るワクチンにおける上述のアジュバントの含有割合は、特に限定はされないが、通常はワクチン１００重量％に対して、０．０１重量％〜９９．９９重量％程度である。【0157】
また、上述の抗原と上述のアジュバントの割合とすれば、抗原１重量部に対して、アジュバントは、通常１０重量部〜１０００重量部程度である。【0158】
本発明に係るワクチンの投与方法は、特に限定されることは無いが、例えば、経口投与、経静脈投与、経皮投与、経粘膜投与、経舌下投与、経筋肉投与等が挙げられる。【0159】
ワクチンの投与量は、所望する免疫賦活化の程度や、投与対象の年齢、性別等によって区々であるため、適宜設定すればよく、特に限定はされないが、例えばリン脂質の量に換算すれば、ヒト、愛玩動物又は家畜の１ｋｇ当たり、通常０．５ｍｇ〜０．５ｇ／回程度とすればよい。【0160】
また、所望するワクチンが発揮する効果の程度、投与対象の年齢、性別等に従って、同一のヒト、愛玩動物、又は家畜に対してワクチンを複数回投与してもよく、通常は２回〜４回程度を上限とすればよい。なお、同一のヒト、愛玩動物、又は家畜に対して本発明に係るワクチンを複数回投与する際には、その間隔を適宜設けてもよく、通常は１４日〜３０日程度とすればよい。【0161】
このようなワクチンは、十分な疾患（特に感染症）の予防効果を発揮するのみならず、ワクチンの投与によって生じる副作用が、極めて低い効果を発揮する。【0162】
＜免疫賦活化方法＞本発明に係る免疫賦活化方法は、上述のリン脂質を生体に投与する工程を含むものである。
【0163】
生体とは、免疫システムを増強させる必要がある生体である限り、特に限定はされない。具体的には、上記＜アジュバント＞にて詳述したような、商業用に抗体を製造する際に用いられる実験動物、上記＜ワクチン＞にて詳述した、疾患（特に感染症）を予防するためのワクチンの投与対象となるヒト、愛玩動物、家畜等が挙げられる。【0164】
リン脂質の投与量は、特に限定される事は無く、例えば上記＜アジュバント＞にて詳述した、アジュバントの使用量に基づいて適宜設定される。或いは、上記＜ワクチン＞にて詳述した、ワクチンの投与量に基づいて設定してもよい。【0165】
そして同様に、複数回投与の回数及び複数回投与の際の投与間隔についても、上記＜アジュバント＞又は＜ワクチン＞にて詳述したものを基に適宜設定すればよい。【0166】
投与方法については、上記＜アジュバント＞又は＜ワクチン＞にて詳述した投与方法から適宜選択すればよい。【0167】
本発明に係る免疫賦活化方法は、上述の本発明に係るアジュバントと共に抗原を投与する事が好ましい。具体的な抗原は、上記＜ワクチン＞にて詳述したものと同様にすればよく、投与対象、投与方法、複数回投与の回数並びにその間隔等についても、上記＜ワクチン＞、＜アジュバント＞における記載と同様にすればよい。【0168】
＜スクリーニング方法＞本発明に係るスクリーニング方法は、以下の工程１及び２を含む、アジュバント候補のスクリーニング方法である。
工程１
（１）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とを接触させる工程
工程２
（２）該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程。
【0169】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、以下に示す工程１’及び工程２’を含む態様のアジュバント候補のスクリーニング方法も包含される。工程１’
（Ｉ）細胞内成分とＩＲＦ３（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ３）とＴＢＫ１（ＴＡＮＫ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ １）とを接触させる工程１’
工程２’
（ＩＩ）該ＴＢＫ１と結合し、且つ該ＩＲＦ３をリン酸化させる該細胞内成分を選択する工程２’。
【0170】
上記工程１及び１’にて用いる細胞内成分は、公知の方法によって細胞を破砕することにより得ることができる。【0171】
このような方法として、例えば、界面活性剤を含む緩衝液を用いて破砕する方法、超音波破砕法、ガラスビーズを用いて破砕する方法、フレンチプレスを用いて破砕する方法等が挙げられ、適宜これらを組み合わせてもよい。【0172】
このような手段によって細胞を破砕して得られる上述の細胞内成分は、破砕して得られたものを、例えばメタノール／クロロホルム混合溶媒にて分画したメタノール画分（水溶性画分）に含まれる成分であっても、クロロホルム画分（不水溶性画分）に含まれる成分であっても、これらの両者に含まれる成分であってもよく、特に限定はされないが、好ましくは、不水溶性画分に含まれる成分である。また、具体的な細胞の由来は特に限定されるものではなく、適宜選択すればよい。【0173】
上記細胞は、破砕前に予めＩＲＦ３がリン酸化されやすいように活性化されていてもよい。具体的な活性化方法としては、例えば当該細胞をＩＰＳ−１、ＴＲＩＦ、ＭｙＤ８８、ＴＩＲＡＰ等を発現する遺伝子を導入する方法が挙げられる。好ましくは、ＩＰＳ−１を発現する遺伝子を導入する方法である。【0174】
上記工程２及び２’における、ＩＲＦ３をリン酸化させる細胞内成分を選択する方法は、ＩＲＦ３のリン酸化を公知の方法によって確認することによって、細胞内成分を選択すればよい。具体的な確認方法は、リン酸化ＩＲＦ３を認識する抗体を用いたウェスタンブロッティング法、フローサイトメトリー法、ＥＬＩＳＡ等が挙げられる。 【0175】
上記工程２及び２’におけるＴＢＫ1と結合し、且つＩＲＦ３をリン酸化する方法は、上記のＩＲＦ３のリン酸化を確認する方法に加え、免疫沈降法、ＱＣＭ（水晶振動子マイクロバランス）法、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）法等を組みわせればよい。
【実施例】
【0176】
以下に示す実験例に基づいて、本発明を更に詳細に説明する。ただし、本発明が以下に示す実験例に限定されないのは言うまでもない。【0177】
まず、後述する実験例で使用する材料及び実験手法等について説明する。【0178】
（１）細胞及び試薬についてＨＥＫ２９３細胞及びＭＥＦ（マウス胎児線維芽細胞）は、１０％の非働化ＦＣＳ（ライフ・テクノロジー社）を含むＤＭＥＭ培地を用い、５％の二酸化炭素環境下で、３７℃で培養を行った。
【0179】
ＧＭ−ＣＳＦによって誘導される骨髄由来の樹状細胞（ＧＭ−ＤＣｓ)は、マウス骨髄から採取した細胞を、１０％のＦＣＳ、１００μＭの２−ＭＥ、及び１０ｎｇ／ｍｌのマウス由来のＧＭ−ＣＳＦ（ＢＤ バイオサイエンス社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で６〜８日間培養して作製した。
【0180】
ＩＳＤ配列は、以下の通りであり常法に従って作製した。（ｓｅｎｓｅ：５′−ＴＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＴＡＣＡ；配列番号１）。【0181】
ＬＰＳ及びポリＩ：Ｃ及びポリｄＡ：ｄＴは、インビボジェン社から購入し、これらを用いて細胞を刺激する際には、リポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジー社）とそれぞれ２：１（２μｇ：１μｌ）の割合で混合し、これをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ライフ・テクノロジー社）と共に刺激した。【0182】
ＰＩＫｆｙｖｅ阻害剤であるＹＭ−２０１６３６はサンタクルーズ社から購入した。【0183】
以下、抗体の入手先について説明する。抗ＰＩＫｆｙｖｅ抗体（Ｓｉｇｍａ社）、抗ｐＩＲＦ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ｐＪＮＫ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、抗ＴＢＫ１（Ａｂｃａｍ社）、抗ｐＴＢＫ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。また、各種ＥＬＩＳＡ法はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社からキットを購入し、マニュアルに従って実験を行った。【0184】
（２）プラスミド及びレポーターアッセイについてＦＬＡＧタグ付きＰＩＫｆｙｖｅ発現プラスミドは、ＰＩＫｆｙｖｅをＰＣＲによって増幅させた後に、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ６ベクターに組み込んで作製した。そして、カイネース・ネガティブ変異体（Ｋ１８３１Ｍ ＰＩＫｆｙｖｅ）発現プラスミドは、ＫＯＤ（東洋紡）を用いて作製した。
【0185】
ＦＬＡＧタグ付きのＰＩＰ５Ｋα、β、並びにγ、発現プラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞のｃＤＮＡからこれらをコードする遺伝子断片をそれぞれ増幅し、ｐＦｌａｇ−ＣＭＶ６ベクターに組み込んだ。【0186】
ＰＩ３ＫＩＩＩ、ＰＴＥＮ、ＴＭＥＭ５５α、ＴＭＥＭ５５β、及びＰＩ４Ｋ２α発現プラスミドは、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクター（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に組み込まれたものを使用した。【0187】
レポーターアッセイは、２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３細胞を播種し、各種発現プラスミドと、レポータールシフェラーゼプラスミドとを、リポフェクタミン２０００（ライフ・テクノロジー社）を用いて播種したＨＥＫ２９３細胞を形質転換し１６時間培養の後の細胞を、パッシブ リシス バッファー（プロメガ社）を用いて溶解した。【0188】
その後、デュアルルシフェラーゼ レポーターアッセイ キット（プロメガ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、レポータープラスミドであるＩＦＮα、ＩＳＲＥ、及びＮＦκＢは公知のものを採用した。そして、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼを作動させるＴＫプロモーターを内部コントロールとして用いた。【0189】
（３）インビトロリン酸化アッセイについて大腸菌を用いてＧＳＴタグ付きＩＲＦ３を製造し、精製の後プレシジョンプロテアーゼ（ＢＤバイオサイエンス社）を用い、プロトコルに従ってＧＳＴタグを切断した。ＧＳＴタグ付きＴＢＫ１は、ＨＥＫ２９３ｔ細胞を用いて製造し、１０ｍＭのグルタチオンを用いて精製した。
【0190】
インビトロカイネースアッセイは、反応バッファー（１０μＭのＡＴＰ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２））中で、２０ｎｇのＴＢＫ１及び１００ｎｍｏｌのＩＲＦ３を、３０℃で３０分インキュベートした。【0191】
リポソームは、ＰＣ：ＰＥ：ＰＩをそれぞれ３０：８：２で混合し、超音波処理法にて作製した。また、インビトロカイネースアッセイには、これを４０μＭで使用した。【0192】
ＧＳＴタグ付きＳＴＩＮＧは、ＨＥＫ２９３ｔ細胞を用いて製造し、１０ｍＭのグルタチオンセファロースビーズを用いて精製した。精製ＳＴＩＮＧは、アゾレクチン脂質とともに透析環境下で界面活性剤を除去することによりリポソームを形成させることで再構成した。【0193】
（４）タンパク質脂質オーバーレイアッセイ１００μＭの精製ＩＲＦ３又はＧＳＴ−ＴＢＫ１タンパク質を膜脂質ストリップ（Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐ６００１）と共に、ＴＢＳーＴバッファー（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０））中でインキュベートした。 その後、膜をＴＢＳーＴバッファー３回洗浄した後、抗ＩＲＦ３抗体又は抗ＴＢＫ１抗体と共にインキュベートして、更に２次抗体で処理した。
【0194】
（５）ＲＮＡｉ及び定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）について２本鎖ステルスＲＮＡはライフサイエンステクノロジー社から入手した。ＰＩＫｆｙｖｅのターゲット配列は以下の通りである。
【0195】
（センス鎖）５’−ＵＵＣＡＧＡＡＵＧＡＡＵＣＵＡＵＣＡＵＣＵＵＣＧＧ−３’〔配列番号２〕。【0196】
ｓｉＲＮＡはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ社）又はＮＥＯＮ（ライフ・テクノロジー社）を用いてエレクトロポーレーションした。エレクトロポーレーションから２日後に、ＭＥＦ及びＧＭ−ＤＣを種々の試薬又はウイルスで刺激した。総ＲＮＡはＴｒｉｚｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ（ライフ・テクノロジー社）を用いて単離し、逆転写反応はＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（東洋紡）を用い、プロトコルに従って実験を行った。定量ＰＣＲに使用したプライマーは以下の通りである。【0197】
ｍＩＦＮ；５′−ＡＴＧＧＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴ−３′〔センス：配列番号３〕：５′−ＣＣＡＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡ−３′〔リバース：配列番号４〕。【0198】
ｍＩＰ−１０；５′−ＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴ−３′：〔センス：配列番号５〕：５′−ＣＡＣＴＣＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＴＴＴＴＡＧＡＣＣ−３′〔リバース：配列番号６〕。【0199】
ｍＧＡＰＤＨ：５′−ＴＧＡＣＧＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＡ−３′〔センス：配列番号７〕：５′−ＡＧＴＧＴＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧ−３′〔リバース：配列番号８〕。【0200】
ｍＩＬ−６；５′−ＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＡＣ−３′：〔センス：配列番号９〕：５′−ＡＣＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡ−３′〔リバース：配列番号１０〕。【0201】
ｍＰＩＫｆｙｖｅ；５′−ＡＡＧＴＣＴＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＡＧＣＴＡＧＴＧＡ−３′〔センス：配列番号１１〕：５′−ＡＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＴＴＣＴＡＣＣＣＡＡＧＧＴ−３′〔リバース：配列番号１２）。【0202】
（６）マウスへの免疫付与ＩＰＳ−１−／−マウス、ＩＲＦ３−／−／ＩＲＦ７−／−マウス、及びＯＴ−ＩＩマウスについては既に公知の方法によって作製されたものを用いた。全ての動物実験は、大阪大学微生物病研究所の動物実験委員会の承認を得て行った。
【0203】
マウスの免疫化は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア株式会社）を、計４回の免疫化のために毎週１００μｇのＯＶＡ（生化学工業株式会社）及び１ｍｇのアラム（シグマ社）で腹腔内注射により免疫化するか、又は１００μｇのＯＶＡ／１００μｇのＣ８−ＰｔｄＩｎｓで筋肉注射により免疫化した。【0204】
Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ及びＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２をＰＢＳに可溶化し、免疫化のためにＯＶＡと混合した。共培養実験については、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、又はポリＩ：Ｃで処理した１×１０５個のＯＶＡ特異的ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞及び１×１０５個のＧＭ−ＤＣを、１０μｇのＯＶＡタンパク質の存在下で７日間培養し、ＩＦＮγの産生量を測定した。【0205】
実験例１ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの同定
ＴＢＫ１による転写因子ＩＲＦ３のリン酸化にともなう、ＩＲＦ３の活性化が樹状細胞の活性化に必須なシグナルカスケードの一つとして知られている。この様なＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードを調節する細胞成分を同定するために、インビトロスクリーニングシステムを構築した。具体的には、組換えＴＢＫ１及びＩＲＦ３を調製し、これらをＡＴＰの存在下で様々な試薬と混合して実験を行った。
【0206】
ＩＲＦ３の活性化は、インビトロカイネース反応の後、Ｓ３９６リン酸化ＩＲＦ３に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により検出することで評価した。ＴＢＫ１及びＩＲＦ３を既知の免疫活性化剤であるＤＭＸＡＡ、ｄｓＤＮＡ、高濃度のＫＣｌ、Ｈ２Ｏ２、既知のＤＮＡウイルスを抗原として樹状細胞が活性化する際に機能するシグナルタンパク質である精製ＳＴＩＮＧと共にインキュベートしたが、これらのいずれもＩＲＦ３リン酸化を増強することはできなかった（図１Ａ）。【0207】
次いで、細胞内成分がＩＲＦ３のリン酸化に関与するか否かを試験した。このために、ＨＥＫ２９３ｔ細胞を、クロロホルム／メタノールを用いて水溶性画分と不水溶性画分とに分離した。脂質又はコレステロールを含有する不水溶性画分（クロロホルム側）は、乾燥させ、反応バッファーに再懸濁して用いた。【0208】
その結果、脂質を含む不溶性画分がＩＲＦ３のリン酸化を増大させることを見出した（図１Ａ）。【0209】
さらに、細胞を活性化させるためにＩＰＳ−１、ＴＲＩＦ、ＭｙＤ８８、又はＴＩＲＡＰで形質転換したＨＥＫ２９３ｔ細胞から単離した不溶性画分を用いて実験を行ったところ、コントロールと比較して、ＩＲＦ３のリン酸化が強く誘導されることが明らかとなった（図１Ｂ）。【0210】
このことは、活性化した細胞中で増加した不水溶性画分に含まれる成分が、ＴＢＫ１を介するＩＲＦ３の活性化に関与することが示された。このような成分として脂質に着目し、これを検討する為のさらなる実験を行った。【0211】
ＩＲＦ３の活性化に関わる脂質を更に同定するために、タンパク質―脂質オーバーレイアッセイを用いてＴＢＫ１又はＩＲＦ３に結合する脂質を検討した。その結果、ＴＢＫ１がＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐに結合し、ＩＲＦ３がＰｔｄＩｎｓ（３）Ｐ、ＰｔｄＩｎｓ（４）Ｐ、及びＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ等の幾つかのアニオン性脂質に結合することを見出した（図１Ｃ）。カチオン性脂質又は任意の他の脂質へのこれらのタンパク質の結合は検出不能であった。【0212】
このような知見から、アニオン性脂質がインビトロでＩＲＦ３のリン酸化を促進する能力を有することが示唆される。そこで、アニオン性脂質のＩＲＦ３の活性化への関与を調べるために、アニオン性脂質である様々な合成ホスファチジルイノシトールを、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と混合してリポソームを形成し、これらをインビトロカイネースアッセイに使用した。【0213】
その結果、これらの中でも、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐを含有するリポソームがＩＲＦ３のリン酸化を最も効果的に助長した（図１Ｄ）。以上のことから、インビトロの実験においてＰｔｄＩｎｓ（５）ＰがＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードを調節することで、アジュバンド能を発揮する可能性が示唆された。【0214】
実施例１にて用いた各種リン脂質は炭素数１６の脂肪酸を含むものであり、具体的な出所は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ社の以下のカタログ番号のである。【0215】
ＰＣ：８４００３５Ｃ、ＰＥ：８４００２２Ｃ、
ＰＩ：８５０１４９Ｐ、
ＰＩ（３）Ｐ：８５０１５０Ｐ、
ＰＩ（４）Ｐ：８４００４５Ｘ、
ＰＩ（５）Ｐ：８５０１５２Ｐ、
ＰＩ（３，４）Ｐ２：８５０１５３Ｐ、
ＰＩ（３，５）Ｐ２：８５０１５４Ｐ、 ＰＩ（４，５）Ｐ２：８５０１５５Ｐ、
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３：８５０１５６Ｐ。
【0216】
このような実施例１にて示す方法は、アジュバント候補のスクリーニング方法として有用である。【0217】
実験例２ＰＩＫｆｙｖｅの同定
次に、細胞内においてウイルス感染時にＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの産生を介したＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードを調節するカイネース又はホスファターゼの同定を試みた。
【0218】
候補遺伝子がＩＲＦ３の活性化を誘導するか否かは、候補遺伝子の発現プラスミドと共に転写因子であるＩＲＦの活性を直接モニターするために設計されたＩＦＮ刺激応答要素（ＩＳＲＥ）を積んだレポータープラスミド（ＩＳＲＥレポータープラスミド）をＨＥＫ２９３細胞に形質転換し、細胞内のルシフェラーゼの発現を指標としたレポーターアッセイによって定量した（図２Ａ）。【0219】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＰＩＫｆｙｖｅの過剰発現は、ＩＳＲＥ及びＩＦＮβのプロモーター活性を増大させたが、ＰＩＫｆｙｖｅのカイネース・ネガティブ突然変異体を過剰発現させてもこれらのプロモーターを活性化しなかった。また、ＰＩＫｆｙｖｅの過剰発現はウイルス感染時の細胞応答に必須な転写因子であるＮＦ−κＢのプロモーター活性には影響を与えなかった（図２Ｂ）。【0220】
ＰＩＫｆｙｖｅは、イノシトール環の５位のリン酸化によってＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ又はＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２を合成するカイネースであり、過剰発現によりＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの産生が誘導され、特異的にＩＳＲＥのプロモーター活性を増大させたと考えられた（図２Ｃ）。【0221】
抗ウイルス応答に必須なサイトカインであるＩＦＮβの産生が誘導するにはＮＦ−κＢとＩＳＲＥが協調的に活性化していることが知られているが、これらの結果から、ＰＩＫｆｙｖｅによるＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの産生がＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードを特異的に調節することでＩＦＮβ等の産生を制御することが示唆された。これらのことは、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐがアジュバンドとして特異的にＴＢＫ１−ＩＲＦ３を標的として働く可能性を示唆している。【0222】
実験例３細胞質の病原体由来核酸の検知経路に関わるＰＩＫｆｙｖｅの役割
実際にＰＩＫｆｙｖｅを介したＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの産生が抗ウイルス先天性免疫応答を調節するか否かを検討するために、ＰＩＫｆｙｖｅをｓｉＲＮＡを用いてノックダウンしたＭＥＦを用いた実験を行った（図３Ａ）。
【0223】
ＰＩＫｆｙｖｅをノックダウンすることで、ポリＩ：Ｃによる刺激及びＲＮＡウイルスであるＮＤＶの感染後のＩＲＦ３依存的として知られるＩＦＮβ及びＩＰ−１０の産生を抑制したが、ＩＲＦ３非依存的なＩＬ−６の産生には影響しなかった（図３Ｂ）。ポリＩ：Ｃによる刺激後のＩＦＮβのｍＲＮＡレベルも、ＰＩＫｆｙｖｅノックダウンによって低下した（図３Ｃ）。【0224】
さらに、ポリＩ：Ｃによる刺激後のＩＲＦ３のリン酸化及びリン酸化よって引き起こされる二量体形成も、ＰＩＫｆｙｖｅのノックダウンによって抑止された（図３Ｄ）。【0225】
これに対し、ウイルス感染に伴って活性化する、その他のシグナルカスケードの影響をＪＮＫのリン酸化及びＮＦ−κＢファミリーであるＲｅｌＡの核内移行により確認したが、ＰＩＫｆｙｖｅのノックダウンによっては妨げられなかった（図３Ｅ及び図３Ｆ）。また、ＧＭ−ＤＣ（樹状細胞）におけるＰＩＫｆｙｖｅのノックダウンは、ポリＩ：Ｃによる刺激及びＥＭＣＶ並びにＳｅＶ（Ｃｍ）による感染後に、ＩＦＮβ及びＩＰ−１０の産生も抑止した（図３Ｇ及び図３Ｈ）。そしてポリＩ：Ｃによる刺激後のＩＬ−６産生は、これらの細胞において抑制されなかった（図３Ｇ）。【0226】
これらの結果をまとめると、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、ＲＮＡウイルス感染時に引き起こされるＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードの活性化に特異的に必要であることをＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの代謝因子であるＰＩＫｆｙｖｅの抑制により明示している。さらに、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの添加は樹状細胞を活性化しサイトカインの産生を通じてアジュバント能を発揮する可能性を示唆している。【0227】
実験例４合成Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐによるサイトカインの産生とアジュバント効果
ＰＩＫｆｙｖｅは、イノシトール環の５’位のリン酸化によって、ＰｔｄＩｎｓからＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐを、ＰｔｄＩｎｓ（３）ＰからＰｔｄＩｎｓ（３，５）Ｐ２を生じる。
【0228】
ＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードへのＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐの関与の直接証拠を得るために、合成したＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐを外因的に投与することによって、ＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナル依存性のサイトカインの産生を誘導することができるか否かを調べた。【0229】
イノシトール環の５’位でリン酸化したホスファチジルイノシトールの中でも、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）ＰによってＧＭ−ＤＣの処理することにより、ＩＲＦ３依存性サイトカインであるＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳの産生を誘導することが明らかとなった（図４Ａ）。【0230】
ウイルス応答におけるサイトカインの産生には、ＴＢＫ１の上流に存在するアダプター因子であるＩＰＳ−１を介して、ＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードを活性化している。そこで、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐによるサイトカイン産生の作用点を明らかにするため、ＩＰＳ−１欠損マウス又はＩＲＦ３／ＩＲＦ７欠損マウスに由来するＧＭ−ＤＣにおけるサイトカインの産生を調べた。【0231】
その結果、野生型ＧＭ−ＤＣ及びＩＰＳ−１−／−に由来するＧＭ−ＤＣは、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ刺激の後に、ＩＰ−１０及びＲＡＮＴＥＳの産生に影響を与えなかった。一方で、ＩＲＦ３−／−／ＩＲＦ７−／−に由来するＧＭ−ＤＣは、ＩＰ−１０又はＲＡＮＴＥＳの産生を示さなかった（図４Ｂ）。【0232】
加えて、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）ＰによるＩＦＮβ産生もＩＲＦ３−／−／ＩＲＦ７−／−に由来するＧＭ−ＤＣにおいて抑止されたが、ＩＰＳ−１−／−由来のＧＭ−ＤＣにおいては変わらなかった（図４Ｃ）。【0233】
これらの結果から、ＰＩＫｆｙｖｅによって生成されたＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐは、ＩＰＳ−１の下流のシグナル分子であるＴＢＫ１−ＩＲＦ３を標的として活性化することが示された。Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）ＰがＧＭ−ＤＣのサイトカインの産生を誘導することから、ＭＰＬ ＡやポリＩ：Ｃと同様に生体においてはＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐがアジュバントとして働くことが強く期待された。
【0234】
そこでＣ５７／ＢＬ６マウスに、オボアルブミン（ＯＶＡ）とＰＢＳ、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、若しくはＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とで筋肉注射により免疫化するか、又は陽性対照であるアラムと併せたＯＶＡで腹腔内注射により免疫化し、血清中のＯＶＡ特異的総ＩｇＧを免疫化後に測定した。【0235】
ＯＶＡとＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐとで免疫化したマウスは、ＯＶＡとＰＢＳ又はＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２とで免疫化したマウスよりも高力価のＯＶＡ特異的ＩｇＧを産生した（図４Ｄ）。【0236】
次に、どのような作用機序でアジュバンド能を発揮しているかを検討するため、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）ＰによりＴ細胞活性化が誘導されるか否かを検討した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞レセプターを発現するトランスジェニックＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡタンパク質の存在下でＣ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐ、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２、又はポリＩ：Ｃで処理したＧＭ−ＤＣとともに共培養し、Ｔ細胞の活性化の指標としてＩＦＮγの産生量を測定した（図４Ｅ）。Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐによる処理ではＩＦＮγ産生を誘導したが、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２による処理では誘導しなかった。【0237】
したがって、これらの知見から、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、Ｔｈ２細胞応答を昂進させることにより、アジュバント能を発揮することが明らかとなった。【0238】
実施例４にて用いた各種リン脂質は炭素数８の脂肪酸を含むものであり、具体的な出所は、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３を除き、Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の以下カタログ番号のものである。【0239】
ＰＩ：Ｐ−０００８ａ、ＰＩ（３）Ｐ：Ｐ−３００８ａ、
ＰＩ（４）Ｐ：Ｐ−４００８、
ＰＩ（５）Ｐ：Ｐ−５００８ａ、
ＰＩ（３，４）Ｐ２：カタログ番号Ｐ−３４０８ａ、
ＰＩ（３，５）Ｐ２：カタログ番号Ｐ−３５０８、
ＰＩ（４，５）Ｐ２：カタログ番号Ｐ−４５０８ａ、
ＰＩ（３，４，５）Ｐ３は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄ社のカタログ番号が８５０１７６Ｐのものである。
【0240】
上記の実施例１〜４における実験結果を総合的にまとめると、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、ポリＩ：Ｃと同様に免疫活性化シグナルを作動させるものの、ポリＩ：Ｃが関与するＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナルカスケードのみを特異的に活性化していることから、ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐが、ポリＩ：Ｃなどが誘起してしまう副作用を軽減しつつも、十分なアジュバント能を発揮することを示している。【0241】
さらに、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐでの免疫後にＩｇＧ１のレベルの増大が見られたが、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、又はＩｇＥ等の他のサブクラスについては見られなかった。ＩｇＥが著量に産生されると、炎症を誘導する可能性が高く、また、免疫効果を発揮するのはＩｇＧ１等が主役となることから、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）が炎症等の副作用を引き起こさないアジュバント能を有することが明らかとなった。【0242】
その他、副作用の低減は、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐを、野生型ＧＭ−ＤＣに作用させても、炎症性サイトカインとして知られるＩＬ−１βの産生を引き起こさないことからもサポートされた（図５）。【0243】
以上のことより、Ｃ８−ＰｔｄＩｎｓ（５）Ｐは、十分なアジュバント能を有しながらも、特異的な作用機序により副作用のない、安全で有用なアジュバントとなりえることが示唆される。【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]