特許 6275256 ボロンジピロメテン蛍光プローブ、その製造方法及び応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6275256

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】ボロンジピロメテン蛍光プローブ、その製造方法及び応用

(51)【国際特許分類】

   C07F 5/02 20060101AFI20180129BHJP

   C09B 23/00 20060101ALI20180129BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20180129BHJP

【ＦＩ】

   C07F5/02 D

   C09B23/00 L

   G01N21/64 F

【請求項の数】9

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-535729(P2016-535729)

(86)(22)【出願日】2014年11月26日

(65)【公表番号】特表2017-504574(P2017-504574A)

(43)【公表日】2017年2月9日

(86)【国際出願番号】CN2014092299

(87)【国際公開番号】WO2015081803

(87)【国際公開日】20150611

【審査請求日】2016年6月2日

(31)【優先権主張番号】201310643027.8

(32)【優先日】2013年12月2日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】513324321

【氏名又は名称】大連理工大学

(74)【代理人】

【識別番号】100125184

【弁理士】

【氏名又は名称】二口 治

(74)【代理人】

【識別番号】100188488

【弁理士】

【氏名又は名称】原谷 英之

(72)【発明者】

【氏名】樊 江莉

(72)【発明者】

【氏名】朱 浩

(72)【発明者】

【氏名】彭 孝軍

(72)【発明者】

【氏名】王 静云

【審査官】 新留 素子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５２０８９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−００１５０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０００−０３９７１６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ

Ｃ０９Ｂ

Ｇ０１Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記一般式Ｉで表される構造を有するボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【化1】

［式Ｉ中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立にＨ、Ｃ_１〜８のアルキル基及び置換もしくは無置換のフェニル基からなる群より選ばれるものであり、前記置換フェニル基は、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ_１〜６のアルコキシ基、Ｃ_１〜６のアルキルアミノ基、Ｃ_１〜６のアミド基、ハロゲン及びＣ_１〜６のハロアルキル基からなる群より選ばれる１種または２種以上の基で任意の位置において置換されたフェニル基である。］

【請求項2】

前記Ｒ_１及びＲ_３は、それぞれ独立にＨおよびメチル基からなる群より選ばれるものである請求項１に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【請求項3】

前記Ｒ_１及びＲ_３は、いずれもメチル基である請求項２に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【請求項4】

前記Ｒ_２は、水素原子またはエチル基である請求項１〜３のいずれか一項に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【請求項5】

前記Ｒ_２は、水素原子である請求項４に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【請求項6】

下記一般式ＩＩで表される構造を有する化合物と塩化アクリルを１〜５：１のモル比で反応させて、次いで、塩基の存在下で三フッ化ホウ素と錯形成反応させてボロンジピロメテン蛍光プローブを得る工程を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブの製造方法。

【化2】

【請求項7】

前記一般式ＩＩで表される構造を有する化合物と塩化アクリルを３：１のモル比で反応させる請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

請求項１〜５のいずれか一項に記載のボロンジピロメテン蛍光プローブを用いて、次亜塩素酸イオンを検出する方法。

【請求項9】

前記ボロンジピロメテン蛍光プローブを用いて、生細胞における次亜塩素酸イオンを検出する請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ファインケミカル分野における蛍光プローブ、その製造方法及び用途に関し、特にボロンジピロメテン蛍光プローブ、その製造方法及び次亜塩素酸イオン検出への応用に関する。

【背景技術】

【0002】

蛍光プローブは、機能性染料として、科学技術の各分野において広く用いられ、特にライフサイエンス、臨床医療診断、免疫分析アッセイなどにおける研究が盛んに行われている。数多くの蛍光染料の中、ボロンジピロメテン（ＢＤＰ）蛍光染料は、大きなモル吸光係数、高い蛍光量子収率、安定なスペクトル性質、優れた光熱安定性、優れた化学安定性、小さい分子量および低い細胞毒性などの長所を持っているため、生体分子用蛍光プローブや蛍光イメージング試薬などとして広く用いられている。

【0003】

次亜塩素酸（ＨＣｌＯ）は、生体内における重要な活性酸素であり、生理学的に、主にミエロペルオキシダーゼによる触媒作用で塩素イオンと過酸化水素との反応により生成する。次亜塩素酸／次亜塩素酸イオンは、強い酸化力により、細胞環境において外来細菌を殺菌しそれらの侵入を阻止し、細胞のライフサイクルを制御する。人体内における次亜塩素酸の濃度は、加齢に伴って徐々に増加する。しかし、過剰の次亜塩素酸／次亜塩素酸イオンは骨関節炎や心血管疾患など一連の疾患を引き起こす恐れがあるため、次亜塩素酸を有効にモニタリングできる方法の開発が研究者達の注目を集めている。

【0004】

近年、研究者達は、水溶液または生体内における次亜塩素酸／次亜塩素酸イオンの検出に用いられるいくつかの蛍光プローブを開発した。これらのプローブは、主に次亜塩素酸の強い酸化力、例えば、ジベンゾイルヒドラジン酸化メカニズム、ヒドロキサム酸化メカニズム、脱オキシム反応メカニズム、ｐ-メトキシフェノール酸化メカニズム、硫黄原子酸化メカニズムなどに基づいて開発されたものである。しかし、これらのプローブは、通常、応答時間が長く、感度が低く、選択性に劣り、ｐＨの影響を受けやすいなどの欠点を持っている。ピロールは、ＢＤＰを合成する重要な原料である。我々は、ピロールが次亜塩素酸により選択的に酸化されるが、その他の活性酸素（例えば、Ｈ_２Ｏ_２、・ＯＨなど）に対して感度が低いことを見出した。また、ピロールは芳香族性を持ち、かつ窒素原子における非共有電子対が環状π結合共役系の形成に寄与するため、プロトンとの結合能が弱められ、ｐＨからの影響を受けにくい。さらに、ピロールは電子リッチであるため、いくつかの蛍光団に対して光誘起電子移動（ＰＥＴ）効果を有効に引き起こすことができる。その結果、バックグラウンド蛍光が低減し、プローブ感度が向上する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、上記した従来技術における次亜塩素酸イオン検出用蛍光プローブが持っている応答時間が長く、感度が低く、選択性に劣り、ｐＨの影響を受けやすいなどの欠点を解決すべく、２,４−ジメチルピロールを識別基とし、ボロンジピロメテン染料を蛍光団とするものであって、選択性（その他の活性酸素やｐＨの影響を受けにくい）および感度が向上し、応答時間が短く、かつ生物分野への応用が期待できるボロンジピロメテン蛍光プローブを提供する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の目的は、以下の手段により達成できる。
下記一般式Ｉで表される構造を有するボロンジピロメテン蛍光プローブ。

【化1】

［式Ｉ中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立にＨ、Ｃ_１〜８のアルキル基及び置換もしくは無置換のフェニル基からなる群より選ばれるものであり、前記置換フェニル基は、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ_１〜６のアルコキシ基、Ｃ_１〜６のアルキルアミノ基、Ｃ_１〜６のアミド基、ハロゲン及びＣ_１〜６のハロアルキル基からなる群より選ばれる１種または２種以上の基で任意の位置において置換されたフェニル基である。］

【0007】

本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブの製造方法は、下記一般式ＩＩで表される構造を有する化合物と塩化アクリルを１〜５：１のモル比で反応させて、次いで、塩基の存在下で三フッ化ホウ素と錯形成反応させて前記ボロンジピロメテン蛍光プローブを得る工程を含む。

【化2】

【0008】

本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブは、次亜塩素酸イオンの検出に応用できる。

【発明の効果】

【0009】

本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブは、以下の優れた特性を有する。
（１）水溶液において蛍光を殆ど発しないため、検出過程においてバックグラウンド蛍光による影響が低減する。
（２）感度が高く、ナノモル濃度の次亜塩素酸／次亜塩素酸イオンの存在下でも蛍光が顕著に強くなり、かつ蛍光強度が次亜塩素酸の濃度と良好な直線性関係を示す。
（３）選択性が良好であり、その他の活性酸素、例えば、Ｈ_２Ｏ_２、・ＯＨなどに対しては殆ど応答しない。
（４）応答が迅速であり、次亜塩素酸を加えると、数秒間以内に蛍光強度が平衡状態になる。
（５）ｐＨ４．０〜９．０の範囲において、次亜塩素酸に対する検出結果が正確であり、ｐＨの影響を受けにくい。
（６）合成が簡便で、製品を得やすい。

【図面の簡単な説明】

【0010】

本明細書には、７枚の図面が含まれる。

【図1】ＢＣｌＯ特性測定実験１において各濃度の次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光強度応答図である。プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、次亜塩素酸ナトリウムの濃度はそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７μＭであり、測定システムはＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）である。図１ａは次亜塩素酸ナトリウムに対するＢＣｌＯの蛍光滴定スペクトルであり、励起波長は４８０ｎｍである。図１ｂは次亜塩素酸ナトリウムに対するＢＣｌＯの滴定曲線であり、励起波長は４８０ｎｍである。

【図2】ＢＣｌＯ特性測定実験２において各濃度の次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの吸収滴定測定結果である。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、次亜塩素酸ナトリウムの濃度はそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７μＭである。

【図3】ＢＣｌＯ特性測定実験３において各種の活性酸素に対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光選択性を示す柱状グラフである。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、次亜塩素酸ナトリウムの濃度は５μＭであり、その他の活性酸素の濃度は１０μＭである。

【図4】ＢＣｌＯ特性測定実験４において低濃度の次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光強度応答図である。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、次亜塩素酸ナトリウムの濃度はそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎＭである。

【図5】ＢＣｌＯ特性測定実験５において次亜塩素酸ナトリウムに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの応答時間図である。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、加えた次亜塩素酸ナトリウムの濃度は５μＭである。横軸に時間（ｓ）、縦軸に蛍光強度を表示する。

【図6】ＢＣｌＯ特性測定実験６において各ｐＨ値条件下で次亜塩素酸イオンに対するプローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光強度応答図である。横軸にｐＨ、縦軸に蛍光強度を表示する。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭであり、加えた次亜塩素酸ナトリウムの濃度は５μＭである。ＮａＯＨ（１Ｍ）またはＨＣｌ（１Ｍ）を用いてｐＨを調整する。

【図7】ＢＣｌＯ特性測定実験７においてプローブ化合物ＢＣｌＯのヒト乳癌（ＭＣＦ−７）細胞での蛍光イメージングである。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭである。図７ａ、ｂ、ｃは、それぞれＢＣｌＯで染色された細胞に０、３、５μＭの次亜塩素酸ナトリウムを加えた後に収集した４９０ｎｍ〜５５０ｎｍ波長範囲の蛍光写真である。励起波長は４８８ｎｍである。二標本検定により統計的解析を行い、次亜塩素酸ナトリウムが０μＭである時の蛍光強度を基準とする。***Ｐ＜０．００１、エラーバーは標準誤差を表示する（ｎ＝１０）。

【図8】ＢＣｌＯ特性測定実験８においてプローブ化合物ＢＣｌＯのマウスマクロファージ（Ｒａｗ ２６４．７）細胞での蛍光イメージングである。蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度は１μＭである。図８ａはＢＣｌＯのみを加えて得た細胞染色蛍光写真である。図８ｂはＲａｗ ２６４．７細胞を１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（リポ多糖）と１２時間インキュベーションし、さらに１μｇ／ｍＬのＰＭＡ（ホルボールミリステート酢酸塩）と１時間インキュベーションした後、ＢＣｌＯを加えて得た細胞染色蛍光写真である。４９０ｎｍ〜５５０ｎｍ波長範囲の蛍光を収集する。励起波長は４８８ｎｍである。二標本検定により統計的解析を行い、ＢＣｌＯのみを加えた時の蛍光強度を基準とする。***Ｐ＜０．００１、エラーバーは標準誤差を表示する（ｎ＝４）。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明は、下記一般式Ｉで表される構造を有するボロンジピロメテン蛍光プローブを提供する。

【化3】

［式Ｉ中、Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、それぞれ独立にＨ、Ｃ_１〜８のアルキル基及び置換もしくは無置換のフェニル基からなる群より選ばれるものであり、前記置換フェニル基は、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＮＨ_２、ＮＯ_２、ＯＨ、ＳＨ、Ｃ_１〜６のアルコキシ基、Ｃ_１〜６のアルキルアミノ基、Ｃ_１〜６のアミド基、ハロゲン及びＣ_１〜６のハロアルキル基からなる群より選ばれる１種または２種以上の基で任意の位置において置換されたフェニル基である。］

【0012】

好ましい実施形態では、本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブを示す一般式Ｉ中、Ｒ_１およびＲ_３は、それぞれ独立にＨおよびメチル基からなる群より選ばれるものであり、メチル基であることがより好ましい。

【0013】

Ｒ_２は、水素またはエチル基であることが好ましく、水素であることがより好ましい。

【0014】

最も好ましい実施形態では、本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブは、下記の構造式を有するＢＣｌＯである。

【化4】

【0015】

さらに、本発明は、下記一般式ＩＩで表される構造を有する化合物と塩化アクリルを１〜５：１のモル比で反応させて、次いで、塩基の存在下で三フッ化ホウ素と錯形成反応させてボロンジピロメテン蛍光プローブを得る工程を含むボロンジピロメテン蛍光プローブの製造方法を提供する。

【化5】

【0016】

本発明に係る製造方法のより具体的な実施形態は、下記の通りである。

【化6】

（１）一般式ＩＩで表される構造を有する化合物と塩化アクリルから中間体化合物ＩＩＩを製造する。中間体化合物ＩＩと塩化アクリルとの仕込みモル比は０．１〜１０００：１であり、０．５〜１００：１であることが好ましく、０．５〜１０：１であることがより好ましく、１〜５：１であることがさらに好ましく、３：１であることが最も好ましい。両者は縮合反応が起こり、一般式IＩＩで表される構造を有する化合物が生成する。

【0017】

前記反応は、水含有の有機溶剤または無水の有機溶剤のいずれかの中に行ってもよいが、無水の有機溶剤中に行うことが好ましい。溶剤におけるピロール原料のモル濃度は、０．０１２〜０．４ｍｏｌ／Ｌである。有機溶剤としては、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなどが挙げられるが、これらに限定されない。反応過程において、ピロール原料と塩化アクリルは２回の縮合反応を経て、活性中間体ＩＩＩを生成する。生成物は不安定であるため、単離せずにそのまま次の反応に用いてもよい。反応過程において、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により反応終了点をモニタリングする。

【0018】

反応温度を１５℃〜１２０℃に制御する。高温の場合、ピロール分子は自己重合しやすくなり、褐色の粘稠物質を生成するため、主反応に影響を及ぼし、収率が著しく低下する場合がある。一方、反応温度が低すぎると、反応を十分に行うため長い時間を要する。従って、反応温度は３０℃〜１００℃であることが好ましく、３０℃〜８０℃であることがより好ましく、４０℃〜６０℃であることが最も好ましい。

【0019】

（２）前記ボロンジピロメテン蛍光プローブを合成する。有機塩基の存在下で、前記工程（１）で得られた中間体ＩＩＩを三フッ化ホウ素化合物と反応させ、脱フッ化水素することにより、生成物である式Ｉの化合物を生成する。使用できる三フッ化ホウ素化合物は、三フッ化ホウ素気体、三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体、または、常温溶液において三フッ化ホウ素を放出できるその他のいかなる化合物のいずれでもよい。

【0020】

前記反応温度は−１０℃〜１００℃であり、好ましくは０℃〜１０℃である。三フッ化ホウ素化合物（例えば、三フッ化ホウ素気体または三フッ化ホウ素錯体）を加える場合、反応を促進するため有機塩基を加える必要がある。前記有機塩基はトリエチルアミンであることが好ましい。

【0021】

本発明に係るボロンジピロメテン蛍光染料の精製方法は、特に限定されず、公知の方法で精製すればよい。通常、反応終了後、溶剤を留去する。好ましくは、溶出液として石油エーテル／酢酸エチルを用いたカラムクロマトグラフィーにより生成物を単離・精製する。

【0022】

得られた蛍光染料は、当該分野における公知の単離・精製手段により回収し、必要な純度に達せばよい。

【0023】

本発明で用いられる原料は、いずれも市販から入手可能であり、或いは、当該分野における公知の原料から、当業者にとって公知の方法または従来技術に開示される方法により簡便に製造できる。

【0024】

なお、本発明の化合物の環における各置換基は、前記工程を行う前または終了直後に、標準的な芳香族置換反応により導入するか、常法の官能基修飾により生成してもよく、これらの反応および修飾はいずれも本発明の方法に含まれる。前記反応および修飾としては、例えば、芳香族置換反応による置換基の導入、置換基の還元、置換基のアルキル化および置換基の酸化が挙げられる。これらの工程に用いられる試薬および反応条件は、化学分野において公知である。芳香族置換反応の具体例としては、濃硝酸によるニトロ基の導入、例えばハロゲン化アシルおよびルイス酸（例えば、三塩化アルミニウム）を用いてフリーデル・クラフツ（Ｆｒｉｅｄｅｌ Ｃｒａｆｔｓ）の条件下で行われるアシル基の導入、ハロゲン化アルキルおよびルイス酸（例えば、三塩化アルミニウム）を用いてフリーデル・クラフツの条件下で行われるアルキル基の導入、およびハロゲンの導入が挙げられる。修飾の具体例としては、例えば、ニッケル触媒を用いて水素添加反応を触媒することにより、または、鉄を用いて塩酸の存在下で加熱処理を行うことにより、ニトロ基をアミノ基に還元することによる修飾；および、アルキルチオ基をアルキルスルフィニル基またはアルキルスルホニル基に酸化することによる修飾が挙げられる。

【0025】

特に明記しない限り、本明細書に使用される用語は、下記の意味を有する。
本明細書に使用される用語「アルキル基」には、直鎖状アルキル基および分岐状アルキル基が含まれるが、単一のアルキル基、例えば「プロピル基」を言及する場合、直鎖状アルキル基のみを意味し、単一の分岐状アルキル基、例えば「イソプロピル基」を言及する場合、分岐状アルキル基のみを意味する。例えば、「Ｃ_１〜４のアルキル基」には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基およびｔ-ブチル基などが含まれる。このような規則は、本明細書に使用されるその他の官能基にも適用する。

【0026】

本発明に係るボロンジピロメテン蛍光プローブは、次亜塩素酸イオンの検出に応用でき、特に生細胞における次亜塩素酸イオンの検出に応用できる。

【実施例】

【0027】

下記の非限定的な実施例は、当業者に本発明をより全面的に理解させるためのものであって、本発明を限定するものではない。

【0028】

実施例１
蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの合成

【化7】

２,４−ジメチルピロール（２．８ｇ、３０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２５０ｍＬが入れられた５００ｍＬの一口フラスコに加え、さらに塩化アクリル（０．９ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加え、遮光、窒素ガス雰囲気下で、５０℃で一晩攪拌した。氷浴下で、トリエチルアミン１０ｍＬと三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体１０ｍＬを滴下し、さらに１時間撹拌した。溶剤を減圧留去し、カラムクロマトグラフィーによる単離を行い、オレンジ色の固体ＢＣｌＯ（９．６ ％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲ(４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ_３),δ：１．９６(ｓ,３Ｈ),２．１７(ｓ,３Ｈ),２．３５(ｓ,６Ｈ),２．５３(ｓ,６Ｈ),２．８４(ｔ,Ｊ＝８Ｈｚ,２Ｈ),３．１７(ｔ,Ｊ＝８Ｈｚ,２Ｈ),５．６２(ｓ,１Ｈ),６．０４(ｓ,２Ｈ),７．４３(ｓ,１Ｈ);^１３Ｃ ＮＭＲ(１００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ_３),δ:１１．１,１３．０,１４．６,１６．２,２７．４,２９．９,１０７．８,１１４．５, １２１．９,１２４．０,１２６．３,１３１．５,１４１．２,１４５．５,１５４．１ｐｐｍ;ＴＯＦ ＭＳ:ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ_２１Ｈ_２７ＢＦ_２Ｎ_３⁺ ［Ｍ+Ｈ］⁺:３７０．２２１６,ｆｏｕｎｄ:３７０．２２５５．

【0029】

ＢＣｌＯ特性測定実験１
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光滴定実験
１μＭのプローブ化合物ＢＣｌＯをＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）に加え、次亜塩素酸イオンの濃度がそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７μＭになるように、徐々に次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、応答する蛍光強度を記録した。励起波長を４８０ｎｍとした。測定結果は、図１ａおよび図１ｂに示す。図からわかるように、プローブ化合物の最大発光ピーク５０５ｎｍにおける蛍光強度は、次亜塩素酸ナトリウム濃度の増加に伴って徐々に増加し、次亜塩素酸ナトリウムの濃度が５μＭである時に飽和する。

【0030】

ＢＣｌＯ特性測定実験２
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの吸収滴定実験
１μＭのプローブ化合物ＢＣｌＯをＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）に加え、次亜塩素酸イオンの濃度がそれぞれ０、１、２、３、４、５、６、７μＭになるように、徐々に次亜塩素酸ナトリウム溶液を加え、吸収強度を記録した。測定結果は図２に示す。図からわかるように、プローブ化合物の吸収スペクトルは、次亜塩素酸ナトリウム濃度の増加に伴っても殆ど変化しない。

【0031】

ＢＣｌＯ特性測定実験３
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの選択性実験
上記合成された化合物ＢＣｌＯを用いて、次亜塩素酸イオンおよび活性酸素に対する選択性を評価した。１μＭの化合物ＢＣｌＯを、５μＭの次亜塩素酸イオンまたは１０μＭのその他の活性酸素（Ｈ_２Ｏ_２、Ｏ_２⁻、ＴＢＨＰ、ＨＯ・、ＴＢＯ・、^１Ｏ_２、ＮＯ・）を含有するＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）に加え、励起波長を４８０ｎｍとし、発光波長を５０５ｎｍとし、それぞれの蛍光強度を記録した。測定結果は図３に示す。図からわかるように、蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯは、次亜塩素酸ナトリウムに対する選択性が非常に高く、５μＭの次亜塩素酸ナトリウムでは蛍光強度が顕著に増加する（１００倍）が、その他の活性酸素が添加されても蛍光強度が殆ど変化しない。

【0032】

ＢＣｌＯ特性測定実験４
次亜塩素酸イオンに対する蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯの検出感度
上記合成された化合物ＢＣｌＯを用いて、ナノモルレベル濃度の次亜塩素酸イオンに対する応答を評価した。化合物ＢＣｌＯ（１μＭ）を、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎＭ各濃度の次亜塩素酸ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）に加え、４８０ｎｍで励起し、蛍光スペクトルおよび５０５ｎｍにおける蛍光強度を記録した。測定結果は図４に示す。図からわかるように、蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯは、次亜塩素酸イオンの濃度が０〜１０ｎＭの範囲において蛍光強度が顕著に増加し、且つ蛍光強度が次亜塩素酸ナトリウムの濃度と良好な直線性関係を示す（Ｒ^２＝０．９９７２４）。従って、蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯは、低濃度の次亜塩素酸ナトリウムの検出にも応用できる。３σ／ｋにより算出した検出限界が０．５６ｎＭであった。

【0033】

ＢＣｌＯ特性測定実験５
次亜塩素酸イオンに対するプローブ化合物ＢＣｌＯの応答時間測定
図５は、次亜塩素酸イオンに対するプローブ化合物ＢＣｌＯの時間関数を示す図である。プローブ化合物ＢＣｌＯの濃度を１μＭとし、測定システムをＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む。ｐＨ＝７．４）とし、励起波長を４８０ｎｍとし、ＢＣｌＯの５０５ｎｍにおける経時的蛍光強度を記録した。図５からわかるように、ＢＣｌＯは次亜塩素酸イオンに対する応答が非常に迅速であり、１秒以内に平衡に達する。横軸に時間（秒）、縦軸に蛍光強度を表示する。

【0034】

ＢＣｌＯ特性測定実験６
プローブ化合物ＢＣｌＯによる次亜塩素酸イオンの検出に対するｐＨの影響に関する研究
上記合成された化合物ＢＣｌＯを用いて、ｐＨに対する応答を評価した。化合物ＢＣｌＯ（１μＭ）を含有するＰＢＳ緩衝液（染料の助溶剤として１０％容量比のアルコールを含む）を約ｐＨ４．０に調整し、励起波長を４８０ｎｍとし、プローブの蛍光強度および５μＭの次亜塩素酸ナトリウムを加えた後の蛍光強度を測定した。その後、塩基溶液を加え、約ｐＨ９．０へ徐々に増加し、それぞれの蛍光強度変化を記録した。測定結果は図６に示す。図からわかるように、ｐＨ４．０〜９．０の範囲において、ｐＨの変化が蛍光プローブ化合物ＢＣｌＯ自身の蛍光発光および次亜塩素酸ナトリウムを加えた後の蛍光発光にはほぼ影響を与えない。従って、プローブ化合物ＢＣｌＯはこのｐＨ範囲において次亜塩素酸イオンの検出に用いられる。横軸にｐＨ、縦軸に蛍光強度を表示する。実験では、ＮａＯＨ（１Ｍ）またはＨＣｌ（１Ｍ）を用いてｐＨを調整した。

【0035】

ＢＣｌＯ特性測定実験７
プローブ化合物ＢＣｌＯによる、ＭＣＦ−７細胞における各濃度の次亜塩素酸イオンの検出に関する研究
ＭＣＦ−７細胞を１０％のＦＣＳ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＥＭＥ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。共焦点蛍光イメージング実験を行う前日、細胞を専用の細胞共焦点培養皿に播種した。翌日、その中に１μＭのプローブ化合物ＢＣｌＯを加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０分間インキュベーションした後、リン酸緩衝液で３回洗浄し、共焦点イメージングを行った。同様の条件で、さらに３μＭまたは５μＭの次亜塩素酸ナトリウムを加え、直ちに共焦点イメージングを行った。

【0036】

細胞の培養密度を２×１０^５個細胞／ｍＬとした。イメージング機器として、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００−ＩＸ８１倒立顕微鏡、油浸レンズ１００倍を用いた。４８８ｎｍで蛍光を励起し、４９０〜５５０ｎｍ波長範囲の蛍光を収集した。

【0037】

図７ａ〜ｃは、それぞれＢＣｌＯに次亜塩素酸ナトリウムを加えた前後の生細胞の染色写真である。細胞におけるＢＣｌＯの蛍光強度変化を定量化するため、各図から１０箇所の領域を選び、これらの相対蛍光強度の平均値を算出した。結果は図７ｄに示す。図からわかるように、次亜塩素酸ナトリウムを加える前に、プローブ化合物ＢＣｌＯは細胞において微弱な緑色蛍光を発光した。これは、ＭＣＦ−７細胞には活性酸素が多少含まれるからである。一方、次亜塩素酸ナトリウムを加えた後、プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光強度が迅速で顕著に増加した。これは、プローブ化合物ＢＣｌＯが生細胞における次亜塩素酸の検出へ適用可能であることを示す。

【0038】

ＢＣｌＯ特性測定実験８
プローブ化合物ＢＣｌＯによる、Ｒａｗ２６４．７細胞における内因性次亜塩素酸の検出に関する研究
Ｒａｗ２６４．７細胞を１０％のＦＣＳ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＤＥＭＥ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。共焦点蛍光イメージング実験を行う前日、細胞を専用の細胞共焦点培養皿に播種した。翌日、その中に１μＭのプローブ化合物ＢＣｌＯを加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０分間インキュベーションした後、リン酸緩衝液で３回洗浄し、共焦点イメージングを行った。同様の条件で、Ｒａｗ２６４．７細胞を１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（リポ多糖）と１２時間インキュベーションし、さらに１μｇ／ｍＬのＰＭＡ（ホルボールミリステート酢酸塩）と１時間インキュベーションした後、１μＭのプローブ化合物ＢＣｌＯを加え、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２０分間インキュベーションした。その後、リン酸緩衝液で３回洗浄し、共焦点イメージングを行った。

【0039】

細胞の培養密度を２×１０^５個細胞／ｍＬとした。イメージング機器として、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００−ＩＸ８１倒立顕微鏡、油浸レンズ１００倍を用いた。４８８ｎｍで蛍光を励起し、４９０〜５５０ｎｍ波長範囲の蛍光を収集した。

【0040】

図８ａ〜ｂは、それぞれＬＰＳおよびＰＭＡによりＲａｗ２６４．７細胞に刺激を与える前後のＢＣｌＯの染色写真である。細胞におけるＢＣｌＯの蛍光強度変化を定量化するため、各図から４箇所の領域を選び、これらの相対蛍光強度の平均値を算出した。結果は図７ｃに示す。図からわかるように、次亜プローブ化合物ＢＣｌＯは、マクロファージ細胞において微弱な緑色蛍光を発光した。これは、Ｒａｗ２６４．７細胞における活性酸素の含有量が低いからである。一方、細胞にＬＰＳおよびＰＭＡによる刺激を与えた後、プローブ化合物ＢＣｌＯの蛍光強度が顕著に増加した。これは、プローブ化合物ＢＣｌＯが生細胞における内因性次亜塩素酸の検出へ適用可能であることを示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】