特許 6276227 Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖の結合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6276227

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖の結合体

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/085 20060101AFI20180129BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20180129BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20180129BHJP

   C07K 14/195 20060101ALN20180129BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/085

   A61K39/00 H

   A61P31/04

   !C07K14/195ZNA

【請求項の数】17

【外国語出願】

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2015-176253(P2015-176253)

(22)【出願日】2015年9月8日

(62)【分割の表示】特願2012-531514(P2012-531514)の分割

【原出願日】2010年9月30日

(65)【公開番号】特開2015-221836(P2015-221836A)

(43)【公開日】2015年12月10日

【審査請求日】2015年9月8日

(31)【優先権主張番号】61/247,518

(32)【優先日】2009年9月30日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】フランセスコ ベルティ

(72)【発明者】

【氏名】パオロ コスタンティーノ

(72)【発明者】

【氏名】マリア ロザリア ロマーノ

【審査官】 六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５１９８１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５２４６２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０８４４１１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００９−５３１３８８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を調製するためのプロセスであって、（ａ）該莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して多糖断片を得る工程と、（ｂ）該断片における少なくとも１個の糖残基にアルデヒド基を導入するために、該断片を酸化して、酸化された糖残基を得る工程と、（ｃ）該酸化された糖残基を、該アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングし、該結合体を得る工程とを含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該工程（ａ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項2】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を処理するためのプロセスであって、該莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項3】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を処理するためのプロセスであって、該莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項4】

前記酸加水分解が、酢酸を用いるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項5】

前記断片の平均分子量が、５ｋＤａ〜１００ｋＤａである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項6】

前記断片のＯ−アセチル化の程度が、８０％〜１００％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロセス。

【請求項7】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスであって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合し、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖断片を酸化して、該β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項8】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスであって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合し、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖断片を酸化して、該α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項9】

工程（ｂ）が請求項７または請求項８に記載の工程である、請求項１および４〜６のいずれかに記載のプロセス。

【請求項10】

カップリングさせられたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖断片を得る工程と、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖断片を酸化して、２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程と、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖断片をキャリア分子にカップリングする工程であって、該カップリングは該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項11】

カップリングさせられたＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖断片を得る工程と、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖断片を酸化して、２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程と、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖断片をキャリア分子にカップリングする工程であって、該カップリングは該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである工程を含み、該断片のＯ−アセチル化の程度が、６０％〜１００％であり、該断片の平均分子量は、１ｋＤａ〜５００ｋＤａである、プロセス。

【請求項12】

請求項９に記載のプロセスであって、該プロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を調製するためのものであり、該プロセスは、（ａ）該莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程と、（ｂ）該β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために、該断片を酸化する工程と、（ｃ）該酸化された断片を、該アルデヒド基のうちの１個を介してキャリア分子とカップリングし、該結合体を得る工程とを含む、プロセス。

【請求項13】

請求項９に記載のプロセスであって、該プロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を調製するためのものであり、該プロセスは、（ａ）該莢膜多糖を酸加水分解によって解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程と、（ｂ）該α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために、該断片を酸化する工程と、（ｃ）該酸化された断片を、該アルデヒド基のうちの１個を介してキャリア分子とカップリングし、該結合体を得る工程とを含む、プロセス。

【請求項14】

前記カップリングが、前記アルデヒド基を前記キャリアにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによる、直接的なカップリングである、請求項１および４〜６および９〜１３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項15】

前記カップリングが、前記アルデヒド基をリンカーにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによる、該リンカーを介したカップリングである、請求項１および４〜６および９〜１３のいずれかに記載のプロセス。

【請求項16】

前記リンカーが前記キャリア分子に連結させられている、請求項１５に記載のプロセス。

【請求項17】

前記カップリングが、１：５から１：２の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）をもたらす、請求項１および４〜６および９〜１６のいずれかに記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２００９年９月３０日に出願された米国仮出願番号６１／２４７，５１８の利益を主張し、上記米国仮出願番号６１／２４７，５１８は、その全容が参考として本明細書に援用される。

【0002】

技術分野
本発明は、糖結合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成するために細菌莢膜糖、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖をキャリアへ結合体化する分野内にある。糖結合体は免疫化に有用である。

【背景技術】

【0003】

背景技術
細菌の莢膜糖は、長年、莢膜を有する細菌に対するワクチンに用いられてきた。しかし、糖はＴ細胞非依存性抗原であるため免疫原性が低い。キャリアへの結合体化は、Ｔ細胞非依存性抗原をＴ細胞依存性抗原へと変換し、これにより記憶応答を増強し、防御免疫を発達させることができる。したがって、最も効果的な糖ワクチンは糖結合体に基づき、プロトタイプの結合体ワクチンはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（「Ｈｉｂ」）に対するものであった［例えば、非特許文献１（参考文献９７）の第１４章を参照］。

【0004】

結合体ワクチンについて記載されている別の細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）である。糖結合体に用いるためにＳ．ａｕｒｅｕｓから様々な多糖が単離されてきた。特に興味深い２種の多糖は、５型および８型莢膜多糖である。ヒトＳ．ａｕｒｅｕｓ株のおよそ６０％は８型であり、およそ３０％は５型である。５型および８型結合体に関する研究の多くは、Ｆａｔｔｏｍらによってなされており、非特許文献２〜１０（参考文献１〜９）等の文書に記載されている。５型および８型多糖結合体化のためのＦａｔｔｏｍプロセスは通常、シスタミンを用いた精製多糖のチオレーションに関与する。この反応は、莢膜多糖におけるカルボキシレート基の存在に依存する。この基は、カルボジイミド、例えばＥＤＡＣの存在下でシスタミンと反応する。次に、誘導体化した多糖は、通常はリンカーを介して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエンドトキシンＡ（ＥＴＡ）等、キャリアタンパク質と結合体化する［非特許文献３（２）］。他の研究者らは、還元的アミノ化［１０および１１］、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｄｅｈｙｄｅ）カップリング［１０］または多糖におけるヒドロキシル基とＣＤＡＰ［１２］もしくは三塩化シアヌル［１３］のようなシアニル化剤との反応によって、精製された５型および８型莢膜多糖の結合体化を行った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編．Ｖａｃｃｉｎｅｓ （２００４）

【非特許文献2】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． （１９９０） ５８（７）：２３６７−７４．

【非特許文献3】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． （１９９２） ６０（２）：５８４−９．

【非特許文献4】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． （１９９３） ６１（３）：１０２３−３２．

【非特許文献5】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． （１９９６） ６４（５）：１６５９−６５．

【非特許文献6】Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ． （１９９６） ７（２）：２４７−５３．

【非特許文献7】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． （１９９８） ６６（１０）：４５８８−９２．

【非特許文献8】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ （１９９３） １７（２）：１２６−３３．

【非特許文献9】Ｆａｔｔｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． （２００２） ３４６（７）：４９１−６．

【非特許文献10】Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． （２００５） ７５４：６８−８２．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

Ｆａｔｔｏｍプロセスによって調製された結合体ワクチンはヒトにおける安全性および免疫原性を示してきたが［５］、依然としてＳ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖の結合体を調製するさらに別の、より良い方法に対する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明の開示
本発明は、先行技術において開示されている結合体化法に代わって用いることのできる結合体化法に基づく。これら先行技術の方法とは異なり、本発明の方法は、多糖におけるヒドロキシル基またはカルボキシレート基を介した結合体化を伴わない。したがって本方法は、先行技術よりも、より天然の多糖に観察される形態に近い形態にこれらの基を残す。本方法は、これらの基を用いるのではなく、結合体化に用いるための多糖における反応性アルデヒド基の生成に関与する。その結果生じた結合体は、先行技術の結合体と比べて異なる、好ましくは改善された免疫学的特性を有することができる。

【0008】

したがって、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖をキャリアタンパク質に結合体化するための代替的または改善された方法およびそれにより得られた結合体を提供する。本発明は、本発明の方法に有用な中間体および該中間体を調製するための方法も提供する。本発明は以下をも提供する。
（項目１） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を調製するためのプロセスであって、（ａ）該莢膜多糖を解重合して多糖断片を得る工程と、（ｂ）該断片における少なくとも１個の糖残基にアルデヒド基を導入するために、該断片を酸化して、酸化された糖残基を得る工程と、（ｃ）該酸化された糖残基を、該アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングし、該結合体を得る工程とを含む、プロセス。
（項目２） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を処理するためのプロセスであって、該莢膜多糖を解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含む、プロセス。
（項目３） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を処理するためのプロセスであって、該莢膜多糖を解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含む、プロセス。
（項目４） 前記解重合が、酢酸を用いた酸加水分解によって行われる、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目５） 前記断片の平均分子量が、５ｋＤａ〜１００ｋＤａである、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目６） 前記断片のＯ−アセチル化の程度が、１０％〜９０％である、前述の項目のいずれかに記載のプロセス。
（項目７） 工程（ａ）が項目２または項目３に記載の工程である、項目１および４〜６のいずれかに記載のプロセス。
（項目８） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスであって、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を酸化して、該β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含む、プロセス。
（項目９） Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスであって、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を酸化して、該α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含む、プロセス。
（項目１０） 工程（ｂ）が項目８または項目９に記載の工程である、項目７に記載のプロセス。
（項目１１） カップリングさせられたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖をキャリア分子にカップリングする工程であって、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖は２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために酸化されており、該カップリングは該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである、工程を含む、プロセス。
（項目１２） カップリングさせられたＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢
膜多糖をキャリア分子にカップリングする工程であって、該Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖は２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために酸化されており、該カップリングは該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである、工程を含む、プロセス。
（項目１３） 項目１０に記載のプロセスであって、（ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を解重合して、非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程と、（ｂ）該β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために、該断片を酸化する工程と、（ｃ）該酸化された断片を、該アルデヒド基のうちの１個を介してキャリア分子とカップリングし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を得る工程とを含む、該結合体を調製するためのプロセス。
（項目１４） 項目１０に記載のプロセスであって、（ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を解重合して、非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程と、（ｂ）該α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換するために、該断片を酸化する工程と、（ｃ）該酸化された断片を、該アルデヒド基のうちの１個を介してキャリア分子とカップリングし、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を得る工程とを含む、該結合体を調製するためのプロセス。
（項目１５） 前記カップリングが、前記アルデヒド基を前記キャリアにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによる、直接的なカップリングである、項目１および４〜７および１０〜１４のいずれかに記載のプロセス。
（項目１６） 前記カップリングが、前記アルデヒド基をリンカーにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによる、該リンカーを介したカップリングである、項目１および４〜７および１０〜１４のいずれかに記載のプロセス。
（項目１７） 前記リンカーが前記キャリア分子に連結させられている、項目１６に記載のプロセス。
（項目１８） 前記カップリングが、１：５から１：２の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）をもたらす、項目１および４〜７および１０〜１７のいずれかに記載のプロセス。
（項目１９） 前述の項目のいずれかに記載のプロセスによって得られたか、または得ることが可能である、結合体、断片、誘導体またはカップリングさせられた多糖。
（項目２０） 項目１９に記載の結合体またはカップリングさせられた多糖を含む、免疫原性組成物。
（項目２１） ｃｌｆＡ抗原、ｃｌｆＢ抗原、ｓｄｒＥ２抗原、ｓｄｒＣ抗原、ｓａｓＦ抗原、ｅｍｐ抗原、ｓｄｒＤ抗原、ｓｐａ抗原、ｅｓａＣ抗原、ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原、ｉｓｄＣ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ０１１抗原、ｉｓｄＡ抗原、ｉｓｄＢ抗原およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される１または複数のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原をさらに含む、項目２０に記載の組成物。
（項目２２） 前記１または複数のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原が、ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原からなる群より選択される、項目２１に記載の組成物。
（項目２３） 以下の組合せ（１）〜（１０）：
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原、
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原、
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原、
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原、
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原、
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原、
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原、
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原、
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原、ならびに
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原
のうちの１つに記載のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原を含むものである、項目２２に記載の組成物。

【0009】

第一の態様では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖とキャリア分子との結合体を調製するためのプロセスであって、（ａ）該莢膜多糖を解重合して多糖断片を得る工程と、（ｂ）該断片における少なくとも１個の糖残基にアルデヒド基を導入するため、該断片を酸化して酸化された糖残基を得る工程と、（ｃ）該酸化された糖残基を、該アルデヒド基を介してキャリア分子とカップリングし、これにより結合体を得る工程とを含むプロセスを提供する。工程（ｃ）におけるカップリングは、直接的であってもリンカー分子を介してもよい。本発明は、このプロセスによって得られたかまたは得ることが可能である結合体も提供する。

【0010】

莢膜多糖
本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖に基づく。５型および８型莢膜多糖の構造は、次の通りに参考文献１４および１５に記載された。

【0011】

【化1】

最近のＮＭＲ分光データ［１６］は、これらの構造を次の通りに改訂した。

【0012】

【化2】

多糖は、天然で見られる莢膜多糖に比べて化学修飾されたものであり得る。

【0013】

例えば、多糖は、脱Ｏ−アセチル化（部分的または完全に）、脱Ｎ−アセチル化（部分的または完全に）、Ｎ−プロピオン酸化（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅｄ）（部分的または完全に）等がなされていてよい。脱アセチル化は、結合体化の前、最中または後に起こり得るが、通常は結合体化前に起こる。特定の多糖に依存して、脱アセチル化は免疫原性に影響するか、あるいは影響しない可能性があり、例えば、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭワクチンは脱Ｏ−アセチル化多糖を用い、一方、Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭはアセチル化されているが、どちらのワクチンも効果的である。脱アセチル化等の効果等は、日常的なアッセイによって評価することができる。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖におけるＯ−アセチル化の関連性は、参考文献６において考察されている。この文書において、天然の多糖は、７５％のＯ−アセチル化を有すると記されている。これらの多糖は、多糖骨格およびＯ−アセチル基の両方に対する抗体を誘導した。０％のＯ−アセチル化を有する多糖もまた、多糖骨格に対する抗体を誘発した。どちらの種類の抗体も、そのＯ−アセチル含量が様々であるＳ．ａｕｒｅｕｓ株に対してオプソニン作用があった。よって、本発明に用いられる５型または８型莢膜多糖は、０〜１００％の間のＯ−アセチル化を有することができる。例えば、５型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であり得る。あるいは、０％Ｏ−アセチル化５型莢膜多糖が用いられてもよい。同様に、８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であり得る。あるいは、０％Ｏ−アセチル化８型莢膜多糖が用いられてもよい。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％、６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％であり得る。他の実施形態では、０％Ｏ−アセチル化５型および８型莢膜多糖が用いられる。本発明に用いられる５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であり得る。通常、５型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は１００％である。同様に、本発明に用いられる８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であり得る。通常、８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は１００％である。一実施形態では、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は、０〜１００％、５０〜１００％、７５〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％または９５〜１００％であり得る。通常、５型および８型莢膜多糖のＮ−アセチル化の程度は１００％である。

【0014】

多糖のＯ−アセチル化の程度は、本技術分野において公知のいずれかの方法によって、例えばプロトンＮＭＲ（例えば、参考文献１７、１８、１９または２０に記載）によって決定することができる。さらに別の方法は、参考文献２１に記載されている。多糖のＮ−アセチル化の程度の決定に同様の方法を用いることができる。Ｏ−アセチル基は、加水分解によって、例えば、無水ヒドラジン［２２］またはＮａＯＨ［６］等、塩基による処理によって除去することができる。Ｎ−アセチル基の除去に同様の方法を用いることができる。５型および／または８型莢膜多糖における高レベルのＯ−アセチル化を維持するために、Ｏ−アセチル基の加水分解をもたらす処理、例えば、極端なｐＨにおける処理は最小限に抑えられる。

【0015】

莢膜多糖は、本明細書における参考文献に記載されている公知の技法により精製することができる。通常のプロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のフェノール−エタノール不活性化、遠心分離、リソスタフィン処理、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ処理、遠心分離、透析、プロテアーゼ処理、さらなる透析、濾過、エタノール／ＣａＣｌ_２による沈殿、透析、凍結乾燥、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を伴う［１］。代替的なプロセスは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞のオートクレーブ、多糖含有上清の限外濾過、濃縮、凍結乾燥、テイコ酸を除去するためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる処理、さらなる限外濾過、ダイアフィルトレーション、高速サイズ排除液体クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を伴う［２３］。好ましくは、参考文献２４に記載されている精製プロセスが用いられる。

【0016】

しかし、本発明は、天然の供給源から精製された多糖に限定されず、多糖は、全合成または部分合成等、他の方法から得ることもできる。

【0017】

キャリア分子
本発明は、通常はタンパク質であるキャリア分子の使用に関与する。一般に、糖のキャリアへの共有結合による結合体化は、糖をＴ細胞非依存性抗原からＴ細胞依存性抗原へと変換し、これにより免疫記憶をプライミングするため、糖の免疫原性を増強する。結合体化は、小児用ワクチンに特に有用であり［例えば、参考文献２５］、周知の技法である［例えば、参考文献２６〜３４に概説されている］。

【0018】

好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素等の細菌毒素またはそれらのトキソイドもしくは変異体である。本発明者らは、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［３５］が適切であることを見出した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＴＡ）およびその無毒性変異体組換えエキソプロテイン（ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ（ｒＥＰＡ）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖のキャリアタンパク質として用いられてきた（［１］および［２］）。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ α−ヘモリシン（α−毒素）（［１０］および［３６］）、卵白アルブミン［１３］およびヒト血清アルブミン［１１］も用いられてきた。これらのキャリアは、本発明において用いることができる。

【0019】

他の適切なキャリアタンパク質として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［３７］、合成ペプチド［３８、３９］、熱ショックタンパク質［４０、４１］、百日咳タンパク質［４２、４３］、サイトカイン［４４］、リンホカイン［４４］、ホルモン［４４］、増殖因子［４４］、ヒト血清アルブミン（通常は組換え）、様々な病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４５］、例えば、Ｎ１９［４６］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのタンパク質Ｄ［４７〜４９］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［５０］、ニューモリシン［５１］もしくはその無毒性誘導体［５２］、鉄取り込みタンパク質［５３］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの毒素ＡもしくはＢ［５４］、ＧＢＳタンパク質［５５］またはＧＡＳタンパク質［５６］等が挙げられる。

【0020】

他の適切なキャリアタンパク質として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原、例えば下に述べるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原が挙げられる。

【0021】

例えばキャリア抑制のリスクを低下させるため、２以上のキャリアタンパク質を用いることができる。このように、５型および８型莢膜多糖に対し異なるキャリアタンパク質を用いることができ、例えば５型多糖はＣＲＭ１９７と結合体化することができ、一方８型多糖はｒＥＰＡと結合体化することができる。特定の多糖抗原に対し２以上のキャリアタンパク質を用いることもでき、例えば、５型多糖の２個の基において、一方の基はＣＲＭ１９７と結合体化し、もう一方の基はｒＥＰＡと結合体化することができる。しかし通常、多糖全体に対し同一のキャリアタンパク質が用いられる。

【0022】

単一のキャリアタンパク質が２以上の多糖抗原を保有することができる［５７、５８］。例えば、単一のキャリアタンパク質が、５型および８型莢膜多糖と結合体化されていてよい。この目標を達成するため、結合体化プロセスに先立ち、異なる多糖を混合することができる。しかし通常、多糖毎に別個の結合体が存在し、結合体化後に異なる多糖が混合される。別個の結合体は同一キャリアに基づいてよい。

【0023】

解重合
本発明のプロセスの工程（ａ）において、莢膜多糖が解重合されて多糖断片が得られる。結合体化に先立つ超音波処理による８型莢膜多糖の解重合が報告されている［３］。この著者らは、低分子量の８型は免疫原性を持たないと結論付けている。したがってこの著者らは高分子量の多糖を好んだが、驚くべきことに、本発明は、天然の莢膜多糖よりも分子量の低い多糖断片を活用する。

【0024】

様々な方法により全長多糖が解重合されて、本発明に用いるためのより短い断片を得ることができる。本発明者らは、５型莢膜多糖におけるα−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）残基とβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ残基との間の（１→３）グリコシド結合の切断をもたらす方法が特に適切であることを見出した。この方法が５型莢膜多糖に適用されると、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を生じる。この部分は、２個の隣接するヒドロキシル基を包含する。同様に、この方法が８型莢膜多糖に適用されると、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を生じると考えられ、この部分もまた、２個の隣接するヒドロキシル基を包含する。５型または８型多糖断片における隣接するヒドロキシル基は、続く後述の断片とキャリア分子との結合体化のためのハンドル（ｈａｎｄｌｅ）を提供する。

【0025】

よって、さらに別の一態様では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を処理するための、該莢膜多糖を解重合して、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含むプロセスを提供する。関連する一態様では、本発明は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を処理するための、該莢膜多糖を解重合して、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する多糖断片を得る工程を含むプロセスを提供する。莢膜多糖は、上述の「莢膜多糖」に記載されているＳ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖であり得る。本発明は、これらプロセスのいずれかによって得られたか、または得ることが可能である多糖断片も提供する。

【0026】

本発明者らは、解重合が酸加水分解によって行われ得ることを見出した。酸加水分解には、多糖中の他の基における副反応を回避するため、弱酸、例えば酢酸を用いることが好ましい。当業者であれば、加水分解に適切な酸および条件（例えば、濃度、温度および／または時間の条件）を同定することができるであろう。例えば、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌの多糖を２％酢酸（ｖ／ｖ）で９０℃、３時間処理するのが適切であることを見出した。本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌを５％酢酸で９０℃、３０分間、５時間または６時間処理するのが適切であることも見出した。他の酸、例えば、トリフルオロ酢酸または他の有機酸による処理も適切となり得る。特に、本発明者らは、特に８型莢膜多糖には、塩酸を用いることによって解重合効率が増加し得ることを見出した。例えば、本発明者らは、多糖を２Ｍ塩酸で１００℃、３０分間処理するのが適切であることを見出した。本発明者らは、２Ｍ塩酸で１００℃、１時間、１．５時間、２時間または２．５時間処理するのが適切であることも見出した。このような塩酸による処理は、例えば、後述する多糖の脱Ｏ−アセチル化をもたらすことができる。

【0027】

多糖を解重合するための他の方法が適切となり得る。このような方法として、加熱、マイクロフルイダイゼーション［５９］、音波放射［３］、酸化−還元［６０］またはオゾン分解［６１］が挙げられる。

【0028】

多糖断片は、クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによって同定することができる。特異的な分子量は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ［６２］から入手できる標準物質等、プルラン標準物質と対比して、ゲル濾過によって測定することができる。通常、本発明の断片は、様々な値の質量を有する断片の混合物である。解重合された５型莢膜多糖に関して、断片の分子量は通常、１〜５００ｋＤａ、例えば、５〜１００ｋＤａ、具体的には１０〜５０ｋＤａ、より具体的には２０〜３０ｋＤａで変動する。同様に、解重合された８型莢膜多糖に関して、断片の分子量は、１〜５００ｋＤａ、例えば、５〜１００ｋＤａ、具体的には１０〜５０ｋＤａ、より具体的には２０〜３０ｋＤａで変動し得る。一部の実施形態では、低分子量の５型および／または８型多糖断片が、本発明における使用のために選択される。例えば、低分子量断片に相当するゲル濾過画分が選択され、プールされてよい。低分子量の多糖断片は通常、５〜２０ｋＤａで変動する分子量を有する。

【0029】

解重合は、莢膜多糖のＯ−アセチル化の程度に変化を生じ得る。例えば、本発明者らは、酸加水分解が、Ｏ−アセチル化の程度の減少を生じ得ることを見出した。一部の実施形態では、断片のＯ−アセチル化の程度は、１０〜９０％、２０〜７０％、３０〜５０％、具体的には３５〜４５％であり得る。他の実施形態では、断片のＯ−アセチル化の程度は、０〜１０％、０〜５％、０〜２％、具体的には０％であり得る。

【0030】

アルデヒド基の導入
断片における少なくとも１個の糖残基へアルデヒド基を導入するため、プロセスの工程（ｂ）において断片が酸化される。この工程は、２以上のアルデヒド基の糖残基への導入に関与し得る。特に、２個のアルデヒド基を導入することができる。例えば、工程（ａ）における解重合が、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する５型多糖断片を生じる場合、この部分における２個の隣接するヒドロキシル基を酸化して、２個のアルデヒド基をこの部分へと導入することができる。このようにして、β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分は、工程（ｂ）の糖残基となり得る。同様に、解重合が、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する８型多糖断片を生じる場合、この部分における２個の隣接するヒドロキシル基を酸化して、２個のアルデヒド基を導入することができる。このようにして、α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分は、工程（ｂ）の糖残基となり得る。

【0031】

よって、さらに別の一態様では、本発明は、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を酸化して、β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスを提供する。関連する一態様では、本発明は、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を酸化して、α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分における２個の隣接するヒドロキシル基を２個のアルデヒド基に変換する工程を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖誘導体を提供するためのプロセスを提供する。莢膜多糖は、上述の「解重合」に記載されている多糖断片であり得る。本発明は、これらプロセスのいずれかにより得られたかまたは得ることが可能であるＳ．ａｕｒｅｕｓ莢膜多糖誘導体も提供する。

【0032】

アルデヒドを生成する通常の反応は、隣接するヒドロキシル基を酸化するための過ヨウ素酸塩、特にメタ過ヨウ素酸（例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムまたはカリウム、例えばＮａＩＯ_４）の使用を包含する［６３］。当業者であれば、適切な酸化条件を同定することができるであろう。例えば、本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌの多糖の１：１比（ｗ／ｗ）のＮａＩＯ_４による室温、１〜２時間、暗所における処理が適切であることを見出した。本発明者らは、２ｍｇ／ｍｌの多糖の９３ｍＭ ＮａＩＯ_４による室温、８時間、暗所における処理が適切であることも見出した。他の酸化条件が用いられてよく、例えば、四酸化オスミウム等が使用されてよい。

【0033】

キャリア分子とのカップリング
プロセスの工程（ｃ）における酸化された糖残基とキャリア分子とのカップリングは、直接的であっても、リンカーを介してもよい。必要に応じて任意の適切なリンカーを用いた、任意の適切な結合体化反応が用いられてよい。

【0034】

工程（ｂ）における酸化が、２個のアルデヒド基がその部分に導入されている、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する５型多糖断片を生じる場合、工程（ｃ）におけるカップリングは、これらアルデヒド基のうちの１個を介することができる。このようにして、酸化されたβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分は、工程（ｃ）の酸化された糖残基となり得る。同様に、酸化が、２個のアルデヒド基がその部分に導入されている、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有する８型多糖断片を生じる場合、工程（ｃ）におけるカップリングは、これらアルデヒド基のうちの１個を介することができる。このようにして、酸化されたα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分は、工程（ｃ）の酸化された糖残基となり得る。

【0035】

よって、さらに別の一態様では、本発明は、結合体化されたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、酸化されて２個の隣接するヒドロキシル基が２個のアルデヒド基に変換されている、その非還元末端にβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖をキャリア分子とカップリングする工程であって、カップリングが該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである工程を含む、プロセスを提供する。関連する一態様では、本発明は、結合体化されたＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖を提供するためのプロセスであって、酸化されて２個の隣接するヒドロキシル基が２個のアルデヒド基に変換されている、その非還元末端にα−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→部分を有するＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖をキャリア分子にカップリングする工程であって、カップリングが該アルデヒド基のうちの１個を介するカップリングである工程を含む、プロセスを提供する。莢膜多糖は、上述の「アルデヒド基の導入」に記載されている莢膜多糖であり得る。キャリア分子は、上述の「キャリア分子」に記載されているキャリアであり得る。本発明は、これらプロセスのいずれかによって得られたかまたは得ることが可能である、結合体化された莢膜多糖も提供する。

【0036】

酸化された糖残基またはリンカーのキャリアへの連結は通常、例えば、キャリアタンパク質におけるリシン残基の、あるいはアルギニン残基の側鎖におけるアミン（−ＮＨ_２）基を介する。キャリアへの連結は、例えば、システイン残基の側鎖におけるスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）（−ＳＨ）基を介することもできる。本発明者らは、酸化された糖残基におけるアルデヒド基をキャリアにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによって、直接的なカップリングが簡便に達成できることを見出した。したがって、本発明において、この性質の直接的なカップリングが好ましい。対照的に、参考文献２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型結合体において、リンカーが有利となり得ることを示唆する。必要に応じて、例えば、酸化された糖残基におけるアルデヒド基をリンカーにおけるアミン基と還元的アミノ化により反応させることによって、あるいは還元的アミノ化によりアルデヒド基をアミン基へと変換させてリンカー連結のためのアミン基を提供することによって、本発明においてリンカーを介したカップリングを用いることができる。

【0037】

還元的アミノ化は、有機化学における標準技法であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ莢膜多糖等、ワクチン用途の莢膜多糖結合体の生産に広範に用いられてきた［１０］。一実施形態では、酸化された糖残基におけるアルデヒド基は、キャリアまたはリンカーにおけるアミン基と反応する。この反応は、適正な還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ_３ＣＮ等のシアノ水素化ホウ素塩、ボラン−ピリジン、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド、水素化ホウ素交換レジン等）の存在下にて多糖をキャリアまたはリンカーと組み合わせることによって簡便に達成することができる。別の一実施形態では、アルデヒド基は還元的アミノ化によりアミン基に変換され、リンカー連結のためのアミン基を提供する。還元的アミノ化は、アンモニアまたは一級アミン（ＮＨ_２Ｒ）のいずれかに関与する。これは、適正な還元剤（例えば、上に列挙した）と組み合わせたアンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム）を用いることによって、簡便に達成することができる。当業者であれば、還元的アミノ化に適切な条件を同定することができるであろう。例えば、本発明者らは、１０ｍｇ／ｍｌの多糖の、４：１の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）のキャリアタンパク質および２：１の多糖：ＮａＢＨ_３ＣＮ比のＮａＢＨ_３ＣＮによる処理が適切であることを見出した。

【0038】

任意の公知手順、例えば上述の還元的アミノ化手順を用いて、リンカー基を介したカップリングを行うことができる。一実施形態では、二官能性リンカーを用いて、酸化された糖残基におけるアルデヒド基とのカップリングのための第一の基およびキャリアとのカップリングのための第二の基を提供することができる。例えば、式、Ｘ_１−Ｌ−Ｘ_２（式中、Ｘ_１はアルデヒドと反応することができ、Ｘ_２はキャリアと反応することができ、Ｌはリンカーにおける接続部分である）の二官能性リンカーを用いることができる。通常、Ｘ_１基はアミン基である。通常、Ｌ基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３−である。別の一実施形態では、二官能性リンカーを用いて、酸化された糖残基におけるアルデヒド基に由来するアミン基（例えば、上述の還元的アミノ化による）とのカップリングのための第一の基およびキャリアとのカップリングのための（通常は、キャリアにおけるアミンとのカップリングのための）第二の基を提供することができる。例えば、式、Ｘ−Ｌ−Ｘ（式中、２個のＸ基は互いに同一のものであり、アミンと反応することができ、Ｌはリンカーにおける接続部分である）のホモ二官能性リンカーを用いることができる。通常、Ｘ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは通常、式、−Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’−（式中、Ｌ’はカルボニルである）を有する。通常、Ｌ^２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ_２）_４−である。このため通常、リンカーはアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル（ＳＩＤＥＡ）である。

【0039】

【化3】

他のＸ基は、ノルボラン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと組み合わせるとエステルを形成する基である。本発明と共に用いるためのアミンと反応性のさらに別の二官能性リンカーは、ハロゲン化（例えば、塩化）アクリロイル［６５］、ハロゲン化ハロアシル［６６］、グルタル酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミジル、エチレングリコールビス［コハク酸スクシンイミジル］等を包含する。

【0040】

リンカーは一般に、多糖に対してモル過剰で加えられる。リンカーは通常、水に不溶性であるため、リンカー／多糖反応は一般に非プロトン溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、酢酸エタノール等）において行われる。しかし、水溶性リンカーが用いられる場合、水等、プロトン溶媒を包含するより広範囲の溶媒を利用できる。適切なリンカーは、スルホン化ＳＩＤＥＡ等、スルホン化形態を包含する。

【0041】

【化4】

リンカーが用いられる場合、結合体はリンカー部分を含むことになる。この部分は、多糖もキャリアも起源としないが、結合体調製において用いられる第三の分子であり、最終結合体産物において多糖およびキャリアタンパク質の両方から容易に識別することができる。リンカー部分は、炭素、水素、酸素および／または窒素等の原子を包含することができる。炭素および水素を含むリンカーが通常のものであり、酸素および／または窒素をさらに含むリンカーもまた通常用いられる。窒素原子を包含するリンカーは、窒素原子と結合した炭素原子を包含することができ、この窒素原子は他方で第二の炭素原子と結合する（−Ｃ−Ｎ−Ｃ−）。酸素原子を包含するリンカーは通常、該原子をカルボニル基の一部として包含する。３０〜５００Ｄａの分子量を有するリンカー部分が通常のものである。２個のカルボニル基を含有するリンカーも通常のものである。

【0042】

特に有用なリンカー部分は、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）である。ｎの値は通常４である。このリンカーにおける末端−ＮＨ−は通例、多糖部分由来の炭素原子に連結される。末端−Ｃ（Ｏ）−は通例、キャリアのアミノ酸側鎖における窒素原子に連結される。好ましいリンカー部分は、酸化された糖残基におけるアルデヒドの還元的アミノ化；その結果生じる−ＮＨ_２基と、二酸（例えば、アジピン酸、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_４−ＣＯＯＨ）のジエステル（例えば、ジスクシンイミジルエステル）である二官能性リンカーとの反応；および産物の還元的アミノ化を伴うプロセスによって簡便に導入することができる（図６［６４］を参照）。

【0043】

リンカーを多糖における−ＮＨ_２基へと連結するために用いることのできる他の化学として、次のものが挙げられる。

【0044】

−アクリロイル化（例えば、塩化アクリロイルとの反応による）と、続くアミノ酸側鎖のε−ＮＨ_２またはシステイン側鎖の−ＳＨのいずれかへのマイケル型付加［６５］。その結果生じるリンカーは、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ_２）_２−（プロピオンアミド）である。

【0045】

−ハロゲン化ハロアシルとの反応と、続くアミノ酸側鎖のε−ＮＨ_２またはシステイン側鎖の−ＳＨとの反応［６６］。リンカーは−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−である。

【0046】

通常、１：２０（すなわち、タンパク質過剰）から２０：１（すなわち、多糖過剰）の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）の結合体が、本発明の方法によって産生される。１：１０から１：１の比が好ましく、特に１：５から１：２の比、最も好ましくは約１：３である。対照的に、先行技術のプロセスによって作製された５型および８型莢膜多糖結合体は、より高い比、例えば、参考文献１、２および３では０．７３：１から１．０８：１を有する傾向がある。本発明の特定の実施形態では、５型莢膜多糖結合体の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は１：１０から１：２であり、および／または８型莢膜多糖結合体の多糖：タンパク質比（ｗ／ｗ）は１：５から７：１０である。

【0047】

組成物は、少量の遊離キャリアを包含することができる［６７］。所定のキャリアタンパク質が本発明の組成物において遊離型および結合体型の両方で存在する場合、非結合体型は、好ましくは組成物全体におけるキャリアタンパク質の総量の５％以下、より好ましくは、２重量％未満で存在する。

【0048】

結合体化の後、遊離型および結合体型多糖を分離することができる。疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過、ダイアフィルトレーション等を包含する多くの適切な方法が存在する［参考文献６８および６９等も参照されたい］。

【0049】

結合体および他の抗原の組合せ
上述の個々の結合体の提供に加え、本発明は、本発明の結合体、および１または複数のさらに別の抗原を含む組成物を提供する。組成物は通常、免疫原性組成物である。

【0050】

さらに別の抗原（複数可）は、本発明のさらに別の結合体を含むことができ、そこで本発明は、２以上の本発明の結合体を含む組成物を提供する。特に、本発明は、本発明の５型莢膜多糖結合体および本発明の８型莢膜多糖結合体を含む組成物を提供する。あるいは、さらに別の抗原（複数可）は、本発明の方法以外の方法、例えば、上述の参考文献１〜１３の方法によって調製された５型または８型莢膜多糖結合体であり得る。同様に、さらに別の抗原（複数可）は、参考文献５９、７０、７１、７２、７３および７４の方法、特にこれらの文書において特に例示されている方法によって調製された５型または８型莢膜多糖結合体であり得る。よって、本発明は、一方の結合体（５型結合体または８型結合体）が本発明の結合体であり、もう一方の結合体が本発明の結合体ではない、５型莢膜多糖結合体および８型莢膜多糖結合体を含む組成物を提供する。

【0051】

さらに別の抗原（複数可）は、下に述べるタンパク質および糖抗原を包含する他のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原を含むことができる。

【0052】

さらに別の抗原（複数可）は、非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体由来の抗原を含むことができる。このように、本発明の組成物は、追加的な細菌、ウイルスまたは寄生生物抗原を包含する１または複数の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原をさらに含むことができる。これらは次のものから選択することができる。

【0053】

−タンパク質「２８７」（後述を参照）および誘導体（例えば、「ΔＧ２８７」）が特に有用である、参考文献７５〜８１の抗原等、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原
−参考文献８２、８３、８４、８５等に開示されている調製物等、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物
−血清型Ｃ由来の参考文献８６に開示されているオリゴ糖または参考文献８７のオリゴ糖等、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来の糖抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖抗原［例えば、参考文献８８〜９０；参考文献９７の第２２および２３章］
−不活性化ウイルス等、Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、９１、９２；参考文献９７の第１５章］
−表面および／またはコア抗原等、Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、９２、９３；参考文献９７の第１６章］
−Ｃ型肝炎ウイルス由来の抗原［例えば、９４］
−百日咳ホロ毒素（ＰＴ）等、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）。これは場合により、パータクチンおよび／または凝集原２および３とも組み合わせる［例えば、参考文献９５および９６；参考文献９７の第２１章］
−ジフテリアトキソイド等、ジフテリア抗原［例えば、参考文献９７の第１３章］
−破傷風トキソイド等、破傷風抗原［例えば、参考文献９７の第２７章］
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ由来の糖抗原［例えば、参考文献９７の第１４章］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、７５、７６、７７］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、１０５］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１０６］
−ＩＰＶ等、ポリオ抗原（複数可）［例えば、１０７、１０８；参考文献９７の第２４章］
−凍結乾燥した不活性化ウイルス［例えば、１１０、ＲａｂＡｖｅｒｔ^ＴＭ］等、狂犬病抗原（複数可）［例えば、１０９］
−麻疹、ムンプスおよび／または風疹抗原［例えば、参考文献９７の第１９、２０および２６章］
−赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質等、インフルエンザ抗原（複数可）［例えば、参考文献９７の第１７および１８章］
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１１１］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１１２、１１３、１１４］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、５６、１１５〜１１７］
−Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ由来の抗原［例えば、参考文献１１８、１１９および１２０に記載されているＡＴＣＣ−３１４３２、ＳＥ−３６０およびＳＥ−１０株から得ることのできるＩ、ＩＩおよび／またはＩＩＩ型莢膜多糖］。

【0054】

糖または炭水化物抗原が用いられる場合、これは通常、免疫原性を増強するためキャリアと結合体化される。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ、髄膜炎菌および肺炎球菌糖抗原の結合体化が周知のものである。

【0055】

毒性タンパク質抗原は、必要であれば解毒化することができる（例えば、化学的および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒［９６］）。

【0056】

ジフテリア抗原が組成物に包含される場合、これは通常、破傷風抗原および百日咳抗原も包含することになる。同様に、破傷風抗原が包含される場合、これは通常、ジフテリアおよび百日咳抗原も包含することになる。同様に、百日咳抗原が包含される場合、これは通常、ジフテリアおよび破傷風抗原も包含することになる。

【0057】

抗原は、アルミニウム塩に吸着することができる。

【0058】

好ましい組成物の一型は、免疫無防備状態に影響を及ぼすさらに別の抗原を包含し、よって本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ結合体は、次の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体由来の１または複数の抗原と組み合わせることができる。Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、インフルエンザウイルス、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびパラインフルエンザウイルス。

【0059】

好ましい組成物の別の一型は、院内感染に関連する細菌由来のさらに別の抗原を包含し、よって本発明のＳ．ａｕｒｅｕｓ結合体は、次の非Ｓ．ａｕｒｅｕｓ病原体由来の１または複数の抗原と組み合わせることができる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよび腸外病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。

【0060】

組成物における抗原は通常、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所定の抗原の濃度は、該抗原に対する免疫応答の誘発に十分なものとなる。

【0061】

本発明の組成物におけるタンパク質抗原の使用の代替法として、抗原をコードする核酸を用いることができる［例えば、参考文献１２１〜１２９］。よって、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸（通例はＤＮＡ、例えばプラスミドの形態）に置き換えることができる。

【0062】

実際には、本発明の組成物に包含される抗原の数には上限が存在し得る。本発明の組成物における抗原（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原を包含する）の数は、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満または３未満であり得る。本発明の組成物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原の数は、６未満、５未満または４未満であり得る。

【0063】

薬学的組成物および方法
本発明は、（ａ）本発明の結合体と、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。通常、「薬学的に許容されるキャリア」は、組成物を受けた個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体は誘導しない任意のキャリアを包含する。適切なキャリアは通常、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合したアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ショ糖［１３０］、トレハロース［１３１］、ラクトースおよび脂質凝集体（油滴またはリポソーム等）等、大型のゆっくりと代謝される巨大分子である。このようなキャリアは、当業者にとって周知のものである。ワクチンは、水、生理食塩水、グリセロール等、希釈剤も含有することができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質その他等、補助物質が存在してよい。無菌の発熱物質不含リン酸緩衝生理食塩水が通常のキャリアである。薬学的に許容される賦形剤についての徹底的な考察は、参考文献１３２に記されている。

【0064】

本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液または懸濁物）でも乾燥形態（例えば、凍結乾燥された）でもよい。乾燥ワクチンが用いられる場合、これはその後、注射に先立ち液体媒質中に再構成されることになる。結合体ワクチンの凍結乾燥は、本技術分野において公知のものであり、例えばＭｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭ製品は凍結乾燥形態で提示され、一方、ＮｅｉｓＶａｃ−Ｃ^ＴＭおよびＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭは水性形態で提示される。凍結乾燥の間結合体を安定化させるため、通常、組成物中に例えば、１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌ（例えば、約２５ｍｇ／ｍｌ）の糖アルコール（例えば、マンニトール）または二糖（例えば、ショ糖もしくはトレハロース）を包含することができる。

【0065】

組成物は、バイアル中に提示、あるいは予め充填してあるシリンジ中に提示することができる。シリンジは、針と共にまたは針なしで供給することができる。シリンジは単一用量の組成物を包含するが、一方、バイアルは単一用量または複数用量を包含することができる。

【0066】

本発明の水性組成物は、他のワクチンの凍結乾燥形態からの再構成にも適切である。本発明の組成物がこのような即席の再構成に用いられる場合、本発明は、２個のバイアルを含み得るキット、あるいはシリンジの内容物がバイアルの内容物の注射に先立つ再活性化に用いられる、１個の予め充填してあるシリンジおよび１個のバイアルを含み得るキットを提供する。

【0067】

本発明の組成物は、単位用量形態または複数用量形態でパッケージすることができる。複数用量形態のため、充填済みシリンジよりバイアルが好ましい。効果的な投薬容積は日常的に確立することができるが、組成物の通常のヒト用量は、例えば筋肉内注射について０．５ｍｌの容積である。

【0068】

組成物のｐＨは通常、６〜８の間、例えば約７である。安定的なｐＨは、バッファーの使用によって維持することができる。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合、これは通常、ヒスチジンバッファーを用いることになる［１３３］。組成物は、無菌および／または発熱物質不含であり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して等張であり得る。

【0069】

本発明の組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明に係るワクチンは、予防用（すなわち感染症の防止）または治療用（すなわち感染症の処置）のいずれであってもよいが、通常は予防用である。ワクチンとして用いた免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）と共に適宜任意のその他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単一用量、あるいは一連の投薬の一部としてこの量を個体に投与することが処置または防止に効果的であることを意味する。この量は、処置しようとする個体の健康状態および身体条件、年齢、処置しようとする個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態に関する治療医の評価ならびに他の関連因子に応じて変動する。量は比較的広範囲であり、日常的な治験によって決定できることが予想される。

【0070】

各用量内において、個々の糖抗原の量は一般に、１〜５０μｇ（糖の質量として測定される）、例えば約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇとなる。

【0071】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓは様々な身体領域を冒し、よって本発明の組成物は様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして注射剤として調製することができる。組成物は、例えば微粉末またはスプレーを用いた吸入器として経肺投与用に調製することができる。組成物は、坐剤または膣坐剤として調製することができる。組成物は、経鼻、経耳または点眼投与用、例えばスプレー、点滴剤、ゲルまたは粉末として調製することができる［例えば、参考文献１３４および１３５］。肺炎球菌糖［１３６、１３７］、Ｈｉｂ糖［１３８］、ＭｅｎＣ糖［１３９］ならびにＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖結合体の混合物［１４０］の経鼻投与での成功が報告されている。

【0072】

本発明の組成物は、特に複数用量形態でパッケージされる場合、抗菌剤を包含することができる。

【0073】

本発明の組成物は、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０等、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含むことができる。界面活性剤は一般に、低レベル、例えば＜０．０１％で存在する。

【0074】

本発明の組成物は、張度を生じるためのナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を包含することができる。１０±２ｍｇ／ｍｌ濃度のＮａＣｌが通常のものである。

【0075】

本発明の組成物は一般に、バッファーを包含する。リン酸バッファーが通常のものである。

【0076】

本発明の組成物は一般に、他の免疫調節剤と組み合わせて投与される。特に、組成物は通例、１または複数のアジュバントを包含する。このようなアジュバントとして次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0077】

Ａ．ミネラル含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切なミネラル含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩等、ミネラル塩を包含する。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等、ミネラル塩［例えば、参考文献１４１の第８および９章を参照］または異なるミネラル化合物の混合物（例えば、リン酸塩アジュバントおよび水酸化物アジュバントの混合物、場合により過剰のリン酸塩を含む）を包含し、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファス等）を取り、塩（複数可）との吸着が通常である。ミネラル含有組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる［１４２］。

【0078】

アルミニウム塩は、Ａｌ^３＋の用量が投与量当たり０．２〜１．０ｍｇとなるように、本発明のワクチンに包含することができる。

【0079】

通常のリン酸アルミニウムアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌにて含まれる。例えば、投与量毎の結合体当たり５０〜１００μｇ Ａｌ^３＋の、低用量のリン酸アルミニウムによる吸着を用いることができる。リン酸アルミニウムが用いられ、抗原がアジュバントに吸着しないことが望ましい場合、溶液中に遊離リン酸イオンを包含することによって（例えば、リン酸バッファーの使用によって）これがもたらされる。

【0080】

Ｂ．油性エマルジョン
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切な油性エマルジョン組成物は、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５、マイクロフルダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いてサブミクロン粒子に処方）等、スクアレン−水エマルジョンを包含する［参考文献１４１の第１０章、参考文献１４３〜１４５も参照されたい］。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ^ＴＭインフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして用いられる。

【0081】

組成物における使用に特に有用なアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。本明細書における使用のための好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）と、場合によりＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油型エマルジョン等、場合により変動量のＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョンである。組成物において用いるためのサブミクロン水中油型エマルジョン、これを作製する方法およびムラミルペプチド等の免疫賦活剤は、参考文献１４３および１４６〜１４７において詳細に記載されている。

【0082】

フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を本発明におけるアジュバントとして用いることもできる。

【0083】

Ｃ．サポニン処方物［参考文献１４１の第２２章］
サポニン処方物は、本発明におけるアジュバントとして用いることもできる。サポニンは、幅広い植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花に見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮から単離されたサポニンが、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））由来のものが市販されている。サポニンアジュバント処方物は、ＱＳ２１等の精製された処方物およびＩＳＣＯＭ等の脂質処方物を包含する。

【0084】

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製された。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃ等、これらの技法を用いて特異的な精製画分が同定された。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１を生産する方法は、参考文献１４８に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロール等、ステロールを含むこともできる［１４９］。

【0085】

サポニンおよびコレステロールの組合せを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と称する独自の粒子を生成することができる［参考文献１４１の第２３章］。ＩＳＣＯＭは通常、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン等、リン脂質も包含する。任意の公知サポニンをＩＳＣＯＭにおいて用いることができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうち１または複数を包含する。ＩＳＣＯＭは、参考文献１４９〜１５１においてさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加的な界面活性剤（複数可）を欠いてもよい［１５２］。

【0086】

サポニンベースのアジュバントの開発についての概説は、参考文献１５３および１５４に見出すことができる。

【0087】

Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を本発明におけるアジュバントとして用いることもできる。これらの構造は一般に、場合によりリン脂質と組み合わされたか処方された、ウイルス由来の１または複数のタンパク質を含有する。これらは一般に、非病原性かつ非複製性であり、一般に、天然のウイルスゲノムを何ら含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えにより産生、あるいはウイルス全体から単離することができる。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用に適切なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡ等）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはカプシドタンパク質等）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡ−ファージ、Ｑβ−ファージ（コートタンパク質等）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１等）に由来するタンパク質を包含する。ＶＬＰについては、参考文献１５５〜１６０においてさらに考察されている。ビロソームについては、例えば、参考文献１６１においてさらに考察されている。

【0088】

Ｅ．細菌または微生物の誘導体
本発明における使用に適切なアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒化された誘導体等、細菌または微生物の誘導体を包含する。

【0089】

ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を包含する。３ｄＭＰＬは、４、５または６アシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ由来の好ましい「小粒子」の形態が参考文献１６２に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２μｍメンブレンを通した滅菌濾過を行うのに十分なほど小さい［１６２］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９等、モノホスホリルリピドＡ模倣物を包含する［１６３、１６４］。

【0090】

リピドＡ誘導体は、ＯＭ−１７４等、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体を包含する。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献１６５および１６６に記載されている。

【0091】

本発明におけるアジュバントとしての使用に適切な免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンに接続した非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を包含する。二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、例えば、パリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列もまた、免疫賦活性であることを示した。

【0092】

ＣｐＧモチーフは、ホスホロチオエート修飾等、ヌクレオチド修飾／アナログを包含することができ、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。参考文献１６７、１６８および１６９は、可能性のあるアナログ置換、例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンへの置き換えを開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１７０〜１７５においてさらに考察されている。

【0093】

ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ等、ＴＬＲ９に向けることができる［１７６］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ等、Ｔｈ１免疫応答の誘導に対し特異的となることができ、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ等、Ｂ細胞応答の誘導に対しより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１７７〜１７９において考察されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

【0094】

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能となるように構築される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で連結させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献１７６および１８０〜１８２を参照されたい。

【0095】

細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化された誘導体は、本発明におけるアジュバントとして用いることができる。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒化されたＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献１８３に記載されており、非経口アジュバントとしては参考文献１８４に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。好ましくは、Ａサブユニットは解毒性変異を含有し、好ましくは、Ｂサブユニットは変異していない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２等、解毒性ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒性誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｅ）、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、参考文献１８５〜１９２に見出すことができる。アミノ酸置換の数値参照は、好ましくは、特に本明細書に参考としてその全体を援用する参考文献１９３に表記されているＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアライメントに基づく。

【0096】

Ｆ．ヒト免疫調節物質
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切なヒト免疫調節物質は、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１９４］等）［１９５］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子等、サイトカインを包含する。

【0097】

Ｇ．生体接着物質および粘膜付着物質
生体接着物質および粘膜付着物質も、本発明におけるアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着物質は、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１９６］、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体等の粘膜付着物質を包含する。キトサンおよびその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして用いることができる［１９７］。

【0098】

Ｈ．微粒子
微粒子も、本発明におけるアジュバントとして用いることができる。生分解性かつ非毒性（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトン等、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましい）材料から形成された微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、これは場合により、負電荷表面（例えば、ＳＤＳにより）または正電荷表面（例えば、ＣＴＡＢ等、カチオン性界面活性剤により）を有するよう処理される。

【0099】

Ｉ．リポソーム（参考文献１４１の第１３および１４章）
アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、参考文献１９８〜２００に記載されている。

【0100】

Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明における使用に適切なアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを包含する［２０１］。このような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント［２０２］および少なくとも１つのオクトキシノール等の追加的な非イオン性サーファクタントと組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステルサーファクタント［２０３］をさらに包含する。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

【0101】

Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献２０４および２０５に記載されている。

【0102】

Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切なムラミルペプチドの例として、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。

【0103】

Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に適切なイミダゾキノロン化合物の例として、参考文献２０６および２０７にさらに記載されているイミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」）が挙げられる。

【0104】

Ｎ．チオセミカルバゾン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に非常に適切なチオセミカルバゾン化合物ならびに化合物を処方、製造およびスクリーニングする方法の例として、参考文献２０８に記載されているものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、ヒト末梢血単核球のＴＮＦ−α等、サイトカイン産生への刺激に特に効果的である。

【0105】

Ｏ．トリプタントリン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用に非常に適切なトリプタントリン化合物ならびに化合物を処方、製造およびスクリーニングする方法の例として、参考文献２０９に記載されているものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、ヒト末梢血単核球のＴＮＦ−α等、サイトカイン産生への刺激に特に効果的である。

【0106】

本発明は、上で同定されたアジュバントのうちの１または複数の態様の組合せを含むこともできる。例えば、次の組合せは、本発明におけるアジュバント組成物として用いることができる。（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［２１０］、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［２１１］、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）［２１２］、（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組合せ［２１３］、（６）サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされたか、あるいはボルテックスしてより大きな粒子サイズエマルジョンに生成された、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０^ＴＭ、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙ）リピドＡ（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群の１または複数の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含有するＲｉｂｉ^ＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、（８）１または複数のミネラル塩（アルミニウム塩等）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬ等）。

【0107】

免疫賦活剤として作用する他の物質は、参考文献１４１の第７章に開示されている。

【0108】

アルミニウム塩アジュバントの使用は特に有用であり、抗原は一般にこのような塩に吸着させられる。Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ^ＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ^ＴＭ結合体は水酸化物アジュバントを用い、一方、Ｍｅｎｉｎｇｉｔｅｃ^ＴＭはリン酸塩アジュバントを用いる。本発明の組成物において、いくつかの抗原を水酸化アルミニウムに吸着させ、他の抗原をリン酸アルミニウムに関連させることもできる。しかし通常、単一の塩のみ、例えば水酸化物またはリン酸塩が用いられ、その両方は用いられない。全ての結合体が吸着されている必要はなく、すなわち一部または全部が溶液中に遊離していてよい。

【0109】

処置方法
本発明は、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法も提供する。免疫応答は好ましくは防御的であり、好ましくは抗体に関与する。この方法は、追加免疫応答を生じさせることができる。

【0110】

哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防用途である場合、ヒトは好ましくは小児（例えば、幼児もしくは乳児）またはティーンエイジャーであり、ワクチンが治療用途である場合、ヒトは好ましくは成人である。例えば、安全性、投薬量、免疫原性等を評価するため、小児用に企図されたワクチンを成人に投与してもよい。処置のためのヒトの好ましいクラスは、院内感染リスクのある患者、特に末期腎疾患患者および／または血液透析を受けている患者である。院内感染リスクのある他の患者、例えば、免疫不全患者または手術、特に心臓手術もしくは外傷を受けた患者も好ましい。処置のためのヒトの別の好ましいクラスは、菌血症リスクのある患者である。さらに好ましいクラスは、インフルエンザウイルスに罹患したか、あるいは以前にそれに曝露された患者であるが、これはＳ．ａｕｒｅｕｓがこれらの患者における感染後肺炎とリンクしているためである。

【0111】

本発明は、医薬として用いるための本発明の組成物も提供する。医薬は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を生じさせることができ（すなわち、免疫原性組成物である）、より好ましくはワクチンである。

【0112】

本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための医薬の製造における本発明の結合体の使用も提供する。

【0113】

これらの使用および方法は、好ましくはＳ．ａｕｒｅｕｓに起因する疾患、例えば、皮膚感染症、例えば、膿痂疹、腫脹、蜂巣炎、毛包炎、麦粒腫、せつ、よう、熱傷様皮膚症候群および膿瘍、化膿性関節炎、肺炎、乳腺炎、静脈炎、髄膜炎、尿路感染症、骨髄炎、心内膜炎、トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、敗血症ならびに院内感染を防止および／または処置するためのものである。

【0114】

治療的処置の有効性をチェックする仕方のひとつは、本発明の組成物の投与後のＳ．ａｕｒｅｕｓ感染症のモニタリングに関与する。予防的処置の有効性をチェックする仕方のひとつは、組成物の投与後のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原に対する免疫応答のモニタリングに関与する。

【0115】

本発明の好ましい組成物は、容認できるパーセンテージのヒト被験体について、各抗原成分についてのセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）についての判断基準よりも優れた抗体力価を患者に付与することができる。宿主が抗原に対してセロコンバージョンされたと考えられる関連抗体力価を有する抗原は周知であり、このような抗体力価はＷＨＯ等の機関によって公表されている。好ましくは、被験体の統計的に有意な試料の８０％超がセロコンバージョンされ、より好ましくは９０％超、さらにより好ましくは９３％超、最も好ましくは９６〜１００％である。

【0116】

本発明の組成物は一般に、患者に直接投与されるであろう。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織腔への）によって、あるいは直腸、経口、膣、局所、経皮、鼻腔内、点眼、経耳、経肺または他の粘膜投与によって成し遂げることができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を経由することができるが、無針注射を代替的に用いることができる。通常の筋肉内用量は０．５ｍｌである。

【0117】

本発明は、全身性および／または粘膜性免疫の誘発に用いることができる。

【0118】

投薬処置は、単一投与計画であっても、複数投与計画であってもよい。一次免疫化計画および／または追加免疫化計画において複数投与を用いることができる。一次投与計画に追加免疫化投与計画が続くだろう。一次投与の間（例えば、４〜１６週間）および一次投与と追加免疫化との間の適切なタイミングは、日常的に決定することができる。

【0119】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ抗原
前述の通り、１または複数のさらに別のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原が本発明の組成物に包含され得る。抗原は、タンパク質または糖抗原であり得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、本発明の結合体のためのキャリアタンパク質または他の結合体のためのキャリアタンパク質として、あるいは非結合体化タンパク質抗原として用いることができる。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、他の結合体のための糖として、あるいは非結合体化糖抗原として用いることができる。

【0120】

適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）であるＳ．ａｕｒｅｕｓの菌体外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を包含する。この多糖は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの両方に存在し、いずれの供給源からも単離することができる［２１４、２１５］。例えば、ＰＮＡＧは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８ｍから単離することができる［２１６］。糖抗原は、細菌から菌体外多糖を精製する際に生じるサイズを有する多糖であり得、あるいは、このような多糖の断片化によって達成される多糖とすることができ、例えば、サイズは、４００ｋＤａ超から７５〜４００ｋＤａもしくは１０〜７５ｋＤａまたは最大３０反復単位へと変動し得る。糖抗原は、様々な程度のＮ−アセチル化を有することができ、参考文献２１７に記載されている通り、ＰＮＡＧは、４０％未満のＮ−アセチル化（例えば、３５、３０、２０、１５、１０または５％未満のＮ−アセチル化；脱アセチル化ＰＮＡＧは、ｄＰＮＡＧとしても公知）であり得る。ＰＮＡＧの脱アセチル化エピトープは、オプソニンによる死滅を媒介することのできる抗体を誘発することができる。ｄＰＮＡＧの調製は参考文献２１８に記載されている。ＰＮＡＧは、Ｏ−スクシニル化されていても、されていなくてもよく、例えば、２５、２０、１５、１０、５、２、１または０．１％より少ない残基がＯ−スクシニル化されていてよい。ＰＮＡＧは、上述の通りキャリア分子と結合体化することができ、あるいは非結合体であり得る。

【0121】

別の適切なＳ．ａｕｒｅｕｓ糖抗原は、Ｏ−アセチル化なしのβ−結合ヘキソサミンである３３６型抗原である［２１９、２２０］。３３６型抗原は、３３６株（ＡＴＣＣ５５８０４）に対して産生された抗体と交差反応性である。３３６型抗原は、上述のキャリア分子と結合体化することができ、あるいは非結合体であり得る。

【0122】

適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、次のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原（またはその免疫原性断片（複数可）を含む抗原）を包含する［例えば、参考文献２２１〜２２８を参照］。ＡｈｐＣ、ＡｈｐＦ、自己溶菌酵素アミダーゼ、自己溶菌酵素グルコサミニダーゼ、コラーゲン結合タンパク質ＣＡＮ、ＥｂｈＢ、ＧｅｈＤリパーゼ、ヘパリン結合タンパク質ＨＢＰ（１７ｋＤａ）、ラミニン受容体、ＭＡＰ、ＭｎｔＣ（ＳｉｔＣとしても公知）、ＭＲＰＩＩ、Ｎｐａｓｅ、ＯＲＦ０５９４、ＯＲＦ０６５７ｎ、ＯＲＦ０８２６、ＰＢＰ４、ＲＡＰ（ＲＮＡ ＩＩＩ活性化タンパク質）、Ｓａｉ−１、ＳａｓＫ、ＳＢＩ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２およびビトロネクチン結合タンパク質。

【0123】

さらに適切なＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、後述する通り、ｃｌｆＡ抗原、ｃｌｆＢ抗原、ｓｄｒＥ２抗原、ｓｄｒＣ抗原、ｓａｓＦ抗原、ｅｍｐ抗原、ｓｄｒＤ抗原、ｓｐａ抗原、ｅｓａＣ抗原、ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原、ｉｓｄＣ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ０１１抗原、ｉｓｄＡ抗原、ｉｓｄＢ抗原およびｓｔａ０７３抗原を包含する。これら抗原のうちの１または複数（すなわち、１、２、３、４、５、６以上）が、本発明の組成物中に存在することができる。これらの抗原のうち、１または複数（すなわち、１、２、３、４、５、６以上）のｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ０１１抗原および／またはｓｔａ０７３抗原の使用が特に想定されている。

【0124】

例えば、本発明の組成物は、次のＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の組合せのうちの一つをさらに含むことができる。
（１）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチドとして有用に組み合わせることができる（例えば、ｅｓｘＢ抗原がｅｓｘＡ抗原の下流にあるＥｓｘＡＢハイブリッド）。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異等、解毒化変異体であり得る。
（２）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせることができる。
（３）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（４）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチドとして組み合わせてもよい（例えば、ＥｓｘＡＢハイブリッド）。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異等、解毒化変異体となることができる。
（５）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびＨｌａ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチドとして有用に組み合わせることができる（例えば、ＥｓｘＡＢハイブリッド）。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異等、解毒化変異体となることができる。
（６）Ｈｌａ抗原、ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。Ｈｌａ抗原は、例えばＨ３５Ｌ変異等、解毒化変異体となることができる。
（７）ｅｓｘＡ抗原およびｅｓｘＢ抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（８）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原およびｓｔａ００６抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして有用に組み合わせることができる。
（９）ｅｓｘＡ抗原、ｅｓｘＢ抗原、ｓｔａ０１１抗原およびｓｔａ０７３抗原。ｅｓｘＡおよびｅｓｘＢ抗原は、下に考察する通りハイブリッドポリペプチド、例えばＥｓｘＡＢハイブリッドとして組み合わせることができる。
（１０）ｓｔａ００６抗原およびｓｔａ０１１抗原。

【0125】

さらに別のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原は、参考文献２２９に開示されている。

【0126】

ｃｌｆＡ
「ｃｌｆＡ」抗原は、「凝集因子Ａ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｃｌｆＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１２であり、アミノ酸配列の配列番号１（ＧＩ：８８１９４５７２）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株においてはｎｗｍｎ＿０７５６（ＧＩ：１５１２２０９６８）である。

【0127】

有用なｃｌｆＡ抗原は、配列番号１を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号１に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＡタンパク質は、配列番号１の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号１の最後の３６８個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号１の最初の３９個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0128】

配列番号２は、配列番号１の有用な断片である（「ＣｌｆＡ_{４０〜５５９}」）。この断片は、配列番号１のＣ末端方向への長い反復領域を省略する。

【0129】

ｃｌｆＢ
「ｃｌｆＢ」抗原は、「凝集因子Ｂ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｃｌｆＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９６３であり、アミノ酸配列の配列番号３（ＧＩ：８８１９６５８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株においてはｎｗｍｎ＿２５２９（ＧＩ：１５１２２２７４１）である。

【0130】

有用なｃｌｆＢ抗原は、配列番号３を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号３に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号３の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｃｌｆＢタンパク質は、配列番号３の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号３の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号３のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号３の最後の４０個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号３の最初の４４個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ＣｌｆＢは天然では長いタンパク質であり、よって断片の使用は、例えば精製、取り扱い、融合、発現等に有益である。

【0131】

配列番号４は、配列番号３の有用な断片である（「ＣｌｆＢ_{４５〜５５２}」）。この断片はＣｌｆＢの最も露出したドメインを包含し、工業規模でより容易に用いられる。これは抗原のヒトタンパク質との類似性も低減させる。ＣｌｆＢの３ドメインモデルに基づく他の有用な断片は、ＣｌｆＢ_{４５〜３６０}（ＣＬｆＢ−Ｎ１２としても公知；配列番号５）、ＣｌｆＢ_{２１２〜５４２}（ＣＬｆＢ−Ｎ２３としても公知；配列番号６）およびＣｌｆＢ_{３６０〜５４２}（ＣＬｆＢ−Ｎ３としても公知；配列番号７）を包含する。

【0132】

ｓｄｒＥ２
「ｓｄｒＥ２」抗原は、「Ｓｅｒ−Ａｓｐリッチフィブリノーゲン／骨シアロタンパク質結合タンパク質ＳｄｒＥ」と注釈が付けられている。Ｎｅｗｍａｎ株においてｓｄｒＥ２はＮＷＭＮ＿０５２５であり、アミノ酸配列の配列番号８（ＧＩ：１５１２２０７３７）を有する。

【0133】

有用なｓｄｒＥ２抗原は、配列番号８を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号８に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号８の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＥ２タンパク質は、配列番号８の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号８由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号８の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号８のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号８の最後の３８個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号８の最初の５２個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ＳｄｒＥ２は天然では長いタンパク質であり、よって断片の使用は、例えば精製、取り扱い、融合、発現等にたいへん有益である。

【0134】

配列番号９は、配列番号８の有用な断片である（「ＳｄｒＥ２_{５３〜６３２}」）。この断片はＳｄｒＥ２の最も露出したドメインを包含し、工業規模でより容易に用いられる。これは抗原のヒトタンパク質との類似性も低減させる。

【0135】

ｓｄｒＣ
「ｓｄｒＣ」抗原は、「ｓｄｒＣタンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｓｄｒＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４４であり、アミノ酸配列の配列番号１０（ＧＩ：８８１９４３２４）を有する。

【0136】

有用なｓｄｒＣ抗原は、配列番号１０を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号１０に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＣタンパク質は、配列番号１０の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１０の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１０のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号１０の最後の３８個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号１０の最初の５０個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ＳｄｒＣは天然では長いタンパク質であり、よって断片の使用は、例えば精製、取り扱い、融合、発現等に有益である。

【0137】

配列番号１１は、配列番号１０の有用な断片である（「ＳｄｒＣ５_{１〜５１８}」）。この断片はＳｄｒＣの最も露出したドメインを包含し、工業規模でより容易に用いられる。これは抗原のヒトタンパク質との類似性も低減させる。

【0138】

ｓａｓＦ
「ｓａｓＦ」抗原は、「ｓａｓＦタンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｓａｓＦはＳＡＯＵＨＳＣ＿０２９８２であり、アミノ酸配列の配列番号１２（ＧＩ：８８１９６６０１）を有する。

【0139】

有用なｓａｓＦ抗原は、配列番号１２を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号１２に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓａｓＦタンパク質は、配列番号１２の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１２の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１２のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号１２の最後の３９個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号１２の最初の３７個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0140】

ｅｍｐ
「ｅｍｐ」抗原は、「細胞外マトリックスおよび血漿結合タンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｅｍｐはＳＡＯＵＨＳＣ＿００８１６であり、アミノ酸配列、配列番号１３（ＧＩ：８８１９４５７５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これはｎｗｍｎ＿０７５８（ＧＩ：１５１２２０９７０）である。

【0141】

有用なｅｍｐ抗原は、配列番号１３を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号１３に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｅｍｐタンパク質は、配列番号１３の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１３由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１３の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１３のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号１３の最初の２６個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0142】

配列番号１４、１５、１６および１７は、配列番号１３の有用な断片である（それぞれ「Ｅｍｐ_{３５〜３４０}」、「Ｅｍｐ_{２７〜３３４}」、「Ｅｍｐ_{３５〜３３４}」および「Ｅｍｐ_{２７〜１４７}」）。

【0143】

ｓｄｒＤ
「ｓｄｒＤ」抗原は、「ｓｄｒＤタンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｓｄｒＤはＳＡＯＵＨＳＣ＿００５４５であり、アミノ酸配列の配列番号１８（ＧＩ：８８１９４３２５）を有する。

【0144】

有用なｓｄｒＤ抗原は、配列番号１８を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号１８に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１８の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｄｒＤタンパク質は、配列番号１８の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１８由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号１８の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号１８のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号１８の最後の３８個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号１８の最初の５２個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ｓｄｒＤは天然では長いタンパク質であり、よって断片の使用は、例えば精製、取り扱い、融合、発現等にたいへん有益である。

【0145】

配列番号１９は、配列番号１８の有用な断片である（「ＳｄｒＤ_{５３〜５９２}」）。この断片は、ＳｄｒＤの最も露出したドメインを包含し、より容易に工業規模で用いられる。これはまた、抗原のヒトタンパク質との類似性を低下させる。同一Ｃ末端残基を有する別の有用な断片は、ＳｄｒＤ_{３９４〜５９２}（ＳｄｒＤ−Ｎ３としても公知；配列番号２０）である。

【0146】

ｓｐａ
「ｓｐａ」抗原は、「プロテインＡ」または「ＳｐＡ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｓｐａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０００６９であり、アミノ酸配列、配列番号２１（ＧＩ：８８１９３８８５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これはｎｗｍｎ＿００５５（ＧＩ：１５１２２０２６７）である。あらゆるＳ．ａｕｒｅｕｓ株は十分に特徴付けられたビルレンス因子であるｓｐａの構造遺伝子を発現し、その細胞壁アンカー型表面タンパク質産物はＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣと命名された５個の高度に相同な免疫グロブリン結合ドメインを有する［２３０］。これらのドメインは、アミノ酸レベルでほぼ８０％の同一性を提示し、５６〜６１残基の長さであり、縦列反復として組織化されている［２３１］。ＳｐＡは、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ソーティングシグナルを有する前駆体タンパク質として合成される［２３２、２３３］。細胞壁アンカー型ｓｐａは、ブドウ球菌表面上に非常に大量に提示される［２３４、２３５］。その各免疫グロブリン結合ドメインは、３個のヘリックス束へとアセンブルする逆平行α−ヘリックスで構成され、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメイン［２３６、２３７］、ＩｇＭのＶＨ３重鎖（Ｆａｂ）（すなわち、Ｂ細胞受容体）［２３８］、フォンヴィルブランド因子のＡ１ドメイン［２３９］および／またはＴＮＦ−α受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）［２４０］（気道上皮表面上に提示される）と結合することができる。

【0147】

有用なｓｐａ抗原は、配列番号２１を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２１に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２１の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｐａタンパク質は、配列番号２１の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２１由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２１の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２１のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号２１の最後の３５個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号２１の最初の３６個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。参考文献２４１は、個々のＩｇＧ結合ドメインが、単独でまたは組み合わせることによって有用な免疫原となり得ることを示唆する。

【0148】

配列番号２２は、配列番号２１の有用な断片である（「Ｓｐａ_{３７〜３２５}」）。この断片は、５個のＳｐＡ Ｉｇ結合ドメインを全て含有し、ＳｐＡの最も露出したドメインを包含する。これはまた、抗原のヒトタンパク質との類似性を低下させる。他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインのうち１、２、３または４個を省略することができる。参考文献２４１に報告されているように、他の有用な断片は、天然のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥドメインのうち１、２、３または４個のみを包含し得、例えば、ＳｐＡ（Ａ）ドメインのみを含み、Ｂ〜Ｅを含まないか、あるいはＳｐＡ（Ｄ）ドメインのみを含み、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥを含まない等である。よって、本発明に有用なｓｐａ抗原は、１、２、３、４または５個のＩｇＧ結合ドメインを包含することができるが、理想的には４個以下を有する。抗原が、１種類のｓｐａドメインのみ（例えば、Ｓｐａ（Ａ）またはＳｐＡ（Ｄ）ドメインのみ）を包含する場合、抗原は、このドメインを２コピー以上、例えば、単一ポリペプチド鎖において複数のＳｐＡ（Ｄ）ドメインを包含することができる。抗原内の個々のドメインは、配列番号２１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸が変異していてよい（例えば、ドメインＤの残基３および／または２４、ドメインＡの残基４６および／または５３等における変異を開示する参考文献２４１を参照）。このような変異体は、配列番号２１を認識する抗体を誘発する抗原の能力を除去してはならないが、ＩｇＧと結合する抗原の能力を除去することができる。ある態様では、ｓｐａ抗原は、（ａ）ＩｇＧ Ｆｃとの結合を破壊または減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＩｇＧ Ｆｃ結合サブドメインにおける１または複数のアミノ酸置換ならびに（ｂ）Ｖ_Ｈ３との結合を破壊または減少させる、ＳｐＡドメインＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄおよび／またはＥのＶ_Ｈ３結合サブドメインにおける１または複数のアミノ酸置換における置換を包含する。ある実施形態では、改変体ＳｐＡは、少なくともまたは多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の改変体ＳｐＡドメインＤペプチドを含む。

【0149】

ｅｓａＣ
「ｅｓａＣ」抗原は、「ｅｓａＣ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｅｓａＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６４であり、アミノ酸配列の配列番号２３（ＧＩ：８８１９４０６９）を有する。

【0150】

有用なｅｓａＣ抗原は、配列番号２３を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２３に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２３の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓａＣタンパク質は、配列番号２３の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２３由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２３の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２３のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0151】

ｅｓｘＡ
「ｅｓｘＡ」抗原は、「タンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｅｓｘＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２５７であり、アミノ酸配列の配列番号２４（ＧＩ：８８１９４０６３）を有する。

【0152】

有用なｅｓｘＡ抗原は、配列番号２４を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２４に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２４の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＡタンパク質は、配列番号２４の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２４由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２４の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２４のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0153】

ｅｓｘＢ
「ｅｓｘＢ」抗原は、「ｅｓｘＢ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｅｓｘＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿００２６５であり、アミノ酸配列の配列番号２５（ＧＩ：８８１９４０７０）を有する。

【0154】

有用なｅｓｘＢ抗原は、配列番号２５を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２５に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２５の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｅｓｘＢタンパク質は、配列番号２５の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２５由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２５の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２５のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0155】

ｓｔａ００６
「ｓｔａ００６」抗原は、「フェリクローム結合タンパク質」と注釈が付けられ、文献［２４２］において「ＦｈｕＤ２」とも言われた。ＮＣＴＣ８３２５株においてｓｔａ００６はＳＡＯＵＨＳＣ＿０２５５４であり、アミノ酸配列、配列番号２６（ＧＩ：８８１９６１９９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これはｎｗｍｎ＿２１８５（ＧＩ：１５１２２２３９７）である。

【0156】

有用なｓｔａ００６抗原は、配列番号２６を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２６に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２６の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ００６タンパク質は、配列番号２６の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２６由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２６の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２６のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号２６の最初の１７個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ｓｔａ００６の変異体型は、参考文献２４３に報告されている。ｓｔａ００６抗原は、例えば、アシル化Ｎ末端のシステインにより脂質付加されてよい。

【0157】

ｉｓｄＣ
「ｉｓｄＣ」抗原は、「タンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｉｓｄＣはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８２であり、アミノ酸配列の配列番号２７（ＧＩ：８８１９４８３０）を有する。

【0158】

有用なｉｓｄＣ抗原は、配列番号２７を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２７に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２７の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＣタンパク質は、配列番号２７の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２７由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２７の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２７のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号２７の最後の３９個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号２７の最初の２８個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ＩｓｄＢの有用な断片は、参考文献２４９に開示されている。

【0159】

参考文献２４４は、ＩｓｄＢおよびＩｓｄＨの両方に由来するエピトープを有用に包含する抗原を開示する。

【0160】

Ｈｌａ
「Ｈｌａ」抗原は、「アルファ毒素」または単に「溶血素」としても公知の「アルファ−溶血素前駆体」である。ＮＣＴＣ８３２５株においてＨｌａはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１１２１であり、アミノ酸配列、配列番号２８（ＧＩ：８８１９４８６５）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これはｎｗｍｎ＿１０７３（ＧＩ：１５１２２１２８５）である。Ｈｌａは、ポア形成および溶血活性を有する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの多くの株によって産生される重要なビルレンス決定基である。抗Ｈｌａ抗体は、動物モデルにおいて毒素の有害な影響を中和することができ、Ｈｌａは肺炎からの防御に特に有用である。

【0161】

有用なＨｌａ抗原は、配列番号２８を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号２８に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号２８の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのＨｌａタンパク質は、配列番号２８の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２８由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号２８の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号２８のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号２８の最初の２６個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。例えば、５０アミノ酸（配列番号２８の残基２７〜７６）のみを残したＣ末端における削除を用いることもできる［２４５］。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0162】

化学的不活性化により（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたは他の架橋試薬を用いた）本発明の組成物におけるＨｌａの毒性を回避することができる。しかし、その代わりとして、その免疫原性を保持しつつその毒性活性を除去したＨｌａの変異体型を用いることが好ましい。このような解毒化変異体は、既に本技術分野において公知のものである。有用なＨｌａ抗原の一型は、成熟抗原（すなわち、最初の２６個のＮ末端アミノ酸を省略した後）の残基３５である配列番号２８の残基６１に変異を有する。よって、残基６１はヒスチジンではなく、その代わりに例えばＩｌｅ、Ｖａｌまたは好ましくはＬｅｕであり得る。このポジションにおけるＨｉｓ−Ａｒｇ変異を用いることもできる。例えば、配列番号２９は成熟変異体Ｈｌａ−Ｈ３５Ｌ配列であり、有用なＨｌａ抗原は配列番号２９を含む。別の有用な変異は、長いループを短い配列に置き換える。例えば、配列番号２８の残基１３６〜１７４の３９ｍｅｒを配列番号３１（Ｈ３５Ｌ変異も包含する）および配列番号３２（Ｈ３５Ｌ変異を包含しない）におけるようなＰＳＧＳ（配列番号３０）等、４ｍｅｒに置き換える。

【0163】

さらに別の有用なＨｌａ抗原は、参考文献２４６および２４７に開示されている。

【0164】

配列番号３３、３４および３５は、配列番号２８の３個の有用な断片である（それぞれ「Ｈｌａ_{２７〜７６}」、「Ｈｌａ_{２７〜８９}」および「Ｈｌａ_{２７〜７９}」）。配列番号３６、３７および３８は、配列番号２９由来の対応する断片である。

【0165】

ｓｔａ０１１
「ｓｔａ０１１」抗原は、「リポタンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｓｔａ０１１はＳＡＯＵＨＳＣ＿０００５２であり、アミノ酸配列、配列番号３９（ＧＩ：８８１９３８７２）を有する。

【0166】

有用なｓｔａ０１１抗原は、配列番号３９を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号３９に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号３９の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０１１タンパク質は、配列番号３９の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３９由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号３９の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号３９のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号３９の最初の２３個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ｓｔａ００６抗原は、例えばアシル化Ｎ末端システインにより脂質付加されてよい。

【0167】

ｓｔａ０１１抗原の調製に用いることのできる配列番号３９の改変体型は、様々なＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ置換を有する配列番号４０、４１および４２を包含するが、これらに限定されるものではない。

【0168】

ｉｓｄＡ
「ｉｓｄＡ」抗原は、「ＩｓｄＡタンパク質」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株において、ｉｓｄＡはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０８１であり、アミノ酸配列の配列番号４３（ＧＩ：８８１９４８２９）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株においてはｎｗｍｎ＿１０４１（ＧＩ：１５１２２１２５３）である。

【0169】

有用なｉｓｄＡ抗原は、配列番号４３を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号４３に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４３の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＡタンパク質は、配列番号４３の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４３由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４３の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号４３のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号４３の最後の３８個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号４３の最初の４６個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号４３のＣ末端の３８ｍｅｒ（ＬＰＫＴＧモチーフから始まる）を除外するための削除も有用である。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0170】

配列番号４４は、天然タンパク質のヘム結合部位を包含し、抗原の最も露出したドメインを包含する、配列番号４３の有用な断片（配列番号４３のアミノ酸４０〜１８４；「ＩｓｄＡ_{４０〜１８４}」）である。これはまた、抗原のヒトタンパク質との類似性を低下させる。他の有用な断片は、参考文献２４８および２４９に開示されている。

【0171】

ＩｓｄＡは、水酸化アルミニウムアジュバントに十分に吸着されず、よって組成物中に存在するＩｓｄＡは、代替的アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されていないかまたは吸着されている可能性がある。

【0172】

ｉｓｄＢ
「ｉｓｄＢ」抗原は、「ニューロフィラメントタンパク質ｉｓｄＢ」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｉｓｄＢはＳＡＯＵＨＳＣ＿０１０７９であり、アミノ酸配列、配列番号４５（ＧＩ：８８１９４８２８）を有する。ＩｓｄＢは、そのままでワクチン抗原として使用することを提案された［２５０］が、これは肺炎を防止することができないだろう。

【0173】

有用なｉｓｄＢ抗原は、配列番号４５を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号４５に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４５の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｉｓｄＢタンパク質は、配列番号４５の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４５由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４５の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号４５のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号４５の最後の３６個のＣ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。配列番号４５の最初の４０個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。ＩｓｄＢの有用な断片、例えば配列番号４５の３７個の内部アミノ酸を欠く断片は、参考文献２４９および２５１に開示されている。

【0174】

一部の実施形態では、本発明の組成物はｉｓｄＢ抗原を包含しない。

【0175】

ｓｔａ０７３
「ｓｔａ０７３」抗原は、「二機能性自己溶菌酵素前駆体」と注釈が付けられている。ＮＣＴＣ８３２５株においてｓｔａ０７３はＳＡＯＵＨＳＣ＿００９９４であり、アミノ酸配列、配列番号４６（ＧＩ：８８１９４７５０）を有する。Ｎｅｗｍａｎ株において、これはｎｗｍｎ＿０９２２（ＧＩ：１５１２２１１３４）である。プロテオミクス分析は、このタンパク質が分泌されるかまたは表面に露出していることを明らかにした。

【0176】

有用なｓｔａ０７３抗原は、配列番号４６を認識する抗体（例えば、ヒトに投与される場合）を誘発することができ、および／または（ａ）配列番号４６に対し５０％以上（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％以上）の同一性を有し、かつ／または（ｂ）配列番号４６の少なくとも「ｎ」個の連続的アミノ酸の断片を含む（「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）である）アミノ酸配列を含み得る。これらのｓｔａ０７３タンパク質は、配列番号４６の改変体を包含する。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４６由来のエピトープを含む。他の好ましい断片は、配列番号４６の少なくとも１個のエピトープを保持しつつ、配列番号４６のＣ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。配列番号４６の最初の２４個のＮ末端アミノ酸は、有用に省略することができる。他の断片は、１または複数のタンパク質ドメインを省略する。

【0177】

Ｓｔａ０７３は、水酸化アルミニウムアジュバントに十分に吸着されず、よって組成物中に存在するＳｔａ０７３は、代替的アジュバント、例えばリン酸アルミニウムに吸着されていないかまたは吸着されている可能性がある。

【0178】

ハイブリッドポリペプチド
本発明に用いられるＳ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原は、それぞれ別個のポリペプチドとして組成物中に存在することができる。しかし２以上の抗原が用いられる場合、これらは別個のポリペプチドとして存在している必要はない。その代わりに、少なくとも２個の（例えば、２、３、４、５個以上の）抗原が、単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチド）として発現されてよい。ハイブリッドポリペプチドは、２点の主要な利点をもたらす。第一の利点は、そのままでは不安定あるいは発現が低くなり得るポリペプチドを、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって補助できることである。第二の利点は、どちらも抗原として有用な２個のポリペプチドの産生に単一の発現および精製のみが必要とされるため、商業的製造が単純化されることである。

【0179】

ハイブリッドポリペプチドは、上に列挙した抗原それぞれに由来する２以上のポリペプチド配列、あるいは配列が株間の部分的な可変性を有する場合は同一抗原の２以上の改変体を含むことができる。

【0180】

２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の抗原由来のアミノ酸配列からなるハイブリッドが有用である。特に、２または３個の抗原等、２、３、４または５個の抗原由来のアミノ酸配列からなるハイブリッドが好ましい。

【0181】

異なるハイブリッドポリペプチドは、単一処方物において一緒に混合することができる。ハイブリッドは、第一、第二または第三の抗原群から選択された非ハイブリッド抗原と組み合わせることができる。このような組合せのうち、抗原は、２以上のハイブリッドポリペプチドにおいて、および／または非ハイブリッドポリペプチドとして存在し得る。しかし、ある抗原はハイブリッドまたは非ハイブリッドのいずれかとして存在し、その両方としては存在しないことが好ましい。

【0182】

ハイブリッドポリペプチドは、式、ＮＨ_２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝_ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは上述のＳ．ａｕｒｅｕｓ抗原のアミノ酸配列であり、Ｌは任意選択的なリンカーアミノ酸配列であり、Ａは任意選択的なＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは任意選択的なＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは２以上の（例えば、２、３、４、５、６等）整数である）によって表すことができる。通例、ｎは２または３である。

【0183】

−Ｘ−部分が野生型形態のリーダーペプチド配列を有する場合、これはハイブリッドタンパク質において包含されても省略されてもよい。一部の実施形態では、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のもの以外は欠失させられる。すなわち、Ｘ_１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ_２…Ｘ_ｎのリーダーペプチドは省略される。これは、全リーダーペプチドを欠失してＸ_１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として用いることに相当する。

【0184】

｛−Ｘ−Ｌ−｝の各ｎ例につき、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもしなくてもよい。例えば、ｎ＝２の場合、ハイブリッドは、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｌ_１−Ｘ_２−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｌ_２−ＣＯＯＨ等であり得る。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、通常は短い（例えば、２０以下のアミノ酸、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。具体例として、クローニングを促進する短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙ_ｎ（式中、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上である）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上である））が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者であれば明らかとなるであろう。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号４７）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号４８）であり、これは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されるためにクローニングおよび操作を補助する。（Ｇｌｙ）_４テトラペプチドが通常のポリグリシンリンカーである。他の適切なリンカー、特に最後のＬ_ｎとしての使用に適切なリンカーは、ＡＳＧＧＧＳ（配列番号４９、例えば、配列番号５０にコードされる）またはＬｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。

【0185】

−Ａ−は、任意選択的なＮ末端アミノ酸配列である。これは通常は短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。具体例として、タンパク質輸送を導くリーダー配列、またはクローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上である））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者であれば明らかとなるであろう。Ｘ_１がそれ自身のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくはＮ末端メチオニン、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一のＭｅｔ残基を提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）である。

【0186】

−Ｂ−は、任意選択的なＣ末端アミノ酸配列である。これは通常は短い（例えば、４０以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。具体例として、タンパク質輸送を導く配列、クローニングまたは精製を促進する短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち配列番号５１等、Ｈｉｓ_ｎ（式中、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上である）を含む）、またはタンパク質の安定性を増強する配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者であれば明らかとなるであろう。

【0187】

本発明のハイブリッドポリペプチドの一型は、ＥｓｘＡ抗原およびＥｓｘＢ抗原の両方を包含することができる。これらは、ＮからＣ末端に向けていずれの順序であってもよい。配列番号５２（「ＥｓｘＡＢ」；配列番号５３にコードされる）および５４（「ＥｓｘＢＡ」）は、両者ともにヘキサペプチドリンカーＡＳＧＧＧＳ（配列番号４９）を有するこのようなハイブリッドの具体例である。

【0188】

一般
本発明の実施は、他に断りがなければ、当業者の技能範囲内である従来の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学的方法を利用する。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、参考文献２５２〜２５９等を参照されたい。

【0189】

「ＧＩ」ナンバリングが上に用いられている。ＧＩナンバーまたは「ＧｅｎＩｎｆｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」は、配列がそのデータベースに加えられる際に、ＮＣＢＩによって処理された各配列記録に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩナンバーは、配列記録のアクセッション番号との類似点を生じない。配列がアップデートされると（例えば、訂正またはさらなるアノテーションもしくは情報を加えるため）、配列は新規のＧＩナンバーを付与される。よって、所定のＧＩナンバーに関連する配列は決して変化しない。

【0190】

２種のアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性の言及は、整列されると、該アミノ酸パーセンテージが２配列の比較において同一であることを意味する。このアライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、本技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献２６０の第７．７．１８節に記載されているプログラムを用いて決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップ開始（ｏｐｅｎ）ペナルティー１２およびギャップ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティー２、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２によるアフィンギャップ検索を用いたスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）相同性検索アルゴリズムによって決定される。スミス−ウォーターマン相同性検索アルゴリズムは、参考文献２６１に開示されている。

【0191】

本発明が「エピトープ」に関係する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。このようなエピトープは、経験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［２６２、２６３］または同様の方法を用いて）同定することができるか、あるいはこれらは予測することができる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原指数［２６４］、マトリックスに基づくアプローチ［２６５］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［２６６］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２６７、２６８］、ニューラルネットワーク［２６９］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２７０、２７１］、ＡＤＥＰＴ［２７２］、Ｔｓｉｔｅｓ［２７３］、親水性［２７４］、抗原指数［２７５］または参考文献２７６〜２８０に開示されている方法等を用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位により認識されて結合される抗原の一部であり、「抗原決定基」と言うこともできる。

【0192】

抗原の「ドメイン」が省略される場合、これは、シグナルペプチド、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン等の省略に関与し得る。

【0193】

用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と共に「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから排他的になることも、あるいは追加的なものを包含することもできる（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0194】

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

【0195】

単語「実質的に」は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含有しない」組成物は、Ｙを完全に含有しなくてよい。必要であれば、単語「実質的に」は、本発明の定義から省略することができる。

【0196】

本発明が、複数の逐次的な工程を含むプロセスを提供する場合、本発明は、その合計数より少ない工程を含むプロセスを提供することもできる。例えば、本発明は、（ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型または８型莢膜多糖を解重合して、多糖断片を得る工程と、（ｂ）該断片における少なくとも１個の糖残基にアルデヒド基を導入するために該断片を酸化して、酸化された糖残基を得る工程とを含むプロセスを提供する。工程（ａ）および（ｂ）の産物は結合体調製における中間体としての有用性があり、分離および後の使用のために使用、保存、搬出等することができるため、さらなる工程（ｃ）は、本発明の範囲内とするために実行する必要はない。このような後の使用は、工程（ｃ）の実行に関与し得る。あるいは、工程（ａ）および（ｂ）の産物は、異なる方法で、例えば、酸化された糖残基において保持されているヒドロキシルまたはカルボキシル基を介してキャリア分子とカップリングすることができる。

【0197】

同様に、出発多糖材料が既に部分的に加工されている場合、本発明は、ある方法における後期の工程のみを含むプロセスを包含する。例えば、本発明は、５型または８型莢膜多糖における酸化された糖残基を、アルデヒド基を介してキャリア分子へとカップリングする工程を含むプロセスを包含し、ここで、このプロセスの出発材料は予め解重合されて多糖断片を生じ、次に酸化されて糖残基にアルデヒド基が導入された５型または８型莢膜多糖である。

【0198】

これらの様々な工程は、非常に様々な期間に、様々な人間により、様々な場所で（例えば、様々な国々で）実行することができる。

【0199】

糖環が開環または閉環型で存在し得ること、また、本明細書における構造式では閉環型が示されているが、開環型も本発明に包含されることが理解されるであろう。同様に、糖がピラノースおよびフラノース型で存在し得ること、また、本明細書における構造式ではピラノース型が示されているが、フラノース型も包含されていることが理解されるであろう。糖の様々なアノマー型も包含されている。

【0200】

一級アミンは、式、ＮＨ_２Ｒによって表すことができる。Ｒ基は通常、電子供与性であり、Ｃ_１−８ヒドロカルビル、特にＣ_１−８アルキル、特別にはメチルを包含する。Ｒは、多くの場合、−ＣＨ_３、−Ｃ_２Ｈ_５または−Ｃ_３Ｈ_７である。ヒドロカルビルは、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ）、トリハロメチル、−ＮＯ_２、−ＣＮ、−Ｎ^＋（Ｃ_１−６アルキル）_２Ｏ⁻、−ＳＯ_３Ｈ、−ＳＯＣ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_３Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＣ_１−６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−ＣＯ_２Ｈ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−ＣＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）ＳＯ_２Ｃ_１−６アルキル、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−ＮＨ−Ｃ_１−６アルキル、−Ｓ−Ｃ_１−６アルキルまたは−Ｏ−Ｃ_１−６アルキル等、１または複数の基により置換されてよい。用語「ヒドロカルビル」は、炭素および水素からなる直鎖、分岐または環状一価基を包含する。よって、ヒドロカルビル基は、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基、シクロアルキル（ポリシクロアルキルを包含する）、シクロアルケニルおよびアリール基ならびにそれらの組合せ、例えば、アルキルシクロアルキル、アルキルポリシクロアルキル、アルキルアリール、アルケニルアリール、シクロアルキルアリール、シクロアルケニルアリール、シクロアルキルアルキル、ポリシクロアルキルアルキル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールシクロアルキルおよびアリールシクロアルケニル基を包含する。通常のヒドロカルビルは、Ｃ_１−１４ヒドロカルビル、より具体的にはＣ_１−８ヒドロカルビルである。

【図面の簡単な説明】

【0201】

【図1】図１は、アジピン酸ジヒドラジンリンカーおよびカルボジイミド化学を用いてＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体を作製するための模式図を示す。

【図2】図２ａは、アジピン酸ジヒドラジンリンカーおよびカルボジイミド化学を用いて作製したＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図２ｂは、アジピン酸ジヒドラジンリンカーおよびカルボジイミド化学を用いて作製したＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭクロマトグラムを示す。

【図3】図３は、解重合された５型莢膜多糖のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭクロマトグラムを示す。

【図4A】図４Ａは、解重合された５型莢膜多糖と天然の５型莢膜多糖の^１Ｈアノマー領域における１Ｄ ^１Ｈシグナルを比較する。数個の顕著な差異がマークされている。

【図4B】図４Ｂおよび図４Ｃは、これら多糖についての２Ｄ（^１Ｈ，^１Ｈ）スカラーカップリングスペクトルのアノマー領域およびメチル−フコース領域をそれぞれ比較する。数個の顕著な差異がマークされている。

【図4C】図４Ｂおよび図４Ｃは、これら多糖についての２Ｄ（^１Ｈ，^１Ｈ）スカラーカップリングスペクトルのアノマー領域およびメチル−フコース領域をそれぞれ比較する。数個の顕著な差異がマークされている。

【図5】図５ａは、本発明の方法を用いて作製されたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図５ｂは、本発明の方法を用いて作製されたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭクロマトグラムを示す。

【図6】図６は、様々な条件下で解重合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖のＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭクロマトグラムを示す。

【図7】図７は、本発明の方法を用いて作製されたＳ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖−ＣＲＭ１９７結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【図8】図８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のマウス腎臓膿瘍モデルにおける様々な抗原に対するＩｇＧ応答を示す。

【図9】図９は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける様々な抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＭ応答を比較する。

【図10】図１０は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける様々な抗原に対する防御反応を示す。

【図11】図１１は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける異なる結合体に対するＩｇＧ応答を比較する。

【図12】図１２は、マウス腎臓膿瘍モデルにおける異なる結合体に対する防御反応を比較する。

【図13A】図１３Ａおよび図１３Ｂは、マウス腎臓膿瘍モデルにおけるさらに別の結合体に対する防御反応を比較する。

【図13B】図１３Ａおよび図１３Ｂは、マウス腎臓膿瘍モデルにおけるさらに別の結合体に対する防御反応を比較する。

【図14】図１４は、マウス腎臓膿瘍モデルにおけるさらに別の結合体に対するＩｇＧ応答およびＩｇＭ応答を比較する。

【図15】図１５は、マウス腎臓膿瘍モデルにおいて異なる作用物質をアジュバントとした場合の、さらに別の結合体に対する防御反応を比較する。

【図16】図１６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染のマウス致死モデルにおける様々な抗原に対する応答を比較する。

【図17】図１７は、２Ｍ塩酸により解重合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図18】図１８は、２Ｍ塩酸により解重合されたＳ．ａｕｒｅｕｓ８型莢膜多糖のＮＭＲスペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0202】

結合体産生および特徴づけ
参考文献２（下を参照）において用いられている方法と同様にカルボジイミド化学およびアジピン酸ジヒドラジンリンカーを用いて、精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型莢膜多糖をＣＲＭ１９７と結合体化した。この方法において、莢膜多糖は、ＥＤＣを用いて誘導体化ＣＲＭ１９７と結合体化される（図１）。反応は、莢膜多糖のカルボキシル基に関与する。カルボジイミド（ＥＤＣ）は、カルボキシル基を活性化して誘導体化キャリアタンパク質（ＣＲＭａｄｈ）由来の−ＮＨ_２基と結合させ、アミド結合を形成する。誘導体化ＣＲＭａｄｈは、同じカルボジイミド化学を用いて調製される。

【0203】

ＣＲＭａｄｈ調製：
ＣＲＭ１９７の溶液に、終濃度１０〜１２ｍｇ／ｍｌとなるよう１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０バッファーを添加した。次に、３．５ｍｇ／ｍｌのＡＤＨ（アジピン酸ジヒドラジド）および０．１５（ＥＤＣ／ＣＲＭ、ｗ／ｗ）を添加し、穏やかな撹拌下、１時間ＲＴにて反応を維持した。次に、６〜８ｋＤａメンブレン（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を用いて、先ず２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．３バッファーに対し、次に５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ７．０バッファーに対して混合物を透析した。ＭｉｃｒｏＢＣＡ、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（３〜８％）、ＨＰＬＣおよびＭＳによって産物を特徴付けた。ＣＲＭａｄｈは、ＡＤＨの６〜８リンカーにより誘導体化されることが判明した。

【0204】

結合体化反応：
５０ｍＭ ＭＥＳバッファーｐＨ６．０４中、２ｍｇ／ｍＬの莢膜多糖濃度で結合体化反応を行った。莢膜多糖の溶液に終濃度４．０ｍｇ／ｍｌとなるよう誘導体化キャリアタンパク質、ＣＲＭａｄｈを添加した。溶液をＲＴにて３時間維持した。反応混合液中の多糖：タンパク質比は１：２（重量／重量）であり、多糖：ＥＤＣ比は１：６．６６（当量／当量）であり、多糖：スルホＮＨＳ比は１：０．５３（当量／当量）であった。

【0205】

３時間後、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）３〜８％Ｔｒｉｓ−酢酸ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより結合体の形成を立証した（図２ａ）。結合体化の後、ゲル濾過クロマトグラフィー（１０ｍＭ ＮａＰｉ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２移動相バッファーによるＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭレジン（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＡｋｔａ^ＴＭシステム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行う）により結合体を精製した。２１５ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにて結合体を検出した（図２ｂ）。さらなる使用まで結合体溶液を−２０℃で保存した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により結合体における全糖を決定し、参考文献２８１に記載されている通りＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイによりタンパク質含量を決定した（表１）。

【0206】

【表1】

精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖を別個に、本発明の方法を用いてＣＲＭ１９７と結合体化した（下を参照）。

【0207】

解重合
精製莢膜多糖を２ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解した。終濃度２％（ｖ／ｖ）となるよう酢酸を添加し、反応を９０℃、３時間（またはロットＢの場合は一晩）維持した。次に、溶液を１Ｍ ＮａＯＨで中和し、解重合した多糖をゲル濾過カラムにおいて（１０ｍＭ ＮａＰｉ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２移動相バッファーによるＳ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭレジン（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＡｋｔａ^ＴＭシステム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行う）精製した。２１５ｎｍにて糖を検出した（図３）。１ｋＤａメンブレン（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を用いて、プールした画分を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。

【0208】

^１Ｈ ＮＭＲを用いて、切断の部位が５型多糖中の（１→３）グリコシド結合であることを立証した。簡単に言うと、天然および解重合した５型莢膜多糖の試料を凍結乾燥し、プロトン化水溶媒を取り除き、重水（９９．９％重水素、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。５ｍｍ広帯域プローブならびにデータ取得および加工のためのＴｏｐＳｐｉｎ２．１ソフトウェアパッケージ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いてＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ
ＩＩＩ ４００ＭＨｚ分光計において全ＮＭＲスペクトルを５０℃で記録（ｒｅｃｏｄｅｄ）した。１Ｄ ^１Ｈスペクトルを、４，０００Ｈｚのスペクトル幅にわたり、３２ｋデータポイントを収集する標準ワンパルス（ｏｎｅ−ｐｕｌｓｅ）実験を用いて収集した。トランスミッタを残留ＨＤＯ周波数（４．７９ｐｐｍ）に設定した。全リサイクル時間を用いた定量的な様式でスペクトルを得て、各シグナルの完全なリカバリーを確実にした（５×Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ Ｔ１）。０．２Ｈｚラインブロードニング関数（ｌｉｎｅ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を適用した後、スペクトルをフーリエ変換した。ＤＱＦ−ＣＯＳＹパルスシーケンスにより２Ｄ（^１Ｈ，^１Ｈ）スカラー相関スペクトルを記録した。Ｆ２ドメインにおいて４０９６個のデータポイントを収集し、Ｆ１ドメインにおいて２５６個を収集した。

【0209】

天然の多糖の１Ｄ ^１Ｈシグナルを公表された値と比較したところ、合致していることが判明した（表２）。

【0210】

【表2-1】

【0211】

【表2-2】

図４Ａは、解重合型および天然型の多糖の^１Ｈアノマー領域における１Ｄ ^１Ｈシグナルを比較する。図４Ｂおよび４Ｃは、これら多糖についての２Ｄ（^１Ｈ，^１Ｈ）スカラーカップリングスペクトルのアノマー領域およびメチル−フコース領域をそれぞれ比較する。データは、酢酸処理が、５型莢膜多糖におけるα−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ（３ＯＡｃ）残基とβ−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ残基との間の（１→３）グリコシド結合の切断をもたらすことを示す。

【0212】

酸化
解重合された莢膜多糖を２ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解した。多糖：ＮａＩＯ_４比が１：１（重量／重量）となるようＮａＩＯ_４を添加し、室温で１〜２時間、暗所にて反応を維持した。次に、１ｋＤａメンブレン（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を用いて溶液を蒸留水に対して透析し、再度凍結乾燥した。

【0213】

結合体化
酸化された莢膜多糖を１０ｍｇ／ｍＬ濃度となるよう２００ｍＭ ＮａＰｉ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２バッファーに溶解した。溶液に多糖：タンパク質比が４：１（重量／重量）となるようＣＲＭ１９７を添加し、糖：ＮａＢＣＮＨ_３比が２：１（重量／重量）となるようＮａＢＨ_３ＣＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。溶液を３７℃で２日間維持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて結合体の形成を確認した（５型結合体に関して図５ａを参照）。結合体化の後、ゲル濾過クロマトグラフィー（１０ｍＭ ＮａＰｉ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２移動相バッファーにより、Ｓ３００ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^ＴＭレジン（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＡｋｔａ^ＴＭシステム（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において行う）により結合体を精製した。２１５ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍにて結合体を検出した（５型結合体に関して図５ｂを参照）。さらなる使用まで結合体溶液を−２０℃で保存した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により結合体における全糖を決定し、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイによりタンパク質含量を決定した（５型結合体に関して表３ａ、８型結合体に関して表３ｂを参照）。

【0214】

【表3a】

【0215】

【表3b】

本発明の別の方法を用いて、精製Ｓ．ａｕｒｅｕｓ５型をＣＲＭ１９７に結合体化した。この方法において、解重合、酸化および結合体化工程は、ＣＲＭ１９７の代わりに上述の誘導体化キャリアタンパク質（ＣＲＭａｄｈ）を用いて結合体化工程を行ったこと以外は上述の通りに行った。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により結合体における全糖を決定し、ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイによりタンパク質含量を決定した（表４）。

【0216】

【表4】

代替的解重合方法
他の研究において、精製莢膜多糖の解重合に対して異なる条件を試験した。多糖を２ｍｇ／ｍＬとなるよう蒸留水に溶解した。終濃度２％または５％（ｖ／ｖ）となるよう酢酸を添加し、反応を９０℃で３０分間、３時間、５時間または６時間維持した。次に溶液を中和し、上述のゲル濾過カラムにおいて精製した。２１５ｎｍにて糖を検出し、プールした（図６）。

【0217】

次に、プールした画分を酸化し、上述の通り水に対して透析した。画分を上述の通りＣＲＭ１９７またはＣＲＭａｄｈと結合体化し、その結果得られた結合体を同様に上述の通りにゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した（図７）。

【0218】

別の研究において、８型莢膜多糖に対して酢酸の代わりに０．５Ｍの塩酸を用い、反応液を３０分毎にサンプリングしつつ、９０℃で２．５時間維持した。ＮＭＲおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣにより試料を分析した。解重合は観察されず、Ｏ−アセチル化のレベルは殆ど変化しなかった。対照的に、２Ｍの塩酸を用いて反応を１００℃で維持した場合、解重合は僅か３０分後に観察された。Ｏ−アセチル化のレベルは２．５時間かけて徐々に低減した（図１７および１８（アセチルピークを丸で囲む））。

【0219】

免疫化研究−膿瘍モデル（１）
全般的なアッセイのプロトコール：後述される計画に従ってマウスを免疫化し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌懸濁物の静脈内注射によってチャレンジした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物を遠心分離し、２回洗浄し、チャレンジ前にＰＢＳに希釈した。所望の接種にはさらなる希釈が必要とされ、これは寒天プレーティングおよびコロニー形成によって実験的に立証された。器官採取のためマウスを安楽死させ、その腎臓を取り出して１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００中でホモジナイズした。次に、アリコートを希釈し、寒天培地上にプレーティングし、３連でＣＦＵを決定した。組織学のため、腎臓組織を室温、１０％ホルマリン中で２４時間インキュベートした。組織をパラフィンに包埋し、薄切片を作製し、ヘマトキシリン／エオシン染色して顕微鏡で検査した。

【0220】

３週齢のＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の５μｇ用量の抗原を用いた腹腔内注射により０および１１日目に免疫化した。０および２０日目にマウスから採血し、２１日目にＳ．ａｕｒｅｕｓでチャレンジした。２５日目に器官を採取した。次のスキームに従い８匹のマウス群において免疫化を行った。

【0221】

群１−アラム（ａｌｕｍ）単独
群２−５型莢膜多糖単独
群３−５型莢膜多糖とアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット１）
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット１）とアラム。

【0222】

結合体は、５型多糖に対し特異的なＩｇＧ応答を誘導した。アラム処方物は応答を改善した（図８）。結合体は、５型多糖に対し特異的なＩｇＭ応答も誘導した（図９）。アラム結合体処方物はまた、腎感染症からの最良の防御をもたらした（図１０）。

【0223】

免疫化研究−膿瘍モデル（２）
３週齢のＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の５μｇ用量の抗原を用いた腹腔内注射により１、１４および２８日目に免疫化した。マウスから０、２７および３７日目に採血し、３８日目にＳ．ａｕｒｅｕｓでチャレンジした。４２日目に器官を採取した。次のスキームに従い８匹のマウス群において免疫化を行った。

【0224】

群１−アラム単独
群２−５型莢膜多糖とアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット２）とアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロットＡ’）とアラム。

【0225】

結合体は、５型多糖に対する特異的なＩｇＧ応答を誘導した。本発明の結合体（ロットＡ’で表す）は、特に高い力価を生じた（図１１）。本発明の結合体は、腎感染症からの最良の防御をもたらした（図１２）。

【0226】

免疫化研究−膿瘍モデル（３）
３週齢のＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の５μｇ用量（またはロットＡの場合は０．５μｇ用量）の抗原を用いた腹腔内注射により１、１４および２８日目に免疫化した。０、２７および３７日目にマウスから採血し、３８日目にＳ．ａｕｒｅｕｓ（液体または固体培地において増殖）でチャレンジした。４２日目に器官を採取した。次のスキームに従い８匹のマウス群において免疫化を行った。

【0227】

群１−アラム単独
群２−５型莢膜多糖とアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット２）とアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット３）とアラム
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロットＡ’）とアラム
群６−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＡ）とアラム
群７−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＢ）とアラム。

【0228】

本発明の結合体（ロットＡ’、ＡおよびＢで表す）は、腎感染症からの防御をもたらした（図１３Ａおよび１３Ｂ）。本発明の結合体は、ＩｇＭ抗体の低い力価をもたらしつつ特異的なＩｇＧ抗体の高い力価をもたらした（図１４）。

【0229】

免疫化研究−膿瘍モデル（４）
３週齢のＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の１μｇ用量の抗原を用いた腹腔内注射により１および１４日目に免疫化した。０、１３および２７日目にマウスから採血し、２８日目にＳ．ａｕｒｅｕｓでチャレンジした。３２日目に器官を採取した。次のスキームに従い８または９匹のマウス群において免疫化を行った。

【0230】

群１−８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットα）とアラム
群２−８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットα）とＭＦ５９
群３−アラム単独
群４−ＭＦ５９単独。

【0231】

本発明の結合体は、腎感染症からの防御をもたらした（図１５）。アラム処方物は、ＭＦ５９処方物よりも良好な防御をもたらした。

【0232】

免疫化研究−致死モデル（１）
全般的なアッセイのプロトコール：後述される計画に従ってマウスを免疫化し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの細菌懸濁物の腹腔内注射によりチャレンジした。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの培養物を遠心分離し、２回洗浄し、チャレンジ前にＰＢＳに希釈した。所望の接種にはさらなる希釈が必要とされ、これは寒天プレーティングおよびコロニー形成によって実験的に立証された。動物を１４日間モニターし、致死性の疾患を記録した。

【0233】

ＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の５μｇ用量の抗原を用いた腹腔内注射により免疫化した。５×１０^８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓによるチャレンジ前に、次のスキームに従い１２匹のマウス群において免疫化を行った。

【0234】

群１−ＰＢＳとアラム
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＣ）とアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット３）とアラム。

【0235】

本発明の結合体（ロットＣで表す）は、より高い生存率をもたらした（図１６）。

【0236】

免疫化研究−致死モデル（２）
ＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の２μｇ（糖）および１０μ（タンパク質、必要に応じて存在）用量の抗原を用いた腹腔内注射により免疫化した。５×１０^８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓによるチャレンジ前に、次のスキームに従い１２匹のマウス群において免疫化を行った。

【0237】

群１−ＰＢＳとアラム
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＤ）とアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭａｄｈ結合体（ロット４）とアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＤ）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＤ）とＨｌａＨ３５Ｌ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム。

【0238】

生存率データを表５に提示する。

【0239】

【表5】

本発明の結合体（ロットＤで表す）は、より高い生存率をもたらした。生存率は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓタンパク質抗原の付加によって増強された。

【0240】

免疫化研究−致死モデル（３）
ＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の２μｇ（５型多糖）、１μｇ（８型多糖、必要に応じて存在）および１０μ（タンパク質、必要に応じて存在）用量の抗原を用いた腹腔内注射により免疫化した。５×１０^８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓによるチャレンジ前に、次のスキームに従い１２匹のマウス群において免疫化を行った。

【0241】

群１−ＰＢＳとアラム
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットβ）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットβ）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ０１１およびＳｔａ０７３タンパク質ならびにアラム。

【0242】

生存率データを表７に提示する。

【0243】

【表7】

免疫化研究−致死モデル（４）
ＣＤ１マウスを、注射容積２００μｌ中の２μｇ（５型莢膜多糖）、１μｇ（８型莢膜多糖、必要に応じて存在）および１０μ（タンパク質、必要に応じて存在）用量の抗原を用いた腹腔内注射により免疫化した。５×１０^８ＣＦＵの５型Ｓ．ａｕｒｅｕｓによるチャレンジ前に、次のスキームに従い１２匹のマウス群において免疫化を行った。

【0244】

群１−ＰＢＳとアラム
群２−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とＥｓｘＡＢ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群３−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とアラム
群４−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とＥｓｘＡＢタンパク質およびアラム
群５−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とＳｔａ００６タンパク質およびアラム
群６−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とＳｔａ０１１タンパク質およびアラム
群７−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）および８型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットγ第一の用量、ロットδ第二の用量）とＳｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群８−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）とＨｌａＨ３５Ｌ、Ｓｔａ００６およびＳｔａ０１１タンパク質ならびにアラム
群９−５型莢膜多糖−ＣＲＭ結合体（ロットＥ）とＨｌａＨ３５Ｌタンパク質およびアラム。

【0245】

生存率データを表８に提示する。

【0246】

【表8】

本発明は単なる具体例として記載されており、本発明の範囲および精神から逸脱することなく改変できることが理解されるであろう。

【0247】

【数1】

【0248】

【数2】

【0249】

【数3】

【0250】

【数4】

【0251】

【数5】

【0252】

【数6】

【0253】

【数7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]