特許 6276479 新規プロモーター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6276479

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】新規プロモーター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180129BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180129BHJP

   C12P 7/42 20060101ALI20180129BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P7/42

【請求項の数】13

【全頁数】19

(21)【出願番号】特願2017-532523(P2017-532523)

(86)(22)【出願日】2016年7月27日

(86)【国際出願番号】JP2016071970

(87)【国際公開番号】WO2017022583

(87)【国際公開日】20170209

【審査請求日】2017年9月20日

(31)【優先権主張番号】特願2015-155759(P2015-155759)

(32)【優先日】2015年8月6日

(33)【優先権主張国】JP

(31)【優先権主張番号】特願2015-201180(P2015-201180)

(32)【優先日】2015年10月9日

(33)【優先権主張国】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000000918

【氏名又は名称】花王株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金田 実郎

(72)【発明者】

【氏名】壺井 雄一

(72)【発明者】

【氏名】高橋 史員

【審査官】 福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２４６５６０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００１／０７２９６７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１０２６３６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列において、１個以上５個以下の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。

【請求項2】

請求項１記載のプロモーターを含む発現ベクター。

【請求項3】

前記プロモーターが、目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子の上流に連結されている、請求項２記載の発現ベクター。

【請求項4】

前記目的物質が有機酸であり、かつ前記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項３記載のベクター。

【請求項5】

目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された請求項１記載のプロモーターとを含む、ＤＮＡ断片。

【請求項6】

前記目的物質が有機酸であり、かつ前記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項５記載のＤＮＡ断片。

【請求項7】

請求項２〜４のいずれか１項記載の発現ベクター又は請求項５又は６記載のＤＮＡ断片を含む形質転換体。

【請求項8】

糸状菌である、請求項７記載の形質転換体。

【請求項9】

前記糸状菌が、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌である、請求項８記載の形質転換体。

【請求項10】

前記糸状菌がＲｈｉｚｏｐｕｓ属菌である、請求項９記載の形質転換体。

【請求項11】

目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と該遺伝子の上流に連結された請求項１記載のプロモーターとを含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換体を培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。

【請求項12】

前記形質転換体が糸状菌である、請求項１１記載の製造方法。

【請求項13】

前記目的物質が有機酸であり、かつ前記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、請求項１１又は１２記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規プロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター及び形質転換体、ならびに該形質転換体を用いた目的物質の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、化学合成法のみならず、生物や酵素を用いた物質合成が工業的レベルで行われるようになってきている。生物や酵素による物質合成は、化学合成法と比較して合成時のエネルギーの低減を可能とし、また光学異性体を有する化合物のうち特定の構造に特化した合成を可能にする。一方、微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。従来、微生物の物質生産性を向上させるための手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学及びバイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な微生物学的な有用物質生産が注目されている。

【0003】

糸状菌であるリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）は、これまでに、乳酸生産に使用できる微生物として開示されている（特許文献１〜３）。しかしながら、リゾプス属菌では、遺伝学的背景が明らかではなかったこと、分子遺伝学的手法の導入が遅れたこと、多核細胞であるがゆえにモノクローナルな系統の単離、維持に困難が予想されることなどから、遺伝子組換え技術等に関する研究例は少ない。リゾプス属菌における遺伝子の転写に必要なプロモーターとして、ｌｄｈＡプロモーター（特許文献１、非特許文献１）、ｐｇｋ１プロモーター（特許文献２、非特許文献２）、ｐｇｋ２プロモーター（特許文献３）、ｐｄｃＡ及びａｍｙＡプロモーター（非特許文献２）、ｔｅｆ及び１８ＳｒＲＮＡプロモーター（特許文献４）などが報告されているが、これらプロモーターの発現強度は必ずしも包括的に調べられておらず、工業的な生産における生産コストの低減化のためには、更なる高い生産性を実現するプロモーター及び微生物が求められている。
（特許文献１）米国特許第６２６８１８９号明細書
（特許文献２）国際公開第２００１／７３０８３号
（特許文献３）国際公開第２００１／７２９６７号
（特許文献４）米国特許出願公開第２０１０／１１２６５１号明細書
（非特許文献１）Applied Microbiology and Biotechnology (2004) vol.64:237-242
（非特許文献２）Archives of Microbiology (2006) vol.186:41-50

【発明の概要】

【0004】

一態様において、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ;及び
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、
を提供する。

【0005】

別の一態様において、本発明は、上記プロモーターを含む発現ベクターを提供する。

【0006】

別の一態様において、本発明は、目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された上記プロモーターとを含むＤＮＡ断片を提供する。

【0007】

別の一態様において、本発明は、上記発現ベクター又はＤＮＡ断片を含む形質転換体を提供する。

【0008】

さらなる一態様において、本発明は、上記形質転換体を培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む目的物質の製造方法を提供する。

【発明の詳細な説明】

【0009】

本明細書において、塩基配列の同一性とは、比較する２つの塩基配列を必要に応じて間隙を導入して整列（アラインメント）させて得られる最大の塩基配列の同一性（％）をいう。本発明において、塩基配列およびアミノ酸配列の配列同一性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５−１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

【0010】

本明細書において、「プロモーター活性」とは、ＤＮＡ（遺伝子）のｍＲＮＡへの転写を促進する活性を意味する。プロモーター活性は、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することができる。例えば、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、などが挙げられる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲ等で測定することによっても確認することができる。

【0011】

本明細書において、微生物の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該微生物の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該微生物に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、ある微生物に外部から導入された遺伝子は、外来遺伝子である。外来遺伝子は、それが導入された微生物と同種の微生物由来の遺伝子であっても、異種の生物由来の遺伝子（異種遺伝子）であってもよい。

【0012】

本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。また本明細書において、プロモーターと遺伝子との「作動可能な連結」とは、該プロモーターが該遺伝子の転写を誘導し得るように連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

【0013】

本発明は、新規プロモーター、該プロモーターを含有する発現ベクター及び形質転換体、ならびに該形質転換体を用いた目的物質の製造方法の提供に関する。

【0014】

本発明者らは、糸状菌由来のプロモーターについて検討したところ、高い転写活性を有する新規なプロモーターを見出した。

【0015】

本発明のプロモーターは、転写活性が高く、制御対象とする遺伝子の転写量を顕著に向上させることができる。本発明のプロモーターによれば、目的物質の微生物学的製造の効率を向上させることができる。

【0016】

一実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡである。別の一実施形態において、本発明のプロモーターは、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡと実質的に同一の塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡを包含する。好ましくは、本発明のプロモーターは、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡのプロモーター活性に対して、１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上のプロモーター活性を有する。

【0017】

本発明のプロモーターの例としては、以下の（ａ）〜（ｄ）で規定されるＤＮＡからなるプロモーターが挙げられる。
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ

【0018】

上記（ａ）の、配列番号１〜３で示される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属由来のプロモーターである。配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）をコードする遺伝子であるａｄｈ１のプロモーターである。配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ由来のコンカナマイシン応答酵素（ＣＩＰＣ）をコードする遺伝子であるｃｉｐＣのプロモーターである。配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ由来のチアミン合成酵素（ＮＭＴ１）をコードする遺伝子であるｎｍｔ１のプロモーターである。

【0019】

上記（ｂ）についての、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列とは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を意味する。上記（ｂ）のＤＮＡの例としては、配列番号１で示される塩基配列と９１％の同一性を有する配列番号２４で示される塩基配列からなる、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｄｈ１プロモーターＤＮＡが挙げられる。

【0020】

上記（ｃ）についての、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列とは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で示される塩基配列に対して、１又は複数個の塩基の欠失、置換、又は付加を有する塩基配列である。本明細書中、「１又は複数個の塩基」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上３個以下、さらに好ましくは１個以上２個以下の塩基をいう。また、上記「塩基の欠失」とは配列中の塩基の欠落もしくは消失を意味し、上記「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、上記「塩基の付加」とは配列に塩基が付け加えられていることを意味する。「付加」には、配列の一端又は両端への塩基の付加、及び配列中の塩基の間に別の塩基が挿入されることが含まれる。

【0021】

上記（ｄ）における「ストリンジェントな条件」としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載のサザンハイブリダイゼーション法の条件、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに４２℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

【0022】

本発明のプロモーターの取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１〜３で示される塩基配列に基づいて、本発明のプロモーターＤＮＡを人工合成することができる。ＤＮＡの人工合成には、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。あるいは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ等の微生物から、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の方法に従って、配列番号１〜３で示されるプロモーター配列をクローニングすることができる。

【0023】

本発明のプロモーターＤＮＡはまた、配列番号１〜３で示される塩基配列のＤＮＡに突然変異を導入したものであってもよい。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７７，６１−６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１−２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｋｍキット（タカラバイオ社）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ^TM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。突然変異導入したＤＮＡから所望のプロモーター活性を有するものを選択することによって、本発明のプロモーターＤＮＡを取得することができる。例えば、変異導入したＤＮＡの下流に目的遺伝子を作動可能に連結し、該目的遺伝子の発現量解析を行うことにより、プロモーター活性を有するＤＮＡとして確認することができる。

【0024】

塩基配列に対する塩基の置換、欠失又は付加の方法は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，５８１−６２１，１９９５）に記載されている。該手法を用いることによって、配列番号１〜３で示される塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失又は付加された塩基配列を取得することができる。

【0025】

本発明のプロモーターは、その下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。本発明のプロモーターを利用することによって、転写活性に優れた発現制御領域を有するＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、目的遺伝子と、その上流に作動可能に連結された本発明のプロモーターとを含むＤＮＡ断片を構築することができる。該ＤＮＡ断片には、本発明のプロモーター及び目的遺伝子の他に、該プロモーターの転写活性を向上させるようなシス作用エレメントが含まれていてもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することができる。該制限酵素認識配列を使用して、プロモーターをベクターに導入することができる。すなわち、公知のベクターを制限酵素で切断し、そこに、本発明のプロモーターを含み端部に制限酵素切断配列を有するＤＮＡ断片を添加することによって、本発明のプロモーターをベクターに導入することができる（制限酵素法）。

【0026】

あるいは、本発明のプロモーターを、目的遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、当該目的遺伝子の発現を転写レベルで向上させることができる発現ベクターが得られる。該発現ベクターにおいては、本発明のプロモーターは、目的遺伝子をコードするＤＮＡの上流に作動可能に連結され得る。本発明のプロモーターを有する発現ベクターは、宿主細胞の染色体に導入する形態や染色体外に保持する形態のいずれであってもよい。またあるいは、目的遺伝子とその上流に作動可能に連結された本発明のプロモーターとを有するＤＮＡ断片を構築し、それを宿主細胞のゲノムに直接導入してもよい。なお、糸状菌では、複製起点を持たない線状ＤＮＡや環状ＤＮＡを細胞に導入するだけで、そのＤＮＡが細胞に保持される例も知られている（Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４５，３０２−３１０，２００４）。したがって、宿主細胞が糸状菌の場合、導入される発現ベクターやＤＮＡ断片には複製起点は必ずしも必要ではない。

【0027】

発現ベクターとしては、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであるならば特に限定されず、例えばｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＰＴＲ１／２（ＴａＫａＲａ）、ｐＲＩ９０９／９１０（ＴａＫａＲａ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１，１９８５）、ｐＡＢ４−１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１−７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５−３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７−４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７−４５１，１９９０）等が挙げられる。

【0028】

上記発現ベクターやＤＮＡ断片において本発明のプロモーターの下流に配置される目的遺伝子は特に限定されない。例えば、目的遺伝子は、目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子である。目的遺伝子は、異種発現産物をコードする異種遺伝子であっても、宿主細胞が本来有する発現産物をコードする遺伝子であっても、その他の任意のタンパク質、ペプチド、核酸などをコードする遺伝子であってもよい。目的遺伝子がコードする物質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、ノンコーディングＲＮＡなどが挙げられる。酵素の例としては、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ又はＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、解糖系の酵素、乳酸合成酵素（ＬＤＨ等）、ＴＣＡ回路の酵素などが挙げられる。目的遺伝子の好ましい例としては、宿主細胞が本来有する発現産物、例えば、解糖系の酵素、乳酸合成酵素（ＬＤＨ等）、ＴＣＡ回路の酵素、トランスポーター、ノンコーディングＲＮＡなどをコードする遺伝子が挙げられ、より好ましくは、乳酸合成酵素、フマル酸合成酵素、コハク酸合成酵素、リンゴ酸合成酵素、α-ケトグルタル酸合成酵素、有機酸原料取り込みトランスポーター、解糖系の酵素、有機酸排出トランスポーター等の、宿主細胞の有機酸合成に関与する酵素が挙げられる。

【0029】

本発明のプロモーターは、微生物における有機酸代謝経路上にない酵素の遺伝子に対するプロモーターであることから、微生物に本来存在する有機酸の合成に関与するプロモーターとは競合しない。したがって、本発明のプロモーターは、微生物学的な有機酸生産において、該有機酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子のプロモーターとして好適に使用することができる。有機酸としては、好ましくは乳酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸及びα−ケトグルタル酸が挙げられる。

【0030】

本発明のプロモーターを含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主細胞に導入することによって、本発明の形質転換体を得ることができる。

【0031】

上記ベクターやＤＮＡ断片を導入する宿主細胞としては、その細胞内で、本発明のプロモーターがプロモーターとして機能するものであれば特に限定されないが、通常は真核生物、好ましくは真菌、より好ましくは糸状菌が挙げられる。好ましい糸状菌としては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌が挙げられ、このうち、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ等のＲｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌が好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒがより好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒがさらに好ましい。

【0032】

上記形質転換体は、目的物質の製造に利用することができる。例えば、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に作動可能に連結された本発明のプロモーターとを有する発現ベクター又はＤＮＡ断片で形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、本発明のプロモーターの制御下で該遺伝子を発現させ、目的物質を生産させる。該宿主細胞の培養条件は、該宿主細胞の増殖及び目的物質の生産が可能な条件であるならば特に限定されない。培養終了後、培養物から目的物質を回収することにより、目的物質を取得することができる。目的物質としては、上述した目的遺伝子にコードされる物質、及び該物質の働きで合成される生成物、例えば上述した有機酸生産に関与する酵素により生成される有機酸、等が挙げられる。有機酸としては、好ましくは乳酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸及びα−ケトグルタル酸が挙げられる。

【0033】

糸状菌を宿主とした目的物質の生産は、糸状菌を一般的な培養方法に従って培養し、培地から目的物質を回収することにより行うことができる。例えば、有機酸合成に関与する酵素をコードする遺伝子とその上流に連結された本発明のプロモーターを有する発現ベクターにより形質転換した糸状菌の胞子又は菌糸体又はその混合物を、適切な培地で１０℃〜５０℃、好ましくは２５℃〜３５℃にて、数日間培養することで、有機酸を生産することができる。培養日数は目的の有機酸が充分に産生される期間であればよい。例えば、目的の有機酸が乳酸であれば、前述の温度にて、１〜１６８時間、好ましくは２〜７２時間、特に好ましくは４〜２４時間培養することにより、導入した遺伝子に依存してＬ−乳酸またはＤ−乳酸が産生される。培地は、糸状菌が健全に生育し、かつ目的の有機酸を生産することが可能な培地である限り特に限定されない。例えば、グルコース等の単糖、オリゴ糖、デンプン等の多糖を基質とした固体培地、液体培地や、市販のＰＤＢ培地（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）、ＰＤＡ培地（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）等を使用することができる。

【0034】

より効率的に糸状菌を宿主とした形質転換体を用いて有機酸を生産するには、以下に示すような工程で生産を行ってもよい。すなわち、形質転換体の胞子懸濁液を調製し（工程Ａ）、それを培養液で培養して胞子を発芽させ菌糸体を調製すること（工程Ｂ１）、好適にはさらに当該菌糸体を増殖させ（工程Ｂ２）、次いで調製した菌糸体を培養して有機酸を生産させること（工程Ｃ）により、効率よく有機酸を製造することができる。

【0035】

＜工程Ａ：胞子懸濁液の調製＞
形質転換した糸状菌の胞子を、例えば、無機寒天培地（組成例：２％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、１．５％寒天、いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））、ＰＤＡ培地、等の培地に接種し、１０〜４０℃、好ましくは２７〜３０℃にて、７〜１０日間静置培養を行なうことにより胞子を形成させ、生理食塩水などに懸濁することで、胞子懸濁液の調製することができる。胞子懸濁液には菌糸体が含まれてもよいし、含まれなくてもよい。

【0036】

＜工程Ｂ１：菌糸体の調製＞
上記で得られた胞子懸濁液を、培養液に接種して培養し、胞子を発芽させて菌糸体を得る。培養液に接種する糸状菌の胞子数は、１×１０²〜１×１０⁸個−胞子／ｍＬ−培養液、好ましくは１×１０²〜５×１０⁴個−胞子／ｍＬ−培養液、より好ましくは５×１０²〜１×１０⁴個−胞子／ｍＬ−培養液、さらに好ましくは１×１０³〜１×１０⁴個−胞子／ｍＬ−培養液である。

【0037】

本工程で使用する胞子発芽用の培養液には、市販の培地、例えば、ポテトデキストロース培地（以下、ＰＤＢ培地という場合もある。例えばベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー製のものがある。）、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（以下、ＬＢ培地という場合もある。ＬＢ培地は商標名「ダイゴ」として日本製薬社より入手できる。）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（以下、ＮＢ培地という場合もある。例えばベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー製のものがある。）、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ培地（以下、ＳＢ培地という場合もある、例えばＯＸＯＩＤ社製のものがある）等が利用できる。また、当該培養液には、発芽率と菌体生育の観点から、炭素源としてグルコース、キシロースなどの単糖、シュークロース、ラクトース、マルトースなどのオリゴ糖、又はデンプン等の多糖；グリセリン、クエン酸などの生体成分；窒素源として硫酸アンモニウム、尿素等、アミノ酸等；その他無機物としてナトリウム、カリウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、リン酸等の各種塩類を適宜添加することができる。単糖、オリゴ糖、多糖及びグリセリンの好ましい濃度は０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、クエン酸の好ましい濃度は０．０１〜１０％（ｗ／ｖ）、硫酸アンモニウム、尿素及びアミノ酸の好ましい濃度は０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、無機物の好ましい濃度は０．０００１〜０．５％（ｗ／ｖ）である。

【0038】

工程Ｂ１においては、上記培養液を用いて、上記形質転換体の糸状菌を培養する。培養は、通常の手順にて行なえばよい。例えば、培養液を含む培養容器に、糸状菌胞子を接種し、好ましくは８０〜２５０ｒｐｍ、より好ましくは１００〜１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、好ましくは２４〜１２０時間、より好ましくは４８〜７２時間培養する。培養に供する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は５０〜１００ｍＬ程度、５００ｍＬ容バッフル付フラスコの場合は１００〜３００ｍＬ程度であればよい。この培養により、糸状菌胞子は発芽し、菌糸体へと成長する。

【0039】

＜工程Ｂ２：菌糸体の増殖＞
有機酸生産能向上の観点から、工程Ｂ１で得られた菌糸体をさらに培養して増殖させる工程（工程Ｂ２）を行うことが好ましい。工程Ｂ２で使用する増殖用の培養液は特に限定されないが、通常使用されるグルコースを含む無機培養液であればよく、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．００１〜２％硫酸アンモニウム、０．００１〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１０％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。当該培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜３００ｍＬ、好ましくは１００〜２００ｍＬであればよい。この培養液に、工程Ｂ１で培養した菌体を、湿重量として１〜２０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地、好ましくは３〜１０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培地となるよう接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４２．５℃の培養温度制御下で、１２〜１２０時間、好ましくは２４〜７２時間培養する。

【0040】

＜工程Ｃ：有機酸生産＞
上記の手順（Ｂ１又はＢ１及びＢ２）で得られた糸状菌の菌糸体を培養して当該菌に有機酸を生産させ、その後生産された有機酸を回収することができる。
工程（Ｃ）で使用される有機酸生産用培養液は、グルコース等の炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源及び各種金属塩等を含み、有機酸を生産できる培養液であればよい。当該工程（Ｃ）に使用される培養液としては、例えば、７．５〜３０％グルコース、０．００１〜２％硫酸アンモニウム、０．００１〜０．６％リン酸２水素カリウム、０．０１〜０．１％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００５〜０．０５％硫酸亜鉛・７水和物、及び３．７５〜２０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液等が挙げられ、好ましくは、１２．５％グルコース、０．１％硫酸アンモニウム、０．０６％リン酸２水素カリウム、０．０２５％硫酸マグネシウム・７水和物、０．００９％硫酸亜鉛・７水和物、及び５．０％炭酸カルシウム（いずれも濃度は％（ｗ／ｖ））を含有する培養液が挙げられる。

【0041】

工程（Ｃ）で使用する培養液の量は、培養容器にあわせて適宜調整すればよいが、例えば、２００ｍＬ容三角フラスコの場合は２０〜８０ｍＬ程度、５００ｍＬ容三角フラスコの場合は５０〜２００ｍＬ程度であればよい。この培養液に、上述の菌体を、湿重量として５ｇ〜９０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液、好ましくは５ｇ〜５０ｇ−菌体／１００ｍＬ−培養液の量となるように接種し、１００〜３００ｒｐｍ、好ましくは１７０〜２３０ｒｐｍで攪拌しながら、２５〜４５℃の培養温度制御下で、２時間〜７２時間、好ましくは４時間〜３６時間培養する。

【0042】

上記培養液から培養上清を回収することにより、有機酸を得ることができる。必要に応じて、傾斜法、膜分離、遠心分離、電気透析法、イオン交換樹脂の利用、蒸留、塩析等の方法、又はこれらの組み合わせにより、当該培養液中の有機酸を有機酸塩として回収した後、回収された有機酸塩から有機酸を単離又は精製してもよい。

【0043】

本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、あるいは方法をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。

【0044】

＜１＞下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるＤＮＡからなるプロモーター：
（ａ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ;及び
（ｄ）配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。

【0045】

＜２＞上記（ｂ）で示されるＤＮＡが、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列と、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡである、＜１＞記載のプロモーター。

【0046】

＜３＞上記（ｃ）で示されるＤＮＡが、配列番号１〜３のいずれかで示される塩基配列に対して、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下、さらにより好ましくは１個以上２個以下の塩基の欠失、置換、又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡである、＜１＞記載のプロモーター。

【0047】

＜４＞＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のプロモーターを含む発現ベクター。

【0048】

＜５＞好ましくは、目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子と作動可能に連結された＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のプロモーターとを含む、＜４＞記載の発現ベクター。

【0049】

＜６＞好ましくは、上記プロモーターが、目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子の上流に連結されている、＜４＞記載の発現ベクター。

【0050】

＜７＞好ましくは、上記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、＜５＞又は＜６＞記載の発現ベクター。

【0051】

＜８＞目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のプロモーターとを含む、ＤＮＡ断片。

【0052】

＜９＞好ましくは、上記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、＜８＞記載のＤＮＡ断片。

【0053】

＜１０＞＜４＞〜＜７＞のいずれか１項記載の発現ベクター、又は＜８＞若しくは＜９＞記載のＤＮＡ断片を含む、形質転換体。

【0054】

＜１１＞好ましくは糸状菌である、＜１０＞記載の形質転換体。

【0055】

＜１２＞上記糸状菌が、
好ましくは、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属、又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の糸状菌であり、
より好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ属菌であり、
さらに好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒであり、
なお好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒである、
＜１１＞記載の形質転換体。

【0056】

＜１３＞目的物質またはその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と該遺伝子の上流に連結された＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載のプロモーターとを含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換体を培養すること；及び
該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。

【0057】

＜１４＞上記目的物質が有機酸であり、かつ上記遺伝子が有機酸合成に関わる酵素をコードする遺伝子である、＜１３＞記載の製造方法。

【0058】

＜１５＞上記有機酸がフマル酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸又はα-ケトグルタル酸である、＜１４＞記載の製造方法。

【実施例】

【0059】

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0060】

実施例１ プロモーターの同定
（１）ゲノム抽出
ＰＤＡ培地にＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）の胞子を植菌後、３０℃で５日間培養を行った。培養後、菌体を３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素中で１０分間以上凍結させた。その後、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間菌体の破砕を行った。破砕後の容器にＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）（ニッポンジーン）を４００μＬ加え転倒混和し、２５０μＬを１．５ｍＬチューブに移した。該菌体溶液から、"Ｇｅｎとるくん（酵母用）"（タカラバイオ）を用いて、プロトコールに従いゲノム抽出を行った。得られたゲノム溶液５０μＬに対し、ＲＮａｓｅＡ（ロシュ）を１μＬ添加し、３７℃で１時間反応させた。反応後、等量のフェノールクロロホルムを加え、タッピングにより混和した後、４℃、１４５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を新しい１．５ｍＬチューブに移した。再度フェノールクロロホルム処理を繰り返し、次いでエタノール沈殿を行い、５５５７株の精製ゲノム溶液を得た。

【0061】

（２）ゲノム配列解析
ゲノム配列解析はＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。すなわち上記（１）で得られた５５５７株の精製ゲノム溶液をＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて処理し、得られたサンプルをＭｉＳｅｑに供した。操作は推奨プロトコールに従い行った。ＭｉＳｅｑにて分析後、出力された配列情報をＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）にて解析した。参照配列には、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆｕｎｇａｌ−ｇｅｎｏｍｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ／ｍｕｃｏｒａｌｅｓ−ｇｅｎｏｍｅｓ）より取得したＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ ＲＡ ９９−８８０株のゲノム配列を用いた。

【0062】

（３）ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出
５５５７株の菌体６ｇ−湿重量を、液体培地４０ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．６ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５０ｇ／Ｌ 炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで８時間培養した。培養液中から菌体をろ過、回収し、０．８５％生理食塩水１００ｍＬで２回洗浄を行った。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除いた後、０．３ｇを量りとり３ｍＬ用メタルコーン（安井器械）とともに３ｍＬ破砕チューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、凍結させた。得られた凍結菌体をマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて１７００ｒｐｍで１０秒間破砕した。破砕後の菌体にＲＬＴ ｂｕｆｆｅｒを５００μＬ添加し、転倒混和後、４５０μＬをＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に供し、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出を行った。得られたＲＮＡ溶液４０μＬに１μＬのＤＮａｓｅＩ（ＴａＫａＲａ）及び５μＬの１０×ＤＮａｓｅＩ ｂｕｆｆｅｒ（ＵＳＢ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加し、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで５０μＬにフィルアップした後、３７℃で３０分以上反応させて溶液中の残存ＤＮＡを除去した。ＤＮａｓｅＩをさらに１μＬ追加し、３７℃で３０分間反応させた後にフェノール／クロロホルム抽出を行い、次いでエタノール沈殿を行った。沈殿を５０μＬの滅菌水に溶解し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡ溶液の濃度及び純度を測定した。また、該ＲＮＡ溶液を適宜希釈し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びＲＮＡ６０００ Ｐｉｃｏ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて抽出したＲＮＡの検定を行った。

【0063】

（４）網羅的転写量解析
網羅的転写量解析は、ＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。上記（３）で抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ溶液から、ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｖ２ ＬＳ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてサンプルを調製した。その際、ＲＮＡのフラグメント長は１５０塩基になるよう調製した。調製したサンプルをＭｉＳｅｑに供し、転写量解析を行った。出力データの解析にはＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）を用いてｃｏｎｔｉｇの形成を行い、転写量はＲＰＫＭ値（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）で算出した。ＲＰＫＭ値とは各ＲＮＡ配列に対してマッピングしたマップリード数を、サンプルごとの総リード数及びＲＮＡ配列の長さで標準化した値であり、以下の式で求められる。
ＲＰＫＭ ＝Ｃ／ＮＬ
Ｃ：一つのＲＮＡ配列に対してマップされたリードの総数
Ｎ：全ＲＮＡ配列に対してマップされた総リード数（ｍｉｌｌｉｏｎ）
Ｌ：コンティグの配列長（ｋｂａｓｅ）

【0064】

（５）高発現プロモーター配列の同定
得られたＲＮＡ配列をクエリにして、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより取得したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ ＲＡ ９９−８８０株の遺伝子配列とＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より取得した遺伝子配列をデータベースとしてＢＬＡＳＴ解析を行うことで、５５５７株ゲノムのアノテーション付けを行った。得られたアノテーション情報と上記（４）の転写量解析の結果から、転写量の高いゲノム領域を同定した。

【0065】

その結果、ａｄｈ１遺伝子、ｃｉｐＣ遺伝子、及びｎｍｔ１遺伝子としてアノテーションされた５５５７株ゲノム領域の転写量が顕著に高いことが判明した。表１に、各遺伝子のＲＰＫＭ値と、参考として既知のプロモーターの中で最もプロモーター活性の高いプロモーターを有するＰＤＣＡをコードする遺伝子（ｐｄｃＡ）のＲＰＫＭ値を示す。５５５７株ゲノムのａｄｈ１、ｃｉｐＣ及びｎｍｔ１の上流１０００ｂｐ、７２９ｂｐ、及び１０００ｂｐ領域（それぞれ、配列番号１〜３）を、各遺伝子のプロモーター配列として取得した。

【0066】

【表1】

【0067】

実施例２ 形質転換体の作製
（１）トリプトファン栄養要求性株の作製
遺伝子導入の宿主株として用いたトリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて¹²Ｃ^5＋を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００〜１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、ｔｒｐＣ遺伝子領域に１塩基欠損変異を有し、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ ０２Ｔ６株を取得した。

【0068】

（２）プラスミドベクター作製
（i）ｐＵＣ１８へのｔｒｐＣ遺伝子領域の導入
５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号４）及びｏＪＫ１６３（配列番号５）を用いたＰＣＲにてｔｒｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号６）及びｏＪＫ１６５（配列番号７）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを構築した。

【0069】

（ii）ａｄｈ１プロモーター及びターミネーターのクローニング
５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ａｄｈ１のプロモーター断片とターミネーター断片を、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号８）及びｏＪＫ２０４（配列番号９）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号１０）及びｏＪＫ２１６（配列番号１１）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、（i）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号１２）及びｏＪＫ２１１（配列番号１３）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にａｄｈ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。さらにａｄｈ１ターミネーターの下流にはＮｏｔ Ｉ制限酵素認識配列が配置されている。

【0070】

（iii）βグルクロニダーゼ遺伝子（以下、ＧＵＳ）のクローニング
ｐＢＩ１２１（ＴａＫａＲａ）を鋳型に、プライマーｏＵＴ１（配列番号１４）及びｏＵＴ２（配列番号１５）を用いたＰＣＲにてβグルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。次に、（ii）で得られたプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｏＪＫ２６８−１（配列番号１６）及びｏＪＫ２６９−４（配列番号１７）を用いてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを構築した。得られたプラスミドには、ａｄｈ１プロモーターとターミネーターの間にＧＵＳ遺伝子が挿入されている。

【0071】

（iv）ｃｉｐＣプロモーターのクローニング
５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ｃｉｐＣのプロモーター断片を、プライマーｏＪＫ８３８（配列番号１８）及びｏＪＫ８３９（配列番号１９）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、実施例２（２）で作製したプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｏＪＫ８４２（配列番号２０）及びｏＪＫ８４３（配列番号２１）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片を（i）と同様の手順で連結してプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを構築した。ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈには、ｃｉｐＣプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの間にＧＵＳ遺伝子が挿入されている。

【0072】

プラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈ及びｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈの作製に用いたＰＣＲプライマーを表２に示す。

【0073】

【表2】

【0074】

（３）宿主株への遺伝子導入
上記（２）で作製したプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈ及びｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを、それぞれＮｏｔ Ｉ制限酵素で処理した。得られた各ＤＮＡ溶液（１μｇ／μＬ）１０μＬを金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに加え混合した後、０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。さらに２．５Ｍ ＣａＣｌ₂を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌し、次いで６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。

【0075】

次に、上記（１）で作製した０２Ｔ６株の胞子に対し、上記の各ＤＮＡ−金粒子溶液を用い、ＧＤＳ−８０（ネッパジーン）にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）上で、３０℃の条件で１週間程静置培養した。生育した菌体を、ａｄｈ１プロモーター下流にＧＵＳ遺伝子が連結したＤＮＡ配列が導入されたＰａｄｈ１−ＧＵＳ株、及びｃｉｐＣプロモーター下流にＧＵＳ遺伝子が連結したＤＮＡ配列が導入されたＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株としてそれぞれ取得した。

【0076】

実施例３ Ｐａｄｈ１−ＧＵＳ株及びＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株におけるプロモーター活性の評価
Ｐａｄｈ１−ＧＵＳ株又はＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株の菌体２．５ｇ−湿重量を、液体培地４０ｍＬ（０．１ｇ／Ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．６ｇ／Ｌ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２５ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０９ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウム、１００ｇ／Ｌグルコース）に植菌し、３５℃、１７０ｒｐｍで８時間培養した。培養液中から菌体をろ取し、０．８５％生理食塩水１００ｍＬで２回洗浄した。洗浄後、吸引濾過により余分な水分を取り除き、０．３ｇを量りとりメタルコーン入りチューブに入れ、直ちに液体窒素に投入し、１０分間以上凍結させた。凍結した菌体の入ったチューブをマルチビーズショッカーで１７００ｒｐｍ、１０秒間処理し、菌体を破砕した。破砕後サンプルに抽出バッファー（５０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンＮａ、１ｍＭ ＤＴＴ）を１ｍＬ添加して懸濁し、得られた懸濁液９００μＬを１．５ｍＬチューブに移し、４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清５００μＬを新しい１．５ｍＬチューブに移し、再度４℃、１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。得られた上清１００μＬを粗酵素液として使用した。得られた粗酵素液のタンパク質量を、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ^TM Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にて測定した。

【0077】

βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は、４−メチルウンベリフェロンＤ−グルクロニドを分解し、４−メチルウンベリフェロンを生成する。４−メチルウンベリフェロンの生成量に基づいて粗酵素液のＧＵＳ酵素活性を定量した。粗酵素液１０μＬをＧＵＳ活性測定用バッファー（５０ｍＭ ＮａＰｉ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシンＮａ、１ｍＭ ＤＴＴ、１．１６ｍＭ ４−メチルウンベリフェロンＤ−グルクロニド）９０μＬに添加し、３７℃で６０分間インキュベート後、９００μＬの０．２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃を加えて反応を停止させた。反応液の吸光度を、インフィニットＭ１０００ ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ）により測定した（励起：３６５ｎｍ、測定：４５５ｎｍ）。バッファー中の４−メチルウンベリフェロンＤ−グルクロニドに代えて、４−メチルウンベリフェロンを所定の希釈系列で添加した溶液の吸光度を同様の条件で測定し、検量線を作製した。該検量線に基づいて、反応液中の４−メチルウンベリフェロン量を求めた。さらにそこから、反応１分間あたりに粗酵素液中に生成される４−メチルウンベリフェロン（ｎｍｏｌ）量を求め、これを１Ｕｎｉｔとした。１Ｕｎｉｔを粗酵素液中のタンパク質量で割った値をＧＵＳ活性値（Ｕｎｉｔ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）として算出した。測定はｎ＝３で行った。結果を表３に示す。ａｄｈ１プロモーター−ＧＵＳ遺伝子構築物を導入したＰａｄｈ１−ＧＵＳ株及びＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株では、異種タンパク質であるＧＵＳが発現していることが確認された。

【0078】

【表3】

【0079】

実施例４ 既知プロモーターとの対比
（１）ＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ株の作製
既知のプロモーターであるｐｄｃＡプロモーターの断片を、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に表４記載のプライマーｏＪＫ８５５（配列番号２２）及びｏＪＫ８５６（配列番号２３）を用いたＰＣＲにて増幅し、次いで実施例２（２）（iv）と同様の手順でｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを構築した。ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ−Ｔａｄｈには、ｐｄｃＡプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの間にＧＵＳ遺伝子が挿入されている。また、ａｄｈ１ターミネーターの下流にはＮｏｔ Ｉ制限酵素認識配列が配置されている。
続いて、実施例２（３）と同様の方法で、ｐｄｃＡプロモーター下流にＧＵＳ遺伝子が連結したＤＮＡ配列が導入されたＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ株を取得した。

【0080】

【表4】

【0081】

（２）プロモーター活性の比較
実施例３と同様の手順でＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ株のＧＵＳ活性値を測定した。得られたＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ株の活性値、ならびに実施例３で測定したＰａｄｈ１−ＧＵＳ株及びＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株の活性値を表５に示す。ＰｐｄｃＡ−ＧＵＳ株と比較し、Ｐａｄｈ１−ＧＵＳ株とＰｃｉｐＣ−ＧＵＳ株は顕著に高いＧＵＳ活性を有しており、この結果は、既知のプロモーターの中で最もプロモーター活性の高いｐｄｃＡプロモーターよりも、ａｄｈ１プロモーター及びｃｉｐＣプロモーターの活性が顕著に高いことを表す。さらに、実施例１で測定した転写量（ＲＰＫＭ値、表１）が表５に示すＧＵＳ活性値と相関していたことから、表１で最大のＲＰＫＭ値を示すｎｍｔ１プロモーターは、ａｄｈ１及びｃｉｐＣプロモーターよりもさらにプロモーター活性が高いことが示唆された。したがって、ａｄｈ１プロモーター、ｃｉｐＣプロモーター及びｎｍｔ１プロモーターは、任意の遺伝子をより高発現させることができるプロモーターである。

【0082】

【表5】

【0083】

実施例５ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ａｄｈ１プロモーターの活性
（１）ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株の作製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ａｄｈ１プロモーターを導入した形質転換体であるＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株を作製した。

【0084】

Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来ａｄｈ１（以下、Ｒｏａｄｈ１）プロモーターの断片（配列番号２４）を、Ｒｈｉｓｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ５３８４株（以下、５３８４株）のゲノムＤＮＡを鋳型に表６記載のプライマーｏＪＫ１１６５（配列番号２５）及びｏＪＫ１１６６（配列番号２６）を用いたＰＣＲにて増幅し、次いで実施例２（２）（iv）と同様の手順でプラスミドベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを構築した。ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ−Ｔａｄｈには、Ｒｏａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの間にＧＵＳ遺伝子が挿入されている。また、ａｄｈ１ターミネーターの下流にはＮｏｔ Ｉ制限酵素認識配列が配置されている。続いて、得られたｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ−Ｔａｄｈを、実施例２（３）と同様の方法でＲｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ ０２Ｔ６株に導入し、Ｒｏａｄｈ１プロモーター下流にＧＵＳ遺伝子が連結したＤＮＡ配列が導入された形質転換体ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株を取得した。

【0085】

【表6】

【0086】

（２）ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株におけるＲｏａｄｈ１プロモーター活性の確認
実施例３と同様の手順で、ＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株の菌体６．０ｇ−湿重量を培養し、培養物から粗酵素液を調製し、粗酵素液のタンパク質量を測定し、次いで粗酵素液のＧＵＳ活性を定量した。結果を表７に示す。Ｒｏａｄｈ１プロモーター−ＧＵＳ遺伝子構築物を導入したＰＲｏａｄｈ１−ＧＵＳ株で、異種タンパク質であるＧＵＳが発現していることが確認された。この結果は、形質転換体内でＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来のａｄｈ１プロモーターがプロモーター活性を有していたことを表す。

【0087】

【表7】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]