特許 6276694 アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6276694

(24)【登録日】2018年1月19日

(45)【発行日】2018年2月7日

(54)【発明の名称】アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/31 20060101AFI20180129BHJP

   C07K 17/00 20060101ALI20180129BHJP

   C07K 1/22 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180129BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180129BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20180129BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/31ZNA

   C07K17/00

   C07K1/22

   C12N15/00 A

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/02 C

【請求項の数】19

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2014-536953(P2014-536953)

(86)(22)【出願日】2013年9月24日

(86)【国際出願番号】JP2013075656

(87)【国際公開番号】WO2014046278

(87)【国際公開日】20140327

【審査請求日】2016年8月24日

(31)【優先権主張番号】特願2012-208762(P2012-208762)

(32)【優先日】2012年9月21日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】吉田 慎一

(72)【発明者】

【氏名】村田 大

(72)【発明者】

【氏名】鴻池 史憲

(72)【発明者】

【氏名】井口 恵太

(72)【発明者】

【氏名】中石 智之

(72)【発明者】

【氏名】林 真広

【審査官】 小林 薫

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００８−１１５１５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１０／１１０２８８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＤＷＰＩ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインから選択されるいずれかのドメインに由来し、全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を２以上含み、
前記アミノ酸配列同士がリンカーによって連結されており、かつ、
少なくとも１つのリンカーがＬｙｓ（リジン残基）またはＣｙｓ（システイン残基）を含むことを特徴とするタンパク質。

【請求項2】

少なくとも１つのリンカーがＬｙｓを含む、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

置換変異導入前のアミノ酸配列が、
配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列、または、
配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列に、下記（１）〜（４）：
（１）配列番号１〜５のいずれかにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）配列番号１〜５のいずれかにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）配列番号１〜５のいずれかにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）配列番号１〜５のいずれかにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
の少なくとも１つの変異を導入したアミノ酸配列である、請求項１または２に記載のタンパク質。

【請求項4】

全てのＬｙｓに導入されるアミノ酸置換変異の半数以上が、Ａｒｇへの置換変異である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項5】

全てのＬｙｓに導入されるアミノ酸置換変異の全てが、Ａｒｇへの置換変異である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項6】

以下に示すアミノ酸残基；
Ｇｌｎ−９、Ｇｌｎ−１０、Ｐｈｅ−１３、Ｔｙｒ−１４、Ｌｅｕ−１７、Ｐｒｏ−２０、Ａｓｎ−２１、Ｌｅｕ−２２、Ｇｌｎ−２６、Ａｒｇ−２７、Ｐｈｅ−３０、Ｉｌｅ−３１、Ｌｅｕ−３４、Ｐｒｏ−３８、Ｓｅｒ−３９、Ｌｅｕ−４５、Ｌｅｕ−５１、Ａｓｎ−５２、Ｇｌｎ−５５、およびＰｒｏ−５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されており、かつ、配列番号５のアミノ酸配列と比較した配列同一性が８０％以上である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項7】

少なくとも一方の末端にＬｙｓまたはＣｙｓを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項8】

少なくとも一方の末端にＬｙｓを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。

【請求項10】

請求項９に記載のＤＮＡを含むベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。

【請求項12】

請求項９に記載のＤＮＡ若しくは請求項１０に記載のベクターを用いた無細胞タンパク質合成系、または、請求項１１に記載の形質転換体を用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質の製造方法。

【請求項13】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質がアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化された、アフィニティー分離マトリックス。

【請求項14】

免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項１３に記載のアフィニティー分離マトリックス。

【請求項15】

免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体である、請求項１４に記載のアフィニティー分離マトリックス。

【請求項16】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定化することからなる、請求項１３〜１５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。

【請求項17】

請求項１３〜１５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させることを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法。

【請求項18】

同一の標的分子に対する２以上の結合ドメインをリンカーによって連結して得られるアフィニティーリガンドを、担体に固定化することからなるアフィニティー分離マトリックスの製造方法であって、
アフィニティーリガンドを、少なくとも１つのリンカーに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基を介して、結合ドメインのコア領域を介さず、担体に固定化することを含む、アフィニティー分離マトリックスの製造方法。

【請求項19】

さらに、アフィニティーリガンドを、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域を介して担体に固定化することを含む、請求項１８に記載のアフィニティー分離マトリックスの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的物質に特異的に結合するタンパク質、該タンパク質を担体に固定化したリガンドアフィニティー分離マトリックス、および、該マトリックスを用いた分離精製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。一方、この機能を、有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックスが挙げられる。

【0003】

抗体医薬として開発されているのは、基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。抗体医薬製造工程における初期精製工程（キャプチャー工程）には、プロテインＡをリガンドとして水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティークロマトグラフィー用カラムが一般的に利用されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。

【0004】

プロテインＡカラムの性能を改良するために、様々な技術開発がなされており、リガンドの側面からの技術開発も進んでいる。最初は天然型のプロテインＡがリガンドとして利用されてきたが、タンパク質工学的に改変を加えた組み換えプロテインＡをリガンドとして、カラムの性能を改良する技術も多数見られるようになった。特に、プロテインＡリガンドの水不溶性担体に対する固定化のされ方を意識した、プロテインＡ改変技術が開発されてきた。

【0005】

ロテインＡを含めたタンパク質性のリガンドは、タンパク質中に存在するＬｙｓ（リジン残基）やＣｙｓ（システイン残基）（プロテインＡには存在しない）の側鎖の反応性官能基を利用して、図１（１）に示す形態で、共有結合を介して担体に多点で固定化される（非特許文献４）。なお、プロテインＡの抗体結合面と非結合面のＬｙｓ（リジン残基）の数の割合を変えた組み換えプロテインＡ（特許文献１）は、図１（１）に示す形態と基本的に同様の固定化様式でありながら、リガンドの抗体結合ドメインを有効活用する技術である。

【0006】

プロテインＡに１個のＣｙｓ（システイン残基）を変異導入した組み換えプロテインＡ（特許文献２、非特許文献５）は、Ｃｙｓを介して、位置特異的に担体へ固定化されている。また、アミノ配列中のＬｙｓやＣｙｓを完全に無くした組み換えプロテインＡ（特許文献３、特許文献４）は、タンパク質をＮ末端（αアミノ基）やＣ末端（特殊タグ）にて担体へ固定化する技術である。これらの技術は、図１（２）または（３）に示す形態で、タンパク質リガンドの末端で担体に固定化する技術であり、それらの文献中に記載がある通り、リガンドの配向を制御でき、かつ、担体の表面積を有効活用できる点で有利である。

【0007】

このように、タンパク質リガンドをアフィニティー分離マトリックスに固定化する上での技術進展は、産業的な利用価値が高いゆえに高い性能が要求される、プロテインＡカラムに関連する技術を中心に発展してきた。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特開２００７−２５２３６８号公報

【特許文献2】国際公開第１９９７／０１７３６１号パンフレット

【特許文献3】特開２００８−１１５１５１号公報

【特許文献4】特開２００８−２６６２１９号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｈｏｂｅｒ Ｓ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０−４７頁

【非特許文献2】Ｌｏｗ Ｄ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」、２００７年、８４８巻、４８−６３頁

【非特許文献3】Ｒｏｑｕｅ Ａ．Ｃ．Ａ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ」、２００７年、１１６０巻、４４−５５頁

【非特許文献4】Ｗｏｎｇ Ｌ．Ｓ．他著、「Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．」、２００９年、１０９巻、４０２５−４０５３頁

【非特許文献5】Ｌｊｕｎｇｑｕｉｓｔ Ｃ．他著、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９８９年、１８６巻、５５７−５６１頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

プロテインＡを含むタンパク質性のリガンドを担体に固定化する際、一点（末端領域のみ）での固定化は配向を制御でき、担体の表面積を有効活用できる点では有利である反面、多点での固定化に比べるとリガンドが担体からリークしやすくなる側面も無視できないと考えられた。そこで、タンパク質性リガンドを担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスの、目的分子に対する結合容量・結合効率を最大化するため、新規改変タンパク質性リガンドを創出する技術を開発することが、本発明が解決しようとする課題である。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、プロテインＡについて、数多くの組み換えプロテインＡ変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、該変異体を取得し、取得した該変異体の物性、および、該変異体を水不溶性担体に固定化した抗体アフィニティー分離マトリックスの性能を比較検討した。その結果、タンパク質リガンドを、図１中の（４）〜（１５）の模式図に示される形態で担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造することで、アフィニティー分離マトリックスの、目的分子に対する結合容量・結合効率を最大化できることを見いだした。

【0012】

すなわち、本発明は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインから選択されるいずれかのドメインに由来し、全てのＬｙｓ（リジン残基）にアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を２以上含み、前記アミノ酸配列同士がリンカーによって連結されており、かつ、少なくとも１つのリンカーがＬｙｓ（リジン残基）またはＣｙｓ（システイン残基）を含むことを特徴とするタンパク質に関する。

【0013】

少なくとも１つのリンカーがＬｙｓを含むことが好ましい。

【0014】

置換変異導入前のアミノ酸配列が、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列、または、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列に、下記（１）〜（４）：
（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
の少なくとも１つの変異を導入したアミノ酸配列であることが好ましい。

【0015】

全てのＬｙｓに導入されるアミノ酸置換変異の半数以上が、Ａｒｇへの置換変異であることが好ましい。

【0016】

全てのＬｙｓに導入されるアミノ酸置換変異の全てが、Ａｒｇへの置換変異であることが好ましい。

【0017】

以下に示すアミノ酸残基；
Ｇｌｎ−９、Ｇｌｎ−１０、Ｐｈｅ−１３、Ｔｙｒ−１４、Ｌｅｕ−１７、Ｐｒｏ−２０、Ａｓｎ−２１、Ｌｅｕ−２２、Ｇｌｎ−２６、Ａｒｇ−２７、Ｐｈｅ−３０、Ｉｌｅ−３１、Ｌｅｕ−３４、Ｐｒｏ−３８、Ｓｅｒ−３９、Ｌｅｕ−４５、Ｌｅｕ−５１、Ａｓｎ−５２、Ｇｌｎ−５５、およびＰｒｏ−５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されており、かつ、変異導入前のアミノ酸配列と比較した配列同一性が８０％以上であることが好ましい。

【0018】

少なくとも一方の末端にＬｙｓまたはＣｙｓを有することが好ましい。

【0019】

少なくとも一方の末端にＬｙｓを有することが好ましい。

【0020】

また、本発明は、前記タンパク質をコードするＤＮＡに関する。

【0021】

また、本発明は、前記ＤＮＡを含むベクターに関する。

【0022】

また、本発明は、前記ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体に関する。

【0023】

また、本発明は、前記ＤＮＡ若しくは前記ベクターを用いた無細胞タンパク質合成系、または、前記形質転換体を用いる、前記タンパク質の製造方法に関する。

【0024】

また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られる、アフィニティー分離マトリックスに関する。

【0025】

前記アフィニティー分離マトリックスは、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することが好ましい。

【0026】

免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体であることが好ましい。

【0027】

また、本発明は、前記タンパク質をアフィニティーリガンドとして水不溶性の基材からなる担体に固定化することからなる、前記アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。

【0028】

また、本発明は、前記アフィニティー分離マトリックスに免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させることを含む、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製方法に関する。

【0029】

また、本発明は、同一の標的分子に対する２以上の結合ドメインをリンカーによって連結して得られるアフィニティーリガンドを、担体に固定化することからなるアフィニティー分離マトリックスの製造方法であって、アフィニティーリガンドを、少なくとも１つのリンカーに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基を介して、結合ドメインのコア領域を介さず、担体に固定化することを含む、アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。

【0030】

さらに、アフィニティーリガンドを、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域を介して担体に固定化することを含むことが好ましい。

【発明の効果】

【0031】

本発明によって得られた新規改変タンパク質リガンドを、水不溶性担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスは、少ないリガンド固定化量で、目的分子に対する結合容量が高いという特徴を示す。本技術は、製造に多大なコストを要するタンパク質を最大限に機能させる側面があり、一方で、抗体含有培養上清の１回あたりの処理量増加を可能にする側面もあるため、アフィニティー分離マトリックスを生産する側にも利用する側にも産業利用上のメリットが大きい。

【0032】

本発明によって得られた新規改変タンパク質リガンドは、図１中の（４）〜（１５）の模式図に示される形態で担体に固定化されるように設計されており、先述の先行技術で得られるリガンドとは、その固定化形態が大きく異なる。なお、図１は３ドメイン体の場合を例として提示しているが、４ドメイン体の場合も同様であり、ドメイン数が増加しても本発明の効果を奏する。

【0033】

特に、本発明は、各々のドメイン間の少なくとも１つ以上のリンカー領域で固定化する点で先行技術の形態とは異なり、これによって、担体に固定化されたとき（固相）と担体に固定化されていないとき（液相）の、複ドメイン型リガンドの（グローバルな）立体構造および動的挙動は、大きく異なることが期待される。また、各々のドメインのコア領域のアミノ酸残基は担体への固定化に利用されないので、各々のドメイン自体の立体構造および動的挙動は、担体に固定化されたときと固定化されていないときとで変わらないことが期待される。

【0034】

そして、驚くべきことに、本発明のアフィニティー分離マトリックスは、図１中の（１）または（２）の形態に比べて、抗体の結合容量が有意に向上することが分かった。

【0035】

すなわち、本発明におけるリガンドの担体への固定化様式では、担体への固定化点が多いため、目的分子の結合容量を向上しつつ、かつ、リガンドが担体からリークしにくい等のメリットを享受することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】本発明のタンパク質リガンドの担体への固定化形態を模式的に示した図である。

【図2】プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ、および、Ｚドメインの配列比較表である。

【図3】同一リガンドを有しその固定化形態が異なるアフィニティー分離マトリックスについて、リガンド固定化量と抗体結合容量の相関をプロットした図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。

【0038】

「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。

【0039】

「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的（目的）の分子を選択的に捕集（結合）する物質を指す用語であり、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。

【0040】

本発明におけるアフィニティーリガンドは、標的分子結合ドメイン（単量体タンパク質、単ドメイン）が２個以上、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜８個、さらに好ましくは２〜６個、最も好ましくは３〜６個連結された多量体タンパク質（複ドメイン型タンパク質）である。これらの多量体タンパク質は、同一の標的分子結合ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであっても良いし、標的分子が同一であれば、複数種類の標的分子結合ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。

【0041】

本発明における標的分子結合ドメインは、リンカーを介して連結される。リンカーを介した連結は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しない方法であることが好ましい。

【0042】

また、実施形態の１つとして、本発明のタンパク質を１つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合させてもよい。融合タンパク質の例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したタンパク質を例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたタンパク質の有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。

【0043】

タンパク質を担体に固定化する際に利用される、タンパク質側の活性基は、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基、リジン（Ｌｙｓ）側鎖のアミノ基、システイン（Ｃｙｓ）側鎖のチオール基、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）側鎖およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）側鎖のカルボキシル基等であるが（非特許文献４）、これらに限定されるものではない。

【0044】

したがって「担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基」とは、例えば、アミノ基を固定化反応に係わる官能基として反応に利用する場合には、Ｎ末端アミノ酸およびリジンが該アミノ酸残基となる。なお、官能基のｐＫａの違いを利用して、例えばリジンのεアミノ基のみが固定化反応に係わる官能基となる場合には、リジンのみが該アミノ酸残基となる。すなわち、本発明によって得られるタンパク質は、担体に固定化して利用することが前提となっておリ、その観点から、「担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基」は、担体に固定化する反応の種類によって一義的に決定されるものである。反応性の観点から、固定化に利用するアミノ酸は、リジンまたはシステインであることが好ましい。官能基は、リジンのアミノ基、または、システインのチオール基であることが好ましい。システインを含むタンパク質はダイマーを形成しやすいので、タンパク質としての扱いやすさという観点からは、「担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基」がリジンであることがより好ましい。

【0045】

「ドメイン間リンカー領域」とは、連結された標的結合ドメインの連結部、すなわち、Ｎ末端側のドメイン配列のＣ末端領域とＣ末端側のドメイン配列のＮ末端領域がつながって出来る領域を指し、ドメインがタンデムにＮ個連結されたタンパク質において、リンカー領域はＮ−１個存在する。つまり、本明細書中においては、連結するＮ末端側のドメインのＣ末端アミノ酸と、Ｃ末端側のドメインのＮ末端アミノ酸の、少なくとも２個以上のアミノ酸残基からなる領域を、「ドメイン間リンカー領域」と定義する。

【0046】

先述の通りに、リンカー領域には、１または複数の、ドメイン配列以外のアミノ酸残基が含まれていてもよい。リンカー領域に含まれるアミノ酸残基数は、好ましくは１６残基以内であり、より好ましくは８残基以内であり、さらに好ましくは４残基以内である。リンカーはリジン又はシステインを含むことが好ましく、リジンを含むことがより好ましい。

【0047】

本明細書における「Ｎ末端領域」および「Ｃ末端領域」は、好ましくは８残基以内であり、より好ましくは４残基以内であり、さらに好ましくは２残基以内であり、さらにより好ましくは１残基以内（いわゆるＮ末端、またはＣ末端）である。本発明のタンパク質は、少なくとも一方の末端に、リジン又はシステインを有していてもよい。

【0048】

本明細書における「コア領域」とは、連結する各々のドメイン配列において、Ｎ末端領域、および、ドメインのＣ末端領域を除く全ての領域を指す。さらに、本発明では２個以上のドメインを連結するので、「コア領域」は各々のドメイン間リンカー領域、および、タンパク質のＮ末端領域（最もＮ末端側に位置するドメインのＮ末端領域）、および、タンパク質のＣ末端領域（最もＣ末端側に位置するドメインのＣ末端領域）を除く、全ての領域を指す。

【0049】

本発明書における、ドメインのＮ末端／Ｃ末端領域を、別の観点から定義すると、ドメインの両末端に位置する特定の二次構造を取らない領域と定義することも可能である。すなわち、Ｎ末端／Ｃ末端領域は、特定の二次構造を取る領域に比べて、可動性（柔軟性）が高い。ここでいう二次構造とは、α−ヘリックス構造およびβ−ストランド（シート）構造およびターン構造が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0050】

標的結合ドメインの二次構造は、同一または類似のアミノ酸配列の立体構造情報から定義することが可能である。アミノ酸配列の立体構造情報は、例えば、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）から入手が可能であり、または、ＤＳＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｆｔ．ｃｍｂｉ．ｒｕ．ｎｌ／ｇｖ／ｄｓｓｐ／）のような二次構造アサイン用プログラムで推測することも可能であり、または、分光学的手法（Ｘ線、ＮＭＲなど）によって実験的に取得してもよい。

【0051】

なお、これらの情報の入手が困難な場合にも、ドメイン（タンパク質）のＮ末端／Ｃ末端のアミノ酸は、その可動性が高いことは明白である。したがって、本発明のタンパク質は、少なくとも１のアミノ酸残基からなる「Ｎ末端領域」および「Ｃ末端領域」は必ず有しており、さらに２以上のアミノ酸残基（一方のドメインのＣ末端アミノ酸ともう一方のドメインのＮ末端アミノ酸）からなる「リンカー領域」を有する。

【0052】

リガンドを担体に固定化する際に利用するアミノ酸残基が、その領域内において数残基程度位置がずれても、本発明の効果を奏する。

【0053】

また、本発明は、同一の標的分子に対する２以上の結合ドメインをリンカーによって連結して得られるアフィニティーリガンドを、担体に固定化することからなるアフィニティー分離マトリックスの製造方法であって、アフィニティーリガンドを、少なくとも１つのリンカーに含まれる少なくとも１つのアミノ酸残基を介して、結合ドメインのコア領域を介さず、担体に固定化することを含む、アフィニティー分離マトリックスの製造方法に関する。さらに、アフィニティーリガンドを、Ｎ末端領域および／またはＣ末端領域を介して担体に固定化することを含むことが好ましい。当該アフィニティーリガンドは、担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基が、（Ａ）タンパク質の各々のドメイン間リンカー領域の少なくとも１つの領域に少なくとも１個以上存在し、かつ、（Ｂ）タンパク質のＮ末端領域および／またはＣ末端領域に存在してもよく、かつ、（Ｃ）タンパク質の各々のドメインのコア領域中には存在しないタンパク質である。当該タンパク質について、３個の標的分子結合ドメインが連結されたタンパク質を例に挙げて補足する。

【0054】

なお、簡略化のため、「３個の標的分子結合ドメインが連結されたタンパク質」は「３ドメイン体」と、「担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基」は「固定化用残基」と、それぞれ表記する。本明細書の定義に従うと、３ドメイン体は２個のリンカー領域を有することになる。

【0055】

つまり、本発明で得られるタンパク質は、（Ａ）の条件を満たすために、リンカー領域に、少なくとも１個以上の固定化用残基を有することになり、つまり、固定化用残基の形態は、（ａ）Ｎ末端側のリンカー領域にのみ存在、（ｂ）Ｃ末端側のリンカー領域にのみ存在、または、（ｃ）両方のリンカー領域に存在の、いずれかの形態となる。固定化用残基は、両方のリンカー領域に存在することが、好ましい。

【0056】

（Ｂ）の条件については、次の（ｄ）〜（ｇ）の４つの形態が考えられる。固定化用残基が３ドメイン体の、（ｄ）Ｎ末端領域にのみ存在、（ｅ）Ｃ末端領域にのみ存在、（ｆ）Ｎ末端領域およびＣ末端領域の両方に存在、または、（ｇ）Ｎ末端領域およびＣ末端領域のどちらにも存在しない、の４つの形態である。

【0057】

そして、（Ｃ）の条件を満たすため、固定化用残基は上記に示した形態以外に、タンパク質中に存在することはない。図１を用いて説明すると、タンパク質が３ドメイン体であり、かつ、固定化用残基は各々のリンカー／末端領域に１個ずつである場合には、図１の（４）〜（１５）のいずれかの形態となる。

【0058】

各々のリンカー領域（Ｎ／Ｃ末端領域）の固定化残基の数は、１〜８個が好ましく、１〜４個がより好ましく、１〜２個がさらに好ましく、１個であるのがさらにより好ましい。

【0059】

また、タンパク質（複ドメイン体１分子中）の固定化残基の数は、リガンドのリークを抑制する観点からは、多い方が好ましい。タンパク質中のドメイン数をＮとすると、Ｎ−２個以上であることが好ましく、Ｎ−１個以上であることがより好ましく、Ｎ個以上であることがさらに好ましい。

【0060】

本発明における、アフィニティーリガンドが標的とする分子は、標的分子結合ドメインが結合可能な全ての分子であるが、例えば、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質が挙げられ、具体的には、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられる。

【0061】

ここで、「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、改変型人工タンパク質を総称する名称である。

【0062】

免疫グロブリンＧおよび免疫グロブリンＧ誘導体を標的とする標的分子結合ドメインは、様々な免疫グロブリン結合性タンパク質に含まれる。その免疫グロブリン結合性タンパク質の種類としては、Ｓｔａｐｈｙｌｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｇｒｏｕｐ Ｃ／Ｇ由来のプロテインＧ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ由来のプロテインＬ、ｇｒｏｕｐＡ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来のプロテインＨ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ＡＰ４由来のプロテインＡｒｐ、ヒト由来ＦｃγＲ等が例として挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0063】

本発明において、免疫グロブリンＧ結合ドメインとして、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインが挙げられる。これらのドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性タンパク質であり、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域の、各々の領域に対して結合する。一般的には、各々のドメインは、Ｆａｂ（Ｆｖ）領域よりもＦｃ領域に対してより強く結合する（非特許文献３）。

【0064】

本発明において、担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基がリジン残基である場合には、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列中の、末端を除く全てのＬｙｓがＬｙｓ以外のアミノ酸で置換変異されたアミノ酸配列を連結の対象にする必要がある。

【0065】

なお、末端を含めて全てのＬｙｓ残基がＬｙｓ以外のアミノ酸で置換変異されたアミノ酸配列にした後で、ドメイン配列の末端領域の１つ以上のアミノ酸をＬｙｓに置換変異したアミノ酸配列を利用しても良いし、ドメイン配列以外のアミノ酸として、１つ以上のＬｙｓ残基をリンカー領域や末端領域に付与しても良い。

【0066】

また、担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基がシステインである場合には、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列中にＣｙｓは含まれないので、ドメイン配列の末端領域の１つ以上のアミノ酸をＣｙｓに置換変異したアミノ酸配列、または、ドメイン配列以外のアミノ酸として、１つ以上のＣｙｓ残基をリンカー領域や末端領域に付与すれば良い。

【0067】

このように、本発明においては、連結する標的分子結合ドメインの末端領域を除くアミノ酸配列中に、担体に固定化し得るアミノ酸残基が存在する場合には、それらのアミノ酸残基を置換変異することが必要である。同時に、本発明の変異を導入することによって、標的分子結合ドメインがその標的分子に対する結合力を失わないことが重要である。

【0068】

本発明における具体的な実施形態の１つとして、配列番号１〜５に示す、野生型のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインのいずれかのドメインの配列を基に例示する。各々のドメインは、図２に示すような形でアラインメントすることができる。

【0069】

簡略化のために、ここではＣドメイン（配列番号５）を基準として例示する。例えば、残基番号については、Ｃドメインの３１位に対応する残基は、Ａ、Ｂドメインでは、同じ３１位であり、Ｅドメインでは２９位、Ｄドメインでは３４位に相当する。「全てのＬｙｓ（リジン残基）」は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂドメインにおける、Ｃドメインの４、７、３５、４９、５０、および、５８位に対応する６つのＬｙｓのことを指す。各々のドメインは互いに配列同一性が高く、アラインメントすることができる。例えば、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ／ｏｍｅｇａ／）で確かめることが可能である。

【0070】

プロテインＡのＣドメインの場合のみ、４、７、３５、４２、４９、５０、および、５８位の７つのＬｙｓ残基のことを指す。ただし、変異を導入する前のアミノ酸配列が欠失変異を受けた配列の場合、例えば１〜４位が欠失した配列の場合は、上述の数に限定されない。さらに、「末端を除く全てのリジン残基」というのは、プロテインＡの各ドメインの場合においては、Ｃドメインの５８位のＬｙｓを除く全てのリジン残基に該当する。

【0071】

本発明においては、このＣドメインのＣ末端のリジン残基は、連結したときに、ドメイン間のリンカー領域、または、連結後のタンパク質（複ドメイン体）のＣ末端領域に必ず存在する。したがって、リジン残基を固定化に利用する際にも、このリジン残基だけは置換変異しなくてもよい。

【0072】

「Ｌｙｓ残基に対するアミノ酸置換変異」について、置換置換により導入されるアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸を含め、特に限定されないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。

【0073】

さらに、アミノ酸置換変異は、半数以上がアルギニン（Ａｒｇ）への置換変異であることが好ましく、２つを除いて全てがＡｒｇへの置換変異であることがより好ましく、１つを除いて全てがＡｒｇへの置換変異であることがさらに好ましく、全てがＡｒｇへの置換変異であることがさらにより好ましい。これは、ＡｒｇはＬｙｓと物性が似た塩基性アミノ酸であり、タンパク質全体の物性に与える影響が比較的小さいからである。

【0074】

本発明における具体的な実施形態の１つとして、本発明の変異を導入する前の配列は、野生型のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの変異体であってもよい。例えば、配列番号６に示す、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインと呼ばれるアミノ酸配列も、Ｂドメインに由来する配列であり、Ｚドメインに本発明の変異を導入することも、当然ながら、本発明の範囲に含まれる。

【0075】

なお、このＺドメインについては、ＮＭＲ分光法により、高い精度で立体構造が解明されており、過去に公知になったＢドメイン、Ｅドメインの立体構造情報と合わせて、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのαヘリックス領域を定義している（Ｔａｓｈｉｒｏ Ｍ．他 著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、１９９７年、２７２巻、５７３−５９０頁、および、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋのＰＤＢ ｃｏｄｅ：２ＳＰＺ）。

【0076】

図２のアラインメントには、Ｚドメインの配列、および、定義されたαヘリックス構造のアサインを示している。「＊」がαヘリックスであり、「ｎ」が各々のドメインで保存されているヘリックスのＮキャップ、「ｃ」が各々のドメインで保存されているヘリックスのＣキャップである。

【0077】

先述の通り、特定の二次構造を取らないＮ末端側／Ｃ末端側の配列を、ドメインのＮ末端／Ｃ末端領域と考える場合、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＮ末端領域は、好ましくはＣドメインの１位〜６位に対応するアミノ酸残基（Ｅ、Ｄドメインは長さが異なる）であり、より好ましくはＣドメインの１位〜５位に対応するアミノ酸残基である。

【0078】

同様に、プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメインのＣ末端領域は、好ましくはＣドメインの５５位〜５８位に対応するアミノ酸残基であり、より好ましくは、５７位〜５８位に対応するアミノ酸残基である。

【0079】

本発明における実施形態を別の視点から示すと、本発明のタンパク質は、ドメインが連結されたタンパク質（複ドメイン体）において、各ドメインのＮ末端／Ｃ末端領域を除くドメイン内部領域には、担体への固定化点となるアミノ酸残基を含まない。本発明のタンパク質は、タンパク質中のドメイン内部領域を除く領域に、担体への固定化点となるアミノ酸残基を少なくとも１個含む。

【0080】

本発明の変異を導入する前のドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列、または、配列番号１〜５のいずれかのアミノ酸配列に対して、以下の（１）〜（４）の少なくとも１つの変異を導入したアミノ酸配列である。

【0081】

（１）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（２）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（３）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである、
（４）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、または、Ｍｅｔのいずれかである。

【0082】

さらに、より好ましくは、以下の（５）〜（８）の少なくとも１つの条件に合致するアミノ酸残基置換が導入されたアミノ酸配列である。
（５）各ドメインにおけるＣドメインの２９位に対応するアミノ酸残基が、
Ａｌａ、Ｇｌｕ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（６）各ドメインにおけるＣドメインの３３位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、または、Ｇｌｕのいずれかである、
（７）各ドメインにおけるＣドメインの３６位に対応するアミノ酸残基が、
Ｉｌｅ、または、Ａｒｇのいずれかである、
（８）各ドメインにおけるＣドメインの３７位に対応するアミノ酸残基が、
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、または、Ｈｉｓのいずれかである。

【0083】

本発明のタンパク質において、次に示す２０個のアミノ酸残基が、９０％以上保持されていることが好ましく、９５％以上保持されていることがより好ましい。

【0084】

例えば、Ｇｌｎ−９、Ｇｌｎ−１０、Ｐｈｅ−１３、Ｔｙｒ−１４、Ｌｅｕ−１７、Ｐｒｏ−２０、Ａｓｎ−２１、Ｌｅｕ−２２、Ｇｌｎ−２６、Ａｒｇ−２７、Ｐｈｅ−３０、Ｉｌｅ−３１、Ｌｅｕ−３４、Ｐｒｏ−３８、Ｓｅｒ−３９、Ｌｅｕ−４５、Ｌｅｕ−５１、Ａｓｎ−５２、Ｇｌｎ−５５、Ｐｒｏ−５７（残基番号はＣドメインに対応する）のうち、９０％以上が保持されていることが好ましい。同時に、全体としての配列同一性が、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらにより好ましい。

【0085】

本発明は、上述のタンパク質をアフィニティーリガンドとして利用し、該リガンドを水不溶性の基材からなる担体に固定化して得られるアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。

【0086】

本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。

【0087】

アフィニティーリガンドを担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基がリジンである場合、リガンドの固定化方法は、リガンドに存在するリジンのεアミノ基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合する方法であれば、特に限定されない。

【0088】

また、結果的に、一部のリガンドがＮ末端のαアミノ基を介して担体に固定化されても、タンパク質のＮ末端で固定化されるので、本発明の範囲内である。

【0089】

カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。

【0090】

担体に固定化する反応に利用するアミノ酸残基がシステインである場合、リガンドの固定化方法は、リガンドに存在するシステインのチオール基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合する方法であれば、特に限定されない。

【0091】

カップリング法としては、同様に、担体をエピクロロヒドリン、などと反応させて担体を活性化し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行う方法などが挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。

【0092】

アフィニティー分離マトリックスを用いた標的分子の精製法は、一般的なアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる。例えば、免疫グロブリンＧを標的分子とする場合、すでに市販品として存在するプロテインＡカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献３）。

【0093】

すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調製した後、該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質を吸着させる。

【0094】

次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。

【0095】

次いで、適切なｐＨに調製した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を有するタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。標的分子の溶出には、該マトリックスからの標的分子の解離を促進する物質を含む溶液であれば、特に酸性緩衝液には限定されない。

【0096】

本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。

【0097】

本発明はまた、上記タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡに関する。該タンパク質をコードする塩基配列は、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、該タンパク質を構成するものであればいずれでも良い。そのような塩基配列を有するＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。

【0098】

また、前記ＤＮＡは公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。該塩基配列を一つまたはそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、該組換えＤＮＡがプラスミドまたはファージである組換えＤＮＡ、さらには、該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を用いて得ることができる。

【0099】

また、本発明のタンパク質は、タンパク質発現を補助する作用、または、精製を容易にする公知の蛋白質との融合蛋白質として取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。該タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。

【0100】

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。

【0101】

すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。

【0102】

また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。

【0103】

また、本発明の単量体タンパク質（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体タンパク質をコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。

【0104】

多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製する方法は、これら連結する方法に限らない。例えば、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第ＷＯ０６／００４０６７号公報）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。また、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましい。

【0105】

本発明の「発現ベクター」は、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。

【0106】

例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のベクターなどが挙げられる。

【0107】

ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）などが挙げられる。

【0108】

本発明の形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0109】

また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。

【0110】

宿主となる細胞は、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。ブレビバチルス属細菌として、ブレビバチルス・チョウシネンシスが挙げられる。

【0111】

本発明のタンパク質は、前記した形質転換体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。

【0112】

また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。

【0113】

本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。

【0114】

その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。

【0115】

さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的タンパク質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。

【0116】

さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用しても良い（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。

【0117】

大腸菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン １％、酵母エキス ０．５％、ＮａＣｌ １％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン １．６％、酵母エキス １．０％、ＮａＣｌ ０．５％）等が挙げられる。

【0118】

ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン １％、肉エキス ０．５％、酵母エキス ０．２％、グルコース １％、ｐＨ ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン ４％、酵母エキス ０．５％ 、グルコース ２％、ｐＨ ７．２）等が挙げられる。

【0119】

また、培養温度は、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。

【0120】

組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。

【0121】

また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。

【0122】

本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。

【0123】

得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。

【実施例】

【0124】

以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例で取得した各種タンパク質は、「ドメインを示すアルファベット−導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。

【0125】

例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ−ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ−Ｇ２９Ｅ」という形で表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体は、スラッシュを用いて併記する。

【0126】

例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体は、「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」という形で表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質は、ピリオドをつけて、連結した数に「ｄ」をつけて併記する。

【0127】

例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は、「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。

【0128】

［実施例１］
リガンドの発現プラスミド調製
Ｃ末端のＬｙｓ−５８を除くＬｙｓ残基を別のアミノ酸に置換したプロテインＡのＣドメイン変異体（Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．１ｄ、配列番号７）をもとに、アフィニティーリガンドを設計した。本実施例では、このドメインを５個連結したＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ（配列番号８）、４個連結したＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．４ｄ（配列番号９）、および、連結した４個のＣ末端側に位置するドメインのみＬｙｓ−５８をＡｒｇに置換した配列番号９の単残基変異体Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ（Ｃ末Ｋ５８Ｒ）．４ｄ（配列番号１０）を、アフィニティーリガンドとして利用することとし、その発現プラスミドを以下の手順で調製した。

【0129】

Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄをコードし、５’末端にＮｃｏＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号１１）を外注によって全合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）。このサブクローニング後の発現プラスミド（ｐＵＣ５７）を、制限酵素（ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ：ともにタカラバイオ社製）で消化して取得したＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄをコードするＤＮＡを、ブレビバチルス発現用ベクターｐＮＫ３２６０’へライゲーションし、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＫ３２６０’に挿入された発現プラスミドを調製した。

【0130】

また、この配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＮＫ３２６０’を鋳型として、配列番号１２〜１３のオリゴヌクレオチドプライマー（外注によって合成、シグマアルドリッチジャパン株式会社）を用いたＰＣＲによって、Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．４ｄをコードするＤＮＡ（配列番号１４、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトを含む）を合成し、制限酵素（ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ）で消化後、ｐＮＫ３２６０’へライゲーションした。

【0131】

同様にして、配列番号８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたｐＮＫ３２６０’を鋳型として、配列番号１２および１５のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲによって、Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ（Ｃ末Ｋ５８Ｒ）．４ｄのコードＤＮＡ（配列番号１６、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトを含む）を合成し、制限酵素（ＮｃｏＩおよびＸｂａＩ）で消化後、ｐＮＫ３２６０’へライゲーションした。

【0132】

ＤＮＡポリメラーゼであるＢｌｅｎｄ Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたＰＣＲ法、および、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたライゲーション反応は、ＴＯＹＯＢＯ社のプロトコルに従い実施した。制限酵素による消化反応はタカラバイオ社のプロトコルに従い実施した。

【0133】

最終的に、配列番号８〜１０のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが、ブレビバチルス発現用ベクターｐＮＫ３２６０’に挿入された発現プラスミドを各々調製した。

【0134】

ＮＫ３２６０’は、公知のブレビバチルス発現ベクター（国際公開第０６／００４０６７号パンフレット）に対し、発現したいタンパク質コードＤＮＡをＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトで挿入できるよう変異処理したベクターである。

【0135】

また、上記とは変異の種類が一部異なるプロテインＡのＣドメイン変異体（Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ．１ｄ、配列番号１７）をベースとし、このドメインを３個連結したＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ．３ｄ（配列番号１８）の発現プラスミドを同様の手法にて調製した。配列番号１８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、上記と同様に外注によって全合成しており（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトを含むコード部分のＤＮＡ配列は配列番号１９に示す。

【0136】

［実施例２］
リガンドの発現・精製
実施例１で得られた発現プラスミドを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ−１株の形質転換を行った。形質転換は、公知の方法による電気導入法にて実施した（「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９９７年、６１号、２０２−２０３頁）。なお、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ−１株は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（特開平６−２９６４８５号公報）に変異処理をして得られたＰｈｅ・Ｔｙｒ要求性株である。

【0137】

ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ−１組換え菌を、６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む５ｍＬの３ＹＣ培地（ポリペプトン ３％、酵母エキス ０．２％、グルコース ３％、硫酸マグネシウム ０．０１％、硫酸鉄 ０．００１％、塩化マンガン ０．００１％、塩化亜鉛 ０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。

【0138】

培養物を遠心処理して菌体を分離し、得られた培養上清から、ＳＰ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のタンパク質を精製（粗精製）した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに塩酸でｐＨ４．０に調製した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ−ＣＨ_３ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＳＰ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Ａと陽イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ−ＣＨ_３ＣＯＯＮａ，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。

【0139】

次に、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて目的タンパク質を精製した。具体的には、分取した目的タンパク質溶液を超純水に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）にて平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。

【0140】

分取した目的タンパク質溶液を超純水に透析し、透析後の水溶液を最終精製サンプルとした。なお、カラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用して実施した。

【0141】

［実施例３］
リガンドのヒト免疫グロブリンに対する親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いて、実施例２で取得したリガンドの、免疫グロブリンとの親和性を解析した。ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンＧ製剤（以後は、ヒトＩｇＧと記する）をセンサーチップに固定化し、実施例２で取得したリガンドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。

【0142】

ヒトＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および、Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）。

【0143】

ヒトＩｇＧとして市販されているガンマガード（バクスター社）を、固定化用緩衝液（１０ ｍＭ ＣＨ_３ＣＯＯＨ−ＣＨ_３ＣＯＯＮａ、ｐＨ４．５）でリガンドの終濃度が５０μｇ／ｍＬ程度になるよう希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００付属のプロトコルに従い、ヒトＩｇＧをセンサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。

【0144】

リガンド溶液は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｐ−２０、ｐＨ７．４）を用いて、１６、３２、６４、１２８ｎＭに希釈した溶液を用いた。各々のリガンド溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで２．５分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、２．５分間）、および、添加終了後（解離相、２．５分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、０．１Ｍ Ｇｌｙ（ｐＨ２．５）、および、２０ｍＭ ＮａＯＨを、各々０．５分間ずつ順に添加し、センサーチップを再生した。

【0145】

この操作は、センサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られたセンサーグラム（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いたセンサーグラム）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、リガンドのヒトＩｇＧに対する親和定数（Ｋ_Ａ ＝ ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）を算出した。

【0146】

表１に示すように、各種複ドメイン型Ｃドメイン変異体のヒトＩｇＧに対する親和定数Ｋ_Ａ（Ｍ^−１）は、１０の９乗オーダーであった。これは、例えば、公知の５ドメイン型リガンドＣ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄ（比較例１）と同程度であった。本発明は固定化時の標的分子の結合“容量”を向上する技術であり、標的分子に対する分子レベルでの結合“力”はほぼ同等であることが重要なので、本結果は本発明の妥当性を示すデータであるといえる。

【0147】

【表1】

【0148】

［実施例４］
リガンドを担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスの試作
カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例２で得られたリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを作製した。

【0149】

水不溶性基材として、市販のプレパックカラム「Ｈｉｔｒａｐ ＮＨＳ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ」１ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、カップリング目的官能基をアミノ基とするタンパク性リガンド固定化用の活性基が導入済みなので、製品マニュアルに従ってリガンドを固定化した。氷浴で冷やした１ｍＭ ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流す操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。

【0150】

その後すぐに、カップリング緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ_３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）でリガンドを希釈した溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したリガンドをカラムに固定化した。

【0151】

その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応リガンドを回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍ ｅｔｈａｎｏｌ ａｍｉｎｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ Ａｃｅｔａｔｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施した。

【0152】

ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液を流す一連の操作は交互に３回ずつ行った。最後に標準緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティー分離カラムの作製を完了した。

【0153】

固定化反応で置換されたＮＨＳは２８０ｎｍに吸収を持つ。脱塩カラムＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いてＮＨＳを除去し、未反応リガンドのみの２８０ｎｍの吸光度（Ａｂｓ_２８０）を測定し、固定化収率を算出した。ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇを利用することで、分子量５，０００以上の成分（ここではリガンド）と分子量１，０００以下の成分（置換されたＮＨＳ）を分離することが可能である。

【0154】

未反応リガンド５００μＬをＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ５ｍＬに通液し、カップリング緩衝液を１ｍＬ添加した後、さらにカップリング緩衝液を１．５ｍＬ添加して、この時の溶出液１．５ｍＬを回収し、２８０ｎｍの吸光度を測定した。ＨＰＬＣやビウレット法による検討で事前に導いた算出式（Ａｂｓ_２８０＝０．４８４のときに１ｍｇ／ｍＬ）を用いて濃度を算出した。

【0155】

リガンド希釈溶液の濃度（仕込み量）、リガンド固定化量、および、固定化収率を表２に示す。

【0156】

例えば、Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ．３ｄ（配列番号１８）の場合、リガンド中の２つのドメイン間リンカー領域およびＣ末端に１個ずつあるリジン残基の側鎖のアミノ基が固定化に利用され、ほとんどが図１の（４）で示す形態でマトリックスに固定化されている。なお、リガンドのＮ末端のアミノ酸のアミノ基で固定化される可能性も否定できないが、反応性の観点からはその可能性は低い。わずかな割合でＮ末端のアミノ酸で固定化された場合も、図１の（６）で示す形態で固定化されるため、本発明で得られる効果に違いはないと推察される。また、ドメイン数は異なるが、５ドメイン型のＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．５ｄ（配列番号８）、および、４ドメイン型のＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ．４ｄ（配列番号９）も同様の形態、すなわち図１の（４）の形態で固定化される。また、配列番号９からＣ末のＬｙｓのみを無くしたＣ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ（Ｃ末Ｋ５８Ｒ）．４ｄ（配列番号１０）は、図１の（７）の形態で固定化される。

【0157】

【表2】

【0158】

［実施例５］
試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量評価
試作アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量を評価するために、アフィニティークロマトグラフィー実験による抗体ｄＢＣ測定を行った。

【0159】

ヒトＩｇＧとしては、ガンマグロブリン（ニチヤク株式会社製）を、標準緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）で１５０倍に希釈して１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した溶液を用いた。

【0160】

また、クロマトシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）のセルを、この溶液が１００％通過しているときのＡｂｓ_２８０（１００％ Ａｂｓ_２８０）をあらかじめ測定した。なお、ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（１ｍＬ）はφ０．７×２．５ｃｍ（０．９６ｍＬ）なので、一連の操作では１ｍＬを１ＣＶとした。

【0161】

クロマトシステムＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００に試作アフィニティー分離マトリックスを接続し、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで標準緩衝液（１００ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４−Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）を５ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ（３１ｃｍ／ｈ）でヒトＩｇＧ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％ Ａｂｓ_２８０の５％を超えるまで続けた。その後、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで標準緩衝液を５ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（３５ｍＭ Ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ３．５）を３ＣＶ流し、ヒトＩｇＧを溶出した。モニタリング吸光度が１００％ Ａｂｓ_２８０の５％を超えたときまでに流したヒトＩｇＧの総量を抗体ｄＢＣ（抗体５％ｄＢＣ）とした。

【0162】

試作した５ドメイン型のアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表３に示す。

【0163】

【表3】

【0164】

また、表３の結果を、横軸を固定化量、縦軸を抗体ｄＢＣとしてプロットしたグラフを図３に示す。

【0165】

本発明によって得られたアフィニティー分離マトリックスは、比較例１で得られたアフィニティー分離マトリックスに対して、ほぼ同等のリガンド固定化量において、有意に高い抗体ｄＢＣを示すことを確認した。異なる２種類のリガンドの抗体ｄＢＣを異なる固定化量３点で比較した図３のプロットの傾向から、担体固定化時に図１の（４）で示す形態でリガンドが固定化された本発明のアフィニティー分離マトリックスは、図１の（１）で示す形態で固定化された場合に比較して、抗体ｄＢＣが明確に高い傾向を示しているといえる。
試作した４ドメイン型のアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表４に示す。

【0166】

【表4】

【0167】

本発明によって得られた、例えば、図１の（７）の形態でリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスは、図１の（４）の形態でリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスと同程度の抗体ｄＢＣを示すことが分かった。

【0168】

つまり、図１の（４）〜（７）のどの形態でも、先に示した抗体ｄＢＣ向上効果が期待され、理論的には、（４）〜（１５）のどの形態でも同様の効果が期待される。また、ドメイン数が変わっても、同じような効果が見られることも分かった。
試作した３ドメイン型のアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表５に示す。

【0169】

【表5】

【0170】

本発明によって得られたアフィニティー分離マトリックスは、比較例２で得られたアフィニティー分離マトリックスに対して、ほぼ同等のリガンド固定化量において、有意に高い抗体ｄＢＣを示した。本データは、本発明で得られたアフィニティー分離マトリックスは、図１の（２）の形態でリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスと比較して、有意に高い抗体ｄＢＣを示す一例といえる。

【0171】

また、ドメイン数、および、配列が変わっても、ドメインの抗体結合機能があれば、同じような効果が見られることが分かった。

【0172】

［比較例１］
Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄ
担体への固定化時に、図１の（１）の形態で固定化される５ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。

【0173】

Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄ（配列番号２０）の発現プラスミドの調製方法は、公開特許文献（国際公開第２０１０／１１０２８８号公報）の記載に準ずる。コードＤＮＡの配列は配列番号２１に示される通りであり、例えば、本配列のＤＮＡを全合成し、市販のブレビバチルス発現用プラスミド（例えばｐＮＣＭＯ２、タカラバイオ社製）に挿入することでも、容易に発現プラスミド調製が可能である。

【0174】

リガンドの発現・精製は、実施例２に記載の手法にて実施した。取得したリガンドのヒトＩｇＧに対する親和性を実施例３に記載の手法にて同様に測定し、結果は表１に記載した。実施例４に記載の手法にて、取得したリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製し、実施例５に記載の方法で抗体ｄＢＣを測定し、結果を表３及び図３に記載した。

【0175】

［比較例２］
Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／（Ｃ末以外Ｋ５８Ｒ）．３ｄ
担体への固定化時に、図１の（２）の形態で固定化される３ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。

【0176】

Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｌ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｒ／Ｋ５０Ｒ／（Ｃ末以外Ｋ５８Ｒ）．３ｄ（配列番号２２）をコードし、５’末端にＮｃｏＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２３）を外注によって全合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）。

【0177】

本リガンドは、３番目のドメインのＬｙｓ−５８（リガンド配列のＣ末端）でのみ担体に固定化される。そのＤＮＡを利用した発現プラスミドは、実施例１に記載の方法で調製し、実施例２に記載の方法でリガンドを発現・精製した。取得したリガンドのヒトＩｇＧに対する親和性を実施例３に記載の手法で測定し、その親和定数（Ｋ_Ａ）は表５に示した。また、実施例４に記載の手法で、取得したリガンドを担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを調製し、実施例５に記載の手法で抗体ｄＢＣを求めた結果を、表５に併記した。

【0178】

［実施例６］
マトリックス用セルロースビーズの作製
（１）セルロース分散液Ｂの作製
旭化成ケミカルズ社製局方セルロースＰＨ−Ｆ２０ＪＰ（メジアン粒径：２１μｍ）７６ｇと蒸留水８００ｇを混合し、攪拌しながら４℃に調整した。次いで設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整したアルカリ水溶液Ａを４００ｇ投入し、３０分間攪拌した。

【0179】

（２）多孔質セルロースビーズの作製
４℃に調整されたセルロース分散液Ｂ１２７６ｇと、４℃に調整したオルトジクロロベンゼン７８０１ｇと、４℃に調整したソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）７８ｇを混合し、ディスクタービン（Ｒｕｓｈｔｏｎ ｔｕｒｂｉｎｅ）翼２枚を取り付けたステンレス容器内にて４６０ｒｐｍ（Ｐｖ値：５．０ｋＷ／ｍ^３）で４℃、１５分間攪拌し、エマルションを作製した。設定温度と攪拌を維持しながら４℃に調整されたメタノール５９２ｇを凝固溶媒として加えた。また凝固溶媒の添加所要時間は５秒であった。その後、攪拌数と設定温度を維持しながら３０分間攪拌した。加圧濾過を行った後、洗浄液としてメタノール３０００ｇを用いて洗浄を行い、次いで３０００ｇの水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを得た。多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズは、３８μｍと９０μｍの篩を用いて湿式分級した。

【0180】

（３）架橋
上記多孔質セルロースビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋１回ビーズを得た。

【0181】

得られた架橋１回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて、１２０℃で１時間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上のＲＯ水で洗浄し、エポキシ基がグリセリル基に変化したオートクレーブ済みの架橋１回ビーズを得た。

【0182】

次いで、このオートクレーブ済みの架橋１回ビーズ２０体積部に蒸留水を加えて３０体積部とし、反応容器に移した。ここに架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４を２．３重量部投入し、４０℃に調整しながら攪拌を続けた。４０℃に調整後、３０分間攪拌した。次いで、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液７．１体積部を用意し、１時間に１／４ずつ加えた。この間、温度を４０℃に維持し、攪拌も継続した。最後の１／４量を添加後、同温度で１時間攪拌した。反応終了後、吸引濾過をしながら、ビーズの２０倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、架橋２回ビーズを得た。

【0183】

得られた架橋２回ビーズを容器に移し、蒸留水を加えて、全量を架橋多孔質セルロースビーズの１０倍体積量とし、オートクレーブを用いて１２０℃で６０分間加温した。室温まで放冷した後、ビーズの５倍体積量以上の蒸留水で洗浄し、オートクレーブ済みの架橋２回ビーズを得た。

【0184】

［実施例７］
リガンドをセルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックス試作例
実施例６で得られた架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬを遠沈管に入れ、ＲＯ水を加えて、全量を６ｍＬとした。これを２５℃にてミックスローターＭＲ−３（アズワン社製）上に取り付けた後、撹拌した。次に過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）をＲＯ水に溶解した、１１．１６ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．０ｍＬ加え、２５℃で１時間撹拌した。反応後、グラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまでＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０ Ｐｕｒｅ＋（ＥＵＴＥＣＨ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で測定した。

【0185】

得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、ｐＨ１２の０．６Ｍクエン酸 バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調製）で置換した。置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、クエン酸バッファーを用いて遠沈管に移し、総体積量７．５ｍＬとなるように液量を調整した。ここに、実施例２で得られたリガンド溶液を加えた後、６℃にて２３時間、ミックスローターＭＲ−３を用い、攪拌させながら反応した。

【0186】

その後、反応液を回収（反応液１）し、ｐＨ８の０．１Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、ＲＯ水を用いて調整）で置換して、６℃で４時間ミックスローターＭＲ−３を用いて、攪拌した。引き続き、５．５重量％濃度のジメチルアミンボラン水溶液（和光純薬工業社製ジメチルアミンボランとＲＯ水で調製）を１．９３ｍＬ加えて、６℃で１時間攪拌した後、反応温度を２５℃に上昇し、２５℃で１８時間、ミックスローターＭＲ−３を用いて攪拌しながら反応した。反応後、反応液を回収した（反応液２）。反応液１及び２の２７８ｎｍ付近の吸収極大のＵＶ吸光度を測定し、仕込んだリガンド量から差し引くことで、リガンド固定化量を算出した。リガンドの仕込み量、リガンド固定化量及び固定化収率は表６に示す。

【0187】

【表6】

【0188】

反応後のビーズをグラスフィルター１１ＧＰ１００（シバタ社製）上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次いで、３倍体積量の０．１Ｎクエン酸一水和物（関東化学社製クエン酸一水和物とＲＯ水で調製）を加え、当該ビーズに０．１Ｎクエン酸一水和物を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、２５℃で３０分間攪拌しながら、酸洗浄を行った。酸洗浄後、ビーズをグラスフィルター１１ＧＰ１００上で、ビーズの３倍体積量のＲＯ水で洗浄し、次いで、３倍体積量の０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えた。次に、当該ビーズに、０．０５Ｍ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を加えて全量を３０ｍＬ以上とし、遠沈管に入れ、室温で３０分間攪拌しながら、アルカリ洗浄を行った。

【0189】

アルカリ洗浄後、ビーズをグラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、ビーズの２０倍体積量のＲＯ水で洗浄した。次に、ビーズの３倍量の０．１Ｎクエン酸ナトリウム水溶液を加え、濾液が中性になっていることを確認した後、ＲＯ水を用いて、洗浄濾液の電導度が１μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、目的とするアフィニティー分離マトリックスを得た。洗浄濾液の電導度は導電率計ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０ Ｐｕｒｅ＋で測定した。

【0190】

［実施例８］
セルロースベースのアフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量評価
実施例７で試作したアフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量を評価するために、アフィニティークロマトグラフィー実験による抗体ｄＢＣ測定を行った。

【0191】

クロマトシステムとしてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用い、直径０．５ｃｍ、高さ１５ｃｍのカラムに２２μｍのメッシュを取り付け、試作アフィニティー分離マトリックスをそれぞれ３ｍＬ入れ、線速４５０ｃｍ／ｈで２０％エタノール水溶液を１時間通液して、試作アフィニティー分離マトリックス充てんカラムを得た。以降は実施例５と同様にして、ＩｇＧの動的結合容量の測定を実施した。

【0192】

試作したセルロースベースのアフィニティー分離マトリックスの評価結果を表７に示す。

【0193】

【表7】

【0194】

本発明によって得られたセルロースベースのアフィニティー分離マトリックスは、比較例３で得られたアフィニティー分離マトリックスに対して、ほぼ同等のリガンド固定化量において、有意に高い抗体ｄＢＣを示すことを確認した。したがって、本発明によって得られたアフィニティー分離マトリックスは、マトリックスのベースとなる基材の種類に依らず、同様の抗体ｄＢＣ向上効果を示すといえる。

【0195】

［実施例９］
リガンドのリーク量の測定
リガンドのリーク量を評価するために、実施例４で得られたアフィニティー分離マトリックスを用いて、ヒトＩｇＧを該マトリックスに添加し酸性溶液で溶出した後の、ＩｇＧ溶出液に含まれるリガンドの量を測定した。クロマトシステムとしてＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １００を用いた。フラクションコレクターに１５ｍｌの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブについては、あらかじめ中和液を入れておいた。実施例５と同様にしてＩｇＧを溶出させ、溶出液を回収した。

【0196】

溶出液中のＩｇＧ量とリガンド（プロテインＡ）量を測定し、精製ＩｇＧ中にリークしたリガンド濃度（リーク量）を求めた。リーク量については、文献に記載のＥＬＩＳＡ法に従って定量した（Ｓｔｅｉｎｄｌ Ｆ．他著， 「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」２０００年、２３５巻、６１−６９頁）。リガンドのリーク定量結果を表８に示す。

【0197】

【表8】

【0198】

本発明によって得られた図１の（４）の形態でリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスは、比較例４で得られた図１の（２）で得られた形態でリガンドが固定化されたアフィニティー分離マトリックスに比較して、有意にリガンドのリークが抑えられていることを確認した。本発明は、高い抗体ｄＢＣと低いリガンド・リークの両立が可能といえる。

【0199】

［比較例３］
Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄをセルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックス
比較例１で得られたＣ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄを、以下の手法にて、セルロースビーズに固定化したアフィニティー分離マトリックスを取得した。実施例７と同様にしてホルミル化担体を作製し、得られたホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズ３．５ｍＬをグラスフィルター（シバタ社製 １１ＧＰ１００）上で、ｐＨ１２の０．２５Ｍクエン酸 バッファー（和光純薬工業社製クエン酸三ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調製）で置換した。ｐＨ１２の０．２５Ｍクエン酸バッファーを用い、置換後のホルミル基含有架橋多孔質セルロースビーズを、遠沈管に入れ、総体積量７．５ｍＬとなるように液量を調整した。ここに、Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．５ｄ溶液（６６．７ｍｇ／ｍＬ）を０．６３ｇ加えた後、６℃にて２３時間、ミックスローターＭＲ−３を用い、攪拌させながら反応した。

【0200】

その後２．４Ｍクエン酸水（和光純薬工業社製クエン酸一水和物、ＲＯ水を用いて調製）を用いて反応溶液ｐＨを５．０に調整し、６℃で４時間ミックスローターＭＲ−３を用いて、攪拌した。以降は実施例６と同様に還元と洗浄操作を実施した。リガンド希釈溶液の濃度（仕込み量）、リガンド固定化量、および、固定化収率については、表６に併記する。アフィニティー分離マトリックスのヒトＩｇＧ結合容量を実施例８に記載の方法で測定した。その結果を表７に併記する。

【0201】

［比較例４］
Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／（Ｃ末以外Ｋ５８Ｒ）．５ｄをアガロースベースの担体に固定化したアフィニティー分離マトリックス
担体への固定化時に、図１の（２）の形態で固定化される５ドメイン型のリガンドを参照用リガンドとして取得し、該リガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを調製した。

【0202】

プロテインＡのＣドメイン変異体（Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ．１ｄ、配列番号２４）をベースとし、このドメインを５個連結し、かつ、Ｃ末端側に位置するドメインのみＬｙｓ−５８にＡｒｇ変異を導入しない、Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／（Ｃ末以外Ｋ５８Ｒ）．５ｄ（配列番号２５）の発現プラスミドを、同様の手法にて調製した。配列番号２５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、実施例１と同様に外注によって全合成しており（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社）、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩサイトを含むコード部分のＤＮＡ配列は配列番号２６に示す。実施例２と同様の手法にて、Ｃ−Ｋ０４Ｒ／Ｋ０７Ｒ／Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｒ／Ｋ３５Ｒ／Ｋ４２Ｒ／Ｋ４９Ｑ／Ｋ５０Ｒ／Ｋ５８Ｒ（Ｃ末以外Ｋ５８Ｒ）．５ｄ（配列番号２５）を発現・精製し、リガンドを取得した。このリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスを実施例４と同様の方法で作製した。リガンド希釈溶液の濃度（仕込み量）１２．１ｍｇ／ｍＬで調製した結果、リガンド固定化量は９．４ｍｇ／ｍＬ−ｇｅｌであり、固定化収率が７７％であった。アフィニティー分離マトリックスからの、リガンドのリーク量を実施例９に記載の方法で測定した。その結果を表８に併記する。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]