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特許6277603百日咳菌の検出方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6277603

(24)【登録日】2018年1月26日

(45)【発行日】2018年2月14日

(54)【発明の名称】百日咳菌の検出方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20180205BHJP

C12Q 1/68 20180101ALI20180205BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 AZNA

C12Q1/68 A

【請求項の数】5

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2013-112859(P2013-112859)

(22)【出願日】2013年5月29日

(65)【公開番号】特開2014-230511(P2014-230511A)

(43)【公開日】2014年12月11日

【審査請求日】2016年5月20日

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】000003160

【氏名又は名称】東洋紡株式会社

(72)【発明者】

【氏名】曽家義博

【審査官】西賢二

(56)【参考文献】

【文献】特開２００７−１２４９７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 NYGREN, M. et al.，J. Clin. Microbiol.，２０００年，Vol. 38, No. 1，pp. 55-60

【文献】 Reizenstein, E. et al.，Diagn. Microbiol. Infect. Dis.，１９９３年，Vol. 17, No. 3，pp. 185-191

【文献】曽家義博，日本臨床検査自動化学会会誌（JJCLA），２０１１年，Vol. 36, No. 3，pp. 401-403

【文献】中村和憲，蛍光消光現象を利用した遺伝子定量・解析技術，産総研TODAY，２００８年２月，pp. 18-19

【文献】野田尚宏，Synthesiology，２０１０年５月，Vol. 3, No. 2，pp. 147-157

【文献】 Houard, S. et al.，Res. Microbiol.，１９８９年，Vol. 140, No. 7，pp. 477-487

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｑ１／００− １／７０

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ

／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
（Ａ）
（１）以下の（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列の組合せで示される、フォワードプライマー及びリバースプライマーの核酸プライマー対、並びに核酸プローブの組合せを用意する工程。
（ａ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｂ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号９でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｃ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１０でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｄ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１１でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｅ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１２でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｆ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１３でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｇ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１４でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｈ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１５でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｉ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１６でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｊ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１７でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｋ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（２）被検核酸および前記工程（１）で用意した核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、前記工程（１）で用意した核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。

【請求項2】

請求項１に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とする百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。

【請求項4】

以下の（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列の組合せで示される、フォワードプライマー及びリバースプライマーの一対の核酸プライマーと核酸プローブとを組み合わせてなる、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出用のプライマー・プローブのセット。
（ａ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｂ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号９でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｃ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１０でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｄ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１１でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｅ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１２でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｆ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１３でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｇ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１４でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｈ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１５でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｉ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１６でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｊ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１７でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｋ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ。

【請求項5】

請求項４に記載のプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は，百日咳菌およびまたはパラ百日咳菌を分類して検出する分野に関する。

【背景技術】

【0002】

百日咳は，伝染性の強い呼吸系の疾病である。百日咳の症状としては，激しい咳および続く吸入フープ，時には嘔吐等の症状がある。極端な場合には，これらの症状は低酸素症，永久脳障害，さらには死亡につながる。大部分の症例（８０−９８％）は，小さいグラム陰性の細菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされるが，一部（２−２０％）はパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされる（非特許文献１）。パラ百日咳菌により引き起こされる百日咳の症状は，典型的には百日咳菌により引き起こされるものより軽いが，臨床兆候のみに基づく鑑別診断は困難である。さらに本邦においてはワクチン接種が行われているが、パラ百日咳菌に対しては無効である。

【0003】

百日咳を初期に診断することは、兆候および症状が他の一般的呼吸器疾患である、風邪、インフルエンザ、または気管支炎と似ているため、非常に困難である。百日咳を決定的に診断するためには培養法が用いられている。患者の鼻および／または喉から粘液を採取し，培養に用いるが、百日咳菌の培養には，診断が得られるまでおよそ１週間を要する。また百日咳菌の培養は、その細菌の性質のため偽陰性の結果が生じやすい。

【0004】

百日咳抗体あるいは抗原の測定も、百日咳感染を診断するために用いられている。最も一般的には，百日咳菌感染を示すために、百日咳毒素蛋白質の検出が用いられている。これらの抗体に基づくアッセイは良好な感度および特異度を有するが、非侵襲的に採取した粘膜サンプルではなく患者血液のサンプルを必要とし、さらに，感染が初期および／または回復期であることを必要とする。したがって，これらのアッセイは，疾病経過の適切な時に患者サンプルを取得しないと，偽陰性の結果を生じやすい。

【0005】

百日咳感染を検出する他の方法には、種々の遺伝子検査法がある。しかしながら、百日咳菌とパラ百日咳菌を同時にかつ区別して検出された報告はなされていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】（Ｍａｔｔｏｏｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：３２６−３８２，２００５）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は，生物学的サンプルにおいて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定するための組成物および方法を提供する。本発明は，単独で，または臨床症状または他の指標と組み合わせて、百日咳感染を診断するために用いることができる。詳細には，本発明は、百日咳菌またはパラ百日咳菌の同時検出を可能とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、百日咳菌のｐｔｘＡ領域とパラ百日咳菌のｐｔｘｐｓｕｅｄｏｇｅｎｅ領域を特異的に増幅する特定のオリゴヌクレオチドプライマー、および、該オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅法によって増幅される領域を特異的に検出する特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより、短時間で特異的に百日咳菌とパラ百日咳菌をそれぞれ、あるいは、同時に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。

【0009】

［１］試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出する方法であって、以下の（Ａ）に示す工程により試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する手段を含むことを特徴とする、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
（Ａ）
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。
［２］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマーが配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［３］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマーが配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列である［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［４］
［１］〜［３］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、配列番号８〜１７のいずれかに示される塩基配列からなる核酸プローブである、［１］〜［３］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［５］
［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、工程（Ａ）（Ｉ）に記載のフォワードプライマー、工程（Ａ）（ＩＩ）に記載のリバースプライマー、および、工程（Ａ）に記載の核酸プローブが、それぞれ以下の（ａ）〜（ｋ）のいずれかの塩基配列の組合せで示される、［１］に記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
（ａ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｂ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号９でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｃ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１０でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｄ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１１でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｅ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１２でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｆ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１３でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｇ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１４でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｈ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１５でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｉ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１６でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｊ）フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、プローブが配列番号１７でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
（ｋ）フォワードプライマーが配列番号５、リバースプライマーが配列番号７、プローブが配列番号１８でそれぞれ示される塩基配列の組合せ
［６］
［５］に記載の核酸プローブが、末端のシトシンのうち少なくとも一つが蛍光色素で標識されている核酸プローブを用いることを特徴とする百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法において、核酸増幅を、α型ＤＮＡポリメラーゼ、および、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させた変異型、のうち１つ以上を含む系で行うことを特徴とする［１］〜［６］のいずれかに記載の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法。
［８］
配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、１対のプライマー。
［９］
配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなる、［８］に記載の、１対のプライマー。
［１０］
配列番号８〜１７のいずれかで示される塩基配列からなる、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するためのプローブ。
［１１］
［８］または［９］に示される一対のプライマーと、［１０］に示されるプローブとを組み合わせてなる、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出用のプライマー・プローブのセット。
［１２］
［６］〜［１１］のいずれかに記載のプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出キット。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出を迅速、正確、安価に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例１における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。

【図2】実施例２における融解曲線分析時の蛍光強度変化量を示す。グラフ縦軸は蛍光強度変化量、横軸は温度を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明は百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー）およびオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出する方法、該方法を実施するためのキットに係る。

【0013】

本発明では百日咳菌のｐｔｘＡ領域および／またはパラ百日咳菌のｐｔｘｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ領域を検出対象としている。百日咳菌のｐｔｘＡ領域の塩基配列を配列番号１に示す。

【0014】

［プライマー］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対が例示される。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマー。

【0015】

上記の配列番号２は配列番号１で示される塩基配列の一部分である。また、配列番号３は配列番号１で示される塩基配列の相補配列の一部分である。

【0016】

上記（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１６〜３６塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号４、５のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。

【0017】

上記（ＩＩ）のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３で示される塩基配列の中の連続する１６〜３６塩基のいずれかで示されるオリゴヌクレオチドプライマーであれば特に制限されない。好ましくは、配列番号６、７のいずれかで示される塩基配列からなる核酸プライマーが例示できる。上記より長い配列では検出対象の核酸配列が異なるため検出感度および特異性が低下する。

【0018】

上記（Ｉ）および（ＩＩ）のプライマーの組合せ（セット）は、上記で説明した範囲内であれば、原則、任意であり特に限定されるものではないが、好ましいセットとして、フォワードプライマーが配列番号４で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号６で示される塩基配列である、一対のプライマー、または、フォワードプライマーが配列番号５で示される塩基配列であり、リバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列である、一対のプライマーが例示できる。

【0019】

［プローブ］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ）は、特に限定されないが、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の相同性が比較的高い領域が望ましい。望ましくは８０％以上、特に９０％以上の相同性を有する配列が望ましい。

【0020】

上記のオリゴヌクレオチドプローブは、核酸が標識されていてもされていなくてもよい。標識される場合、標識される核酸の数に特に制限は無い。好ましくはオリゴヌクレオチドプローブの末端の核酸が標識されている形態であり、より好ましくは末端の核酸のうちどちらか片方のみが標識されている形態である。標識物質にも特に制限はないが、蛍光物質であることがより好ましい。蛍光標識としては特に標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質が好ましく、具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が例示できる。

【0021】

［検出方法］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法において、試料中の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌由来の核酸を検出する方法としては、以下の（１）〜（４）の工程を例示することができる。
（１）配列番号１と９５％以上相同な塩基配列で示される核酸配列のうち一部領域を核酸増幅するための核酸プライマー対であって、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれか１つ以上に該当する核酸プライマー対を用意する工程。
（Ｉ）フォワードプライマーが、配列番号２で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（ＩＩ）リバースプライマーが、配列番号３で示される塩基配列のうち１６塩基以上３６塩基以下の塩基配列からなる核酸プライマーである。
（２）被検核酸および核酸プライマー対を含む反応液によって、被検核酸を増幅する工程。
（３）工程（２）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる工程。
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程。

【0022】

［被検核酸の増幅］
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。

【0023】

前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば、クラミジアトラコマチスを寄生させた細胞培養試料や生体試料等の試料に含まれる核酸が挙げられる。

【0024】

前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、膿、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、血液などが挙げられる。試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。

【0025】

続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述のプライマー対を用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。なお、ＰＣＲ等の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。

【0026】

本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出方法における核酸の増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｒｅｓｅａｒｃｈ第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ：ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄｃｈｉｍｅｒｉｃｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ．第７８巻、第５３３頁（２００３年））などが挙げられる。

【0027】

なかでもＰＣＲ法は、試料核酸、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、一対のプライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長の３工程からなるサイクルを繰り返すことにより、上記一対のプライマーで挟まれる試料核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。すなわち、変性工程で試料の核酸を変性し、続くアニーリング工程において各プライマーと、それぞれに相補的な一本鎖試料核酸上の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程で、各プライマーを起点としてＤＮＡポリメラーゼの働きにより鋳型となる各一本鎖試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、二本鎖ＤＮＡとする。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上上記一対のプライマーで挟まれた試料ＤＮＡの領域は２^ｎ倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ領域は大量に存在するので、電気泳動等の方法により容易に検出できる。よって、遺伝子増幅法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、最近非常に広く用いられている技術である。
増幅反応としては、最初の熱変形工程が８０〜１００℃で１０秒〜１５分、繰り返しの熱変形工程が８０〜１００℃で１〜３００秒、アニーリンクが４０〜８０℃で１〜３００秒、伸長反応工程が６０〜８５℃で１〜３００秒程度行い、この繰り返しを３０〜７０回繰り返しすことが好ましい。

【0028】

核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼには、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。

【0029】

本発明のプローブが含まれる反応系で百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の核酸配列を増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌核酸配列またはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中に百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の核酸配列と結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。

【0030】

ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となる百日咳菌および／またはパラ百日咳菌核酸配列と結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。

【0031】

他方、ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。

【0032】

通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。

【0033】

さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、登録商標）、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー）なども利用できる。

【0034】

［ＤＮＡ合成活性］
本明細書において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。

【0035】

その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ塩化マグネシウム
１５ｍＭジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌＢＳＡ
Ｂ：２μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：１．５ｍＭｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ^〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：２０％トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：１μｇ／μｌキャリアーＤＮＡ

【0036】

［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８ａｔ２５℃），１０ｍＭＫＣｌ，６ｍＭ硫酸アンモニウム，１ｍＭＭｇＣｌ_２，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．００１％ＢＳＡ，５ μｇトリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。

【0037】

［核酸増幅産物とプローブとの複合体形成］
本発明の百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出方法においては、上記で説明した被検核酸の増幅によって得られた増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。

【0038】

核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。

【0039】

本発明において用いられる標識としては磁性体、電子伝達体、酵素、ビオチン、蛍光物質、ハプテン、抗原、抗体、放射性物質および発光団などがある。磁性体としては、酸化鉄、二酸化クロム、コバルト、フェライトなどが挙げられる。電子伝達体としては、フェロセン、ＰＱＱ、レドックス化合物が挙げられる。酵素としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，ＣａｌＦｌｕｏｒＲｅｄ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ６７０（登録商標）、放射性同位体（例えば，３２Ｐ，３５Ｓ，３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，１３１Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
好ましい検出可能な標識は蛍光標識である。本明細書において用いる場合，“蛍光標識”とは，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。

【0040】

本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，または蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。

【0041】

好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）３５０，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５６８，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌｌｏｗＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５''−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（ＢｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌＲｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（ＥｐｏｃｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。

【0042】

適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅＢｌａｃｋＨｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。

【0043】

検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる。例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ１４５−１５６（１９９５）を参照。
ハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどが挙げられる。放射性物質としては、
^３２Ｐ、^３５Ｓなどが挙げられる。発光団としては、ルテニウム、エクオリンなどが挙げられる。該標識は、核酸検出反応に影響を与えることがなければなにを用いても良い。また反応に影響がなければオリゴヌクレオチドのどの位置に結合させてもよい。好ましくは、３’末端、５’末端部位である。

【0044】

前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＭｇＳＯ_４、グリセロール、有機溶媒等、従来公知のものがあげられる。反応液の調整の方法としては、具体的には、反応液２５μｌあたり、オリゴヌクレオチドが０．５〜５０ｐｍｏｌ、×１０の緩衝液が０．５〜５０μｌ、２ｍＭのｄＮＴＰで０．５〜５０μｌ、塩類が２５ｍＭ濃度液で０．１〜３０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼが０．１〜３０ｎｇ程度であることが好ましい。

【0045】

検出方法としては、具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。

【0046】

前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜１００℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜２０分であり、好ましくは１秒〜１０分である。

【0047】

また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。

【0048】

ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。

【0049】

蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜１０℃／秒である。

【0050】

また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。

【0051】

プライマー、プローブ、検出キット
本発明はまた、上記で説明した百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出するための方法において用いるプライマー対、プローブまたは該プライマーと該プローブとを組合せたセットに関する。

【0052】

本発明はさらに、これらのプライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセットを含む、百日咳菌および／またはパラ百日咳菌検出キットに関する。
本発明のキットは、その構成において、プライマー対、プローブまたはプライマー・プローブのセット以外については特に限定されない。たとえばＰＣＲ法など公知の方法において、プライマーおよび／またはプローブとして上記のものを適用すればよい。

【実施例】

【0053】

以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0054】

実施例１百日咳菌の検出
＜百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４、６、８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、６、８と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ４はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ８はプローブとして使用され、3’末端は蛍光標識される。

【0055】

百日咳菌の検出
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0056】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６５０ｐｍｏｌ、
オリゴ８（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ

【0057】

＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．０９℃／秒

【0058】

＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、６５℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表１および図１の通りであった。

【0059】

【表1】

【0060】

図１のグラフから、百日咳菌ゲノムの存在する場合には、明らかなピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が６０分以内であった。

【0061】

実施例２パラ百日咳菌の検出
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。

【0062】

【0063】

＜増幅条件＞
９４℃・３０秒、
９７℃・１秒、
５８℃・３秒、
６３℃・５秒（５０サイクル）
４０℃・３０秒
４０℃から７５℃に温度上昇させながら蛍光検出する。温度上昇速度は０．２℃／秒

【0064】

＜融解曲線解析による検出＞
融解温度解析の結果、−ｄＦ（蛍光強度変化量）／ｄＴ（温度変化量）の最も大きな値を示す温度（Ｔｍ）は、６５℃付近を示し、その時の蛍光強度変化量は下記表２および図２の通りであった。

【0065】

【表2】

【0066】

図２のグラフから、パラ百日咳菌ゲノムの存在する場合には、百日咳菌ゲノム検出時とは異なる温度にピークが得られることが確認された。
本検出系において、検出まで要する時間が６０分以内であった。

【0067】

実施例３百日咳菌の検出
＜百日咳菌を検出するオリゴヌクレオチドの合成＞
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号４、６、９に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ４、６、９と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマジェノシス（株）等）に依頼した。
オリゴ４はセンス鎖であり、オリゴ６がアンチセンス鎖であり組み合わせて増幅反応のオリゴヌクレオチドとして使用される。オリゴ９はプローブとして使用され、３’末端は蛍光標識される。

【0068】

（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0069】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６１５ｐｍｏｌ、
オリゴ９（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（ＫＯＤ plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0070】

【0071】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６５．１℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0072】

（２）パラ百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。

【0073】

【0074】

【0075】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５８．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0076】

実施例４
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0077】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ５５ｐｍｏｌ、
オリゴ７１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１０（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0078】

【0079】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６４℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0080】

【0081】

【0082】

【0083】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５７．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0084】

実施例５
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0085】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１１（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0086】

【0087】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６３℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0088】

【0089】

【0090】

【0091】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５６．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0092】

実施例６
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0093】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ５５ｐｍｏｌ、
オリゴ７１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１２（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0094】

【0095】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６２℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0096】

【0097】

【0098】

【0099】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５５．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0100】

実施例７
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0101】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１３（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0102】

【0103】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６１℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0104】

（２）パラ百日咳に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
パラ百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件によりパラ百日咳菌を検出した。

【0105】

【0106】

【0107】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５４．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0108】

実施例８
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0109】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ５５ｐｍｏｌ、
オリゴ７１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１４（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0110】

【0111】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合６０℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0112】

【0113】

【0114】

【0115】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５３．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0116】

実施例９
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0117】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１５（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0118】

【0119】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５９℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0120】

【0121】

【0122】

【0123】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５２．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0124】

実施例１０
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0125】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ５５ｐｍｏｌ、
オリゴ７１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１６（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0126】

【0127】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５８℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0128】

【0129】

【0130】

【0131】

＜融解曲線解析による検出＞
融解曲線解析結果抽出ＤＮＡを用いた場合５１．℃付近にピークが認められたが、抽出ＤＮＡがない場合は、ピークは認められなかった。

【0132】

実施例１１
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0133】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ４５ｐｍｏｌ、
オリゴ６１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１７（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0134】

【0135】

【0136】

【0137】

【0138】

【0139】

【0140】

実施例１２
（１）百日咳菌に由来する核酸のＰＣＲ法による増幅
＜ＰＣＲ法による増幅反応＞
百日咳菌より抽出したＤＮＡ溶液をサンプルとして使用して、下記試薬を添加して、下記条件により百日咳菌を検出した。

【0141】

＜試薬＞
以下の試薬を含む１０μｌ溶液を調製した。
ＫＯＤｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ０．５Ｕ
オリゴ５５ｐｍｏｌ、
オリゴ７１５ｐｍｏｌ、
オリゴ１８（３’末端をＦＩＴＣにより標識）５ｐｍｏｌ、
×１０緩衝液（KOD plus ver.2用）１μｌ、
２ｍＭｄＮＴＰ１μｌ、
２５ｍＭＭｇＳＯ４２μｌ、
抽出ＤＮＡ溶液１００ｎｇ（ｏｒ蒸留水）

【0142】

【0143】

【0144】

【0145】

【0146】

【0147】

【産業上の利用可能性】

【0148】

本発明を百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の検出に利用することで、迅速性、正確性の両方に優れ、なおかつ高感度に百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を検出することができる。

【図1】

【図2】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

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