知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6278210
(24)【登録日】2018年1月26日
(45)【発行日】2018年2月14日
(54)【発明の名称】アミノ官能性化合物の分析方法及び分析試薬
(51)【国際特許分類】
C07D 207/404 20060101AFI20180205BHJP
G01N 27/62 20060101ALI20180205BHJP
C07D 403/12 20060101ALI20180205BHJP
【ＦＩ】
C07D207/404CSP
G01N27/62 V
C07D403/12
【請求項の数】15
【全頁数】31
(21)【出願番号】特願2015-188056(P2015-188056)
(22)【出願日】2015年9月25日
(62)【分割の表示】特願2012-216013(P2012-216013)の分割
【原出願日】2003年2月13日
(65)【公開番号】特開2016-29068(P2016-29068A)
(43)【公開日】2016年3月3日
【審査請求日】2015年10月14日
(31)【優先権主張番号】特願2002-36446(P2002-36446)
(32)【優先日】2002年2月14日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000066
【氏名又は名称】味の素株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100080816
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 朝道
(72)【発明者】
【氏名】宮野 博
(72)【発明者】
【氏名】矢橋 昭久
(72)【発明者】
【氏名】新保 和高
(72)【発明者】
【氏名】中沢 正和
(72)【発明者】
【氏名】平山 和雄
【審査官】
村守 宏文
(56)【参考文献】
【文献】
特許第５１３６５４２（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】
特表２００４−５２５８８９（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第０２／００４９３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特許第４４５３３６３（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】
特開平１０−３０６０７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００２−５２３０５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００４−５０５２４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２００２／０５９１０６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第００／０１１２０８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開平０５−２２２０３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００１−２３５４７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
SCHMEER,K. 他，“Compositional analysis of the phenylthiocarbamyl amino acids by liquid chromatography-atmospheric，Journal of Chromatography A，１９９５年 ２月 ３日，Volume 691, Issues 1-2，Pages 285-299
【文献】
CHACE,D.H. 他，“Rapid Diagnosis of Phenylketonuria by Quantitative Analysis for Phenylakanine and Tyrosine in Neon，Clinical Chemistry，１９９３年 １月，Volume 39, Number 1，Pages 66-71
【文献】
Analytical Biochemistry，２００１年，Vol.294, No.1，p.7-18
【文献】
Techniques in Protein Chemistry VII，１９９６年，p.331-339
【文献】
Journal of Chromatography，１９８７年，Vol.407，p.273-279
【文献】
平井 外２名，二級アミンを含む新規イソプレノイド誘導体の高速液体クロマトグラフィーにおける高感度検出のための蛍光誘，分析化学，日本，１９９１年，Vol.40, No.5，233-238
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｄ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種のアミノ官能性化合物を混合した複数種混合物を質量分析で測定するための質量分析用標識試薬であって、下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物を含有することを特徴とする質量分析用標識試薬。
（１）
上記式中、Ａｒは、アルキル基、芳香族基、ハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、アルコキシ基、アシル基、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、若しくはトリアルキルアンモニウム基を有している、芳香族性を示す炭素環化合物残基、又は芳香族性を示す複素環化合物残基を表し、
前記芳香族性を示す炭素環化合物残基が、フェニル基又はナフチル基であり、
カルバメート基の窒素原子は、前記炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を構成する炭素原子と結合することにより、Ａｒと結合しており、
当該カルバメート化合物は塩の形態でもよい。
上記式中、Ａｒは、アルキル基、芳香族基、ハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、アルコキシ基、アシル基、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、若しくはトリアルキルアンモニウム基を有している、芳香族性を示す炭素環化合物残基、又は芳香族性を示す複素環化合物残基を表し、
前記芳香族性を示す炭素環化合物残基が、フェニル基又はナフチル基であり、
カルバメート基の窒素原子は、前記炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を構成する炭素原子と結合することにより、Ａｒと結合しており、
当該カルバメート化合物は塩の形態でもよい。
【請求項2】
上記式中、Ａｒは、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、若しくはトリアルキルアンモニウム基を有している、請求項１記載の標識試薬。
【請求項3】
前記芳香族性を示す複素環化合物残基の環構成原子が、炭素原子及び窒素原子である、請求項１記載の標識試薬。
【請求項4】
前記芳香族性を示す複素環化合物残基が、ピリジル基、ピラジル基、キノリル基、アクリジル基、又はクマリル基である、請求項１記載の標識試薬。
【請求項5】
前記質量分析用標識試薬が、タンデム質量分析用標識試薬である、請求項１〜４のいずれか一項記載の標識試薬。
【請求項6】
前記タンデム質量分析用標識試薬が、プリカーサーイオンスキャン法、セレクテッドリアクションモニタリング法、又はコンスタントニュートラルスキャン法によるタンデム質量分析用標識試薬である、請求項５記載の標識試薬。
【請求項7】
前記複数種のアミノ官能性化合物が、アミン類、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質からなる群より選ばれるアミノ官能性化合物の混合物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の標識試薬。
【請求項8】
前記アミン類が、１級アミン、又は２級アミンである、請求項７記載の標識試薬。
【請求項9】
複数試料の同時測定用である、請求項１〜８のいずれか一項記載の標識試薬。
【請求項10】
少なくともアミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物を質量分析法により分析する方法であって、当該アミノ官能性化合物を請求項１〜９記載の標識試薬により標識し、質量分析に付すことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法。
【請求項11】
前記標識後であって質量分析前に分離に付される、請求項１０記載の分析方法。
【請求項12】
前記分離が液体クロマトグラフィーにより行われる、請求項１１記載の分析方法。
【請求項13】
前記分離が、逆相カラムを用いて行われる、請求項１１または１２記載の分析方法。
【請求項14】
アミノ官能性化合物と請求項１〜９記載の標識試薬とを反応させることを特徴とする質量分析に適したアミノ官能性化合物の標識化方法。
【請求項15】
アミノ官能性化合物に対して１０〜１０００倍モル当量の標識試薬を使用する、請求項１４に記載の標識化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミノ酸、ペプチド等アミノ官能性化合物を、質量分析法を利用して、選択性を高める分析試薬により、簡便かつ高感度に分析（検出を含む。）する方法、及びその方法に使用可能な分析（標識）試薬、標識化方法、更にはそれらに使用可能な新規カルバメート化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
アミノ酸、ペプチド、及びその他のアミノ官能性化合物は生体内で重要な役割を演じており、その存在量を正確に把握することは、医学、薬学、農学、生化学、臨床化学の属する分野、及び他の分野で要求されている。それらの分野で特にアミノ酸の選択的かつ高感度な定量法が望まれているのは、この分析に供される試料量や分析対象の濃度が様々であること、また夾雑成分の影響を受け易いことが理由である。細胞内の代謝アミノ酸を定量する場合はその典型的な例である。また、生体から入手する試料量が少なければ少ない程、例えば被験者の肉体的・精神的負担は少なくなる。
【0003】
殆どのアミノ酸は吸収、蛍光性及び電気化学的応答が非常に弱い。分析感度を増大させるために、通常、アミノ基を紫外吸収性の大きな化合物や発色団或いは発蛍光団により標識し、紫外、可視或いは蛍光で、それぞれ検出する方法が用いられている。代表的な紫外標識試薬として、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）[Cohen, S. A. and Strydom, D. J., 174 1 (1988) 参照。]、可視標識試薬として、ニンヒドリンが広く知られ、市販されている。また、蛍光標識試薬として、オルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）[Roth, M., Anal. Chem., 43 880 (1971) 参照。]、ダンシルクロライド（Ｄａｎｓｙｌ−Ｃｌ）[Seiler, N., Methods Biochem. Anal., 18 259 (1970) 参照。]、４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラザン（NBD-F）[Imai, K., and Watanabe Y., Anal. Chim. Acta, 130 377 (1981) 参照。]等が報告され、また市販されている。これらの分析方法は、紫外／可視による方法では、分析感度がおよそ１ｐｍｏｌが限界であり、蛍光による方法の検出できるアミノ酸量は、およそ１００ｆｍｏｌ程度であり、生化学や臨床化学の分野においては、更なる感度向上が望まれていた。
【0004】
紫外領域に吸収を有する標識体（ＰＩＴＣ：２５４ｎｍ）や励起、蛍光波長が比較的短波長にある標識体（ＯＰＡ：λｅｘ＝３４０〜３４５ｎｍ、λｅｍ＝４５５ｎｍ、Ｄａｎｓｙｌ−Ｃｌ：λｅｘ＝２５５ｎｍ、λｅｍ＝４７０ｎｍ）の場合、定量に当り、夾雑物の影響を受け易いという問題点を有している。
【0005】
更に、ＰＩＴＣ、Ｄａｎｓｙｌ−ＣｌやＮＢＤ−Ｆ等標識試薬の多くは、試薬或いはその加水分解物は、強い紫外吸収や蛍光を有している。通常、定量的分析結果を得るためには、標識反応では、分析対象に対し大過剰の試薬を加える。そのため、試薬或いはその加水分解物は、分析の大きな障害となってきた。
【0006】
６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（AQC）[Iwaki, K., Yoshida, S., Nimura, N., Kinoshita, T., Takeda, K., and Ogura, H., Chromatographia 23 899 (1987) 参照。]もアミノ基を標識し、アミノ酸を蛍光で検出する試薬として開発され、市販されているものである。しかし、励起波長λex=245nm、蛍光波長λem=395nmと短波長側にあり、夾雑物の影響を受け易い点、また、試薬及び試薬の分解物もまた、蛍光を有しているという点で、前記の他の試薬と差は無い。
【0007】
これらの標識試薬を用いた場合、標識化合物を液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）分離してアミノ酸を分析する方法が行われてきた。ＨＰＬＣでは、僅かな環境の変化、即ち、移動相の組成の僅かな変化やカラム温度の変動により、その分析対象物質のカラム保持能が変動する場合が多い。検出は標識試薬の吸収や蛍光で行われるため、それぞれのアミノ酸は、カラム保持能で同定しなければならない。また、これまでの知見から化合物が推測できない保持能を有する分析対象が検出された場合、その物質がアミノ基を有することは分かっても、それ以外の構造に関する情報は得られない。
【0008】
このように、紫外、可視或いは蛍光による標識アミノ官能性化合物の分析は、選択性という点でも問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明の課題は、アミノ酸等のアミノ官能性化合物の簡便かつ高感度で高い選択性を有する分析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、アミノ酸やその他のアミノ官能性化合物を特定の構造を有する標識試薬により標識し、しかる後に標識されたアミノ酸等のアミノ官能性化合物を質量分析法、特に好ましくは質量分析法の一手法であるタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ法）に供することにより、それらの化合物を簡便、選択的かつ高感度に分析できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【0011】
即ち、本発明は、少なくともアミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物を質量分析法により分析する方法であって、当該化合物を下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物により標識し、質量分析に付すことに特徴を有するアミノ官能性化合物等の分析方法に存する。この発明を本発明において、特に「本発明の分析方法」と称することがある。【化1】
【0012】
本発明において、「アミノ官能性化合物」とは分子内にアミノ基及び／又はイミノ基を有する化合物（塩の形態でもよい。）を意味し、これらのアミノ基やイミノ基は１個でも複数でもよい。試料中のアミノ官能性化合物は１種でも複数種混合物でもよい。
【0013】
当該式中、Ａｒに関し、炭素環化合物残基としてそれぞれ置換基を有していてもよいフェニル基、ナフチル基（１−及び２−ナフチル基）、アントリル基（１−、２−及び５−アントリル基）等を、また、複素環化合物残基としてそれぞれ置換基を有していてもよいピリジル基（２−、３−及び４−ピリジル基）、ピラジル基、キノリル基（２〜８−キノリル基）、アクリジル基（１〜４−及び９−アクリジル基）、クマリル基（５〜８−クマリル基）等を挙げることができる。当該基は芳香環に置換基を一つ以上有することができる。置換基として、炭素数１〜５のアルキル基、ナフチル基、フェニル基等の芳香族基、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子等のハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜７のアシル基（アセチル基、ベンゾイル基等）、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基等を挙げることができる。アミノ官能性化合物を高感度で検出するためには、中でも、極性置換基、特に溶液中でイオン化し易い置換基を有することが好ましく、例えばスルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアンモニウム基等を挙げることができる。
【0014】
Ａrの具体な例として、下記の基を挙げることができる：フェニル基、ナフチル基（１−及び２−ナフチル基）、アントリル基（１−、２−及び５−アントリル基）、ピリジル基（２−、３−及び４−ピリジル基）、ピラジル基、キノリル基（３−、６−及び８−キノリル基）、９−アクリジル基、６−クマリル基、ｐ−ジアルキルアミノフェニル基、ｐ−トリアルキルアンモニウムフェニル基、１−（３−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（５−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（３−ジアルキルアミノ）ナフチル基、１−（５−ジアルキルアミノ）ナフチル基、ｐ−スルホフェニル基、１−（３−スルホ）ナフチル基、１−（５−スルホ）ナフチル基、ｐ−ホスホフェニル基、１−（３−ホスホ）ナフチル基、１−（５−ホスホ）ナフチル基、ｐ−グアニジノフェニル基、１−（３−グアニジノ）ナフチル基、１−（５−グアニジノ）ナフチル基等。
【0015】
上記ジアルキルアミノ基及びトリアルキルアンモニウム基のアルキル基はそれぞれ独立的に、炭素数１〜５のアルキル基を表すことができる。
【0016】
当該アミノ官能性化合物としては、アミン類（１級アミン、２級アミン等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質等を挙げることができる。このような化合物を複数種含んでいてもよい。例えば、アミノ酸の複数種混合物、アミノ酸１種以上とペプチド１種以上の混合物、アミノ酸１種以上とアミン１種以上の混合物等を挙げることができる。
【0017】
本発明において使用する質量分析法としては、質量の分析を利用する分析法であれば、特に制限は無いが、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ法）による検出方法を採用するのが特に好ましい。
【0018】
ＭＳ／ＭＳ法の代表的な例としてはＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ 法、Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ 法、及びＣｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ 法を挙げることができる。ＭＳ／ＭＳ法に含まれる分析法であれば今後開発される方法を採用することもできる。
【0019】
複数種のアミノ官能性化合物を含む試料について分析する場合、アミノ官能性化合物の全量を定量することもできるし、化合物単位でこれを定量することもできる。例えば、複数種アミノ酸の混合物を分析する場合、全アミノ酸を定量することも、個別アミノ酸の定量をすることもできる。
【0020】
本発明は、別の形態として、下記の発明が含まれる。
【0021】
１． アミノ官能性化合物と下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物とを反応させることに特徴を有する質量分析に適したアミノ官能性化合物の標識化方法（標識方法）。【化2】
【0022】
２． 下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物を含有することに特徴を有する質量分析に適したアミノ官能性化合物用標識試薬（標識試薬；標識剤）。【化3】
【0023】
以上、１．標識方法及び２．標識試薬の発明において、アミノ官能性化合物、カルバメート化合物の範囲や内容ついては、前記本発明の分析方法において説明した通りである。
【0024】
本発明は、更に別の形態として、下記の発明が含まれる。
【0025】
３． 下記一般式（１）で示されることに特徴を有するカルバメート化合物（新規化合物）、又はこのカルバメート化合物を含有することに特徴を有するアミノ官能性化合物の分析に適した標識試薬（標識剤）。
【0026】
この発明は、前記標識試薬として使用可能な新規化合物、又はこの新規化合物を含有する標識試薬に関する。本発明の新規化合物は、前記本発明の分析方法に使用可能なカルバメート化合物のうち、既知の化合物を除いた化合物から選択される。従って、カルバメート化合物の範囲については、既知の化合物を除いて、前記本発明の分析方法のところで説明したカルバメート化合物についての説明が先ずここでも適用される。【化4】
【0027】
ピリジル基及びピラジル基については、何れも芳香環に極性置換基を有していても有していなくてもよいことになる。
【0028】
当該式中、当該炭素環化合物又は複素環化合物残基としては、フェニル基、ナフチル基（１−及び２−ナフチル基）、アントリル基（１−、２−及び５−アントリル基）等、ピリジル基（２−、３−及び４−ピリジル基）、ピラジル基、キノリル基（３−、６−及び８−キノリル基）、アクリジル基（１〜４−及び９−アクリジル基）、クマリル基（５〜８−クマリル基）等を挙げることができ、上記極性置換基としてスルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ３Ｎａ等）、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、及びトリアルキルアンモニウム基等を挙げることができる。
【0029】
当該式中、Ａｒとして、より好ましくは３−ピリジル基、ピラジル基、ｐ−ジアルキルアミノフェニル基、ｐ−トリアルキルアンモニウムフェニル基、１−（３−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（５−トリアルキルアンモニウム）ナフチル基、１−（３−ジアルキルアミノ）ナフチル基、１−（５−ジアルキルアミノ）ナフチル基、ｐ−スルホフェニル基、１−（３−スルホ）ナフチル基、１−（５−スルホ）ナフチル基、ｐ−ホスホフェニル基、１−（３−ホスホ）ナフチル基、１−（５−ホスホ）ナフチル基、ｐ−グアニジノフェニル基、１−（３−グアニジノ）ナフチル基、１−（５−グアニジノ）ナフチル基等を挙げることができる。
【0030】
前記ジアルキルアミノ基及びトリアルキルアンモニウム基のアルキル基としては、それぞれ独立的に、炭素数１〜５であるアルキル基を挙げることができる。
【0031】
本発明で使用するアミノ官能性化合物の上記アミノ基（又はイミノ基）の標識試薬（カルバメート化合物）による標識化には特に困難は無い。アミノ官能性化合物と前記カルバメート化合物とを反応せしめて標識化すればよい。標識化反応の条件は、このような試薬を用いて標識する場合の一般的な条件（Iwaki, K., Yoshida, S., Nimura, N., Kinoshita, T., Takeda, K., and Ogura, H., Chromatographia 23 899 (1987) 参照。）を用いればよいが、好ましくはアミノ官能性化合物をｐＨ値８〜１０程度の環境下で、アルコール類を除く適当な有機溶媒で溶解した試薬と標識試薬とを混合した後、６０℃程度に加熱する等の条件を好適に採用することができる。標識試薬（カルバメート化合物）の使用量については、アミノ官能性化合物の量、特にその中に含まれる全アミノ基、イミノ基の量を考慮して、アミノ官能性化合物に対し、１０〜１０００倍モル（当量）程度、好ましくは１００〜１０００倍モル（当量）程度使用し、全てのアミノ基、イミノ基に対して標識できるようにする。
【0032】
本発明に係る化合物の調製には特に困難は無い。その調製方法としては、例えば、下記の反応式に従って芳香族アミンとＮ，Ｎ‐ジスクシンイミジルとから容易に合成することができる。また、トリアルキルアンモニウム塩を製造する場合は、そのジアルキルアミン体とヨウ化メチル等ヨウ化アルキルとから容易に合成することができる。【化5】
【0033】
本発明の新規化合物には、以下のものが含まれる。ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート；
３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート；
ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド；及び
アミノピラジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート。
【0034】
本発明のカルバメート化合物（新規化合物）、及び本発明において使用するカルバメート化合物は何れも遊離体或いは塩の形態でもよい。塩の形態には特別の制限は無い。各種アミンの塩を調製する場合に使用する造塩工程を利用して目的とする塩を調製することができる。例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の鉱酸や酢酸等の有機酸との塩を挙げることができる。更に、ヨウ化メチル等のヨウ化アルキル、臭化メチル等の臭化アルキル、塩化メチル等の塩化アルキル等、アミンに作用せしめて第４級アンモニウムを調製する場合に使用する試薬を用いて目的とする塩を調製することもできる。また、スルホン酸基、リン酸基等の酸性置換基を有する場合、それを塩基性物質等で中和した形の誘導体も当該塩の中に含まれる。
【発明の効果】
【0035】
本発明によれば、アミノ酸、ペプチド等のアミノ官能性化合物を、特定の標識試薬を用いることにより選択性を高めて、簡便かつ高感度に分析することができる。特に、ＭＳ／ＭＳ法等、質量分析法により目的化合物を定量的に分析することができる。また、複数の試料（サンプル）を同時に測定することもできる。更に、このために使用する質量分析用の標識試薬やこの標識試薬に使用することができる新規化合物も提供する。
【0036】
従って、本発明は産業上、特に食品、医薬品、医療や、分析機器の分野において広く実施することができ、故に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１は、ＴＡＨＳ−標識アミノ酸１７種類のＳＲＭ分析結果を図示したものである。 実施例の例７：分析例１において、標識剤としてｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）を用いた標識アミノ酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるＳＲＭクロマトグラムである。最終標識アミノ酸濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図2】図２は、ＴＡＨＳ−標識アミノ酸１７種類のＰｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ｓｃａｎ分析結果を図示したものである。 実施例の例８：分析例２において、標識剤としてｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）を用いた標識アミノ酸のＰｒｅｃｕｒｓｏｒ ｉｏｎ ｓｃａｎ分析によるマススペクトルである。最終標識アミノ酸濃度：２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図3】図３は、ＤＡＨＳ−標識アミノ酸１７種類のＳＲＭ分析結果を図示したものである。 実施例の例９：分析例３において、標識剤としてｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）を用いた標識アミノ酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるＳＲＭクロマトグラムである。最終標識アミノ酸濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図4】図４は、ＡＰＤＳ−標識アミノ酸１７種類のＳＲＭ分析結果を図示したものである。 実施例の例１０：分析例４において、標識剤として３−アミノピリジルカルバメート（ＡＰＤＳ）を用いた標識アミノ酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるＳＲＭクロマトグラムである。最終標識アミノ酸濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図5】図５は、ＡＱＣ−標識アミノ酸１７種類のＳＲＭ分析結果を図示したものである。 実施例の例１１：分析例５において、標識剤として６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）を用いた標識アミノ酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法によるＳＲＭクロマトグラムである。最終標識アミノ酸濃度：０．２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図6】図６は、ＮＡＨＳ−標識アミノ酸１７種類のＣｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ ｓｃａｎ分析結果を図示したものである。 実施例の例１２：分析例６において、標識剤として１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＮＡＨＳ）を用いた標識アミノ酸のＣｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ ｓｃａｎ分析によるマススペクトルである。最終標識アミノ酸濃度： ２ｎｍｏｌ／ｍＬ。ＴＩＣ：Ｔｏｔａｌ Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ。
【図7】図７は、標識剤としてＰＡＨＳを用いた標識アミノ酸１９種類のＣｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ ｉｏｎ ｓｃａｎ分析結果を図示したものである。実施例の例１３：分析例７において、標識剤としてＰＡＨＳを用いた標識アミノ酸のＣｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ分析によるマススペクトルである。最終標識アミノ酸濃度：５ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【図8】図８は、例１４：分析例８において、標識剤としてｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）を用いた標識アミノ酸のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＳＲＭクロマトグラムである（アミノ酸２０種類の高速分析クロマトグラム）。最終標識アミノ酸濃度：０．５ｎｍｏｌ／ｍＬ。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下に、本発明の実施の形態について説明する。好ましい代表例を中心に説明するもので、本発明はこれに限定されるものではない。
【0039】
＜分析方法の原理＞本発明における分析方法においては質量分析が使用されるが、その原理等について先ず説明する。
【0040】
アミノ官能性化合物、例えばアミノ酸は下記反応式により標識試薬により標識することができる。【化6】
【0041】
Ａrは前記本発明の分析方法において説明したＡrと同じ意味を有する。上記アミノ酸を示す一般式中のＲは、この一般式が各種アミノ酸を表すものとして適切な置換基を表す。塩基性アミノ酸のように、Ｒ中に更にアミノ基や、イミノ基を有する場合、これらの基ともカルバメート化合物が反応する。
【0042】
標識試薬に、前記カルバメート化合物と、例えばアミノ酸との標識体は、質量分析計内において、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ； ＣＩＤ）すると下記反応式に示す点線矢印の部位において選択的な開裂が発生する。標識試薬として、陽イオン性を増大させるために、炭素環或いは複素環に、好ましくは例えば置換基として前記ジアルキルアミノ基又はトリアルキルアンモニウム基が結合したものを選択し、質量分析計で陽イオンを観測するように設定すると、アミノ酸由来の構造がニュートラルロスし、試薬由来のフラグメントイオン ［Ａｒ−ＮＨ−ＣＯ］だけが選択的に検出される。
【0043】
このことを利用して、下記に示す２種類の測定方法、即ち、プリカーサーイオンスキャン法（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ）、セレクテッドリアクションモニタリング法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ （ＳＲＭ）法）により、第一のマスアナライザーでアミノ官能性化合物と前記標識試薬との反応体のイオンを、第二のマスアナライザーで試薬由来のフラグメントイオンを検出することで極めて選択性が高く、高感度な分析を達成することができる。Ａｒは前記Ａｒと同じ意味を有する。【化7】
【0044】
このような特徴は、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）、アミノピラジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）、９−アミノアクリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート等で示された。
【0045】
一方、標識試薬に前記カルバメート化合物の中、試薬のイオン性が小さい化合物を選択した場合、ＣＩＤにより同様に点線矢印の部位において選択的な開裂が発生するが、質量分析計内で陽イオンを観測するように設定すると、試薬由来の構造がニュートラルロスし、［アミノ酸＋Ｈ］がフラグメントイオンとして観測される。このことを利用して、コンスタントニュートラルロススキャン法（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ）により、質量分析計で陽イオンを観測するように設定することにより、第一のマスアナライザーでアミノ酸と試薬の反応体のイオンを、第二のマスアナライザーで試薬骨格由来の構造がニュートラルロスしたアミノ酸由来のイオンを検出することで、極めて選択性が高く高感度なアミノ酸分析が達成される。このような特徴は、１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＮＡＨＳ）で示された。
【0046】
＜好適な質量分析方法＞本発明において使用する質量分析法には特に制限は無いが、より好ましい例として幾つか紹介する。
【0047】
＜Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ＞プリカーサーイオンスキャン分析では、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は指定された質量範囲に従ってスキャンされ、この範囲のイオンは、例えばＱ２でのＣＩＤにより解離する。このとき第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は、特定のフラグメントイオン（例えば、ＴＡＨＳの場合ｍ／ｚ ＝１７７）を選択するように設定する。得られるスペクトルには特定のフラグメントイオンを生成するプリカーサーイオン（親イオン）だけが記録される。
【0048】
＜Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ （ＳＲＭ）＞ＳＲＭ分析では、対象となるイオンを第一のマスアナライザー（Ｑ１等）で選択し、このイオンを衝突セルの中で解離させ、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で特定のフラグメントイオン（例えば、ＴＡＨＳの場合ｍ／ｚ ＝１７７）を選択してモニタリングする。この方法により、定量対象化合物と同一の保持時間でかつプリカーサーイオンと同一の質量を有する夾雑成分が存在しても、夾雑成分が定量対象化合物のフラグメントイオンを生じない限り、その影響を排除できるので、感度・選択性が飛躍的に向上する。
【0049】
＜Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ＞コンスタントニュートラルスキャン分析では、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は指定された質量範囲に従ってスキャンされ、この範囲のイオンは、例えばＱ２でのＣＩＤにより解離する。このとき第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は、特定のニュートラルフラグメント（例えば、１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの場合 ｍ／ｚ ＝１７０）を選択するように設定する。得られるスペクトルにはある特定の中性分子が脱離する全てのプリカーサーイオン（親イオン）を検出するスキャン法を採用する。
【0050】
質量分析は、その分析対象物質の質量に起因するイオンを検出できるために、極めて選択性の高い検出方法として、広く使用されている。本発明においては、分析対象を規則的な開裂を発生させる標識試薬を設計することで、アミノ官能性化合物のより選択性の高い検出方法を達成した。更に、イオン性の高い標識試薬を設計した場合には、アミノ官能性化合物の高感度分析を達成することができる。
【0051】
また、一般的に質量分析においては、低分子領域に夾雑物が多く、それがノイズの原因となり、分析対象の検出能を妨げる要因となるが、一つ以上の芳香環を試薬に導入することで、分子量を大きくし、ノイズの少ない領域での測定を達成することができる。
【0052】
アミノ酸の検出限界は、アミノ酸の種類によって異なるが、四重極質量分析計、例えばＡＰＩ３６５タイプの検出器（アプライドバイオシステム）を用い、ＳＲＭモードを選択した場合、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）で２〜４０ｆｍｏｌ程度、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）で３〜２０００ｆｍｏｌ程度、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）で３〜１８０ｆｍｏｌ程度、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）で２〜２００ｆｍｏｌ程度であり、一般的な蛍光標識試薬を凌ぐことができることが確認された（後述の実施例参照。）。特に、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）は蛍光標識試薬として市販されているものであるが、その検出限界は数百ｆｍｏｌと報告されている。ＳＲＭでの測定では、蛍光法と同等から最大で百倍の感度改善が見られた。
【0053】
質量分析装置の改良は装置会社（例えば、アプライドバイオシステム）により、盛んに進められている。最新の四重極質量分析計（例えば、ＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステム））による測定では、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート標識後のアミノ酸の検出限界は殆どのアミノ酸で１ｆｍｏｌ以下となる（後述実施例参照。）。
【0054】
本発明の方法による検出は、標識されたアミノ官能性化合物の質量に起因するイオンで行われるため、それ以外の化合物、例えば、標識試薬や標識試薬の加水分解物、その他、標識反応により形成される予期せぬ夾雑物の障害を受けることなく、分析対象を測定することができる。
【0055】
プリカーサーイオンスキャン及びニュートラルロススキャンでは、標識された全てのアミノ官能性化合物を検出することができる。そのため、同定されていない化合物が検出された場合、マススペクトルによりその質量等から、構造を推定することが可能となる。
【0056】
＜一般的な実施方法＞次に、本発明に関し、一般的な実施方法について説明する。試料中のアミノ官能性化合物としてアミノ酸混合溶液を用いた。
【0057】
芳香族アミンを有するカルバメート化合物によるアミノ官能性化合物の標識については、一般的には次のようにして調製することができる。例えば、アミン標準溶液に、硼酸塩緩衝液（硼酸塩０．２Ｍ、ＥＤＴＡ５ｍＭ）或いはｐＨ８〜９．５を示すその他の緩衝液（酸性塩にはリン酸等、塩基性塩にはＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３等）を添加する。標識試薬の有機溶媒への溶解性を考慮し、上記硼酸塩緩衝液、又はこの緩衝液とアセトニトリル等非アルコール性有機溶媒の混液を添加することもできる。
【0058】
この混合物に試薬溶液（ＨＰＬＣ等級アセトニトリル１ｍＬ中にカルバメート化合物３ｍｇ）を添加する。得られた混合物を、例えば５５℃で１０分間加熱する。
【0059】
このように調製した標識アミノ酸（アミノ官能性化合物）は逆相カラムを用いて分離後、質量分析装置に導入する。一般的な条件は次の通りである。
【0060】
ａ） ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００；ｂ） Ｃｏｌｕｍｕｎ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０ ＵＧ ５μｍ ４．６ｍｍＩ．Ｄ×２５０ｍｍ；
ｃ） 検出器：質量分析装置 Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３６５；及び
ｄ） 移動相
移動相Ａ：０．２％ ＡｃＯＨ
移動相Ｂ：０．２％ ＡｃＯＨ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ
勾配：０ｍｉｎ：０％ → ２０ｍｉｎ：３０％；及び
ｅ）温度：４０℃。
【0061】
ＳＲＭモードで標識アミノ酸を検出する場合、質量分析計の陽イオンモードにおけるＭＳ／ＭＳ法において第一のマスアナライザー（Ｑ１等）で指定アミノ酸の標識体である質量を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で試薬のフラグメントイオンの質量を選択して測定する。
【0062】
即ち、アミノ基又はイミノ基が分子（アミノ官能性化合物）中に一つ存在する場合を例にすると、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）でアミノ酸の標識体である質量（（アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ＋Ｈ）又は４級アンモニウム試薬の場合 （アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ））を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で試薬由来のフラグメントイオンを選択し測定する。但し、「ＨＯＳｕ」はＮ−ヒドロキシスクシンイミドを意味する。
【0063】
プリカーサーイオンスキャンモードで標識アミノ酸のみを検出する場合、質量分析計の陽イオンモードにおけるＭＳ／ＭＳ法において第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は設定した質量範囲に従ってスキャンされ、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は設定した特定のフラグメントイオンの質量を選択して測定する。
【0064】
即ち、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）では設定した質量範囲（例えば ｍ／ｚ＝１００〜６００）をスキャンし、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で試薬由来のフラグメントイオンを選択し測定する。
【0065】
コンスタントニュートラルロススキャンで標識アミノ酸のみを検出する場合、質量分析計の陽イオンモードにおけるＭＳ／ＭＳ法において第一のマスアナライザー（Ｑ１等）は設定した質量範囲に従ってスキャンされ、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）は設定した特定のニュートラルフラグメントを与える全てのプリカーサーイオンを測定する。
【0066】
即ち、第一のマスアナライザー（Ｑ１等）では設定した質量範囲（例えば、ｍ／ｚ＝１００〜６００）をスキャンし、第二のマスアナライザー（Ｑ３等）で試薬由来のニュートラルフラグメントを損失（ロス）したプリカーサーイオンを選択し測定する。
【0067】
＜標識試薬の合成方法＞目的とする標識試薬については、従来法（例えば、Iwaki, K., Yoshida, S., Nimura, N., Kinoshita, T., Takeda, K., and Ogura, H., Chromatographia 23 899 (1987)等参照。）により、容易に調製することができる。例えば、下記一般式（１）：
【化8】
【0068】
この方法で合成した標識試薬として、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド、ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、アミノピラジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート、９−アミノアクリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメートを挙げることができる。
【0069】
本発明を利用すれば、アミノ官能性化合物の短時間分析、アミノ官能性化合物の同位体の測定、未同定化合物の構造推定、複数試料の同時測定等も可能であり、以下若干説明する。
【0070】
（アミノ官能性化合物の短時間分析）本発明によればアミノ官能性化合物、特にアミノ酸の短時間分析を行うことができる。ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）等の標識試薬を用いることで短時間分析が可能となる。この結果、分析時間を大幅に短縮できるので処理能力が改善する。例えば、従来のＡＱＣ試薬を用いたアミノ酸分析では３５分程度の分析時間を有しており（ＡｃｃＱ・ＴａｇＴＭアミノ酸分析法（Ｗａｔｅｒｓ））、本発明による分析時間は短くなる。
【0071】
（アミノ官能性化合物の同位体の測定）本発明方法においては、アミノ官能性化合物の同位体を測定することができ、その結果アミノ官能性化合物の同位体比率を高感度で補正計算せずに求めることができる。
【0072】
質量分析計内における衝突誘起解離（ＣＩＤ）によりアミノ官能性化合物と試薬骨格由来の結合位での規則的な開裂を利用することによりこの発明方法が提供される。
【0073】
即ち、この発明においては本発明方法で特にＳｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法を使用することによりアミノ官能性化合物の同位体を測定することができ、その結果同位体比率を求めることができる。当該標識試薬としては、分析に際してアミノ酸等アミノ官能性化合物が選択的に開裂し、更にそのフラグメントイオンが高感度に検出される試薬、例えばＡＱＣ、ＴＡＨＳ等の標識試薬を使用することができる。
【0074】
〔同位体の測定に関する従来の技術〕天然とは異なる同位体組成を利用した分析方法は古くから用いられている。例えば、１３Ｃ、２Ｈ（Ｄ）、１５Ｎ、１８Ｏ等の天然存在比の低い安定同位体、或いは放射性同位体を含む基質を生体に導入することで基質の生体内における分布や変化を知ることは医学や、薬学のみならず様々な研究分野で用いられている。同位体を高感度に定量的に評価することができれば、同位体原子の挙動をトレースすることが可能となり、更なる情報の獲得につながる。しかしながら、アミノ官能性化合物を直接的に質量分析計で測定するには、感度面が問題となっている。一方、標識試薬で誘導化したアミノ官能性化合物の同位体比率を質量分析計で高感度に分析するためには、アミノ官能性化合物以外の骨格部分の天然同位体分布を考慮する必要があり、分析結果を補正し目的化合物の同位体比を算出する必要があった。
【0075】
例えば、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−マススペクトロメトリー）法では、本発明方法と同じように誘導体化を行うが、試薬部分の天然同位体比分布に起因する煩雑な補正計算が必要な場合が殆どである。
【0076】
また、ＮＭＲ法は、低感度或いは広いダイナミックレンジが狭いために微量の同位体の検出には向かない。
【0077】
［この発明の内容と実施］特に、アミノ官能性化合物のアミノ基と試薬骨格のカルボニル基の位置で規則的に開裂することが重要であることに着目して、タンデム質量分析計において、アミノ官能性化合物と試薬骨格由来の結合位で規則的な開裂を起こし、フラグメントイオンを得ることにより、試薬骨格に相当する部位の天然同位体分布の補正無しに、目的のアミノ官能性化合物の同位体比率を求めることが可能である。また、例えば、三連四重極型の質量分析装置を用いると、広いダイナミックレンジにある同位体比の高感度分析が可能になる。
【0078】
この発明においては、タンデム質量分析（計）において、例えば含まれる誘導化されたアミノ酸が選択的に開裂し、更にそのフラグメントイオンが高感度に検出される試薬を用いて本発明の質量分析を行うことにより目的とするアミノ官能性化合物の同位体の測定を行うことができ、その結果目的とする同位体比率を求めることができる。
【0079】
〔分析の原理〕この発明においてはタンデム質量分析法のうち、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法を採用する。但し、同位体という１マスユニット差の化合物の定量を行うために、１マスユニットが識別可能な分解能で測定を行うことができる。
【0080】
（未同定化合物の構造推定）本発明の標識試薬を用いると、
（１）標識化されるものは一級及び二級アミノ官能性化合物である。
（２）精密質量から組成式を求めることができる。
（３）（１）及び（２）の情報から未知化合物の構造絞込みが容易となる。
【0081】
即ち、本発明の標識試薬及び分析方法を用い、試料中のアミノ官能性化合物のプロファイリング法及びプロファイリングにより得られた標的化合物の構造を推定することができる。本発明の標識試薬では質量情報を高感度に得ることができるだけでなく、標識試薬骨格部とアミノ官能性化合物との結合部位で規則的な開裂が起こることから、得られるフラグメントイオンの情報は未知のアミノ官能性化合物のフラグメントイオン情報に等しいことから、構造解析をより容易に行うことが可能となる。
【0082】
〔構造解析の従来の技術〕紫外吸収或いは蛍光を有する試薬で誘導化し、分析を行った際に現われた未知のピークについては誘導化に用いた試薬との反応性から化合物の官能基の推定程度しか行うことができなかった。また、ＮＭＲを用いる場合には感度面から微量の化合物の解析は困難であることが多い。
【0083】
質量分析計を用いることで、高感度に得られる未知化合物の質量情報或いは未知化合物のフラグメントイオンの情報は構造解析を行う上で有用な情報となる。
【0084】
〔本発明による実施方法〕サンプル中から特異的なピーク或いは目的のピークを見出し、その特異的或いは目的のピークに該当する化合物の同定或いはその構造の推定を行う。
【0085】
例えば、タンデム質量分析において、Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ法やＣｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ法を用いることで誘導体化試薬部と被誘導体化化合物との間で規則的に開裂する化合物全てを選択的にモニターすることができる。即ち、誘導体化試薬と反応したアミノ官能性化合物を網羅的に検出し、その中から特異的なピーク或いは目的のピークを見出し質量に関する情報を得ることができる。
【0086】
更に、得られたピークに関しては精密質量の測定可能な装置により、精密質量を求めることにより、目的化合物の組成式を得、公共のデータベース等からその構造の絞込みを行う。また、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ法により得られるアミノ官能性化合物部のフラグメントイオンの解析を行うことにより目的化合物の構造を推定することができる。例えば、未知サンプルをＮＡＨＳ（或いはＰＡＨＳ）で標識し、Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ法による測定を行い、目的のピークを選択する。ここで、目的のピークについて精密質量を測定することで誘導化された 構造未知のアミノ官能性化合物としての組成式を知ることができる。また、Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ法により、フラグメントイオンとして得られるアミノ官能性化合物の精密質量から未知化合物そのものの組成式を得ることができる。また、更なるフラグメントイオンの組成式を得ることも可能であり、データベースの併用等により更に、推定構造を絞り込むことが可能である。
【0087】
（複数試料の同時測定）本発明においては、前記本発明の分析方法を利用して、標識試薬のうち、試薬内の原子の一部或いは全部が天然とは異なる同位体組成を有する化合物を用いることにより複数試料（サンプル）を同時に測定することができる。
【0088】
即ち、本発明は、更に別の形態として、下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物であって、構造中Ｏ＝Ｃ−ＮＨ−Ａｒに含まれる少なくとも一つの原子（但し、交換性の水素原子は除く。）に安定同位体元素を含むことに特徴を有するカルバメート化合物に存する。【化9】
【0089】
上記式中、カルバメート基の窒素原子に結合するＡｒは芳香族性を示す炭素環化合物又は複素環化合物残基を表し、当該芳香環は一つ以上の置換基を有していてもよく、Ａｒ基とカルバメート基の窒素原子との結合についてはＡｒ基中当該環を構成する炭素原子と当該カルバメート基の窒素原子とが結合し、当該カルバメート化合物は塩の形態でもよい。
【0090】
当該式中、Ａｒとして置換基を有していてもよいフェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピリジル基、ピラジル基、キノリル基、アクリジル基及びクマリル基から選択することができる。
【0091】
Ａｒが置換基を有する場合の置換基には、アルキル基、芳香族基、ハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、アルコキシ基、アシル基、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、及びトリアルキルアンモニウム基から選択することができる。
【0092】
この発明において使用する上記カルバメート化合物に関しては、本発明の分析方法で使用するカルバメート化合物について説明した通りである。
【0093】
上記カルバメート化合物に含まれる安定同位体としては、１３Ｃ、２Ｈ（Ｄ）、１５Ｎ、及び１８Ｏから選択することができる。
【0094】
本発明は、更に別の形態として、前記本発明の分析方法であって、安定同位体を含まないカルバメート化合物（標識試薬）と反応させた試料（サンプル）と、安定同位体を１つ以上含み、前記カルバメート化合物と同一構造（同一の骨格）を有するカルバメート化合物（標識試薬）を反応させた別の試料（サンプル）とを混合し、タンデム質量分析計で同時に複数の試料（サンプル）を分析する方法にも存する。
【0095】
上記安定同位体を含まないカルバメート化合物として、合成的に導入されたものではない、又は天然存在比に従うものを採用することができる。
【0096】
上記カルバメート化合物と同一構造を有するカルバメート化合物として、分子内に１２Ｃ及び／又は１３Ｃを含む化合物を採用することができる。
【0097】
この方法において、得られる分析結果を相対的、半定量的かつ視覚的に求める方法、特に相互に比較可能なように表現する方法を含むことができる。
【0098】
以上の方法は、代表的な方法を示したが、複数の試料に対して、同一構造式を有するカルバメート化合物（標識試薬）で相互に同位体組成を異にする化合物を複数種用意し、それぞれ各試料と各カルバメート化合物とを反応させ、これ等の混合物を一つの試料として本発明の質量分析を行うことにより、複数試料の同時測定を行うことができる。
【0099】
例えば、本発明の前記分析方法であって、一のカルバメート化合物（標識試薬）と反応させた試料（サンプル）と、前記一のカルバメート化合物に対する安定同位体を１つ以上含み前記カルバメート化合物と同一構造を有するカルバメート化合物（標識試薬）と反応させた別の試料（サンプル）とを混合し、タンデム質量分析計で同時に複数の試料（サンプル）を分析する方法や；
【0100】
同様に、複数の試料に対し、それぞれ相互に異なる数の同位体を含み質量の異なる同一構造（式）を有するカルバメート化合物複数種を用意し、各試料と当該相互に異なる各カルバメート化合物１種とを反応させた後に各試料反応物を混合し、タンデム質量分析計で同時に複数の試料（サンプル）を分析する方法等を提供する。
【0101】
これらの方法では、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）、ｐ−ジメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）のような試薬骨格側が第二マスアナライザーで検出することができる試薬を使用することができる。また、その質量差が大きい程望ましく、更にこれ等の標識試薬と構成原子の安定同位体としては、１２Ｃに対する１３Ｃの関係が望ましい。
【0102】
〔複数試料の同時測定に関する従来の技術〕複数の試料（サンプル）中のアミノ官能性化合物を分析する際には、サンプルの数の回数分析を行うことが必要となる。このような場合には、測定間誤差、即ち精度が問題となる。特に、質量分析計を検出器として用いた場合、試料ごとにイオン化効率が異なることが広く知られており、サンプル間の化合物量を比較する場合、内部標準物質による補正が必須であった。
【0103】
本発明においては、分析をより迅速に行うために、複数のサンプルを同時に測定する優れた方法を提供することができる。また、得られる分析結果を半定量的に視覚的に表現することもできる。例えば、視覚的にＤＮＡマイクロアレイのように表現することで、大量データを扱うことが可能となる。
【0104】
詳細には、カルバメート化合物の試薬骨格部：Ｏ＝Ｃ−ＮＨ−Ａｒ内に安定同位体原子を一つ以上導入することで、物理化学的性質がほぼ同じで、質量のみが異なる試薬を用い、更にタンデム質量分析計を用いることで、複数のサンプルを一度に分析に付すことができるようにする。
【好適な実施の形態】
【0105】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【0106】
＜例１：ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートの合成＞次の手順に従ってｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを合成した。アセトニトリル｛純正化学株式会社｝２５ミリリットル中にＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−ｐ−フェニレンジアミン｛和光純薬工業株式会社｝５３５ｍｇ（５ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れた。炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）｛和光純薬工業株式会社｝１．２８ｇ（５ミリモル）をアセトニトリル５０ミリリットル中に溶解させ、攪拌した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−ｐ−フェニレンジアミン溶液を２時間かけて滴下した。滴下が完了した後に、更に２２時間攪拌し、反応混合物からアセトニトリルを留去した。５ミリリットルのアセトニトリルに溶解させ、析出物を濾取した。収量は５９７ｍｇ（収率４８％）であった。
【0107】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ３ＣＮ、ｐｐｍ）：δ； ７．２２（ｄ、９．０Ｈｚ 、２Ｈ）、６．７２（ｄ、９．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．８８（ｓ、６Ｈ）、２．７６（ｓ、４Ｈ）。ＱＴＯＦＭＳ：ｍ／ｚ ２７８［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ：Ｃ１３Ｈ１６Ｎ３Ｏ４（高分解能ＱＴＯＦＭＳ；ｍ／ｚ ２７８．１１４１，［Ｍ＋Ｈ］＋，Δ−４．４ｐｐｍ）。
【0108】
＜例２：ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイドの合成＞次の手順に従って、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイドを合成した。アセトニトリル８ｍＬ、ジクロロメタン｛純正化学株式会社｝２ｍＬの混合溶媒中に、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート２６４ｍｇ（１．１ミリモル）を溶解させ、攪拌した。この溶液にヨウ化メチル｛ナカライテスク株式会社｝０．４ｍＬ（８当量）添加し、２３時間攪拌し、析出物を濾取した。収量：３５４ｍｇ（収率７６％）。
【0109】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＤＭＳＯ−ｄ６、ｐｐｍ）：δ；７．９７（ｄ、８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．６２（ｄ、８．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．５８（ｓ、９Ｈ）、２．８３（ｓ、４Ｈ）。ＱＴＯＦＭＳ：ｍ／ｚ ２９２［Ｍ］＋、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ：Ｃ１４Ｈ１８Ｎ３Ｏ４（高分解能ＱＴＯＦＭＳ；ｍ／ｚ ２９２．１２９７，［Ｍ］＋，Δ−２．９ｐｐｍ）。
【0110】
＜例３：３−アミノピリジルカルバメートの合成＞次の手順に従って、２−アミノピリジルカルバメートを合成した。アセトニトリル２５ミリリットル中に３−アミノピリジン｛和光純薬工業株式会社｝４７０ｍｇ（５ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れた。炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）１．２８ｇ（５ミリモル）をアセトニトリル５０ミリリットル中に溶解させ、攪拌した。この溶液に、３−アミノピリジン溶液を２時間かけて滴下した。滴下が完了した後に、更に２１時間攪拌し、反応混合物からアセトニトリルを留去した。得られた、非結晶性固体の１１２ｍｇを２ミリリットルのジエチルエーテル｛純正化学株式会社｝に溶解させ、１２時間、冷暗所に放置し、析出物を濾取した。収量：３２ｍｇ（収率２９％）。
【0111】
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３、ｐｐｍ）：δ；８．５２（ｄ、２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．３３（ｄｄ、１．２ ａｎｄ ４．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０３（ｄｄｄ、１．２， ２．４ ａｎｄ ８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．３２（ｄｄ、４．８ ａｎｄ ８．８Ｈｚ、１Ｈ）、２．９１（ｓ、４Ｈ）。ＱＴＯＦＭＳ：ｍ／ｚ ２３６［Ｍ＋Ｈ］＋、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｕｌａ：Ｃ１０Ｈ９Ｎ３Ｏ４（高分解能ＱＴＯＦＭＳ；ｍ／ｚ ２３６．０６７１，［Ｍ＋Ｈ］＋，Δ−１．５ｐｐｍ）。
【0112】
＜例４：１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート合成＞次の手順に従って、１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート［N. Nimura, K. Iwaki, T. Kinoshita, K. Takeda and H. Ogura , Anal. Chem., 58 (1986) 2372参照。］を合成した。アセトニトリル２５ミリリットル中に１−ナフチルアミン｛ＩＣＮ｝７１５ｍｇ（５ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れた。炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）１．２８ｇ（５ミリモル）をアセトニトリル５０ミリリットル中に溶解させ、攪拌した。この溶液に、１−ナフチルアミン溶液を２時間かけて滴下した。滴下が完了した後に、更に１８時間攪拌し、反応混合物からアセトニトリルを留去し目的の化合物５５８ｍｇ（収率２８％）を得た。
【0113】
＜例５：スクシンイミドフェニルカルバメート（ＰＡＨＳ）の合成＞次の手順に従ってPAHS [N. Nimura, K. Iwaki, T. Kinoshita, K. Takeda and H. Ogura , Anal. Chem., 58 (1986) 2372参照。]を合成した。アセトニトリル２５ミリリットル中にアニリン｛和光純薬｝４６７ｍｇ（５ミリモル）を溶解させ、滴下漏斗に入れた。炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）１．２８ｇ（５ミリモル）をアセトニトリル５０ミリリットル中に溶解させ、攪拌した。この溶液にアニリン溶液を２時間かけて滴下した。滴下が完了した後に、更に２３時間攪拌し、反応混合物からアセトニトリルを留去し、目的の化合物を混合物として得た。
【0114】
＜例６：芳香族カルバメート化合物によるアミンの標識化について具体的手順＞アミノ官能性化合物の標識は、芳香族カルバメートの極性の違いにより、以下の二つの方法（反応条件）を用いた。
【0115】
（１）アミノ官能性化合物を含む試料としてのアミン標準溶液２０μＬに、硼酸塩緩衝液（硼酸塩０．２Ｍ、ＥＤＴＡ５ｍＭ）６０μＬを添加した。この混合物に、標識試薬溶液（ＨＰＬＣ等級アセトニトリル１ｍＬ中にカルバメート化合物３ｍｇ）２０μＬを添加した。得られた混合物を５５℃に１０分間加熱した。
【0116】
（２）アミノ官能性化合物を含む試料としてのアミン標準溶液２０μＬに、硼酸塩緩衝液（硼酸塩０．２Ｍ、ＥＤＴＡ５ｍＭ）８０μＬとアセトニトリル８０μＬを添加した。この混合物に試薬溶液（ＨＰＬＣ等級アセトニトリル１ｍＬ中にカルバメート化合物３ｍｇ）２０μＬを添加した。得られた混合物を５５℃に１０分間加熱した。
【0117】
前記アミン標準液としてアミノ酸混合液を用いて、同様に調製した標識アミノ酸混合物について逆相カラムを用いて分離後、質量分析装置に導入した。一般的な条件は次の通りである。
【0118】
ａ）ＨＰＬＣ：Ａｊｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００；ｂ）Ｃｏｌｕｍｕｎ：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０ ＵＧ ５μｍ ４．６ｍｍＩ．Ｄ×２５０ｍｍ；
ｃ）検出器：質量分析装置 Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３６５；
ｄ）移動相；
移動相Ａ：０．２％ ＡｃＯＨ
移動相Ｂ：０．２％ ＡｃＯＨ ｉｎ ＣＨ３ＣＮ；及び
ｅ）温度：４０℃。
【0119】
＜例７：分析例１＞ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
【0120】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。ＳＲＭモードによる測定は、第一のマスアナライザー（Ｑ１）で指定アミノ酸の標識体である質量（アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ）を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３）では試薬由来のフラグメントイオンｍ／ｚ＝１７７を選択し検出する。（ＨＯＳｕはＮ−ヒドロキシスクシンイミドを意味する。）
【0121】
例えば、Ｇｌｕの場合 Ｑ１：ｍ／ｚ＝３２４／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７７を用いた。但し、Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＣｙｓにおいてはＱ１で標識アミノ酸の２価イオンを選択する。
【0122】
例えば、Ａｒｇ（試薬の１結合体）の場合 Ｑ１：ｍ／ｚ ＝１７６／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７７であり、Ｌｙｓ（試薬の２結合体）の場合 Ｑ１：ｍ／ｚ ＝２５０／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７７とした。分析した結果を図１に示す。
【0123】
図１の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸を定量することができる。
【0124】
＜例８：分析例２＞ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎ において検出した。
【0125】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｉｏｎ Ｓｃａｎモードによる測定は、第一のマスアナライザー（Ｑ１）ではｍ／ｚ ＝１００〜６００の質量範囲を設定した。第二のマスアナライザー（Ｑ３）では試薬由来のフラグメントイオンｍ／ｚ ＝１７７を設定した。分析した結果を図２に示す。
【0126】
図２の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸の質量を知ることができる。
【0127】
＜例９：分析例３＞ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）により、前記例６に記載した（２）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
【0128】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。質量分析装置の設定方法については前記例７と同様であるが、試薬由来のフラグメントイオンを検出するＱ３はｍ／ｚ＝１６３を設定した。
【0129】
例えば、Ｇｌｕの場合、Ｑ１：ｍ／ｚ＝３１０／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１６３を用いた。但し、Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＣｙｓにおいてはＱ１で標識アミノ酸の２価イオンを選択する。
【0130】
例えば、Ａｒｇ（試薬の１結合体）の場合、Ｑ１：ｍ／ｚ ＝１６９／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１６３であり、Ｌｙｓ（試薬の２結合体）の場合、Ｑ１：ｍ／ｚ ＝２３６／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１６３とした。分析の結果を図３に示す。
【0131】
図３の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸を定量することができる。
【0132】
＜例１０：分析例４＞３−アミノピリジルカルバメート（ＡＰＤＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
【0133】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。質量分析装置の設定方法については、前記例７と同様であるが、試薬由来のフラグメントイオンを検出するＱ３はｍ／ｚ＝１２１を設定した。
【0134】
例えば、Ｇｌｕの場合、Ｑ１：ｍ／ｚ＝１４８／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１２１とした。但し、Ｌｙｓ，ＣｙｓにおいてはＱ１で標識アミノ酸の２価イオンを選択する。
【0135】
例えば、Ｌｙｓ（試薬の２結合体）の場合、Ｑ１：ｍ／ｚ ＝１９４／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１２１とした。分析の結果を図４に示す。
【0136】
図４の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸を定量することができる。
【0137】
＜例１１：分析例５＞６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。
【0138】
質量分析装置の設定方法については、前記例７と同様であるが、試薬由来のフラグメントイオンを検出するＱ３はｍ／ｚ＝１７１を設定した。
【0139】
例えば、Ｇｌｕの場合、Ｑ１：ｍ／ｚ＝３１８／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１とした。但し、Ａｒｇ， Ｈｉｓ， Ｌｙｓ， ＣｙｓにおいてはＱ１で標識アミノ酸の２価イオンを選択する。
【0140】
例えば、Ａｒｇ（試薬の１結合体）の場合、Ｑ１：ｍ／ｚ ＝１７３／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７１、Ｌｙｓ（試薬の２結合体）の場合は、Ｑ１：ｍ／ｚ ＝２４４／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７１とした。分析の結果を図５に示す。
【0141】
図５の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸を定量することができる。
【0142】
＜例１２：分析例６＞１−ナフチルアミノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＮＡＨＳ）により、前記例６に記載した（２）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ において検出した。
【0143】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件については、移動相Ｂ ０ｍｉｎ １０％→２５ｍｉｎ ６０％→２５．１ｍｉｎ ８０％→３７ｍｉｎ ８０％を用いた。
【0144】
Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ Ｓｃａｎモードは、第一マスアナライザー（Ｑ１）では、ｍ／ｚ ＝２００〜６００の質量範囲を設定した。第二マスアナライザー（Ｑ３）は、試薬骨格に相当する質量１７０をニュートラルロスとして設定し、ｍ／ｚ ＝２００〜６００の質量範囲をスキャンした。分析の結果を図６に示す。
【0145】
図６の結果から明らかな如く、試料中に含まれるアミノ酸の質量を知ることができる。
【0146】
＜例１３：分析例７＞ＰＡＨＳにより、前記例６に記載した（２）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ Ｓｃａｎ において検出した。
【0147】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ １０％→２５ｍｉｎ ６０％→２５．１ｍｉｎ ８０％→３７ｍｉｎ ８０％を用いた。Ｃｏｎｓｔａｎｔ ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ Ｓｃａｎモードは、第一マスアナライザー（Ｑ１ ）では、ｍ／ｚ ＝１５０〜４００の質量範囲を設定した。第二マスアナライザー（Ｑ３）は、試薬骨格に相当する質量１１９をニュートラルロスとして設定し、ｍ／ｚ ＝１５０〜４００の質量範囲をスキャンした。分析の結果を図７に示す。
【0148】
＜例１４：分析例８＞ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
分離用カラムには野村化学Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ Ｃ３０−ＵＧ（粒子径３μｍ、４．６Ｉ．Ｄ×３０ｍｍ）を用い、ＨＰＬＣ分離の勾配条件には、移動相Ｂ ０ｍｉｎ→３ｍｉｎ ＝ ０％→５６％を用いた。
ＳＲＭモードによる測定は、第一のマスアナライザー（Ｑ１）で指定アミノ酸の標識体である質量（アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ）を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３）では試薬由来のフラグメントイオンｍ／ｚ＝１７７を設定した。
【0149】
例えば、Ｇｌｕの場合 Ｑ１：ｍ／ｚ＝３２４／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７７を用いた。但し、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＣｙｓにおいてはＱ１で標識アミノ酸の２価イオンを選択する。
【0150】
例えば、Ａｒｇ（試薬の１結合体）の場合 Ｑ１：ｍ／ｚ ＝１７６／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７７であり、Ｌｙｓ（試薬の２結合体）の場合 Ｑ１：ｍ／ｚ ＝２５０／Ｑ３：ｍ／ｚ ＝１７７とした。結果を図８に示す。
【0151】
実験条件に従い、各アミノ酸の溶液濃度は０．５ｎｍｏ１／ｍＬとし、１０ｕＬを注入したときに得られたクロマトグラムを図８に示した。その検出限界は２〜４０ｆｍｏｌであった。２０種類のアミノ酸が３ｍｉｎ（洗浄・平衡化時間を含めて８ｍｉｎ／ｃｙｃｌｅ）で分析を終了させることができた。
尚、Ｉｌｅ／Ｌｅｕは識別できなかった。
【0152】
以上から、本発明方法において、例えばＴＡＨＳ試薬を用いることにより分析時間を大幅に短縮できることが示された（短時間分析の事例）。
【0153】
＜例１５：検出限界の測定＞Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法でのアミノ酸の検出限界を下記の通り測定した。
【0154】
Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ法を用いて、１７種類のアミノ酸（ヒスチジン、アルギニン、セリン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、スレオニン、アラニン、プロリン、シスチン、リジン、チロシン、メチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンを含む。）の検出限界を求めた。
【0155】
検出限界は、アミノ酸の種類によって異なったが、検出器としてＡＰＩ３６５（アプライドバイオシステム）を用いた場合、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）で２〜４０ｆｍｏｌ、ｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＤＡＨＳ）で３〜２０００ｆｍｏｌ、３−アミノピリジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＰＤＳ）で３〜１８０ｆｍｏｌ、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート（ＡＱＣ）で２〜２００ｆｍｏｌであった。
【0156】
検出器としてＡＰＩ４０００（アプライドバイオシステム）を用いた場合、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカルバメート標識後のアミノ酸の検出限界は０．０３〜３ｆｍｏｌであった。（ｆｍｏｌ＝１０−１５ｍｏｌ）結果を下記表１に示した。
【0157】
【表1】
＊１： ＡＰＩ３６５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）タイプ質量分析計を用いた場合
＊２： ＡＰＩ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）タイプ質量分析計を用いた場合
【0158】
以上の結果から、アミノ酸等のアミノ官能性化合物を、簡便かつ高感度に分析（定量）できることが分かる。
【0159】
＜例１６：ＡＱＣ試薬を用いたアミノ酸標準品の同位体比分析＞６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）｛ウォーターズ｝により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸を逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
【0160】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。ＳＲＭモードによる測定は、第一のマスアナライザー（Ｑ１）で指定アミノ酸の標識体である質量（アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ）を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３）では試薬由来のフラグメントイオンｍ／ｚ＝１７１．１を選択し検出する。（ＨＯＳｕ： Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）
【0161】
同位体比分析の測定では、第一のマスアナライザー（Ｑ１）及び第二のマスアナライザー（Ｑ３）の分解能を１マスユニットが識別できる高分解能条件（Ｑ１／Ｑ３＝ｕｎｉｔ／ｕｎｉｔ）で分析を行った。
【0162】
例えば、Ｌｅｕの場合で分子内の１３Ｃの数を考慮するとＱ１：ｍ／ｚ＝３０２．２（ｍ、１３Ｃが０個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０３．２（ｍ＋１、１３Ｃが１個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０４．２（ｍ＋２、１３Ｃが２個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０５．２（ｍ＋３、１３Ｃが３個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０６．２（ｍ＋４、１３Ｃが４個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０７．２（ｍ＋５、１３Ｃが５個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
Ｑ１：ｍ／ｚ＝３０８．２（ｍ＋６、１３Ｃが６個）／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７１．１
を用いた。
結果を表２に示す。
【0163】
【表2】
【0164】
以上の結果から、本発明においてアミノ官能性化合物の同位体を高感度に簡便に測定することが理解される。また、その同位体比率を高感度にかつ補正計算することなく求められることも分かる。
【0165】
＜例１７：フェニルアラニンの同定＞フェニルアラニンが質量、フラグメントイオン、組成式が未知であると仮定して、以下の実験操作を行った。以下、標品として用いたフェニルアラニンを未知化合物と表記し、フェニルアラニンと同定するまでの工程を記す。
【0166】
未知化合物のｍ／ｚを３３６であると求められ、精密質量が測定可能な装置（四重極−飛行時間型質量分析計）では、目的の標識された未知化合物の精密質量ｍ／ｚが３３６．１３７３と求められる。得られた精密質量から未知化合物の組成式の候補はＣ９Ｈ１１ＮＯ２（最も理論値に近い組成式＝ｅｒｒｏｒが最小）であった。これ等の情報を元に、ＫＥＧＧ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）の化合物データベースから検索を行ない未知化合物はフェニルアラニン及びベンゾカインが候補化合物となった。
【0167】
＜例１８：ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド−ｄ３の合成＞次の手順に従って、ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド−ｄ３を合成した。アセトニトリル８ｍＬ、ジクロロメタン｛純正化学株式会社｝２ｍＬの混合溶媒中にｐ−ジメチルアミノアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート２６４ｍｇ（１．１ミリモル）を溶解させ、攪拌した。この溶液にヨウ化メチル−ｄ３｛日本酸素株式会社｝０．４ｍＬ（８当量）添加し、５０時間攪拌し、析出物を濾取した。
【0168】
＜例１９：分析例９＞ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド−ｄ３（ＴＡＨＳ−ｄ３）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸（アミノ酸の濃度は５ｎｍｏｌ／ｍＬ）及びｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した標識アミノ酸（アミノ酸の濃度は濃度は１０ｎｍｏｌ／ｍＬ）の反応液を混合したものを逆相カラムによりＨＰＬＣ分離し、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇにおいて検出した。
【0169】
ＨＰＬＣ分離の勾配条件は、移動相Ｂ ０ｍｉｎ ０％→２０ｍｉｎ ３０％を用いた。ＳＲＭモードによる測定は、第一のマスアナライザー（Ｑ１）で指定アミノ酸の標識体である質量（アミノ酸＋標識化試薬−ＨＯＳｕ）を選択し、第二のマスアナライザー（Ｑ３）では試薬由来のフラグメントイオンを選択し検出する。
【0170】
例えば、Ｐｈｅの場合ＴＡＨＳ−ｄ３により標識されたＰｈｅはＱ１：ｍ／ｚ＝３４５／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１８０
ＴＡＨＳにより標識されたＰｈｅはＱ１：ｍ／ｚ＝３４２／Ｑ３：ｍ／ｚ＝１７７を用いた。
結果を図９に示す。
【0171】
＜例２０：分析例１０＞ｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド−ｄ３（ＴＡＨＳ−ｄ３）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製したサンプルＡ及びｐ−トリメチルアンモニウムアニリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートアイオダイド（ＴＡＨＳ）により、前記例６に記載した（１）の反応条件によって調製した試料（サンプル）Ｂの反応混合液の分析結果を、例えば、視覚的に代謝マップ上に表現した結果を図１０に示す。
【0172】
この結果から複数のサンプルを同時に測定し、分析間の感度補正等を行うことなく簡便な処理により、例えば、複数のサンプルの状態間差を相対的に半定量的な結果を視覚的に表現することが可能である。なお本発明は、以下の様にも記載される。
（形態１）
複数種のアミノ官能性化合物を混合した複数種混合物を質量分析で測定するための質量分析用標識試薬であって、下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物を含有することを特徴とする質量分析用標識試薬。
上記式中、Ａｒは、アルキル基、芳香族基、ハロゲン原子、カルボキシル基、水酸基、ニトロ基、ジアゾ基、シアノ基、アルコキシ基、アシル基、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、若しくはトリアルキルアンモニウム基を有している、芳香族性を示す炭素環化合物残基、又は芳香族性を示す複素環化合物残基を表し、
前記芳香族性を示す炭素環化合物残基が、フェニル基又はナフチル基であり、
カルバメート基の窒素原子は、前記炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を構成する炭素原子と結合することにより、Ａｒと結合しており、
当該カルバメート化合物は塩の形態でもよい。
（形態２）
上記式中、Ａｒは、スルホン酸基、リン酸基、グアニジル基、ジアルキルアミノ基、若しくはトリアルキルアンモニウム基を有している、形態１記載の標識試薬。
（形態３）
前記芳香族性を示す複素環化合物残基の環構成原子が、炭素原子及び窒素原子である、形態１記載の標識試薬。
（形態４）
前記芳香族性を示す複素環化合物残基が、ピリジル基、ピラジル基、キノリル基、アクリジル基、又はクマリル基である、形態１記載の標識試薬。
（形態５）
前記質量分析用標識試薬が、タンデム質量分析用標識試薬である、形態１〜４のいずれか一つに記載の標識試薬。
（形態６）
前記タンデム質量分析用標識試薬が、プリカーサーイオンスキャン法、セレクテッドリアクションモニタリング法、又はコンスタントニュートラルスキャン法によるタンデム質量分析用標識試薬である、形態５記載の標識試薬。
（形態７）
前記複数種のアミノ官能性化合物が、アミン類、アミノ酸、ペプチド及びタンパク質からなる群より選ばれるアミノ官能性化合物の混合物である、形態１〜６のいずれか一つに記載の標識試薬。
（形態８）
前記アミン類が、１級アミン、又は２級アミンである、形態７記載の標識試薬。
（形態９）
複数試料の同時測定用である、形態１〜８のいずれか一つに記載の標識試薬。
（形態１０）
少なくともアミノ官能性化合物を含む試料中のアミノ官能性化合物を質量分析法により分析する方法であって、当該アミノ官能性化合物を請求項１〜９記載の標識試薬により標識し、質量分析に付すことを特徴とするアミノ官能性化合物の分析方法。
（形態１１）
前記標識後であって質量分析前に分離に付される、形態１０記載の分析方法。
（形態１２）
前記分離が液体クロマトグラフィーにより行われる、形態１１記載の分析方法。
（形態１３）
前記分離が、逆相カラムを用いて行われる、形態１１または１２記載の分析方法。
（形態１４）
アミノ官能性化合物と形態１〜９記載の標識試薬とを反応させることを特徴とする質量分析に適したアミノ官能性化合物の標識化方法。
（形態１５）
アミノ官能性化合物に対して１０〜１０００倍モル当量の標識試薬を使用する、形態１４に記載の標識化方法。
（形態１６）
下記一般式（１）で示されるカルバメート化合物。
前記芳香族性を示す炭素環化合物残基が、フェニル基又はナフチル基であり、
カルバメート基の窒素原子は、前記炭素環化合物残基又は複素環化合物残基を構成する炭素原子と結合することにより、Ａｒと結合しており、
当該カルバメート化合物は塩の形態でもよい。
（形態１７）
前記ジアルキルアミノ基及びトリアルキルアンモニウム基のアルキルはそれぞれ独立的に、炭素数１〜５のアルキルを表す、形態１６記載のカルバメート化合物。