特許 6279478 ヒダントイナーゼの突然変異体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6279478

(24)【登録日】2018年1月26日

(45)【発行日】2018年2月14日

(54)【発明の名称】ヒダントイナーゼの突然変異体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20180205BHJP

   C12P 13/04 20060101ALI20180205BHJP

   C12P 13/22 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 9/86 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20180205BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 AZNA

   C12P13/04

   C12P13/22 A

   C12N9/86

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】15

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2014-541685(P2014-541685)

(86)(22)【出願日】2012年11月16日

(65)【公表番号】特表2014-533497(P2014-533497A)

(43)【公表日】2014年12月15日

(86)【国際出願番号】EP2012072891

(87)【国際公開番号】WO2013072486

(87)【国際公開日】20130523

【審査請求日】2015年11月13日

(31)【優先権主張番号】11189395.4

(32)【優先日】2011年11月16日

(33)【優先権主張国】EP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515356546

【氏名又は名称】エボニック テクノヘミー ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｔｅｃｈｎｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100135633

【弁理士】

【氏名又は名称】二宮 浩康

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】シュテフェン オスヴァルト

(72)【発明者】

【氏名】ハイコ シュースター

(72)【発明者】

【氏名】ユルゲン ロース

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス カーラウ

(72)【発明者】

【氏名】ウルリヒ シュヴァーネベルク

(72)【発明者】

【氏名】ロニー マルティネス

(72)【発明者】

【氏名】ヘマンシュ ムンダダ

(72)【発明者】

【氏名】ウアズラ ホルター

【審査官】 川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６２−０２５９９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００３−５２１２３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０４４２８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５３−０９１１８９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｐ １３／００−１３／２４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ｉ）又は（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９のアミノ酸配列中、１〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼであって、
ここでψ＝５であり、かつ更に、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントインを基質としたときのヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、かつ
ζ＝１．２以上であり、
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、対応するアミノ酸配列において、配列番号１の配列と比較したときに同じアミノ酸残基を有する位置で生じる、前記ヒダントイナーゼ。

【請求項2】

ψは、４、３、２、１から選択される、請求項１に記載のヒダントイナーゼ。

【請求項3】

ζは１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０から選択される、請求項１に記載のヒダントイナーゼ。

【請求項4】

ヒダントイナーゼは、以下の基質ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３，４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイン、又は非天然アミノ酸に相応する５−置換ヒダントイン化合物、それぞれその誘導体のうち少なくとも１つを各々のカルバモイルアミノ酸に変換し、ここで前記基質の変換に関するヒダントイナーゼの触媒活性は、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントインの変換に関して、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくとも、上記で定義されたζ倍高い、請求項１から３までのいずれか１項に記載のヒダントイナーゼ。

【請求項5】

Ｄ−ヒダントインのエナンチオ選択性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼのエナンチオ選択性よりも少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、５０倍、１００倍、又は１５０倍高い、請求項１から４までのいずれか１項に記載のヒダントイナーゼ。

【請求項6】

請求項１から５までのいずれか１項に記載のヒダントイナーゼのいずれかをコードするポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項６に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。

【請求項8】

請求項６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項７に記載のベクターを有する単離された若しくは形質転換された宿主細胞。

【請求項9】

以下の：
ヒダントイナーゼ；ヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼ；ヒダントイナーゼとカルバモイラーゼ；又はヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼとカルバモイラーゼ
から選択される酵素活性を少なくとも発現する、請求項８に記載の宿主細胞。

【請求項10】

以下の工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）請求項１から５までのいずれか１項に記載のヒダントイナーゼのヒダントイナーゼ活性、及びカルバモイラーゼ活性、及び少なくとも１つの５−置換ヒダントインを反応培地に用意し、任意で前記反応培地にヒダントインラセマーゼ活性を用意する工程、
（ｂ）５−置換ヒダントインを工程（ａ）で用意された酵素活性により各々のアミノ酸に変換するために反応培地をインキュベートする工程、及び
（ｃ）各々の５−置換ヒダントインの酵素的変換から得られたアミノ酸を反応培地から回収する工程
を含むアミノ酸を製造する方法。

【請求項11】

前記５−置換ヒダントインは、Ｄ，Ｌ−５−置換ヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｄ，Ｌ−トリプトファンヒダントイン）、Ｄ−５−置換ヒダントイン、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントン（＝Ｄ−トリプトファンヒダントイン）から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

反応培地に用意される前記５−置換ヒダントインは、Ｌ−５−置換ヒダントイン又はＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインであり、かつ更にヒダントインラセマーゼ活性は、Ｌ−５−置換ヒダントイン又はＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインをＤ−５−置換ヒダントインに変換するために工程（ａ）で反応培地に用意される、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

製造すべきアミノ酸は、Ｄ−トリプトファンであり、かつ５−置換ヒダントインは、
Ｄ−５−インドリルメチルヒダントイン、Ｌ−５−インドリルメチルヒダントイン又はＤ，Ｌ−５−インドリルメチルヒダントインから選択される、請求項１０から１２までのいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

反応培地は、部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、かつヒダントイナーゼ活性は請求項８又は９に記載の宿主細胞により用意され、かつ宿主細胞は前記反応培地中で培養される、請求項１２又は１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

反応培地は部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、かつカルバモイラーゼ活性は、請求項８又は９に記載の宿主細胞又は第二の宿主細胞により用意され、かつ前記宿主細胞は前記反応培地中で培養される、請求項１０から１４までのいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般的にヒダントイナーゼに関する。より具体的には、本発明は以前に単離されたヒダントイナーゼに対して増大した酵素活性を示す一連の変性ヒダントイナーゼならびにアミノ酸を製造する方法におけるそれらの使用、特にホールセル触媒におけるそれらの使用に関する。

【0002】

関連分野の説明
酵素を使用してアミノ酸を製造する方法は公知である。更に、化学的に廉価に合成された出発材料としての５−置換ヒダントイン化合物の光学活性アミノ酸への非対称的分解に関する方法がある。５−置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するこれらの方法は、製剤調製物、化学工業における製品、食品添加剤などの製造に重要である。

【0003】

５−置換ヒダントイン化合物からのアミノ酸を製造するこの方法では、２つの酵素が必要である：（１）加水分解により、５−置換ヒダントイン化合物を各々のＮ−カルバモイルアミノ酸に変換することによりＮ−カルバモイルアミノ酸を形成する反応を触媒するヒダントイナーゼ（ヒダントイン加水分解酵素）と称される酵素；
（２）加水分解により前記のＮ−カルバモイルアミノ酸を各々のアミノ酸に変換することにより、光学活性アミノ酸を形成する反応を触媒するＮ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼと称される酵素。

【0004】

以後、本明細書内では“ヒダントイナーゼ”と称することになるヒダントイン加水分解酵素は、幅広い特異性と生物学的機能を有する様々なクラスの酵素を含む。ヒダントイナーゼの重要な特性はエナンチオ選択性であり、光学的に純粋なＤ−又はＬ−アミノ酸の製造にとって価値あるものにする。５−置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するために、ヒダントイナーゼ及び／又はＮ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼは、エナンチオ選択的酵素でなくてはならない。Ｌ−アミノ酸生産微生物により、又は微生物により生産される酵素含有材料によりＬ−アミノ酸を製造する方法が記載されていて、その際、多様な属、例えば、フラボバクテリウム、バシラス、ジュードモナス及びアルスロバクター（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４６，６３，１９９６）が用いられていた。

【0005】

ヒダントイナーゼ遺伝子及びＮ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼ遺伝子は、アルスロバクター属の微生物から単離されており、かつこれらの遺伝子によりコードされる組換えタンパク質はＬ−アミノ酸を生産するために使用されていた。

【0006】

光学的に純粋なアミノ酸を生産するヒダントイナーゼの重要性の観点から、アミノ酸生産に関して改善された特性を有する変性酵素を開発するために集中した尽力がなされてきた。この尽力の結果、多くの微生物が単離され、かつ望ましい酵素特性を有するヒダントイナーゼを生産する微生物が単離及び同定された。米国特許第５５１６６６０号には、Ｄ−、Ｌ−及び／又はＤ，Ｌ−５−モノ置換されたヒダントインからＬ−α−アミノ酸を生産できるヒダントイナーゼを生産するアルスロバクター種の株が開示されている。

【0007】

より最近の開発は、ホールセル触媒技術を利用する各々のヒダントインからの工業規模でのＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の生産である（ＷＯ２００２／０７７２１２、ＷＯ２００４／０４２０４７、ＷＯ２０００／０５８４４９、ＷＯ２００３／０４２４１２）。触媒には、大腸菌のような微生物中で共有発現させたＤ−ヒダントイナーゼ、ヒダントインラセマーゼ及びＤ−カルバモイラーゼが含まれる。

【0008】

国際特許明細書ＷＯ００／５８４４９には、約４０％の活性の増大を生じたアルスロバクターに由来するヒダントイナーゼの突然変異体が開示されている。

【0009】

入手可能なアルスロバクター種から由来するこれらの標準の触媒の試験は、各々のトリプトファンヒダントインからのＤ−トリプトファンの生産が可能であるが、しかし極めて低い変換率であることを示した。この低い変換率は、入手可能な野生型アルスロバクター種のヒダントイナーゼが基質としてのトリプトファンヒダントインを受容する不十分な特性による。

【0010】

本発明の目的は、５−置換ヒダントイン、有利にはトリプトファンヒダントインに関して増大した変換率を有するヒダントイナーゼを提供すること、ならびに特にヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを使用し、有利には大腸菌宿主中で共有発現させてＬ−トリプトファンヒダントインから出発して、アミノ酸、有利にはＤ−トリプトファンの製法を提供することであった。

【0011】

従って、本発明の対象は特にトリプトファンヒダントインに関して増大した変換率で、改善されたヒダントイナーゼを提供することであった。更に、ヒダントイナーゼのエナンチオ選択性を増大するのが有益であろう。

【0012】

本発明のまとめ
本発明の対象は、（ｉ）又は（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９のアミノ酸配列中、１〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼにより解決され、その際、ψはψ＝７５と定義され、及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、及びζはζ＝１．２と定義される。

【0013】

本発明に関連して、別途定義が無い限りヒダントイナーゼの触媒活性は、５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物の相応するＤ−カルバモイルアミノ酸への変換に関するこの酵素の触媒活性として解釈されることになる。

【0014】

本発明に関連して、ヒダントイナーゼのエナンチオ選択性は、Ｄ_act／Ｌ_actの比として定義され、ここでＤ_act＝５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物を相応するＤ−カルバモイルアミノ酸へ変換する酵素の触媒活性であり、及びＬ_act＝５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物のエナンチオマーを相応するＤ−カルバモイルアミノ酸のエナンチオマーへ変換するこの酵素の触媒活性である。言い換えると、Ｌ_act＝相応する５−置換Ｌ−ヒダントイン化合物を相応するＬ−カルバモイルアミノ酸に変換するこの酵素の触媒活性である。

【0015】

本発明に関連して、アミノ酸の付加という用語は、ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端でのアミノ酸残基の付加を意味する。

【0016】

本発明の有利な実施態様では、ψは、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１から選択される。

【0017】

本発明の更に有利な実施態様では、ζは１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０から選択される。

【0018】

本発明の更に有利な実施態様では、ψとζは、以下のものから選択される：
ψ＝７０及びζ＝１．５、ψ＝７０及びζ＝２、ψ＝７０及びζ＝３、ψ＝７０及びζ＝４、ψ＝７０及びζ＝５、ψ＝７０及びζ＝１０、ψ＝７０及びζ＝１５、ψ＝７０及びζ＝２０、ψ＝７０及びζ＝２５、ψ＝７０及びζ＝３０、
ψ＝６０及びζ＝１．５、ψ＝６０及びζ＝２、ψ＝６０及びζ＝３、ψ＝６０及びζ＝４、ψ＝６０及びζ＝５、ψ＝６０及びζ＝１０、ψ＝６０及びζ＝１５、ψ＝６０及びψ＝２０、ψ＝６０及びζ＝２５、ψ＝６０及びζ＝３０、
ψ＝５０及びζ＝１．５、ψ＝５０及びζ＝２、ψ＝５０及びζ＝３、ψ＝５０及びζ＝４、ψ＝５０及びζ＝５、ψ＝５０及びζ＝１０、ψ＝５０及びζ＝１５、ψ＝５０及びψ＝２０、ψ＝５０及びζ＝２５、ψ＝５０及びζ＝３０、
ψ＝４０及びζ＝１．５、ψ＝４０及びζ＝２、ψ＝４０及びζ＝３、ψ＝４０及びζ＝４、ψ＝４０及びζ＝５、ψ＝４０及びζ＝１０、ψ＝４０及びζ＝１５、ψ＝４０及びψ＝２０、ψ＝４０及びζ＝２５、ψ＝４０及びζ＝３０、
ψ＝３０及びζ＝１．５、ψ＝３０及びζ＝２、ψ＝３０及びζ＝３、ψ＝３０及びζ＝４、ψ＝３０及びζ＝５、ψ＝３０及びζ＝１０、ψ＝３０及びζ＝１５、ψ＝３０及びψ＝２０、ψ＝３０及びζ＝２５、ψ＝３０及びζ＝３０、
ψ＝２０及びζ＝１．５、ψ＝２０及びζ＝２、ψ＝２０及びζ＝３、ψ＝２０及びζ＝４、ψ＝２０及びζ＝５、ψ＝２０及びζ＝１０、ψ＝２０及びζ＝１５、ψ＝２０及びψ＝２０、ψ＝２０及びζ＝２５、ψ＝２０及びζ＝３０、
ψ＝１０及びζ＝１．５、ψ＝１０及びζ＝２、ψ＝１０及びζ＝３、ψ＝１０及びζ＝４、ψ＝１０及びζ＝５、ψ＝１０及びζ＝１０、ψ＝１０及びζ＝１５、ψ＝１０及びψ＝２０、ψ＝１０及びζ＝２５、ψ＝１０及びζ＝３０、
ψ＝９及びζ＝１．５、ψ＝９及びζ＝２、ψ＝９及びζ＝３、ψ＝９及びζ＝４、ψ＝９及びζ＝５、ψ＝９及びζ＝１０、ψ＝９及びζ＝１５、ψ＝９及びψ＝２０、ψ＝９及びζ＝２５、ψ＝９及びζ＝３０、
ψ＝８及びζ＝１．５、ψ＝８及びζ＝２、ψ＝８及びζ＝３、ψ＝８及びζ＝４、ψ＝８及びζ＝５、ψ＝８及びζ＝１０、ψ＝８及びζ＝１５、ψ＝８及びψ＝２０、ψ＝８及びζ＝２５、ψ＝８及びζ＝３０、
ψ＝７及びζ＝１．５、ψ＝７及びζ＝２、ψ＝７及びζ＝３、ψ＝７及びζ＝４、ψ＝７及びζ＝５、ψ＝７及びζ＝１０、ψ＝７及びζ＝１５、ψ＝７及びψ＝２０、ψ＝７及びζ＝２５、ψ＝７及びζ＝３０、
ψ＝６及びζ＝１．５、ψ＝６及びζ＝２、ψ＝６及びζ＝３、ψ＝６及びζ＝４、ψ＝６及びζ＝５、ψ＝６及びζ＝１０、ψ＝６及びζ＝１５、ψ＝６及びψ＝２０、ψ＝６及びζ＝２５、ψ＝６及びζ＝３０、
ψ＝５及びζ＝１．５、ψ＝５及びζ＝２、ψ＝５及びζ＝３、ψ＝５及びζ＝４、ψ＝５及びζ＝５、ψ＝５及びζ＝１０、ψ＝５及びζ＝１５、ψ＝５及びψ＝２０、ψ＝５及びζ＝２５、ψ＝５及びζ＝３０、
ψ＝４及びζ＝１．５、ψ＝４及びζ＝２、ψ＝４及びζ＝３、ψ＝４及びζ＝４、ψ＝４及びζ＝５、ψ＝４及びζ＝１０、ψ＝４及びζ＝１５、ψ＝４及びψ＝２０、ψ＝４及びζ＝２５、ψ＝４及びζ＝３０、
ψ＝３及びζ＝１．５、ψ＝３及びζ＝２、ψ＝３及びζ＝３、ψ＝３及びζ＝４、ψ＝３及びζ＝５、ψ＝３及びζ＝１０、ψ＝３及びζ＝１５、ψ＝３及びψ＝２０、ψ＝３及びζ＝２５、ψ＝３及びζ＝３０、
ψ＝２及びζ＝１．５、ψ＝２及びζ＝２、ψ＝２及びζ＝３、ψ＝２及びζ＝４、ψ＝２及びζ＝５、ψ＝２及びζ＝１０、ψ＝２及びζ＝１５、ψ＝２及びψ＝２０、ψ＝２及びζ＝２５、ψ＝２及びζ＝３０、
ψ＝１及びζ＝１．５、ψ＝１及びζ＝２、ψ＝１及びζ＝３、ψ＝１及びζ＝４、ψ＝１及びζ＝５、ψ＝１及びζ＝１０、ψ＝１及びζ＝１５、ψ＝１及びψ＝２０、ψ＝１及びζ＝２５、ψ＝１及びζ＝３０。

【0019】

本発明によれば、微生物であるアルスロバクター種により生産される野生型ヒダントイナーゼと比べて増大した触媒活性を有する変性ヒダントイナーゼ（ヒダントイン加水分解酵素）が提供される。更に本発明のヒダントイナーゼは微生物であるアルスロバクター種により生産される野生型ヒダントイナーゼと比べて増大したエナンチオ選択性を有していてもよい。本発明によるヒダントイナーゼは、５−置換ヒダントイン化合物、特にＤ−トリプトファンヒダントインに関して、増大した変換率を有し、よってＤ−アミノ酸を製造する方法において適切である。このような方法は、有利には各々のトリプトファンヒダントインから出発して、特にＤ−ヒダントイナーゼ、Ｄ−カルバモイラーゼ及び任意でヒダントインラセマーゼを用いるＤ−トリプトファンの生産に適切である。これらの酵素は、有利には大腸菌のような微生物中で共有発現されている。５−置換ヒダントイン化合物からアミノ酸を製造するこの方法において、ヒダントイナーゼは、５−置換ヒダントイン化合物、有利には（Ｄ−トリプトファンヒダントイン）を加水分解して各々のＮ−カルバモイルアミノ酸（有利にはＮ−カルバモイルＤ−トリプトファン）を生じることにより、Ｎ−カルバモイルアミノ酸を形成する反応を触媒する。このＮ−カルバモイルアミノ酸は、Ｎ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼにより加水分解され、各々のアミノ酸（有利にはＤ−トリプトファン）を形成する。

【0020】

トリプトファンを製造するために、出発材料としてＤ，Ｌ−トリプトファンヒダントイン又はＬ−トリプトファンヒダントインを使用してもよく、その際、特にヒダントインラセマーゼの存在は、本発明のヒダントイナーゼのためのＤ−トリプトファンヒダントイン基質を提供するために適切である。このような方法は、特にヒダントインラセマーゼ、Ｄ−ヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼを使用して、各々のＤ，Ｌ−又はＬ−トリプトファンヒダントインから出発してＤ−トリプトファンを製造するために適切である。これらの３個の酵素は、有利には大腸菌のような微生物中で共有発現される。

【0021】

当業者は特定の参照配列の特定のアミノ酸の位置（例えば、１５２）に関して得られる情報を変異型ヒダントイナーゼならびに同位体のアミノ酸配列に置き換えることができることを理解している：当業者は変異型配列を有する参照アミノ酸配列を配置し、かつ変異型配列中で相応する位置（例えば、アミノ酸の位置１５２）を決定できる。この実施例に関連して、当業者は参照配列中、参照配列のアミノ酸の位置１５２に相当するアミノ酸位置は、必ずしも変異型アミノ酸配列の１５２番目のアミノ酸残基でなくてもよいが、変異型酵素の３次元構造中では同じ位置を有することを理解している。アミノ酸配列を配置する方法は、更に以下に詳細に説明されている。他の方法を用いて、参照配列と比べて変異型配列中で相応する位置を決定することもできる。

【0022】

図の説明
図１は、プラスミドｐＡＳ６−ＨｙｕＨであり、これは配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼを発現する野生型遺伝子ｈｙｕＨと配列番号４のアミノ酸配列を有するＤ−カルバモイラーゼを発現する遺伝子を含んでいる。プラスミドマップに示されている略語は、以下の要素から成る：Ｄ−Ｃａｒｂ．＝Ｄ−カルバモイラーゼ遺伝子ＮＲＲＬ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；ｒｈａＰ＝ラムノースプロモーター；ｈｙｕＨ＝ヒダントイナーゼＤＳＭ９７７１；ｒｒｎＢ＝転写ターミネーター；ｂｌａ＝β−ラクタメーゼ；ｏｒｉ＝複製起点ＣｏｌＥ１。

【0023】

配列の説明
本発明に関連して、時折ポリペプチド配列の変異型は、フォーマットＡＡ１ＸＡＡ２中の元の配列と比較して変異型配列中に存在する各アミノ酸の置換を示すことにより説明される。その際、ＡＡ１は元の配列中の位置Ｘに存在するアミノ酸残基を意味し、及びＡＡ２は、変異体の配列中の位置Ｘに存在するアミノ酸残基を意味する。

【0024】

配列番号１は、アルスロバクター種からの野生型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示している。

【0025】

配列番号２は、アルスロバクター種からの野生型ヒダントイナーゼをコードするヌクレオチド配列を示している。

【0026】

配列番号３は、アルスロバクター種からの野生型ヒダントイナーゼラセマーゼのアミノ酸配列を示している。

【0027】

配列番号４は、アルスロバクター種からの野生型Ｄ−カルバモイラーゼのアミノ酸配列を示している。

【0028】

配列番号５は、参照としてのアミノ酸配列を示し、その際、１５２、６４、７１、７２、９５、１５４、１８１、２８４、２８５、３９８及び４５２位のアミノ酸残基Ｘは請求項に記載の通りに定義されていて、かつ１５２位のアミノ酸残基はアラニン以外の任意のアミノ酸残基を示す。

【0029】

配列番号６は、１５２位のアラニンがグリシンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0030】

配列番号７は、１５２位のアラニンがシステインに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0031】

配列番号８は、１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0032】

配列番号９は、１５２位のアラニンがトレオニンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0033】

配列番号１０は、１５２位のアラニンがバリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0034】

配列番号１１は、１５２位のアラニンがセリンに及び１５４位のバリンがイソロイシンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0035】

配列番号１２は、１５２位のアラニンがバリンに、及び１５４位のバリンがシステインに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0036】

配列番号１３は、１５２位のアラニンがシステインに、及び１５４位のバリンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0037】

配列番号１４は、７１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、及び７２位のチロシンがヒスチジンに置換され及び１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0038】

配列番号１５は、７１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換され、及び７２位のチロシンがアスパラギンに置換され及び１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0039】

配列番号１６は、７１位のアルギニンがバリンに置換され、及び７２位のチロシンがアスパラギンに置換され、及び１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0040】

配列番号１７は、７１位のアルギニンがセリンに置換され、及び７２位のチロシンがアスパラギンに置換され、及び１５２位のアラニンがシステインに置換され、及び１５４位のバリンがセリンに置換され、及び１８１位のバリンがアラニンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0041】

配列番号１８は、７１位のアルギニンがチロシンに置換され、及び７２位のチロシンがアスパラギンに置換され、及び１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0042】

配列番号１９は、７１位のアルギニンがロイシンに置換され、及び１５２位のアラニンがシステインに置換され、及び１５４位のバリンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0043】

配列番号２０は、７１位のアルギニンがチロシンに置換され、及び７２位のチロシンがヒスチジンに置換され、及び１５２位のアラニンがセリンに置換されている変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す。

【0044】

配列番号２１〜７２は、表１に示されているようにヒダントイナーゼの様々なアミノ酸の位置で突然変異誘発に使用されたプライマー配列を示している。

【0045】

配列番号７３は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ９５Ｈ。

【0046】

配列番号７４は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ１５４Ｇ。

【0047】

配列番号７５は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ１５４Ｎ。

【0048】

配列番号７６は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｄ。

【0049】

配列番号７７は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｅ。

【0050】

配列番号７８は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ２８４Ｆ。

【0051】

配列番号７９は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ１５４Ａ。

【0052】

配列番号８０は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｔ。

【0053】

配列番号８１は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｖ。

【0054】

配列番号８２は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ１５４Ｓ。

【0055】

配列番号８３は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｖ１５４Ａ、Ｔ３９８Ａ、Ｈ４５２Ｌ。

【0056】

配列番号８４は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ａ１５２Ｓ、Ｖ１５４Ｉ。

【0057】

配列番号８５は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0058】

配列番号８６は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｖ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｓ。

【0059】

配列番号８７は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｓ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｃ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１８１Ａ。

【0060】

配列番号８８は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｓ。

【0061】

配列番号８９は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｒ７１Ｙ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｓ。

【0062】

配列番号９０は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｖ、Ｒ７１Ｉ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｓ。

【0063】

配列番号９１は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｙ、Ｙ７２Ｎ、Ａ１５２Ｓ。

【0064】

配列番号９２は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0065】

配列番号９３は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｆ４４８Ｌ。

【0066】

配列番号９４は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｍ４１７Ｖ。

【0067】

配列番号９５は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0068】

配列番号９６は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0069】

配列番号９７は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｅ３５８Ｋ。

【0070】

配列番号９８は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ３７Ｒ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｖ３１８Ａ。

【0071】

配列番号９９は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ３７Ｒ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｎ３０３Ｓ、Ｑ４０４Ｒ。

【0072】

配列番号１００は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｎ７０Ｄ。

【0073】

配列番号１０１は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｖ１５４Ａ。

【0074】

配列番号１０２は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0075】

配列番号１０３は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ａ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0076】

配列番号１０４は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｖ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0077】

配列番号１０５は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0078】

配列番号１０６は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ａ、Ｓ３７Ｗ，Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0079】

配列番号１０７は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ａ、Ｓ３７Ｖ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0080】

配列番号１０８は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｄ１５Ｎ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0081】

配列番号１０９は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｖ、Ｓ３７Ｒ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0082】

配列番号１１０は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｄ１５Ｎ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｖ１５４Ｃ。

【0083】

配列番号１１１は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｄ１５Ｎ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ、Ｖ１５４Ｉ。

【0084】

配列番号１１２は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｐ、Ｄ１５Ｇ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0085】

配列番号１１３は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｄ１５Ｒ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0086】

配列番号１１４は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｇ、Ｄ１５Ｑ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0087】

配列番号１１５は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｆ、Ｄ１５Ａ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0088】

配列番号１１６は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｄ１５Ｓ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0089】

配列番号１１７は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｐ、Ｄ１５Ｇ、Ｓ３７Ｇ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ、Ａ１５２Ｓ。

【0090】

配列番号１１８は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｓ１４Ｐ、Ｄ１５Ｇ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ。

【0091】

配列番号１１９は、配列番号１と比べて以下の置換を有する変異型ヒダントイナーゼのアミノ酸配列を示す：Ｄ１５Ｓ、Ｓ３７Ｇ、Ｉ６４Ｃ、Ｒ７１Ｄ、Ｙ７２Ｈ。

【0092】

本発明の詳細な説明
上記のように本発明は、増大した触媒活性、及び任意で、Ｄ−５−置換ヒダントイン基質に対して、特にＤ−トリプトファンヒダントインに対して増大したエナンチオ選択性を有するアルスロバクター種からの配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ヒダントイナーゼから誘導される新規ヒダントイナーゼを提供する。

【0093】

本発明によるヒダントイナーゼは、（ｉ）又は（ｉｉ）
（ｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９から選択されるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８又は配列番号１１９のアミノ酸配列中、１〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有し、その際、ψはψ＝７５と定義され、及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、及びζはζ＝１．２と定義される。

【0094】

本発明に関連して、別途定義が無い限りヒダントイナーゼの触媒活性は、５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物の相応するＤ−カルバモイルアミノ酸への変換に関するこの酵素の触媒活性として定義されることになる。

【0095】

本発明に関連して、ヒダントイナーゼのエナンチオ選択性は、Ｄ_act／Ｌ_actの比として定義され、ここでＤ_act＝５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物を相応するＤ−カルバモイルアミノ酸へ変換するこの酵素の触媒活性であり、及びＬ_act＝５−置換Ｄ−ヒダントイン化合物のエナンチオマーを相応するＤ−カルバモイルアミノ酸のエナンチオマーへ変換する酵素の触媒活性である。言い換えると、Ｌ_act＝相応する５−置換Ｌ−ヒダントイン化合物を相応するＬ−カルバモイルアミノ酸に変換するこの酵素の触媒活性である。

【0096】

本発明の有利な実施態様では、ψは７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１から選択される。

【0097】

本発明の更に有利な実施態様では、ζは１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０から選択される。

【0098】

本発明の更に有利な実施態様では、ψとζは、以下のものから選択される：
ψ＝７０及びζ＝１．５、ψ＝７０及びζ＝２、ψ＝７０及びζ＝３、ψ＝７０及びζ＝４、ψ＝７０及びζ＝５、ψ＝７０及びζ＝１０、ψ＝７０及びζ＝１５、ψ＝７０及びζ＝２０、ψ＝７０及びζ＝２５、ψ＝７０及びζ＝３０、
ψ＝６０及びζ＝１．５、ψ＝６０及びζ＝２、ψ＝６０及びζ＝３、ψ＝６０及びζ＝４、ψ＝６０及びζ＝５、ψ＝６０及びζ＝１０、ψ＝６０及びζ＝１５、ψ＝６０及びψ＝２０、ψ＝６０及びζ＝２５、ψ＝６０及びζ＝３０、
ψ＝５０及びζ＝１．５、ψ＝５０及びζ＝２、ψ＝５０及びζ＝３、ψ＝５０及びζ＝４、ψ＝５０及びζ＝５、ψ＝５０及びζ＝１０、ψ＝５０及びζ＝１５、ψ＝５０及びψ＝２０、ψ＝５０及びζ＝２５、ψ＝５０及びζ＝３０、
ψ＝４０及びζ＝１．５、ψ＝４０及びζ＝２、ψ＝４０及びζ＝３、ψ＝４０及びζ＝４、ψ＝４０及びζ＝５、ψ＝４０及びζ＝１０、ψ＝４０及びζ＝１５、ψ＝４０及びψ＝２０、ψ＝４０及びζ＝２５、ψ＝４０及びζ＝３０、
ψ＝３０及びζ＝１．５、ψ＝３０及びζ＝２、ψ＝３０及びζ＝３、ψ＝３０及びζ＝４、ψ＝３０及びζ＝５、ψ＝３０及びζ＝１０、ψ＝３０及びζ＝１５、ψ＝３０及びψ＝２０、ψ＝３０及びζ＝２５、ψ＝３０及びζ＝３０、
ψ＝２０及びζ＝１．５、ψ＝２０及びζ＝２、ψ＝２０及びζ＝３、ψ＝２０及びζ＝４、ψ＝２０及びζ＝５、ψ＝２０及びζ＝１０、ψ＝２０及びζ＝１５、ψ＝２０及びψ＝２０、ψ＝２０及びζ＝２５、ψ＝２０及びζ＝３０、
ψ＝１０及びζ＝１．５、ψ＝１０及びζ＝２、ψ＝１０及びζ＝３、ψ＝１０及びζ＝４、ψ＝１０及びζ＝５、ψ＝１０及びζ＝１０、ψ＝１０及びζ＝１５、ψ＝１０及びψ＝２０、ψ＝１０及びζ＝２５、ψ＝１０及びζ＝３０、
ψ＝９及びζ＝１．５、ψ＝９及びζ＝２、ψ＝９及びζ＝３、ψ＝９及びζ＝４、ψ＝９及びζ＝５、ψ＝９及びζ＝１０、ψ＝９及びζ＝１５、ψ＝９及びψ＝２０、ψ＝９及びζ＝２５、ψ＝９及びζ＝３０、
ψ＝８及びζ＝１．５、ψ＝８及びζ＝２、ψ＝８及びζ＝３、ψ＝８及びζ＝４、ψ＝８及びζ＝５、ψ＝８及びζ＝１０、ψ＝８及びζ＝１５、ψ＝８及びψ＝２０、ψ＝８及びζ＝２５、ψ＝８及びζ＝３０、
ψ＝７及びζ＝１．５、ψ＝７及びζ＝２、ψ＝７及びζ＝３、ψ＝７及びζ＝４、ψ＝７及びζ＝５、ψ＝７及びζ＝１０、ψ＝７及びζ＝１５、ψ＝７及びψ＝２０、ψ＝７及びζ＝２５、ψ＝７及びζ＝３０、
ψ＝６及びζ＝１．５、ψ＝６及びζ＝２、ψ＝６及びζ＝３、ψ＝６及びζ＝４、ψ＝６及びζ＝５、ψ＝６及びζ＝１０、ψ＝６及びζ＝１５、ψ＝６及びψ＝２０、ψ＝６及びζ＝２５、ψ＝６及びζ＝３０、
ψ＝５及びζ＝１．５、ψ＝５及びζ＝２、ψ＝５及びζ＝３、ψ＝５及びζ＝４、ψ＝５及びζ＝５、ψ＝５及びζ＝１０、ψ＝５及びζ＝１５、ψ＝５及びψ＝２０、ψ＝５及びζ＝２５、ψ＝５及びζ＝３０、
ψ＝４及びζ＝１．５、ψ＝４及びζ＝２、ψ＝４及びζ＝３、ψ＝４及びζ＝４、ψ＝４及びζ＝５、ψ＝４及びζ＝１０、ψ＝４及びζ＝１５、ψ＝４及びψ＝２０、ψ＝４及びζ＝２５、ψ＝４及びζ＝３０、
ψ＝３及びζ＝１．５、ψ＝３及びζ＝２、ψ＝３及びζ＝３、ψ＝３及びζ＝４、ψ＝３及びζ＝５、ψ＝３及びζ＝１０、ψ＝３及びζ＝１５、ψ＝３及びψ＝２０、ψ＝３及びζ＝２５、ψ＝３及びζ＝３０、
ψ＝２及びζ＝１．５、ψ＝２及びζ＝２、ψ＝２及びζ＝３、ψ＝２及びζ＝４、ψ＝２及びζ＝５、ψ＝２及びζ＝１０、ψ＝２及びζ＝１５、ψ＝２及びψ＝２０、ψ＝２及びζ＝２５、ψ＝２及びζ＝３０、
ψ＝１及びζ＝１．５、ψ＝１及びζ＝２、ψ＝１及びζ＝３、ψ＝１及びζ＝４、ψ＝１及びζ＝５、ψ＝１及びζ＝１０、ψ＝１及びζ＝１５、ψ＝１及びψ＝２０、ψ＝１及びζ＝２５、ψ＝４及びζ＝３０。

【0099】

本発明の他の実施態様では、本発明のヒダントイナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼと比べて少なくとも８０％の相同性を有するか、又は最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する；その際、１５２、６４、７１、７２、９５、１５４、１８１、２８４、２８５、３９８及び４５２位のアミノ酸残基は、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８及びＸ４５２と定義され、及びこれらのアミノ酸残基は以下のように選択される：
Ｘ１５２＝アラニン以外の任意のアミノ酸；
Ｘ６４＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ７１＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ７２＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ９５＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ１５４＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ１８１＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ２８４＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ２８５＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ３９８＝任意のアミノ酸残基；
Ｘ４５２＝任意のアミノ酸残基；
及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくとも１．２倍だけ高い。

【0100】

有利な実施態様では、触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５又は３０倍だけ高い。

【0101】

他の有利な実施態様では、Ｄ−ヒダントインのエナンチオ選択性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼのエナンチオ選択性よりも少なくとも１．２、１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００又は１５０倍だけ高い。より有利な実施態様では、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントイン（Ｄ−トリプトファンヒダントイン）用のヒダントイナーゼのエナンチオ選択性は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼと比べて少なくとも１．２、有利には少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００又は１５０倍だけ増大した。

【0102】

当業者は、本明細書で記載したようなヒダントイナーゼの変異型も、本発明の範囲内に含まれることを理解している。これらの変異型ヒダントイナーゼは、それぞれ配列番号１及び配列番号５のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼと比べて少なくとも８０％の相同性を有するか、又は最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する。これらの変異型中で、本発明による参照アミノ酸配列（それぞれ配列番号１と配列番号５）に関して特定のアミノ酸の置換は保持されている。

【0103】

更に、ヒダントイナーゼ活性を有する上記タンパク質の誘導体が提供され、この誘導体は、それぞれ配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０と少なくとも８０％の相同性、有利には少なくとも８５％の相同性、更に有利には少なくとも９０％の相同性、更に有利には少なくとも９５％の相同性、更に有利には少なくとも９６％の相同性、更に有利には少なくとも９７％の相同性、更に有利には少なくとも９８％の相同性、及び最も有利には少なくとも９９％の相同性を有する。先に概要を述べたように、これらの変異型中で本発明によるアミノ酸の置換は、参照配列（それぞれ配列番号１と配列番号５）に関して保持されている。

【0104】

更に、ヒダントイナーゼ活性を有する上記タンパク質の誘導体が提供され、この誘導体は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０に示されるアミノ酸配列に関して最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質により示される。先に概要を述べたように、これらの変異型中で本発明によるアミノ酸の置換は、参照配列（それぞれ配列番号１と配列番号５）に関して保持されている。

【0105】

本発明は、更に最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含むアミノ酸配列を有する変異型ヒダントイナーゼにも関する。本明細書中で使用される“最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む”というフレーズ中“最大９０個のアミノ酸残基”という範囲は、最大７０個、有利には最大４５個、更に有利には最大４０個、より有利には最大３５個、更に有利には最大３０個、なお有利には最大２５個、より有利には最大２０個、より有利には最大１５個、更に有利には最大１０個、及び最も有利には最大５個のアミノ酸残基に限定されていてもよい。

【0106】

本明細書中で使用される“最大９０個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を含む”というフレーズ中の“最大９０個のアミノ酸残基”という用語は、好ましくは１〜７０個、有利には１〜４５個、更に有利には１〜４０個、より有利には１〜３５個、更に有利には１〜３０個、なお有利には１〜２５個、更に有利には１〜２０個、更に有利には１〜１５個、なお有利には１〜１０個、及び最も有利には１〜５個のアミノ酸残基を意味する。“付加”という用語は、上記配列に関してアミノ酸残基のＮ−末端又はＣ−末端の付加を意味する。

【0107】

更に、ヒダントイナーゼ活性を有するそれぞれ配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸配列を有する上記タンパク質の断片も提供され、その際、有利には該断片は、それぞれ配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸配列の少なくとも３００個、更に有利には少なくとも３５０個及び特に有利には少なくとも４００個、及び最も有利には少なくとも４５０個の連続アミノ酸又は先に定義したようなそれらの誘導体を含む。

【0108】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌ；
Ｘ６４＝Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＶａｌ；
Ｘ７１＝Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ又はＬｅｕ；
Ｘ７２＝Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＡｓｎ；
Ｘ９５＝Ｉｌｅ又はＨｉｓ；
Ｘ１５４＝Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ又はＳｅｒ；
Ｘ１８１＝Ｖａｌ又はＡｌａ；
Ｘ２８４＝Ｖａｌ又はＰｈｅ；
Ｘ２８５＝Ａｌａ又はＡｓｐ；
Ｘ３９８＝Ｔｈｒ又はＡｌａ；
Ｘ４５２＝Ｈｉｓ又はＬｅｕ。

【0109】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ、Ｓｅｒ又はＶａｌ；
Ｘ６４＝Ｉｌｅ、Ｔｈｒ又はＶａｌ；
Ｘ７１＝Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ又はＬｅｕ；
Ｘ７２＝Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＡｓｎ；
Ｘ９５＝Ｉｌｅ又はＨｉｓ；
Ｘ１５４＝Ｃｙｓ、Ｉｌｅ又はＳｅｒ；
Ｘ１８１＝Ｖａｌ又はＡｌａ；
Ｘ２８４＝Ｖａｌ又はＰｈｅ；
Ｘ２８５＝Ａｌａ又はＡｓｐ；
Ｘ３９８＝Ｔｈｒ又はＡｌａ；
Ｘ４５２＝Ｈｉｓ又はＬｅｕ。

【0110】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ１５４は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌ；
Ｘ１５４＝Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ又はＳｅｒ。

【0111】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ１５４は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ、Ｓｅｒ又はＶａｌ；
Ｘ１５４＝Ｃｙｓ、Ｉｌｅ又はＳｅｒ。

【0112】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ１５２＝Ｖａｌ；Ｘ１５２＝Ｇｌｙ又はＸ１５２＝Ｔｈｒ。

【0113】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２とＸ１５４は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ１５４＝Ｉｌｅ。

【0114】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２とＸ１５４は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｖａｌ；Ｘ１５４＝Ｃｙｓ。

【0115】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２とＸ１５４は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ。

【0116】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ７１＝Ａｓｐ；Ｘ７２＝Ｈｉｓ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0117】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ７１＝Ａｓｐ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0118】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ７１＝Ｖａｌ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0119】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ７１＝Ｓｅｒ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ；Ｘ１８１＝Ａｌａ。

【0120】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ７１＝Ｔｙｒ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0121】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ７１＝Ｌｅｕ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0122】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ１５４、Ｘ１８１は、以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ７１＝Ｔｙｒ；Ｘ７２＝Ｈｉｓ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ。

【0123】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２が更に以下のように：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓに限定されたヒダントイナーゼが提供される。

【0124】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0125】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｖａｌ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0126】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｇｌｙ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0127】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｔｈｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0128】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｉｌｅ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0129】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｖａｌ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｃｙｓ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0130】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｒｇ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0131】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｓｐ；Ｘ７２＝Ｈｉｓ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0132】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ａｓｐ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0133】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ｖａｌ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0134】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ｓｅｒ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ；Ｘ１８１＝Ａｌａ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0135】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ｔｙｒ；Ｘ７２＝Ａｓｎ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0136】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｃｙｓ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ｌｅｕ；Ｘ７２＝Ｔｙｒ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｓｅｒ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0137】

本発明の他の実施態様では、Ｘ１５２、Ｘ６４、Ｘ７１、Ｘ７２、Ｘ９５、Ｘ１５４、Ｘ１８１、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ３９８、Ｘ４５２は更に以下のように限定される：
Ｘ１５２＝Ｓｅｒ；Ｘ６４＝Ｉｌｅ；Ｘ７１＝Ｔｙｒ；Ｘ７２＝Ｈｉｓ；Ｘ９５＝Ｉｌｅ；Ｘ１５４＝Ｖａｌ；Ｘ１８１＝Ｖａｌ；Ｘ２８４＝Ｖａｌ；Ｘ２８５＝Ａｌａ；Ｘ３９８＝Ｔｈｒ；Ｘ４５２＝Ｈｉｓ。

【0138】

本発明の他の実施態様では、本発明によるヒダントイナーゼは、以下の基質ヒダントイン、５−メチルヒダントイン、５−ベンジルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（３，４−ジヒドロキシベンジル）ヒダントイン、５−メチルチオエチルヒダントイン、５−イソプロピルヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−ｓｅｃ−ブチルヒダントイン、５−（４−アミノブチル）ヒダントイン、５−ヒドロキシメチルヒダントイン、又は非天然アミノ酸、各々それらの誘導体、又は各々カルバモイルアミノ酸に相応する５−置換ヒダントインのうち少なくとも１つを変換し、その際、前記基質の変換に関するヒダントイナーゼの触媒活性は、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントインの変換に関して、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性と少なくとも同じ高さである。

【0139】

上記のように、本発明によるヒダントイナーゼ用の基質は、この酵素の基質特異性で加水分解されることができるどのＤ−５−置換ヒダントイン化合物であってもよい。それらには、非天然アミノ酸又はそれらの誘導体に相応する５−置換ヒダントイン化合物も含まれる。非天然アミノ酸又はそれらの誘導体とは、標準の遺伝子コードによりコードされないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸又はそれらの誘導体の各々のヒダントインには、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジルオキシメチルヒダントイン、５−（３，４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルが含まれる。有利には、本発明によるヒダントイナーゼの基質は、Ｄ，Ｌ−５−インドリルメチルヒダントイン、より有利にはＤ−５−インドリルメチルヒダントインである。

【0140】

また本発明は、本発明のヒダントイナーゼをコードするポリヌクレオチドも提供する。

【0141】

従って、本発明は１×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液中６５℃で洗浄し、上記に定義したような本発明によるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの全長相補鎖にすることから成るストリンジェントな条件下にハイブリダイズする単離又は組換えポリヌクレオチドを提供する；その際、ヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、その際ζはζ＝１．２と定義付けられる。

【0142】

また本発明は、本発明によるヒダントイナーゼをコードする上記のようなポリヌクレオチドを有するベクターを提供する。有利には、該ベクターは更に作動的に連結し及び宿主細胞中でのポリヌクレオチドの発現に適切である調節配列を有する。

【0143】

本発明は、ポリヌクレオチド又は本発明によるヒダントイナーゼをコードする上記のようなポリヌクレオチドを有するベクターを有する単離された又は形質転換された宿主細胞を提供する。有利には、宿主は、大腸菌、コリネ型バクテリア、バシラス種から成るグループから選択される。宿主細胞は、本発明によるヒダントイナーゼを発現する。有利な実施態様では、宿主細胞は以下のものから選択される酵素活性を少なくとも発現する：ヒダントイナーゼ；ヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼ；ヒダントイナーゼとカルバモイラーゼ；又はヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼとカルバモイラーゼ。

【0144】

更に本発明は以下の工程（ａ）〜（ｃ）
（ａ）本発明によるヒダントイナーゼのヒダントイナーゼ活性及びカルバモイラーゼ活性及び少なくとも１つの５−置換ヒダントインを反応培地に用意し、任意で前記反応培地にヒダントインラセマーゼ活性を用意する工程、
（ｂ）５−置換ヒダントインを工程（ａ）で用意された酵素活性により各々のアミノ酸に変換するために反応培地をインキュベートする工程、及び
（ｃ）各々の５−置換ヒダントインの酵素的変換から得られたアミノ酸を反応培地から回収する工程
を含むアミノ酸を製造する方法を提供する。

【0145】

有利な方法では、前記５−置換ヒダントインは、Ｄ，Ｌ−５−置換ヒダントイン、Ｄ，Ｌ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｄ，Ｌ−トリプトファンヒダントイン）、Ｄ−５−置換ヒダントイン、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントン（＝Ｄ−トリプトファンヒダントイン）から選択される。

【0146】

なお有利な方法では、反応培地に用意される前記５−置換ヒダントインは、Ｌ−５−ヒダントインであるか又はＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインであり、及び更にヒダントインラセマーゼ活性は、Ｌ−５−置換ヒダントイン又はＤ，Ｌ−５−置換ヒダントインをＤ−５−置換ヒダントインに変換するために工程（ａ）で反応培地に用意される。

【0147】

他の有利な方法では、製造されるべきアミノ酸はＤ−トリプトファンであり、及び５−置換ヒダントインはＤ−５−インドリルメチルヒダントイン、Ｌ−５−インドリルメチルヒダントイン又はＤ，Ｌ−５−インドリルメチルヒダントインから選択される。

【0148】

この方法では、５−置換ヒダントインは本発明のヒダントイナーゼにより各々のカルバモイルアミノ酸に変換され、これは前記カルバモイラーゼ活性により各々のアミノ酸に変換される。

【0149】

特に有利な実施態様では、前記カルバモイルアミノ酸は、Ｎ−（アミノカルボニル）−ＤＬ−トリプトファン（＝Ｎ−カルバモイル−ＤＬ−トリプトファン；＝ＣＡ索引名：Ｎ−（アミノカルボニル）−トリプトファン；＝登録番号：９８２９９−５０−４；式：Ｃ１２Ｈ１３Ｎ３Ｏ３）又はＮ−カルバモイル−Ｌ−トリプトファン（＝ＣＡ索引名：Ｎ−（アミノカルボニル）−Ｌ−トリプトファン＝登録番号：８９５９５−６４−２；式：Ｃ１２Ｈ１３Ｎ３Ｏ３）から選択される。

【0150】

なお有利な他の方法では、反応培地は部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、及びヒダントイナーゼ活性は本発明による宿主細胞により用意され、及び宿主細胞は前記反応培地中で培養される。

【0151】

特に有利な方法では、反応培地は部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、及びカルバモイラーゼ活性は本発明による宿主細胞により又は第二の宿主細胞により用意され、及び前記宿主細胞は前記反応培地中で培養される。

【0152】

有利な実施態様では、ヒダントイナーゼ活性及びカルバモイラーゼ活性ならびに任意でヒダントインラセマーゼ活性を発現する宿主細胞（別々の細胞又は同じ細胞）は、バイオマスを生産するために細胞培養培地中で培養され、次に細胞培養培地及びバイオマスは分離され、かつバイオマスはバッファー又は水の使用により再懸濁される。基質の変換を開始するために、基質は、バイオマスの添加前、間又は後に前記バッファー又は水のどちらかに添加される。

【0153】

Ｄ，Ｌ−５−モノ置換ヒダントインから光学的に純粋なアミノ酸を製造する際に使用するために、本発明のヒダントイナーゼは、例えば、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ（Ｒｏｚｚｅｌｌ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｆ．ｅｄｓ．，Ｈａｎｓｅｒ出版社、ＮＹ、７５〜１７６頁（１９９２））に記載されているように使用されてもよい。ヒダントイナーゼの一般的使用は、“Ｅｎｚｙｍｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｄｒａｎｚ，Ｋ．ａｎｄ Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｈ．ｅｄｓ．，ＶＣＨ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、４０９〜４３１頁（１９９５））ならびにＷａｇｎｅｒ，Ｔ．等［アルスロバクター種ＤＳＭ７３３０の新規突然変異体株の休止細胞によるＤ，Ｌ−５−（２−メチルチオエチル）ヒダントインからの１−メチオニンの製造、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４６：６３〜６８（１９９６）］にも記載されている。

【0154】

Ｄ，Ｌ−又はＬ−５−置換ヒダントイン又はＤ，Ｌ−又はＬ−カルバモイルアミノ酸の各々のＤ−アミノ酸への酵素的変換に関しては、本発明のヒダントイナーゼの発現及びカルバモイラーゼの発現ならびに更に有利にはヒダントインラセマーゼの発現を含む細胞触媒技法を適用するのが有利である。

【0155】

本発明によるヒダントイナーゼは、この方法の範囲においてそれらの遊離型又は固定型で使用できる。また、カルバモイラーゼとヒダントインラセマーゼを固定してもよい。酵素を固定する技法は当業者に公知である。有利な方法は、Ｂｈａｖｅｎｄｅｒ Ｐ．Ｓｈａｒｍａ、Ｌｏｒｒａｉｎｓ Ｆ．Ｂａｉｌｙ ａｎｄ Ｒａｌｐｈ Ａ．Ｍｅｓｓｉｎｇ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｔｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉｅｎ Ｔｅｃｈｎｉｋｅｎ ｕｎｄ Ａｎｗｅｎｄｕｎｇｅｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，９４，８３６〜８５２（１９９２））；Ｄｏｒｄｉｃｋ等（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，５００９〜５０１０（１９９４））、Ｏｋａｈａｔａ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ.、３８、１９７１〜１９７４（１９９７））、Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ等（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，６，２９１〜３０５（１９９２））；Ｇｏｔｏ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１０、２６３〜２６８（１９９４））、Ｋａｍｉｙａ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，１１，２７０〜２７５（１９９５））、Ｏｋａｈａｔａ等（Ｔｉｂｔｅｃｈ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９７，１５，５０〜５４）；Ｆｉｓｈｍａｎ等（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０，５３５〜５３８（１９９８））に記載されている。

【0156】

５−置換ヒダントイン又はカルバモイルアミノ酸の各々のアミノ酸への変換は、バッチ法又は連続法で行うことができる。有利には、酵素−膜−反応器は反応容器として使用される（Ｗａｎｄｒｅｙ等、Ｊａｈｒｂｕｃｈ １９９８，Ｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ ｕｎｄ Ｃｈｅｍｉｅｉｎｇｅｎｉｅｕｒｗｅｓｅｎ、ＶＤＩ Ｓ． １５１頁以降；Ｗａｎｄｒｅｙ等、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、第２巻、ＶＣＨ １９９６、８３２；Ｋｒａｇｌ等、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，６，６８４頁以降（１９９６））。

【0157】

細胞触媒アプローチを使用するアミノ酸の製造に関して、高い増殖率と容易な成長条件を利用すべきであるので細菌細胞が使用される。これに関して利用できる多くの細菌が当業者に公知である。これに関して大腸菌を細胞及び発現系として有利に使用できる（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ、３３、１０３〜１０９（１９８５））。

【0158】

アミノ酸を製造するために、本発明のヒダントイナーゼを発現する、及び有利には更にカルバモイラーゼを発現するならびに更に有利にはヒダントインラセマーゼを発現する細胞を培養培地中で使用してもよい。二者択一的に、各々の単離細胞、洗浄細胞、細胞処理製品、細胞処理製品から得られる粗酵素溶液又は精製酵素溶液を反応混合物中で使用してもよい。反応を実施するために、基質として５−置換ヒダントイン化合物を含有する前記培養培地又は反応混合物をそれぞれ１５〜４５℃の温度、有利には２５〜４０℃の温度で、ｐＨ５〜９、有利にはｐＨ６〜８で静止させて又は８時間撹拌しながら５日間保持する。前記培養培地又は反応混合物は、それぞれ更に遷移金属イオン（有利にはＺｎ^２＋、Ｍｎ^２＋及びＣｏ^２＋から選択される）を０．０２ｍＭ〜１０ｍＭの間の濃度で、有利には０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度で含んでいてもよい。無傷細胞を使用する場合、反応混合物は更に形質転換細胞の成長に重要である栄養成分、例えば、炭素源、窒素源及び無機イオンを有していてもよい。更に、基質（５−置換ヒダントイン又はカルバモイルアミノ酸化合物）を培養培地又は反応混合物に小分けに添加してもよい。

【0159】

記載した方法で使用される酵素は、各々の逆反応を触媒することもできるので、本発明は更に上記のようなＤ−アミノ酸を製造する方法も提供し、その際、基質としての前記５−置換ヒダントインの代わりにＮ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸が使用される：前記Ｎ−カルバモイル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸又はＮ−カルバモイル−Ｌ−アミノ酸は、本発明によるヒダントイナーゼにより各々のＤ，Ｌ−５−置換ヒダントイン又はＬ−５−置換ヒダントイン化合物に変換される。更に、前記Ｄ，Ｌ−５−置換ヒダントイン又はＬ−５−ヒダントイン化合物は、ヒダントインラセマーゼによりＤ−エナンチオマー、すなわち各々のＤ−５−置換ヒダントイン化合物に変換される。次に、Ｄ−５−置換ヒダントイン化合物は、本発明によるヒダントイナーゼにより各々のＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換される。引き続き、カルバモイラーゼはＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を各々のＤ−アミノ酸に変換する。この方法の特に有利な実施態様では、基質として使用されるＮ−カルバモイルアミノ酸は、Ｎ−（アミノカルボニル）−ＤＬ−トリプトファン；＝（＝Ｎ−カルバモイル−ＤＬ−トリプトファン；ＣＡ索引名：Ｎ−（アミノカルボニル）−トリプトファン；＝登録番号：９８２９９−５０−４；式：Ｃ１２Ｈ１３Ｎ３Ｏ３）又はＮ−カルバモイル−Ｌ−トリプトファン（＝ＣＡ索引名：Ｎ−（アミノカルボニル）−Ｌ−トリプトファン＝登録番号：８９５９５−６４−２；式：Ｃ１２Ｈ１３Ｎ３Ｏ３）である。

【0160】

培養培地又は反応混合物中で製造されるアミノ酸は、公知の方法により迅速に定量化できる。このために、Ｃ−１８カラム及び例えば、１％アセトニトリル含有２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ２．３）の混合物及び１０％Ｈ₂Ｏ含有アセトニトリルを溶出液として用いる高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してもよい。

【0161】

培養培地又は反応混合物中で蓄積したアミノ酸は、標準の方法により培養培地又は反応混合物から回収できる。例えば、濾過、遠心分離、真空下の濃縮、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、結晶化及びこのようなものの方法を使用できるが、必要な場合には互いに組み合わせて使用してもよい。

【0162】

以下の反応スキームは、反応工程ならびに触媒変換に関わる酵素（Ｄ−ヒダントインの変換により説明される）を示している。Ｄ−ヒダントインは、Ｄ−ヒダントイナーゼの触媒活性によりＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸に変換され、これはＤ−５−置換ヒダントイン化合物を加水分解してＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を生じる反応を触媒する。もう１つの更なる反応工程では、Ｎ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼと称する酵素が前記Ｎ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を加水分解して光学活性Ｄ−アミノ酸を生じる反応を触媒する。更に、ヒダントインラセマーゼと称する酵素は、光学活性Ｌ−ヒダントイン化合物の光学活性Ｄ−ヒダントイン化合物への変換を触媒し、逆も同じである。

【0163】

反応スキーム

【化1】

定義
ヒダントイナーゼ：“ヒダントイナーゼ”又は“ヒダントイナーゼ活性”という用語は、本明細書中では酵素と定義付けられるか、又はヒダントイン、特に５−置換ヒダントインを加水分解する酵素の活性と定義付けられる。ヒダントイナーゼは、５−置換ヒダントインを加水分解して各々のＮ−カルバモイルアミノ酸を形成する反応を触媒する。特に、本発明によるヒダントイナーゼは、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントインを加水分解してＮ−カルバモイル−Ｄ−トリプトファンを形成する反応を触媒するか、又はＬ−５−インドリルメチルヒダントインを加水分解してＮ−カルバモイル−Ｌ−トリプトファンを形成する反応を触媒する。ヒダントイナーゼの１例は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質である。ヒダントイナーゼ活性の１例は、Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントイン、Ｌ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン又はＬ−５−ベンジルヒダントインのような化合物に対する配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質の触媒活性であり、これは前記ヒダントイナーゼの活性により各々のＮ−カルバモイルアミノ酸に変換される。

【0164】

ヒダントインラセマーゼ：“ヒダントインラセマーゼ”又は“ヒダントインラセマーゼ活性”とは、本明細書中ではＬ−ヒダントインをＤ−ヒダントインに、逆も同様に変換する酵素又は酵素の活性として定義付けられる。特に、Ｎ−ヒダントインラセマーゼは、Ｌ−５−インドリルメチルヒダントインを変換してＤ−５−インドリルメチルヒダントインを形成する反応を触媒するか、又はＤ−５−インドリルメチルヒダントインを変換してＬ−５−インドリルメチルヒダントインを形成する反応を触媒する。ヒダントインラセマーゼの１例は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質である。ヒダントインラセマーゼ活性の１例は、Ｌ−５−メチルチオエチルヒダントイン、Ｌ−５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントイン、Ｌ−５−ベンジルヒダントイン又はＬ−５−インドリルメチルヒダントインのような化合物に対する配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質の触媒活性であり、これは前記ヒダントインラセマーゼの活性により各々のＤ−エナンチオマーに変換される。

【0165】

Ｎ−カルバモイラーゼ：“Ｎ−カルバモイラーゼ”又は“Ｎ−カルバモイラーゼ活性”という用語は、本明細書中では、Ｎ−カルバモイルアミノ酸、特にＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する酵素又は酵素の活性として定義される。Ｎ−カルバモイラーゼ又はＮ−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼは、それぞれ前記Ｎ−カルバモイルアミノ酸、特にＮ−カルバモイル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する反応を触媒し、各々のアミノ酸、特に光学活性Ｄ−アミノ酸を生じる。特に、Ｎ−カルバモイラーゼは、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−トリプトファンを加水分解してＤ−トリプトファンを形成する反応を触媒するか、又はＮ−カルバモイル−Ｌ−トリプトファンを加水分解してＬ−トリプトファンを形成する反応を触媒する。Ｎ−カルバモイラーゼの１例は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質である。Ｎ−カルバモイラーゼ活性の１例は、Ｎ−カルバモイルメチオニン、Ｎ−カルバモイルチロシン、Ｎ−カルバモイルフェニルアラニン又はＮ−カルバモイルトリプトファンのような化合物に対する配列番号４を有するタンパク質の触媒活性であり、これは前記Ｎ−カルバモイラーゼの活性により各々のアミノ酸に変換される。

【0166】

５−置換ヒダントイン：“５−置換ヒダントイン”という用語は、以下のような式（Ｉ）による化合物を意味し、式中、Ｒは水素、−ＣＨ₃、−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₃、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル、インドリルメチル、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ₂、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ₂−、−ＣＨ₂−ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＳＨ、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₃、イミダゾリルメチル、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ₂−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂を意味する、又は“５−置換ヒダントイン”という用語は、プロリンヒダントインを意味する。前記残基は、天然に存在するアミノ酸に相当し、これらはヒダントイナーゼによる各々のヒダントイン化合物の加水分解及び引き続くＮ−カルバモイラーゼによる各々のＮ−カルバモイルアミノ酸の加水分解の際に得られる。更に、５−置換ヒダントイン化合物は、非天然アミノ酸又はその誘導体、例えば、５−フェニルヒダントイン、５−（４−ヒドロキシフェニル）ヒダントイン、５−メトキシメチルヒダントイン、５−ベンジルオキシメチルヒダントイン、５−（３，４−メチレンジオキシベンジル）ヒダントイン、ジヒドロウラシルに相応していてもよい。式（Ｉ）は、５−置換ヒダントインのＤ−エナンチオマーを示していることに留意すべきである。

【0167】

【化2】

【0168】

核酸構築物：本明細書中で使用されているような“核酸構築物”という用語は、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を意味し、これは天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はさもなければ天然に存在し得ない方法で変性されて核酸の断片を含有するようになる。核酸構築物という用語は、該核酸構築物が本発明のコーディング配列を発現するために必要な調節配列を含んでいる場合には“発現カセット”と同意語である。

【0169】

調節配列：“調節配列”という用語は、本明細書中では全てのコンポーネントを含むものとして定義される。これらは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要であるか、又は有利である。それぞれの調節配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとって固有であるか又は外来である、又は互いに固有であるか又は外来である。

【0170】

このような調節配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。最低でも調節配列には、プロモーター及び転写及び翻訳終止シグナルが含まれる。調節配列と、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域のライゲーションを容易にする特定の制限部位を組込む目的で、調節配列はリンカーと一緒に用意されてもよい。

【0171】

作動的に連結した：“作動的に連結した”という用語は、本明細書内ではポリヌクレオチド配列のコーディング配列に対して調節配列が適切な位置に存在し、調節配列がポリペプチドのコーディング配列の発現を指示する構造を意味する。

【0172】

コーディング配列：本明細書中で使用される場合には、“コーディング配列”とはヌクレオチド配列を意味し、これはそのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接に指す。コーディング配列の境界は、一般的にオープンリーディング枠により決定され、これは通常はＡＴＧ開始コドンで、又は二者択一的な開始コドン、例えば、ＧＴＧ及びＴＴＧで開始され、及び終止コドン、例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡで終了する。コーディング配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡであるか又は組換えヌクレオチド配列であってもよい。

【0173】

発現：“発現”という用語には、ポリペプチドの生産に関わるいずれかの工程が含まれ、これには転写、後−転写変性、翻訳、後−翻訳変性及び分泌が含まれるが、しかしこれらに限定されるわけではない。

【0174】

発現ベクター：本明細書中では、“発現ベクター”という用語は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有する線状又は環状ＤＮＡ分子として定義され、及びこれはその発現のために用意される更なるヌクレオチドに作動的に連結する。

【0175】

宿主細胞：本明細書中で使用されるような“宿主細胞”という用語には、核酸構築物又は本発明のポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターで形質転換、トランスフェクション、トランスダクション及びそのようなものを受けやすい任意のタイプの細胞が含まれる。

【0176】

細胞培養培地：“細胞培養培地”という用語は、細菌、酵母及び菌類を含む微生物の培養に使用される培地を一般的に意味し、かつ“増殖培地”とも称してもよい。

【0177】

非天然アミノ酸：“非天然アミノ酸”という用語は、式ＮＨ₂−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯＯＨ［式中、Ｒはタンパク質を構成するアミノ酸残基の変性残基を表し、このタンパク質を構成するアミノ酸残基は、水素、−ＣＨ₃、−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ₂−ＣＨ（ＣＨ₃）₂、−ＣＨ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−ＣＨ₃、ベンジル、４−ヒドロキシベンジル、インドリルメチル、−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ₂、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＮＨ₂−、−ＣＨ₂−ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₃、−ＣＨ₂−ＳＨ、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₃、イミダゾリルメチル、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）ＮＨ₂、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ₂から選択される］を有するαアミノ酸を意味する。又は“非天然アミノ酸”という用語は、プロリンの誘導体を意味し、これはその環構造の−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−基中で変性されていてもよい。上記の変性は、脂肪族基、芳香族基、複素環式基、酸基、塩基、ヒドロキシル基及び／又はフッ素のようなハロゲンによる水素原子の置換であってもよい。

【0178】

変性：本明細書中での“変性”という用語は、本発明によるポリペプチドから成るポリペプチド又はその相同配列の任意の化学的変性；ならびにこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子増幅を意味する。変性は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加であることができる。

【0179】

変異型：本明細書で使用する場合には、“変異型”とは本発明によるポリペプチドの変性ヌクレオチド配列又はその相同配列を発現する生物により生産されるヒダントイナーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。変性ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の変性によりヒトの介入から得られる。変異型ポリペプチド配列は、天然に存在してもよい。例えば、マイクロバクテリウム・リクエファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＪ３９１２から単離されるヒダントイナーゼが記載されていて、これは配列番号１のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼと約８３％の相同性を有する。このマイクロバクテリウム・リクエファシエンスのヒダントイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の（天然に存在する）変異型としてみなしてもよい。

【0180】

本発明のタンパク質は、例えば合成でき、精製タンパク質から製造されるか、又は組換え法及び当業者に公知の技法を用いて製造される。本明細書中では、それらの製造に特定の技法が記載されているが、これらのペプチドの製造にとって適切な全ての技法も本発明の範囲内であると解釈される。一般的に、これらの技法にはＤＮＡ及びタンパク質シーケンシング、クローニング、発現ならびに本発明のタンパク質のそれぞれをコード及び発現する原核ベクター及び真核ベクターの構築を可能にするその他の組換え技術が含まれる。

【0181】

“ペプチド”及び“オリゴペプチド”という用語は同意語であると解釈される（共通して認識されるので）、かつそれぞれの用語は、文脈上必要な場合には交換可能な方法で使用でき、ペプチド結合により結合する少なくとも２個のアミノ酸の鎖を示す。本明細書中で“ポリペプチド”という用語は、１０個よりも多いアミノ酸残基を含有する鎖に使用される。全てのオリゴペプチド及びポリペプチドの式又は配列は、本明細書中では左から右に及びアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれている。本明細書中で使用されるアミノ酸の１文字コードは当業者に一般的に公知であり、及びＳａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に見出すことができる。

【0182】

“単離”ペプチド又はタンパク質とは、その固有の環境から取り出されるポリペプチド又はタンパク質を意味する。例えば、組換えにより製造されるポリペプチド及び宿主細胞中で発現されるタンパク質は、本発明の目的では、固有の又は組換えポリペプチドとして単離されたものと考えられ、これらは引き続き例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１〜４０（１９８８）に開示されているような適切な技法、例えば単一工程の精製法のいずれかにより精製される。

【0183】

本発明によるヒダントイナーゼは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法により組換え細胞培養培地から回収及び精製できる。最も有利には、高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が精製に使用される。

【0184】

本発明のポリペプチドには、天然に精製された生成物、化学合成法の生成物、及び原核又は真核宿主（例えば、細菌、酵母、菌類、高等植物、昆虫及びホ乳類細胞を含む）から組換え技術により製造された生成物が含まれる。組換え製造法で使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるか又はグリコシル化されなくてもよい。更に、本発明のポリペプチドは、初期変性されたメチオニン残基を有してもよく、幾つかの場合には宿主変性法の結果生じる。

【0185】

本発明のタンパク質は、非−ヒダントイナーゼポリペプチド（例えば、異種アミノ酸配列）に作動的に連結し、融合タンパク質を形成することができる。本明細書で使用されているように、ヒダントイナーゼ“キメラタンパク質”又は“融合タンパク質”は、非−ヒダントイナーゼポリペプチドに作動的に連結したヒダントイナーゼポリペプチドを有する。

【0186】

例えば、１実施態様では、融合タンパク質はＧＳＴ−ヒダントイナーゼ融合タンパク質であり、その際に、前記ヒダントイナーゼ配列はＧＳＴ配列のＣ−末端に融合している。このような融合タンパク質は、組換えヒダントイナーゼの精製を容易にできる。他の実施態様では、融合タンパク質はヘテロシグナル配列をそのＮ−末端に含有するヒダントイナーゼタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、ホ乳類及び酵母宿主細胞）では、ヒダントイナーゼの発現及び／又は分泌は、ヘテロシグナル配列の使用により増大させることができる。

【0187】

シグナル配列を使用して、本発明のタンパク質又はポリペプチドの分泌及び単離を容易にすることができる。シグナル配列は、１つ又は複数の切断事象での成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアにより通常は特徴づけられる。このようなシグナルペプチドは、分泌経路を通過する際にシグナル配列を成熟タンパク質から切断可能にするプロセシング箇所を含む。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換される真核宿主からのタンパク質の分泌を指示し、かつシグナル配列は引き続き又は同時に切断される。よってタンパク質は、当該分野で承認されている方法により細胞外媒体から容易に精製できる。二者択一的に、シグナル配列は１つの配列を用いて目的のタンパク質に結合できる。これはＧＳＴドメインのようなもので精製を容易にする。従って、例えばポリペプチドをコードする配列はマーカー配列、例えばペプチドをコードする配列に融合してもよく、これが融合ポリペプチドの精製を容易にする。本発明のこの点に関する特定の有利な実施態様では、マーカー配列はヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に提供されるタグであり、とりわけ、その多くは市販されている。Ｇｅｎｔｚ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１〜８２４頁（１９８９）に記載されているように、例えばヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。ＨＡタグは、インフルエンザ・ヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相応する精製に有用な別のペプチドであり、これは例えばＷｉｌｓｏｎ等、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）に記載されている。

【0188】

有利には、本発明のキメラ又は融合タンパク質は通常の組換えＤＮＡ技術により製造される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、通常の技法、例えば、平滑末端又はジグザク末端を用いることによりにインフレームで一緒にライゲートされ、制限酵素による消化で適切な末端を提供し、必要に応じて粘着性末端を充填し、アルカリ硫酸塩の処理により望ましくない連結を回避し、及び酵素的ライゲーションをする。他の実施態様では、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む通常の技法により融合遺伝子を合成できる。二者択一的に、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して実施でき、これが２つの連続遺伝子断片の間で相補的オーバーハングを生じ、これは引き続きアニーリングされ、かつ再び増幅されてキメラ遺伝子配列を生じる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。

【0189】

更に、既に融合部分をコードしている多くの発現ベクターは市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。本発明による核酸をこのような発現ベクター中にクローン化し、該融合部分が融合部分にインフレームで結合するようにし、本発明によるタンパク質を有する融合タンパク質を発現させることができる。

【0190】

“保存的置換”又は“相同”アミノ酸残基による置換という用語は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられた置換を意味する意図がある。これらのファミリーは、当業者に公知であり、及び塩基性側鎖を有するアミノ酸（リシン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。

【0191】

保存的アミノ酸の置換は、得られるタンパク質の活性において通常は最小の影響を有する。このような置換は以下に記載されている。保存的な置換は１つのアミノ酸を、大きさ、疎水性度、電荷、極性、立体特性、芳香族性などにおいて類似している他のアミノ酸と置き換える。このような置換は、タンパク質の特性を細かく調節することが望ましい場合には一般的に保存的である。

【0192】

本明細書中で使用されているような“相同”アミノ酸残基は、疎水性、電荷、極性、立体特性、芳香族性などに関して類似した化学特性を有するアミノ酸残基を意味する。

【0193】

互いに相同であるアミノ酸の例には次のものが含まれる；プラスの電荷に関しては：リシン、アルギニン、ヒスチジン；マイナスの電荷に関しては：グルタミン酸、アスパラギン酸；疎水性度に関しては：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン；極性に関しては：セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；芳香族性に関しては：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；化学的に類似した側鎖に関しては：セリンとトレオニン；又はグルタミンとアスパラギン；又はロイシンとイソロイシン。

【0194】

タンパク質中で元のアミノ酸を置換してもよく、及び保存的置換としてみなされるアミノ酸の例には次のものが含まれる：ＳｅｒをＡｌａに；ＬｙｓをＡｒｇに；Ｇｌｎ又はＨｉｓをＡｓｎに；ＧｌｕをＡｓｐに；ＳｅｒをＣｙｓに；ＡｓｎをＧｌｎに；ＡｓｐをＧｌｕに；ＰｒｏをＧｌｙに；Ａｓｎ又はＧｌｎをＨｉｓに；Ｌｅｕ又はＶａｌをＩｌｅに；Ｉｌｅ又はＶａｌをＬｅｕに；Ａｒｇ又はＧｌｎをＬｙｓに；Ｌｅｕ又はＩｌｅをＭｅｔに；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒをＰｈｅに；ＴｈｒをＳｅｒに；ＳｅｒをＴｈｒに；ＴｙｒをＴｒｐに；Ｔｒｐ又はＰｈｅをＴｙｒに；及びＩｌｅ又はＬｅｕをＶａｌに。

【0195】

例えば、表現的に静かなアミノ酸置換基をどのように作るかについての手引きは、Ｂｏｗｉｅ、Ｊ．Ｕ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に提供されていて、その際、著者等はアミノ酸配列の変化の耐久性を研究するに当たり２つの主なアプローチがあることを示している。１つめの方法は、進展のプロセスに依存し、その際、自然な選択により突然変異が受容又は拒絶される。２つめのアプローチは、遺伝子工学を使用して、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸の変化を導入し、及び機能を保持する配列を選択又はスクリーニング又は同定する。著者等が述べているように、これらの研究は、タンパク質が意外にもアミノ酸置換に耐性があることを明らかにした。更に著者等は、どの変化がタンパク質の特定の位置で許容的であり得るかを示した。例えば、殆どの埋没アミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするのに対して、表面の側鎖の特徴は一般的に保存される。このような表現的に静かなその他の置換は、上記のＢｏｗｉｅ等及びそこに挙げられている参考文献に記載されている。

【0196】

本明細書中で定義されているように“実質的に相同”という用語は、第一と第二のアミノ酸配列が共通のドメインを有するように、第二のアミノ酸配列に対して、十分な又は最小の数の同一又は同等（例えば、類似した側鎖を有する）のアミノ酸配列を有する第一のアミノ酸配列を意味する。例えば、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性又はそれより多くの相同性を有する共有のドメインを有するアミノ酸配列は、本明細書中では十分に同一であると定義されているが、但し、本明細書中で定義されているような本発明によるアミノ酸の位置の置換は保持されたままである。

【0197】

また、他のヒダントイナーゼファミリーメンバーをコードする核酸、従って本発明のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有するものも、本発明の範囲であるが、本明細書中で定義されているような本発明によりコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸の位置の置換は、保持されたままである。変異型（例えば、天然の対立遺伝子変異体）及び本発明によるＤＮＡのホモログに相応するこのような核酸分子は、本明細書中で開示されているｃＤＮＡ又は適切なその断片を用いて本明細書中で開示されているような核酸に対するそれらの相同性に基づき単離できる。それというのも、通常のハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーション試料は、有利には高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下にあるからである。

【0198】

本明細書で提供される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体の他に、本発明によるヌクレオチド配列に突然変異を組込むことにより更なる変化を導入でき、それによりタンパク質の機能を実質的に変化させることなく、ヒダントイナーゼタンパク質のアミノ酸配列において変化を生じるが、但し、本明細書中で定義されたような本発明によりコードされたアミノ酸配列中のアミノ酸位置の置換は保持されたままであることを当業者は認識するであろう。

【0199】

本発明により改善されたヒダントイナーゼが提供される。改善されたヒダントイナーゼは、触媒活性及び／又はエナンチオ選択性が改善されたタンパク質である。このようなタンパク質は、例えば飽和突然変異誘発によりコーディング配列の全て又は部分的に沿ってランダムに導入された突然変異により得られてもよく、及びその結果得られた突然変異体は組み変えて発現でき、かつ各々の生物活性に関してスクリーニングされる。例えば、ヒダントイナーゼの触媒活性を測定するための標準のアッセイが提供され、このように改善されたタンパク質を容易に選択してもよい。

【0200】

本明細書で使用されているように“遺伝子”及び“組換え遺伝子”という用語は、染色体ＤＮＡから単離されていてもよい核酸分子を意味し、これにはタンパク質（例えば、ヒダントイナーゼ）をコードするオープンリーディングフレームが含まれる。遺伝子は、コーディング配列、非コーディング配列、イントロン及び調節配列を含んでいてもよい。更に、本明細書で定義されているように遺伝子は単離核酸分子を意味する。

【0201】

本発明の核酸分子又はその機能的同等物は、標準的な分子生物技術ならびにそこで提供される配列情報を用いて単離できる。例えば、本明細書中に記載されているような核酸配列の全て又は一部分をハイブリダイズ試料として用いて、標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９に記載されているようなもの）を使用し、本発明による核酸分子を単離できる。

【0202】

更に、本発明による核酸配列の全て又は一部を含んでいる核酸配列は、記載配列中に含まれる配列情報に基づき設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離できる。

【0203】

本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は二者択一的にゲノムＤＮＡをテンプレートとして及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術により増幅できる。このように増幅された核酸を適切なベクター中にクローン化し、及びＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。

【0204】

更に、本発明によるヌクレオチド配列に相応するか又はハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、例えば自動化ＤＮＡシンセサイザーを用いて製造できる。

【0205】

他のヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、もう一方のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるように、もう一方のヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、それにより安定な二重鎖を形成する。

【0206】

“単離ポリヌクレオチド”又は“単離核酸”は、両方のコーディング配列と直接に隣接しないＤＮＡ又はＲＮＡである。これは前記コーディング配列と、それが由来する生物の天然に存在するゲノム中では直接に隣接している（１つは５’末端及びもう１つは３’末端）。従って、１実施態様では、単離核酸には、コーディング配列に直接隣接する５’非コード（例えば、プロモーター）配列の幾つか又は全てが含まれる。従って、この用語には例えば、ベクターに、自律型複製プラスミド又はウイルスに、又は原核もしくは真核生物のゲノムＤＡＮに組込まれる組換えＤＮＡ、又は他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ又はＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により製造されるゲノムＤＮＡ断片）として存在するものが含まれる。また、実質的に細胞性材料、ウイルス材料、又は培養培地（組換えＤＮＡ技術により製造される場合）、又は化学前駆体又は化学物質（化学合成される場合）不含である更なるポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡが含まれる。更に、“単離核酸断片”は、断片として天然に存在しない核酸断片であり、かつ天然の状態では見出されないであろう。

【0207】

本明細書中で使用されているように、“ポリヌクレオチド”又は“核酸分子”という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド相同体を使用して生じるＤＮＡ又はＲＮＡの相同体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であることができるが、有利には二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド相同体又は誘導体（例えば、イノシン又はホスホロチオエート・ヌクレオチド）を使用して合成されてもよい。このようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば変化した塩基対の能力を有するか、又は増大したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を製造できる。

【0208】

また本発明の範囲内に含まれるものは、本明細書中に記載された核酸分子の相補鎖である。

【0209】

本明細書で提供されるような配列情報は、誤って同定された塩基の包含までもが必要なほど狭く解釈されるべきではない。本明細書中に開示されている特異的配列を容易に使用し、完全な遺伝子をアルスロバクター種から単離でき、これは次に容易に更なる配列分析に課すことができ、それにより配列のエラーが同定される。

【0210】

特記されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子のシーケンシングにより決定された全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサーを使用して決定されたものであり、及び本明細書中で決定されたＤＮＡ分子によりコードされたポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上記のように決定したＤＮＡ配列の翻訳により予測したものである。従って、当該分野で公知のように、この自動化されたアプローチにより決定されたどのＤＮＡ配列に関しても、本明細書中で決定されたどのヌクレオチド配列も幾つかのエラーを有し得る。オートメーションにより決定されたヌクレオチド配列は、シーケンシングされたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して一般的に少なくとも約９０％の相同、より一般的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％相同である。実際の配列は、マニュアルのＤＮＡシーケンシング法を含む他のアプローチにより、更に詳細に決定できる。当該分野で公知のように、決定されヌクレオチド配列中での単一の挿入又は欠失は、実際の配列と比べてヌクレオチド配列の翻訳中にフレームシフトを生じるので、決定されたヌクレオチド配列によりコードされた予測のアミノ酸配列は、シーケンシングされたＤＮＡ分子により実際にコードされたアミノ酸とは完全に異なるであろう。

【0211】

当業者は、このような誤って同定された塩基を同定でき、かつこのようなエラーをどのように修正するかを知っている。

【0212】

“相同性”又は“パーセント相同性”という用語は、本明細書中では互換的に使用される。本発明の目的で、ここでは２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント相同性を決定するために、配列は最適な比較を目的にアライメントされる（例えば、第二のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアライメントのために、ギャップは第一のアミノ酸配列又は核酸配列の中に組込まれる）ことが定義付られる。次に、相応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置でアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が、第二の配列中の相応する位置で同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合には、この分子はその位置で同一である。２つの配列の間のパーセント相同性は、配列により割り当てられる同一の位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝同一の位置の数／位置の全体数（すなわち、重複する位置）＊１００）。有利には２つの配列は同じ長さである。

【0213】

当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために幾つかの種々のコンピュータープログラムが入手可能であることに気付くであろう。例えば、配列の比較及び２つの配列間のパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。有利な実施態様では、２つのアミノ酸配列の間のパーセント相同性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４〜４５３頁（１９７０））アルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のｇａｐウェイトならびに１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）を利用して決定される。当業者は、全てのこれらの種々のパラメーターが僅かに異なる結果を生じるが、しかし異なるアルゴリズムを使用する場合に、２つの配列の全体的なパーセント相同性は著しく変化しないことを理解している。

【0214】

もう１つの実施態様では、２つのヌクレオチド配列の間のパーセント相同性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０又は８０のｇａｐウェイトならびに１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイトを使用してＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を使用して決定される。他の実施態様では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列のパーセント相同性は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティー及び４のギャップペナルティーを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉ）に組み込まれていたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ,４：１１〜１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して決定される。

【0215】

本発明の核酸及びタンパク質配列は、更に“クエリー配列”として使用でき、一般的なデータベースに対する検索を行い、例えば、他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定することができる。このような研究は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの研究は、ＢＬＡＳＴＮプログラム（スコア＝１００、ワード長さ＝１２）を用いて行われ、本発明のＰＬＰ０３核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質の研究は、ＢＬＡＳＴＸプログラム（スコア＝５０、ワード長さ＝３）を用いて行われ、本発明のＰＬＰ０３タンパク質分子に相同であるアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップのあるアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁に記載されているようなギャップのあるＢＬＡＳＴを使用できる。ＢＬＡＳＴ及びギャップのあるＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、個々のプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴＮ）を使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。

【0216】

“アミノ酸のパーセンテージ相同性”又は“アミノ酸配列のパーセンテージ相同性”とは、２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味し、これは最適にアライメントしている場合には、同じアミノ酸の指定したパーセンテージを殆ど有する。例えば、“９５％のアミノ酸相同性”とは、２つのポリペプチドのアミノ酸の比較を意味し、最適にアライメントしている場合には９５％アミノ酸相同性を有する。有利には、同じではない残りの位置は、保存的アミノ酸の置換の分だけ異なる。例えば、電荷又は極性のような類似した化学特性を有するアミノ酸の置換は、タンパク質の特性に影響を与えないようである。この例には、グルタミンをアスパラギンに、又はグルタミン酸をアスパラギン酸にすることが含まれる。

【0217】

本明細書中で使用されているように、“ハイブリダイジング”という用語は、互いに少なくとも約９０％、有利には少なくとも約９５％、より有利には少なくとも約９６％、より有利には少なくとも９８％相同であるヌクレオチド配列が、通常は互いにハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を説明する意図がある。当業者は、更なる規定が適用されること、すなわち本明細書中で定義されているような本発明によるコード化されたアミノ酸配列中のアミノ酸の位置の置換が保持されたままであることを理解している。

【0218】

このようなハイブリダイゼーションの条件の有利な限定されない例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに引く続き、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃、有利には５５℃での、更に有利には６０℃、及びなお有利には６５℃での１回又は複数回の洗浄である。

【0219】

高ストリンジェントな条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でのハイブリダイゼーション及び０．２＊ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温での洗浄が含まれる。二者択一的に、洗浄を４２℃で行ってもよい。

【0220】

当業者は、どの条件がストリンジェントなハイブリダイゼーション及び高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件に当てはまるのかを知るであろう。このような条件に関する更なるガイダンスは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｏｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌ等（著者）、１９９５、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）から容易に入手可能である。

【0221】

当然ながら、ポリＡ配列（ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）トラクト）にだけ、又はＴ（又はＵ）残基の相補的ストレッチにだけハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部分に特異的にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドには含まれないであろう。それというのも、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチ又はその相補鎖（例えば、実際には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を有するどの核酸分子にもハイブリダイズしてしまうからである。

【0222】

また本発明は、調節配列とコンパーチブルな条件下に、適切な宿主細胞中のコーディング配列の発現を指示する１つ又は複数の調節配列に作動的に連結した本発明の単離ポリヌクレオチドを有する核酸構造物にも関する。

【0223】

本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドは、様々な方法で複製されて、ポリペプチドの発現を提供してもよい。ベクターへの挿入前の、ポリヌクレオチド配列の複製は、発現ベクターに応じて望ましいか又は必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチド配列を変性する技法は当業者に周知である。

【0224】

調節配列は、適切なプロモーター配列、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現するために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写調節配列を有する。このプロモーターは、突然変異体、トランケートされた及びハイブリッドされたプロモーターを含む選択された宿主細胞中で転写活性を示すどのヌクレオチド配列であってもよく、かつ宿主細胞に相同性又はヘテロである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られていてもよい。

【0225】

本発明の核酸構造物の転写を指示するための適切なプロモーターの例、特に細菌性宿主細胞中のものは、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バシラス・サブチリス・レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バシラス・リシェニフォルミスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バシラス・ステアロサーモフィルス麦芽アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バシラス・リシェニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バシラス・サブチリスｘｙＩＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、及び原核β−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等、１９７８、米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ７５：３７２７〜３７３１）ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等、１９８３、米国科学アカデミー紀要ＵＳＡ８０：２１〜２５）から得られるプロモーターである。更なるプロモーターは、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ１９８０、２４２；７４〜９４の“Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”及び上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９に記載されている。

【0226】

リボソーム結合配列として、これが宿主細胞中で発現できる限りはどの配列も使用できる。しかし、シャイン−ダルガノ配列と開始コドンが、これらの間に十分な距離（例えば、６〜１８塩基）を有するように調節されているプラスミドを使用するのが好ましい。

【0227】

転写及び翻訳を効率的に実施するために、タンパク質（ここで、該タンパク質の活性を有するタンパク質もしくは、その部分の欠失によりこのようなタンパク質から誘導されるタンパク質のＮ−末端は、発現ベクターによりコードされたタンパク質のＮ−末端に融合している）が発現されてもよい。

【0228】

調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、つまり宿主細胞により認識され転写を中止する配列であってもよい。転写中止配列は、常に目的のタンパク質の発現に必要なものではないにもかかわらず、通常は市販されているベクターの部分である。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’−末端に作動的に連結する。構造遺伝子の真下に転写中止配列を置くのが有利である。選択される宿主細胞中で機能的であるどのターミネーターを本発明で使用してもよい。

【0229】

調節配列は、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの翻訳されない部分であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’−末端に作動的に連結している。選択される宿主細胞中で機能的であるどのリーダー配列を本発明で使用してもよい。

【0230】

また調節配列は、ポリアデニル化配列、すなわちヌクレオチド配列の３’末端に作動的に連結した配列であってもよく、及びこれはトランスクライブされた場合には、トランスクライブされたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加する信号として宿主細胞により認識される。選択される宿主細胞中で機能的であるどのポリアデニル化配列を本発明で使用してもよい。

【0231】

調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に結合し、及びコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向けるアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコーディング領域であってもよい。ヌクレオチド配列のコーディング配列の５’末端は、分泌ポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと一緒に、転写リーディング枠中に自然に結合したシグナルペプチドコーディング領域を含んでいてもよい。二者択一的に、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列とは異種であるシグナルペプチドコーディング領域を含んでいてもよい。外来シグナルペプチドコーディング領域が必要であるかもしれないが、その際に、コーディング配列は当然ながらシグナルペプチドコーディング領域を含まない。二者択一的に、外来シグナルペプチドコーディング領域は、ポリペプチドの分泌を容易にするために、単に天然のペプチドコーディング領域を置き換えてもよい。しかし、発現ポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向ける、すなわち、培養培地へ分泌されるどのシグナルペプチドコーディング領域を本発明で使用してもよい。

【0232】

調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域であってもよい。結果として得られるポリペプチドは、プロエンザイム又はプロポリペプチド（又はある場合にはチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に不活性であり、かつプロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自動触媒的切断により成熟した活性ポリペプチドに変換できる。プロペプチドコーディング領域は、枯草菌アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、酵母α因子、リゾムコール属ミエヘイアスパラギン酸プロテアーゼ及びマイセリオフトラ・サーモフィラ・ラッカーゼの遺伝子から得られてもよい。

【0233】

ペプチド及びプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合には、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、及びシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。宿主細胞の成長に関係するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加するのも望ましいかもしれない。調節系の例は、化学刺激又は物理刺激に応答してスイッチがオン又はオフする遺伝子の発現を引き起こすものであり、調節化合物の存在を含む。原核系における調節系には、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｐオペレーター系が含まれる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が使用されてもよい。糸状菌では、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、黒色コウジ菌グリコアミラーゼプロモーター及び米コウジ菌グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用してもよい。調節配列の他の例は、遺伝子複製を可能にするものである。原核系では、これらにはメトトレキセートの存在で増殖されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及び重金属で増殖されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらの場合には、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節配列に作動的に連結するであろう。

【0234】

また本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター及び転写及び翻訳終始シグナルを有する組換え発現ベクターに関する。本明細書中で記載されている様々な核酸及び調節配列を合わせて組換え発現ベクターを作製してもよく、この組換え発現ベクターは、１つ又は複数の便利な制限部位を含み、このような部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にしてもよい。二者択一的に、本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列又は該配列を有する核酸構造物を発現用の適切なベクターに挿入することにより発現されてもよい。発現ベクターの作製では、コーディング配列が発現用の適切な調節配列に作動的に連結するように、コーディング配列はベクター中に存在してもよい。

【0235】

組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を便利に課すことができ、及びヌクレオチド配列の発現をもたらすことができるどのベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、通常はベクターと、このベクターが組込まれることになる宿主細胞との相溶性によるであろう。ベクターは線状又は閉じた円形のプラスミドであってもよい。

【0236】

ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち染色体外の部分として存在するベクター（その複製は染色体の複製とは独立している）、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。該ベクターは、自己複製を保証するどの媒体を有していてもよい。二者択一的に、該ベクターは宿主細胞に組込まれる場合にゲノム中にインテグレートされ、かつそれがインテグレートされていた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。更に、一緒になって宿主細胞のゲノム中に組込まれるべき全体のＤＮＡを有する単一のベクターもしくはプラスミド又は２つ又はそれ以上のベクターもしくはプラスミド、又はトランスポゾンを使用してもよい。

【0237】

これらの形質転換体を同定し、かつ選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に耐性）をコードする遺伝子は、一般的に目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に組込まれる。本発明のベクターは、形質転換された、トランスフェクトされた、トランスデュースされた、又はそのような細胞の容易な選択を可能にする１つ又は複数の選択マーカーを含有するのが好ましい。選択マーカーは、遺伝子であり、その生成物は殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養、及びそのようなものを提供する。バクテリア性選択マーカーの例は、バシラス・サブチリス又はバシラス・リフェニフォルミス由来のｄａｌ遺伝子であるか、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールのような抗生物質耐性、又はテトラサイクリン耐性を確実にするマーカーである。

【0238】

組込まれた核酸で形質転換された細胞は薬剤選択により同定できる（例えば、選択マーカー遺伝子を組込まれた細胞は生きるが、その他の細胞は死ぬ）。酵母宿主細胞に適切な選択マーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞で使用するための選択マーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（ニトレートリダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（スルフェートアデニルトランスフェラーゼ）及びｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）ならびにそれらの同等物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0239】

本発明のベクターは、宿主細胞中へのゲノムへのベクターの組込みを可能にするか、又はゲノムとは独立に細胞中でのベクターの自律複製を可能にするエレメントを有していてもよい。

【0240】

宿主細胞ゲノム中への組込みのために、ベクターはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、又は相同又は非相同組換えによりゲノム中に組込むためのベクターの他の任意のエレメントに依存してもよい。二者択一的に、相同組換えにより、染色体中の正確な位置で宿主細胞のゲノム中への組込みを指示する更なるヌクレオチド配列をベクターは含んでいてもよい。正確な位置での組込みの可能性を高めるために、組込みエレメントは、有利には十分な数の核酸を含むべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同であるどの配列であってもよい。更に、組込みエレメントは、非コーディング又はコーディングヌクレオチド配列であってもよい。他方で、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組込まれていてもよい。

【0241】

自律複製のために、ベクターは更にベクターに複製の原点を有し、該ベクターが当該宿主細胞中で自律的に複製できるようにしてもよい。複製の原点は、細胞中で機能する自律的複製を媒介するどのプラスミドレプリケーターであってもよい。“複製の原点”又は“プラスミドレプリケーター”という用語は、本明細書中では、プラスミド又はベクターがｉｎ ｖｉｖｏで複製可能にするヌクレオチド配列であると定義される。

【0242】

複製の細菌起源の例は、大腸菌中での複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹＣ１８４ならびにバシラス中での複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭＲ１の複製の起源である。

【0243】

酵母宿主細胞中で使用するための複製の起源の例は、２ｍｉｃｒｏｎ複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ及びＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。

【0244】

本発明のポリヌクレオチドの１つよりも多いコピーを宿主細胞に挿入し、遺伝子産物の生産を増大してもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増大は、配列の少なくとも１つの更なるコピーを宿主細胞ゲノム中に組込むことにより得られるか、又は複製可能な選択マーカー遺伝子とポリヌクレオチドを含むことにより得られ、その際、細胞は選択マーカー遺伝子の複製コピーを有し、及びそれにより該細胞を適切な選択剤の存在で培養することによりポリヌクレオチドの更なるコピーを選択できる。

【0245】

上記のエレメントをライゲートするために使用し、本発明の組換え発現ベクターを構築する手法は、当業者に周知である（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９参照）。

【0246】

発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適切な形で発明の核酸を有する。これは、組換え発現ベクターが発現に使用すべき宿主細胞に基づき選択される１つ又は複数の調節配列を含むことを意味し、前記配列は、発現すべき核酸配列に作動的に連結している。組換え発現ベクター中では、“作動的に連結した”は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節配列に結合していることを意味する意図がある（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系で、又は宿主細胞中で、ベクターが宿主細胞中に組込まれる場合）。“調節配列”という用語には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節エレメントを含む意図がある。このような調節配列は、例えば、Ｇｅｏｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞中のヌクレオチド配列の構成的発現又は誘発性発現を指示するものが含まれる。

【0247】

ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター、例えば、λファージＰＬプロモーター、Ｅ．Ｃｏｌｉ ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ｌａｍｂｄａＰＲ、ＰＬプロモーター及びｔｒｐプロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、アーリー及びレートＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲｓのプロモーター、例えば、ラウス肉腫ウイルス（“ＲＳＶ”）のもの、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）及びメタロチオネインプロモーター、例えば、マウスメタロチオニン−Ｉプロモーターに作動的に連結すべきである。当業者は、他の適切なプロモーターも知るであろう。原核生物中でのタンパク質の発現は、タンパク質の発現を指示する構築的又は誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、大腸菌中で頻繁に実施される。特殊な実施態様では、微生物、有利には大腸菌、バシラス種、コリネ型バクテリアにおいてヒダントイナーゼの高い発現レベルを指示できるプロモーターが有利である。このようなプロモーターは当業者に公知である。発現構築物は、転写開始部位、終始部位を有していてもよく、かつ転写領域では、翻訳用のリボソーム結合部位を有していてもよい。構築物により発現される成熟したトランスクリプトのコーディング領域は、開始部分で翻訳開始ＡＵＧ及び翻訳すべきポリペプチドの末端で適切に存在する終止コドンを含むであろう。

【0248】

ベクターＤＮＡは、通常の形質転換又はトランスフェクション技術により原核細胞及び真核に組込むことができる。本明細書で使用されているように、“形質転換”及び“トランスフェクション”という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に組込むための当該分野で認識される様々な技術（リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスダクション、感染、リポフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション又は電気穿孔法を含む）を意味する意図がある。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｏｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版社、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、Ｄａｖｉｓ等、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）ならび他の研究マニュアルに見出すことができる。

【0249】

ベクターのうちバクテリアにおいて使用するために有利であるのは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びＰＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能）；及びｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手可能）である。その他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになるであろう。

【0250】

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを有する組換え宿主細胞にも関し、これらはヒダントイナーゼポリペプチドの組換え生産において有利に使用される。本発明のポリヌクレオチドを有するベクターは、宿主細胞に組込まれ、該ベクターが染色体挿入物として、又は自己複製する外染色体外ベクターとして保持されるようにする。“宿主細胞”という用語には、複製の間に突然変異により親細胞と同一ではない親細胞の子孫も含まれる。宿主細胞の選択は、ポリペプチド及びその起源をコードする遺伝子に応じて広い範囲になるであろう。

【0251】

“形質転換細胞”又は“組換え細胞”を参照することもでき、該細胞は、これに（又はその子孫に）組換えＤＮＡ技術によって本発明による核酸が組込まれた（宿主）細胞である。

【0252】

原核生物及び真核細胞の両方には、例えば、細菌、菌類、酵母及びそのようなものが含まれる。特に、宿主細胞として有用な微生物は、グラム陽性又はグラム陰性細菌のような細菌細胞であり、バシラス種、バシラス・サブチリス、ストレプトマイセス種、大腸菌、シュードモナス種、サルモネラ・チフィムリウム、コリネ型バクテリアならびに放線菌、真菌細胞、例えば、酵母、動物細胞及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

【0253】

ベクターの細菌宿主細胞への組込みは、例えば、コンピテントセル（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ８１：８２３〜８２９；又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５６：２０９〜２２１参照）、電気穿孔（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２〜７５１参照）、又は接合（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：５７７１〜５２７８参照）を使用して、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６８：１１１〜１１５参照）により実行してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0254】

【図1】図１は、プラスミドｐＡＳ６−ＨｙｕＨを示す図である。

【0255】

以下の実施例は、本発明により変性ヒダントイナーゼを同定及び単離するために使用される方法に関して更なる詳細を提供する。本発明は該実施例の記載に限定されるわけではない。

【0256】

実施例
例１：ヒダントイナーゼのクローニング及び発現
配列番号１のアミノ酸配列を有するアルスロバクター種ヒダントイナーゼ（ＨｙｕＨ）をｐＯＭ１８ベクターに供給した。更なる操作に、ＨｙｕＨ遺伝子の正確な方向でサブクローニングが必要であった。ｐＯＭ１８の二重消化にＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用した。ベクターのバックボーン、ｐＡＳ６由来のｃａｒｂＡ遺伝子（カルバモイラーゼ）及びｐＯＭ１８由来のＨｙｕＨ遺伝子は、ゲル抽出ＰＣＲであった。３つ全てのゲル抽出生成物をカラム精製（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ）し、及びライゲーションを行い、引き続き大腸菌ＤＨ５α中で形質転換した。ＬＢ−ａｍｐ中でクローンを一晩成長させ、及びｃａｒｂＡ由来の遺伝子特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して培養ＰＣＲを実施し、正確な方向をチェックした。得られたプラスミドｐＡＳ６−ＨｙｕＨは、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する野生型ヒダントイナーゼ遺伝子及び配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現するカルバモイラーゼ遺伝子を有していた。所望のクローンのプラスミドを製造し、及び発現と活性のチェックのためｐＯＭ２１ｃ（ヒダントインラセマーゼを発現するプラスミド）含有のＪＭ１０９細胞中で形質転換した。発現の分析のために、予備培養物をＬＢ培地（適切な抗生物質を有する）中、３７℃で一晩成長させた。予備培養物１０μｌを誘発培地（ＬＢ培地＋２ｍｇ／ｍｌラムノース）３ｍｌ中に添加した。培養物を３０℃で２０時間成長させた。細胞５μｌをＳＤＳ ＰＡＧＥ分析に課した。蛍光に基づくスクリーニングアッセイを使用し、酵素活性をチェックした。

【0257】

例２：ヒダントイナーゼの突然変異体
野生型アルスロバクター種ヒダントイナーゼ（配列番号１）中の幾つかの位置を突然変異誘発のために決定した。突然変異体ライブラリーを選択したアミノ酸位置で飽和突然変異誘発により製造した。次に、活性を高めるためにハイスループット・スクリーニングアッセイを使用して合理的突然変異体ライブラリーをスクリーニングした。部位飽和には、５つの部位（Ｙ７３、Ｉ９５、Ｖ１５４、Ｐ１５５、Ｈ３１６）及び突然変異誘発には２つの部位（Ａ１５２Ｇ、Ｓ１５３Ｇ）を選択した。決定したアミノ酸位置に、５つの部位飽和突然変異誘発と１つの部位特異的突然変異を行った。

【0258】

例２．１：目的の突然変異体ライブラリーの構築（ＳＳＭ＆ＳＤＭ）
野生型ヒダントイナーゼを発現する例１で得られたプラスミド（ｐＡＳ６−ＨｙｕＨ；図１）を使用して、又は後続の工程では前記ヒダントイナーゼの突然変異体を有するプラスミドを使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼを部位飽和突然変異誘発（ｓｓｍ）及び部位特異的突然変異誘発（ｓｄｍ）に適用した。

【0259】

部位飽和／部位特異的突然変異誘発には、目的の突然変異体ライブラリーの作製に２工程のＰＣＲアプローチを適用した。ＰＣＲ産物をカラム精製し、及び一晩ＤｐｎＩ消化を行い、親プラスミドを取り除いた。次にｐＡＳ６−ＨｙｕＨの全てのエレメントを有する全長プラスミドを示す生成物をｐＯＭ２１ｃ含有のＪＭ１０９細胞中で形質転換した。

【0260】

詳細：２工程のＰＣＲプロトコールに続いて部位飽和／部位特異的突然変異誘発（ＳＳＭ）を実施した。ＰＣＲ反応混合物５０μｌは、プラスミドテンプレート１ｎｇ／μｌ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト、ドイツ）、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ１Ｕ及び３００μＭ ｄＮＴＰ’ｓを有していた。反応混合物を２つの等量に分け、及び各々のアミノ酸位置（表１参照）の部位飽和用のフォワードプライマーとリバースプライマー４００ｎＭを添加し、反応混合物を分けた。ＰＣＲプログラムを９８℃で４５秒間（１サイクル）；９８℃で１５秒間；６５℃で３０秒間；７２℃で３分３０秒間（５サイクル）；７２℃で５分間（１サイクル）行った。第一工程の後に、両方の反応をプールし、及び１８回以上の繰り返しで同じプログラムを実施した。

【0261】

表１には、記載したＰＣＲ法に使用したプライマー（Ｆ＝フォワードプライマー；Ｒ＝リバースプライマー）がまとめられていて、変性すべき配列番号１のアミノ酸位置も示されている。

【0262】

例２．２：アルスロバクター種ヒダントイナーゼ（ＨｙｕＨ）のランダム突然変異体ライブラリーの構築
ｅｐＰＣＲ突然変異体ライブラリーの作製に、ＭｎＣｌ_２を使用してエラープローン条件を生じさせた。ＭｎＣｌ_２の濃度を様々に変えること（０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ）によりＰＣＲを初めに行った。反応混合物は、プラスミドテンプレート０．３ｎｇ／μｌ（例１で得られた野生型ヒダントイナーゼを発現するプラスミド［ｐＡＳ６−ＨｙｕＨ；図１］を使用して、又は試験のより後半の工程で、前記の得られたヒダントイナーゼの突然変異体を有するプラスミドを使用して）、１×ＳｅＳａＭ^（R）Ｔａｑバッファー（ＳｅＳａＭ−Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、ブレーメン、ドイツ）、ＳｅＳａＭ^（R）Ｔａｑポリメラーゼ１Ｕ、ｄＮＴＰｓ２００μＭならびに表１に示されているＨｙｕＨ＿ＧＳ＿Ｆ及びＨｙｕＨ＿Ｒプライマー２５０ｎＭをそれぞれ様々なＭｎＣｌ_２の濃度に合わせて有していた。ＰＣＲプログラムは、９４℃で２分（１サイクル）；９４℃で３０秒間；５６℃で３０秒間；７２℃で５０秒間（２５サイクル）；７２℃で５分間（１サイクル）であった。ＳｅＳａＭ^（R）プロトコール（Ｍｕｎｄｈａｄａ等、“ＳｅＳａＭ−Ｔｖ−ＩＩ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐａｃｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｕｎｏｂｔａｉｎａｂｌｅ ｂｙ ｅｐＰＣＲ”Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２０１１ Ｊｕｌ ４；１２（１０）：１５９５〜６０１）を使用して、トランスバージョンにバイアスが掛かった突然変異体ライブラリーを構築した。ＰＣＲ産物をカラム精製し、及びクローニング用にＭｅｇａｗｈｏｐを課した。ＰＣＲ反応混合物５０μｌは、プラスミドテンプレート１ｎｇ／μｌ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト、ドイツ）、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ１Ｕ、３００μＭ ｄＮＴＰ’ｓならびにｅｐＰＣＲ又はＳｅＳａＭ^（R）からの突然変異したテンプレート５ｎｇ／ｌを有していた。Ｍｅｇａｗｈｏｐ用のＰＣＲプログラムは、７２℃で３分間（１サイクル）；９８℃で４５秒間（１サイクル）；９８℃で１５秒間；６２℃で３０秒間；７２℃で５分間（２５サイクル）；７２℃で５分間（１サイクル）であった。次にＰＣＲミックスをカラム精製し、かつ一晩Ｄｐｎｌ（１０Ｕ）消化に課した。タンパク質発現及び引き続く分析のために、ｐＡＳ６−ＨｙｕＨの全てのエレメントを有する全長プラスミドを示すＰＣＲ産物を化学的コンピテントセルＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マンハイム、ドイツ）中で形質転換した。

【0263】

例２．３：目的のＯｍｎｉｃｈａｎｇｅ突然変異体ライブラリー
Ｏｍｎｉｃｈａｎｇｅ用のプロトコールは、配列中の離れた位置での複数の部位飽和突然変異誘発を可能にする。これは４工程で行われ、ＮＮＫ−コドンとホスホロチオジエステル結合を含むプライマーを用いるＰＣＲによる断片の生成から開始し、次に相補的５’−オーバーハングを生じるための元素状ヨウ素でのＤＮＡ切断反応、３番目にＤＮＡ−ハイブリダイゼーション及び最後に形質転換及びニック修復が続く。

【0264】

詳細には、ＰＣＲ反応混合物５０μｌは、プラスミドテンプレート０．５ｎｇ／μｌ、１×Ｐｈｕｓｉｏｎバッファー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、フランクフルト、ドイツ）、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ５Ｕ、２００μＭ ｄＮＴＰ’ｓ及び断片に特異的フォワード及びリバースプライマー４００μＭを有していた。短い断片用のＰＣＲプログラムは、９４℃で３分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で３０秒間（２５サイクル）；７２℃で１分間（１サイクル）であった。ベクター断片には、ＰＣＲプログラムを９４℃で３分間（１サイクル）；９４℃で３０秒間；５５℃で３０秒間；７２℃で１．５分（２５サイクル）；７２℃で３分間（１サイクル）に変更した。次にＰＣＲ混合物をカラム精製し、及び一晩Ｄｐｎｌ（１０Ｕ）消化に課し、カラム精製し、及び希釈して０．０５ｐｍｏｌ／μｌにした。イオジン切断及びＤＮＡ−断片のハイブリダイゼーションを元のＯｍｎｉｃｈａｎｇｅプロトコールに従って実施した（Ｄｅｎｎｉｇ等、“ＯｍｎｉＣｈａｎｇｅ：Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｉｔｅ−Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ Ｃｏｄｏｎｓ”ＰＬｏＳＯＮＥ，２００１，６（１０）：ｅ２６２２２）。次にハイブリダイゼーション産物を形質転換し、タンパク質発現及び引き続く分析のために化学的コンピテントセルＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マンハイム、ドイツ）中で形質転換した。

【0265】

例３：マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）用の蛍光に基づくスクリーニングアッセイ
予備培養及び発現：９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中の適切な抗生物質含有のＬＢ培地１００μｌをポジティブ及びネガティブコントロールならびに得られたクローンと一緒に爪楊枝を使用して接種した。このプレートを３７℃（９００ｒｐｍ）で一晩インキュベートした。スクリーニングプレートを調製するために、９６ウェルレプリケーターを使用して、抗生物質２ｍｇ／ｍｌラムノース含有の培地２００μｌ／ウェルを有する新たなＭＴＰにクローンを移した。プレートの残りの材料に、５０％グリセロール（ｗ／ｗ）１００μＬを加え、短く混合し、及びプレートを−８０℃で貯蔵した。

【0266】

バイオ形質転換：３０℃（９００ｒｐｍ）で一晩インキュベートした後に、ホモジナイズしたＬ−トリプトファン又はＤ−トリプトファンヒダントイン懸濁液（ＰＢＳバッファー中５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）１００μＬ／ウェルをスクリーニングプレートに添加した。該プレートを３０℃及び９００ｒｐｍでインキュベートし、及び適切なプレートリーダーを用いて種々の時点で蛍光を３００／３５０ｎｍで測定した。

【0267】

例４：結果
部位飽和突然変異誘発の実験及び例２によるランダム突然変異誘発ライブラリーから得られた突然変異体ヒダントイナーゼを例３に記載された蛍光アッセイを使用してそれらの活性に関してスクリーニングした。読み取りは、４０分と６０分の間の解析測定に関する。各々の測定を３回実施した。上記のように、基質としてそれぞれＬ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｌ−トリプトファンヒダントイン）とＤ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｄ−トリプトファンヒダントイン）を用いて、突然変異体ヒダントイナーゼをそれらの活性に関してアッセイし、及びそれらの活性を配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ヒダントイナーゼの活性と比較した。

【0268】

表２には、得られた結果がまとめられている。そこに示されているように、配列番号１のアミノ酸配列を有する微生物アルスロバクター種により生産された野生型ヒダントイナーゼの活性と比較して、より高い触媒活性及び／又はより高いエナンチオ選択を示す一連の改善された突然変異体が得られた。

【0269】

表２では、“突然変異誘発ラウンド”の欄は、どのタイプの突然変異誘発から突然変異体が由来しているかを示している（ＳＳＭ＝部位飽和突然変異誘発；ｅｐＰＣＲ＝エラープローンＰＣＲ；ｃｏｍｂｉ ＳＳＭ＝組合せの部位飽和突然変異誘発、１つ以上のアミノ酸の位置での突然変異誘発）。“置換”と記載されている欄では、配列番号１のアミノ酸配列中の所定の位置でのアミノ酸残基の置換が示されている。

【0270】

“Ｄ−Ｔｒｐ−ｈｙｄ対ＨｙｕＨ ｗｔの活性比”と表示されている欄は、基質としてＤ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｄ−トリプトファンヒダントイン）を使用して、野生型ヒダントイナーゼに関して触媒活性の何倍かの改善を示す。“Ｌ−Ｔｒｐ対ＨｙｕＨ ｗｔの活性比”と表示されている欄は、基質としてＬ−５−インドリルメチルヒダントイン（＝Ｌ−トリプトファンヒダントイン）を使用して野生型ヒダントイナーゼに関する活性の何倍かの改善を示す。

【0271】

“Ｄ−Ｔｒｐ−ｈｙｄ対Ｌ−Ｔｒｐ−ｈｙｄの活性比”の欄は、Ｄ−５−インドリルメチルヒダントインを変換するための突然変異体の触媒活性対Ｌ−５−インドリルメチルヒダントインを変換するための突然変異体ヒダントイナーゼの活性の比を示し、かつどちらかのエナンチオマーに何倍かの過剰の優位性を示している。言い換えると、“Ｄ−Ｔｒｐ−ｈｙｄ対Ｌ−Ｔｒｐ−ｈｙｄの活性比”の欄は、各々のヒダントイナーゼのエネンチオ選択性を示している。

【0272】

本発明によるヒダントイナーゼは、５−置換ヒダントイン化合物、特にＤ−トリプトファンヒダントインに関して増大した変換率を示している。従って、本明細書中で記載されている本発明によるヒダントイナーゼ突然変異体は、本発明による突然変異体ヒダントイナーゼならびにＤ−カルバモイラーゼを使用するＤ−トリプトファンヒダントインから出発して、Ｄ−アミノ酸、特にＤ−トリプトファンを製造する方法において適切であると考えられた。

【0273】

【表1】

【0274】

【表2】

【0275】

【表3】

【0276】

【表4】

【0277】

【表5】

【0278】

【表6】

【0279】

【表7】

【図1】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]