特許 6279503 インフルエンザウイルスの再集合

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6279503

(24)【登録日】2018年1月26日

(45)【発行日】2018年2月14日

(54)【発明の名称】インフルエンザウイルスの再集合

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/04 20060101AFI20180205BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20180205BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20180205BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20180205BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/04ZNA

   A61P31/16

   A61K39/145

   !C12N15/00 A

【請求項の数】17

【外国語出願】

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2015-55989(P2015-55989)

(22)【出願日】2015年3月19日

(62)【分割の表示】特願2013-548864(P2013-548864)の分割

【原出願日】2013年3月2日

(65)【公開番号】特開2015-119730(P2015-119730A)

(43)【公開日】2015年7月2日

【審査請求日】2016年3月1日

(31)【優先権主張番号】61/605,922

(32)【優先日】2012年3月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/685,766

(32)【優先日】2012年3月23日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM ACC2219

(73)【特許権者】

【識別番号】517323533

【氏名又は名称】セキラス ユーケー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｅｑｉｒｕｓ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ピラダ スッパピパット

(72)【発明者】

【氏名】ピーター メイソン

(72)【発明者】

【氏名】ビョン カイナー

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ ラルフ ドルミッチャー

(72)【発明者】

【氏名】ハイディ トルシェイム

【審査官】 小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／０７７９８６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第９７／０３７０００（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／０７００９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Vaccine，２０１１年 ７月１８日，Vol.29, No.32，p.5153-5162

【文献】 PLoS One，２０１１年 ６月１３日，Vol.6, No.6，e20823, p.1-11，Epub

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４と比較して、同時にかつ同じ増殖条件下で、ＭＤＣＫ細胞においてより高いウイルス力価まで増殖し得るリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、該リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含み、ここで、
ＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメントが、同じドナー株に由来し、かつ、（ｉ）配列番号１８および１９の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、または、（ｉｉ）配列番号１８および１９によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含み、
該ウイルスがさらに、
（ａ）（ｉ）配列番号１４の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＳセグメントと、
（ｉ）配列番号１３の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、Ｍセグメントと、
（ｉ）配列番号２０の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２０によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＰセグメントと、
（ｉ）配列番号９の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＰＡセグメントと、
を含むか；あるいは
（ｂ）（ｉ）配列番号１４の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＳセグメントと、
（ｉ）配列番号１３の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、Ｍセグメントと、
（ｉ）配列番号１２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＰセグメントと、
（ｉ）配列番号１７の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１７によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＰＡセグメントと、
を含むか；あるいは
（ｃ）（ｉ）配列番号２２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２２によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＳセグメントと、
（ｉ）配列番号１３の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、Ｍセグメントと、
（ｉ）配列番号１２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＰセグメントと、
（ｉ）配列番号９の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＰＡセグメントと、
を含むか；あるいは
（ｄ）（ｉ）配列番号１４の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＳセグメントと、
（ｉ）配列番号２１の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号２１によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、Ｍセグメントと、
（ｉ）配列番号１２の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＮＰセグメントと、
（ｉ）配列番号９の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するウイルスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、ＰＡセグメントと、
を含む、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。

【請求項2】

前記ウイルスが、
（ｉ）配列番号１８および配列番号１９の配列を有するか、または、（ｉｉ）配列番号１８および配列番号１９によってコードされるウイルスポリペプチドをコードする、ＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメント；ならびに
（ａ）（ｉ）配列番号１４のＮＳセグメント、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＳセグメントと、（ｉ）配列番号１３のＭセグメント、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＭセグメントと、（ｉ）配列番号２０のＮＰセグメント、または（ｉｉ）配列番号２０によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＰセグメントと、（ｉ）配列番号９のＰＡセグメント、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＰＡセグメント；あるいは
（ｂ）（ｉ）配列番号１４のＮＳセグメント、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＳセグメントと、（ｉ）配列番号１３のＭセグメント、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＭセグメントと、（ｉ）配列番号１２のＮＰセグメント、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＰセグメントと、（ｉ）配列番号１７のＰＡセグメント、または（ｉｉ）配列番号１７によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＰＡセグメント；あるいは
（ｃ）（ｉ）配列番号２２のＮＳセグメント、または（ｉｉ）配列番号２２によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＳセグメントと、（ｉ）配列番号１３のＭセグメント、または（ｉｉ）配列番号１３によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＭセグメントと、（ｉ）配列番号１２のＮＰセグメント、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＰセグメントと、（ｉ）配列番号９のＰＡセグメント、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＰＡセグメント；あるいは
（ｄ）（ｉ）配列番号１４のＮＳセグメント、または（ｉｉ）配列番号１４によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＳセグメントと、（ｉ）配列番号２１のＭセグメント、または（ｉｉ）配列番号２１によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＭセグメントと、（ｉ）配列番号１２のＮＰセグメント、または（ｉｉ）配列番号１２によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＮＰセグメントと、（ｉ）配列番号９のＰＡセグメント、または（ｉｉ）配列番号９によってコードされるウイルスポリペプチドをコードするＰＡセグメント
を含む、請求項１に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。

【請求項3】

前記ウイルスが、汎流行性インフルエンザ株由来のＨＡセグメントを有する、請求項１または請求項２に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。

【請求項4】

リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のインフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を培養宿主に導入する工程；ならびに
（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、
を包含する、方法。

【請求項5】

前記少なくとも１種の発現構築物が、配列番号９〜１４および配列番号１７〜２２からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

工程（ｉｉ）において得られるリアソータントウイルスを精製する工程（ｉｉｉ）をさらに包含する、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

インフルエンザＡ型ウイルスを生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）培養宿主を、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスに感染させる工程；
（ｂ）該工程（ａ）からの宿主を培養して、該ウイルスを生成する工程
を包含する、方法。

【請求項8】

前記工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程（ｃ）をさらに包含する、請求項７に記載のインフルエンザＡ型ウイルスを生成する方法。

【請求項9】

ワクチンを調製する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項７または８に記載の方法によってウイルスを調製する工程、および
（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製する工程、
を包含する、方法。

【請求項10】

前記培養宿主が、孵化鶏卵である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記培養宿主が、哺乳動物細胞である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記細胞が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞が、接着して増殖するか、または、懸濁物中で増殖する、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記ＭＤＣＫ細胞が、細胞株ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

工程（ｂ）が、前記ウイルスを不活性化する工程を包含する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ワクチンが、全ビリオンワクチン、スプリットビリオンワクチン、表面抗原ワクチン、またはビロソームワクチンである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ワクチンが、１用量あたり１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この特許出願は、２０１２年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６０５，９２２号および２０１２年３月２３日に出願された同第６１／６８５，７６６号（これらの完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

【0002】

（技術分野）
本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスの再集合の分野にある。さらに、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスから防御するためのワクチンを製造することに関する。

【背景技術】

【0003】

（背景技術）
インフルエンザ感染に対して最も効率的な防御は、広まっている株に対するワクチン接種であり、可能な限り迅速にワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを生成することは、重要である。

【0004】

野生型インフルエンザウイルスは、しばしば、卵および細胞培養物において低い力価まで増殖する。ワクチン製造のためによりよく増殖するウイルス株を得るために、上記広まっているワクチン株を、より迅速に増殖する高収量ドナー株と再集合させることは、現在一般的な実務である。これは、培養宿主を、上記広まっているインフルエンザ株（上記ワクチン株）および上記高収量ドナー株に同時に感染させ、上記ワクチン株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）セグメント、ならびに上記ドナー株に由来する他のウイルスセグメント（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２をコードするもの）を含むリアソータントウイルスを選択することによって、達成され得る。別のアプローチは、上記インフルエンザウイルスを、逆遺伝学によって再集合させることである（例えば、参考文献１および２（特許文献１および特許文献２）を参照のこと）。

【0005】

参考文献３（特許文献３）は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１遺伝子セグメント、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来する改変ＰＡセグメント、ならびにＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来する残りのウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスが、細胞中で増大した増殖を示すことを報告する。

【0006】

ワクチン製造のためのインフルエンザウイルスを再集合させるためのドナー株は、現在ごく数が限られており、最も一般的に使用される株は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ａ／ＰＲ／８／３４）株である。しかし、Ａ／ＰＲ／８／３４バックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、常に効率的なワクチン製造を確実にするために十分よく増殖するわけではない。従って、インフルエンザウイルスの再集合のためのさらに改善されたドナー株を提供することは、当該分野で必要である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００７／００２００８号

【特許文献2】国際公開第２００７／１２４３２７号

【特許文献3】国際公開第２０１０／０７００９８号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

（好ましい実施形態の要旨）
本発明者らは、いまや驚くべきことに、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、同じドナー株に由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスと比較して、培養宿主においてより迅速に増殖し得ることを発見した。特に、本発明者らは、２種の高収量ドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むインフルエンザウイルスが、上記２種の元のドナー株のうちのいずれかを使用して作製されたリアソータントより高収量の、標的ワクチン関連ＨＡ／ＮＡ遺伝子を含むリアソータントを生成し得ることを見いだした。

【0009】

原則としては、密接に関連したインフルエンザＡ型ウイルスの全てのセグメントは、生存能のあるウイルスを生成するように特異的に再集合され得るが、得られたウイルス成分の効率の悪い活性に起因して、これらウイルスのほんのわずかが高増殖リアソータントである。本発明者らは、上記高収量株を生成するバックボーン組み合わせを提供した。２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、同じドナー株（特に、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９様株（本明細書中では１０５ｐ３０株ともいわれる）に由来するＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメントを含み得る。上記ＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメントは、配列番号２および／もしくは配列番号３の配列と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。

【0010】

上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、２種または３種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、各ドナー株は、上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスのバックボーンセグメントのうちの１種より多くを提供し得るが、上記ドナー株のうちの１種もしくは２種はまた、単一のバックボーンセグメントのみを提供し得る。

【0011】

上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、２種、３種、４種もしくは５種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記ドナー株の１種もしくは２種は、上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスのバックボーンセグメントのうちの１種より多くを提供し得る。一般に、上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、６種より多くのバックボーンセグメントを含み得ない。よって、例えば、上記ドナー株のうちの１種が、上記ウイルスセグメントのうちの５種を提供する場合、上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、合計２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントしか含み得ない。

【0012】

リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含む場合、上記ウイルスは、好ましくは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントもしくはＭセグメントを含まない。リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントもしくはＭセグメントを含む場合、上記ウイルスは、好ましくは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントを含まない。いくつかの実施形態において、本発明は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントおよびＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントおよびＭセグメントを有するリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを包含しない。上記Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７に由来するＰＢ１セグメントは、配列番号４６の配列を有し得、上記Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来するＰＡセグメント、ＮＰセグメントもしくはＭセグメントは、それぞれ、配列番号４７、４８もしくは４９の配列を有し得る。

【0013】

本発明者らはまた、公知のドナー株の改変体が、上記元のドナー株と比較して、より高いウイルス力価まで増殖し得、従って、インフルエンザウイルスを再集合させるためにより良好なドナー株であり得ることを発見した。このような株の例は、ＰＲ８−Ｘおよび１０５ｐ３０である。

【0014】

本発明のインフルエンザＡ型ウイルス株は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４と比較して、同じ時間においてかつ同じ増殖条件下でＭＤＣＫ細胞においてより高いウイルス力価まで増殖し得、そして／または同じインフルエンザドナー株に由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザ株と比較して、より高いレスキュー効率を有し得る。このようなインフルエンザ株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、さらに提供される。

【0015】

本発明はまた、ドナー株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを提供し、ここで上記ドナー株は、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択される。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記ＰＡセグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号９および１７からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記ＰＢ１セグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号１０および１８からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記ＰＢ２セグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号１１および１９からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記Ｍセグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号１３および２１からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記ＮＰセグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号１２および２０からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。上記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、上記ＮＳセグメントである場合、上記バックボーンウイルスセグメントは、配列番号１４および２２からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有する配列を有し得る。

【0016】

上記リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、少なくとも２種のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む実施形態において、少なくとも１種のバックボーンセグメントは、前の段落において考察されるように、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択されるドナー株に由来し得る。好ましいリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、上記１０５ｐ３０ドナー株に由来する１種、２種、３種もしくは４種のウイルスセグメントを含み、ここで上記ＰＡセグメントは、配列番号１７と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得、上記ＮＰセグメントは、配列番号２０と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得、上記Ｍセグメントは、配列番号２１と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得、そして／または上記ＮＳセグメントは、配列番号２２と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。いくつかの実施形態において、このようなインフルエンザＡ型ウイルスはまた、上記ＰＲ８−Ｘドナー株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含み得る。上記少なくとも１種のウイルスセグメントが、上記ＰＡセグメントである場合、上記ウイルスセグメントは、配列番号９と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記少なくとも１種のウイルスセグメントが、上記ＮＰセグメントである場合、上記ウイルスセグメントは、配列番号１２と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記少なくとも１種のウイルスセグメントが、上記Ｍセグメントである場合、上記ウイルスセグメントは、配列番号１３と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。上記少なくとも１種のウイルスセグメントが、上記ＮＳセグメントである場合、上記ウイルスセグメントは、配列番号９と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有し得る。本発明者らは、このようなバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、細胞培養物中において良好に増殖することを示した。一般に、リアソータントインフルエンザウイルスは、各バックボーンセグメントのうちの１種のみを含む。例えば、上記インフルエンザウイルスが、１０５ｐ３０に由来するＰＡセグメントを含む場合、上記ウイルスは、同時にＰＲ８−ＸのＰＡセグメントを含まない。

【0017】

好ましい実施形態において、上記ウイルスは、（ａ）配列番号１９のＰＢ２セグメント、配列番号１８のＰＢ１セグメントおよび配列番号２２のＮＳセグメント；または（ｂ）配列番号１９のＰＢ２セグメント、配列番号１８のＰＢ１セグメントおよび配列番号２１のＭセグメント；または（ｃ）配列番号１９のＰＢ２セグメント、配列番号１８のＰＢ１セグメントおよび配列番号２０のＮＰセグメント；または（ｄ）配列番号１９のＰＢ２セグメント、配列番号１８のＰＢ１セグメントおよび配列番号１７のＰＡセグメント、の配列と、少なくとも９５％の同一性もしくは１００％の同一性を有するウイルスセグメントを含む。これら実施形態は好ましい。なぜなら、本発明者らは、このようなリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスは、細胞培養物において特に良好に増殖することを見いだしたからである。

【0018】

本発明は、本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製するための方法を提供する。これら方法は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされる上記ウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を培養宿主に導入する工程であって、ここで上記バックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来する、工程；および（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）において得られウイルスを精製する工程、を包含する。

【0019】

上記方法は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を、培養宿主に導入する工程であって、ここで上記バックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来し、上記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来する、工程；および（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含し得る。

【0020】

また、本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製するための方法が提供され、上記方法は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を、培養宿主に導入する工程であって、ここでバックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来し、ＨＡセグメントおよびＰＢ１セグメントは、同じインフルエンザＨＡサブタイプを有する異なるインフルエンザ株に由来する、工程；および（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

【0021】

本発明はまた、本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製するための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を、培養宿主に導入する工程であって、ここで１種以上のバックボーンウイルスセグメントは、１０５ｐ３０および／もしくはＰＲ８−Ｘインフルエンザ株に由来し、少なくとも１種のウイルスセグメントは、第２のインフルエンザ株に由来する、工程；および（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、上記培養宿主を培養する工程、ならびに必要に応じて、（ｉｉｉ）上記工程（ｉｉ）において得られたウイルスを精製する工程、を包含する。

【0022】

上記方法は、以下の工程をさらに包含し得る：（ｉｖ）培養宿主を、工程（ｉｉ）もしくは工程（ｉｉｉ）において得られたウイルスに感染させる工程；（ｖ）上記工程（ｉｖ）からの培養宿主を培養して、さらなるウイルスを生成する工程；ならびに必要に応じて、（ｖｉ）工程（ｖ）において得られたウイルスを精製する工程。

【0023】

本発明はまた、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主を、本発明のリアソータントウイルスに感染させる工程；（ｂ）上記工程（ａ）からの宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；ならびに必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程を包含する。

【0024】

本発明はまた、ワクチンを調製するための方法を提供し、（ｄ）上記の実施形態のうちのいずれか１つの方法によって、ウイルスを調製する工程、および（ｅ）上記ウイルスからワクチンを調製する工程を包含する。

【0025】

さらなる実施形態において、本発明は、インフルエンザ株ＰＲ８−Ｘおよび１０５ｐ３０を提供する。

【0026】

本発明はまた、上記Ｍゲノムセグメントが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３３に整列される場合、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置においてリジンを有する改変体Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株を包含する。本発明に従う上記改変体Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３５に整列される場合、配列番号３５のアミノ酸２２５に対応する位置においてグリシンを、および／または配列番号３５に整列される場合、配列番号３５のアミノ酸２３１に対応する位置においてアスパラギンを有するＨＡセグメントをさらに有し得る。上記改変体Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株はまた、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３１に整列される場合、配列番号３１のアミノ酸７０に対応する位置においてヒスチジンを有するＮＡセグメントを有し得る。

【0027】

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメーター（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリクスを使用して、ギャップ開始ペナルティー＝１０．０、およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５）を使用する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ全体アラインメントアルゴリズム［４］である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のｎｅｅｄｌｅツールにおいて便宜上実行される［５］。

【0028】

本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現システムを提供し、ここで上記発現構築物は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンウイルスセグメントをコードする。上記発現構築物は、同じドナー株に由来するＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントをコードし得る。

【0029】

本発明はまた、１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株のセグメントをコードするｖＲＮＡを含む１種以上の発現構築物を含む発現システムを提供し、上記発現構築物は、１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含む。上記発現構築物は、ＰＲ８−Ｘに由来するＰＢ２セグメント、ＮＰセグメント、ＮＳセグメント、ＭセグメントおよびＰＡセグメントをコードするｖＲＮＡをさらに含み得る。

【0030】

本発明はまた、本発明の発現システムを含む宿主細胞を提供する。これら宿主細胞は、上記発現システムにおいて発現構築物からインフルエンザＡ型ウイルスを発現し得る。

【0031】

本発明の発現システムにおいて使用され得る発現構築物はまた、提供される。例えば、本発明は、同じ構築物上に、本発明に従うリアソータントインフルエンザ株のバックボーンセグメントをコードする発現構築物を提供する。

【0032】

（ドナー株）
インフルエンザドナー株は、ときおり、上記ウイルスのＨＡセグメントもしくはＮＡセグメント（しかし両方ではない）をも提供し得るとしても、リアソータントインフルエンザウイルスにおいて上記バックボーンセグメントを代表的には提供する株である。通常、しかし、リアソータントインフルエンザウイルスにおける上記ＨＡセグメントおよび上記ＮＡセグメントはともに、上記ワクチン株に由来する。

【0033】

本発明者らは、驚くべきことに、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスが、同じドナー株に由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、細胞培養物においてより高い力価まで増殖し得ることを発見した。本発明者らは、この効果は、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントの存在に起因し、特定の変異を有するウイルスセグメントの存在を要しないことを示した。しかし、特に良好な結果は、上記Ｍゲノムセグメントが、配列番号３３に整列される場合に、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置においてリジンを有するインフルエンザＡ型株で達成される。

【0034】

同じインフルエンザ株（例えば、１０５ｐ３０）に由来する上記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスはまた、上記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントが異なるウイルスに由来するインフルエンザウイルスと比較して、より良好なレスキュー効率を示したので、有利である。上記１０５ｐ３０のＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントは、それぞれ、配列番号１８および配列番号１９の配列を有する。

【0035】

本発明者らはまた、いくつかのインフルエンザウイルス株が、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４と比較して、同じ時間においてかつ同一増殖条件下で、ＭＤＣＫ細胞においてより高いウイルス力価まで増殖し得ることを示した。

【0036】

本発明のドナー株もしくは他の公知のドナー株（例えば、Ａ／ＰＲ／８／３４（ｗｔ ＰＲ８））に由来するインフルエンザドナー株の改変体もまた、ドナー株として有用であり得る。これらドナー株は、上記ドナー株が由来するドナー株と比較して、より高いウイルス力価へと（同じ時間でかつ同じ増殖条件下で）増殖し得る。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザ株を細胞培養物中で数回継代することで、上記元のＡ／ＰＲ８／３４株と比較して、遙かにより高いウイルス力価まで増殖するウイルス株（ＰＲ８−Ｘ）が生じることを発見した。同様に、本発明者らは、上記Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９株を細胞培養物中で数回継代することで、継代されていないＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９株と比較して、同じ時間でかつ同じ増殖条件下でさらにより高いウイルス力価まで増殖し得る株（１０５ｐ３０）が生じることを見いだした。本発明のドナー株改変体は、代表的には、同じ増殖条件下でかつ同じ時間にわたって（例えば、１２時間、２４時間、４８時間もしくは７２時間）、上記改変体が由来したドナー株で得られたウイルス力価と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％もしくは少なくとも１０００％高いウイルス力価を達成する。

【0037】

上記ＰＲ８−Ｘのセグメントは、配列番号１１（ＰＢ２）、配列番号１０（ＰＢ１）、配列番号９（ＰＡ）、配列番号１２（ＮＰ）、配列番号１３（Ｍ）、配列番号１４（ＮＳ）、配列番号１５（ＨＡ）もしくは配列番号１６（ＮＡ）の配列を有する。

【0038】

上記１０５ｐ３０のセグメントは、配列番号１９（ＰＢ２）、配列番号１８（ＰＢ１）、配列番号１７（ＰＡ）、配列番号２０（ＮＰ）、配列番号２１（Ｍ）、配列番号２２（ＮＳ）、配列番号２３（ＨＡ）もしくは配列番号２４（ＮＡ）の配列を有する。

【0039】

上記１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株のセグメントのうちの１種、２種、３種、４種、５種、６種もしくは７種を含むインフルエンザ株はまた、ドナー株として使用され得る。

【0040】

本発明は、配列番号１１〜１４もしくは配列番号１８〜２２の配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するウイルスセグメントを有するドナー株で実施され得る。例えば、遺伝コードの縮重に起因して、異なる配列を有するいくつかの核酸によってコードされる同じポリペプチドを有する可能性がある。従って、本発明は、配列番号１１〜１４もしくは配列番号１８〜２２の配列と同じポリペプチドをコードするウイルスセグメントで実施され得る。例えば、配列番号３および配列番号２８の核酸配列は、これらが同じウイルスタンパク質をコードするとしても、７３％の同一性を有するに過ぎない。

【0041】

本発明はまた、配列番号１１〜１４もしくは配列番号１８〜２２によってコードされるポリペプチド配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするウイルスセグメントで実施され得る。

【0042】

上記ＤＮＡ配列および上記アミノ酸配列におけるバリエーションはまた、上記ウイルスの継代の間に起こり得る偶発突然変異から生じ得る。このような改変体インフルエンザ株はまた、本発明において使用され得る。

【0043】

（リアソータントウイルス）
本発明は、２種以上のインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。上記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来し得る。

【0044】

本発明はまた、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４と比較して、同じ時間でかつ同じ増殖条件下でＭＤＣＫ細胞においてより高いウイルス力価まで増殖し得るインフルエンザウイルス株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。

【0045】

本発明は、本発明のドナー株（例えば、ＰＲ８−Ｘもしくは１０５ｐ３０株）に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを提供する。本発明のリアソータントインフルエンザウイルスは、２種、３種もしくはこれより多くの異なるインフルエンザ株との間のリアソータントであり得るが、ただし、少なくとも１種のウイルスセグメントは、本発明のドナー株に由来する。

【0046】

インフルエンザウイルスは、セグメント化されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスは、８種のセグメント（ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１、ＨＡおよびＮＡ）を有するのに対して、インフルエンザＣ型ウイルスは、７種を有する。本発明のリアソータントウイルスは、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメント、もしくは本発明のドナー株に由来する少なくとも１種（すなわち、１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種）のバックボーンウイルスセグメントを含む。上記バックボーンウイルスセグメントは、ＨＡもしくはＮＡをコードしないものである。従って、バックボーンセグメントは、代表的には、上記インフルエンザウイルスのうちの上記ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ_１、Ｍ_２、ＮＳ_１およびＮＳ_２ポリペプチドをコードする。上記リアソータントウイルスは、本発明のドナー株に由来するＨＡもしくはＮＡのいずれか（ただし両方ではない）を含むリアソータントウイルスもまた想定されるとしても、代表的には、上記ドナー株に由来するＨＡおよびＮＡをコードするセグメントを含まない。

【0047】

本発明のリアソータントウイルスが、単一のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントである場合、上記リアソータントウイルスは、一般に、１：７、２：６、３：５、４：４、５：３、６：２もしくは７：１の比において上記ドナー株および上記ワクチン株に由来するセグメントを含む。上記ドナー株に由来するセグメントが大多数（特に、６：２の比）であるのが、代表的である。上記リアソータントウイルスが、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む場合、上記リアソータントウイルスは、一般には、第１のドナー株、第２のドナー株および上記ワクチン株に由来するセグメントを、１：１：６、１：２：５、１：３：４、１：４：３、１：５：２、１：６：１、２：１：５、２：２：４、２：３：３、２：４：２、２：５：１、３：１：２、３：２：１、４：１：３、４：２：２、４：３：１、５：１：２、５：２：１もしくは６：１：１の比において含む。

【0048】

好ましくは、上記リアソータントウイルスは、上記ドナー株のＨＡセグメントを含まない。なぜなら、これは、上記インフルエンザウイルスの主要ワクチン抗原をコードし、したがって上記ワクチン株に由来するはずだからである。従って、本発明のリアソータントウイルスは、好ましくは、上記ワクチン株に由来する、少なくとも上記ＨＡセグメントを有し、代表的には、上記ワクチン株に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを有する。

【0049】

本発明はまた、１種より多くの（例えば、２種もしくは３種の）異なるドナー株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントウイルスを包含し、ここで少なくとも１種のウイルスセグメント（好ましくは、ＨＡではない）は、上記ＰＲ８−Ｘもしくは１０５ｐ３０インフルエンザ株に由来する。このようなリアソータントインフルエンザウイルスは、代表的には、ワクチン株に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含む。上記リアソータントは、１種より多くのインフルエンザドナー株に由来するウイルスセグメントを含む場合、上記さらなるドナー株は、本発明のドナー株を含む任意のドナー株であり得る。例えば、上記ウイルスセグメントのうちのいくつかは、上記Ａ／ＰＲ／８／３４もしくはＡＡ／６／６０（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０）インフルエンザ株に由来し得る。上記ＡＡ／６／６０株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントは、例えば、上記リアソータントウイルスが、生の弱毒化インフルエンザワクチンにおいて使用される予定である場合に、有利であり得る。

【0050】

本発明はまた、１種より多くのワクチン株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントを包含するが、ただし上記リアソータントは、本発明に従うバックボーンを含む。例えば、上記リアソータントインフルエンザウイルスは、１つのドナー株に由来するＨＡセグメントおよび異なるドナー株に由来するＮＡセグメントを含み得る。

【0051】

本発明のリアソータントウイルスは、同じ時間（例えば、１２時間、２４時間、４８時間もしくは７２時間）でかつ同じ増殖条件下で、上記野生型ワクチン株（これから、上記リアソータントウイルスのウイルスセグメントのうちのいくつかが得られる）よりも高いウイルス力価まで増殖し得る。このウイルス力価は、当業者に公知の標準的方法によって決定され得る。本発明のリアソータントウイルスは、同じ時間枠でかつ同じ条件下で上記野生型ワクチン株のウイルス力価より少なくとも１０％高いか、少なくとも２０％高いか、少なくとも５０％高いか、少なくとも１００％高いか、少なくとも２００％高いか、少なくとも５００％高いか、もしくは少なくとも１０００％高いウイルス力価を達成し得る。

【0052】

本発明は、汎流行性インフルエンザワクチン株および汎流行間期の（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ）（季節性）インフルエンザワクチン株を再集合させるために適している。上記リアソータントインフルエンザ株は、上記インフルエンザＡ型ウイルスＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６を含み得る。それらは、上記インフルエンザＡ型ウイルスＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９を含み得る。本発明のリアソータントインフルエンザウイルスにおいて使用される上記ワクチン株が、季節性インフルエンザ株である場合、上記ワクチン株は、Ｈ１もしくはＨ３サブタイプを有し得る。本発明の一局面において、上記ワクチン株は、Ｈ１Ｎ１株もしくはＨ３Ｎ２株である。

【0053】

本発明における使用のための上記ワクチン株はまた、汎流行性株もしくは潜在的に汎流行性の株であり得る。汎流行性アウトブレイクを引き起こす能力を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、現在広まっているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含み（すなわち、十年より長きにわたってヒト集団において明らかにならなかったもの（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団においてこれまで全く見いだされなかったもの（例えば、トリ集団においてのみ一般に見いだされた、Ｈ５、Ｈ６もしくはＨ９））、その結果、ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンに対して免疫学的にナイーブである；（ｂ）ヒト集団において水平伝播し得る；および（ｃ）ヒトに対して病原性である。Ｈ５ヘマグルチニンタイプを有するワクチン株は、上記リアソータントウイルスが、汎流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対して免疫化するためのワクチンにおいて使用される場合に好ましい。他の考えられる株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の新興の潜在的に汎流行性の株が挙げられる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと拡がり得るかもしくは拡がった潜在的汎流行性ウイルス株（例えば、ブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株）に対して防御するためのワクチンにおいて使用するためのリアソータントウイルスを生成するために特に適している。

【0054】

本発明のリアソータントインフルエンザ株は、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／４／０９株に由来するＨＡセグメントおよび／もしくはＮＡセグメントを含み得る。従って、例えば、上記ＨＡ遺伝子セグメントは、配列番号２５よりも配列番号３２に対して密接に関連するＨ１ヘマグルチニンをコードし得る（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して、配列番号２５ではなく、配列番号３２と比較する場合、より高い程度の配列同一性を有する）。配列番号３２および配列番号２５は、８０％同一である。同様に、上記ＮＡ遺伝子は、配列番号２６に対してより密接に配列番号２７に関連するＮ１ノイラミニダーゼをコードし得る。配列番号２７および２６は、８２％同一である。

【0055】

ワクチン株として使用され得るとして株は、抵抗性汎流行性株［７］を含む、抗ウイルス治療に対して抵抗性の（例えば、オセルタミビル［６］および／もしくはザナミビルに抵抗性の）株が挙げられる。

【0056】

本発明の方法における使用のためのドナー株の選択は、再集合されるべき上記ワクチン株に依存し得る。進化的に異なる株間のリアソータントは、細胞培養物において良好に複製しない可能性があるので、上記ドナー株および上記ワクチン株が、同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有することが考えられる。しかし、他の実施形態において、上記ワクチン株および上記ドナー株は、異なるＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有し得、この構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、上記ワクチン株に由来するＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含むリアソータントウイルスの選択を容易にし得る。従って、上記１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘ株は、上記Ｈ１インフルエンザサブタイプを含むが、これらドナー株は、上記Ｈ１インフルエンザサブタイプを含まないワクチン株のために使用され得る。

【0057】

上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントが別のサブタイプへと変化させられた本発明のドナー株のリアソータントもまた、使用され得る。上記１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株のＨ１インフルエンザサブタイプは、例えば、Ｈ３もしくはＨ５サブタイプへと変化させられ得る。

【0058】

従って、本発明は、本発明の１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する１種、２種、３種、４種、５種、６種もしくは７種のウイルスセグメントおよび上記Ｈ１サブタイプではないＨＡセグメントを含むインフルエンザＡ型ウイルスを包含する。上記リアソータントドナー株は、上記Ｎ１サブタイプではないＮＡセグメントをさらに含み得る。上記ドナー株をリアソートするために適した技術は、当業者に明らかである。

【0059】

本発明はまた、本発明の１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種もしくは少なくとも７種のウイルスセグメント、および異なるインフルエンザ株に由来するＨ１ ＨＡセグメントを含むリアソータントドナー株を包含する。

【0060】

機能的ＮＳタンパク質をコードしないＮＳセグメントを含むリアソータントウイルスはまた、本発明の範囲内である。ＮＳ１ノックアウト変異体は、参考文献８において記載される。これらＮＳ１変異体ウイルス株は、生の弱毒化インフルエンザワクチンを調製するために特に適している。

【0061】

本発明の方法において使用される上記「第２のインフルエンザ株」は、上記使用されるドナー株とは異なる。

【0062】

（逆遺伝学）
本発明は、逆遺伝学技術を介してリアソータントインフルエンザウイルス株を生成するために特に適している。これら技術において、上記ウイルスは、発現システムを使用して、培養宿主において生成される。

【0063】

一局面において、上記発現システムは、同じドナー株に由来するＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントをコードし得る。本発明のこの局面において、上記システムは、別のインフルエンザドナー株に由来するセグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳおよび／もしくはＰＡのうちの少なくとも１種（すなわち、１種、２種、３種もしくは４種）をコードし得る。

【0064】

別の局面において、上記システムは、上記ＰＲ８−Ｘ株に由来する１種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種）ゲノムセグメントをコードし得るが、通常、これ／これらは、上記ＰＲ８−Ｘ ＨＡセグメントを含まず、通常、上記ＰＲ８−Ｘ ＮＡセグメントを含まない。従って、上記システムは、ＰＲ８−Ｘに由来するセグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／もしくはＰＢ２のうちの少なくとも１種（おそらく６種全て）をコードし得る。

【0065】

上記システムは、上記１０５ｐ３０株に由来する１種以上（例えば、１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種）のゲノムセグメントをコードし得るが、通常、これ／これらは、上記１０５ｐ３０ ＨＡセグメントを含まず、通常、上記１０５ｐ３０ ＮＡセグメントを含まない。従って、上記システムは、１０５ｐ３０に由来するセグメントＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／もしくはＰＢ２のうちの少なくとも１種（おそらく６種全て）をコードし得る。

【0066】

インフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスについての逆遺伝学は、複製および転写を開始するために必要とされる４種のタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよび核タンパク質）および８種全てのウイルスゲノムセグメントを発現するために１２種のプラスミドで実施され得る。しかし、構築物の数を減らすために、複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（ウイルスＲＮＡ合成に関して）は、単一プラスミド上に（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種もしくは８種全てのインフルエンザｖＲＮＡセグメントをコードする配列）に含まれ得、そして複数のタンパク質コード領域とＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種もしくは８種のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）とは、別のプラスミド上に含まれ得る［９］。同じプラスミド上で、ｐｏｌ Ｉプロモーターの制御下に１種以上のインフルエンザｖＲＮＡセグメントを、および別のプロモーター（特に、ｐｏｌ ＩＩプロモーター）の制御下に１種以上のインフルエンザタンパク質コード領域を含めることもまた可能である。これは、好ましくは、２方向性プラスミドを使用することによって行われる。

【0067】

参考文献９の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一の発現構築物上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一の発現構築物上の８種全てのｖＲＮＡコードセグメント。ある発現構築物上に上記ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびヘマグルチニン（ＨＡ）セグメントを、および別の発現構築物上に上記６種の他のウイルスセグメントを含めることは、新たに現れてくるインフルエンザウイルス株が、通常は、上記ＮＡおよび／もしくはＨＡセグメントにおいて変異を有するので特に好ましい。従って、別個の発現構築物上に上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを有するという利点は、置換される必要があるのは上記ＨＡ配列およびＮＡ配列を含むベクターだけでいいということである。従って、本発明の一局面において、上記ワクチン株の上記ＮＡおよび／もしくはＨＡセグメントは、ある発現構築物上に含められ得、本発明のドナー株に由来するセグメント（上記ＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを除く）をコードするｖＲＮＡは、異なる発現構築物上に含まれる。従って、本発明は、本発明のドナー株のバックボーンウイルスセグメントをコードする１種、２種、３種、４種、５種もしくは６種のｖＲＮＡを含む発現構築物を提供する。上記発現構築物は、機能的ＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を生成するＨＡおよび／もしくはＮＡウイルスセグメントを含まなくてもよい。

【0068】

公知の逆遺伝学システムは、ｐｏｌ Ｉプロモーター、細菌性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどから所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子を発現する工程を包含する。インフルエンザウイルスは、生活環を完了するためにウイルスプロモーターの存在を必要とするので、システムはまた、これらタンパク質を提供し得る。例えば、上記システムは、ウイルスポリメラーゼタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含み、その結果、ＤＮＡの両方のタイプの発現は、完全な感染性ウイルスの組み立てをもたらす。タンパク質として上記ウイルスポリメラーゼを供給することもまた可能である。

【0069】

逆遺伝学がインフルエンザｖＲＮＡの発現のために使用される場合、互いに関して配列エレメントの正確なスペーシングは、上記ポリメラーゼが複製を開始するために重要であることが当業者に明らかである。従って、上記ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、上記ｐｏｌ Ｉプロモーターと終止配列との間で正確に配置されることが重要であるが、この配置は、逆遺伝学システムを扱う者の能力の十分に範囲内である。

【0070】

組換えウイルスを生成するために、細胞は、ビリオンを組み立てるために必要なウイルスゲノムの全てのセグメントを発現しなければならない。本発明の発現構築物へとクローニングされるＤＮＡは、好ましくは、上記ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全てを提供するが、ヘルパー・ウイルスを使用して、上記ＲＮＡおよびタンパク質のうちのいくつかを提供することもまた可能であるが、ヘルパー・ウイルスを使用しないシステムが好ましい。上記インフルエンザウイルスは、セグメント化ウイルスであるので、上記ウイルスゲノムは、通常、本発明の方法において１種より多い発現構築物を使用して発現される。しかし、単一の発現構築物上で上記ウイルスゲノムの１種以上のセグメントもしくはさらには全てのセグメントを組み合わせることもまた、想定される。

【0071】

いくつかの実施形態において、上記宿主細胞において補助的タンパク質（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現をもたらす発現構築物もまた、含まれる。例えば、逆遺伝学システムの一部として、非ウイルスセリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を発現することは、有利であり得る。

【0072】

（発現構築物）
本発明の発現システムにおいて使用される発現構築物は、一方向性もしくは二方向性の発現構築物であり得る。１種より多くの導入遺伝子は、上記方法において使用される場合（同じ発現構築物上かもしくは異なる発現構築物上に関わらず）、一方向性および／もしくは二方向性の発現を使用することもまた可能である。

【0073】

インフルエンザウイルスは、感染性のためのタンパク質を必要とするので、二方向性発現構築物を使用することは、一般に好ましい。なぜなら、これは、上記宿主細胞によって必要とされる発現構築物の総数を減らすからである。従って、本発明の方法は、少なくとも１種の二方向性発現構築物を利用し得、ここで遺伝子もしくはｃＤＮＡは、上流のｐｏｌ ＩＩプロモーターと下流の非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターとの間に位置する。上記ｐｏｌ ＩＩプロモーターからの上記遺伝子もしくはｃＤＮＡの転写は、タンパク質へと翻訳され得る、キャップされたプラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ウイルスｍＲＮＡを生成する一方で、上記非内因性ｐｏｌ Ｉプロモーターからの転写は、マイナス鎖（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）ｖＲＮＡを生成する。上記二方向性発現構築物は、二方向性発現ベクターであり得る。

【0074】

二方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち、５’→３’および３’→５’の両方）において発現を駆動する少なくとも２種のプロモーターを含む。上記２種のプロモーターは、同じ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖へと作動可能に連結され得る。好ましくは、上記プロモーターのうちの一方は、ｐｏｌ Ｉプロモーターであり、他方のプロモーターのうちの少なくとも一方は、ｐｏｌ ＩＩプロモーターである。これは、有用である。なぜなら、上記ｐｏｌ Ｉプロモーターが、キャップされていないｖＲＮＡを発現するために使用される一方で、上記ｐｏｌ ＩＩプロモーターが、その後、タンパク質へと翻訳され得るｍＲＮＡを転写するために使用され得、従って、同じ構築物からＲＮＡおよびタンパク質の同時発現を可能にするからである。１種より多くの発現構築物が、発現システム内で使用される場合、上記プロモーターは、内因性および非内因性のプロモーターの混合物であり得る。

【0075】

上記発現構築物において使用される上記ｐｏｌ Ｉおよびｐｏｌ ＩＩプロモーターは、上記宿主細胞が由来する同じ分類学上の目の生物に対して内因性であり得る。あるいは、上記プロモーターは、上記宿主細胞とは異なる分類学上の目の生物に由来し得る。用語「目」とは、従来の分類学上の順位に言及し、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目などである。ヒトおよびチンパンジーは、同じ分類学上の目（霊長目）にあるが、ヒトおよびイヌは、異なる目にある（霊長目 対 食肉目）。例えば、上記ヒトｐｏｌ Ｉプロモーターは、イヌ細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）においてウイルスセグメントを発現するために使用され得る。

【0076】

上記発現構築物は、代表的には、ＲＮＡ転写終止配列を含む。上記終止配列は、内因性終止配列もしくは上記宿主細胞に対して内因性ではない終止配列であり得る。適切な終止配列は、当業者に明らかであり、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終止配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終止配列、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記発現構築物は、特に、ｐｏｌ ＩＩプロモーターによって発現が制御される遺伝子の末端においてｍＲＮＡについての１種以上のポリアデニル化シグナルを含む。

【0077】

発現システムは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種もしくは少なくとも１２種の発現構築物を含み得る。

【0078】

発現構築物は、ベクター（例えば、プラスミドもしくは他のエピソーム構築物）であり得る。このようなベクターは、代表的には、少なくとも１種の細菌および／もしくは真核生物の複製起点を含む。さらに、上記ベクターは、原核生物細胞および／もしくは真核生物細胞における選択を可能にする選択マーカーを含み得る。このような選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、アンピシリンもしくはカナマイシン）に対する耐性を付与する遺伝子である。上記ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを促進するために。１つ以上のマルチクローニング部位をさらに含み得る。

【0079】

代替として、発現構築物は、線状の発現構築物であり得る。このような線状の発現構築物は、代表的には、任意の増幅および／もしくは選択配列を含まない。しかし、このような増幅および／もしくは選択配列を含む線状構築物はまた、本発明の範囲内である。参考文献１０は、線状発現構築物を記載しており、各ウイルスセグメントに対する個々の線状発現構築物を記載する。同じ線状発現構築物上に１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種もしくは６種）のウイルスセグメントを含めることもまた、考えられる。このようなシステムは、例えば、参考文献１１において記載されてきた。

【0080】

発現構築物は、当該分野で公知の方法を使用して、生成され得る。このような方法は、例えば、参考文献１２において記載される。上記発現構築物が線状発現構築物である場合、単一の制限酵素部位を利用して、上記宿主細胞へ導入する前に、上記発現構築物を線状にすることもまた、考えられる。あるいは、少なくとも２つの制限酵素部位を使用して、上記発現構築物をベクターから切り出すことが考えられる。さらに、線状発現構築物を、核酸増幅技術を使用して（例えば、ＰＣＲによって）増殖させることによって、上記線状発現構築物を得ることもまた、考えられる。

【0081】

本発明のシステムにおいて使用される発現構築物は、非細菌性発現構築物であり得る。このことは、上記構築物は、そこでコードされるウイルスＲＮＡセグメントの真核生物細胞における発現を駆動し得るが、細菌における上記構築物の増殖に必要とされる成分を含まないことを意味する。従って、上記構築物は、細菌性の複製起点（ｏｒｉ）を含まず、通常は、細菌性選択マーカー（例えば、抗生物質耐性マーカー）を含まない。このような発現構築物は、参考文献１３（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。

【0082】

上記発現構築物は、化学合成によって調製され得る。上記発現構築物は、完全に化学合成によってもしくは部分的に調製され得る。化学合成によって発現構築物を調製するために適した方法は、例えば、参考文献１３（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。

【0083】

本発明の発現構築物は、当業者に公知の任意の技術を使用して、宿主細胞へと導入され得る。例えば、本発明の発現構築物は、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈澱、リポソーム、マイクロインジェクション、もしくは微粒子ボンバードメント（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用することによって、宿主細胞へと導入され得る。

【0084】

（細胞）
本発明における使用のための培養宿主は、上記目的のウイルスを生成し得る任意の真核生物細胞であり得る。本発明は、代表的には、細胞株を使用するが、例えば、初代細胞が代替として使用されてもよい。上記細胞は、代表的には、哺乳動物細胞である。適切な哺乳動物細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルを含む）およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞タイプが使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎臓細胞［１４〜１６］）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫ細胞株およびＭＤＣＫ細胞株におけるような腎臓細胞である。

【0085】

さらに適切な細胞としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ ５；ＰＥＲ．Ｃ６［１７］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８；など。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ （ＡＴＣＣ） コレクション［１８］から、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１９］から、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から、広く入手可能である。例えば、上記ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で種々の異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ ３４の下でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。

【0086】

本発明における使用に好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２０〜２２］である。元のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ ３４としてＡＴＣＣから入手可能である。ＭＤＣＫ細胞の派生物が使用されることは好ましい。このような派生物は、例えば、参考文献２０（これは、懸濁培養物における増殖に適合されたＭＤＣＫ細胞（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」もしくは「３３０１６−ＰＦ」；参考文献２０もまた参照のこと）を開示する）に記載された。さらに、参考文献２３は、無血清培地中での懸濁物で増殖するＭＤＣＫ由来の細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。いくつかの実施形態において、上記使用されるＭＤＣＫ細胞株は、腫瘍形成性であり得る。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することもまた、想定される。例えば、参考文献２４は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献２５は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）が挙げられる）を開示する。

【0087】

１種より多くの細胞タイプの混合物を使用して、本発明の方法を実施することが考えられる。しかし、本発明の方法が、単一の細胞タイプで（例えば、モノクローナル細胞で）実施されることは、好ましい。好ましくは、本発明の方法において使用される細胞は、単一の細胞株に由来する。さらに、同じ細胞株は、上記ウイルスをリアソートするために、および上記ウイルスの任意のその後の増殖のために使用され得る。

【0088】

好ましくは、上記細胞は、一般的な汚染源を回避するために、血清の非存在下で培養される。真核生物細胞を培養するための種々の無血清培地が、当業者に公知である（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地、ｕｌｔｒａ ＣＨＯ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地が使用され得る（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さもなければ、複製用の細胞もまた、慣例的な血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％のウシ胎仔血清を含むＭＥＭもしくはＤＭＥＭ培地）中で培養され得る。

【0089】

上記細胞は、接着性培養物もしくは懸濁物中にあり得る。

【0090】

（従来の再集合）
伝統的には、インフルエンザウイルスは、培養宿主（通常は、卵）にドナー株およびワクチン株を共感染させることによって、再集合される。リアソータントウイルスは、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質を含むリアソータントウイルスを選択するために、上記ドナー株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質に対する特異性を有する抗体を添加することによって、選択される。この処理を数継代経ると、上記ワクチン株のＨＡおよび／もしくはＮＡセグメントを含む、迅速に増殖するリアソータントウイルスを選択し得る。

【0091】

本発明は、これら方法における使用に適している。上記ドナー株と比較して、異なるＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するワクチン株を使用することは、より容易であり得る。なぜなら、これは、リアソータントウイルスに対する選択を促進するからである。しかし、上記ドナー株と同じＨＡおよび／もしくはＮＡサブタイプを有するワクチン株を使用することも考えられ、本発明のいくつかの局面においては、このことは好ましい。この場合、上記ドナー株のＨＡおよび／もしくはＮＡタンパク質に対して優先的な特異性を有する抗体が利用可能なはずである。

【0092】

（ウイルス調製）
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスを生成するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）培養宿主を、本発明のリアソータントウイルスに感染させる工程；（ｂ）工程（ａ）からの宿主を培養して、上記ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）上記工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程を包含する。

【0093】

上記培養宿主は、細胞もしくは孵化鶏卵であり得る。本発明のこの局面において、細胞が培養宿主として使用される場合、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が、使用される上記細胞株および上記ウイルスに応じて広い範囲にわたって変動し、適用要件に適合させられ得ることは、公知である。従って、以下の情報は、ガイドラインを表すに過ぎない。

【0094】

上記で言及されるように、細胞は、好ましくは、無血清培地もしくは無タンパク質培地中で培養される。

【0095】

上記細胞の増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）は、当業者に公知の方法に従って行われ得る。例えば、上記細胞は、遠心分離もしくは濾過のような通常の支援方法を使用して、灌流システムにおいて培養され得る。さらに、上記細胞は、感染の前に流加培養システムにおいて、本発明に従って増殖させられ得る。本発明の状況において、培養システムは、上記細胞が最初にバッチシステムにおいて培養され、上記培地中の栄養素（もしくは上記栄養そのうちの一部）の枯渇が、濃縮された栄養素の制御された供給によって補償される流加培養システムに言及する。感染の前の細胞の増殖の間に、上記培地のｐＨ値をｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の間の値に、特に、ｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の間の値に調節することは、有利であり得る。細胞の培養は、好ましくは、３０〜４０℃の間の温度で起こる。上記感染した細胞を培養する場合（工程ｉｉ）、上記細胞は、好ましくは、３０℃〜３６℃の間、もしくは３２℃〜３４℃の間の温度、もしくは３３℃において、培養される。このことは、この温度範囲における感染細胞のインキュベーションが、ワクチンへと処方される場合に、改善した効力を生じるウイルスの生成を生じることが示されたので、特に好ましい［２６］。

【0096】

酸素分圧は、感染前に培養する間に、好ましくは、２５％〜９５％の間の値に、特に、３５％〜６０％の間の値に調節される。本発明の状況において述べられる上記酸素分圧の値は、空気の飽和に基づく。細胞の感染は、上記バッチシステムにおいて好ましくは、約８〜２５×１０^５細胞／ｍＬ、もしくは上記灌流システムにおいて好ましくは、約５〜２０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度において起こる。上記細胞は、１０^−８〜１０の間、好ましくは、０．０００１〜０．５の間のウイルス用量（ＭＯＩ値，「感染多重度」；感染時の１細胞あたりのウイルス単位数に対応する）で感染させられ得る。

【0097】

ウイルスは、接着性培養物もしくは懸濁物において、細胞で増殖させられ得る。マイクロキャリア培養が、使用され得る。いくつかの実施形態において、上記細胞は、従って、懸濁物中での増殖に適合させられ得る。

【0098】

本発明に従う方法はまた、ウイルスもしくはそれらによって生成されるタンパク質の採取および単離を包含する。ウイルスもしくはタンパク質の単離の間に、上記細胞は、分離、濾過、もしくは限外濾過のような標準的方法によって、上記培養培地から分離される。次いで、上記ウイルスもしくは上記タンパク質は、勾配遠心分離、濾過、沈澱、クロマトグラフィーなどのような当業者に十分公知の方法に従って濃縮され、次いで、精製される。上記ウイルスが、精製の間もしくは精製後に不活性化されることもまた、本発明によれば好ましい。ウイルス不活性化は、上記精製プロセス内の任意の時点で、例えば、β−プロピオラクトンもしくはホルムアルデヒドによって起こり得る。

【0099】

上記培養宿主は、卵であり得る。ワクチン用のインフルエンザウイルス増殖のための現在標準的な方法は、孵化ＳＰＦ鶏卵を使用し、ウイルスは、上記卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。卵を介してウイルスを継代し、その後、細胞培養物中で上記ウイルスを増殖させることもまた可能であり、逆もまた然りである。

【0100】

（ワクチン）
本発明は、上記方法に従って生成されるウイルスを利用して、ワクチンを生成する。

【0101】

ワクチン（特に、インフルエンザウイルスのための）は、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、完全ビリオン、「スプリット」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。抗原はまた、ビロソームの形態で提示され得る。本発明は、これらタイプのワクチンのうちのいずれかを製造するために使用され得る。

【0102】

不活性化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、完全ビリオン、スプリットビリオン、もしくは精製表面抗原（インフルエンザについては、ヘマグルチニンを含み、通常はまた、ノイラミニダーゼを含む）を含み得る。ウイルスを不活性化するための化学的手段としては、以下の薬剤のうちの１つ以上の有効量での処理が挙げられる：洗剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、もしくはこれらの組み合わせ。ウイルス不活性化の非化学的方法は、当該分野で公知である（例えば、ＵＶ光もしくはγ線照射）。

【0103】

ビリオンは、ウイルス含有流体（例えば、尿膜腔液もしくは細胞培養上清）から、種々の方法によって採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するために洗剤を含む線形スクロース勾配溶液を使用するゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、ダイアフィルトレーションによって、必要に応じた希釈の後に精製され得る。

【0104】

スプリットビリオンは、精製されたビリオンを洗剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート ８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）で処理して、サブビリオン調製物を生成する（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリットプロセスを含む）ことによって得られる。インフルエンザウイルスをスプリットするための方法は、例えば、当該分野で周知である（例えば、参考文献２７〜３２などを参照のこと）。上記ウイルスのスプリットは、代表的には、感染性であろうと非感染性であろうと、破壊濃度のスプリット薬剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）で完全ウイルスを破壊するかもしくはフラグメント化することによって行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましいスプリット薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、４級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ）、オクチル−もしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｌｅｎｅ ｅｓｔｅｒ）などである。１つの有用なスプリット手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的効果を使用し、スプリットは、最初のビリオン精製の間に起こり得る（例えば、スクロース密度勾配溶液において）。よって、スプリットプロセスは、上記ビリオン含有材料の清澄化（非ビリオン材料を除去するために）、上記採取したビリオンの濃縮（例えば、吸着法（例えば、ＣａＨＰＯ_４吸着）を使用して）、非ビリオン材料からの完全ビリオンの分離、密度勾配遠心分離工程においてスプリット薬剤を使用する（例えば、デオキシコール酸ナトリウムのようなスプリット薬剤を含むスクロース勾配を使用する）ビリオンのスプリット、次いで、望ましくない物質を除去するための濾過（例えば、限外濾過）を含み得る。スプリットビリオンは、有用には、リン酸ナトリウム緩衝化等張性塩化ナトリウム溶液中で再懸濁され得る。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ^ＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸ^ＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥ^ＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ^ＴＭ製品である。

【0105】

精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原であるヘマグルチニン、および代表的には、同様にノイラミニダーゼを含む。精製形態でこれらタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野で周知である。上記ＦＬＵＶＩＲＩＮ^ＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬ^ＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣ^ＴＭ製品は、インフルエンザサブユニットワクチンである。

【0106】

別の形態の不活性化抗原は、ビロソーム［３３］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗剤でのウイルスの可溶化、続いて、ヌクレオキャプシドの除去およびウイルス糖タンパク質を含む膜の再構成によって、調製され得る。ビロソームを調製するための代替法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、膜中にウイルスタンパク質を含むリポソームを生じることを含む。

【0107】

本発明の方法はまた、生ワクチンを生成するために使用され得る。このようなワクチンは、通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、この流体は、遠心分離によって清澄にされ得、緩衝液（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸一ナトリウムを含む）で安定化され得る。インフルエンザウイルスワクチンの種々の形態が、現在利用可能である（例えば、参考文献３４の第１７章および１８章を参照のこと）。生ウイルスワクチンとしては、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴ^ＴＭ製品（三価生ウイルスワクチン）が挙げられる。

【0108】

上記ウイルスは、弱毒化され得る。上記ウイルスは、温度感受性であり得る。上記ウイルスは、低温適合（ｃｏｌｄ−ａｄａｐｔｅｄ）され得る。これら３つの特徴は、生のウイルスを抗原として使用する場合に特に有用である。

【0109】

ＨＡは、現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、ＨＡレベルを参照することによって標準化されている（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低用量が、使用され得る（例えば、小児に関して、もしくは汎流行的状況において、またはアジュバントを使用する場合）。分割用量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ ＨＡ／株）、１／４および１／８）が使用されてきたことと同様に、より高い用量も使用されてきた（例えば、３×もしくは９×用量［３５、３６］）。従って、ワクチンは、０．１〜１５０μｇの間のＨＡ／インフルエンザ株、好ましくは、０．１〜５０μｇの間（例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなど）を含み得る。特定の用量としては、１株あたり、例えば、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などが挙げられる。

【0110】

生ワクチンに関して、投与は、ＨＡ含有量よりむしろ、５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、１株あたり１０^６〜１０^８の間の（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５の間の）ＴＣＩＤ_５０が、代表的である。

【0111】

本発明とともに使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見いだされるような天然のＨＡ、もしくは改変されたＨＡを有し得る。例えば、ＨＡを改変して、トリ種においてウイルスの病原性を高くする決定因子（例えば、上記ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りの超塩基性領域）を除去することは、公知である。逆遺伝学の使用は、このような改変を促進する。

【0112】

汎流行間期の株に対して免疫化するために適していると同時に、本発明の組成物は、汎流行性もしくは潜在的に汎流行性の株に対して免疫化するために特に有用である。本発明は、ヒトおよび非ヒト動物にワクチン接種するために適している。

【0113】

その抗原が、有用にも上記組成物中に含まれ得る他の株は、抗ウイルス治療に抵抗性（例えば、オセルタミビル［３７］および／もしくはザナミビルに対して抵抗性）である株（抵抗性汎流行性株［３８］が挙げられる）である。

【0114】

本発明の組成物は、１種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種もしくはこれ以上）インフルエンザウイルス株（インフルエンザＡ型ウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢ型ウイルスが挙げられる）に由来する抗原を含み得るが、ただし、少なくとも１種のインフルエンザ株は、本発明のリアソータントインフルエンザ株である。上記抗原のうちの少なくとも２種、少なくとも３種もしくは全てが、本発明のリアソータントインフルエンザ株に由来する組成物もまた、想定される。ワクチンが、インフルエンザの１種より多くの株を含む場合、上記異なる株は、代表的には、別個に増殖され、上記ウイルスが採取され、抗原が調製された後に混合される。従って、本発明のプロセスは、１種より多くのインフルエンザ株に由来する抗原を混合する工程を包含し得る。三価ワクチンは代表的である（２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。四価ワクチンもまた、有用である［３９］（２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および２種のインフルエンザＢ型ウイルス株、または３種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株に由来する抗原を含む）。

【0115】

（薬学的組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。以下に記載されるように、アジュバントもまた含まれ得る。このような成分の詳細な議論は、参考文献４０で入手される。

【0116】

ワクチン組成物は、一般に、水性形態にある。しかし、いくつかのワクチンは、乾燥形態、例えば、注射可能な固体、またはパッチ上の、乾燥したかもしくは重合した調製物の形態にあり得る。

【0117】

ワクチン組成物は、チオメルサールもしくは２−フェノキシエタノールのような保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは、実質的に水銀物質を実質的に含まないべきである（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）ことが好ましい（例えば、チオメルサールを含まない［３１、４１］）。水銀を含まないワクチンは、より好ましい。α−トコフェロールスクシネートは、水銀化合物の代替として含まれ得る［３１］。保存剤非含有ワクチンは、特に好ましい。

【0118】

張度を制御するために、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含み得ることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

【0119】

ワクチン組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間（好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間）の重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有さない重量オスモル濃度が以前に報告されている［４２］が、この範囲において重量オスモル濃度を維持することは好ましい。

【0120】

ワクチン組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントで）；またはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。

【0121】

ワクチン組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間（例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間）である。本発明のプロセスは、従って、バルクワクチンのｐＨを、パッケージ前に調節する工程を包含し得る。

【0122】

上記ワクチン組成物は、好ましくは、無菌である。上記ワクチン組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ ＥＵ（エンドトキシン単位、標準尺度）、好ましくは、＜０．１ ＥＵ／用量を含む）。上記ワクチン組成物は、好ましくは、グルテン非含有である。

【0123】

本発明のワクチン組成物は、洗剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム（特に、スプリットワクチンもしくは表面抗原ワクチンのために））を含み得る。上記洗剤は、ほんの微量で存在し得る。従って、上記ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０の各々について１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。他の残りの微量の成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

【0124】

ワクチン組成物は、１回の免疫化のための物質を含んでいてもよいし、複数回の免疫化のための物質を含んでいてもよい（すなわち、「複数用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）。保存剤を含めることは、複数用量の構成において好ましい。複数用量組成物中に保存剤を含める代替として（もしくはそれに加えて）、上記組成物は、物質の取り出しのための無菌アダプタを有する容器中に含まれ得る。

【0125】

インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。

【0126】

組成物およびキットは、好ましくは、２℃〜８℃の間で貯蔵される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、遮光して保持されるべきである。

【0127】

（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが単離され、そして／または細胞株上で増殖させられた場合、最終ワクチン中に残っている細胞株ＤＮＡのいかなる潜在的な腫瘍形成活性をも最小限にするために、上記ＤＮＡの量を最小限にすることは、標準的な実務である。

【0128】

従って、本発明に従って調製されるワクチン組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ（好ましくは、１ｎｇ未満、より好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。

【0129】

任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均長が５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることは、好ましい。

【0130】

混入したＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減らすための便利な方法は、２工程処理（第１は、ＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（これは、ウイルス増殖の間に使用され得る）を、次いで、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）（これは、ビリオン破壊の間に使用され得る）を使用する）を含む参考文献４３および４４において開示される。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、ビリオンを不活性化するためにも使用され得る［４５］。

【0131】

（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、アジュバントを含み得る。これは、上記組成物を受ける被験体において誘発される免疫応答（液性および／もしくは細胞性）を高めるように機能し得る。好ましいアジュバントは、水中油型エマルジョンを含む。種々のこのようなアジュバントは公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、直径５μｍ未満であり、理想的には、サブミクロンの直径を有し、これら小さなサイズは、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）で達成されて、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、濾過滅菌に供され得るので、好ましい。

【0132】

前記エマルジョンは、動物（例えば魚類）供給源または植物供給源からのものなどの油を含むことができる。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀類が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に利用できる堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られる、ホホバ油を使用することができる。種子油としては、紅花油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油およびこれらに類するものが挙げられる。穀類の群の中で、トウモロコシ油が最も容易に入手できるが、他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ ｇｒａｉｎ）、例えばコムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギおよびこれらに類するものの油も使用することができる。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果油および種子油から出発して適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝性であり、従って、本発明の実施の際に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段についての手順は、当該技術分野において周知である。殆どの魚類は、容易に回収できる代謝性の油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨油、例えば鯨ろうが、ここで使用することができる魚油のいくつかの例である。多数の分岐鎖油が５炭素イソプレン単位で生化学的に合成されており、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン、として公知の、分岐した不飽和テルペノイドを含有し、これは、ここで特に好ましい。スクワラン、スクアレンの飽和類似体、も好ましい油である。スクアレンおよびスクワランを含む、魚油は、商業的供給源から容易に入手することができ、または当該技術分野において公知の方法によって得ることができる。別の好ましい油は、α―トコフェロール（下記参照）である。油の混合物を使用することができる。

【0133】

界面活性剤をそれらの「ＨＬＢ」（親水親油バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、およびさらに好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；商品名ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭで販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々であり得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質、例えばホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えばＴｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭＮＰシリーズ；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されたポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般にＳＰＡＮとして公知）、例えばソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートを含む（しかしこれらに限定されない）界面活性剤と共に用いることができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。前記エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

【0134】

界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物、を使用することができる。ポリオキシエチレンソルビタンエステル、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）、およびオクトキシノール、例えばｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、の組み合わせも適する。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。

【0135】

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）０．０１％から１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の洗剤）０．００１％から０．１％、特に０．００５％から０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１％から２０％、好ましくは０．１％から１０％および特に０．１％から１％または約０．５％である。

【0136】

上記ワクチンがスプリットウイルスを含む場合、上記ワクチンは、水相中に遊離界面活性剤を含むことが好ましい。これは、上記遊離界面活性剤が、上記抗原に対して「スプリット効果」を発揮し得、それによって、他に存在し得る任意の非スプリットビリオンおよび／もしくはビリオン凝集物を破壊するので、有利である。これは、スプリットウイルスワクチンの安全性を改善し得る［４６］。

【0137】

好ましいエマルジョンは、＜１μｍの平均液滴サイズ（例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍ、もしくはこれより小さい）を有し得る。これら液滴サイズは、便利なことには、微小流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓａｔｉｏｎ）のような技術によって達成され得る。

【0138】

本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。

【0139】

・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。上記エマルジョンの容積での組成は、約５％ スクアレン、約０．５％ ポリソルベート８０および約０．５％ Ｓｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比は、４．３％ スクアレン、０．５％ ポリソルベート８０および０．４８％ Ｓｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、引用文献５０の第１０章および引用文献５１の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」として公知である［４７〜４９］。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。

【0140】

・スクアレン、トコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。このエマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。これらエマルジョンは、容積で、２〜１０％ スクアレン、２〜１０％ トコフェロールおよび０．３〜３％ ポリソルベート８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これがより安定なエマルジョンを提供し得るように、好ましくは、＜１（例えば、０．９０）である。スクアレンおよびポリソルベート８０は、約５：２の容積比もしくは約１１：５の重量比において存在し得る。従って、上記３種の成分（スクアレン、トコフェロール、ポリソルベート８０）は、１０６８：１１８６：４８５、もしくは約５５：６１：２５のの重量比において存在し得る。１種のこのようなエマルジョン（「ＡＳ０３」）は、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％溶液を与え、次いで、この溶液の９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ α トコフェロールおよび５ｍｌ スクアレン）の混合物とを混合し、次いで、この混合物を微小流動化することによって、作製され得る。得られたエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有するサブミクロン油滴を有し得る。上記エマルジョンはまた、３−ｄｅ−Ｏ−アシル化ものホスホリルリピドＡ（３ｄ ＭＰＬ）を含み得る。このタイプの別の有用なエマルジョンは、例えば、上記で考察した比において、ヒト用量あたり、０．５〜１０ｍｇ スクアレン、０．５〜１１ｍｇ トコフェロール、および０．１〜４ｍｇ ポリソルベート８０を含み得る［５２］。

【0141】

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸緩衝液を含み得る。

【0142】

・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌ ポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−トコフェロールスクシネート）の質量比でこれら３種の成分を含み得、これら濃度は、抗原由来のこれら成分の何らかの寄与を含むはずである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。

【0143】

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でトレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［５３］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％ スクアラン、２．５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバントでのように［５４］（５％ スクアラン、１．２５％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ ポリソルベート８０）、上記Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。微小流動化が好ましい。

【0144】

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴のうちの少なくとも９０％（容積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［５５］。上記エマルジョンはまた、アルジトール；凍結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種以上を含み得る。上記エマルジョンは、ＴＬＲ４アゴニストを含み得る［５６］。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

【0145】

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン［５７］。アジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチン中のこれら成分の最終濃度（重量）は、５％ スクアレン、４％ ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％ Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（ｃａｐｒｙｌｉｃ／ｃａｐｒｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ））である。

【0146】

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献５８に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。

【0147】

・非代謝性の油（例えば、軽油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０もしくはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献５９に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、脂肪族アミンを、デスアシルサポニン（ｄｅｓａｃｙｌｓａｐｏｎｉｎ）に添加することにより生成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。

【0148】

・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセルとして会合されるエマルジョン［６０］。

【0149】

・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６１］。

【0150】

・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６１］。

【0151】

いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即座に混合され得、従って、上記アジュバントおよび抗原は、パッケージされたもしくは配布されたワクチン（使用時に最終的な処方物の準備ができている）では別個に保持され得る。他の実施形態において、エマルジョンは、製造の間に抗原と混合され、従って、上記組成物は、液体アジュバント添加形態でパッケージされる。上記抗原は、一般に、水性形態にあり、その結果、上記ワクチンは、２種の液体を混合することによって最終的に調製される。混合するための上記２種の液体の容積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間）が、一般に、約１：１である。成分濃度が、上記の特定のエマルジョンの説明において与えられる場合、これら濃度は、代表的には、非希釈組成物に関するものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。

【0152】

（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（もしくはキット成分）に適した容器としては、バイアル、シリンジ（例えば、使い捨てシリンジ）、鼻スプレー（ｎａｓａｌ ｓｐｒａｙ）などが挙げられる。これら容器は、滅菌であるべきである。

【0153】

組成物／成分がバイアル中に配置される場合、上記バイアルは、好ましくは、ガラス材料もしくはプラスチック材料から作製され得る。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が上記バイアルに添加される前に、滅菌される。ラテックス感受性患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックス非含有ストッパーでシールされ、全てのパッケージング材料中にラテックスが存在しないことが好ましい。上記バイアルは、ワクチンの単一用量を含んでいてもよいし、１用量より多い用量（「複数用量」バイアル）、例えば、１０用量を含んでいてもよい。好ましいバイアルは、無色ガラスから作製される。

【0154】

バイアルは、あらかじめ充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合されたキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルへと排出され得（例えば、その中の凍結乾燥された材料を再構成するために）、上記バイアルの内容物は、取り出されて上記シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジを取り出した後、次いで、ニードルが取り付けられ得、上記組成物が、患者へと投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に配置され得る。その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに到達し得る前に除去されなければならない。バイアルは、特に、複数用量バイアルについては、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有し得る。

【0155】

成分がシリンジにパッケージされる場合、上記シリンジは、これに取り付けられるニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジと共に供給され得る。このようなニードルは、鞘に入れられ得る。安全ニードル（ｓａｆｅｔｙ ｎｅｅｄｌｅ）が好ましい。１インチ ２３ゲージ、１インチ ２５ゲージおよび５／８インチ ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、記録保持を容易にするために、ロット番号、インフルエンザ流行期、および内容物の使用期限がプリントされ得る剥離式ラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、上記プランジャーが吸引の間に偶発的に除去されてしまわないように、ストッパーを有し得る。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、単一用量のワクチンを含む。上記シリンジは、一般に、ニードルの取り付け前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製され得る。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルは、好ましくは、ブチルゴムシールドに合され得る。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」^ＴＭの下で市販されるものである。

【0156】

容器は、例えば、小児への送達を容易にするために、半用量容積を示すために印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容積を示す印を有し得る。

【0157】

ガラス容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスよりむしろホウケイ酸ガラスから作製された容器を使用することが好ましい。

【0158】

キットもしくは組成物は、（例えば、同じボックスの中に）上記ワクチンの詳細（例えば、投与の説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）を含むリーフレットとともにパッケージされ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に容易に利用可能なアドレナリン溶液を保持することなど）を含み得る。

【0159】

（処置方法、および上記ワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらワクチン組成物は、ヒト被験体もしくはヒト以外の動物被験体（例えば、ブタまたはトリ）への投与に適しており、本発明は、被験体に本発明の組成物を投与する工程を包含する、この被験体における免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供し、被験体における免疫応答を惹起するための医薬の製造のための、本発明の組成物の使用を提供する。

【0160】

これら方法および使用によって惹起される免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒトでの研究から、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関する（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集抑制力価が、同種のウイルスによる感染から約５０％防御を与える）ことが示された［６２］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集抑制によって、マイクロ中和によって、単一放射免疫拡散（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射溶血（ＳＲＨ）によって、測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。

【0161】

本発明の組成物は、種々の方法において投与され得る。最も好ましい免疫化経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは脚への）によるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［６３〜６５］、経口［６６］、皮内［６７、６８］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［６９］などが挙げられる。

【0162】

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、６ヶ月齢からの小児および成人での免疫化における使用に関して現在推奨されている。従って、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であってもよい。上記ワクチンを受けるのに好ましい被験体は、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年齢（例えば、≦５歳）、入院している被験体、ヘルスケアワーカー、軍隊および軍職員、妊婦、慢性疾患の、免疫不全の被験体、上記ワクチンを受ける７日前までに抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよびザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取した被験体、卵アレルギーがある人々、および外国に旅行する人々である。上記ワクチンは、これらの群に適しているのみではないが、一般に、集団においてより多く使用され得る。汎流行性株については、すべての年齢群への投与が好ましい。

【0163】

好ましい本発明の組成物は、効力についてＣＰＭＰ基準のうちの１つ、２つもしくは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧７０％血清保有率（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２．５倍。高齢者（＞６０歳）において、これら基準は、以下である：（１）≧６０％血清保有率；（２）≧３０％セロコンバージョン；および／もしくは（３）ＧＭＴ増加≧２倍。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。

【0164】

処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初回免疫化スケジュールおよび／もしくは追加免疫化スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて上記種々の用量は、同じ経路もしくは異なる経路によって与えられ得る（例えば、非経口の初回免疫（ｐｒｉｍｅ）および粘膜の追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜の初回免疫および非経口の追加免疫など）。１より多くの用量の投与（代表的には、２用量）は、免疫学的にナイーブな患者（例えば、これまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人に関して）において、または新たなＨＡサブタイプ（汎流行性アウトブレイクにおけるような）に対するワクチン接種のために、特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。

【0165】

本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、ムンプス・ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタイプｂワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家およびワクチン接種施設への訪問の間に）に患者に投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、高齢の患者において特に有用である。

【0166】

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時（例えば、同じ医療相談の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）に、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、そのリン酸塩）を含む）が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、ホスフェート（１：１）（オセルタミビルホスフェート（ＴＡＭＩＦＬＵ^ＴＭ）としても公知）である。

【0167】

（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を含み、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、さらなる何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0168】

語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、完全にＹを含まなくてもよい。必要であれば、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

【0169】

数値ｘに関する用語「約」とは、任意のものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

【0170】

別段示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を包含するプロセスは、いかなる具体的な混合する順序も必要としない。従って、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合、２つの成分が、互いに合わされ得、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わせられ得るなど。

【0171】

上記方法の種々の工程は、同時にもしくは異なる時間に、同じもしくは異なる地理学的位置（例えば、国）において、および同じもしくは異なる人々もしくは実体によって、行われ得る。

【0172】

動物（および特にウシ）の材料が、細胞培養において使用される場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来材料が完全に存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。

【0173】

化合物が、組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。

【0174】

２種のアミノ酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列される場合、アミノ酸のパーセンテージが、上記２種の配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメント、ならびに上記％相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７０の第７．７．１８節において記載されるもの）を使用して、決定され得る。好ましいアラインメントは、ギャップ開始ペナルティー
１２およびギャップ伸長ペナルティー ２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス ６２を伴うアフィンギャップ検索を使用して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。上記Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献７１において教示される。

【0175】

２種の核酸配列の間のパーセンテージ配列同一性への言及は、整列される場合、塩基のパーセンテージが、上記２種の配列を比較する際に同じであることを意味する。このアラインメントおよび上記％相同性もしくは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献７０の第７．７．１８節に記載されるもの）を使用して、決定され得る。好ましいアラインメントプログラムは、ＧＣＧ Ｇａｐ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｓｕｉｔｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．１）（好ましくは、デフォルトパラメーター（これは、以下のとおりである：オープンギャップ＝３；伸長ギャップ＝１）を使用する）である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、ここでＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来する、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目２）
２種、３種もしくは４種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、ここで各ドナー株は、１種より多いバックボーンセグメントを提供する、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目３）
２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、ここでＰＢ１セグメントは、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来しない、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目４）
２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、ここで少なくともＰＡセグメント、ＮＰセグメント、もしくはＭセグメントは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４に由来しない、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目５）
前記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントが、同じドナー株に由来する、項目２〜４のいずれか１項に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目６）
前記インフルエンザＡ型ウイルスが、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３３に整列される場合、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置においてリジンを有するＭゲノムセグメントを含む、上述の項目のいずれかに記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目７）
インフルエンザドナー株であって、ここで該ドナー株は、１０５ｐ３０である、インフルエンザドナー株。
（項目８）
インフルエンザＡ型株であって、ここでＭゲノムセグメントは、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、配列番号３３に整列される場合、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置においてリジンを有する、インフルエンザＡ型株。
（項目９）
前記インフルエンザＡ型株が、Ｈ１Ｎ１株である、項目８に記載のインフルエンザＡ型株。
（項目１０）
ドナー株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含むリアソータントインフルエンザＡ型ウイルスであって、ここで該ドナー株は、１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘからなる群より選択される、リアソータントインフルエンザＡ型ウイルス。
（項目１１）
前記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、配列番号１１〜１４もしくは配列番号１８〜２２からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％の同一性を有する配列を有する、項目９に記載のウイルス。
（項目１２）
前記少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントが、配列番号１７もしくは配列番号２０の配列を有する、項目９に記載のウイルス。
（項目１３）
前記ウイルスは、２種以上のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む、項目９〜１２のいずれか１項に記載のウイルス。
（項目１４）
ＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメントが、同じドナー株に由来する、項目１３に記載のウイルス。
（項目１５）
ＰＢ１ウイルスセグメントおよびＰＢ２ウイルスセグメントが、配列番号１８および１９の配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、項目１１に記載のウイルス。
（項目１６）
前記ウイルスが、配列番号１７〜２２からなる群より選択される配列と、少なくとも９５％の同一性を有するウイルスセグメントをさらに含む、項目１５に記載のウイルス。
（項目１７）
リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を培養宿主に導入する工程であって、ここでバックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来し、ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントは、同じドナー株に由来する、工程；ならびに
（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、
を包含する、方法。
（項目１８）
前記発現構築物は、２種以上のインフルエンザドナー株のバックボーンセグメントをコードする、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
リアソータントインフルエンザＡ型ウイルスを調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を培養宿主に導入する工程であって、ここでバックボーンウイルスセグメントは、２種以上のインフルエンザ株に由来する、工程；ならびに
（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程；
を包含し、ここで該発現構築物は、Ａ／Ｔｅｘａｓ／１／７７インフルエンザ株に由来するＰＢ１セグメントをコードしない、方法。
（項目２０）
リアソータントインフルエンザウイルスを調製する方法であって、該方法は、
（ｉ）インフルエンザウイルスを生成するために必要とされるウイルスセグメントをコードする１種以上の発現構築物を培養宿主に導入する工程であって、ここで１種以上のバックボーンウイルスセグメントは、１０５ｐ３０インフルエンザ株および／もしくはＰＲ８−Ｘインフルエンザ株に由来し、ここで少なくとも１種のウイルスセグメントは、第２のインフルエンザ株に由来する、工程；ならびに
（ｉｉ）リアソータントウイルスを生成するために、該培養宿主を培養する工程、
を包含する、方法。
（項目２１）
前記少なくとも１種の発現構築物が、配列番号１１〜１４および配列番号１８〜２２からなる群より選択される配列と、少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
工程（ｉｉ）において得られるリアソータントウイルスを精製する工程（ｉｉｉ）をさらに包含する、項目１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記第２のインフルエンザ株に由来する前記少なくとも１種のウイルスセグメントは、ＨＡセグメントである、項目２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
インフルエンザウイルスを生成するための方法であって、該方法は、（ａ）培養宿主を、項目１〜１６に記載のリアソータントインフルエンザウイルスに感染させる工程；（ｂ）該工程（ａ）からの宿主を培養して、該ウイルスを生成する工程；および必要に応じて、（ｃ）該工程（ｂ）において得られたウイルスを精製する工程を包含する、方法。
（項目２５）
ワクチンを調製する方法であって、該方法は、（ａ）項目２４に記載の方法によってウイルスを調製する工程、および（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製する工程、を包含する、方法。
（項目２６）
前記培養宿主が、孵化鶏卵である、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記培養宿主が、哺乳動物細胞である、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２８）
前記細胞が、ＭＤＣＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞もしくはＰｅｒＣ６細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞が、接着して増殖する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞が、懸濁物中で増殖する、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記ＭＤＣＫ細胞が、細胞株ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
工程（ｂ）が、前記ウイルスを不活性化する工程を包含する、項目２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記ワクチンが、全ビリオンワクチンである、項目２５〜３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ワクチンが、スプリットビリオンワクチンである、項目２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記ワクチンが、表面抗原ワクチンである、項目２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記ワクチンが、ビロソームワクチンである、項目２５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記ワクチンが、１用量あたり１０ｎｇ未満の残留宿主細胞ＤＮＡを含む、項目２５〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記インフルエンザ株のうちの少なくとも１種は、Ｈ１サブタイプ、Ｈ２サブタイプ、Ｈ５サブタイプ、Ｈ７サブタイプもしくはＨ９サブタイプのものである、上述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
１０５ｐ３０ドナー株であって、該株は、インフルエンザＨＡ Ｈ１サブタイプを含まない、１０５ｐ３０ドナー株。
（項目４０）
１種以上の発現構築物を含む発現システムであって、該発現システムは、１０５ｐ３０株もしくはＰＲ８−Ｘ株のセグメントをコードするｖＲＮＡを含み、ここで該発現構築物は、１０５ｐ３０株もしくはＰＲ８−Ｘ株に由来する少なくとも１種のバックボーンウイルスセグメントを含む、発現システム。

【図面の簡単な説明】

【0176】

【図1】図１は、ＭＤＣＫ細胞において増殖させたｗｔ ＰＲ８ウイルスおよびＰＲ８−Ｘウイルスの感染後の異なる時間におけるウイルス力価（病巣形成アッセイ（Ｆｏｃｕｓ−Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）（ＦＦＡ）によって；図１Ａ）、およびＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって；図１Ｂ）を図示する。図１Ａにおける実線および図１Ｂにおける斜線の入った棒は、野生型ＰＲ８での結果を表す。図１Ａにおける破線および図１Ｂにおける白抜きの棒は、野生型ＰＲ８−Ｘでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、図１Ａおよび１Ｂにおけるｙ軸は、それぞれ、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）およびＨＡ力価を示す。

【図2】図２は、ＭＤＣＫ細胞において増殖させた逆遺伝学由来のＰＲ８ウイルスおよびＰＲ８−Ｘウイルスの感染後の異なる時間において、ウイルス力価（ＦＦＡによって；図２Ａ）およびＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって；図２Ｂ）を図示する。図２Ａにおける実線および図２Ｂにおける斜線の入った棒は、ＰＲ８での結果を表す。図２Ａにおける破線および図２Ｂにおける白抜きの棒は、ＲＧ由来ＰＲ８−Ｘでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、図２Ａおよび２Ｂにおけるｙ軸は、それぞれ、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）およびＨＡ力価を示す。

【図3】図３は、上記ＰＲ８−Ｘに由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むＰＲ８もしくはＰＲ８−Ｘいずれかのバックボーンセグメントで作製された逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの、ＭＤＣＫ細胞での感染後の異なる時間において、ウイルス力価（ＦＦＡによって；図３Ａ）およびＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって；図３Ｂ）を比較する。図３Ａにおける実線および図３Ｂにおける斜線の入った棒は、上記ＰＲ８バックボーンでの結果を表す。図３Ａにおける破線および図３Ｂにおける白抜きの棒は、上記ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、図３Ａおよび３Ｂにおけるｙ軸は、それぞれ、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）およびＨＡ力価を示す。

【図4】図４は、汎流行性Ｈ１株（株１）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むｗｔ ＰＲ８もしくはＰＲ８−Ｘいずれかのバックボーンセグメントで作製した逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの、ＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、ＦＦＡ（図４Ａ）によってウイルス力価を、そしてＨＡ力価（赤血球凝集アッセイによって；図４Ｂ）を比較する。図４Ａにおける実線および図４Ｂにおける斜線を入れた柱は、上記ｗｔ ＰＲ８バックボーンでの結果を表す。図４Ａにおける破線および図４Ｂにおける白抜きの棒は、上記ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、図４Ａおよび４Ｂにおけるｙ軸は、それぞれ、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）およびＨＡ力価を示す。

【図5】図５は、１０５ｐ３０に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むＰＲ８もしくはＰＲ８−Ｘのいずれかのバックボーンセグメントで作製した逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの、ＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価（図５Ａ）を、そしてＨＡ力価（図５Ｂ）を比較する。図５Ａにおける実線および図５Ｂにおける斜線を入れた柱は、上記ｗｔ ＰＲ８バックボーンでの結果を表す。図５Ａにおける破線および図５Ｂにおける白抜きの棒は、上記ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸はウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図6】図６は、野生型ＰＲ８−Ｘウイルスおよび１０５ｐ３０ウイルス（図６Ａ）またはＭＤＣＫ細胞において増殖させた逆遺伝学由来のＰＲ８−Ｘウイルスおよび１０５ｐ３０ウイルス（図６Ｂ）の感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を図示する。図６Ａおよび６Ｂにおいて、実線は、１０５ｐ３０での結果を表す。破線は、ＰＲ８−Ｘでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、図６Ａおよび６Ｂにおけるｙ軸は、それぞれ、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）およびＨＡ力価を示す。

【図7】図７は、上記ｗｔ ＰＲ８株（三角付きの線）もしくは１０５ｐ３０株（四角付きの線）のバックボーンセグメント、および汎流行性Ｈ１インフルエンザ株（株２）のＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むリアソータントウイルスの増殖特徴を示す。図７Ａおよび図７Ｂにおけるｘ軸は、感染後の時間を示す。図７Ａにおけるｙ軸は、１ｍＬあたりのＦＦＵにおける力価Ｌｏｇ１０を示す。図７Ｂにおけるｙ軸は、１ｍＬあたりのウイルス粒子における力価ｌｏｇ１０を示す。

【図8】図８は、（Ａ）Ｈ１株（株１）もしくは（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含む１０５ｐ３０もしくはＰＲ８−Ｘのいずれかのバックボーンセグメントで作製した逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスのＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を比較する。実線は、上記１０５ｐ３０バックボーンでの結果を表す。破線は、上記ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図9】図９は、（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株３）もしくは（Ｂ）Ｈ３（株１）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとの組み合わせにおいて、＃１７、＃１９、もしくはＰＲ８−Ｘのいずれかのバックボーンで作製された逆遺伝学由来の６：２ リアソータントウイルスのＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を比較する。図９Ａおよび９Ｂにおいて、丸印付きの破線は、＃１７バックボーンでの結果を表す。菱形印付きの実線は、＃１９バックボーンでの結果を表す。四角印付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図10-1】図１０は、キメラの＃１９バックボーンもしくはＰＲ８−Ｘバックボーンのいずれかと、以下の株：（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株２）、（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株４）、（Ｃ）Ｈ１株（株２）、（Ｄ）Ｈ１株（株３）、もしくは（Ｅ）Ｈ３株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとで作製された異なる逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの一団のＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を比較する。図１０Ａ〜Ｅにおいて、三角印付きの実線は、＃１９バックボーンでの結果を表す。四角印付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図10-2】図１０は、キメラの＃１９バックボーンもしくはＰＲ８−Ｘバックボーンのいずれかと、以下の株：（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株２）、（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株４）、（Ｃ）Ｈ１株（株２）、（Ｄ）Ｈ１株（株３）、もしくは（Ｅ）Ｈ３株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとで作製された異なる逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの一団のＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を比較する。図１０Ａ〜Ｅにおいて、三角印付きの実線は、＃１９バックボーンでの結果を表す。四角印付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図10-3】図１０は、キメラの＃１９バックボーンもしくはＰＲ８−Ｘバックボーンのいずれかと、以下の株：（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株２）、（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株４）、（Ｃ）Ｈ１株（株２）、（Ｄ）Ｈ１株（株３）、もしくは（Ｅ）Ｈ３株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとで作製された異なる逆遺伝学由来の６：２リアソータントウイルスの一団のＭＤＣＫ細胞における感染後の異なる時間において、病巣形成アッセイ（ＦＦＡ）によってウイルス力価を比較する。図１０Ａ〜Ｅにおいて、三角印付きの実線は、＃１９バックボーンでの結果を表す。四角印付きの破線は、ＰＲ８−Ｘバックボーンでの結果を表す。ｘ軸は、感染後の時間を示し、ｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍｌ）を示す。

【図11-1】図１１は、キメラ＃１９（白抜きの棒）もしくはＰＲ８０−Ｘ（中実の棒）のいずれかのバックボーンと、以下の株：（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株２）、（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株４）、（Ｃ）Ｈ３株（株１）、もしくは（Ｄ）Ｈ３株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとで作製された異なる６：２リアソータントウイルスのＭＤＣＫ細胞における感染後６０時間において、ＨＡ収量を（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって）比較する。伝統的な再集合（「伝統的」）と、上記ｗｔ ＰＲ８バックボーンとによって作製された対応する６：２リアソータントウイルスを、コントロールとして含めた（斜線を入れた柱）。ｙ軸は、上記ＨＡ含有量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。

【図11-2】図１１は、キメラ＃１９（白抜きの棒）もしくはＰＲ８０−Ｘ（中実の棒）のいずれかのバックボーンと、以下の株：（Ａ）汎流行性Ｈ１株（株２）、（Ｂ）汎流行性Ｈ１株（株４）、（Ｃ）Ｈ３株（株１）、もしくは（Ｄ）Ｈ３株（株２）に由来するＨＡセグメントおよびＮＡセグメントとで作製された異なる６：２リアソータントウイルスのＭＤＣＫ細胞における感染後６０時間において、ＨＡ収量を（レクチン捕捉ＥＬＩＳＡによって）比較する。伝統的な再集合（「伝統的」）と、上記ｗｔ ＰＲ８バックボーンとによって作製された対応する６：２リアソータントウイルスを、コントロールとして含めた（斜線を入れた柱）。ｙ軸は、上記ＨＡ含有量（μｇ／ｍＬ単位）を示す。

【図12】図１２は、バックボーン１７、１８、１９および２０（表１に示されるとおり；それぞれ、菱形、四角、三角および×印付きの線）を含むリアソータントインフルエンザウイルス、ＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを除いて、Ｈ３インフルエンザ株（株１）に由来する同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むコントロール（丸付きの線）、ならびに等価な野生型株（＋印付きの線）の増殖曲線を示す。ｘ軸は、感染後の時間（ｈｐｉ）を示し、ｙ軸は、ＩＵ／ｍＬを示す。

【図13】図１３は、バックボーン１７および１９（それぞれ、菱形および三角付きの線）およびＨ３インフルエンザ株（株３）に由来するＨＡセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルス、ＰＲ８−Ｘ（＋印付きの線）に由来する全てのバックボーンセグメントを除いて同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含むコントロールならびに等価な野生型株（丸付きの線）の増殖曲線を示す。

【図14-1】図１４は、バックボーン１９（白抜きのボックス）、ＰＲ８−Ｘバックボーン（斜線が入ったボックス）および野生型インフルエンザウイルス（点付きのボックス）を含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用する、ＦＦＡ（１４（Ａ）および１４（Ｃ））およびＨＡ−ＥＬＩＳＡ（１４（Ｂ）および１４（Ｄ））アッセイの結果を示す。図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）は、Ｈ１インフルエンザ株（株２）での結果を示し、図１４（Ｃ）および（Ｄ）は、Ｈ３インフルエンザウイルス株での結果を示す。図１４（Ａ）および１４（Ｃ）におけるｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍＬ単位）を示し、図１４（Ｂ）および１４（Ｄ）におけるｙ軸は、ＨＡ（μｇ／ｍＬ単位）を示す。

【図14-2】図１４は、バックボーン１９（白抜きのボックス）、ＰＲ８−Ｘバックボーン（斜線が入ったボックス）および野生型インフルエンザウイルス（点付きのボックス）を含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用する、ＦＦＡ（１４（Ａ）および１４（Ｃ））およびＨＡ−ＥＬＩＳＡ（１４（Ｂ）および１４（Ｄ））アッセイの結果を示す。図１４（Ａ）および図１４（Ｂ）は、Ｈ１インフルエンザ株（株２）での結果を示し、図１４（Ｃ）および１４（Ｄ）は、Ｈ３インフルエンザウイルス株での結果を示す。図１４（Ａ）および１４（Ｃ）におけるｙ軸は、ウイルス力価（ＩＵ／ｍＬ単位）を示し、図１４（Ｂ）および１４（Ｄ）におけるｙ軸は、ＨＡ（μｇ／ｍＬ単位）を示す。

【図15】図１５は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（配列番号３３）および１０５ｐ３０（配列番号４５）のＭ１ウイルスセグメントのアラインメントである。

【発明を実施するための形態】

【0177】

（発明を実施するための態様）
（新たなドナー株の開発）
高増殖ドナー株を提供するために、ドナー株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４を、ＭＤＣＫ ３３０１６細胞において５回継代する。この方法を使用して、本発明者らは、元の株と比較して、改善された増殖特徴を示す株ＰＲ８−Ｘを得ることができた。

【0178】

上記１０５ｐ３０インフルエンザドナー株は、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９インフルエンザウイルスを、ＭＤＣＫ ３３０１６細胞での臨床分離株から単離し、上記ウイルスを３０回継代することによって提供した。得られた株は、配列番号３３に対して整列させた場合、配列番号３３のアミノ酸９５に対応する位置においてリジンを有するＭセグメントを有する。

【0179】

（ｗｔ ＰＲ８ウイルスおよびＰＲ８−Ｘウイルスの増殖特徴）
ＰＲ８−Ｘドナー株およびｗｔ ＰＲ８ドナー株の増殖特徴を比較するために、これらウイルス株のウイルス力価を、病巣形成アッセイおよび赤血球凝集アッセイによって、ＭＤＣＫ細胞において測定する。

【0180】

（病巣形成アッセイ（ＦＦＡ））
上記ＦＦＡに関しては、感染していないＭＤＣＫ細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ １００μｌ中、密度 １．８×１０^４細胞／ウェルでプレートする（ｐｌａｔｅ）。翌日、培地を吸引し、細胞を、容積 ５０μｌ（ウイルスをＤＭＥＭ＋１％ ＦＣＳ中で希釈）中で、ウイルスに感染させる。上記細胞を、３７℃において翌日までインキュベートする。

【0181】

感染後のいくつかの時点で、上記培地を吸引し、上記細胞をＰＢＳで１回洗浄する。氷冷５０％／５０％ アセトン−メタノール５０μｌを、各ウェルに添加し、続いて、−２０℃において３０分間にわたってインキュベートする。このアセトン混合物を吸引し、上記細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ）で１回洗浄する。ＰＢＳ中２％ ＢＳＡ ５０μｌを、各ウェルに添加し、続いて、室温（ＲＴ）において３０分間にわたってインキュベートする。抗ＮＰの１：６０００希釈物 ５０μｌを、ブロッキング緩衝液中に添加し、続いて、室温において１時間にわたってインキュベートする。この抗体溶液を吸引し、上記細胞をＰＢＳＴで３回洗浄する。二次抗体（ヤギ抗マウス）を、５０μｌ
ブロッキング緩衝液で１：２０００希釈において添加し、上記プレートを、室温において１時間にわたってインキュベートする。この抗体溶液を吸引し、上記細胞をＰＢＳＴで３回洗浄する。５０μｌのＫＰＬ Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅを各ウェルに添加し、１０分間にわたってインキュベートする。上記Ｔｒｕｅ−Ｂｌｕｅを吸引し、ｄＨ_２Ｏで１回洗浄することによって、上記反応を停止させる。上記水を吸引し、上記細胞を放置して乾燥させる。

【0182】

結果（図１）から、上記ＰＲ８−Ｘ株は、これが由来した上記ｗｔ ＰＲ８株と比較して、同じ時間枠においてより高い力価まで増殖し得ることが示される。

【0183】

（ＰＲ８−Ｘバックボーンもしくはｗｔ ＰＲ８バックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
ウイルスの再集合のためのドナー株として上記ＰＲ８−Ｘ株が適切であることを試験するために、リアソータントウイルスを、逆遺伝学によって生成する。上記リアソータントウイルスは、汎流行性Ｈ１株に由来する上記ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質、ならびにＰＲ８−ＸもしくはＰＲ８のいずれかに由来する他のウイルスセグメントを含む。これらリアソータントウイルスのウイルス力価を、上記のように、ＦＦＡおよびＨＡアッセイによって決定する。結果を図４に示す。

【0184】

結果から、ＰＲ８−Ｘに由来するウイルスセグメントを含むリアソータントウイルスは、上記ＰＲ８／３４株に由来するウイルスセグメントを含むリアソータントウイルスと比較して、ＭＤＣＫ細胞において迅速に増殖することが示される。

【0185】

（ＰＲ８−Ｘと比較した、１０５ｐ３０株の増殖特徴）
ＭＤＣＫ細胞を、ｍｏｉ １０^−３において１０５ｐ３０およびＰＲ８−Ｘに感染させ、感染後のいくつかに時点において、サンプルを採取する。力価を、ＦＦＡアッセイによって決定する。結果から、１０５ｐ３０は、ＰＲ８−Ｘと比較して、ＭＤＣＫ細胞においてさらにより迅速に増殖することが示される（図６）。

【0186】

（１０５ｐ３０バックボーンもしくはｗｔ ＰＲ８バックボーンを含むリアソータントウイルスの増殖特徴）
ウイルスの再集合のためのドナー株として上記１０５ｐ３０株が適切であることを試験するために、逆遺伝学を使用して、汎流行性Ｈ１インフルエンザ株に由来する上記ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびに上記１０５ｐ３０株もしくは上記ｗｔ ＰＲ８株のいずれかに由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントウイルスを生成する。ＭＤＣＫ細胞を、上記リアソータントウイルスに、ｍｏｉ １０^−３において感染させ、感染後１時間、１２時間、３６時間および６０時間にサンプルを採取する。上記力価を、病巣形成アッセイによって、もしくはリアルタイム検出ＰＣＲによってウイルス粒子を測定することによって、のいずれかで決定する。上記１０５ｐ３０株に由来するバックボーンセグメントを含む上記リアソータントウイルスは、上記ｗｔ ＰＲ８株のバックボーンセグメントと再集合されているウイルスより迅速に増殖する。このことから、上記１０５ｐ３０株は、迅速に増殖するリアソータントウイルスを生成するための良好なドナー株であることが示される（図７）。

【0187】

（２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを使用する、インフルエンザウイルスのレスキュー）
Ｈ３インフルエンザウイルスに由来する上記ＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびに上記１０５ｐ３０ドナー株および上記ＰＲ８−Ｘドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスのレスキュー効率を、ＭＤＣＫ細胞において試験する。上記リアソータントインフルエンザウイルスは、以下の表に示されるように、上記１０５ｐ３０ドナー株および上記ＰＲ８−Ｘドナー株のバックボーンセグメントを含む：

【0188】

【表1】

番号３、４、１０、１１、１４および１６〜２０に従うバックボーンを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、レスキュー可能である。バックボーン番号３、４、１０、１１もしくは１６を含むインフルエンザウイルスは、１０^２ＩＵ／ｍＬ未満のウイルス力価を達成する。バックボーン番号１７および１８を含むインフルエンザウイルスは、１０^２ＩＵ／ｍＬ〜１０^６ＩＵ／ｍＬの間のウイルス力価を達成し、バックボーン番号１９および２０を有するインフルエンザウイルスは、１０^６ＩＵ／ｍＬより高い力価すら達成する。

【0189】

これらデータから、上記ＰＢ１セグメントおよびＰＢ２セグメントが同じインフルエンザドナー株に由来するインフルエンザウイルスは、これらセグメントが異なるインフルエンザドナー株に由来するインフルエンザウイルスと比較して、より高いレスキュー効率を示し得ることが示される。

【0190】

（２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスの増殖特徴）
バックボーン番号１７、１８、１９および２０（上記の表１に示されるとおり）、ならびにＨ３インフルエンザ株（株１）に由来する上記ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含む、リアソータントインフルエンザ株を作る。コントロールとして、等価な野生型Ｈ３インフルエンザウイルス、同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用する。

【0191】

さらに、バックボーン番号１７および１９、ならびに第２のＨ３インフルエンザ（株１）ウイルスもしくは汎流行性Ｈ１インフルエンザウイルス（株３）のいずれかに由来する上記ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントを含む、リアソータントインフルエンザ株を生成する。上記Ｈ３株のためのコントロールとして、等価な野生型Ｈ３（株２）インフルエンザウイルス、ならびに同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用する。上記汎流行性Ｈ１インフルエンザウイルスについては、同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用する。

【0192】

上記リアソータントインフルエンザウイルスおよび上記コントロールウイルスを、ＭＤＣＫ細胞において増殖させ、ウイルス力価を、異なる時点においてＦＦＡによって測定する。バックボーン１７、１９および２０を含む上記リアソータントＨ３ウイルス（株１）、ならびにバックボーン１７および１９を含む上記Ｈ３インフルエンザウイルス（株３）に関して、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む上記インフルエンザウイルスは、上記野生型ウイルスおよび単一のドナー株にのみ由来するバックボーンセグメントを含む上記リアソータントウイルスと比較して、より高い力価まで増殖する（図１１および図１２を参照のこと）。

【0193】

上記汎流行性Ｈ１インフルエンザウイルスに関して、バックボーン１７および１９を含む上記リアソータントインフルエンザ株は、ＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを含んだ上記コントロールと比較して、より高い力価まで増殖する（図９を参照のこと）。

【0194】

上記データから、２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、単一のドナー株のみに由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較すると、改善された増殖速度を示し得ることが示される。

【0195】

上記実験をまた、４種の異なるＨ１株もしくはＨ３株に由来する上記ＨＡセグメントおよびＮＡセグメントと組み合わせて、バックボーン１９または上記ＰＲ８−Ｘに由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを使用して反復した。結果を図１０に示す。

【0196】

（２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントを有するリアソータントインフルエンザウイルスは、より高い収量を与える）
２種の異なるインフルエンザドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスもまた、より高い収量を提供し得るか否かを試験するために、上記リアソータント株のＨＡ収量を、ＨＡ−ＥＬＩＳＡによって試験する。この目的のために、上記のようにバックボーン＃１９ならびに上記Ｈ３（株２）およびＨ１インフルエンザ株のＨＡ／ＮＡセグメントを含む同じリアソータントインフルエンザウイルスを、使用する。コントロールとして、等価な野生型インフルエンザウイルス、ならびに同じＨＡセグメントおよびＮＡセグメント、ならびにＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスを、使用する。さらに、ウイルス力価を、ＦＦＡアッセイで確認する。

【0197】

上記結果から、２種の異なるドナー株に由来するバックボーンセグメントを含む上記リアソータントインフルエンザ株は、ＰＲ８−Ｘに由来する全てのバックボーンを含んだインフルエンザウイルスと比較して、より高い収量まで増殖し得ることが確認される（図１３（Ａ）および１３（Ｃ）を参照のこと）。さらに、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスもまた、より高いＨＡ収量を与える（図１３（Ｂ）および１３（Ｄ）を参照のこと）。

【0198】

これらデータから、２種のドナー株に由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスは、単一のドナー株のみに由来するバックボーンセグメントを含むリアソータントインフルエンザウイルスと比較して、より高い収量を与えることが示される。

【0199】

本発明は、例示によってのみ記載されてきたこと、および改変は、本発明の範囲および趣旨内にありながら行われ得ることが理解される。

【0200】

【化1】

【0201】

【化2】

【0202】

【化3】

【0203】

【化4】

【0204】

【化5】

【0205】

【化6】

【0206】

【化7】

【0207】

【化8】

【0208】

【化9】

【0209】

【化10】

【0210】

【化11】

【0211】

【化12】

【0212】

【化13】

【0213】

【化14】

【0214】

【化15】

【0215】

【化16】

【0216】

【化17】

【0217】

【化18】

【0218】

【化19】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]