特許 6280329 皮膚の老化を防止および／または緩和するのに用いるためのマイクロＲＮＡ阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6280329

(24)【登録日】2018年1月26日

(45)【発行日】2018年2月14日

(54)【発明の名称】皮膚の老化を防止および／または緩和するのに用いるためのマイクロＲＮＡ阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20180205BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20180205BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20180205BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/68 AZNA

   C12N15/00 A

   A61Q19/00

【請求項の数】9

【外国語出願】

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2013-172867(P2013-172867)

(22)【出願日】2013年8月23日

(65)【公開番号】特開2014-45773(P2014-45773A)

(43)【公開日】2014年3月17日

【審査請求日】2016年6月13日

(31)【優先権主張番号】12306029.5

(32)【優先日】2012年8月29日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】508283406

【氏名又は名称】シャネル パフュームズ ビューテ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100128761

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 恭子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】カンディ エレオノーラ

(72)【発明者】

【氏名】メリーノ ジェリー

(72)【発明者】

【氏名】サインティニー ガエル

(72)【発明者】

【氏名】マヘ クリスチャン

【審査官】 千葉 直紀

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１５４４０２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１０６２８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３７６４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５１９６０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 AGING, 2012.Nov, Vol. 4, No. 11, pp. 843-853

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚の老化を防止および／または緩和するための候補化合物についてスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、線維芽細胞試料と接触させるステップと、
ｂ．前記線維芽細胞におけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ステップａ．で処置された線維芽細胞において、処置されていない線維芽細胞と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％の阻害が測定される化合物を選択するステップと、
ｄ．ステップｃ．で得られた化合物の皮膚の老化に対する効果を試験するステップと
を含む方法。

【請求項2】

ステップｂ．をステップａ．の前後に実施することを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

以下のステップ：
ａ’．線維芽細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップと、
ａ．試料のうちの１つを、少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次に
ｂ．前記試料におけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ステップａ．で処置された線維芽細胞において、処置されていない線維芽細胞試料と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％の阻害が測定される化合物を選択するステップと
ｄ．ステップｃ．で得られた化合物の皮膚の老化に対する効果を試験するステップと
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記線維芽細胞が、早期老化線維芽細胞であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

早期老化線維芽細胞が、古典的な培養条件下における７０回の集団倍加後に得られることを特徴とする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

古典的な培養条件が、ＬＳＧＳ増殖サプリメントを添加した１０６培地中で、常にサブコンフルエント状態に保たれる線維芽細胞の培養を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

被験化合物が、植物性抽出物から選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ステップｃ．において測定されるマイクロＲＮＡの発現または活性の阻害が、少なくとも５０％であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

皮膚の老化を防止および／または緩和するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法に従って得られうる、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤の化粧品としての使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、老化を防止および／または緩和するための、マイクロＲＮＡの発現または活性を阻害する化合物の同定および使用に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞の老化とは元来、培養の終末期における増殖性細胞について述べられる、増殖の不可逆的な停止の形態であるが、ＤＮＡの損傷、酸化ストレス、化学療法、および発がん性の活性化などの有糸分裂性刺激の過剰など、複数の刺激により誘導されることが知られている（Serranoら, 1997; Campisi, 2001; Schmittら, 2002）。細胞は、不可逆的な停止期に入ると、ベータ−ガラクトシダーゼ活性の増強、ならびにｐ５３、前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、およびｐ１９Ａｒｆを含めた重要なメディエーターの発現の増大を含め、特有の特徴を示す（Serranoら, 1997; Naritaら, 2003; Sharplessら, 2004）。大半はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて研究されているが、細胞の老化は、動物全身レベルにおける老化過程と相関付けられており、したがって、老化を制御する多くの因子が生物の老化の一因となることが示唆されている（SharplessおよびDePinho, 2004; Campisi, 2005）。

【0003】

全ての老化しつつある細胞（senescing cell）は、遺伝子発現の大きな変化を経る。包括的な遺伝子発現プロファイリングは、細胞周期、インスリン増殖因子、インターフェロン、ＭＡＰキナーゼ、および酸化ストレス経路における遺伝子を、細胞老化時において一貫して制御不良となるものとして同定している。遺伝子発現の変化は、老化の表現型をもたらすものであり、細胞における老化プログラムを活性化させる機構および経路の一部として十分に確立されている。しかし、老化時における遺伝子発現の変化の一因となる因子については、依然として明らかでない。

【0004】

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、多様な生物学的過程および病理学的過程における遺伝子発現の重要な調節因子である。ｍｉＲＮＡの発現レベルの変化は、細胞の老化（senescence）および生物の老化（aging）において生じ（Grillariら, 2010；Hacklら, 2010）、特定のｍｉＲＮＡの推定標的であるｍＲＮＡのレベルの変化と連関している（Laffertyら, 2009； Heら, 2007； Maesら, 2009）。複数の研究により、ｍｉＲＮＡの特定のセットが、線維芽細胞の複製老化において上方制御されることが確認されている（Faraonioら, 2012；Dhahbiら, 2011； Yong Wangら, 2010）。

【発明の概要】

【0005】

したがって、細胞の老化、特に、線維芽細胞の老化を防止するか、低減するか、または阻害までもする生成物または活性薬剤を提供することが望ましく、そして、重要である。

【0006】

したがって、本発明は、このような有用な薬剤を同定する方法を提供する。

【0007】

したがって、本発明は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための候補化合物についてスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物（test compound）を、線維芽細胞試料と接触させるステップと、
ｂ．前記線維芽細胞におけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された線維芽細胞において、処置されていない線維芽細胞と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関する。

【0008】

線維芽細胞は、早期老化線維芽細胞（pre-senescent fibroblast）であることが好ましい。したがって、本発明は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための候補化合物についてスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、以下のステップ：
ａ．少なくとも１つの被験化合物を、早期老化線維芽細胞試料と接触させるステップと、
ｂ．前記早期老化線維芽細胞におけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された早期老化線維芽細胞において、処置されていない早期老化線維芽細胞と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関する。

【0009】

「早期老化線維芽細胞」は、検出可能なレベル（このレベルは、ウェスタンブロットにより決定することができる）でｐ１６を発現する細胞を意味する。これらの細胞は、若齢の線維芽細胞より増殖が緩慢である。

【0010】

第１の実施形態によれば、ステップｂ．をステップａ．の前後に実施する。この場合、ステップａ．の前に、線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞において測定されるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される）の発現または活性は、対照値（すなわち、処置されていない線維芽細胞、好ましくは処置されていない早期老化線維芽細胞）に対応する。したがって、ステップｃ．は、ａ．で処置された線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞において、ステップａ．の前の同じ線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が測定される化合物の選択を含む。

【0011】

別の実施形態によれば、方法は、線維芽細胞試料、好ましくは早期老化線維芽細胞試料を調製する第１のステップａ’．を含む。したがって、本発明は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための候補化合物についてスクリーニングするｉｎ ｖｉｔｒｏにおける方法であって、以下のステップ：
ａ’．線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞の少なくとも２つの試料を調製するステップと、
ａ．試料のうちの１つを、少なくとも１つの被験化合物と接触させるステップと、次に
ｂ．前記試料におけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現または活性を測定するステップと、
ｃ．ａ．で処置された線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞において、処置されていない線維芽細胞試料、好ましくは早期老化線維芽細胞試料と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が測定される化合物を選択するステップと
を含む方法に関することが好ましい。

【0012】

この第２の実施形態では、ステップａ．にかけられていない線維芽細胞試料、好ましくは早期老化線維芽細胞試料において測定される、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択されるマイクロＲＮＡの発現または活性が、対照値（すなわち、処置されていない線維芽細胞、好ましくは処置されていない早期老化線維芽細胞）に対応する。

【0013】

「皮膚の老化」という表現により、これが、例えば、皺および細かい線、皮膚の干からび、皮膚のたるみ、皮膚の薄層化、ならびに弾力性および／もしくは張りを失った皮膚など、時間生物学的な、ならびに／または光誘導性の、老化による皮膚の外観における任意の変化を意図し、および、例えば、紫外性放射に曝露された後における任意の皮膚内部の、特にコラーゲンの、分解など、外観の変化に表れる、系統的ではない、皮膚におけるどのような内的変化も意図する。

【0014】

本発明における対象のｍｉＲは、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される。
成熟ｍｉＲ−１３４は配列番号１（ｕｇｕｇａｃｕｇｇｕｕｇａｃｃａｇａｇｇｇｇ）である。これは、配列ＨＧＮＣ：３１５１９である。
成熟ｍｉＲ−１５２は、配列番号２（ＵＣＡＧＵＧＣＡＵＧＡＣＡＧＡＡＣＵＵＧＧ）である。これは、配列ＨＧＮＣ：３１５３８である。

【0015】

これらの配列は、ＨＧＮＣデータベースに由来する。

【0016】

ｍｉＲ−１３４の機能は未知であるが、ｍｉＲ−１５２は、子宮内膜がん（Tsurutaら, 2011）および肝細胞がん（Huangら, 2010）における腫瘍抑制因子として記載されており、肝細胞がんでは、ｍｉＲ−１５２が、ＤＮＡメチル化の異常を引き起こすＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１を標的とする。いかなる理論にも束縛されることなく、実施例は、いずれのｍｉＲＮＡも、インテグリンアルファ９（ＩＴＧＡ９）を標的とするが、ｍｉＲ−１５２は、ＩＴＧＡ５を標的とすることを示す。インテグリンは、細胞−細胞間接着および細胞−マトリックス間接着を媒介するアルファ鎖およびベータ鎖から構成されるヘテロ二量体の膜内在性糖タンパク質である。ＩＴＧＡ９によりコードされるタンパク質は、ベータ１鎖に結合すると、細胞外マトリックスにおけるＶＣＡＭ１、サイトタクチン、オステオポンチン、およびフィブロネクチン−ＥＩＩＩＡ（ＦＮ−ＥＩＩＩＡ、また、ＥＤＡとも称する）の受容体である、インテグリンを形成する。一般に、インテグリンなど、細胞−マトリックス間接着の受容体は、細胞とそれらを取り巻く細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との緊密な相互作用を伴う発生過程において、本質的な役割を果たす。それらの各々の（１または複数の）ＥＣＭリガンドへの接合を媒介するのに加え、インテグリンは、特化したシグナル伝達機能を有し、遺伝子発現、ならびに細胞の形状、遊走、増殖、および生存を制御しうる。さらに、ＥＣＭに結合するインテグリンは、マトリックスから細胞へのシグナルを伝達するのに必要とされるだけでなく、この相互作用は、細胞によるマトリックスの構成およびリモデリングを可能とする応答もまた誘発する（Leissら, 2008）が、この特徴は、老化した組織、特に、老化した皮膚では極めて制限される。近年の研究は、α９β１インテグリン（ＩＴＡＧ９）が、老化時には、マトリックス分解プロテアーゼの発現を増大させ（Royら, 2011）、皮膚の結合組織を構成するコラーゲンおよび他の細胞外マトリックスタンパク質を分解することを示している（Quanら, 2009）。

【0017】

試験される被験化合物は、任意の種類でありうる。被験化合物は、天然由来の場合もあり、化学合成により生成させた場合もある。化学合成は、構造的に明確な化合物、特徴づけされていない化合物もしくは物質、または化合物の混合物のライブラリーを含みうる。

【0018】

天然の化合物には、植物および動物など、植物由来の化合物が含まれる。被験化合物は、植物性であることが好ましく、植物抽出物（botanical extract）から選択されることが好ましい。

【0019】

上記のステップａ’．およびステップａ．において用いられる早期老化線維芽細胞は、複製老化の細胞モデルである。これらの早期老化線維芽細胞は、古典的な培養条件下における７０回の集団倍加後に得られる。古典的な培養条件は、ＬＳＧＳ増殖サプリメントを添加した１０６培地中で、常にサブコンフルエント状態に保たれる線維芽細胞の培養を含む。

【0020】

それらは、以下の工程により得ることが好ましい。

【0021】

ヒト新生児初代皮膚線維芽細胞を、適切な培地中で培養する。前記培地は、ＬＳＧＳ増殖サプリメントを添加した１０６培地でありうる。細胞は、常にサブコンフルエント状態に保つ。細胞は、適切な時点、通常は毎週１回継代培養する。

【0022】

各継代培養では、細胞の一部を回収および分析して、集団倍加、集団倍加時間、老化についての生化学的マーカー、および細胞周期を測定する。

【0023】

ヒト初代線維芽細胞の集団倍加は、約１００日間の培養期間において測定することが好ましい。老化マーカー（ｐ１６）の解析から、増殖マーカー（ｐ１）が減少する間には細胞が分化していないことが示唆される。老化時においては、増殖中の細胞（proliferating cells）の百分率が低下する。

【0024】

ステップａ．によれば、被験化合物を、線維芽細胞試料、好ましくは早期老化線維芽細胞試料と接触させる。

【0025】

ステップｂ．によれば、前記線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞において、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現および／または活性を測定する。

【0026】

「マイクロＲＮＡの発現」という用語は、生成するマイクロＲＮＡの量を意味することを意図する。

【0027】

「マイクロＲＮＡの活性」という用語は、前記マイクロＲＮＡが、それがハイブリダイズするｍＲＮＡのレベルを阻害する能力を意味することを意図する。

【0028】

当業者は、前記マイクロＲＮＡがハイブリダイズするｍＲＮＡを定量的または半定量的に検出し、したがって、前記マイクロＲＮＡの活性を決定する技法に精通している。ｍＲＮＡの、特定のヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づく技法は、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、最も一般的な技法である。

【0029】

当業者はまた、マイクロＲＮＡ、または前記マイクロＲＮＡがハイブリダイズするｍＲＮＡを定量的または半定量的に検出する技法にも精通している。特に、マイクロＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより測定することができる。マイクロＲＮＡの活性は、ｍＲＮＡ標的についてのリアルタイムＰＣＲにより測定することもでき、ウェスタンブロットによって、標的のタンパク質レベルを評価することにより測定することもできる。代替的に、標的が未知の場合は、ベータ−ｇａｌ染色または増殖に対する効果など、マイクロＲＮＡ自体の生物学的効果を評価することにより、マイクロＲＮＡの活性を調べることもできる。

【0030】

マイクロＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲにより測定することが好ましい。

【0031】

次に、被験化合物による処置後におけるマイクロＲＮＡの発現または活性を、対照値と比較する、すなわち、処置前における同じ線維芽細胞（好ましくは早期老化線維芽細胞）において得られた値、または処置されていない別の線維芽細胞（好ましくは早期老化線維芽細胞）試料において得られた値と比較する。

【0032】

ステップｃ．によれば、有用な化合物は、処置された線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞において、処置されていない線維芽細胞、好ましくは早期老化線維芽細胞と比較して、少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害、または少なくとも１つのマイクロＲＮＡの活性について少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％の阻害が測定される化合物である。前記マイクロＲＮＡの発現または活性の阻害は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％であることが好ましい。

【0033】

本明細書で規定されるスクリーニング法により選択された化合物は、その後、皮膚の老化に対するそれらの効果について、他のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて調べることができる。本発明による有用な化合物は、標的とされるマイクロＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択されるマイクロＲＮＡの阻害剤である。

【0034】

本発明の対象はまた、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの阻害剤の化粧品としての使用（cosmetic use）であり、前記阻害剤は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための上記の方法に従って同定される。

【0035】

別の態様によれば、本発明の目的は、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ阻害剤の使用であり、前記阻害剤は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための治療組成物を作製する目的で、上記の方法に従って同定される。したがって、本発明はまた、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ阻害剤の使用に関し、前記阻害剤は、皮膚の老化を防止および／または緩和するための上記の方法に従って同定される。

【0036】

阻害剤は、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２から選択されるマイクロＲＮＡの発現または活性を消失させるかまたは実質的に低減する化合物を指す。「実質的に」という用語は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％の低減を意味し、より好ましくは少なくとも６０％の低減を意味する。

【0037】

マイクロＲＮＡ阻害剤は、組成物の０．００１〜１０重量％の比率で、好ましくは組成物の０．０１〜５重量％の比率で用いることができる。

【0038】

阻害剤は、アンチセンスＤＮＡポリヌクレオチドまたはアンチセンスＲＮＡポリヌクレオチドの場合もあり、ｓｉＲＮＡの場合もある。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の阻害剤は、抗ｍｉＲであることが好ましい。

【0039】

抗ｍｉＲは、内因性ｍｉＲを特異的に阻害するｍｉＲ阻害剤である。抗ｍｉＲは、内因性マイクロＲＮＡ分子に特異的に結合し、これを阻害するようにデザインされた一本鎖核酸である。抗ｍｉＲは、標的ｍｉＲの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。これらの即時使用可能な（ready-to-use）阻害剤は、ｓｉＲＮＡに用いられるトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータと同様のトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータを用いて細胞内に導入することができ、ｍｉＲの生物学的効果についての詳細な研究を可能とする。抗ｍｉＲの使用は、ｍｉＲ活性の下方制御によるｍｉＲの機能的解析を可能とする。

【0040】

抗ｍｉＲは市販されており、例えば、ＡｍｂｉｏｎまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得ることができる。

【0041】

文献に基づくと、ｍｉＲの発現を７０％阻害すると、ヒト正常細胞における老化の誘導／阻害に影響する（Menghini R, Casagrande V, Cardellini M, Martelli E, Terrinoni A, Amati F, Vasa-Nicotera M, Ippoliti A, Novelli G, Melino G, Lauro R, Federici M., MicroRNA 217 modulates endothelial cell senescence via silent information regulator 1. Circulation. 2009;120(15):1524-32）。

【0042】

上記のスクリーニング法により同定されたｍｉＲ阻害剤は、生理学的に許容される担体、好ましくは、美容的に許容される媒体、すなわち、毒性、非適合性、不安定性、またはアレルギー反応の危険性なしにヒトの皮膚と接触させて用いるのに適し、とりわけ、使用者に許容されない不快感（発赤、こわばり、刺痛など）を引き起こすことのない媒体と組み合わせて、組成物中に調合することができる。これらの組成物は、例えば、経口投与することもでき、局所投与することもできる。組成物は、局所適用することが好ましい。経口投与の場合、組成物は、錠剤、ゲル状カプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液または脂質ベシクルもしくはポリマーベシクルの形態でありうる。局所投与の場合、組成物は、より具体的に、皮膚および粘膜の治療における使用のための組成物であり、軟膏（salve）、クリーム、ミルク、軟膏（ointment）、粉末、含浸パッド、溶液、ゲル、スプレー、ローション、または懸濁液の形態でありうる。組成物はまた、制御放出のためのマイクロスフェアもしくはナノスフェアの懸濁液、または脂質ベシクルもしくはポリマーベシクル、またはポリマーパッチ、またはハイドロゲルの形態でもありうる。この局所適用のための組成物は、無水物形態の場合もあり、水性形態の場合もあり、エマルジョン形態の場合もある。局所適用のための組成物は、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、または多重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／ＷエマルジョンまたはＯ／Ｗ／Ｏエマルジョン）の形態の場合もあり（これらは、場合によって、マイクロエマルジョンの場合もあり、ナノエマルジョンの場合もある）、水性分散液、溶液、水性ゲル、または粉末の形態の場合もある。好ましい変化形では、組成物が、ゲル、クリーム、またはローションの形態である。

【0043】

組成物の生理学的に許容される担体は一般に、水を含み、場合によって、エタノールなど、他の溶媒も含む。

【0044】

本組成物は、顔および／または身体の皮膚のためのケア製品および／またはクレンジング製品として用いることが好ましく、とりわけ、例えば、ポンプ式のディスペンサーボトル、エアゾール、またはチューブ内でコンディショニングされた流体、ゲル、またはムースの形態の場合もあり、例えば、ジャー内でコンディショニングされたクリームの形態の場合もある。変化形として、組成物は、メーキャップ製品の形態の場合もあり、特に、ファウンデーションまたはルースパウダーもしくはコンパクトパウダーの形態の場合もある。

【0045】

組成物は、以下から選択される少なくとも１つの化合物など、各種の補助剤を含みうるが、この列挙を限定的とするものではない：
・とりわけ、ポリジメチルシロキサン（ジメチコン）、ポリアルキルシクロシロキサン（シクロメチコン）、およびポリアルキルフェニルシロキサン（フェニルジメチコン）など、直鎖状または環状で揮発性または非揮発性のシリコーン油；フルオロ油、アルキル安息香酸、および、ポリイソブチレンなどの分枝状炭化水素など、合成油；植物油、とりわけ、ダイズ油またはホホバ油；ならびに液体石油ゼリーなどの鉱油から選択されうる油；
・オゾケライト、ポリエチレン蝋、蜜蝋、またはカルナウバ蝋などの蝋；
・とりわけ、触媒の存在下における、少なくとも１つの反応基（とりわけ、水素またはビニル）を含有し、末端位および／または側鎖位において、少なくとも１つのアルキル基（とりわけ、メチル）またはフェニルを保有するポリシロキサンの、有機水素ポリシロキサンなどの有機シリコーンとの反応によって得られるシリコーンエラストマー；
・界面活性剤、好ましくは、非イオン性であれ、アニオン性であれ、カチオン性であれ、両親媒性であれ、乳化性の界面活性剤であり、特に、グリセロールの脂肪酸エステル、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステル、およびスクロースの脂肪酸エステルなど、ポリオールの脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールの脂肪族アルキルエーテル；アルキルポリグルコシド；ポリシロキサンで修飾されたポリエーテル；ベタインおよびその誘導体；ポリクォタニウム；エトキシル化された脂肪族アルキル硫酸塩；スルホコハク酸；サルコシン酸；リン酸アルキルおよびリン酸ジアルキルならびにこれらの塩；ならびに脂肪酸石鹸；
・直鎖状脂肪族アルコールであり、特に、セチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの共界面活性剤；
・増粘剤および／またはゲル化剤であり、特に、アクリロイルメチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）および／またはアクリルアミドおよび／またはアクリル酸および／またはアクリル酸塩もしくはアクリル酸エステルの、架橋形成されたまたは架橋形成されない、親水性または親油性のホモポリマーおよびコポリマー；キサンタンガムまたはグアーガム；セルロースの誘導体；ならびにシリコーンガム（ジメチコノール）；
・ジベンゾイルメタン誘導体（ブチルメトキシジベンゾイルメタンを含めた）、ケイ皮酸誘導体（エチルヘキシルメトキシケイ皮酸を含めた）、サリチル酸、パラアミノ安息香酸、β，β’−ジフェニルアクリル酸、ベンゾフェノン、ベンジリデンカンファー誘導体、フェニルベンズイミダゾール、トリアジン、フェニルベンゾトリアゾール、およびアントラニル酸誘導体などの有機スクリーニング剤；
・コーティングされたもしくはコーティングされない色素またはナノ色素の形態における鉱物酸化物に基づき、特に、二酸化チタンまたは酸化亜鉛に基づく無機スクリーニング剤；
・染料；
・保存剤；
・ＥＤＴＡ塩などの封鎖剤；
・香料；
・ならびにこれらの混合物。

【0046】

このような補助剤の例はとりわけ、限定なしに述べると、皮膚ケア業界で通常用いられる、多種多様な美容成分および医薬成分であって、本発明の組成物中のさらなる成分として用いるのに適する美容成分および医薬成分について記載する、ＣＴＦＡによる辞典（International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association刊, 第11版, 2006）において言及されている。

【0047】

組成物はまた、充填剤、色素、ナクレ、伸長剤、およびマッティングポリマー、ならびにこれらの混合物など、光学的効果を伴う少なくとも１つの化合物も含みうる。

【0048】

「充填剤」という用語は、組成物に、実体または剛性および／もしくは柔軟性、マット効果、ならびに、適用直後の均一性を与えるのに適する、無色または白色、鉱物性または合成性、層状または非層状の粒子を意味するものとして理解されたい。とりわけ言及されうる充填剤には、滑石、雲母、シリカ、カオリン、Ｎｙｌｏｎ−１２（Ａｔｏｃｈｅｍ社により市販されているＯｒｇａｓｏｌ（登録商標））などのＮｙｌｏｎ（登録商標）粉末、ポリエチレン粉末、ポリウレタン粉末、ポリスチレン粉末、ポリエステル粉末、場合によって、修飾デンプン、Ｔｏｓｐｅａｒｌ（登録商標）の商標名でToshiba社により市販されているシリコーン樹脂製マイクロビーズなどのシリコーン樹脂製マイクロビーズ、ヒドロキシアパタイト、およびシリカ製中空マイクロスフェア（Ｍａｐｒｅｃｏｓ社製のＳｉｌｉｃａ Ｂｅａｄｓ（登録商標））が含まれる。

【0049】

「色素」という用語は、媒体中で不溶性の白色もしくは有色、鉱物性もしくは有機性の粒子であって、組成物を着色し、かつ／または不透明化させることを意図する粒子を意味するものとして理解されたい。色素は、標準サイズの場合もあり、ナノメートルサイズの場合もある。言及されうる鉱物性色素には、二酸化チタン、二酸化ジルコニウム、および二酸化セリウムがあり、また、酸化亜鉛、酸化鉄、および酸化クロムもある。

【0050】

「ナクレ」という用語は、光を反射する虹色の粒子を意味するものとして理解されたい。想定されうるナクレの中では、天然の真珠層、酸化チタン、酸化鉄、天然色素、またはオキシ塩化ビスマスでコーティングした雲母について言及することができ、また、着色したチタン雲母についても言及することができる。

【0051】

水性相におけるこれらの充填剤および／または色素および／またはナクレの質量濃度は一般に、組成物の総重量に対する重量比で０．１％〜２０％であり、好ましくは０．２％〜７％である。

【0052】

「伸長剤」という用語は、皮膚を伸長させ、この伸長効果により、皮膚を滑らかにし、皺およびこれらに由来する小皺を軽減するか、なおまたはこれらを即時に消失させるのに適する化合物を意味するものとして理解されたい。言及されうる伸長剤には、天然由来のポリマーが含まれる。「天然由来のポリマー」という用語は、植物由来のポリマー、外皮に由来するポリマー、鶏卵タンパク質、および天然由来のラテックスを意味する。これらのポリマーは、親水性であることが好ましい。とりわけ言及されうる植物由来のポリマーには、タンパク質およびタンパク質の加水分解物が含まれ、より具体的には、トウモロコシ抽出物、ライムギ抽出物、コムギ抽出物、ソバ抽出物、ゴマ抽出物、スペルトコムギ抽出物、エンドウ抽出物、マメ抽出物、レンティル抽出物、ダイズ抽出物、およびルピン抽出物など、穀類抽出物、野菜抽出物、および油産生植物の抽出物が含まれる。合成ポリマーは一般に、ラッテクスまたはシュードラテックスの形態にあり、重縮合体型の場合もあり、フリーラジカルの重合化により得られる場合もある。とりわけ、ポリエステル／ポリウレタン分散液、およびポリエーテル／ポリウレタン分散液について言及しうる。伸長剤は、ＰＶＰ／アクリル酸ジメチコニルおよび親水性ポリウレタンのコポリマー（Ｈｙｄｒｏｍｅｒ社製のＡｑｕａｍｅｒｅ Ｓ−２００１（登録商標））であることが好ましい。

【0053】

本明細書における「マッティングポリマー」という用語は、溶液中、分散液中、または粒子形態中の任意のポリマーであって、皮膚のテカリを低減し、肌の色を統一するポリマーを意味する。言及されうる例には、シリコーン製エラストマー、樹脂粒子、およびこれらの混合物が含まれる。言及されうるシリコーン製エラストマーの例には、ShinEtsu社によりＫＳＧ（登録商標）の商標名で市販されている製品、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社によりＴｒｅｆｉｌ（登録商標）、ＢＹ２９（登録商標）、もしくはＥＰＳＸ（登録商標）の商標名で市販されている製品、またはＧｒａｎｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社によりＧｒａｎｓｉｌ（登録商標）の商標名で市販されている製品が含まれる。

【0054】

本発明において用いられる組成物はまた、マイクロＲＮＡ阻害剤以外の活性薬剤も含む場合があり、特に、以下から選択される少なくとも１つの活性薬剤を含む場合があるが、この列挙を限定的とするものではない：増殖因子の生成を刺激する薬剤；抗糖化剤または脱糖化剤；コラーゲンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する薬剤（抗コラゲナーゼ剤であり、とりわけ、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤）；エラスチンの合成を増大させるか、またはその分解を防止する薬剤（抗エラスターゼ剤）；インテグリン、またはテンシンなど、焦点接着成分の合成を刺激する薬剤；グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンの合成を増大させるか、またはそれらの分解を防止する薬剤（抗プロテオグリカナーゼ剤）；線維芽細胞の増殖を増大させる薬剤；脱色素沈着剤または抗色素沈着剤；抗酸化剤もしくはフリーラジカルスカベンジャーまたは抗汚染剤；ならびにこれらの混合物。

【0055】

このような薬剤の例は、とりわけ、以下の薬剤である：植物抽出物、特に、コンドルス・クリスプス（Chondrus crispus）抽出物、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）抽出物、エンドウ（Pisum sativum）抽出物（Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ（登録商標）ＴＰ ＬＳ）、センテラ・アジアチカ（Centella asiatica）抽出物、イカダモ（Scenedesmus）属抽出物、モリンガ・プテリゴスペルマ（Moringa pterygosperma）抽出物、マンサク抽出物、セイヨウグリ（Castanea sativa）抽出物、ローゼル（Hibiscus sabdriffa）抽出物、ゲッカコウ（Polianthes tuberosa）抽出物、アルガンツリー（Argania spinosa）抽出物、アロエ・ベラ（Aloe vera）抽出物、フサザキスイセン（Narcissus tarzetta）抽出物、または甘草抽出物；ダイダイ（Citrus aurantium）のエッセンシャルオイル（ネロリ）；グリコール酸、乳酸、およびクエン酸などのα−ヒドロキシ酸、ならびにこれらのエステル；サリチル酸などのβ−ヒドロキシ酸、およびこれらの誘導体；植物タンパク質の加水分解物（とりわけ、ダイズの加水分解物、またはヘーゼルナッツの加水分解物）；アクリル化オリゴペプチド（とりわけ、Ｓｅｄｅｒｍａ社によりＭａｘｉｌｉｐ（登録商標）、Ｍａｔｒｉｘｙｌ（登録商標）３０００、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＣＬ、またはＢｉｏｐｅｐｔｉｄｅ（登録商標）ＥＬの商標名で市販されている）；酵母抽出物であり、特に、サッカロマイセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）抽出物；藻類抽出物であり、特に、コンブ抽出物；パルミチン酸レチニル、アスコルビン酸、アスコルビルグルコシド、リン酸アスコルビルマグネシウムまたはリン酸アスコルビルナトリウム、パルミチン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、ソルビン酸アスコルビル、トコフェロール、酢酸トコフェリル、およびソルビン酸トコフェリルなど、ビタミンおよびそれらの誘導体；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；ならびにこれらの混合物。

【0056】

変化形として、または加えて、本発明において用いられる組成物は、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｓｅｒｏｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓ／Ｃｏｇｎｉｓ Ｆｒａｎｃｅ社により、Ｐｒｏｔｅａｓｙｌ ＴＰ ＬＳ（登録商標）の商標名で市販されている、エンドウ（Pisum sativum）種子抽出物など、少なくとも１つのエラスターゼ阻害剤（抗エラスターゼ）を含みうる。

【0057】

組成物はまた、保湿剤、安定化剤、水分制御剤、ｐＨ制御剤、浸透圧調節剤、またはＵＶ−ＡスクリーンおよびＵＶ−Ｂスクリーンなど、不活性添加剤またはこれらの添加剤の組合せも含有しうる。

【0058】

以下の例は、本発明を、その範囲を限定することなく例示する。これらの例は、以下に列挙される図面に基づく。

【図面の簡単な説明】

【0059】

【図1】ヒト皮膚線維芽細胞における複製老化の誘導。（Ａ）１０３日間の培養期間におけるヒト初代線維芽細胞の集団倍加を示す図である。７０回の集団倍加後に、増殖曲線がプラトーをなすことから、細胞が、分裂を停止し、老化状態に達しつつあることが示される。（Ｂ）ウェスタンブロットが、継代培養１（ｐ１）、ｐ４、ｐ８、およびｐ１６におけるヒト線維芽細胞からのタンパク質抽出物に対して実施され、ｓｉｒｔ１およびｐ１６など、一部の老化マーカーについての解析を示す。β−アクチンは、ローディング対照として用いた。（Ｃ）ｐ１、ｐ４、ｐ８、およびｐ１６におけるヒト線維芽細胞を３時間にわたるＢｒｄＵパルス下に置き、回収し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーにより解析した。ＢｒｄＵ陽性細胞は、Ｓ期の蛍光集団として示され、ＰＩ染色によりＤＮＡ含量が２ｎまたは４ｎであると評価される（プロットでは、２５０および４００の値に定められる）。（ＤおよびＥ）ｐ１、ｐ４、ｐ８、およびｐ１２におけるＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色および線維芽細胞のフィールド１つ当たりの青色細胞個数による定量化を示す図である。

【図2】線維芽細胞の複製老化におけるｍｉＲ−１３４の発現。リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−１３４の相対定量化は、ｐ１の増殖中の線維芽細胞、ｐ１１の早期老化線維芽細胞、およびｐ１６の老化線維芽細胞から回収した全ＲＮＡに対して実施した。

【図3】線維芽細胞の複製老化におけるｍｉＲ−１５２の発現。リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−１３４の相対定量化は、ｐ１の増殖中の線維芽細胞、ｐ１１の早期老化線維芽細胞、およびｐ１６の老化線維芽細胞から回収した全ＲＮＡに対して実施した。

【図4】ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２が、増殖中の線維芽細胞／若齢の線維芽細胞へのトランスフェクションにより、線維芽細胞における増殖を抑制する。（Ａ）陰性対照配列、ｍｉＲ−１３４配列、またはｍｉＲ−１５２配列による線維芽細胞のトランスフェクションの９６時間後に、細胞を３時間にわたるＢｒｄＵパルス下に置き、回収し、ＰＩで染色し、図１で記載した通りにフローサイトメトリーにより解析した。（Ｂ）陰性対照配列、ｍｉＲ−１３４配列、およびｍｉＲ−１５２配列によるトランスフェクション後における、ＢｒｄＵ陽性線維芽細胞の定量化。

【図5】ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２が、増殖中の線維芽細胞／若齢の線維芽細胞へのトランスフェクションにより、線維芽細胞における老化を誘導する。（ＡおよびＢ）陰性対照配列、ｍｉＲ−１３４配列、およびｍｉＲ−１５２配列によるトランスフェクションの９６時間後における、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色および線維芽細胞のフィールド１つ当たりの青色細胞個数による定量化。

【図6】ＩＴＧＡ９は、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２の推定標的であり、線維芽細胞の複製老化において減少する。（Ａ）リアルタイムＰＣＲによる、ｐ１およびｐ１６におけるＩＴＧＡ９のｍＲＮＡレベルの相対定量化。（Ｂ）ＩＴＧＡ９の３’ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２の標的部位を、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．１ソフトウェアにより同定した。（Ｃ）ｐ１およびｐ１６における線維芽細胞からのタンパク質抽出物に対して実施したウェスタンブロットにより、ＩＴＧＡ９のタンパク質レベルが示される。β−アクチンは、ローディング対照として用いた。

【図7】ＩＴＧＡ９のｍＲＮＡは、線維芽細胞へのｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２のトランスフェクションにより下方制御される。陰性対照配列、ｍｉＲ−１３４配列、およびｍｉＲ−１５２配列によるトランスフェクションの９６時間後における、リアルタイムＰＣＲによる、線維芽細胞のＩＴＧＡ９ ｍＲＮＡレベルの相対定量化。

【図8】ＩＴＧＡ５は、ｍｉＲ−１５２の推定標的であり、線維芽細胞の複製老化において減少する。（Ａ）リアルタイムＰＣＲによる、ｐ１およびｐ１６におけるＩＴＧＡ５ ｍＲＮＡレベルの相対定量化。（Ｂ）ＩＴＧＡの３’ＵＴＲにおいて予測されるｍｉＲ−１５２の標的部位を、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．１ソフトウェアにより同定した。（Ｃ）ｐ１およびｐ１６における線維芽細胞からのタンパク質抽出物に対して実施したウェスタンブロットにより、ＩＴＧＡ５のタンパク質レベルが示される。β−アクチンは、ローディング対照として用いた。

【図9】ＩＴＧＡ５は、線維芽細胞へのｍｉＲ−１５２のトランスフェクションにより下方制御される。（Ａ）陰性対照配列およびｍｉＲ−１５２配列によるトランスフェクションの９６時間後における、リアルタイムＰＣＲによる、線維芽細胞のＩＴＧＡ５ ｍＲＮＡレベルの相対定量化。（Ｂ）陰性対照配列、ｍｉＲ−１５２配列、および抗ｍｉＲ １５２配列によるトランスフェクションの９６時間後において、線維芽細胞からのタンパク質抽出物に対して実施したウェスタンブロットにより、ＩＴＧＡ５のタンパク質レベルが示される。β−アクチンは、ローディング対照として用いた。

【図10】線維芽細胞において特異的なアンタゴｍｉＲを用いるｍｉＲ−１３４の阻害。陰性対照配列および抗ｍｉＲ−１３４配列による線維芽細胞のトランスフェクションの９６時間後における、リアルタイムＰＣＲによる、ｍｉＲ−１３４レベルの相対定量化。

【図11】線維芽細胞において特異的なアンタゴｍｉＲを用いるｍｉＲ−１５２の阻害。陰性対照配列および抗ｍｉＲ−１５２配列による線維芽細胞のトランスフェクションの９６時間後における、リアルタイムＰＣＲによる、ｍｉＲ−１５２レベルの相対定量化。

【図12】化合物４および５によるｍｉＲ−１３４の阻害。陰性対照および異なる濃度の化合物４または５による線維芽細胞の処置の４８時間後における、リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−１３４レベルの相対定量化。

【図13】化合物２、４、および８によるｍｉＲ−１５２の阻害。陰性対照および異なる濃度の化合物２、４、または８による線維芽細胞の処置の４８時間後における、リアルタイムＰＣＲによるｍｉＲ−１５２レベルの相対定量化。

【実施例1】

【0060】

材料および方法
細胞の培養およびトランスフェクション
ヒト新生児初代皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を、ＬＳＧＳ増殖サプリメント（Ｃａｓｃａｄｅ）を添加した１０６培地中で培養した。細胞は、通常毎週１回継代培養し、各継代培養では、継代培養間で生じる集団倍加および集団倍加時間を計算するために、採取された細胞の数および播種された細胞の数を記録した。各継代培養では、細胞の異なるアリコートを三連（triplicate）で採取して、ＲＮＡおよびタンパク質を抽出し、細胞の老化状態または非老化状態をアッセイするために、アリコートを老化活性化β−ガラクトシダーゼ染色にかけた。

【0061】

ヒト初代線維芽細胞は、製造元のプロトコールに従い、Ｌｉｐｏｆｅｃａｔｍｉｎｅ ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒトｐｒｅ−ｍｉＲ １３４、抗ｍｉＲ−１３４、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１５２、抗ｍｉＲ−１５２、および陰性対照としてのスクランブル配列（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培地を除去し、新鮮な培地で置換した。

【0062】

４００，０００個のヒト初代線維芽細胞を、ＬＳＧＳ増殖サプリメントを伴う１０６培地中に播種し、被験化合物で処置した。２４時間後および４８時間後に、細胞を回収し、標準的な手順に従いｍＲＮＡを抽出した。下記の通りにリアルタイムＰＣＲを実施した。

【0063】

ＲＮＡの抽出およびリアルタイムＰＣＲ解析
細胞に由来する全ＲＮＡは、全ＲＮＡ抽出についての製造元のプロトコールに従うことにより、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉｒＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて単離した。全ＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｓｐｅｃｔｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、ＵＳＡ）を用いて定量化し、ＲＮＡの品質は、アガロースゲル上で管理した。マイクロＲＮＡを検出するため、ＲＮＡは、ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いて逆転写させ、ＴａｑＭａｎ ユニバーサル マスター ミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）ならびにｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２に特異的なプライマーによりｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ｕ１８を内部対照として用いた（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）。各遺伝子およびｍｉＲの発現は、閾値サイクル（Ｃｔ）により規定し、相対発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子であるＵ１８の発現に対する標準化の後、２−ΔΔＣｔ法を用いることにより計算した。

【0064】

老化に関連するβ−ガラクトシダーゼ染色
細胞を６ウェル培養プレート内で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中に２％のホルムアルデヒド／０．２％のグルタルアルデヒドで５分間にわたり固定した。ＰＢＳによるさらなる洗浄ステップの後、細胞を、β−ガラクトシダーゼ染色溶液（１ｍｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラクトシド［Ｘ−ｇａｌ］を含有する、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ／Ｌのフェリシアン化カリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌのフェロシアン化カリウム、４０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸、１２ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）と共に、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。染色溶液を７０％のグリセロールで置換することにより、反応を停止させた。

【0065】

細胞増殖および細胞周期の解析
細胞増殖を評価するのに用いられる方法は一般に、ＤＮＡ合成時における３Ｈチミジンまたはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）などのチミジン類似体の取込みに基づく。Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（商標）ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキットは、ＢｒｄＵアッセイに対する新規の代替法である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）。この方法は、ヌクレオシド類似体であるＢｒｄＵの、抗体に基づく検出を、活発なＤＮＡ合成時にＤＮＡへと取り込まれるチミジンのヌクレオシド類似体であるＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン）で置換する。略述すると、細胞を、ＥｄＵと共に４時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、製造元のプロトコールに従い、試料を固定、透過処理、および染色した。細胞周期は、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ フロー サイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（ＢＤ）プログラムおよびＭｏｄｆｉｔ ＬＴ（Ｖｅｒｉｔｙ ソフトウェア、ＢＤ）プログラムを用いて、１５，０００事象を評価した。

【0066】

バイオインフォマティックス
ＩＴＧＡ９の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２の標的部位についての解析は、http://www.targetscan.org/において入手可能なＴａｒｇｅｔＳｃａｎ ５．１ソフトウェアを用いて実施した。

【0067】

ウェスタンブロット法
全細胞抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ ＰＶＤＦ膜（Ｇ＆Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上でブロッティングした。膜は、ＰＢＳＴ中５％の脱脂粉乳でブロッキングし、一次抗体と共に室温で２時間にわたりインキュベートし、洗浄し、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（ウサギおよびマウス、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）を用いて、室温で１時間にわたりハイブリダイズさせた。検出は、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）により実施した。抗Ｓｉｒｔ１（Ａｂｃａｍ；希釈は１：５００）、抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ；希釈は１：５０００）、抗ｐ１６（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ；希釈は１：１０００）、抗ＩＴＧＡ９（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ；希釈は１：４００）を用いた。

【0068】

結果
１．ヒト初代線維芽細胞における複製老化についてのモデルの確立：ヒト初代線維芽細胞を培養し、老化状態に達するまで連続継代培養した。図１Ａは、１０３日間の培養期間におけるヒト初代線維芽細胞の集団倍加を示す。７０回の集団倍加（継代培養１６：ｐ１６）後に、増殖曲線がプラトーをなすことから、細胞が、分裂を停止し、老化状態に達しつつあることが示される。ｐ１、ｐ４、ｐ８、およびｐ１６において細胞を回収し、ｐ１６／ＩＮＫ４ａおよびＳｉｒｔ−１についてのウェスタンブロット解析を実施した。Ｓｉｒｔ−１の発現の減衰およびｐ１６／ＩＮＫ４ａレベルの上昇は、細胞が複製老化状態に入りつつあることを示す。βアクチンのタンパク質レベルは、ローディング対照として報告される（図１Ａおよび１Ｂ）。異なる継代培養におけるＢｒｄＵ陽性ヒト初代線維芽細胞の百分率により示される通り、老化時において、増殖中の細胞の百分率は低下する（図１Ｃ）。ヒト初代線維芽細胞は、７０回集団倍加した１６継代培養後に複製老化を経る。異なる継代培養のヒト初代線維芽細胞におけるＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色についての顕微鏡写真は、老齢細胞における老化マーカーの発現を示す。ＳＡ−β−ガラクトシダーゼを発現させる細胞は、濃い青色の染色を示す（図１Ｄ）が、染色の定量化は図１Ｅに示される。

【0069】

２．老化しつつある線維芽細胞におけるｍｉＲ−１３４レベル：ｐ１、ｐ１１、およびｐ１６において細胞を回収して、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｐ１〜ｐ１６のｍｉＲ−１３４レベルの相対定量化は、老化線維芽細胞におけるｍｉＲ−１３４発現の有意な増大を示す：ｐ１６において、ｍｉＲ−１３４の発現は、ｐ１におけるその発現（１．００±０．０５に等しい）の約５．３５（±０．０８）倍である、図２。したがって、線維芽細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１３４発現の増大と関連するが、線維芽細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１３４発現の増大と関連しない。

【0070】

３．老化しつつある線維芽細胞におけるｍｉＲ−１５２レベル：ｐ１、ｐ１１、およびｐ１６において細胞を回収して、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｐ１〜ｐ１６のｍｉＲ−１５２レベルの相対定量化は、老化線維芽細胞におけるｍｉＲ−１５２発現の有意な増大を示す：ｐ１６において、ｍｉＲ−１５２の発現はｐ１におけるその発現（１．００±０．０７に等しい）の約３．３７（±０．０９）倍である（図３）。したがって、線維芽細胞の老化状態は、ｍｉＲ−１５２発現の増大と関連するが、線維芽細胞の増殖状態は、ｍｉＲ−１５２発現の増大と関連しない。

【0071】

４．ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２は、増殖中の線維芽細胞／若齢の線維芽細胞へのトランスフェクションにより、線維芽細胞の増殖を抑制する：陰性対照、ｍｉＲ−１３４配列、またはｍｉＲ−１５２配列によるヒト皮膚線維芽細胞のトランスフェクションの９６時間後に、細胞を３時間にわたるＢｒｄＵパルス下に置き、回収し、ＰＩで染色し、方法で記載した通りにフローサイトメトリーにより解析した。陰性対照（２６％）、ｍｉＲ−１３４（１９％）、およびｍｉＲ−１５２（１８％）でトランスフェクトしたＢｒｄＵ陽性ヒト初代線維芽細胞の百分率により示される通り、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２をトランスフェクトすると、増殖中の細胞（proliferating cell）の百分率は低下した（図４Ａおよび４Ｂ）。

【0072】

５．ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２は、増殖中の線維芽細胞／若齢の線維芽細胞へのトランスフェクションにより、線維芽細胞における老化を誘導する：ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２でトランスフェクトすると、線維芽細胞におけるＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色が有意に増大した。これは、これらの２つのｍｉＲＮＡは、老化を誘導するのにそれら自体で十分であることを証明する（図５Ａ）。トランスフェクションの９６時間後におけるヒト皮膚線維芽細胞のフィールド１つ当たりの青色細胞個数の定量化は、ＳＡ−β−ガラクトシダーゼ染色の、陰性対照と比較して４〜４．５倍の増大を示す（図５Ｂ）。

【0073】

６．ＩＴＧＡ９は、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２両方の標的である：ｐ１およびｐ１６の細胞を用いて、リアルタイムＰＣＲによるＩＴＧＡ９のｍＲＮＡの相対定量化を実施したところ（図６Ａ）、得られたデータは、ＩＴＧＡ９のｍＲＮＡが、老化線維芽細胞（ｐ１６）において強く低減されることを明確に示す。実際、トランスフェクションの９６時間後における、リアルタイムＰＣＲによる、ヒト皮膚線維芽細胞のＩＴＧＡ９ ｍＲＮＡレベルの相対定量化は、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２のトランスフェクションにより、ＩＴＧＡ９が、それぞれ、２０％および４０％低減されることを示す。これは、おそらくＩＴＧＡ９タンパク質の安定性が高いために、同じ実験条件下のタンパク質レベルではそれほど明白ではない（図６Ｃ）。本発明者らは、ＩＴＧＡ９の３’ＵＴＲにおいて、ｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２について予測される２つの標的部位を、ｔａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．１ソフトウェアを用いて同定した。図７に示す通り、ＩＴＧＡ９のｍＲＮＡは、線維芽細胞へのｍｉＲ−１３４およびｍｉＲ−１５２のトランスフェクションにより下方制御される。

【0074】

７．ＩＴＧＡ５は、ｍｉＲ−１５２の標的である：ｐ１およびｐ１６の細胞を用いて、リアルタイムＰＣＲによるＩＴＧＡ５のｍＲＮＡの相対定量化を実施したところ（図８Ａ）、得られたデータは、ＩＴＧＡ５のｍＲＮＡが、老化線維芽細胞（ｐ１６）において低減されることを明確に示す。実際、トランスフェクションの９６時間後における、ヒト皮膚線維芽細胞のＩＴＧＡ５ ｍＲＮＡレベルについてのリアルタイムＰＣＲは、ｍｉＲ−１５２のトランスフェクションにより、ＩＴＧＡ５が３０％低減されることを示す。これはまた、同じ実験条件下のタンパク質レベルでも明白である（図８Ｃ）。本発明者らは、ＩＴＧＡ５の３’ＵＴＲにおいて、ｍｉＲ−１５２について予測される２つの標的部位を、ｔａｒｇｅｔＳｃａｎ ６．１ソフトウェアを用いて同定した。リアルタイムＰＣＲによるヒト線維芽細胞のＩＴＧＡ５ ｍＲＮＡレベルの相対定量化により示される通り、トランスフェクションすると、ＩＴＧＡ５は、線維芽細胞においてｍｉＲ−１５２により下方制御される。ｍｉＲ−１５２および抗ｍｉＲ−１５２のトランスフェクション後におけるヒト線維芽細胞からのタンパク質抽出物に対して実施したウェスタンブロットは、ＩＴＧＡ５の有意な減少を示した。β−アクチンをローディング対照として用いた。

【0075】

８．合成抗ｍｉＲ−１３４によるｍｉＲ−１３４の調節：抗ｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲを特異的に阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤である。抗ｍｉＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ分子に特異的に結合し、これを阻害するようにデザインされた一本鎖核酸である。抗ｍｉＲＮＡは、標的ｍｉＲＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。これらの即時使用可能な阻害剤は、ｓｉＲＮＡに用いられるトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータと同様のトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータを用いて細胞内に導入することができ、ｍｉＲＮＡの生物学的効果についての詳細な研究を可能とする。抗ｍｉＲＮＡの使用は、ｍｉＲＮＡ活性の下方制御によるｍｉＲＮＡについての機能的解析を可能とする。抗ｍｉＲＮＡは市販されており、例えば、ＡｍｂｉｏｎまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得ることができる。ヒト初代線維芽細胞を、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１３４で処置した。９６時間後に、リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３４レベルを相対定量化するために細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１３４は、処置されない細胞に対して、ｍｉＲ−１３４レベルを有意に下方制御し、処置された細胞におけるｍｉＲ−１３４の発現は、０．１８４±０．０２２に過ぎない（これに対し、スクランブルでは、１．００±０．０１である）（図１０）。

【0076】

９．合成抗ｍｉＲ−１５２によるｍｉＲ−１５２の調節：抗ｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲＮＡを特異的に阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤である。抗ｍｉＲＮＡは、内因性マイクロＲＮＡ分子に特異的に結合し、これを阻害するようにデザインされた一本鎖核酸である。抗ｍｉＲＮＡは、標的ｍｉＲＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。これらの即時使用可能な阻害剤は、ｓｉＲＮＡに用いられるトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータと同様のトランスフェクションパラメータまたは電気穿孔パラメータを用いて細胞内に導入することができ、ｍｉＲＮＡの生物学的効果についての詳細な研究を可能とする。抗ｍｉＲＮＡの使用は、ｍｉＲＮＡ活性の下方制御を介するｍｉＲＮＡについての機能的解析を可能とする。抗ｍｉＲＮＡは市販されており、例えば、ＡｍｂｉｏｎまたはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより得ることができる。ヒト初代線維芽細胞を、異なる濃度の抗ｍｉＲ−１５２で処置した。９６時間後に、リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１５２レベルを相対定量化するために細胞を採取した。抗ｍｉＲ−１５２は、処置されない細胞に対して、ｍｉＲ−１５２レベルを有意に下方制御し、処置された細胞におけるｍｉＲ−１５２の発現は、０．３２５±０．０３２に過ぎない（これに対し、スクランブルでは、１．００±０．０１である）（図１１）。

【0077】

１０．化合物４および５によるｍｉＲ−１３４の阻害：ヒト初代線維芽細胞を、図１２に示す濃度の、それぞれ、没食子酸エピガロカテキン（Epigallocatechine Gallate）およびベルバスコシド（Verbascoside）である化合物４および５で処置した。４８時間後に、リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１３４レベルを相対定量化するために細胞を採取した。化合物４および５は、処置されない細胞に対して、ｍｉＲ−１３４レベルを有意に下方制御し、処置された細胞におけるｍｉＲ−１３４の発現は、０．６０３±０．０３および０．７３４±０．０５に過ぎない（これに対し、スクランブルでは、１．００±０．０１である）（図１２）。

【0078】

１１．化合物２、４、および８によるｍｉＲ−１５２の阻害：ヒト初代線維芽細胞を、図１３に示す濃度の、それぞれ、カテキン水和物（Catechine Hydrate）、没食子酸エピガロカテキン、およびボワダンジュＰＦＡ（Bois d’Ange PFA）である化合物２、４、および８で処置した。４８時間後に、リアルタイムＰＣＲを用いてｍｉＲ−１５２レベルを相対定量化するために細胞を採取した。化合物２、４、および８は、処置されない細胞に対して、ｍｉＲ−１５２レベルを有意に下方制御し、処置された細胞におけるｍｉＲ−１５２の発現は、０．７６９±０．０３、０．８０４±０．０５、および０．３１４±０．０４に過ぎない（これに対し、スクランブルでは、１．００±０．０１である）（図１３）。

【実施例2】

【0079】

化粧組成物（Ｏ／Ｗセラム（serum））
当業者は、以下の組成物を、古典的な方法により調製することができる。

【0080】

活性薬剤は、以下の通りに調製する：
アンディ（Andira coriacea）（すなわち、ボワダンジュ）の木質をエタノールで抽出して、減圧下における蒸発後に３８６ｍｇの粗抽出物を得た。次に、Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸およびＭｅＯＨの勾配（６０ｍＬ・分−１で１７分間で、７０：３０から６０：４０へのＨ２Ｏ＋ＦＡ／ＭｅＯＨ）を用いて、逆相分取ＨＰＬＣ（Ｃ１８ Ｖａｒｉａｎ Ｐｕｒｓｕｉｔ ＸＲＳ、２５０ｍｍ×４１．１ｍｍ×５μｍ）により粗抽出物を精製し、純粋なＣｏａｔｌｉｎｅ Ａ（１２．３ｍｇ）およびＣｏａｔｌｉｎｅ Ｂ（４０．２ｍｇ）をもたらした。

【0081】

【表1】

【0082】

（参考文献）
Serrano et al (1997), Cell 88:593-562
Campisi (2001), Trends Cell Biol 11:S27-S31
Schmitt et al (2002) Cell 109:335-346
Narita et al (2003), Cell 113:703-706
Sharpless et al (2004) J Clin Invest 113:160-168
Grillari et al (2010) Exp Gerontol 45: 302-311
Hackl et al. (2010) Aging Cell 9: 291-296
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Quan T et al, (2009) J Investig Dermatol Symp Proc. 14(1):20-4
Roy S et al, (2011) J Oral Pathol Med. 40(10):755-61

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]